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CN103140586A - 产生发酵产物的方法 - Google Patents

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CN103140586A CN2011800480075A CN201180048007A CN103140586A CN 103140586 A CN103140586 A CN 103140586A CN 2011800480075 A CN2011800480075 A CN 2011800480075A CN 201180048007 A CN201180048007 A CN 201180048007A CN 103140586 A CN103140586 A CN 103140586A
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starch
acid
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C-L.索恩格
福山志朗
A.诺尔加德
P.尼尔森
P.R.欧斯特加德
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Novo Nordisk AS
Novozymes North America Inc
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Abstract

本发明涉及使用发酵生物在发酵培养基中将植物材料发酵为发酵产物的工艺，其中一种或多种脱酰胺酶存在于发酵培养基中。

Description

产生发酵产物的方法
技术领域
本发明涉及使用一种或多种发酵生物从植物材料产生发酵产物的方法；可用于本发明的方法和/或工艺的组合物、转基因植物和修饰的发酵生物。
背景技术
大量难以合成产生的商品如今可通过发酵生物产生。此类产品包括醇(例如乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐/酯(gluconate)、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)和激素。发酵亦常用于可消费的醇(例如啤酒和葡萄酒)，乳制品(例如，用于酸奶和奶酪的产生)，皮革，和烟草工业。
本领域中已知大量通过发酵由含淀粉材料的降解提供的糖而产生发酵产物如乙醇的方法。
然而，从此类植物材料产生发酵产物如乙醇仍然过于昂贵。因此，存在提供可增加发酵产物的收率(yield)，并由此减少生产成本的方法的需要。
Yong等,2004,J.Agric.Food Chem.52:7094-7100公开了玉米醇溶蛋白(zein)可通过脱酰胺酶(蛋白质-谷氨酰胺酶)的作用而溶解。对于小麦谷蛋白的类似观察公开于Yong等,2006,J.Agric.Food Chem.54:6034-6040。
美国专利号7,279,298公开了金黄杆菌属菌种(Chryseobacterium sp.)脱酰胺酶在溶解具有≥5000Da的分子量的植物/动物蛋白中的用途。
本发明的一个目的是提供改善的用于产生发酵产物的方法/工艺。
发明内容
本发明涉及从糊化或未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法。具体而言，本发明涉及产生发酵产物的方法，其包括：
(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)用葡糖淀粉酶将糊精糖化为糖；
(c)添加脱酰胺酶；和
(d)使用发酵生物发酵糖。
本发明亦涉及组合物，其包含一种或多种脱酰胺酶和一种或多种选自下组的酶：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶和普鲁兰酶。
本发明亦涉及本发明的脱酰胺酶或组合物在产生发酵产物的发酵方法中的用途。
本发明亦涉及修饰的发酵生物，其经编码脱酰胺酶的多核苷酸转化，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达所述脱酰胺酶。
发明详述
本发明涉及产生发酵产物的方法，其包括：
(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)用葡糖淀粉酶将糊精糖化为糖；
(c)添加脱酰胺酶；和
(d)使用发酵生物发酵糖。
发酵产物
术语“发酵产物”意指由包括使用发酵生物发酵的方法或工艺产生的产物。根据本发明涵盖的发酵产物包括醇(例如乙醇，甲醇，丁醇)；有机酸(例如柠檬酸，乙酸，衣康酸，乳酸，琥珀酸，葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)；抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒；或工业乙醇或在可消费醇类工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。
优选的发酵方法包括醇类发酵方法。根据本发明获得的发酵产物如乙醇，可优选地用作燃料。然而，在乙醇的情况下，其亦可用作可饮用的乙醇。
含淀粉材料
根据本发明，可使用任何合适的含淀粉材料，包括粒状淀粉(生的、未经烹制的淀粉)。所述起始材料通常基于期望的发酵产物而选择。适用于本发明的方法或工艺的含淀粉起始材料的实例包括大麦、豆类、木薯、谷类、玉米、买罗高粱、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、树薯、小麦和全谷粒，或其任意混合物。所述含淀粉材料亦可为蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。
