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JP6591993B2 - グルコースシロップ生産用組成物 - Google Patents

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Description

配列表への言及
本願は、コンピュータで読取可能な形の配列表を含有し、それらは参照により本明細書中に援用される。
本発明は、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、およびグルコアミラーゼを含む組成物に関する。さらに本発明は、ＤＸを高い％で含むグルコースシロップの生産方法に関する。
デンプンは、一般には約８０％のアミロペクチンおよび２０％のアミロースからなる。アミロペクチンは、直鎖α−１，４Ｄ−グルコース残基がα−１，６−グルコシド結合によって連結されている分岐した多糖である。アミロペクチンは、α−アミラーゼによって部分的に分解される。α−アミラーゼは、その１，４−α−グルコシド結合を加水分解して分岐および線状オリゴ糖を生成する。
α−アミラーゼは、様々な目的、例えばデンプン処理（例えば液化）の初期段階において営利的に使用されている。α−アミラーゼによるアミロペクチンの長期に及ぶ分解は、α−アミラーゼによるさらなる加水分解の影響を受けにくいいわゆるα−限界デキストリンの形成を引き起こす。α−アミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプン、ならびに他の線状および分岐１，４−グルコシドオリゴ糖および多糖の加水分解を触媒する一群の酵素を構成する。
分岐オリゴ糖は、脱分岐酵素により加水分解して線状オリゴ糖にすることができる。残りの分岐オリゴ糖は、グルコアミラーゼにより解重合してＤ−グルコースにすることができる。グルコアミラーゼは、線状オリゴ糖を加水分解してＤ−グルコースにする。
アミロペクチンを攻撃することができる脱分岐酵素は２種類に、すなわちそれぞれイソアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６８）およびプルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１）に分けられる。イソアミラーゼは、アミロペクチンとβ−限界デキストリンのα−１，６−Ｄ−グルコシド分岐結合を加水分解する。イソアミラーゼは、それがプルランを攻撃できないことによって、かつそれらのα−限界デキストリンに及ぼす作用が限られていることによってプルラナーゼと区別することができる。
デンプン転化工程においてイソアミラーゼまたはプルラナーゼを加えることは当業界でよく知られている。プルラナーゼは、プルラン中のα−１，６−グリコシド結合の加水分解を触媒して還元性炭水化物末端を有するマルトトリオースを放出するプルラン、すなわち６−グルカノ−ヒドロラーゼ活性を有するデンプン脱分岐酵素（ＥＣ３．２．１．４１）である。通常はプルラナーゼは、α−アミラーゼおよび／またはグルコアミラーゼと組み合わせて使用される。
プルラナーゼは当業界で知られている。米国特許第６，０７４，８５４号明細書および同第５，８１７，４９８号明細書は、バチルス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）由来のプルラナーゼを開示している。国際公開第２００９／０７５６８２号パンフレットは、バチルス・アシドプルリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）由来のプルラナーゼを開示している。
グルコアミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）は、デンプンまたは関係のあるオリゴ糖および多糖の分子の非還元性末端からのＤ−グルコースの開放を触媒する酵素である。グルコアミラーゼは、幾種類かの糸状菌および酵母菌（アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、およびホウロクタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）由来のものが、特に営利的には重要である）によって産生される。
営利的にはグルコアミラーゼは、α−アミラーゼおよび、例えばプルラナーゼによってすでに部分的に加水分解されているデンプン質材料を、シロップの形態のグルコースに転化するために使用される。
酵素による処理の前に全粒穀物などのデンプン材料は、その構造をほぐし、さらなる処理を可能にするために、例えば製粉によって粒子の大きさに粉砕することができる。乾式製粉で全粒は粉にされ使用される。湿式製粉は胚と粗びき粉（デンプン顆粒およびタンパク質）の良好な分離をもたらし、そのデンプン水解物を、例えばシロップの生産に使用する場所でしばしば利用される。乾式および湿式製粉の両方ともデンプン処理の業界でよく知られており、また本発明の方法においても使用することができる。
製粉後、一般にそのデンプン材料は液化される。液化は、α−アミラーゼ、好ましくは細菌性α−アミラーゼおよび／または酸性真菌性α−アミラーゼの存在下で行われる。
液化の間に長鎖デンプンは、α−アミラーゼによって分解されて分岐および線状のより短い単位（マルトデキストリン）になる。液化は、３ステップの熱スラリー工程として行うことができる。液化工程は、７０〜９５℃の間、例えば８０〜９０℃の間、例えば約８５℃で約１０分間〜５時間、一般には１〜２時間行われる。このような処理の後、液化されたデンプンは、一般には１０〜１５の「デキストロース当量（ＤＥ）」を有することになる。
全般的には液化および液化条件は当技術分野でよく知られている。
グルコースシロップの生産の場合、その液化デンプン材料は糖化される。典型的な糖化工程では液化の間に生成したマルトデキストリンは、グルコアミラーゼと、脱分岐酵素、例えばイソアミラーゼ（米国特許第４，３３５，２０８号明細書）またはプルラナーゼとを加えることによってデキストロースに転化される。グルコアミラーゼと脱分岐酵素を加える前にその温度を６０℃に下げる。糖化過程は、２４〜７２時間続く。糖化酵素を加える前に、その液化α−アミラーゼを不活性化するためにそのｐＨを、高温（９５℃を超える）を維持しながら４．５未満まで下げる。
シロップの生産の場合、使用される酵素組成物は少なくともグルコアミラーゼおよびプルラナーゼを含むべきであるが、多くの場合、α−アミラーゼ活性もまた存在するはずである。例えばクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼを使用する場合、その産生宿主由来のクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼもまたその組成物中に存在することになる。驚くべきことに、シロップの高い％のＤＸ値、例えば９５％を超えるＤＸ値に到達するためには組成物中に存在するα−アミラーゼのレベルを注意深く制御しなくてはならないことが分かった。
本発明は、約９６％のＤＸ％を有する高グルコースシロップを生産するための組成物および方法を提供する。
より高いＤＸのシロップの用途は、ＤＭＨ（デキストロース一水和物）、有機酸（例えばクエン酸、乳酸など）またはアミノ酸（例えばＬ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、グルタミン酸一ナトリウム、およびＬ−システイン）などの発酵化学製品、高フルクトースコーンシロップ、結晶性フルクトース、および他の特製シロップの生産である。
第一の態様において本発明は、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、およびグルコアミラーゼ酵素を含み、ＮＰＵＮ／ｇとして表されるプルラナーゼ用量対ＦＡＵ（Ａ）／ｇまたはＫＮＵ／ｇとして表されるα−アミラーゼ用量の比が少なくとも６０である組成物に関する。
第二の態様において本発明は、（ａ）液化デンプンをグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、および任意選択によりα−アミラーゼと接触させるステップと、（ｂ）その液化デンプンを糖化するステップとを含み、（ａ）において、ＤＳ １ｇ当たりのＮＰＵＮとして表されるプルラナーゼ用量対ＤＳ １ｇ当たりのＦＡＵ（Ａ）またはＫＮＵとして表されるα−アミラーゼ用量の比が、少なくとも６０、具体的には少なくとも７５、具体的には少なくとも１００、より具体的には少なくとも１５０、より具体的には少なくとも２００、より具体的には少なくとも２５０、より具体的には少なくとも３００、より具体的には少なくとも４００、より具体的には少なくとも５００、より具体的には少なくとも６００、より具体的には少なくとも８００であるか、α−アミラーゼが存在しない場合には、プルラナーゼがＤＳ １ｇ当たり少なくとも０．５、具体的には少なくとも０．７５、具体的には少なくとも１．０、具体的には少なくとも１．５ＮＰＵＮの用量で存在する、液化デンプンからグルコースシロップを製造する方法に関する。
定義
α−アミラーゼ：α−アミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプン、ならびに他の線状および分岐１，４グルコシドオリゴ糖および多糖の加水分解を触媒する一群の酵素である。本発明により使用されるα−アミラーゼは、真菌または細菌供給源から得ることができる。本発明の目的の場合、真菌性αアミラーゼの活性度は、材料および方法の項で述べるαアミラーゼアッセイを使用してＦＡＵ（Ａ）として求めることができる。細菌性α−アミラーゼの活性度は、下記の段落「Ｋｉｌｏ Ｎｏｖｏ α−アミラーゼ単位（ＫＮＵ）」中で述べる手順に従ってＫｉｌｏ Ｎｏｖｏ α−アミラーゼ単位（ＫＮＵ）として求めることができる。
酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））：酸性α−アミラーゼの活性度は、単位ＦＡＵ（Ａ）（酸性真菌性α−アミラーゼ単位）で測定することができる。１ＦＡＵ（Ａ）は、下記の表「第一反応、デンプン分解」中で指定される標準条件下で１時間当たり５．２６０ｍｇのデンプン乾物量を分解する酵素の量として定義される。
酸性α−アミラーゼ、すなわちエンド−α−アミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカン−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプン分子の内部領域でα−１，４−グリコシド結合を加水分解して、様々な鎖長を有するデキストリンおよびオリゴ糖を形成する。ヨウ素で形成される色の彩度は、デンプンの濃度に正比例する。アミラーゼの活性度は、指定された分析条件下で逆比色分析（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）を使用してデンプンの濃度の低下として求められる。
ＦＡＵ（Ａ）、すなわち酸性α−アミラーゼの活性度は、下記の記述に従って求められる。この反応の原理は２つのステップに基づく。第一ステップにおいて酵素、すなわち酸性α−アミラーゼが、デンプンを様々なオリゴ糖に加水分解する。第二ステップにおいてヨウ素が、その分解生成物ではなくデンプンと青色の錯体を形成する。したがって色の彩度がデンプンの濃度に正比例する。活性度は、指定された分析条件下で逆比色分析を使用してデンプンの濃度の低下として求められる。
Figure 0006591993
Ｋｉｌｏ Ｎｏｖｏ α−アミラーゼ単位（ＫＮＵ）
細菌性α−アミラーゼの活性度は、基質としてジャガイモデンプンを使用して求めることができる。この方法は、アミラーゼによる溶液中のデンプンの分解、およびデンプンがヨウ素の存在下で暗藍色を呈することに基づく。酵素反応が進むにつれて反応物の分割量を取り出し、ヨウ素溶液と混合することによってそのデンプン含量を分析する。デンプンが分解するにつれてヨウ素の存在下での暗藍色は薄くなり、次第に黒みをおびた赤茶色に変わる。これを色ガラス標準と比較する。その色がガラス標準に一致した時、終点に到達する。
１ Ｋｉｌｏ Ｎｏｖｏ α−アミラーゼ単位（ＫＮＵ）は、下記「ＫＮＵ」表中で規定される標準条件（すなわち、３７℃＋／−０．０５、０．０００３Ｍ Ｃａ2+、およびｐＨ５．６）下で５２６０ｍｇ／時のデンプン乾燥物質、例えばＭｅｒｃｋ Ａｍｙｌｕｍ ｓｏｌｕｂｉｌｅをデキストリン化する酵素の量として定義される。
Figure 0006591993
プルラナーゼ：用語「プルラナーゼ」は、プルラン中のα−１，６−グリコシド結合の加水分解を触媒して、還元性炭水化物末端を有するマルトトリオースを放出するプルラン、すなわち６−グルカノ−ヒドロラーゼ活性（ＥＣ３．２．１．４１）を有するデンプン脱分岐酵素を意味する。本発明の目的の場合、プルラナーゼの活性度は、材料および方法の項ならびに下記の段落中で述べる手順に従ってＮＰＵＮとして求められる。
