NO840200L - Glukoamylase cdna. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører glukoamylase gen, en fremgangsmåte for isolering av et slikt gen og en vert som er transformert ved en ekspression vektor ac nevnte gen og produsert glukolamylase.

Fremgangsmåtene innen genteknikken har med hell blitt anvendt

i den farmasøytiske industrien, noe som har resultert i en rekke nye prosukter. Det har blitt mer og mer klart at de samme teknikkene kan anvendes i en større skala for frems-tillinga av ensymer av verdi for andre industrier. Fordelene ved å oppnå kommersielt nyttige fremgangsmåter gjennom genteknikk antas å omfatte:

1. Kostnadsbesparelse i ensymproduksjon,

2. Fremstilling av ensymer i organismer som vanligvis er anerkjent som sikre, som er mer egnet for mat-prosukter, 3. Bestemte genetiske modifikasjoner på DNA-nivået for å forbedre ensymegenskaper, slik som varmestabilitet og andre ytelseskarakteristika.

En viktig industriell anvendelse av genteknikk omfatter for-bedringer av evnen hos industrielle gjærstammer til å bryte ned komplekse karbohydrat substrat slik som stivelse, Gjær slik som Saccharomyces cerevisiae som er egnet for alkohol fermentering,fremstiller ikke et ensym som er i stand til å hydrolysere stivelse til unyttbare substrater. For tiden må stivelse brukt som en matkilde i alkohol fermentering for-sukres, enten kjemisk eller ensymatisk, i en separat fremgangsmåte for å fremstille unyttbare substrater for den fermenterende gjær.

Det ville således være ønskelig å konstruere, ved hjelp av genetiske rekombinasjonsfremgangsmåter, en fermenteringsgjær, slik som S.cerevisiae som selv har evnen til å syntetisere en eller flere ensymer, som er i stand til å bryte ned stivelse til utnyttbare substrater. EP Ps. 0 034 470 åpenbarer fremstilling av rekombinant DNA som inneholder et amylase-kodende gen ved å spalte en bakteriell dono-mikroorganisme for å tilveiebringe DNA, og innføre disse fragmentene i en vektor. Amylaseensymene fremstilt fra denne DNA som brukes til å hydrolysere stivelse, er fortrinnsvis alfa-amylase, beta-amylaseeller en pullulanase.

Følgelig vedrør foreliggende oppfinnelse i et aspect konstruksjon av en fermenteringsgjær som inneholder, i rekombinant form, et gen som koder for en glukoamylase som er i stand til å hydrolysere stivelse både i alfa 1-4 og al-a 1-6 bindinger for å frembringe glukose.

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt konstruksjonen

av et glukoamylasegen, som kna innføres i rekombinant form i en fremmed vert, omfattende, men ikke begrenset til, gjær eller bakterier. En slik vert kan også omfatte virus,plante-eller dyreceller.

I henhold til et aspekt ifølge oppfinnelsen er det tilveiebrakt en modifisert DNA sekvens som koder for glukoamylase protein fra sopp, eller enkle eller multiple base substitusjoner, fjernelser, innføringer eller ombyttingerderav, hvor DNA-sekvensen er avledet fra mulige, syntetiske eller halvsyntetiske kilder, og er i stand til, når den er korrekt kombinert med en spaltet ekspressjons vektor, og uttrykket et ikke-naturlig protein med glukoamylaseensymaktivitet etter transformasjon av en mikroorganismevert, med vektoren. Ekspressjons vektoren er fortrinnsvis plasmedidet pACl beskrevet nærmere nedenunder som er blitt spaltet ved sitt Hindlll-sete, slik at sekvensen kan innføres på dette stedet.

Med tanke på et annet aspekt ved op<p>finnelse, er det oppdaget at Aspersillus awamorei celler,Når de dyrkes under betingelser som induserer glukoamylaser, inneholder en forholdsvis høy konsentrasjon av 2,2 kilobase poly A RNA som ikke er påvist i cellene dyrket under ikke-induserende betingelser. Den induserte poly A RNA (mRNA) er i stand til å styre syntesen av et ikke-glykosilert polypeptid med en molekylvekt mellom ca. 70 000 og 74 000 dalton, i et cellefritt proteinsyntetiserende system. Det fremstilte polypeptid er immunologisk reaktivt med antistoffer fremstilt mot A.Awamori glukoamylase.

Det er fremstilt en radioaktivt merket cDNA-kopi av den induserte poly A RNA som brukes ved hybridiserings-undersøk-elser for å identifisere A.awamori genom DNA-fragmenter, som inneholder deler av glukoamylasegenet. Hybridiserings-undersøkelsene antyder at A-awamori inneholder et enkelt glukoamylasegen.

Likeledes brukes cDNA-n for å identifisere fag- eller plas-midvektorer som inneholder slike genom-DNA-fragmenter i rekombinant form. De identifiserte kloningsvektorene kan brukes for å bestemme genpolynucleotisekvenser og sekvens-homologi med cDNA-n.

Når et HindIII-fragment som inneholder A.Awamori glukoamylasegenet innføres i gjær, påvises hverken transkripsjon eller translasjon i disse heterologiske vertene.

Oppfinnelsen tilveiebringer også rekombinante DNA-ekspressjonsvektor som inneholder DNA-sekvensen. Vektoren er fortrinnsvis en som er forenlig med en utvalgt, fremmed mikroorganismevert, og tillater ekspressjon av genet i verten. Det eksogene genet som uttrykkes kan være genom-DNA, syntetisk DNA eller en cDNA erholt fra en mRNA ved bruk av revers-transkriptase.

En ny fremgangsmåte for å fremstille et glukoamylasegen som inneholder den passende DNA-sekvensen omfatter vanligvis å fremstille nedbrytningsfragmenter av genomet, som gir en glukoamylase-sonde, ved å bruke sonden for å identifisere nedbrytningsfragmenter av genom, som inneholder glukoamylasegenområder, og klone de identifiserte nedbrytingsfragmenter av genom molekylært, og klone partiell cDNA molekylært, og sekvensere genom- og cDNA-klonene, og sammenligne de sekven-serte glukoamylase-genområdene med hele eller en del av aminosyresekvensen til det fullt ferdige glukoamylase-ensymet for å bestemme eksistensen og lokaliseringen av alle intronene og eksonene i genom-klonene, og å konstruere et gen hvis kodonsekvens i det vesentlige er identisk med den til gluko-amy lasegenet fra genomet, når sekvensene som inneholder intronene er fjernet.

Ved en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten, tilveiebringes glukoamylase-sonden for å velge ut en sopp-kilde som, når den dyrkes på stivelse, er i stand til å produsere et nivå av glukoamylase som er minst ca. 10 ganger større enn det som produseres av sopp-artene når de dyrkes på

xylose eller glyserol i fravær av stivelse, dyrkes eller av den utvalgte sopp under betingelser som induserer utskillelse av glukoamylase i dyrkingsmediet, erholder mRNA fra de dyrkede celler, fraksjonerer den oppnådde mRNA etter størr-else, velge ut en mRNA som det er påvisbart har en forholdsvis høy konsentrasjon med hensyn på mRNA med ekvivalent størrelse produsert av celler av de utvalgte soppartene dyrket under betingelser som ikke induserer utskillelse av glukoamylase i dyrkingsmediet, og kopierer den utvalgte mRNA slik at den produserer glukoamylase-sonden.

I nok en annen utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes en vertorganisme som er transformert med en DNA-ekspressjonsvektor som omfatter et promoter-fragment som virker i denne verten, og et DNA-segment med en modifisert DNA-sekvens som koder for glukoamylase-protein fra soppen, idet DNA-segmentet er i en slik orientering i forhold til promoter-fragmentet at det i verten uttrykkes slik at det produseres et ikke-naturlig glukoamylaseprotein.

Genet ifølge oppfinnelsen, når det uttrykkes i en vertorganisme tansformert med en ekspressjonsvektor som omfatter genet, gir et ensym som har glukoamylaseaktiviteter. Fortrinnsvis produseres glukoamylaseensymet som et preprotein ved en signalsekvens ved sin Nt^-ende, som fremstilles av vertorganismen under utskillelsen.

Ved en annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille glukose ved forsukring av stivelse ved å bruke et rekombinant glukoamylasegen.

En annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille etanol ved samtidig forsukring og fermentering som omfatter å dyrke, på en ikke-fermenterbar karbon kilde som er et substrat for glukoamylaseensym, en vertorganisme transformert med DNA-ekspressjonsvektoren beskrevet ovenfor. Karbonkilden er fortrinnsvis stivelse, oppløselig stivelse, maltose eller isomaltose.

Ved nok en annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for å utskille et hvilket som helst proteinholdig materiale ekstracellulært som omfatter å dyrke vert-organismen i et dyrkingsmedium, idet verten er transformert med en DNA-ekspressjonsvektor, som omfatter et promoter fragment som virker i vertorganismen, en signalsekvense med i det vesentlige den følgende aminosyre sekvens:

og et DNA-segment som koder for det proteinholdige materialet.

Det proteinholdige materialet er fortrinnsvis et protein som normalt utskilles, og mest foretrukket er det glukoamylase. Vektoren kan eller behøver ikke å inneholde et DNAsegment som virker som et opphav for replikasjon, en selekterbar markør eller et terminatorsegment for transkribsjon.

Ved foreliggende oppfinnelse viser det seg at glykoamylase-ensymet som erholdes når det heterologe genet uttrykkes i gjær, er glykolisert. Dertil utskiller en betydelig del (f.eks. mer enn 90%) av glukoamylasen i mediene. Når N-enden i det ikke-naturlige glykoamylaseproteinet utskilt i mediene (med en renhet på mer enn 85%) ble sekvensbestemt, ble dess-uten de første 9 aminosyrene å være identiske med det fullt utviklede glukoamylaseproteinet utskilt av Aspergillus. Den tilsynelatende molekylvekt bestemt ved hjelp av SDS polyakrylamid gel elektroforese av det erholdte glukoamylaseproteinet og svarer til den som er funnet for den ferdig fremstilte og glukoliserte formen av det naturlige glukoamylase utdkilt av Aspergillus. Videre er karboksyende-aminosyren identisk med den til den formen av glukoamylase produsert av Aspergillus, som har høy molekylvekt. Figur 1 viser gel elektroforese spor som viser in vitro translasjon av A.awamori mRNA fra celler dyrket i medium som inneholder xylose eller stivelse som karbonkilde. Translasjons-produkter ble immunoutfelt for å øke anti-glukoamylase-antistoff fra kanin(felt 1: xylose-dyrkede celler; felt 3: stivel-sesdyrkede celler) eller normalt kanin antistoffer (felt 2: xylosedyrkede celler; felt 4: stivelsedyrkede celler). Figur 2A og 2B viser gel elektroforesespor som identifiserer glukoamylase mRNA. I fig 2 A ble poly A-holdig mRNA fra celler dyrket i medium som inneholder stivelse (felt 1) eller xylose (felt 2) analysert ved hjelp av MeHgOH-agarose gel elektroforese. Humane og E.coli ribosomale RNA-n gir molekylære vekt-markører. De ribosomale RNA-n fra A.awamorier avmerket som "28S" og "185". Den viktigste "induserte" mRNA (pil) ble isolert fra gelen og brukt til å styre translasjon in vitro.

I figur 2B er vist alle translasjonsproduktene fra reaksjonen som ikke inneholder noe eksogent mRNA (felt 1) eller den isolerte viktigste "induserte" mRNA (felt 2). Immunoutfelling av proteinprodukter i felt 2, ved å bruke anti-glukoamylase-antistoff fra kanin, vist i felt 3.