术语“粒状淀粉”意指生的、未烹制的淀粉，即，以其天然形式存在于谷类、块茎或谷粒中的淀粉。淀粉在植物细胞中作为微小的不溶于水的颗粒形成。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀(swell)。在高至50℃至75℃的温度，膨胀可为可逆的。然而，在更高温度开始称为“糊化”的不可逆膨胀。待加工的粒状淀粉可为高度精制的淀粉质量，优选至少90%，至少95%，至少97%或至少99.5%纯，或者其可为更加粗制的含淀粉材料，其含有包括非淀粉部分(例如胚残余物和纤维)的(例如，磨制的)全谷粒。原材料(如全谷粒)可通过例如磨制减小粒度以打开其结构并允许进一步的加工。根据本发明优选两种方法，湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨给出胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并通常用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域是公知的，并等同地涵盖于本发明的工艺中。在一个实施方案中，粒度减少至0.05到3.0mm，优选0.1-0.5mm，或使得至少30%，优选至少50%，更优选至少70%，甚至更加优选至少90%的含淀粉材料可穿过具有0.05到3.0mm筛网，优选0.1到0.5mm筛网的筛。
用于自糊化的含淀粉材料产生发酵产物的工艺
在本发明的该方面，在液化步骤中用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精，接着进行糖化和发酵。糖化和发酵步骤可顺序或同时进行。
所述糖化和发酵步骤可顺序或同时进行。可在液化、糖化、发酵或同时糖化/发酵过程中添加脱酰胺酶。
液化优选在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行。在一个实施方案中，在液化过程中添加普鲁兰酶(pullulanase)。发酵生物优选为酵母，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。
液化可作为三步热浆工艺来进行。将浆料加热至60-95℃，例如80-85℃，并添加α-淀粉酶以起始液化(稀化)。然后可将浆料在95-140℃，例如105-125℃的温度喷射蒸煮约1-15分钟，例如约3-10分钟，特别是约5分钟。使浆料冷却至60-95℃并添加更多的α-淀粉酶以完成水解(二次液化)。液化过程通常在pH4.5至6.5，特别是在pH5至6进行。所有α-淀粉酶可作为单剂例如在喷射蒸煮之前添加。
糖化步骤可使用本领域公知的条件进行。举例而言，完全的糖化步骤可持续约24至约72小时，然而，仅在30-65℃，通常约60℃的温度进行通常40-90分钟的预糖化，然后在同时发酵和糖化(SSF)工艺中在发酵过程中进行完全糖化也是常见的。糖化通常在20-75℃，例如40-70℃，通常约60℃的温度，在约pH4至5的pH，通常在约pH4.5进行。
在一个实施方案中，糖化和发酵同时进行(SSF)，其中对于糖化没有保持阶段，意指发酵生物(如酵母)和酶(包括脱酰胺酶)可一同添加。当发酵生物是酵母，如酿酒酵母的菌株，而所需的发酵产物是乙醇时，SSF通常在20℃至40℃，如26℃至34℃，优选约32℃的温度进行。
其它发酵产物可在本领域技术人员公知的适于所讨论的发酵生物的条件和温度下进行发酵。根据本发明，温度可在发酵过程中调高或调低。
在一个具体实施方案中，本发明的方法在将含淀粉材料转化为糊精之前还包括下述步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度；和
y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
用于减少含淀粉材料的粒度的方法对于本领域技术人员是已知的。在一个实施方案中，磨制所述含淀粉材料以减少粒度。
含水浆料可含有10-55w/w%干固体(DS)，优选25-45w/w%干固体(DS)，更优选30-40w/w%干固体(DS)的含淀粉材料。将浆料加热到糊化温度以上，并可添加α-淀粉酶，优选细菌和/或酸性真菌α-淀粉酶以起始液化或稀化。在进行本发明步骤i)中的α-淀粉酶处理前，浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步使浆料糊化。
自未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法
在该方面，本发明涉及用于从未经糊化(常称作“未经烹制”)的含淀粉材料产生发酵产物的方法。在一个实施方案中，本发明的方法包括在起始糊化温度以下，优选在α-淀粉酶和/或糖源生成酶的存在下对(例如经磨制的)含淀粉材料例如粒状淀粉进行糖化以产生糖类，所述糖类可由合适的发酵生物发酵成所需的发酵产物。
在本发明的一个实施方案中，自未糊化的(即未烹制的)、优选磨制的谷类谷粒如玉米来产生所需的发酵产物，优选乙醇。
因此，在该方面本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括下述步骤：
(a)在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度糖化所述含淀粉材料；
(b)使用一种或多种发酵生物进行发酵，其中发酵在一种或多种脱酰胺酶的存在下进行。
在一个优选实施方案中，步骤(a)和(b)同时(即一步发酵)或顺序进行。
发酵产物，如特别是乙醇，可在发酵之后例如通过蒸馏来回收。通常在发酵过程中存在淀粉酶，如葡糖淀粉酶和/或其它糖源生成酶和/或α-淀粉酶。