プルラナーゼ活性度（ＮＰＵＮ）：ＮＰＵＮ（ニュー・プルラナーゼ・ユニット・ノボザイム（Ｎｅｗ Ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ Ｕｎｉｔ Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））は、下記の手順で測定されるエンドプルラナーゼ活性度の単位である。
１ＮＰＵＮ＝１プルラナーゼ単位（ＮＰＵＮ）は、下記の表「第一反応、プルラン分解」中で指定される標準条件下で１分当たり０．３５μモルのグルコースに相当する還元性末端を開放する酵素の量として定義される。
第一反応では基質は主試料およびブランク試料の両方に等しく存在する。しかしながら主試料の反応はｐＨ５．０で行われ、一方、プルラナーゼおよびアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）のどちらも酵素的に活性でないｐＨ９．６のブランク試料では反応は存在しない。
Figure 0006591993
第二反応ではｐＨは約９．６に調整され、試料中のグルコースは、グルコキナーゼによって非還元性Ｄ−グルコース−６−リン酸にリン酸化される。グルコキナーゼはこの範囲において最適な活性および安定性を有し、かつｐＨ９においてグルコースに特異的である（Ｇｏｗａｒｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９８６，２３７，ｐｐ４１５〜４２０参照）。このステップは、主試料およびブランク試料の同一ｐＨに依存し、両方で等量のグルコースを除去する。
Figure 0006591993
グルコアミラーゼ：グルコアミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）という用語は、デンプンまたは関係のあるオリゴ糖および多糖の分子の非還元性末端からのＤ−グルコースの解放を触媒する酵素と定義される。本発明の目的の場合、グルコアミラーゼの活性度は、材料および方法の項ならびに下記の段落中で述べる手順に従ってＡＧＵとして求められる。
グルコアミラーゼの活性度（ＡＧＵ）：グルコアミラーゼ単位（ＡＧＵ）は、０．１Ｍ酢酸緩衝液中において、インキュベーション温度３７℃、ｐＨ４．３、マルトース出発濃度１００ｍＭ、および反応時間６分において１分当たり１μモルのマルトースを加水分解し、それによってα−Ｄ−グルコースを生成する酵素の量として定義される。この定義は０．５〜４．０ＡＧＵ／ｍＬの酵素作用範囲に適用される。
インキュベート後に反応をＮａＯＨで停止し、下記の２ステップ呈色反応法を使用してグルコースの量を測定することができる。すなわちグルコースを、ヘキソキナーゼによって触媒される反応物中でＡＴＰによりリン酸化する。形成されたグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸脱水素酵素によって酸化して６−ホスホグルコン酸にする。この同じ反応において等モル量のＮＡＤ＋が還元されてＮＡＤＨになり、結果として３４０ｎｍにおける吸光度を増加させる。
反応条件は、下記の表で指定される。
Figure 0006591993
重合度（ＤＰ）：ＤＰとは、所与の糖中のアンヒドログルコピラノース単位の数（ｎ）を指す。ＤＰ１の例は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類である。ＤＰ２は、マルトースおよびスクロースなどの二糖類である。
宿主細胞：用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入などの影響を受けやすい任意の細胞型を意味する。用語「宿主細胞」は、複製の間に生ずる突然変異が原因の親細胞と同一でない親細胞の任意の子孫を包含する。
成熟ポリペプチド：用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳後の、およびＮ−末端処理、Ｃ−末端トランケーション、グリコシル化、リン酸化などの任意の翻訳後修飾後のその最終形態のポリペプチドを意味する。幾つかの実施形態によれば配列番号６の成熟ポリペプチドは、本質的に配列番号６のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号７の成熟ポリペプチドは、本質的に配列番号７のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号８の成熟ポリペプチドは、本質的に配列番号８のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号５の成熟ポリペプチドは、本質的に配列番号９のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号１０の成熟ポリペプチドは、本質的に配列番号１０のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号１１の成熟ポリペプチドは、本質的に配列番号１１のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号１２の成熟ポリペプチドは、本質的に配列番号１２のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号１３の成熟ポリペプチドは、本質的に配列番号１３のアミノ酸１８〜５７６番からなり、配列番号１４の成熟ポリペプチドは、本質的に配列番号１４のアミノ酸１８〜５７６番からなる。
具体的には配列番号６の成熟ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸１８〜５７３番からなることができる。
配列番号７の成熟ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸１８〜５７３番からなることができる。
配列番号８の成熟ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸１８〜５７３番からなることができる。
配列番号９の成熟ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸１８〜５７３番からなることができる。
配列番号１０の成熟ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸１８〜５７３番からなることができる。
配列番号１１の成熟ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸１８〜５７３番からなることができる。
配列番号１２の成熟ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸１８〜５７３番からなることができる。
配列番号１３の成熟ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸１８〜５７６番からなることができる。
配列番号１４の成熟ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸１８〜５７６番からなることができる。
さらなる実施形態では、配列番号６の成熟ポリペプチドが配列番号６のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号７の成熟ポリペプチドが配列番号７のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号８の成熟ポリペプチドが配列番号８のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号９の成熟ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号１０の成熟ポリペプチドが配列番号１０のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号１１の成熟ポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号１２の成熟ポリペプチドが配列番号１２のアミノ酸１８〜５７３番からなり、配列番号１３の成熟ポリペプチドが配列番号１３のアミノ酸１８〜５７６番からなり、かつ配列番号１４の成熟ポリペプチドが配列番号１４のアミノ酸１８〜５７６番からなる。
成熟ポリペプチド配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６）に基づくことができ、このプログラムは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４のアミノ酸１〜１７番がシグナルペプチドであると予測する。配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸１９〜４７４番（特に１９〜４７１番）、あるいは配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸１９〜４７１番によって規定される配列が、触媒ドメインである。配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸４８０〜５７３番、あるいは配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸４８３〜５７６番によって規定される配列が、デンプン結合ドメインである。
他の実施形態によれば配列番号１８の成熟ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸２２〜４５０番によって規定される。
さらなる実施形態では配列番号１９の成熟ポリペプチドが配列番号１９のアミノ酸２２〜４７１番によって規定されるのに対し、アミノ酸１〜２１番がシグナルペプチドである。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の近縁性は、パラメータ「配列同一性」によって記述される。
本発明の目的の場合、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラム（好ましくはバージョン５．０．０以降）により実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３）を使用して求められる。使用されるパラメータは、ギャップ・オープン・ペナルティ１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティ０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）の代替行列である。「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）と表示されるＮｅｅｄｌｅのアウトプットは、同一性の％として使用され、
（同一残基数×１００）／（アライメント長−アライメント中のギャップの総数）
として計算される。
本発明の目的の場合、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ．ａｌ．，２０００、上記）のＮｅｅｄｌｅプログラム（好ましくはバージョン５．０．０以降）により実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、上記）を使用して求められる。使用されるパラメータは、ギャップ・オープン・ペナルティ１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティ０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）の代替行列である。「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）と表示されるＮｅｅｄｌｅのアウトプットは、同一性の％として使用され、
（同一デオキシリボヌクレオチド数×１００）／（アライメント長−アライメント中のギャップの総数）
として計算される。
本発明は、高グルコースシロップ、具体的には９５％を超えるＤＸ％（ＤＰ１の％）の値を有するグルコースシロップを生産するための方法および組成物に関する。
驚くべきことに、シロップの高い％のＤＸ値、例えば９５％を超えるＤＸ値に達するためには組成物中に存在するα−アミラーゼのレベルを注意深く制御しなくてはならないことが分かった。
本発明による方法および組成物は、ＮＰＵＮ対ＡＧＵの所与の比率においてそのＮＰＵＮ／ＦＡＵ（Ａ）またはＮＰＵＮ／ＫＮＵが少なくとも６０、具体的には少なくとも８０になるように調整されるようにα−アミラーゼレベルが最適化される場合に、より高いＤＸ％を有するグルコースシロップをもたらす。この高ＤＸ％のシロップは、工業的に妥当な基質濃度−一般には３０％を超える初期乾燥固体含量（ＤＳ）において得ることができる。