Figur 3 viser et restriksjons endonuclease kart av A.awamori genom som omgir glukoamylase genet. Hele det strukturelle genet finnes innenfor det 3,4 kilobase EcoRI-fragmentet isolert fra "Charon 4A"-samlingen. De proteinkodede områdene av glukoamylasegenet er angitt som tykke bokser, og pilen angir retningen for og utstrekningen av transkribsjonen. Figur 4 viser gel elektroforetisk spor hvor pGAR1 brukes til å hybridisere til, og velge ut, glukoamylase mRNA. All A.awamori mRNA (felt 1) og mRNA isolert ved hjelp av hybridisering til pGAR1 DNA (felt 2) ble translatert in vitro og proteinproduktene er vist. Proteinprodukter i felt 2 immunoutfelles ved å bruke anti-glukoamylase-antistoffer fra kanin (felt 3) eller normalt kanin-antistoff(felt 4) Figur 5 illustrerer primer-uttrekking for å bestemme 5'ender i glukoamylase-mRNA og sekvensen som ble bestemt. Produktene fra primer-uttrekkningen ved 42°C.,(felt 1) og 50°C.,(felt 2) er vist på en sekvenseringsgel parallelt med m13/dideoksynucleo-tid-sekvensering-reaksjoner i dette området, ved å utnytte den identiske 15-mer-primeren. Den viste sekvensen representerer glukoamylase-mRNA-sekvensen og er komplementær til den som avleses fra de viste sekvenseringsreaksjoner. Figur 6 illustrerer et restriksjonskart for EcoRI-fragment som inneholder genom-glykoamylasegenet, hvor de mørklagte boksene under sekvensen angir eksonen eller kodende områder for glukoamylasegenet og pilen viser retningen for mRNA-transkribsjonen.

Figur 7 illustrerer et plasmidkart for PGAC9

Figur 8 illustrerer et plasmidkart for PGC21.

Figur 9 viser plate-analyser på degradering av "Baker"s" stivelse med forskjellige transformerte gjærstammer. Stammene angitt nedenunder ble strøket ut på minimal media som inneholdt histidin ved 40 ml/l og 2% vekt/volum "Baker<1>s" stivelse.

Etter 12 dager med inkubering ved 30°C, ble platene farget med joddamper. Stivelsen ble farvet fiolett, og de klare sonene representerer områder hvor stivelsen er blitt hydro-lisert.

Figru 10 viser DEAE-sefarose-kromatografering av glukoamylase produsert av den rekombinante gjæren i en 10-liters fermentoer. Figur 11 viser gel elketroforetiske spor av: "BioRad" standard for protein med høy molekylvekt (felt 1), 25 ug av A.awamori glukoamylase-I (felt 2 o- 5), 25 ug A.awamori glukoamylase-II (felt 3 og 6), og 25 ug rekombinant glukoamylase (felt 4 og 7). Feltene 1 til 4 ble farget med "Coomassie Blue"-farge og feltene 5 til 7 med "Perijodsyre Schiffs" farge.

De følgende uttrykk som er brukt i beskrivelsen er definert nedenunder: "DNA-sekvens" henviser til en lineær rekkefølge av nucleotider bunnet sammen med hverandre ved hjelp av fosfordiesterbindinger mellom 3' og 5' -karbonatomene hos tilgrensende pentoser.

"Modifisert DNA-sekevns" henviser til en DNA-sekvens som er endret fra i forhold til den naturlige glukoamylase-DNA-sekvens, slik som ved fjerning av intronene fra, eller modifi-sering av intronene hos den naturlige sekvensen. Eksemplene viser sekvenser som er frie for introner. Sekvenser som i det vesentlige er frie for introner betyr at mer enn ca. 80% er frie.

"Glukoamylase-ensym-aktivitet" henviser til utstrekningen som ensymet i kontakt med en vandig oppslemming av stivelse eller stivelse-hydrolysat bryter ned stivelse til glukose molekyler.

"Enkle eller multiple baser-substitusjoner og utstrykninger, innføringer og ombyttinger" av den grunnleggende modifiserte DNA-sekvens henviser til degenerasjon i DNA-sekvensen hvor kodonene kan være muterte eller deoksyribonucleotidene kan være derivatiserte slik at de inneholder forskjellige baser eller andre elementer, men DNA-sekvensen som er endret på denne måten er fremdeles i stand til, etter transformasjon i en vert, og uttrykke glukoamylaseprotein.

"Glukoamylaseprotein fra sopp" henviser til protein som ikke er avledet fra en bakteriell kilde, men heller fra en sopp-kilde, slik som en stamme av slekten Aspergillus. En modifisert DNA-sekvens som koder for sopp-glukoamylaseprotein til-kjennegir således at DNA-n ikke er avledet fra en bakteriell donor mikroorganisme.

"Ikke-naturlig glukoamylaseprotein" henviser til glukoamylase-protein som ikke er produsert naturlig eller i naturen av mikroorganismen som brukes som vert.

"Ikke-fermenterbar karbonkile som er et substrat for glukoamylase" henviser til substrater for glukoamylaseensymet som verten ikke kan fermentere, slik som stivelse, maltose, isomaltose og andre stivelse-avledede oligosakkarider. Cellulose er ikke et substrat for glukoamylase og følgelig ikke tatt i betraktning i denne definisjonen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en modifisert DNA-sekvens og en ekspressjonsvektor hvor genet er blitt innført med rekombinante DNA-teknikker, som, når den transformeres inn i en vert-organismen, uttrykker glukoamylase. Den modifiserte DNA-sekvensen kan være avledet fra en naturlig, syntetisk eller halvsyntetisk kilde. Fortrinnsvis er den avledet fra en utvalgt naturlig sopp-kilde, som produserer et indusert nivå av glukoamylase som er minst ca. 10 ganger dens ikke-induserte nivå. Det induserte nivået er det som produseres av sopp-arten, når de dyrkes på stivelse, som en eneste eller primær karbonkilde, og det ikke-induserte nivået er det som fåes når soppartene dyrkes på glyserol eller xylose.

Den utvalgte sopp for fremstilling av gluamylase dyrkes passende under glukoamylase-induksjons-betingelser og en poly A RNA-fraksjon fra de dyrkede feltene isoleres og størrelse-fraksjoneres for å påvise en glukoamylase-mRNA tilstede i en påvisbar høyere konsentrasjon enn i mRNA fra ikke-induserte celler. En glukoamylase-cDNA fremstilles ved å kopiere mRNA-n, idet det brukes en revers-transkribtase.

En foretrukket DNA-sekvens som er tatt i betraktning ved den foreliggende oppfinnelse, er sekvensen som koder for sopp-glukoamylasen (amyloglukosidase) fra filamentsopp, fortrinnsvis en art av ordenen Ascomycetes, fortrinnsvis filamentAscomycetes, mer foretrukket fra en Aspergillus-art, og mest foretrukket Aspergillus awamori. Det naturlig forekommende ensymet erholdt fra disse kildene er aktivt til å bryte ned stivelse med høy molekylvekt, og er i stand til å hydrolysere alfa 1-6 forgrenings-bindinger så vel som alfa 1-4 kjede-bindinger. Det produseres og utskilles forholdsvis høye nivåer av ensymeri kulturer av A.awamori dyrket på stivelse, og en rekke 6-karbon-sukkeret, slik som glukose.

Selv om oppfinnelsen vil bli beskrevet ved spesiell henvisning til A.awamori som en kilde for DNA-sekvensen, er det anerkjent at oppfinnelsen gjelder også for andre sopp-arter som har en induserbar glukoamylase, fortrinnsvis arter av Aspergillus-slekten.Særlig syne A-awamori glukoamylase å være lik med,

om ikke identisk med, Aspergillus niger glukoamylase, som det vil sees nedenunder.

Sopp-arten A.awamori ble valgt ut for nærmere undersøkelse. Når denne sopparten dyrkes på stivelse, som en eneste eller primær karbonkilde, produserer den en mengde glukoamylase i kulturmediet, basert på målbar ensym-aktivitet pr. celle tørrvekt, som er ca. 200 ganger større enn celler dyrket på xylose eller glyserol.

Når A.awamori dyrkes på stivelse, produserer og utskiller den minst to fysisk adskillbare glukoamylase ensymer. Et av disse ensymene, henvist til som glukoamylase-I, har en molekylvekt på ca. 74 900 dalton, slik det er rapportert i Referanse 1, side 1,og er glykolisert på noen eller alle serin- og threo-nin-restene i peptidet. Et annet ensym, glukoamylase-II, har en molekylvekt på ca. 54 000 dalton, som rapportert i Referanse 1, se side 1, og er også glykolisert. Det skal bemerkes at størrelsene på det glykoliserte glukoamylaseproteinet som her er gitt, bare er omtrentlige ettersom glykoproteinet er vansk-elige å karakterisere nøyaktig.

Flere beviskjeder antyder at de to A.awamori glukoamylase-ensymene er avledet fra et felles polypeptid. Antistoffer fremstilt mot hver ensymform reagerer immunospesifikt med den andre formen, som det vil sees nedenunder. De to ensymene har identiske aminosyresekvenser i N-fragmentene og inneholder ca. 30 aminosyrer hver. Videre er disse N-endesekvensene identiske til de i glukoamylase I og II- formene fra Aspergillus niger, og de to A.niger glukoamylaseformene synes å være avledet fra et felles polypeptid, som rapportert i litteraturhenvisning 1a, se side 1. Eksperimenter som er ut-ført for å understøtte den foreliggende oppfinnelse, omtalt nedenunder, indikerer at et enkelt A.awamori glukoamylasegen koder for en enkel glukoamylase-polypeptidforløper, som er svært lik med, om ikke identisk med, den som fremstilles av A.niger.

I henhold til et aspekt ved oppfinnelsen, er det oppdaget at celler av en utvalgt soppart, når de dyrkes under betingelser som induserer utskillelsen av glukoamylase i kulturmediet, inneholder poly A RNA som i det vesentlige ikke er påvisbar i celler dyrket under ikke-induserende betingelser. Poly A RNA er i stand til å styre syntesen av et polypeptid som er immunologisk reaktivt med antistoffer fremstilt mot glukoamylasen fra den sopparten, i et cellefritt proteinsyntetiserende system.

Etterson genet ikke uttrykkes i gjærverter med sin intakte reguleringselementer, er det nødvendig å fjerne eller modi-fisere intronene og å endre promoteren slik at gjæren vil transkribere genet, translatere mRNA -n og produsere en aktiv glukoamylase.

Intronene kan fjernes fra glukoamylasegenet enten ved hjelp av fremgangsmåter som er kjente fra litteraturen for fjerning av introner, eller ved hjelp av den enklere fremgangsmåten beskrevet i del B av eksempel 2 nedenunder, ved å bruke bestemte restriksjonsensymer i forskjellige trinn for å fremstille fragmenter som så bindes sammen, og å bruke sted-styrt mutageneser. I mutageneseteknikken fjernes intronet nærmest 5'-enden i glukoamylasegenet ved å bruke en primer, som er homolog til sekvenser på begge sider av intronet, og å knytte denne primeren til en enkjedet DNA-templet i glukoamylase-genomklonen. Primeren brukes så til å starte opp DNA-syntese av den komplementære kjeden ved forlengelse av primeren på

en M13 enkjedet fag-DNA-templet.De resulterende molekyler var dobbeltkjedede, sirkulære molekyler med enkjedede sløyfer som inneholdt intronsekvensen. Når molekylene transformeres inn i celler, kan disse sløyfene bli fjernet og derved fjernes intronet, men selv uten fjerning av DNA vil replikasjonen gi det korrekte resultat. Dersom intronene er tilstede i genet, produseres lite eller ikke noe glukoamylaseensym i en gjær hvor genet uttrykkes.

Etterat intronene er blitt fjernet, kan glukoamylasegenet inn-føres ved hjelp av genetisk rekombinasjon i en DNA-ekpressjonsvektor , fortrinnsvis et plasmid, som så kan brukes til å transformere en mikroorganismevert. Egnede mikroorganismer for dette formålet omfatter bakterier slik som E.coli,

virus og gjær. Mikroorganismeverten som er anvendelig ved foreliggende oppfinnelse må inneholde den hensiktsmessige genetiske forutsetning for transformasjon derav, d.v.s. at ekspressjonsvektoren er forenlig med den genetiske forutsetning til vertstammen. F.eks. mangler vert-mottakergjær-stammene C468 og H18, som er haploide S.cerevisiae laboratorie-stammer anvendt i de etterfølgende eksempler, og illustrerer gjærverter, ^-isopropylmalate dehydrogenase-aktivitet, og suppleres derfor til leusin prototrofi ved innføring i eks-press jonsvektoren av den selekterbare markør 3-idoprpylmala-tet dehydrogenase (LEU 2). Mens ekspressjonsvektoren selv kan være i stand til fenotype selektsjon ved å inneholde en selekterbar markør, trenger den ikke å være i stand til det etter som verten kan velges ut etter gluamylasegenet.

Den bakterieverten som her er foretrukket, er E.coli. Den gjær-vertstammen som her er foretrukket, er fra en art av slekten Saccharomyces, fortrinnsvis S.cerevisiae, S.uvarum, S.carls-bergensis, eller blandinger eller mutanter derav, mer foretrukket S.cerevisiae-stamme og mest foretrukket gjærstamme C468 beskrevet nærmere nedenunder.