术语“起始糊化温度”意指淀粉发生糊化的最低温度。一般而言，在水中加热的淀粉在约50℃至75℃开始糊化；糊化的准确温度取决于特定的淀粉，并可方便的由本领域技术人员确定。从而，起始糊化温度可根据植物物种，植物物种的特定品种以及生长条件而改变。在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的起始糊化温度可使用由Gorinstein和Lii,1992,
Figure BDA00003004058100051
44(12):461-466描述的方法确定为5%的淀粉颗粒丧失双折射的温度。
在步骤(a)之前，可制备含淀粉材料，如粒状淀粉的浆料，其具有10-55wt%含淀粉材料的干固体(DS)，优选25-45wt%干固体，更优选30-40wt%干固体。浆料可包含水分和/或工艺水(process water)，例如釜馏物(逆流(backset))、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或来自其它发酵产物设备(plant)的工艺水。由于本发明的方法在糊化温度以下进行，因此不发生显著的粘度增加，如果需要，可使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含约1至约70vol%，优选15-60vol%，特别为约30至50vol%水和/或工艺水，例如釜馏物(逆流)、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水或来自其它发酵产物设备的工艺水，或其组合等。
可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0.05至3.0mm，优选0.1至0.5mm来制备含淀粉材料。在进行本发明的方法或工艺后，含淀粉材料中至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少优选99%的干固体转化为可溶的淀粉水解物。
本发明该方面的方法在低于起始糊化温度的温度进行。当步骤(a)和发酵步骤(b)分别进行时，温度通常处于30至75℃的范围，优选45至60℃的范围。然后在适于所述发酵生物的温度进行后续的单独发酵步骤(b)，当发酵生物为酵母时，所述温度通常在25至40℃的范围。
在一个优选实施方案中，步骤(a)和(b)作为同时糖化和发酵工艺进行。在该实施方案中，当发酵生物是酵母时，所述工艺通常在25至40℃，如29至35℃，如30至34℃，如约32℃的温度进行。本领域技术人员可容易地确定何种工艺条件是合适的。
在一个实施方案中，进行发酵从而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如6wt%以下，如约3wt%以下，如约2wt%以下，如约1wt%以下，如约0.5wt%以下，或如约0.25wt%以下，如约0.1wt%以下。所述低水平的糖可通过简单的使用经调整量的酶和发酵生物来实现。本领域技术人员可方便地确定使用的发酵生物和酶的剂量/量。发酵生物和酶的使用量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言，麦芽糖水平可保持为约0.5wt%以下，如约0.2wt%以下。
本发明的方法可在约3-7的pH，优选pH3.5至6，或更优选pH4至5进行。
糖化和发酵
在本发明的一个实施方案中，糖化和发酵作为同时糖化和发酵(SSF)步骤进行。通常，这意指组合的/同时糖化和发酵在适于，优选最适于所讨论的发酵生物的条件(例如温度和/或pH)下进行。
在另一个实施方案中，糖化和发酵作为混合糖化和发酵进行，其通常以单独的部分水解步骤起始，并以同时水解和发酵步骤结束。单独的部分水解步骤是酶糖化步骤，其通常在适于，优选最适于所讨论的水解酶的条件(例如，在更高温度)下进行。后续的同时糖化和发酵步骤通常在适于所述发酵生物的条件(通常在低于单独的水解步骤的温度)下进行。
在另一个实施方案中，所述糖化和发酵步骤亦可作为单独糖化和发酵进行，其中在发酵起始之前完成糖化。
发酵生物
术语“发酵生物”指适于产生所需发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，包括酵母和丝状真菌。根据本发明合适的发酵生物能够将可发酵的糖，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖或阿拉伯糖直接或间接发酵即转化为所需的发酵产物。
发酵生物的实例包括真菌生物如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)的菌株，特别是树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵母(Candida utilis)、阿糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、Candida sonorensis、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)或博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)的菌株。其它发酵生物包括汉逊酵母属(Hansenula)的菌株，特别是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)的菌株；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。