一実施形態において本発明は、（ａ）液化デンプンをグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、および任意選択によりα−アミラーゼと接触させるステップと、（ｂ）その液化デンプンを糖化するステップとを含み、（ａ）において、ＤＳ １ｇ当たりのＮＰＵＮとして表されるプルラナーゼ用量対ＤＳ １ｇ当たりのＦＡＵ（Ａ）またはＫＮＵとして表されるα−アミラーゼ用量の比が、少なくとも６０、具体的には少なくとも７５、具体的には少なくとも１００、より具体的には少なくとも１５０、より具体的には少なくとも２００、より具体的には少なくとも２５０、より具体的には少なくとも３００、より具体的には少なくとも４００、より具体的には少なくとも５００、より具体的には少なくとも６００、より具体的には少なくとも８００であるか、α−アミラーゼが存在しない場合には、プルラナーゼがＤＳ １ｇ当たり少なくとも０．５、具体的には少なくとも０．７５、具体的には少なくとも１．０、具体的には少なくとも１．５ＮＰＵＮの用量で存在する、液化デンプンからグルコースシロップを製造する方法に関する。
幾つかの実施形態ではこの方法は、液化デンプンをグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、および任意選択によりα−アミラーゼと接触させるステップを含み、ＤＳ １ｇ当たりのＮＰＵＮとして表されるプルラナーゼ用量対ＤＳ １ｇ当たりのＦＡＵ（Ａ）またはＫＮＵとして表されるα−アミラーゼ用量の比が、１００〜７００の範囲内、例えば２００〜６００の範囲内、例えば３００〜５００の範囲内、例えば３５０〜５００の範囲内、例えば３７５〜４７５の範囲内、または例えば４００〜４５０の範囲内にある。
他の実施形態によればこの方法は、液化デンプンをグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、および任意選択によりα−アミラーゼと接触させるステップを含み、α−アミラーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０〜０．００８ＦＡＵ（Ａ）の範囲内にあり、かつプルラナーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０．５〜１．５ＮＰＵＮの範囲内にある。
他の実施形態ではαアミラーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０〜０．００７ＦＡＵ（Ａ）の範囲内にあり、かつプルラナーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０．６〜１．４ＮＰＵＮの範囲内にある。他の実施形態ではαアミラーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０〜０．００６ＦＡＵ（Ａ）の範囲内にあり、かつプルラナーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０．７〜１．３ＮＰＵＮの範囲内にある。
他の実施形態ではαアミラーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０〜０．００５ＦＡＵ（Ａ）の範囲内にあり、かつプルラナーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０．７５〜１．２５ＮＰＵＮの範囲内にある。
他の実施形態ではαアミラーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０〜０．００４ＦＡＵ（Ａ）の範囲内にあり、かつプルラナーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０．８〜１．２ＮＰＵＮの範囲内にある。
他の実施形態ではαアミラーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０〜０．００３ＦＡＵ（Ａ）の範囲内にあり、かつプルラナーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０．９〜１．１ＮＰＵＮの範囲内にある。
他の実施形態ではαアミラーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０〜０．００２５ＦＡＵ（Ａ）の範囲内にあり、かつプルラナーゼの用量が、ＤＳ １ｇ当たり０．９５〜１ＮＰＵＮの範囲内にある。
ＤＳ １ｇ当たりのＮＰＵＮとして表されるプルラナーゼとＤＳ １ｇ当たりのＡＧＵとして表されるグルコアミラーゼの比は、具体的には２〜１５の範囲内、例えば２〜１０の範囲内、２〜５の範囲内、３〜５の範囲内、または３．５〜４の範囲内であることができる。
他の実施形態によればこの方法は、液化デンプンをグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、および任意選択によりα−アミラーゼと接触させるステップを含み、プルラナーゼの用量は、ＤＳ １ｇ当たり０．５〜１．５ＮＰＵＮの範囲内であり、かつグルコアミラーゼの用量は、ＤＳ １ｇ当たり０．１２５〜０．３７５ＡＧＵの範囲内である。
他の実施形態ではプルラナーゼの用量は、ＤＳ １ｇ当たり０．６〜１．４ＮＰＵＮの範囲内であり、かつグルコアミラーゼの用量は、ＤＳ １ｇ当たり０．１５〜０．３５ＡＧＵの範囲内である。
他の実施形態ではプルラナーゼの用量は、ＤＳ １ｇ当たり０．７〜１．３ＮＰＵＮの範囲内であり、かつグルコアミラーゼの用量は、ＤＳ １ｇ当たり０．１７５〜０．３２５ＡＧＵの範囲内である。
他の実施形態ではプルラナーゼの用量は、ＤＳ １ｇ当たり０．８〜１．２ＮＰＵＮの範囲内であり、かつグルコアミラーゼの用量は、ＤＳ １ｇ当たり０．２〜０．３ＡＧＵの範囲内である。
低レベルのグルコアミラーゼではより長い糖化時間が必要とされる場合もある。一実施形態ではＤＳ １ｇ当たりのＡＧＵとして表されるグルコアミラーゼ用量は、少なくとも０．１、具体的には少なくとも０．１５、具体的には少なくとも０．１８、具体的には少なくとも０．２、より具体的には少なくとも０．２２、より具体的には少なくとも０．２３、より具体的には少なくとも０．２５、さらに一層具体的には少なくとも０．２８である。
本発明による方法および組成物を使用してきわめて高いＤＸ％の値を得ることができる。特定の実施形態ではグルコースシロップは、少なくとも９５．８％、具体的には少なくとも９５．９％、具体的には少なくとも９６％、より具体的には少なくとも９６．１％のＤＰ１（ＤＸ％）を含む。
糖化時間は、酵素の用量により変えることができる。一つの特定の実施形態では糖化時間は、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間である。
本発明による工程ではデンプンの加水分解／糖化は、具体的には３．５〜５．０の範囲内にあるｐＨ、例えば４．０〜４．５の範囲のｐＨで、かつ５９〜７０℃の範囲内にある、例えば５９〜６５℃の範囲、または例えば５９〜６２℃の範囲の温度で行うことができる。
本発明による糖化工程用の基質として使用される液化デンプンは、デンプンスラリーまたは部分的に加水分解されたデンプン（液化物またはマルトデキストリン）であることができる。具体的にはデンプンスラリーまたは部分的に加水分解されたデンプンは、５〜４２の範囲、例えば５〜３０の範囲、８〜１８の範囲、または例えば９〜１４の範囲のデキストロース当量（ＤＥ）を有することができる。
デンプンは、任意の供給源由来の、具体的にはトウモロコシ、コムギ、またはタピオカ由来のものであることができる。デンプンスラリーまたは部分的に加水分解されたデンプンは、存在するその液化工程由来の残留αアミラーゼ活性を有していてもよく、また、例えば高温（９５℃を超える）を維持しながらｐＨを４．５未満に還元してその液化α−アミラーゼを不活性化することによって不活性にされていてもよい。
上記デンプンスラリーまたは部分的に加水分解されたデンプンの導電率は、具体的には０〜５００μＳ／ｃｍの範囲内であることができる。幾つかの実施形態によればそのカルシウム含量は、０〜２００ｐｐｍの遊離カルシウムに相当する。
本発明による工程においてデンプンの加水分解／糖化は、具体的には３．５〜５．０の範囲内にあるｐＨ、例えば４．０〜４．７の範囲のｐＨで、かつ５８〜７０℃の範囲内にある、例えば５８〜６５℃の範囲、５９〜６５℃の範囲、または例えば５９〜６２℃の範囲の温度で行うことができる。
出発材料として与えられる液化デンプンを含む組成物、すなわち工程のステップｉ）で与えられる液化デンプンを含む組成物は、２５〜４５％の乾燥固体（ＤＳ％）、例えば２５〜４０ＤＳ％を含有することができる。
本発明による方法は、業界の妥当な基質用量を適用することができる。一実施形態では液化デンプン基質中の初期乾燥固体含量（ＤＳ）は、少なくとも２５％、具体的には少なくとも３０％、より具体的には少なくとも３５％、さらに一層具体的には少なくとも４０％である。
酵素組成物
本発明はまた、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、およびα−アミラーゼを含む組成物に関する。
特定の実施形態では組成物は、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、およびグルコアミラーゼ酵素を含み、ＮＰＵＮ／ｇとして表されるプルラナーゼ用量対ＦＡＵ（Ａ）／ｇまたはＫＮＵ／ｇとして表されるα−アミラーゼ用量の比が少なくとも６０である。
より具体的には組成物は、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、およびグルコアミラーゼ酵素を含み、ＮＰＵＮ／ｇとして表されるプルラナーゼ用量対ＦＡＵ（Ａ）／ｇまたはＫＮＵ／ｇとして表されるα−アミラーゼ用量の比が少なくとも７５、具体的には少なくとも１００、より具体的には少なくとも１５０、より具体的には少なくとも２００、より具体的には少なくとも２５０、より具体的には少なくとも３００、より具体的には少なくとも４００、より具体的には少なくとも５００、より具体的には少なくとも６００、より具体的には少なくとも８００である。
別の実施形態ではＮＰＵＮ／ｇとして表されるプルラナーゼ用量対ＦＡＵ（Ａ）／ｇまたはＫＮＵ／ｇとして表されるα−アミラーゼ用量の比が、６０〜１０００、より具体的には７０〜８００、より具体的には８０〜６００、より具体的には９０〜５００、より具体的には１００〜４００の範囲である。
ＮＰＵＮ／ｇとして表されるプルラナーゼ用量対ＦＡＵ（Ａ）／ｇまたはＫＮＵ／ｇとして表されるα−アミラーゼ用量の比は、具体的には１００〜７００の範囲内、例えば２００〜６００の範囲内、例えば３００〜５００の範囲内、例えば３５０〜５００の範囲内、例えば３７５〜４７５の範囲内、または例えば４００〜４５０の範囲内であることができる。
さらなる態様において本発明は、ＮＰＵＮ／ｇとして表されるプルラナーゼとＡＧＵ／ｇとして表されるグルコアミラーゼの比が、少なくとも２、具体的には少なくとも２．５、具体的には少なくとも３、より具体的には少なくとも３．５、より具体的には少なくとも５、より具体的には少なくとも１０、さらに一層具体的には少なくとも１５である組成物に関する。
ＮＰＵＮ／ｇとして表されるプルラナーゼとＡＧＵ／ｇとして表されるグルコアミラーゼの比は、具体的には２〜１５の範囲内、例えば２〜１０の範囲内、２〜５の範囲内、３〜５の範囲内、または３．５〜４の範囲内であることができる。
プルラナーゼ
本発明の工程では任意のプルラナーゼを使用することができる。一実施形態ではプルラナーゼは、例えば米国特許第６，０７４，８５４号明細書および同第５，８１７，４９８号明細書中で開示されているバチルス・デラミフィンカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）由来のプルラナーゼ、または、例えば国際公開第２００９／０７５６８２号パンフレット中で開示されているバチルス・アシドプルリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）由来のプルラナーゼ（配列番号４、ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＸＢ７１６２４）である。
市販されているプルラナーゼには、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手できるＰｒｏｍｏｚｙｍｅ Ｄ２、Ｎｏｖｏｚｙｍ ２６０６２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、およびＯｐｔｉｍａｘ Ｌ １０００（ＤｕＰｏｎｔ−Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が挙げられる。
グルコアミラーゼ