DNA-ekspressjon- eller DNA-overføringsvektorer egnet for overføring og replikasjon er blitt beskrevet, f.eks. i litteraturhenvisning 1c og 1d, side 1. Mange av gjærvektorene som nå er i bruk er avledet fra E.coli vektorer, slik som pBR322. Disse litteraturhenvisningene, særlig de to ovenfor nevnte beskriver integrerende transformasjoner hvor mikroorganismeverten transformeres med vektorer uten noe opphav for replikasjon som integreres i vertkromosomet, og bevares og replikeres som en del av det kromosomet. Ved en annen ut-førelsesform av foreliggende oppfinnelse kan verten transformeres ved hjelp av autonom replikasjon hvor vektorene inneholder DNA-segmenter som tjener som opphav for DNA-replikasjonen i vertcellen. Vektorer som inneholder auto-

nomt replikerende segmenter er også beskrevet i lit.henvisning 1e, side 1. Fortrinnsvis er DNA-segmentet som er i stand til å funksjonere som et opphav for replikasjon, fra gjær. To typer slike replikasjonsopphav fra gjær er: en avledet fra et naturlig forekommende gjærplasmid, vanligvis henvist til så som 2 mikron sirkelen, som overfører evnen til å replikere uavhengig av gjær kromosomalt DNA, og en avledet fra det kromosomale re<p>likasjonsopphavet hos gjær, som inneholder en replikasjonsopphavssekvens, betegnet ars (autonom replika-

sjons sekvens), som også gir evne til autonom replikasjon.

Ekspressjonsvektoren ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder nødvendigvis et promoterfragment som virker i mikroorganismer, d.v.s. i verten som anvendes, såvel som den modifiserte DNA-sekvens som koder for sopp-glukoamylaseproteinet. Det protein-kodende segmentet må være orientert i forhold til promoterfragmentet slik at det uttrykkes i en mikroorganismevert på en slik måte at det produseres ikke-naturlig forekom-ende glukoamylase. For bakterier slik som E.coli foretrekkes en trp-promoter. For gjær foretrekkes et gjær-promoterfragment. Blandt mulige gjær-promoterfragmenter for de her nevnte formål er inkludert f.eks. alkohol dehydrogenase (ADH-I), 3-fos-foglyserolkinase (PGK), puruvat kinase (PYK), triose fosfat isomerase (TPI), beta-isopropylmalate dehydrogenase (LEU2), glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (TDH), enolase I (EN01), og lignende. Et foretrukket promoterfragment for de her nevnte formål er fra genet fra enolase I.

Ekspressjonsvektoren ifølge oppfinnelsen inneholder også fortrinnsvis et mikroorganisme-transkribsjonsavslutningssegment etterfulgt av segmentet som koder for proteinet, i en retning for transkribsjon av det kodende segmentet. Eksempler på

mulige transkribsjonssegmenter omfatter 3' segmentene fra de ovenfor nevnte gener. Et foretrukket transkribsjons-avslutnings-segment er fra genet for enolase I.

Et foretrukket vertsystem består av S.cerevisiae gjær-vertstammen C468 transformert med plasmidet pGAC9. Denne foretrukede transformerte gjærstammen ble deponert i American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, november 17., 1983, og fikk betegnelsen ATCC Deponeringsnummer 20 690. Et annet foretrukket vertsystem består av E.coli vert-stamme MH70 transformert med plasmidet pGC 24, en transformant som ble deponert hos ATCC den 16. desemeber 1983, og betegnet ATCC Deponeringsnummer 39 537.

A.awamori glukoamylase-signalsekvensen beskrevet nedenunder er påvist for å virke i gjær slik at glukoamylase fremstilles effektivt og utskilles fra gjær. Denne sekvensen kunne også brukes til utskillelse av andre proteiner fra gjær og fortrinnsvis for utskillelse av proteiner, som vanligvis utskilles av sin naturlige vert. Eksempler på slike proteiner omfatter amylaser, cellulase,protease, interferoner,lymfokiner,insulin og hormoner.

Eksemplene nedenunder tjener til å eksemplifisere utøvelsen av oppfinnelsen. De er gitt kun for illustrerende formål og må ikke betraktes som begrensende for oppfinnelsen på noen måte. Prosenter er basert på vekt med mindre annet er angitt. Alle eksperimenter ble utført i henhold til retningslinjene for oppbevaring, gitt av NIH(USA).

Eksempler.

Alle stammene som er anvendt i eksemplene, og som er blitt deponert i deponeringsinstitusjoner, ble deponert enten hos US Departement og Agricultural Research Service, National Regional Research Laboratories (NRRL) og Peoria,IL 61604 eller hos the American Type Culture Collection (ATCC) og Rockville, MD 20852. Hver stamme deponert hos ATCC har de enkelte ATCC-betegnelsene angitt i eksemplene i overens-stemmelse med en kontrakt mellom ATCC og den som foreliggende patentsøknad er overdratt til, Cetus Corporation. Kontrakten med ATCC sørger for permanent tilgjengelighet til avkommet av disse stammene for almenheten. Etter utgivelsen av US Patentet som beskriver og identifiserer deponeringene, eller etter publiseringene eller etter offentliggjørelsen av en hvilken som helst US eller utenlandsk patentsøknad, uansett hvilken som kommer først, og for tilgjengeligheten til avkommet av disse stammene for en som utpekes av U.S.Commi-ssioner of Patents and Trademarks, som bemyndighet til dette, i henhold til 35 U.S.C. 122 og patentverkets regler som gjelder for dette (inkludert 37 CFR 1.14 med spesiell henvisning til 886 OG 638). Patentsøkeren har sagt seg enig i at dersom noen av disse stammene, som er deponert, skulle dø eller gå tapt, eller bli ødelagt, når de dyrkes under egnede betingelser, vil den øyeblikkelig bli erstattet etter anmerkning om dette, med en levedyktig kultur av den samme stammen. NRRL-deponeringene nevnt i eksemplene og ikke navngitte patentdeponeringer, har vært fritt tilgjengelige for almenheten før innleveringsdatoen for denne søknaden.

I eksemplene er alle deler og prosenter angitt på vektbasis, og alle temperaturer er angitt i °C, med mindre annet er angitt.

Eksempel 1.

Bestemmelse av nucleotidsekvens i glukoamylasegen.

Eksperimentelt ble A.awamori celler dyrket enten på stivelse eller xylose, som en primær kilde for karbon.A.awamori cellene ble erholdt fra NRRL, deponeringsnummer 3112, og er nylig blitt deponert på nytt og betegnet NRRL deponeringsnummer 15271. Soppvekst ble startet opp fra en suspensjon av sporer i vann. Soppcellene ble dyrket i en rystekultur ved 30°C,

i 2-5 dager i et standard dyrkingsmedium (1% vekt/volum gjær-ekstrakt, 0,01 M ammonium sulfat, 0,024 M kalium fosfat buffer, pH 7,0) sammen med 5% wekt/volum av enten stivelse eller xylose. Som angitt ovenfor, produserte celler dyrket på stivelse, en mengde glukoamylase i dyrkingsmediet som, basert på en målbar ensymaktivitet pr. celle - tørrvekt, som var ca. 200 ganger mer enn hos celler dyrket på xylose.

Alt cellulært RNA ble isolert fra soppkulturene ved hjelp av en guanidium thiocyanate/CsC1-fremgangsmåte, vesentlig som beskrevet i litteraturhenvisning 2, se side 1. I korte trekk ble mycelier presset tørre i osteklede, nedfrosset i flytende nitrogen og malt til et pulver i en morter og støter i flytende nitrogen. Cellepulveret ble homogenisert i en guanidium thiocyanatoppløsning som inneholdt 10 mM adenosin: VOSO^kompleks. Etter sentrifugering for å pelletere cellulære rester, ble CSC1 tilsatt til homogenatet og RNA-n ble utpelletert gjennom et underlag av CsCl ved sentrifugering med høy hastighet.

Poly-A-holdig RNA (poly A RNA) ble isolert fra den øvrige RNA ved to passeringer over oligo-dT cellulose, på vanlig måte,

og poly A RNA ble størrelsefraksjonert ved hjelp av agarose gel elektroforese i henhold til standard fremgangsmåter.

Den induserte poly A RNA ble ekstrahert fra agarose gelen i det vesentlige som beskrevet i litteraturhenvisning 3, side 1. I korte trekk ble gelen smeltet og deretter nedfrosset for å avgi RNA-n i oppløsning. Den størknede agarose ble fjernet ved sentrifugering. Den ekstraherte poly A RNA ble ekstrahert med fenol og utfelt med etanol.

For å undersøke translasjonsproduktene av den induserte poly A RNA i et cellefritt proteinsyntetiserende system, ble det fremstilt antistoffer mot A.awamori glukoamylase. Glukoamylase -I og -II fra A.awamori ble erholdt fra filtratet av en kultur av A.awamori-celler dyrket under betingelser for gluko-amylaseinduksjon. Filtratet ble fraksjonert ved hjelp av jonedeterkromatografi under anvendelse av en dietylaminoetyl-cellulose-kolonne. Eluering med en pH-gradient som varierte fra pH 8,0 til pH 3,0 ga to protein-topper, som oppviste glukoamylaseaktivitet. Ensymet som ble eluert ved den lavere pH omfattet det større glukoamylase-I, og den andre toppen, glukoamylase-II. Gel elektroforese viste at glukoamylase-II var ren, men at glukoamylase-I ikke var det. Glukoamylase-I ble renset videre ved molekylsiktkromatografi på den kolonne med kryssbundet dextran, "Sepharcryl S-200". Det ble obser-vert to topper, en av dem inneholdt glukoamylase-I, som ble påvist å være ren. For begge ensymformene ble ensymrenhet fastslått ved hjelp av polyakrylamidgel elektroforese under betingelser uten detergent, og ved hjelp av natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid-gel elektroforese (SDS-PAGE).

De to rensede glukoamylaseformene ble brukt hver for seg til

å fremstille anti-glukoamylase-antistoffer i kaniner. Hver av de to fremstilte immunoglobulin G(IgG)-antistoffer-frak-

sjonene var i stand til å nøytralisere glukoamylase-aktiviteten hos begge glukoamylaseformene. Videre indikerte Ouchterlony-analyse at de to antistoff-fraksjonene med de to ensymformene at hvert antistoff reagerer immunospesifikt ved begge ensymformene .

Poly A RNA fra indusert og ikke-indusert A.awamori ble brukt til å styre syntesen av radioaktiv-metionin-merkede polypep-tider i et kanin-retikulosit-lysatsett erholdt fra New England Nuclear Co., Boston, Mass., og solgt som "Reticulocyte Lysate/ Methionine L-( 35S)-Translation System". Lit.henvisningen 4 og 5, side 1, beskriver typiske retikulocyt lysat systemer. Etter en bestemt reaksjonsperiode ble alikoter av lysatet fjernet og analysert, enten før eller etter reaksjon med anti-glucoamylase-antistoff eller normal kanin-immunoglobulin G (IgG), med SDS-PAGE. De immunoreaktive produktene ble utfelt i det vesentlige i henhold til fremgangsmåten beskrevet i lit.henvisning '6, side 1.

For å bestemme den molkulære basis for akkumulering av glukoamylaseprotein i stivelse-dyrkede, men ikke xylose-dyrkede, kulturer av A.awamori, ble nivåer for glukoamylase-mRNA undersøkt. All cellulær mRNA ble isolert og brukt for å

styre syntesen av A.awamori protein i et kanin-retikulosyt lysatsystem.Translasjonsproduktene ble immunoutfelt for å bruke anti-glukoamylase-antistoffer fra kanin (felt 1, xylose-dyrkede celler; felt 3 stivelse-dyrkede celler) eller normalt kanin-antistoff (felt 2, xylose-dyrkede celler; felt 4, stivelse-dyrkede celler). Resultatene er vist i fig. 1 og beviser nærværet av translaterbar glukoamylase-mRNA i et RNA fra stivelse-dyrkede celler. Derimot ble det ikke påvist noen glykoamylase-mRNA i xylose-dyrkede celler. Dette stemmer over-ens med den 200 gangers forskjellen i glukoamylaseprotein funnet i supernatanter fra kulturer med disse cellene. Følge-lig synes akkumuleringen av glukoamylaseprotein i stivelse-dyrkede kulturer å skyldes en sammenlignbar økning i translaterbar glukoamylase-mRNA.