优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵细菌(Zymobactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)，特别是酪酸梭菌(Clostridium butyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的菌株，以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77:61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)或Thermoanaerobacter mathrani的菌株。还想到的是乳杆菌属(Lactobacillus)以及谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)，热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)的菌株。
在一个实施方案中，所述发酵生物是C6糖发酵生物，例如，酿酒酵母的菌株。
在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每ml发酵培养基中活的发酵生物如酵母计数为105至1012，优选107至1010的范围内，特别是约5x107。
对于乙醇发酵，酵母是优选的发酵生物。优选酵母属(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种的菌株，优选对高水平的乙醇，即高至例如约10，约12，约15或约20vol%或更高的乙醇具有抗性的菌株。
商业上可获得的酵母包括，例如RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre,USA获得)，FALI(可从Fleischmann’s Yeast,USA获得)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从Ethanol Technology,WI,USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North AmericanBioproducts Corporation,GA,USA获得)，GERT STRAND(可从Gert Strand AB,Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。
根据本发明，能够从可发酵的糖(包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖或阿拉伯糖)产生所需的发酵产物的发酵生物优选在准确的条件下以特定的生长速率生长。当将所述发酵生物导入/添加入所述发酵培养基时，接种的发酵生物经过许多阶段。起初，生长并未发生。该期间称为“迟滞期”，且可视为适应期。在下一个称为“指数期”的阶段，生长速率逐渐增加。经过一段最大生长的时间，生长速率停止，且所述发酵生物进入“稳定期”。又一段时间后所述发酵生物进入“死亡期”，此时活细胞数减少。
在一个实施方案中，当发酵生物在迟滞期时，将脱酰胺酶添加至发酵培养基。
在另一个实施方案中，当发酵生物在指数期时，将脱酰胺酶添加至发酵培养基。
在另一个实施方案中，当发酵生物在稳定期时，将脱酰胺酶添加至发酵培养基。
发酵
用于本发明的发酵方法或工艺中的植物起始材料为含淀粉材料。发酵条件基于例如，植物材料的种类、可用的可发酵糖类、发酵生物和/或期望的发酵产物来确定。本领域技术人员可容易地确定合适的发酵条件。根据本发明的发酵可在通常使用的条件下进行。优选的发酵方法为厌氧方法。
本发明的方法或工艺可作为分批或连续过程进行。本发明的发酵可在超滤系统中进行，其中在固体、水和发酵生物存在下保持渗余物的循环，而其中渗透物为含有所期望的发酵产物的液体。同样涵盖的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法/工艺，其中在固体、水和发酵生物存在下保持渗余物的循环，而其中渗透物为含有发酵产物的液体。
在发酵后，发酵生物可自发酵浆料分离并再循环。
发酵培养基
发酵培养基("Fermentation media"或"fermentation medium")指其中进行发酵的环境，并包括发酵底物，即由发酵生物代谢的糖源，并可包括发酵生物。
发酵培养基可包含对于发酵生物的营养物和生长刺激物。营养物和生长刺激物广泛用于发酵领域，并包括氮源如氨；维生素和矿物质，或其组合。
在发酵之后，所述发酵培养基可进一步包含发酵产物。
淀粉来源的糖的发酵
多种发酵生物可用于发酵来源于含淀粉材料的糖。发酵常规地使用酵母，例如酵母属的酵母，如酿酒酵母的菌株作为发酵生物来进行。然而，细菌和丝状真菌亦可用作发酵生物。一些细菌具有与例如酿酒酵母相比更高的最佳发酵温度。因此，在此类情况下，发酵可在高至75℃，例如40-70℃，如50-60℃的温度进行。然而，具有显著较低至约室温(约20℃)的最适温度的细菌也是已知的。合适的发酵生物的实例可见于上文“发酵生物”部分。
对于使用酵母的乙醇产生，在一个实施方案中，发酵可进行24至96小时，特别是35至60小时。在一个实施方案中，发酵在20至40℃，优选26至34℃，特别是32℃左右的温度进行。在一个实施方案中，pH为3至6，优选为pH4至5左右。
其它发酵产物可在本领域技术人员已知适于所讨论的发酵生物的温度进行发酵。
发酵通常在3至7范围的pH，优选在pH3.5至6，如约pH5进行。发酵通常持续24-96小时。
回收
在发酵之后，可将发酵产物从发酵培养基分离。可蒸馏发酵培养基以提取所需发酵产物，或可通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基提取所需发酵产物。或者，发酵产物可通过汽提来回收。回收的方法在本领域是公知的。
酶
即使未在本发明的方法或工艺的上下文中具体提及，应理解的是酶以“有效量”使用。
脱酰胺酶