本発明により使用されるグルコアミラーゼは、任意の適切な供給源に由来する、例えば微生物または植物に由来することができる。好ましいグルコアミラーゼは、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のグルコアミラーゼ、具体的にはクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）Ｇ１またはＧ２グルコアミラーゼ（Ｂｏｅｌ ｅｔ．ａｌ．，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３（５）：１０９７−１１０２）、あるいはこれらの変異型、例えば国際公開第９２／００３８１号パンフレット、同第００／０４１３６号パンフレット、および同第０１／０４２７３号パンフレット中で開示されているもの（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手できる）と、国際公開第８４／０２９２１号パンフレット中で開示されているアワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼと、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，５５（４）：９４１−９４９）とからなる群から選択される真菌または細菌由来のもの、あるいはこれらの変異型または断片である。他のコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属グルコアミラーゼの変異型には、高い熱安定性を有する変異型、すなわちＧ１３７ＡおよびＧ１３９Ａ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９−５０５）と、Ｄ２５７ＥおよびＤ２９３Ｅ／Ｑ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：５７５−５８２）と、Ｎ１８２（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１：２７５−２８１）と、ジスルフィド結合Ａ２４６Ｃ（Ｆｉｅｒｏｂｅ ｅｔ．ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：８６９８−８７０４）と、Ａ４３５およびＳ４３６の場所へのＰｒｏ残基の導入（Ｌｉ ｅｔ．ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：１１９９−１２０４）とが挙げられる。
他のグルコアミラーゼには、アテリア・ロルフシイイ（Ａｔｈｅｌｉａ ｒｏｌｆｓｉｉ）（以前は白絹病（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ）の名称であった）のグルコアミラーゼ（米国特許第４，７２７，０２６号明細書、およびＮａｇａｓａｋａ ｅｔ．ａｌ．，１９９８，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｗ−ｓｔａｒｃｈ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ”，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５０：３２３−３３０参照）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属グルコアミラーゼ、具体的にはタラロマイセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（国際公開第９９／２８４４８号パンフレット）、タラロマイセス・レイセタナス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）（米国特許第３２，１５３号再発行明細書）、タラロマイセス・デュポンティ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｕｐｏｎｔｉ）、およびタラロマイセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（米国特許第４，５８７，２１５号明細書）由来のものが挙げられる。
検討された真菌性グルコアミラーゼには、国際公開第２００６／０６９２８９号パンフレット中で開示されているトラメテス・シングラタ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｃｉｎｕｌａｔａ）が含まれる。
一実施形態ではグルコアミラーゼは、シュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属の菌株、具体的には国際公開第２０１１／０６６５７６号パンフレットに記載されているシュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属の菌株（配列番号２、４、または６）、あるいはキカイガラタケ（Ｇｌｏｅｐｈｙｌｌｕｍ）属の菌株、具体的には国際公開第２０１１／０６８８０３号パンフレットに記載されているキカイガラタケ（Ｇｌｏｅｐｈｙｌｌｕｍ）の菌株（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６）、あるいはミナミクロサルノコシカケ（Ｎｉｇｒｏｆｏｍｅｓ）属の菌株、具体的には国際公開２０１２／０６４３５１号パンフレット中で開示されているミナミクロサルノコシカケ（Ｎｉｇｒｏｆｏｍｅｓ）種の菌株（配列番号２）（これによりこれらすべての参考文献は参照により援用される）、あるいはアオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌株、具体的には国際公開第２０１１／１２７８０２号パンフレットに記載（配列番号２）または国際公開第２０１３／０３６５２６号パンフレットに記載されているペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）由来のものである。上記グルコアミラーゼのいずれかとの高い一致、すなわち前述の酵素配列の成熟部分のいずれか一つとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、例えば１００％の一致を示すグルコアミラーゼもまた考えられる。
一実施形態ではグルコアミラーゼは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の菌株、具体的には国際公開第２００９／０４８４８７号パンフレット、国際公開第２００９／０４８４８８号パンフレット、国際公開第２００８／０４５４８９号パンフレット、国際公開第２０１１／０２２４６５号パンフレット、国際公開第２０１２／００１１３９号パンフレットに記載されているものに由来する。
市販されているグルコアミラーゼ組成物には、ＡＭＧ ２００Ｌ、ＡＭＧ ３００Ｌ、ＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ、ＳＡＮ（商標）ＥＸＴＲＡ Ｌ、ＳＰＩＲＩＺＹＭＥ（商標）ＰＬＵＳ、ＳＰＩＲＩＺＹＭＥ（商標）ＦＵＥＬ、ＳＰＩＲＩＺＹＭＥ（商標）Ｂ４Ｕ、ＳＰＩＲＩＺＹＭＥ ＵＬＴＲＡ（商標）、ＳＰＩＲＩＺＹＭＥ ＥＸＣＥＬ（商標）、およびＡＭＧ（商標）Ｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手できる）、ＯＰＴＩＤＥＸ（商標）３００、ＧＣ４８０（商標）、およびＧＣ１４７（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔ．，ＵＳＡから入手できる）、ＡＭＩＧＡＳＥ（商標）およびＡＭＩＧＡＳＥ（商標）ＰＬＵＳ（ＤＳＭから入手できる）、Ｇ−ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９００、Ｇ−ＺＹＭＥ（商標）、およびＧ９９０ ＺＲ（ＤｕＰｏｎｔ−Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手できる）が挙げられる。
α−アミラーゼ
真菌性α−アミラーゼには、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の菌株、例えばニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、および白麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）α−アミラーゼ由来のα−アミラーゼが挙げられる。
好ましい酸性真菌性α−アミラーゼには、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の菌株由来のものであるＦｕｎｇａｍｙｌ様のα−アミラーゼである。本発明によれば用語「Ｆｕｎｇａｍｙｌ様のα−アミラーゼ」とは、国際公開第９６／２３８７４号パンフレット中の配列番号１０で示されるアミノ酸配列の成熟部分と高い一致を示す、すなわち７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超える、または１００％さえもの一致を示すα−アミラーゼを指す。
別の好ましい酸性α−アミラーゼは、菌株クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のものである。好ましい実施形態では酸性真菌性α−アミラーゼは、プライマリアクセッション番号Ｐ５６２７１でＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ／ＴｅＥＭＢＬデータベース中で「ＡＭＹＡ＿ＡＳＰＮＧ」として開示されており、また国際公開第８９／０１９６９号パンフレット（実施例３）中に記載されているクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のものである。
他の検討された野生型α−アミラーゼには、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属およびトンビマイタケ（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）属の菌株、好ましくはリゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）（参照により援用される国際公開第２００４／０５５１７８号パンフレット）またはトンビマイタケ（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）の菌株由来のものが挙げられる。
好ましい実施形態ではα−アミラーゼは、白麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）由来のものであり、Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８１：２９２−２９８，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｃｉｄ−ｓｔａｂｌｅ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ”によって、またさらにＥＭＢＬ：＃ＡＢ００８３７０として開示されている。
真菌性α−アミラーゼはまた、デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）およびα−アミラーゼ触媒ドメインを含む野生型酵素（すなわち非ハイブリッド）またはこの変異型であることができる。一実施形態ではその野生型α−アミラーゼは、白麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）の菌株由来のものである。
真菌性ハイブリッドα−アミラーゼ
好ましい実施形態ではα−アミラーゼは、ハイブリッドα−アミラーゼである真菌性酸性α−アミラーゼである。真菌性ハイブリッドα−アミラーゼの好ましい例には、国際公開第２００５／００３３１１号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００５／００５４０７１号明細書（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、あるいは米国特許出願第６０／６３８，６１４号明細書（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）中で開示されているものが挙げられる（これらはこれにより参照により援用される）。ハイブリッドα−アミラーゼは、α−アミラーゼ触媒ドメイン（ＣＤ）と、炭水化物結合ドメイン／モジュール（ＣＢＭ）、例えばデンプン結合ドメインと、任意選択のリンカーとを含むことができる。