MeHgOH-agarose-gel elektroforese av mRNA fra stivelse-dyrkede celler avslørte en hoved-mRNA med 2,2 kilobaser (indikert ved en pil), som var fraværende i mRNA fra xylose-dyrkede celler (figur 2A). Det syntes sannsynlig at denne dominerende "induserte" mRNA ble utgjort av mRNA for den sterkt uttrykte, "induserte" glukoamylase. For å identifisere den "induserte" mRNA, ble båndet for omtrent 2,2 kilobase mRNA eluert fra en gel, og translatert i kanin-retikulosyt lysate systemet. Immunoutfelling av proteinproduktet med antiglukoamylase-antistoff fra kanin, beviste nærværet av mRNA som koder for glukoamylase innenfor det omtrent 2,2 kilobase "induserte" mRNA-båndet (Fig. 2B). 1 henhold til et aspekt ved oppfinnelsen, ble isolert glukoamylase-mRNA fra den utvalgte sopparten brukt til å produsere en glukoamylase-cDNA ved hjelp omvendt transkribsjon av mRNA-n. Ekspremitellt ble indusert poly A RNA fra A.awamori forhånds-behnadlet med 10 mM MeHgOH for å denaturere RNA-n, og deretter innført i en reaksjon som innehold oligo-dT som en primer, og 2 mM adenosin: VOSO^som en inhibitor for RNAse. Det henvises til lit.henvisning 7,side 1, for en omtale av denne generelle teknikken. Etter cDNA-synteser ble poly A RNA ødelagt ved behandling med NaOH. Den syntetiserte cDNA ble størrelsefrak-sjonert ved hjelp av gel elektroforese for å adskille den fullstendige cDNA fra ufullstendig dannede fragmenter. Et typisk gel elektroforetisk spor for cDNA-fraksjonen viste et enkelt påvisbart båndi størrelseområde for omtrent 2,2 kilobaser .

Den induserte glukoamylase-mRNA,og cDNA-n produsert fra denne, ble merket radioaktivt for å gi sonder for identifisering av genom-DNA-fragmenter, som inneholder hele eller deler av det homologe glukoamylasegenet, cDNA-n kan lett merkes ved å ut-føre syntesen av den i nærvær av radioaktivt merkede nucleotider.

Den grunnleggende fremgangsmåten som brukes for radioaktiv merking av mRNA er omtalt i lit.henv.8, se side 1. I et eksempel ble induserte poly A RNA fra A.awamori delvis brutt ned ved å bruke natrium hydroksyd til å generere fragmenter som inneholder 5<1->0H grupper. Disse fragmentene ble deretter fosforylert med radioaktivt fosfat ( 32p)-ATP), ved å bruke

32

en polynucleotid kinase. De p-merkede RNA-fragmentene for-delte seg over hele lengden av den isolerte RNA, og er følge-lig fordelaktig for bruk som sonder for genom-DNA-fragmenter som inneholder endedeler av glukoamylasegenet.

All genom-DNA isolert fra A.awamori ble fullstendig brutt ned med hver av en rekke restriksjons endonucleaser. Fragmentene ble størrelsefraksjonert ved hjelp av gel ekeltroforese og hybridisert til en av de ovenfor nevnte RNA- eller cDNA-sonder ved hjelp av "Southern blot"-fremgangsmåter (lit.henv.9,side 1). Detaljer ved denne fremgangsmåten finnes generellt i lit.henv. 5, se side 1, på side 387. I korte trekk ble det utført et forhybridiseringstrinn ved 42°C. i 24 timer, under anvendelse av et fem gangers konsentrat av standard oppløsning av koksalt og sitrat (0,15 M natriumklorid, 0,015 M trinatrium sitrat). Dette ble etterfulgt av et hybridiseringstrinn utført ved 42°C. i 24 timer, under anvendelse av et to gangers konsentrat av standard oppløsningen av koksalt og sitrat. I undersøkelsene som omfattet genom-DNA fra A.awamori, frembrakte flere av de anvendte endonucleasene, deriblandt Hindlll,Xhol,Bell, og Pvul, bare et fragment som hybridiserte til de ovenfor nevnte A.awamori merkede RNA- eller cDNA-sondene. Noen av de enkelte genfragmentene er i det samme størrelseområdet som RNA- over-settelsen, noe som sterkt indikerer at A.awamori inneholder bare et gen som koder for glukoamylase-polypeptidet.EcoRI frembrakte et 3,4 kilobase stort fragment som hybridiserte til den merkede cDNA.

A.awamori genom-DNA-fragmentene produsert ved nedbryting med EcoRI ble ved hjelp av vanlige kjente teknikker skjøtet inn

i en lambda Charon 4A fagvektor. Samlingen av EcoRI-fragmenter ble gjennomsøkt med hensyn på rekombinanter som hybridiserte til A.awamori glukoamylase-cDNA. Hybridiserende plaks ble

renset og alle inneholdt et felles 3,4 kilobaser stort EcoRI-fragment, som hybridiserte til glukoamlyse-cDNA-sonde.

Dette 3,4 kilobase EcoRI-fragmentet ble så subkloned inn

i EcoRI-setet hos et pACYC184 plasmid (ATCC deponerings-

nummer 37 033), hvilket ga et rekombinant plasmid som her er betegnet som pGAR1. En prøve av E.coli K12 stamme MM294 transformert med pGAR1 ble deponert iAmerican Type Culture Collection, 2.desember 1983, og har fått ATCC nummer 39 527. Påfølg-ende samlinger ble gjennomsøkt ved å bruke pGAR1 som sonde. Omtrent 20 kilobaser av A.awamori genom-DNA som omgir gluko-amy lasegenet ble isolert fra EcoRI,Hindlll og Bglll samlinger. Et sammensatt restriksjonskart hvor dette 20 kilobase-området er vist i figur 3; EcoRI-fragment innskuddet er forstørret. Beliggenheten av spaltingsstedene til de angitte restriksjons endonucleasene ble bestemt ved å bryte ned plasmidene med utvalgte kombinasjoner av endonucleasene, og størrelsefrak-sjonere de erholdte fragmentene i henhold til kjente fremgangsmåter. De fem kraftige rektangelene angir sekvensbestemte proteinkodende områder i glukoamylasegenet. Transkribsjons-retningen for mRNA-n er angitt med 5'- til 3' linjen.

Plasmidet pGAR1 ble stadfestet å inneholde glukoamylasegen-sekvenser i kraft av dets evne til å hybridisere til og velge A.awamori glukoamylase-mRNA-sekvenser. pGARi DNA ble mobili-sert på nitrocellulose og hybridisert til komplett A.awamori mRNA. Den utvalgte mRNA ble oversatt in vitro, og produktene ble identifisert ved hjelp av immunoutfelling med anti-glukoamylase-antistoff fra kanin. Resultatene, vist i figur 4, bekrefter identifikasjonen av pGARi og følgelig av den omtrent 2,2 kilobaser "induserte" mRNA, som kodende for glukoamylase.

I figur 4 ble komplett A.awamori mRNA (felt 1) og mRNA isolert i kraft av hybridisering til pGARi DNA (felt 2)oversatt in vitro og proteinproduktene er vist. Proteinprodukter i felt 2 ble immunoutfellt ved å bruke antiglukoamylase-antistoff fra kanin (felt 3) eller normalt kanin antistoff (felt 4). Subklon pGARi som inneholder A.awamori glukoamylasegenet ble praktisk talt fullstendig brutt ned med forskjellige restriksjonsensymer hvis sekvenser er omfattet innenfor EcoRI-fragmentet (d.v.s. de i figur 6), og flere av fragmenetene ble subklonet inn i M13 vektorene M13mp8 og M13mp9. Disse bakteri-ofage vektorene er tilgjengelige fra Bethesda Research Laboratories, P.O. Box 6009, Gaithersburg,MD 20877.

Fragmentene fra glukoamylase-genomområdet subklonet inn i vektorene Ml3mp8 og Ml3mp9 ble sekvensert ved hjelp av dide-oksynucleotid- kjede avslutningsmetoden beskrevet i lit.henv. 10,og 11, se side 1. Deler av sekvensen ble stadfestet ved hjelp av Maxam-Gilbert-sekvenseringsteknikken (lit.henv.12, side 1). Hele sekvensen til det 3,4 kilobase EcoRI-fragment er vist i tabell I nedenunder.

Den erholdte nucleotid sekvensen ble sammenlignet med områdene i kjent aminosyresekvens A.niger (Lit-henv. 1a og 1b, se side 1.) og A.awamori glukoamylase, i en datamaskinprogramert til-pasningsoperasjon. Tilpasningsoperasjonen undersøkte nucleotid-sekvensen i hver av de seks mulige avlesningsrammene for kodon svarende til den gitte aminosyresekvens. Tilpasningsoperasjonen ga nesten fullstendig overenstemmelse mellom kodende områder i glukoamylasegenet og områdene i et kjent amino syresekvens i glukoamylase fra A.awamori. Aminosyresekvensen for et av de indre peptidene i A.niger (figur 7 i lit.henv.

1a, se side 1)ble funnet ikke å bli sammenhengende kodet for av nuclein syre sekvensen (nucleotides 753-895 i tabell I).

En mellomliggende sekvens med 55 nucleotider ble antatt å avbryte dette proteinkodende området. Intronene i glukoamylasegenet er i den nedre delen. Aminosyresekvensen til glukoamylase-

genet er angitt under de tilsvarende nucleotider, og er nummerert under nucleotidsekvensnummerene til høyre. Aminosyrene -24 til -1 (alle store bokstaver) angir signalsekvensen i preglukoamylaseproteinet.

For å bekrefte identifiseringen av denne avbrytende sekvensen som ligger i mellom, og for å identifisere andre sekvenser som ligger i mellom innefor glukoamylasegenet, ble cDNA-sekvense-

ne avledet fra glukoamylase-mRNA klonet molekulært. Dobbelt-kjedet cDNA ble fremstilt fra mRNA fra stivelsedyrket A.

awamori og en cDNA-samling ble fremstilt i pBR322, også tilgjengelig fra Bethe&da Research Laboratories, som beskrevet ovenfor. Det ble identifisert seksten glukoamylase cDNA-holdige plasmider ved å bruke pGARi-sonde; det største plasmidet,

p24A2, som ble deponert hos National Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, USA, 7. desember 1983 og betegnet NRRL Nr, B-14217, inneholdt 1,8 kilobaser med sekvens avledet fra 3<1->enden i den omtrent 2,2 kilobase stor glukoamylase-

mRNA. Nucleotid-sekvensen til glukoamylase-cDNA i p24A2 ble bestemt og funnet å strekke seg over genom-sekvesen, vist i tabell I, fra nucleotid 501 til polyadenylerings-stedet i posisjon 2489-2491. ( den nøyaktige polyadenyleringstedet kan ikke bestemmes entydig på grunn av nærværet av to A-rester i nucleotidene 2490-2491). Sammenligning av nucleotidsekvens-

en til det molekulært klonede glukoamylasegenet med den til glukoamylase-mRNA, bestemt ut fra molekylært klonet glukoamylase cDNA, og med glukoamylase-aminosyre-sekvens, har avslørt nærværet av fire mellomliggende sekvenser (introner) i A.awamori glukoamylasegenet. ( sammenknyttingspunktet til den første mellomliggende sekvens, ble utledet fra ufullstendige aminosyresekvensdataer for restene 43-49 hos A.awamori gluko-

amylase-I). De raellemliggende sekvensene var korte ( varier-ende fra 55 til 75 base par) og var alle lokalisert innenfor proteinkodende sekvenser. Disse sekvensene som ligger opp til sammenknytingspunktene for den mellomliggende sekvens i glukoamylasegenet, ble sammenlignet med samsvarende sammen-skjøtende sekvenser fra eucaryoter generelt (Lit.henv.13,se side 1), og spesielt fra S.cerevisiae (lit.henv.14, se side 1). Sammenføyninger innenfor glukoamylasegenet er nær overens-stemmelse med de gjengse frekvensene i de 5' og 3' mellomliggende sekvensender. Sekvenser beslektet med den gjengse sekvensen TACTAACA postulert av Langfor, et al. i lit.henv.15, se side 1, som kreves for sammenknytting av S.cerevisiae, finnes nær 3<1->enden i alle mellomliggende sekvenser i glukoamylase .