根据本发明，脱酰胺酶是对游离氨基酸(天冬酰胺和谷氨酰胺)或肽和/或多肽的氨基酸序列中的侧链酰胺基团起作用，并由此释放侧链羧基基团和氨的酶。脱酰胺酶的实例包括天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)、谷氨酰胺酶(EC3.5.1.2)，肽谷氨酰胺酶(EC3.5.1.43)，和蛋白质-谷氨酰胺谷氨酰胺酶(EC3.5.1.44)。脱酰胺酶可来源于噬纤维菌目(Cytophagales)或放线菌目(Actinomycetes)，更具体而言来自金杆菌属(Aureobacterium)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、稳杆菌属(Empedobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、Myroides或鞘杆菌属(Sphingobacterium)。脱酰胺酶亦可来源于芽孢杆菌属(Bacillus)，例如解淀粉芽孢杆菌。
在一个实施方案中，所述脱酰胺酶与美国专利号6,251,651中公开的SEQID NO:6具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，和至少100%序列同一性。
所述脱酰胺酶可在淀粉材料至糊精的转化，糊精的糖化，或发酵过程中添加/导入。所述脱酰胺酶可来自外源来源，和/或可例如通过由发酵生物进行的脱酰胺酶的过表达而原位产生。后者可通过制备能够表达脱酰胺酶的修饰的发酵生物如酵母来实现，例如，通过用一种或多种脱酰胺酶编码基因转化所述酵母或通过导入增加内源脱酰胺酶基因表达的启动子来实现。用于将脱酰胺酶基因导入发酵生物如酵母，和/或在发酵生物中过表达脱酰胺酶基因的技术在本领域中是已知的。脱酰胺酶亦可以以含有和/或表达脱酰胺酶的转基因植物材料的形式存在于/被导入发酵培养基。
α-淀粉酶
根据本发明，可使用任何α-淀粉酶，如真菌、细菌或植物来源的α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加时在3至7，优选3.5至6，或更优选4-5的范围内的pH具有最佳活性的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。
细菌α-淀粉酶
根据本发明，细菌α-淀粉酶优选来源于芽孢杆菌属(Bacillus)。
在一个优选实施方案中，所述芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的菌株，但也可来源于其它芽孢杆菌属菌种。涵盖的α-淀粉酶的特定实例包括WO99/19467的SEQ IDNO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，WO99/19467中的SEQ ID NO:4中所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，和示于WO99/19467的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为分别与示于WO99/19467的SEQ ID NOS:3、4或5中的任一序列具有至少60%，例如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。
所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和WO02/10355(所有文件通过提述并入本文)中描述的变体和/或杂合体。具体α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562、6,187,576或美国专利号6,297,038(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO96/23873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO99/19467公开的SEQ ID NO:3所列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO99/19467中的SEQ ID NO:3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(所述文献通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO99/19467公开的SEQID NO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
细菌杂合体α-淀粉酶
具体涵盖的杂合体α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO1999/19467的SEQ ID NO:4)的445个C-末端氨基酸残基，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶(示于WO99/19467的SEQ ID NO:5)的37个N-末端氨基酸残基，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部的α-淀粉酶：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467的SEQ ID NO:4中地衣芽孢杆菌编号方式)。也优选具有一个或多个下述突变(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的对应突变)的变体：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(关于编号方式，使用WO99/19467的SEQ ID NO:5)。