検討されたハイブリッドα−アミラーゼの特定の例には、米国特許出願第６０／６３８，６１４号明細書中の実施例の表１〜５中で開示されているものが挙げられ、これには、触媒ドメインＪＡ１１８およびアテリア・ロルフシイイ（Ａｔｈｅｌｉａ ｒｏｌｆｓｉｉ）のＳＢＤを有するＦｕｎｇａｍｙｌ変異型（米国特許出願第６０／６３８，６１４号明細書中の配列番号１００）と、アテリア・ロルフシイイ（Ａｔｈｅｌｉａ ｒｏｌｆｓｉｉ）のＡＭＧリンカーおよびＳＢＤを有するリゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）α−アミラーゼ（米国特許出願第６０／６３８，６１４号明細書中の配列番号１０１）と、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼリンカーおよびＳＢＤを有するリゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）α−アミラーゼ（米国特許出願第１１／３１６，５３５号明細書の表５中でアミノ酸配列配列番号２０、配列番号７２、および配列番号９６の組合せとして開示されている）または国際公開第２００６／０６９２９０号パンフレット中の表５中のＶ０３９としてのリゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）α−アミラーゼと、アテリア・ロルフシイイ（Ａｔｈｅｌｉａ ｒｏｌｆｓｉｉ）のグルコアミラーゼリンカーおよびＳＢＤを有するトンビマイタケ（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）α−アミラーゼ（米国特許出願第６０／６３８，６１４号明細書中の配列番号１０２）とが含まれる。他の具体的に検討されたハイブリッドα−アミラーゼは、米国特許出願第１１／３１６，５３５号明細書および国際公開第２００６／０６９２９０号パンフレット（これらはこれにより参照により援用される）中の実施例４の表３、４、５、および６中で列挙されているもののいずれかである。
検討されたハイブリッドα−アミラーゼの他の特定の例には、米国特許出願公開第２００５／００５４０７１号明細書中で開示されているものが挙げられ、これには１５ページの表３中で開示されているもの、例えば白麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）のリンカーおよびデンプン結合ドメインを有するクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼが含まれる。
前述のα−アミラーゼのいずれかと高い一致を示す、すなわちその成熟酵素配列と７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超える、または１００％さえもの一致を示すα−アミラーゼもまた検討される。
細菌性α−アミラーゼ
本発明による工程に有用な細菌性α−アミラーゼには、バチルス属の菌株、例えばバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のα−アミラーゼが挙げられる。
市販用のα−アミラーゼ製品
α−アミラーゼを含む好ましい市販の組成物には、ＭＹＣＯＬＡＳＥ（商標）（ＤＳＭ）と、ＢＡＮ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）ＳＣ、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（商標）、ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（商標）Ｘ、ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（商標）ＳＣ、およびＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ、ＳＡＮ（商標）ＥＸＴＲＡ Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）と、ＣＬＡＲＡＳＥ（商標）Ｌ−４０，０００、ＤＥＸ−ＬＯ（商標）、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＡＡ、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＡＬＰＨＡ、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＤＥＬＴＡ ＡＡ、ＧＣ３５８、ＧＣ９８０、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＣＬ、およびＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＲＳＬ（ＤｕＰｏｎｔ−Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）と、ＦＵＥＬＺＹＭＥ（商標）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ Ｃｏｒｐ，ＵＳＡから入手できる）とが挙げられる。
特定の実施形態において本発明による組成物は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ（ＡＭＧ）、およびプルラナーゼを含み、このαアミラーゼは、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはリゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）αアミラーゼ、あるいはその変異型から選択され、またこのグルコアミラーゼは、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、タラロマイセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、トラメテス・シングラタ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｃｉｎｕｌａｔａ）、またはキチリメンタケ（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ ｔｒａｂｅｕｍ）グルコアミラーゼ、あるいはその変異型から選択され、またこのプルラナーゼは、バチルス・デラミフィンカス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｎｃａｓ）またはバチルス・アシドプルリチカス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）プルラナーゼ、あるいはそのハイブリッドおよび／または変異型から選択される。
さらなる特定の実施形態において本発明による組成物は、
ｉ）配列番号１、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５、またはそれらの成熟ポリペプチドのいずれか一つで示されるアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号１、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５、またはそれらの上記成熟ポリペプチドのいずれか一つで示されるアミノ酸配列の部分配列、および
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）で示すアミノ酸配列のいずれか一つとの少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．５％の配列の一致を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む／本質的にそれからなる／それからなるグルコアミラーゼを含む。
このグルコアミラーゼが、ｉｉ）で規定される部分配列、またはｉｉｉ）で規定されるアミノ酸配列を含む場合、好ましくはそのグルコアミラーゼは、ｉ）で規定されるそれぞれのアミノ酸（それは部分配列または変異型である）のグルコアミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、グルコアミラーゼは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される。
他の実施形態において本発明による組成物は、
ｉ）配列番号２、５、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５、またはそれらの成熟ポリペプチドのいずれか一つで示されるアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号２、５、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５、またはそれらの上記成熟ポリペプチドのいずれか一つで示されるアミノ酸配列の部分配列、および
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）で示すアミノ酸配列のいずれか一つとの少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．５％の配列の一致を有する変異型アミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む／本質的にそれからなる／それからなるα−アミラーゼを含む。
上記で規定されるα−アミラーゼが部分配列または変異型である場合、好ましくはそのα−アミラーゼは、配列番号２、５、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５、またはそれらの成熟ポリペプチド（それは部分配列または変異型である）から選択されるそれぞれのα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、α−アミラーゼは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」または「Ｋｉｌｏ Ｎｏｖｏ α−アミラーゼ単位（ＫＮＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される。本発明の脈絡では、配列番号２、５、および１９、またはそれらの成熟ポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むα−アミラーゼは、真菌性α−アミラーゼであると考えられ、活性度は「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の上記定義に関して示されるように試験される。配列番号２０〜２５またはそれらの成熟ポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むα−アミラーゼは、細菌性αアミラーゼであると考えられ、活性度は「Ｋｉｌｏ Ｎｏｖｏ α−アミラーゼ単位（ＫＮＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される。
特定の実施形態では、ｉｉｉ）で規定されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるα−アミラーゼは、配列番号２０またはその成熟ポリペプチドで規定されるアミノ配列を含むまたはそれからなるα−アミラーゼのＩ１８１*／Ｇ１８２*／Ｎ１９３Ｆ（配列番号２０のアミノ酸の番号付けを使用して）の変異がなされた変異型である。
他の実施形態によれば、ｉｉｉ）で規定されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるα−アミラーゼは、配列番号２３またはその成熟ポリペプチドで規定されるアミノ配列を含むまたはそれからなるα−アミラーゼのＨ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ（配列番号２１のアミノ酸の番号付けを使用して）の変異がなされた変異型である。
さらなる実施形態では、ｉｉｉ）で規定されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるα−アミラーゼは、配列番号２３またはその成熟ポリペプチドで規定されるアミノ配列を含むまたはそれからなるα−アミラーゼのＧ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ｉ２０１Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ（配列番号２１のアミノ酸の番号付けを使用して）の変異がなされた変異型である。
さらに他の実施形態では本発明による組成物は、
ｉ）配列番号３、１６、１７、および１８、またはそれらの成熟ポリペプチドのいずれか一つで示されるアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号３、１６、１７、および１８、またはそれらの上記成熟ポリペプチドのいずれか一つで示されるアミノ酸配列の部分配列、および