5<1->enden i glukoamylase-nRNA ble bestemt ved å bruke et syntetisk oligonucleotid til å starte opp reverstranskribtase-syntese fra mRNA-templetten. Det ble syntetisert 4 hovedprod-ukter av primer-forlengelse ved å bruke pentadekameren 5'GCGAGTAGAGATCGG3' som er komplementær til sekvenser innenfor det signalpeptid-kodenåe området nær 5<1->enden i glukoamylase-mRNA, slik som angitt i figur 5.

Det korte båndet for dublettene fortolkes som å representere den ufullstendig utvidede formel av det lange båndet. For å undersøke mulige virkninger av RNA<1>s sekundærstrukturer på dette sporet, var det foretrukket med primer-forlengelse ved 42 og 50°C. Produktene av primer-forlengelse ved 42°C.,(felt 1) og 50°C.,(felt 2) er vist på en gel for sekvensbestemmelse beskrevet i lit.henv.16, se side 1, parallellt med m13/di-deoksynucleotid-sekvenseringsreaksjoner i dette området, ved å bruke den identiske pentadecamer-primeren. Sekvensen vist i figur 5 representerer glukoamylase-mRNA-sekvensen og er komplementær ved den som avleses fra de viste sekvenserings-reaksjonene. Sporene for primer-forlengelser var uforandret, noe som understøtter konklusjonen at fire forskjellige 5'-ender foreligger innenfor populasjonen av glukoamylase-mRNA. Primerforlengelsesreaksjoner utført i nærvær av dideoksynycleo-tide bekreftet likheten med koli hos genom-og mRNA-sekvenser i dette området. Produktene av primerforlengelsen kartlegges til T-rester, i posisjonene -71, -66, -59 og -52 fra stedet for translasjoninitiering, og er angitt i tabell I. I den utstrekning reverstranskribtase er i stand til å kopiere det eller de ytterste endenucleotid(er) i mRNA, er 5'-endene i glukoamylase-mRNA-er lokalisert til disse fire områdene. DNA-sekvensen 5'

i området for transkribsjoninitiering ble funnet og inneholde sekvenser som er homologe med gjengse sekvenser som tidligere er påvist å være involvert i transkribsjonsinitiering med RNA-polymerase II.

Tabell IIA viser nucleotidsekvensen som koder for det ferdige glukoamylasepeptidet. Nucleotidene 206 til 277 kcder for en signalsekvensen for A.awamori glukoamylase. Slik det brukes i beskrivelsen og i kravene, henviser uttrykket "signalsekvens" generelt til en sekvens av aminosyrer som er ansvarlige for å initiere "utførsel"

av en proteinkjede. Når en signalsekvens først har initi-ert "utførsel" av en voksende proteinkjede, spaltes den fra det ferdige proteinet på et bestemt sted.Uttrykket omfatter også forløpersekvenser eller forløperpeptider. Den foretruk-ne signalsekvens er her den utledede signalsekvensen fra A.

Awamori glukoamylasegenet gjengitt i tabell IIB

Eksempel 2:

Ekspressjon av glukoamylasegen i gjær.

A. Konstruksjon av HindIII-" kassett" av genom- glukoamylasegen.

En fremgangsmåte for å uttrykke gener ved høye nivåer i gjær omfatter å konstruere vektorer som inneholder promoter- og terminatorområdene for en enolase I fra gjær (Lit.henv.16,se side 1). Enolasesegmentene ble tidligere utformet slik at promoteren og terminatoren var adskilt ved hjelp av et eneste Hindlll-sete.

Plasmid pAC1 (10,67 kilobase) er en E.coli/gjær-skyttel-vektor, som er i stand til autonom replikasjon i både E.coli og gjær-stammer. I E.coli og beslektede arter gir plasmidet resistens mot Ø-laktam antibiotikumet ampicillin og beslektede forbindelser, som et resultat av synteser av TEM type I 3-laktamase. Videre bærer plasmidet gjærgenet LEU2 som uttrykkes både i stammer av E.coli og S.cerevisiae.Nærværet av plasmidet enten i stammer av E.coli eller S.cerevisiae reverserer følgelig et vekstkrav for leusin som skyldes tap av 3-isopropylmalatdehydrogenaseaktivitet.

Plasmid pAC1 er satt sammen av de følgende DNA-segmenter-Nummerering starter ved EcoRI-setet til promoterfragmentet for enolase I i fortsetter i retning med urviseren. Koordi-nater 0 til 725 omfatter et 725 base par EcoRi til Hindlll DNA-fragment avledet fra et tilsvarende fragment i plasmidet

p eno 46 (Lit.henv.16, se side 1), som inneholder DNA fra det ikke-oversatte 5<1->området i S.cerevisiae Enol-genet. Dette fragmentet er blitt modifisert i området like før initieringskodonet (ATG) i enolasegenet for å frembringe et Hindlll sete. Nærmere bestemt ble sekvensen endred fra CACTAAATCAAAATG til CACGGTCGAGCAAGCTT (ATG). Koordinatene 725 til 2281 omfatter det 1,55 kilobaser stdre Hindlll til Bglll DNA-fragment fra det ikke-oversatte 3'-området i S.cerevisiae Enol-genet og ble opprinnelig erholdt fra plasmidet peno 46 (lit.henv.16, se side 1). Koordinatene 2282 til 2557 omfatter et 275 basepar stort DNA-fragment fra plasmidet pBR322 (lit.henv.16a,se side 1)mellom gjenkjenningssetene BamHI og Sali (pBR322-koordinatene 375 til 650). Koordinatene 2558 til 4773 omfatter det 2,22 kilobaser store Xhol til Sali DNA-fragmentet fra S.cerevisiae som koder for LEU2-genproduktet, 6-isopropylmalatet dehydrogenase. Plasmidet YEp13 (Lit.henv.16b,se side 1) tilveiebrakt ved en bekvem kilde for det ønskede DNA-fragmentet med 2215 basepar. Koordinatene 4474 til 8528 omfatter et 3,75 kilobase stort DNA-fragment, som gir anledning til autonom replikasjon av plasmidet AC1 i gjærstammer. Dette området koder for en del av

gjærplasmidet 2u og ble avledet fra plasmidet pDB248 (lit. henv. 16c, se side 1) . Nedbryting av plasmidet pDB248 med ■ •. ensymene EcoRI og Sali frigjorde det ønskede 3,75 kilobase store DNA-fragmentet som er innlemmet i plasmidet AC1. Coordinatene 8529 til 10672 omfatter DNA-sekvenser som gir anledning til autonom replikasjon i E.coli vertstammer og gir ampicillin resistens. Detønskede DNA-fragmentet med 2143 basepar ble erholdt fra E.coli plasmidet pBR322 som et Tthini til EcoRI DNA-fragment (henholdsvis pBR322 koordinatene2218 og 4360). En prøve av E.coli K12 stamme MM294 transformert med pAC1 ble deponert i American Type Culture Collection 2.desember J\ 983, og har fått deponerings-betegnelsen ATCC Nr. 39 532.

Mens glukoamylasegenet ikke har et passende restriksjonssete like foran dets initieringskodon (ATG) som er nyttig for kloning i vektorer, kan det ha en enkel basepar-endring 32, basepar ovenfor ATG som gir et eneste Hindlll-sete, og muliggjør bruk av enolase promoteren for initiering av transkribsjon. Sted-spesifikk mutagenesis ble brukt for å oppnå den ønskede mutasjon. Et heksadekamer oligonucleotid som er komplementært til området som omgir det ønskede Hindlll-setet og som inneholder den hensiktsmessige feil, ble brukt til å starte opp DNA-synteser på en enkjedet Ml3-templett av glukoamylasegenet. Sekvensen til den anvendte primeren var: GAGCCGAAGCTTCATC, med feilene understreket. En annen feil ble innlemmet i primeren for å hjelpe til ved utsorteringen av korrekte kloner ved å hybridisere aktuelle plaks med det samme oligonnucleotidet som ble brukt til primer-forlengelse, etter radioaktiv merking av det sistnevnte.

Et pikomol av en enkjedet DNA-fag, M13mp9 som inneholder et 2,3 kilobase stort glukoamylasegenfragment (fra EcoRI til Sali), ble omsatt med 10 pikomol av primeren i en 15 pl reaksjonsblanding som også inneholdt 20 mM Tris pH 7,9, 20

mM MgCl2, 100 nm NaC1, og 20 mM 8-merkaptoetanol. Blandingen ble oppvarmet til 67°C, inkubert ved 37°C, i 30 minutter, og deretter plassert på is.

Til reaksjonsblandingen ovenforble det tilsatt 1 ul av hvert deoksynucleotid trifosfat ved 10 mM, til en sluttkonsentrasjon på 500 uM. Fem enheter E.coli Klenow-fragment av DNA-polymerase I (0,5 ul)ble så tilsatt og utvidelsesreaksjonen ble anbragt på is i 30 minutter. Oppstarting på is minimal-iserer nedbryting av primere med 3' - 5<1->eksonuclease og derav følgende feilkorrigering. Etter 30 minutter på is, fikk reaksjonen fortsette ved 37°C i 2 timer, og deretter ble den inaktivert ved oppvarming ved 67°C i 10 minutter.

Legg merke til at primeren ikke ble kinasebehandlet og det ble ikke brukt noe ligase i motsetning til ved andre publiserte fremgangsmåter. JM103 kompetente celler ble transformert med 1 ul av reaksjonsbaldningen og enten 5 ul eller 50 pl ble utplatet.

Den anvendte heksameren for priming ble kinasebehandlet med merket 32 p-ATP til en spesifikk aktivitet på 3 x 10 7cpm/ug. Nitrocellulosefiltere ble brukt til å binde fag-DNA fra plakken ved direkte oppsuging, og disse filterene ble denaturert, nøytralisert og vasket. Etter oppvarming i 2 timer ved 80°C, ble filterene trehybridisert i 3 timer ved 45°C. , i 25 ml i en oppløsning av 9 M NaCl og 0,9 M natriumsitrat, natrium dodecylsulfat, 50 ml av en oppløsning av 0,5 g serumalbumin fra okse, 0,5 g Ficoll 400 (en karbohydrat polymer) og 0,5 g polyvinylpyrrolidin, og 505u'g/mlgjær-RNA. Etter prehybridiserin^e det tilsatt 1,5 x 10 cpm/ml av

et kinasebehandlet primer, og hybridisering fikk fortsette over natten ved 45°C. Neste dag ble filtrene vasket 2 ganger, 5 minutter hver i en oppløsning av 9 M NaCl og 0,9 M natrium sitrat ved omtrent 5°C, (for å fjerne ikke-radioaktivt materiale som ikke var spesifikt bundet), deretter en gang ved 45°C, i 5 minutter (for å fjerne en sondehybridisert til ikke-mutant fag-DNA). Filtere ble lufttørret, plassert på "Kodak XAR" (hurtig) film med en forstørrelsesraster og eksponert over natten ved -70°C.

En mutant klon bland flere tusen plaks ble oppdaget i den første utsorteringsrunden. Derpå følgende nedbrytning med restriksjonsensym av dette klonet bekreftetinnføringen av Hindlll-setet foran glukoamylasegenet.

I det neste trinnet ble det skapt et Hindlll-sete ved 3' enden av glukoamylasegenet. En klon med det fremstilt Hindlll-setet nær 5' enden av genet ble kuttet med Ncol, det ujevne ender ble omdannet til butte ender ved ensymatisk utbedring under anvendelse av Klenow fragment av E.coli DNA polymerase-I, og det ble kuttet med EcoRI. Figur 7 viser et restriksjonskart for området. Denne fremgangsmåte ga ett fragment som inneholdt glukoamylasegenet og hadde en ujevn EcoRI ende før 5' enden i genet og en butt ende etter 3' enden i genet. Dette fragmentet ble klonet inn i et polylinker område i plasmidet pUC8, som var tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories, for å plassere en Hindlll-sete innenfor 20 nucleotider av 3'enden i fragmentet for å produsere en Hindlll-"kassett".

B. Konstruksjon av cDNA- klon av glukoamylasegenet i full

lengde, som mangler introner.