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）で示すアミノ酸配列のいずれか一つとの少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．５％の配列の一致を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む／本質的にそれからなる／それからなるプルラナーゼを含む。
このプルラナーゼが、ｉｉ）で規定される部分配列、またはｉｉｉ）で規定される変異型アミノ酸配列を含む場合、好ましくはそのプルラナーゼは、ｉ）で規定されるそれぞれのアミノ酸（それは部分配列または変異型である）のプルラナーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、プルラナーゼは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される。
そのグルコアミラーゼが、
ｉ）配列番号４またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号４またはその上記成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列の部分配列、および
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）で示すアミノ酸配列のいずれか一つとの少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．５％の配列の一致を有する変異型アミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、かつ
そのプルラナーゼが、
ｉｖ）配列番号３、１６、１７、および１８、またはそれらの成熟ポリペプチドのいずれか一つで示されるアミノ酸配列、
ｖ）配列番号３、１６、１７、および１８、またはそれらの上記成熟ポリペプチドのいずれか一つで示されるアミノ酸配列の部分配列、および
ｖｉ）ｉｖ）およびｖ）で示すアミノ酸配列のいずれか一つとの少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．５％の配列の一致を有する変異型アミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、かつ
そのα−アミラーゼが、
ｖｉｉ）配列番号５またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列、
ｖｉｉｉ）配列番号５またはその上記成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列の部分配列、および
ｉｘ）ｖｉｉ）およびｖｉｉｉ）で示すアミノ酸配列のいずれか一つとの少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．５％の配列の一致を有する変異型アミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる実施形態は、本発明の範囲内にある。
上記グルコアミラーゼが、上記で規定された部分配列または変異型アミノ酸配列である場合、好ましくはそのグルコアミラーゼは、それぞれのアミノ酸配列（例えば配列番号４またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列）（これは部分配列または変異型である）のグルコアミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、グルコアミラーゼは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される。
上記プルラナーゼが、上記で規定された部分配列または変異型アミノ酸配列である場合、好ましくはそのプルラナーゼは、それぞれのアミノ酸配列（例えば配列番号３、１６、１７、および１８、またはそれらの成熟ポリペプチドのいずれか一つで示されるアミノ酸配列）（これは部分配列または変異型である）のプルラナーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、プルラナーゼは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される。
上記で規定されたα−アミラーゼが、部分配列または変異型である場合、好ましくはそのα−アミラーゼは、配列番号５またはその成熟ポリペプチド（それは部分配列または変異型である）から選択されるそれぞれのα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、α−アミラーゼは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される。
特定の実施形態ではグルコアミラーゼは、配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号１またはその成熟ポリペプチドのポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択され、そのグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、グルコアミラーゼは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される。
別の特定の実施形態ではグルコアミラーゼは、配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号４またはその成熟ポリペプチドの成熟ポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択され、そのグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、グルコアミラーゼは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される。
特定の実施形態ではα−アミラーゼは、配列番号２で開示されるα−アミラーゼから、あるいは配列番号２またはその成熟ポリペプチドのポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するα−アミラーゼから選択され、そのα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、α−アミラーゼは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される。別の特定の実施形態ではα−アミラーゼは、配列番号５で開示されるα−アミラーゼから、あるいは配列番号５またはその成熟ポリペプチドのポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するα−アミラーゼから選択され、そのα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、α−アミラーゼは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される。
特定の実施形態ではプルラナーゼは、配列番号３またはその成熟ポリペプチドで開示されるプルラナーゼと、配列番号３またはその成熟ポリペプチドのポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択され、そのプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有する。この場合、プルラナーゼは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される。
さらなる特定の実施形態では組成物は、
ｉ）配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号１の成熟ポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択されるグルコアミラーゼ（このグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有し、この場合、それは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉ）配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼと、配列番号２の成熟ポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するα−アミラーゼとから選択されるα−アミラーゼ（このα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有し、この場合、それは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される）、および
ｉｉｉ）配列番号３またはその成熟ポリペプチドで開示されるプルラナーゼと、配列番号３の成熟ポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択されるプルラナーゼ（このプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有し、この場合、それは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される）
を含む。
具体的にはこの組成物は、
ｉ）配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号１またはその成熟ポリペプチドの成熟ポリペプチドとの少なくとも９０％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択されるグルコアミラーゼ（このグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも９０％を有し、この場合、それは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉ）配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼと、配列番号２またはその成熟ポリペプチドの成熟ポリペプチドとの少なくとも９０％の配列の一致を有するα−アミラーゼとから選択されるα−アミラーゼ（このα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも９０％を有し、この場合、それは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される）、および
ｉｉｉ）配列番号３またはその成熟ポリペプチドで開示されるプルラナーゼと、配列番号３またはその成熟ポリペプチドの成熟ポリペプチドとの少なくとも９０％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択されるプルラナーゼ（このプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも９０％を有し、この場合、それは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される）
を含むことができる。
具体的にはこの組成物は、
ｉ）配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号１またはその成熟ポリペプチドのグルコアミラーゼとの少なくとも９５％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択されるグルコアミラーゼ（このグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、グルコアミラーゼは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉ）配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼと、配列番号２の成熟ポリペプチドとの少なくとも９５％の配列の一致を有するα−アミラーゼとから選択されるα−アミラーゼ（このα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉｉ）配列番号３で開示されるプルラナーゼまたはその成熟ポリペプチドと、配列番号３の成熟ポリペプチドとの少なくとも９５％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択されるプルラナーゼ（このプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される）
を含むことができる。
具体的にはこの組成物は、
ｉ）配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号１の成熟ポリペプチドとの少なくとも９７％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択されるグルコアミラーゼ（このグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉ）配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼと、配列番号２の成熟ポリペプチドとの少なくとも９７％の配列の一致を有するα−アミラーゼとから選択されるα−アミラーゼ（このα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉｉ）配列番号３またはその成熟ポリペプチドで開示されるプルラナーゼと、配列番号３の成熟ポリペプチドとの少なくとも９７％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択されるプルラナーゼ（このプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される）
を含むことができる。
具体的にはこの組成物は、
ｉ）配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号１の成熟ポリペプチドとの少なくとも９９％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択されるグルコアミラーゼ（このグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号１またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉ）配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼと、配列番号２の成熟ポリペプチドとの少なくとも９９％の配列の一致を有するα−アミラーゼとから選択されるα−アミラーゼ（このα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号２またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉｉ）配列番号３またはその成熟ポリペプチドで開示されるプルラナーゼと、配列番号３の成熟ポリペプチドとの少なくとも９９％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択されるプルラナーゼ（このプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される）
を含むことができる。
さらなる特定の実施形態では組成物は、
ｉ）配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号４の成熟ポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択されるグルコアミラーゼ（このグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有し、この場合、それは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉ）配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼと、配列番号５の成熟ポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するα−アミラーゼとから選択されるα−アミラーゼ（このα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有し、この場合、それは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される）、および
ｉｉｉ）配列番号３またはその成熟ポリペプチドで開示されるプルラナーゼと、配列番号３の成熟ポリペプチドとの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択されるプルラナーゼ（このプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または例えば少なくとも９５％を有し、この場合、それは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される）
を含む。
具体的にはこの組成物は、
ｉ）配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号４の成熟ポリペプチドとの少なくとも９０％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択されるグルコアミラーゼ（このグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度少なくとも９０％を有し、この場合、それは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉ）配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼと、配列番号５の成熟ポリペプチドとの少なくとも９０％の配列の一致を有するα−アミラーゼとから選択されるα−アミラーゼ（このα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される）、および
ｉｉｉ）配列番号３またはその成熟ポリペプチドで開示されるプルラナーゼと、配列番号３の成熟ポリペプチドとの少なくとも９０％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択されるプルラナーゼ（このプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも９０％を有し、この場合、それは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される）
を含むことができる。
具体的にはこの組成物は、
ｉ）配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号４の成熟ポリペプチドとの少なくとも９５％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択されるグルコアミラーゼ（このグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉ）配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼと、配列番号５の成熟ポリペプチドとの少なくとも９５％の配列の一致を有するα−アミラーゼとから選択されるα−アミラーゼ（このα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される）、および
ｉｉｉ）配列番号３またはその成熟ポリペプチドで開示されるプルラナーゼと、配列番号３の成熟ポリペプチドとの少なくとも９５％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択されるプルラナーゼ（このプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも９５％のプルラナーゼ活性度を有し、この場合、それは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される）
を含むことができる。
具体的にはこの組成物は、
ｉ）配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号４の成熟ポリペプチドとの少なくとも９７％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択されるグルコアミラーゼ（このグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉ）配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼと、配列番号５の成熟ポリペプチドとの少なくとも９７％の配列の一致を有するα−アミラーゼとから選択されるα−アミラーゼ（このα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される）、および
ｉｉｉ）配列番号３またはその成熟ポリペプチドで開示されるプルラナーゼと、配列番号３の成熟ポリペプチドとの少なくとも９７％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択されるプルラナーゼ（このプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される）
を含むことができる。
具体的にはこの組成物は、
ｉ）配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼと、配列番号４の成熟ポリペプチドとの少なくとも９９％の配列の一致を有するグルコアミラーゼとから選択されるグルコアミラーゼ（このグルコアミラーゼは、グルコアミラーゼ活性、例えば配列番号４またはその成熟ポリペプチドで開示されるグルコアミラーゼのグルコアミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉ）配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼと、配列番号５の成熟ポリペプチドとの少なくとも９９％の配列の一致を有するα−アミラーゼとから選択されるα−アミラーゼ（このα−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性、例えば配列番号５またはその成熟ポリペプチドで開示されるα−アミラーゼのα−アミラーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「酸性α−アミラーゼ単位（ＦＡＵ（Ａ））」の定義に関して上記で示したように試験される）、
ｉｉｉ）配列番号３またはその成熟ポリペプチドで開示されるプルラナーゼと、配列番号３の成熟ポリペプチドとの少なくとも９９％の配列の一致を有するプルラナーゼとから選択されるプルラナーゼ（このプルラナーゼは、プルラナーゼ活性、例えば配列番号３またはその成熟ポリペプチドで示されるアミノ酸配列のプルラナーゼ活性度の少なくとも９５％を有し、この場合、それは「プルラナーゼ活性（ＮＰＵＮ）」の定義に関して上記で示したように試験される）
を含むことができる。
これら組成物は、当業界で知られている方法に従って調製することができ、液状または乾燥組成物の形態であることができる。これら組成物は、当業界で知られている方法に従って安定化することができる。
使用法
本発明による組成物は、グルコースシロップを生産するために糖化工程において使用することができる。したがって、さらなる態様において本発明は、液化デンプンを本発明による組成物と接触させるステップを含む、液化デンプンからグルコースシロップを製造する方法に関する。
本発明は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない下記の実施例によってさらに記述される。
材料および方法
グルコアミラーゼ活性
グルコアミラーゼ活性（ＡＧＵ）
グルコアミラーゼ単位（ＡＧＵ）は、標準条件（３７℃、ｐＨ４．３、基質：１００ｍＭマルトース、緩衝液：０．１Ｍ酢酸、下記グルコアミラーゼインキュベーションで示される６分間の反応時間）下で、１分当たり１μモルのマルトースを加水分解し、それによってグルコースを生成する酵素の量と定義される。
Figure 0006591993
分析原理は３つの反応ステップによって記述される。
ステップ１は酵素反応である。
グルコアミラーゼ（ＡＭＧ）、ＥＣ３．２．１．３（エキソ−α−１，４−グルカン−グルコヒドロラーゼ）がマルトースを加水分解してα−Ｄ−グルコースを形成する。インキュベート後、反応をＮａＯＨで停止する。
ステップ２および３はエンドポイント反応を引き起こす。
グルコースを、ヘキソキナーゼによって触媒される反応においてＡＴＰによりリン酸化する。形成されたグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸脱水素酵素によって酸化して６−ホスホグルコン酸にする。この同じ反応において等モル量のＮＡＤ＋が還元されてＮＡＤＨになり、結果として３４０ｎｍにおける吸光度が増加する。Ｋｏｎｅｌａｂ ３０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの自動分析装置を使用することができる。