Den lengste fremstilte og isolerte cDNA klonen, som hadde områder som er homologe med genomklonen av glukoamylasegenet, p24A2, svarer i sekvens til genomklonen fra nucleotidene 501 til 2490, minus nucleotidene som svarer til introner angitt i nedre del i tabell I. Denne klonen er fremdeles flere hundre nucleotider kortere enn nødvendig for en cDNAklon. Kopi av genet i full lengde ble gjennomført i flere trinn. Genomklonen med Hindlll sete nær 5' enden i genet ble kuttet med EcoRI og Avall, og dette fragmentet ble renset. Den lengste cDNA klonen beskrevet ovenfor ble brutt ned med Avall og Pstl, og det lille Avall til Pstl fragmentet ble renset. Fagvektoren M13mp11, som er tilgjengelig fra P-L-Biochemicals,1037 W.McKinley Ave.,Milwaukee, WI 53205, ble brutt ned med EcoRI og Pstl, og det store vektorfragmentet ble renset fra det lille polylinkerfragmentet. Disse tre fragmentene ble ligert sammen slik at det ble fremstilt en M13mp11 vektor som inneholdt EcoRI og Pstl-området av genom klonet, men som nå manglet det andre intronet.

Den lengste cDNAklonen ble så kuttet Pstl ved å bruke betingelser gitt av fabrikanten av restriksjonsensymet, og det store Pstlfragmentet ble isolert. M13mp11 vektoren beskrevet ovenfor ble kuttet med Pstl, og det store Pstlfragmentet fra cDNA klonen ble ligert inn på dette stedet. Klonene generert fra denne ligeringen ble gjennomsøkt for å identifisere klonen med Pstl fragmentet innført i den korrekte orienteringen. Klonen isolert fra dette trinn hadde genom-sekvens fra EcoRI til Avall (inneholdt det første intronet og det nye 5<1>Hindlllsetet) og cDNAsekvensen fra Avall til Pstl-setet på den andre siden av området for poly-A-hale.

Det gjenværende intronet ved 51 enden av genet ble fjernet ved stedrettet mutagenese under anvendelse av et nonakosamer-oligonucleotid for å dekke intronområdet. Nonakosameren,

som hadde homologi med 15 basepar på 5' siden av intronet og 14 basepar på 3' siden, hadde sekvensen:

Ved frmgangsmåten for å utføre stedrettet mutagenese, ble et pikomol av et enkjedet DNA-fag derivat betegnet som M13mp9 (som er kommersielt tilgjengelig) og som inneholdt et 2,3 kilobase glukoamylasegehfragment (fra EcoRI til Sali), knyttet sammen med 10 pikomol primer i 15 p. 1 som inneholdt 6 mm tris(hydroksymetyl)aminometan (heretter Tris) ved pH 7,9, 6 mm MgC^ og 100 mM NaCl. Blandingen ble oppvarmet til 67°C, inkubert ved 37°C, i 30 minutter, og deretter plassert på is. Ved denne temperaturen kan begge halvdelene av nonakoso-meren knyttes til sitt komplement på templetten uten den andre, hvilket lar den rette sløyfen dannes.

Til den ovenfor nevnte sammenknyttingsblandingen ble et ul

av hvert deoksynucleotid trifosfat ved 10 mM tilsatt, til en sluttkonsentrasjon på 500 pm. Fem enheter E.coli Klenow fragment av DNA polymerase I (0,5 ul) ble så tilsatt og forlengelsesreaksjonen fikk stå på is i 30 minutter for å minimalisere 3' - 5'- eksonucleasenedbryting av primeren. Etter 30 minutter på is, fikk reaksjonen fortsette ved 37°C, 1 2 timer, og deretter ble den inaktivert ved oppvarming ved 67°C, i 10 minutter.

Ved fremgangsmåten som her er anvendt ble primeren ikke kinasebehandlet og ingen ligase ble anvendt i motsetning til ved andre publiserte fremgangsmåter.JM 103 kompetente celler ble transformert med 1 ul av reaksjonsblandingen og enten 5 ul eller 50 pl ble utplated.(JM103 er en E.coli stamme som føres av Bethesda Research Laboratories, Inc.,Gaithers-burg, MD 20877.

Nonakosameren brukt til priming var kinasebehandlet med merket 32 p-ATP til en spesifikk aktivitet på 3 x 10 7cpm/ug. Det ble anvendt nitrocellulosefiltere for å binde fag-DNA

fra plakkene ved direkte oppsuging, og disse filtrene ble denaturert, nøytralisert og vasket. Etter oppvarming i 2 timer ved 80°C., ble filtrene prehybridisiert i 3 timer ved 55°C i 25 ml av en oppløsning av 9 M NaCl, o,9 M natriumsitrat, 0,1% natrium dodesyl sulfat, 50 ml av en oppløsning som inneholdt 0,5 g okseserumalbumin, 0,5 g Ficoll 400

(som er en karbohydrat polymer som kan fåes fra Pharmacia Fine Chemicals) og 0,5 g polyvinylpyrrolidon, og til slutt 50 ug/ml gjær-RNA. Etter prehybridiseringen ble det tilsatt 1,5 x 10^ cpm/ml kinasebehandlet primer, og hybridiseringen fikk fortsette over natten ved 55°C.

Den neste dagen ble filtrerene vasket to ganger i fem minutter hver i en oppløsning av 9 M NaCl og 0,9 M natrium citrat ved omtrent 5°C.,(for å fjerne ikke-spesifikt bundet radio aktivt materiale), og deretter en gang ved 55°C, i fem minutter (for å fjerne sonder hybridisert til ikke-mutant fagDNA). Filteret ble lufttrøket og plassert på Kodak XAR (hurtig) film med en forstørrelsesraster og eksponert over natten ved -70°C.

Frekvensen av oppnådde positive resultater var ca 4%. Positive kandidat-plaks ble ytterligere undersøkt ved å fremstille minipreparater og bryte dem ned for å se om en størrelsereduksjon oppsto på grunn av fjerning av intronet med 75 basepar. Sekvensering av et av positivene avslørte at intronet var blitt nøyaktig fjernet.

I sluttrinnet ble denne plasmidvektoren brutt ned med EcoRI og BamHI, og fragmentet ble renset og brukt til å erstatte fragmentet EcoRI til BamHI i den genomiske Hindlll "kassett"-vektoren, beskrevet under avsnitt A ovenfor. Resultatet er en cDNA Hindlll "kassett", som vil det normale polyadenyler-ingsignalet i 3' enden av klonen, men mangler alle fire intronene . C. Gjærstammer transformert med ekspressjonsvektor fra gjær.

Den intronholdige Hindlll "kassett" av det genomiske glukoamylasegenet som beskrevet i avsnitt A ovenfor, ble skåret ut og innført i et gjær-ekpressjonsvektorplasmid pAV1 for å fremstille et plasmid,betegnet som PGAC9, hvis kart er gjengitt i figur 7. En prøve av E.coli K12stamme MM294 transformert med pGC21 ble deponert i NRRL 7.desember 1983, og har fått betegnelsen NRRL nr.B-14215. En prøve av E.coli K12 stamme MM294 transformert med pAC1 ble deponert i American Type Culture Collection 2. desemeber 1983, og har fått betegnelsen ATCC nr. 39 532. "Kassetten" av cDNA klon i full lengde uten introner, slik som beskrevet i avsnitt B ovenfor, ble likeens skåret ut innført i vektorenpAd for å fremstille et plasmid betegnet PGG21, hvis kart er gjengitt i figur 8.

Plasmid DNA-enet pGC21 og pGAC9 ble forøket i E.coli, renset på en cesium klorid gradient og brukt til å transformer to gjærstammer: gjærstamme C468, som er en haploid Saccharomyces cerevisiae med auksotrofe markører for leusin og histidin,

og gjærstammen H18, som er en hapoid S.cerevisiae med auksotrofe markører for leusin og histidin, som mangler repress-oren for glukoamylase genet hos Saccharomyces diastaticus.

Leu<+->transformanter ble sortert etter ekpressjon av Aspergillus awaraori glukoamylasegenet. H18 ble deponert i National Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois,USA 7. desember 1982, og har fått betegnelsen NRRL nr. Y-12842.

Gjærstammer som var transformert med et gjærekspressjons-vektorene pGC21 og åGAC9 ble sammenlignet med de samme stammene transformert med opphavsplasmidet pAC1, som kontroll av vekst på forskjellige flytende stivelser og på faste media. Det ble brukt tre typer stivelse: "vasket" stivelse (en opp-løselig stivelse, vasket tre ganger med 70% etanol, for å fjerne sukkeret og kortkjedede karbohydrater), kassava-stivelse, og oppløselig potet (Baker's) stivelse. Gjær transformert med et hvilket som helst av de tre plasmidene vokste på de tre stivelsene; cDNA klonene (pGAC9) oppviste imidlertid bedre vekst enn de andre klonene, både i flytende og på faste media. Når Baker's stivelse, som er den mest polymeriserte av de tre stivelsene, ble brukt på faste media i en konsentrasjon på 2% (vekt/volum), ble platene turbide. Disse plater ble sådd med gjær fra begge stammene som bar opphavsplasmidet, genomklonen eller cDNAklonen, og med gjærstamme Saccharomyces diastaticus, med NRRL deponeringsnr. Y-2044, som uttrykker en gjær glukoamylase. Platene er vist i figur 9. Stammene som bærer cDNA klonen (pGAC9) var istand til å klarne stivelsen rundt vekstsonen, hvilket indikerer at de kunne bryte ned stivelsen fullstendig. Derimot var S.diastaticus-stammen og gjærstammene transformert med enten opphavsplasmidet pAC1 eller genom klonen pGC21 ikke i stand til å klarne stivelsen rundt vekstområdet. Klarningen av den sterkt polymeriserte stivelsen som ble oppvist av pGAC9-holdige stammer, indikerer den funksjonelle ekspressjon av A.awamori glukoamylase genet som har både alfa 1-4 og alfa 1-6 amylase aktivitet.

I en annen prøve på glukoamylase ekpressjon, ble gjærceller som bærer kontrollplasmidet, pAC1, eller cDNA klonen,pGAC9, dyrket i et vasket, flytende stivelsesmedium. Cellene ble høstet og lysert ved hjelp av ti sykluser med frysing,

tining, og vorteksing med glasskuler. Hvert cellelysat, som inneholdt intracellulære proteiner, ble elektroforese-be-handlet på 7% akrylamidgel som inneholdt 0,1% natrium dodesyl sulfat(SDS) og 7,6 M urea og overført til cellulose papir aktivert med cyan bromid. Etter at proteinene var overført, ble papiret først undersøkt med antiserum fra en kanin-immun-isert mot A.awamori glukoamylase og deretter med radioaktivt merket Staph A protein,som bindes til antistoff molekyler. Etter at ubundet radioaktivitet var vasket bort, ble papiret tørket og eksponert mot røngtenfilm. Denne teknikken som er kalt en "Western" og er beskrevet i lit.henv.17, se side 1, kan utføres med antiserum eller renset antistoff. Protein som reagerer med glukoamylase antisera, ble påvist i lysatet fra pGAC9 cDNA klonene, men ikke i pACl-kontrollene.

) Ekspressjonen av A.awamori glukoamylase genet ble også testet direkte, ved evnen hos en gjær som inneholder et slikt gen, til å vokse på en ellers ikke utnyttbar karbonkilde. For gjærstammen C468 og H18 ble denne vekstprøven utført ved å bruke maltose som karbonkilde, etter som begge disse stammene har en mutasjon (mal), som stenger for utnyttelsen av maltose som karbonkilde. Evnen hos stammene C468 og H18 som inneholder kontrollplasmidet pAC1 eller cDNA plasmidet pGAV9, til vekst på maltose og glukose som karbonkilde, er angitt i tabell III. Glukoseplatene inneholdt histidin, men maltoseplatene inneholdt både histidin og leusin - suplementering. Fra denne

tabellen kan det sees at nærværet av et glukoamylasegen på plasmidet lar C468 vokse sakte på maltose og H18 å vokse litt

bedre enn kontrollen.

Disse prøvene indikerer at nærværet av glukoamylasegenet utfyller mal-mutasjonen i C468 og letter direkte selekt-sjons eksperimenter når veksten av gjæren alene er avhengig av riktige og tilstrekkelig funksjonering av A.awamori glukoamylasegenet.

Alle dise eksperimentene viser at gjærstamme C468 som inneholder plasmidet pGAC9 er aldeles utmerket når det gjelder å uttrykke glukoamylasegenet. En prøve av gjærstamme C468 transformert med pGAC9 ble deponert hos American Type Culture Collection 17.november 1983, og har fått tildelt ATCC deponeringsnummer 20 690. D. 1. Karakterisering av glukoamylase aktivitet i gjærkulturer.

Etablerte kulturer av gjærstamme C468, som inneholdt pAC1

eller som inneholdt pGAC9 fremstilt som beskrevet ovenfor,

ble dyrket i minimal media med glukose eller vasket Difco oppløselig stivelse,som karbonkilder. Kulturene ble høstet, etter 5 dager for glukosekulturene, og etter 7 dager for stivelsekulturene, og cellefrie supernatanter fremstilt ved sentrifugering. Disse supernatantene ble konsentrert ved å bruke et Amicon konsentreringsapparat med en PM10 membran. Glukoamylaseanalyser var negative for supernatantene fra de glukose- og stivelsedyrkede kulturene av gjærstamme C468, som inneholdt pAC1 plasmid. Derimot utskilte celler som inneholdt kontrollplasmidet pGAC9 omtrent seks enheter glukoamylaseaktivitet pr. liter.(For definisjon av en enhet glukoamylaseaktivitet, se fotnoten til Tabell IV).

Glukoamylaseproduksjonen i aerobic rysteflaske-kulturer av gjærstammer C468 som inneholdt pGAC9-plasmid, ble deretter analysert. Etter to dager med inkubering ved 30°C., og rysting ved 250 rpm, hadde kulturen av C468-gjærstammen, som inneholdt pGAC9, konsumert all glukosen og var i stasjonær fase. Kulturen hadde fått en celletetthet på omtrent 2 g/l. tørrvekt. En glukoamylaseanalyse på den ukonsentrerte supernatanten indikerte at det ble produsert omtrent 47 enheter aktivitet pr. liter supernatant.

2. Lokalisering av glukoamylase- aktivitet i kulturer

av transformerte gjærceller.

Eksperimentet gjengitt nedenunder ble brukt til å finne ut hvorvidt majoriteten av glukoamylase-aktiviteten finnes i kulturmediet eller inne i cellen.

Stammene C468 - pGAC9 og C468 - pAC1 ble dyrket i 500 ml medium som inneholdt 1,45 g Difco gjær-nitrogenbase

(Difco Laboratories, Detroit, MI 48232), 5,2 g ammonium sulfat og 2% glukose pr.liter til en celletetthet på 2-3 x 10<7>celler pr. ml. Kulturene ble sentrifugert ved 4°C, og supernatantene og cellepelletene ble opparbeidet hver for seg. Supernatantprøvene ble filtrert gjennom et 0,45 u filter og deretter oppkonsentrert 15 til 20 ganger ved å bruke en Amicon omrørt celle med en PM-10 membran. Cellepelleten ble vasket en gang i 1 M Sorbitol 0.1 M fosfat buffer pH 7,5 og deretter ble volumet av de sammenpressede cellene bestemt ved centrifugering ved omtrent 1000 x g i 5 minutter, i et konisk, inndelt sentrifugerør. Hver ml med sammenpressede celler ble resuspendert i 1,5 ml i 1,0 M Sorbitol-0,1 M fosfatbuffer ved pH 7,5 og det ble tilsatt like store volum med "Zymolyase 5000" (miles Laboratory, Elkhart IN 46515). Cellene ble forsiktig blandet ved værelsetemperatur i en time, og deretter sentrifugert ved 500xg for å utvinne protoplastene. Supernatanten, som utgjøres av proteinet som var tilstede mellom celleveggen og den indre membranen, ble plassert på is, for senere opparbeidelse. Rommet mellom cellemembranen og -veggen i gjær omtales som det intetstiti-ale rom og denne protoplast supernatantprøven vil det bli henvist til som den interstitiale prøven i den etterfølgende tekst. Protoplasten ble resuspendert i 1 M Sorbitol-0,1 M KPO^- buffer-10 mM NaN^ og vasket 1 gang ved sentrifugering ved 500 x g. Pelletten ble suspendert i 5 ml 1 M Sorbitol-0,1 M KP04ved pH 7,5-10 mM NAN^ og 1 ml ble brukt til å analysere glukoamylaseaktiviteten tilstede i de intakte, azid-behandlede protoplastene. Til de gjenværende 4 ml med protopast ble det tilsatt 4 ml 50 mM Tris ved pH 7,4 - 10

mM EDTA, sammen med 6 g. sterile glasskuler (0,45 -.0,5 mm B.Braun) og blandingen ble vorteksbehandlet kraftig i 20 sekunder, avkjølt på is, og denne fremgangsmåten ble gjentatt inntil mikroskopiske observasjoner avslørte membran-rester eller -partikler, men få eller ingen intakt protoplaster. Steril 2 M sukrose ble tilsatt sakte med en pasteur-pipette innført i bunnen av røret og lysatet fikk flyte bort fra glasskulene. Lysatet ble fjernet til et nytt rør, og sentri-

fugert sammen med den interstitiale prøven ved omtrent 20 OOOxg i 30 minutter ved 4<">C. Supernatanten fra de oppbrutte protoplastene ble betegnet den intracellulære prøven og pellettene fra den interstitiale prøven, og prøven med de oppbrutte protoplastene ble kombinert til membranprøven. Følgelig er gjærkulturen blitt fraksjonert i fem prøver: den ekstracellulære eller supernatant prøven, den interstitiale, den membranforbundne og den intracellulære prøven, samt en prøve som inneholdt intakte azid-behandlede protoplastere.

Kulturprøvene ble annalysert med hensyn på glukoamylaseaktivitet under anvendelse av peroksidase-glukose oksidase (PGO)/o-dianisidin (ODAD)-analysen (Sigma Kit nr.510) som påviser glukose frigjort fra oppløselig stivelse ved hjelp av glukoamylase. Analysen kan påvirkes av andre ensymer tilstede som utnytter glukose av glukose som er tilstede i prøvene. Hver PGO-ODAD-analyse-blanding ble testet med kjente mengder glukose (vanligvis en fortynnelseserie fra 0 til 550 nanomol) og det ble konstruert en standard kurve.

En glukoamylaseenhet er definert som den mengde glukoamylase som frigjør et umol glukose pr. minutt fra vasket opp-løselig stivelse ved 37°C.

Prøver ble omsatt med vasket oppløselig stivelse på den dagen de ble fremstilt, deretter kokt og nedfrosset ved -20°C.,

for senere glukoseanalyse. En del av hver frisk prøve ble utfelt ved tilsetning av 3 volumdeler kald 95% etanol, deretter fikk de stå over natten,og utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering ved 2000 x g i 5 minutter ved 4°C. Super-natantprøven greide ved en andre sentrifugering for å utvinne små fnugg, som forble suspendert i etanolsupernatanten. Pellettene ble tørket, og deretter resuspendert i 50 mM

Tris ved pH 7,4-10 mM EDTA til halvparten av sitt opprinnelige volum, med unntak av supernatantprøven som ble resuspendert til en tyvendedel av sitt opprinnelige volum. Disse etanolutfelte prøvene ble omsatt med vasket, oppløselig stivelse, og deretter kokt og nedfrosset i -20°C, for analyse med de friske prøvene.

Intakte azidbehandlede protoplastere ble analysert i en reaksjonsblanding som inneholdt 1M Sorbitol-0,5% vasket stivelse og 200 p. 1 protoplastere. Disse blandingene ble inkubert ved 37^C i 30 min, deretter sentrifugert 500 x g og supernatanten ble filtrert, deretter kokt og analysert eller lageret ved -20°C. Disse analysene avslørte at reaksjonsblandingen noe rester glukose og at protoplastene reduserte mengde glukose i blandingen under inkubering.

Når lyserte protoplastere ble inkubert i samme blandingen, ble mere glukose utnyttet enn når protoplastene var intakte. Verdiene for de glukoamylase plasmidbærende stammer var de samme som for stammen som bærer det samme plasmidet uten glukoamylase-DNA-innskuddet, hvilket innebærer at lite,

om noe, glukoamylaseaktivitet er forbundet med membranen.

De nyfraksjonerte prøvene ble analysert og de intracellulære prøvene ble funnet å ha restglukosenivåer som var for høye for analysen. Membranforbundne og interstitialprøver fra pGAC9- og pAC1-transformerte celler besluttes begge i å produsere påvisbare nivåer av glukose fra oppløselige stivelse. Supernatantprøven fra pGAC9-transformert gjær oppviste glukoamylaseaktivitet ca. 22 enheter/liter, mens prøven fra pAC1-transformert gjær ikke oppviste noen glukoamylaseaktivitet. Etanolutfelte prøver fra den pAC1-transformerte gjæren oppviste neglisjerbare (mindre enn eller lik med 0,08 enheter/liter) eller ingen glukoamylaseaktivitet. Etanolutfelte prøver fra gjær transformert med pGAC9 viste alle glukoamylaseaktivitet på 0,15 enheter pr. liter eller høyere. Supernatantprøven inneholdt over 90% av den totale glukoamylaseaktiviteten og de intrecellulære, membranforbundne og interstitiale prøvene inneholdt fra 1 til 4 % av den totale aktivitet avhengig av prøven. Følgelig utskilles mesteparten av glukoamylaseensymet i det ekstracellulære mediet.

E. Fremstilling av rekombinant glukoamylase fra gjær i

en 10 liter Fermentor.

For å fremstille tilstrekkelig glukoamylase for karakterisering, ble det satt opp en 10 liters fermentering av gjærstammen C468, som inneholdt pGAC9, i minimal media med glukose som den eneste karbonkilde. E 100-ml forkultur ble dyrket i minimalmedia inntil en optisk tetthet ved 680nm (ODgg^) på 6 og tilsatt til fermentoren. Fermentoren ble kjørt som en aerobic satsvis fermentering inntil den nådde en OD^gQ

på 10, og deretter ble glukosetilsetning påbegynt. Glukose-tilsetningen ble fortsatt inntil en ODgg0på omtrent 30, og deretter stoppet,slik at restglukosene ble konsumert. Total fermenteringstid var omtrent 32 timer. Den endelige celle-tettheten var omtrent 10 g pr. liter tørr vekt. Fortynnede prøver av den ikke-konsentrerte fermentorsupernatanten ble analysert med hensyn på glukoamylaseaktivitet, og man fikk analysedataene gjengitt i tabell IV. Supernatanten ble oppkonsentrert 15 ganger ved å bruke en Amicon hullfiberkonsen-treringsenhet med en størrelseutelukkelse ved molekylvekt 10.000.

Den oppkonsentrerte fermentor supernatanten ble justert til

50 mM fosfat, pH 7,5, ved tilsetning av konsentrert buffer og ble tilført en kolonne med DEAE Sefarose (CL-6B). Kolonnen ble eluert med en pH gradient (start ved pH 7,5, stopp ved pH 3,0). Elueringsprofilen er vist i figur 10. Forskjellige prøver fra kolonnen ble analysert ved hjelp av elektroforese på SDS-urea-polyakrylamid gel. Et fotografi av gelen farget med BioRad-sølvfarge, viste at den oppkonsentrerte fermenter-ingssupernatanten inneholdt bare noen få proteiner, som viser at glukoamylasen ble utskilt i mediene og ikke frigjort ved cell-lyse. En sammenligning av en prøve fra denne konsentrerte fermentorsupernatanten med et like stort volum av toppfraksjonen av glukoamylaseaktivitet indikerte en betydelig renhet av proteinet. Beregninger indikerte at 20-30% av supernatanten proteinet var glukoamylase og at toppfraksjonen var omtrent 80% glukoamylase. Den rekokombinante glukoamylasen forflyttet seg med en mobilitet som var noe mindre enn A.awamori glucoamylase, noe som indikerte at glukoamylasen fremstilt i den transformerte gjæren også var glykosylert.

En analyse av toppfraksjonen av glucoamylaseaktivitet fra kolonnen indikerte at den rekombinante glukoamylasen hadde en spesifikk aktivitet, sammenlignbar med naturlig forekommende A.awamori glukoamylase, nemlig 25-50 enheter pr.mr.

Ekperimenter beviser at den rekombinante glukoamylasen produsert av gjær C468/pGAC9 er glykosylert. Duplikatprøver av A.awamori glukoamylase-I og glukoamylase-II og den rekombinante glukoamylasen ble gjort til gjenstand for elektroforese i en 10% polyakrylamid-SDS-gel under anvendelse av standard fremgangsmåter. Etter elektroforese, ble gelen oppdelt og feltet 1 - 4 ble farget med hensyn på protein, med en "Coomassie Blue"-farge og feltene 5-7 ble farget med hensyn på karbohydrat med "Perjodsyre Shiff 1s"farge. Detaljer ved disse fremgangsmåtene finnes i lit.henv.18, se side 1a,.