Figure 0006591993
酸性α−アミラーゼ活性
本発明により使用される場合、任意の酸性α−アミラーゼの活性度は、単位ＦＡＵ（Ａ）（酸性真菌性α−アミラーゼ単位（Ａｃｉｄ Ｆｕｎｇａｌ Ａｌｐｈａ−ａｍｉｌａｓｅ Ｕｎｉｔｓ））で測定することができる。
酸性α−アミラーゼ活性（ＦＡＵ（Ａ））
酸性α−アミラーゼの活性度は、単位ＦＡＵ（Ａ）（酸性真菌性α−アミラーゼ単位）で測定することができる。１ＦＡＵ（Ａ）は、標準条件下で１時間当たり５．２６０ｍｇのデンプン乾物を分解する酵素の量と定義される。
酸性α−アミラーゼ、エンド−α−アミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカン−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプン分子の内部領域でα−１，４−グリコシド結合を加水分解して、様々な鎖長を有するデキストリンおよびオリゴ糖を形成する。ヨウ素により形成される色の彩度は、デンプンの濃度に正比例する。アミラーゼの活性度は、指定した分析条件下で逆比色分析を使用してデンプンの濃度の低下として求められる。
ＦＡＵ（Ａ）、すなわち酸性α−アミラーゼの活性度は、下記の記述に従って求められ、それはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから請求に応じて入手できるＮｏｖｏｚｙｍｅｓ基準と比較して測定される。この反応の原理は２つのステップに基づく。第一ステップにおいて酵素、すなわち酸性α−アミラーゼは、デンプンを様々なオリゴ糖に加水分解する。第二ステップにおいてヨウ素は、その分解生成物ではなくデンプンと青色の錯体を形成する。
したがって色の彩度は、デンプンの濃度に正比例する。活性度は、指定した分析条件下で逆比色分析を使用してデンプンの濃度の低下として求められる。
Figure 0006591993
さらなる詳細が好ましい場合、それらはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから請求に応じて入手できるＥＢ−ＳＭ−０５１０．０２中に見出すことができ、それは参照により援用される。
プルラナーゼ活性
エンド−プルラナーゼは、プルラン中のα−１，６−グリコシド結合を加水分解し（−ＢＨ４で還元してバックグラウンドの還元糖を還元する）、還元性炭水化物末端を有するマルトトリオースを放出する。プルラナーゼは、酵素分類番号Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１を有するプルラン、すなわち６−グルカノ−ヒドロラーゼである。
ＮＰＵＮ（ニュー・プルラナーゼ・ユニット・ノボザイム）は、下記の手順で測定されるエンドプルラナーゼの活性度の単位であり、それはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから請求に応じて入手できるＮｏｖｏｚｙｍｅｓ基準と比較して測定される。
１ＮＰＵＮ＝１プルラナーゼ単位（ＮＰＵＮ）は、標準条件下で１分当たり０．３５μモルのグルコースに相当する還元性末端を放出する酵素量として定義される。
第一反応では基質は、主試料およびブランク試料の両方に等しく存在する。しかしながら主試料の反応はｐＨ５．０で行われ、一方、プルラナーゼおよびアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）のどちらも酵素的に活性でないｐＨ９．６のブランク試料では反応は存在しない。
Figure 0006591993
第二反応ではｐＨは約９．６に調整され、試料中のグルコースは、グルコキナーゼによって非還元性Ｄ−グルコース−６−リン酸にリン酸化される。これはこの範囲で最適な活性および安定性を有し、かつｐＨ９においてグルコースに特異的である（Ｇｏｗａｒｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９８６，２３７，ｐｐ４１５〜４２０参照）。このステップは、主試料およびブランク試料の同一ｐＨに依存し、両方の等量のグルコースを除去する。
Figure 0006591993
第二反応は、ＰＡＨＢＡＨ（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）およびビスマスを含有するアルカリ性試薬＞ｐＨ１１によって停止される。還元糖と錯体を作って、４０５ｎｍで検出される色を発生する。生ずる色は、プルラナーゼ活性度に比例する。
Figure 0006591993
さらなる詳細が好ましい場合、それらはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから請求に応じて入手できる２０１０−２８８３５−０２中に見出すことができ、それは参照により援用される。
実施例１
この実験のためにデキストリン当量（ＤＥ）が１１に調整されたマルトデキストリンを、トウモロコシデンプンを使用する通常のデンプン液化工程により調製し、噴霧乾燥した。このマルトデキストリン粉末をｍｉｌｌｉＱ水中に溶解し、ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨによって６０℃で４．３になるように調整し、次いでそのシロップの屈折率（ＲＩ）を測定することによってその固形物を３３％乾燥固体（ＤＳ）に調整した。１８ｇのマルトデキストリン溶液と、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（配列番号１）、プルラナーゼ（Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ Ｄ２（登録商標））（配列番号３）、およびクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸性α−アミラーゼ（配列番号２）を含有する２ｍＬの酵素混合物とを、様々な用量で混ぜ合わせることによって糖化を開始させた。試料を撹拌しながら６０℃でインキュベートし、糖成分を決定するために様々な時間間隔で取り出した。ＤＰ１画分が最大化する時点における酵素用量およびＤＰ１〜ＤＰ４＋の組成を表１に示した。
Figure 0006591993
表１は、４４．８９より高いＮＰＵＮ／ＦＡＵ（Ａ）比を有する酵素ブレンドが、Ｄｅｘｔｒｏｚｙｍｅ ＤＸ（登録商標）より高いＤＰ１画分を示したことを示す。Ｄｅｘｔｒｏｚｙｍｅ ＤＸより３倍高いＮＰＵＮ活性度（ＤＳ １ｇ当たり１．０１ＮＰＵＮ／ＦＡＵ（Ａ））においてさえ、ＤＰ１のピークは、０．０４５よりも高いＦＡＵ（Ａ）活性度においてＤｅｘｔｒｏｚｙｍｅ ＤＸほど高くはなかった。
実施例２
様々な酵素ブレンドを使用した糖化
トウモロコシデンプンの液化から得られたマルトデキストリン粉末を加熱しながら水に溶解して３４．４％乾燥固体のスラリーを作製した。スラリーの固形物含量を屈折率の測定を使用して測定したところ１．３９２７１を示した。１Ｍ塩酸溶液を使用してスラリーを４．３のｐＨに調整した。このスラリーの分割量１８ｇを１８個のセプタムキャップ付きガラス製反応用シンチレーションバイアルに加え、それを加熱ブロック中に挿入して６１℃の温度に加熱した。下記の表に基づいて各バイアルに酵素用量を加え、３３％の目標乾燥固体に至るように各バイアルに追加の水を加えた。その酵素ブレンドは、キチリメンタケ（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ ｔｒａｂｅｕｍ）由来のグルコアミラーゼ（配列番号４）、リゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）由来のα−アミラーゼ（配列番号５）、およびバチルス・デラミフィンカス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｎｃａｓ）由来のプルラナーゼ（配列番号３）を含んだ。各バイアルから隔壁を介して注射針で１．５ｍＬの試料を様々な時点（３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、および６０時間）で採取し、１０５℃で５分間失活させた。各失活試料１ｍＬを４ｍＬの脱イオン水で希釈した。希釈した試料は、デキストロース純度（ＤＰ１％またはＤＸ％）の測定のためにＨＰＬＣ法を使用してＤＰ１〜４が評価された。
表２の結果は、ＮＰＵＮ／ＦＡＵ（Ａ）比が高いほど、デキストロース％が高いことを示す。
Figure 0006591993
上記と同じ手順に従って行った別の実験における結果を表３に示す。
Figure 0006591993
本明細書中で開示された態様は本発明の幾つかの態様の例示を意図しているので、本明細書中で記述されまた特許請求される本発明は、それら特定の態様による範囲に限定されるべきではない。任意の均等の態様は本発明の範囲内にあることを意図している。実際には本明細書中で示しかつ記述したものに加えて本発明の様々な修正形態が、前述の記述から当業者には明らかになるはずである。そのような修正形態もまた、別添の特許請求の範囲に含まれることを意図している。不一致の場合、定義を含めた本発明の開示内容が支配することになる。

Claims (6)

  1. α−アミラーゼ、プルラナーゼ、およびグルコアミラーゼ酵素を含み、前記α−アミラーゼが、配列番号５またはその成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは該アミノ酸配列からなり、前記プルラナーゼが、配列番号３またはその成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは該アミノ酸配列からなり、前記グルコアミラーゼが、配列番号４またはその成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは該アミノ酸配列からなり、そして、ＮＰＵＮ／ｇ ＤＳとして表されるプルラナーゼ用量対ＦＡＵ（Ａ）／ｇ ＤＳとして表されるα−アミラーゼ用量の比が９０以上である、組成物。
  2. 前記組成物が、配列番号４で開示される前記グルコアミラーゼから、あるいは配列番号４の前記成熟ポリペプチドとの少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するグルコアミラーゼから選択されるグルコアミラーゼと、配列番号５で開示される前記α−アミラーゼから、あるいは配列番号５の前記成熟ポリペプチドとの少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するα−アミラーゼから選択されるα−アミラーゼと、配列番号３で開示されるプルラナーゼから、あるいは配列番号３の前記成熟ポリペプチドとの少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するプルラナーゼから選択されるプルラナーゼとを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 液化デンプンを請求項１または２に記載の組成物と接触させるステップを含む、前記液化デンプンからグルコースシロップを製造する方法。
  4. （ａ）液化デンプンをグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、およびα−アミラーゼと接触させるステップであって、前記α−アミラーゼが、配列番号５またはその成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは該アミノ酸配列からなり、前記プルラナーゼが、配列番号３またはその成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは該アミノ酸配列からなり、前記グルコアミラーゼが、配列番号４またはその成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは該アミノ酸配列からなり、そして、ＮＰＵＮ／ｇ ＤＳとして表されるプルラナーゼ用量対ＦＡＵ（Ａ）／ｇ ＤＳとして表されるα−アミラーゼ用量の比が９０以上である、ステップと、（ｂ）前記液化デンプンを糖化するステップとを含む、液化デンプンからグルコースシロップを製造する方法。
  5. 前記液化デンプン基質中の初期乾燥固体含量（ＤＳ）が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％である、請求項４に記載の方法。
  6. 糖化時間が、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、または少なくとも７２時間である、請求項４または５に記載の方法。
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