En sammenbinding av glukoamylase-I (feltene 2 og 5), glukoamylase-II (feltene 3 og 6) og den rekombinante glukoamylase

(felt 4 og 7) er vist i figur 11. Ettersom båndene som svarer til disse proteinene også farges med karbohydratfargen, viser dette at den rekombinante glukoamylasen er glykosylert av gjæren.

Eksempel 3.

Fremstilling av alkohol fra transformert Gjær.

Gjærstammer C468 som inneholder pGAC9, og kontrollen gjærstamme C468, som inneholdt pAC1 ble inokulert i tO ml av det følgende medium:

Fermentering ble utført i 250 ml flasker som var utstyrt med luftbegrensningsmidler for å forhindre innstrømmingen av oksygen i flasken. Flaskene ble inkubert ved 32°C, og rystet ved 20 0 rpm i 7 dager.

Etanolinnholdet i hver flaske ble anslått ved å bruke gass-kromatografi. Kulturen med C468/pGAC9 inneholdt 23,4 g. pr liter etanol, mens kontrollen, kulturen som inneholdt C468/ pAC1 inneholdt 4,5 g pr. liter etanol. Resultatene viser at glukoamylaseproduksjonen i C468/pGAC9-kulturen gjorde det mulig for stammen og omdanne den oppløselige stivelse til glukose og deretter fermentere glukosen til etanol.

Eksempel 4

Ekspressjon av glukoamylasegenet i E. coli.

For å uttrykke glucoamylasegenet i E.coli, ble det gjort en modifikasjon idet 5<1->uoversatte området for å gjøre DNA-sekvensen mer forenlig med transkribsjon og translasjon i E.coli. Nærmere bestemt ble 27 basepar mellom Hindlll-setet,som var bygd opp av 32 basepar, og for en ATG initiering-kodonet (se eksempel 2) og ATG-kodonet fjernet ved hjelp av oligon-nucleotid-mutagenese under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2B, for fjerning av et intron. Oligonnucleotidet, som var homologt med 12 basepar på 5'-siden av området som skulle fjernes, og 11 basepar på 3'-siden,

hadde sekvensen:

Bortsett fra denne fjerningen, var den endelige Hindlll-"kassetten" identisk med som var bygd opp for gjær ekspre-sjonsvektoren i eksempel 2.

E.coli ekpressjonsvektor ptrp3 ble konstruert ved å bytte ut området fra EcoRi til Clal i pBR322 (koordinatene -3 til 28, se lit.henv.16a,se side 1) med et fragment fra EcoRI til Clal, som inneholdt E.coli tryptofan promoteren og ribosom bindings-setet. Nucleotidsekvensen til dette området er vist i tabell V; EcoRI-, Clal- og Hindlll-setene er identifisert i tabell V.

Hindlll-"kassetten" i glukoamylasegenet, beskrevet ovenfor

i dette eksemplet, ble klonet inn i Hindlll-setet til ptrp3. Transformanter ble undersøkt ved hjelp av DNA-restriksjon-fragment-kartlegging, for å identifisere klonet hvor glukoamylasegenet var i den samme orientering som promoteren;

en slik klon ble valgt ut for videre undersøkelse som pGC24.

For å undersøke ekpressjon av glukoamylasegenet under anvendelse av trp-promoteren, ble plasmidet pGC24 transformert inn i verten E.coli MH70 som var oppdaget fra E.coli Genetic Stock Center, Yale University (betegnelsen i samlingen er CGSC 6153) . MH70 er en mal - E.coli stammer hvis genotype

er araD139, K(argF-lac)205, flbB5301, ptsF25, reiAi?, rpsL150, malQ63, bglR15, deoCl? MalQ-mutasjonen er i amylomaltasegenet; en mutasjon i dette genet gir E.coli som ikke er i stand til å hydrolysere maltosen til glukose.

En prøve av MH70 transformert med pCG2 4 ble deponert i American Type Culture Collection 16.desember, 1983, og har fått betegnelsen ATCC deponeringsnummer 39 537.

MH70/pGC24-transformanten og stammen MH70 ble dyrket ved 37°C og 200 rpm i 5 ml av det følgende medium som inneholdt tryptofan 50 mg pr.liter.

"25X Bonner-Vogel"-salter (Methods in Enzykology, XVIIA:5): Etter inkubering over natten, ble cellene høstet ved sentrifugering ved 3000 g i 5 minutter og resuspendert i 5 ml av det samme mediet,men uten trypofan. Cellene ble så subdyrket i 20 ml av mediet uten trotofan til en A^gQ-verdi på 0,05 - 0,07. Denne kulturen ble dyrket ved 37°C og 250 rpm til en A,.^. -verdi på 0,05. Cellene ble høstet fra 10 ml av 660 kulturen ved sentrifugering som ovenfor, og resuspendert i 1 ml buffer for lydbølgebehandling (15% sukrose, 50mM Tris pH 7,40 mM EDTA). Prøvene ble lydbølgebehandlet i 3 minutter (pulsvis) i en skål-sonikator("Sonifier Cell Disrupter nr.350, Branson Sonic Power Co.)" Cellelysatene ble sentrifugert i 5 minutter i en Eppendorf Mikrosentrifuge, og de klare super natantene ble fjernet for videre analyser. De klare lysatene ble gjort til gjenstand for elektroforese på en polyakrylamid-natrium-dodesyl sulfat (SDS)-gel og analysert ved hjelp av "Western"- analyse, som beskrevet i eksempel 2C. Et pro-teinbånd med molekylvekt omtrent 6 9.000, størrelsen forventet for en ikke glykosylert form av glukoamylase, ble påvist i det klare MH70/pGC24-lysatet, men ikke i MH70-lysatet.

For ytterligere å påvise at et aktivt glukoamylase ensym ble fremstilt i E.coli, ble MH70/pGC24 og MH70 strøket ut på plater med McConkey Agar "(Difco Co., Detroit, MI 48232)",som inneholdt 1% maltose og inkubert over natten ved 37°C. Fermenteringen av maltose resulterer i en pH-endring i mediene, som indikeres ved omskifting fra en fargeløs til rød farge i koloniene; ikke-fermenterende kolonier forblir fargeløse. Ettersom MH70 er malQ , var koloniene av denne fargeløse. Ekspressjonen av A.awamori glukoamylase i MH70/pGC24 mulig-gjorde hydrolysen av maltose til glukose, og fermenteringen av glukosen resulterte i røde kolonier. En aktiv glukoamylase produseres derfor i E.coli.

Mens det her er blitt beskrevet et foretrukkene utførelsesform-er av den foreliggende oppfinnelse, vil det forstås at forskjellige endringer og modifikasjoner kan gjøres uten å avvike fra oppfinnelsens ånd. Mens eksempelene alle viser autonom replikasjon i verten, er det f.eks. også mulig å bruke integrerende transformasjon av verten, slik som beskrevet i Lit.henv.1c og 1d,se side 1, hvor genet og promoteren integreres i kromosomet.

Claims (27)

1. Modifisert DNA sekvenser, karakterisert ved ved at den koder for sopp-glukoamylaseprotein eller enkle eller multiple base-substitusjoner, -fjerninger, -innskidd eller - ombyttinger derav, at den er avledet fra naturlige, syntetiske eller halvsyntetiske kilder, og at den er i stand til, når den kombineres på en korrekt måte med en spaltet ekspressjonsvektor, og uttrykke et ikke-naturlig forekommende protein med glukoamylaseensymaktivitet etter transformasjon av en vert-organisme med vektorer.

2. DNA sekvens,ifø lge krav 1, karakterisert ved at DNA-n er cDNA og hvor sopp-glukoamylaseproteinet som sekvensen koder for, er fra artene A.awamori eller A.niger.

3. Sekvens, ifølge krav 2, karakterisert ved artene er A.awamori NRRL 15,271 og DNAsekvensene i det vesentlige er den følgende, i retning fra 5' til 3':

4. DNA-ekspressjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder et promoterfragment som virker i en vertorganisme og et DNA-segment med en modifisert DNA-sekvens ifølge hvilket som helst av krav 1-3, idet DNA-segmentet foreligger i en orientering i forhold til promoterfragmentet, slik at det i verten uttrykkes til å produsere et ikke-naturlig forekommende glukoamylaseprotein.

5. En vektor ifølge krav 4, karakterisert v e d at vertorganismen er av bakteriell,viral eller gjær-opprinnelse. I

6. Vektor ifølge krav 5, karakterisert ved at vertorganismen er E.coli.

7. Vektor ifølge krav 5, karakterisert ved at vertorganismen er gjær.

8. Vektor ifølge krav 7, karakterisert ved at gjæren er en art av slektene Saccharomyces.

9. Vektor ifølge krav 4, karakterisert ved at sopp-glukoamylaseproteinet, som sekvensen koder for, er fra artene A.awamori eller A.niger.

10. DNA-ekspressjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder et promoterfragment som virker i en vertorganisme, og et DNA-segment som har en modifisert DNA-sekvens ifølge krav 3, idet DNA-segmentet foreligger i jen orientering i forhold til promoterfragmentet slik at detj i verten uttrykkes til å produsere et ikke naturlig forekommende glukoamylaseprotein.

11. Vektor ifølge krav 4, karakterisert v|ed at den er plasmidet pGAC9.

12. Vertorganisme, karakterisert ved ajt den er transformert med ekspressjonsvektoren ifølge kraVj 4.

13. Vert ifølge krav 12, karakterisert ved at vertorganismen er en bakterie, et virus eller en gjærj.

14. Vert ifølge krav 13, karakterisert ved at vertorganismen er E.coli.

15. Vert ifølge krav 13, karakterisert ved at vertorganismen er gjær.

16. Vert ifølge krav 15, karakterisert ved at gjæren er en art av slekten Saccharomyces.

17. Gjærvert, karakterisert ved at den er transformert med ekspressjonsvektoren ifølge krav 11.

18. Gjærvert ifølge krav 17, karakterisert ved at stammen er C468.

19. Fremgangsmåte for å utskille et proteinholdig materiale ekstracellulært, karakterisert ved å dyrke en vertorganisme som er transformert med en DNA-ekspressjonsvektor som omfatter et promoterfragment, som virker i gjæren, en signalsekvens med i det vesentlige den følgende aminosyresekvens :

og et DNA-segment som koder for det proteinholdige materialet, hvor det proteinholdige materialet er kjennetegnet som et celleprotein som syntetiseres i sin normale vert med en hydro- . fob signal sekvens som vanligvis spaltes under under utskillelsen fra sin normale vertcelle.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at det proteinholdige materialet er glukoamylase.

21. Fremgangsmåte for å fremstille glukoamylase, karakterisert ved å dyrke verten ifølge krav 12 i et dyrkingsmedium.

22. Fremgangsmåte for forsukring av stivelse eller stivelse-hydrolysater som inneholder oligosakkarider, karakterisert ved å behandle stivelsene eller stivelsehydro-lysatet med et glukoamylaseensym separat, hvor glukoamylasen er blitt fremstilt av verten ifølge krav 12.

23. Fremgangsmåte for å fremstille etanol ved samtidig forsukring og fermentering, karakterisert ve|d å dyrke på en ikke-fermenterbar karbonkilde som er et substrat for glukoamylase, en vertorganisme transformert med en DNA-ekspress jonsvektor som omfatter et promoterfragment og et DNA-segment med en modifisert DNA-sekvens som koder for sopp-glukoamylaseprotein, idet DNA-segmentet foreligger i en orientering i forhold til promoterfragmentet, slik at det i verten uttrykkes på en slik måte at det produseres et ikke-naturlig forekommende glukoamylaseprotein. I

24. Fremgangsmåte ifølge krav 21, 22 eller 23, karakterisert ved at vertorganismen er en gjærart.

25.F remgangsmåte, ifølge krav 19 eller 24, karakterisert ved vertorganismen er en gjær.

26. Ensym med glukoamylaseaktivitet, karakterijs-e r t ved at det fremstilles ved ekspressjon av den modifiserte DNA-sekvensen i DNA-ekspressjonsvektoren i den transformerte verten ifølge krav 12.

27. Signalsekvens som er anvendelig i en fremgangsmåte for utskillelse av et hvilket som helst proteinholdig materiale I ekstracellulært ifølge krav 19, karakterisert ved at den i det vesentlige har den følgende aminosyré-sekvens: MET SER PHE ARG SER LEU LEU ALA LEU SER GLY LEU VAL CYS THR GLY LEU ALA ASN VAL ILE SER LYS ARG. i