在一个实施方案中，所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS(干固体)，优选0.001-1KNU每g DS，如大约0.050KNU每g DS的量剂量添加。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如川地曲霉(Aspergilluskawachii)，黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶为下述的α-淀粉酶，其与WO96/23874的SEQID NO:10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
另一个优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉的α-淀粉酶，其作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO89/01969(实施例3，其通过提述并入本文)。一种源自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由Novozymes A/S,Denmark得到)。
其它涵盖的野生型α-淀粉酶包括源自多孔菌属(Meripilus)和根毛霉属(Rhizomucor)的菌株，优选巨多孔菌(Meripilus giganteus)或微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO2004/055178，其通过提述并入本文)的菌株的那些α-淀粉酶。
在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉并公开于Kaneko等1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298,“Molecular-cloning and determinationof the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stableα-amylase fromAspergillus kawachii”，并进一步为EMBL:#AB008370。
所述真菌α-淀粉酶也可为包括淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即非杂合的)或其变体。在一个实施方案中所述野生型α-淀粉酶来源于川地曲霉的菌株。
真菌杂合体α-淀粉酶
在一个优选实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶为杂合体α-淀粉酶。真菌杂合体α-淀粉酶的实例包括WO2005/003311或美国专利申请公开号2005/0054071(Novozymes)和WO2006/069290(Novozymes)中公开的那些，所述文件通过提述并入本文。杂合体α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，以及任选的接头。
杂合体α-淀粉酶的具体实例包括WO2006/069290实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的Fungamyl变体(美国临时申请号60/638,614中的SEQ ID NO:100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(美国临时申请号60/638,614中的SEQ ID NO:101)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316,535中氨基酸序列SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:72和SEQ ID NO:96的组合公开于表5)，或WO2006/069290中表5中作为V039的α-淀粉酶，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(WO2006/069290中的SEQ ID NO:102)。其它杂合体α-淀粉酶列于美国申请号11/316,535和WO2006/069290(其通过提述并入本文)实施例4中表3、4、5和6中。
杂合体α-淀粉酶的其它具体实例包括美国专利申请公开号2005/0054071中公开的那些，包括具有带或不带接头的真菌淀粉结合域的杂合黑曲霉α-淀粉酶，优选第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉α-淀粉酶接头和川地曲霉α-淀粉酶淀粉结合域(JA001)的黑曲霉α-淀粉酶或具有川地曲霉α-淀粉酶接头和罗耳阿太菌葡糖淀粉酶淀粉结合域(JA004)的黑曲霉α-淀粉酶。
其它α-淀粉酶与任何上面提及的α-淀粉酶显示高序列同一性程度，即，与上述公开的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%同一性。
酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.001至10AFAU/g DS，优选0.01至5AFAU/g DS，特别是0.3至2AFAU/g DS，或0.001至1FAU-F/g DS，优选0.01至1FAU-F/g DS的量添加。
商业性α-淀粉酶产品
优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括MYCOLASETM(来自DSM(GistBrocades)，BANTM，TERMAMYLTMSC，FUNGAMYLTM,LIQUOZYMETMX，LIQUOZYMETMSC和SANTMSUPER，SANTMEXTRAL(Novozymes A/S)和CLARASETML-40,000，DEX-LOTM，SPEZYMETMFRED，SPEZYMETMAA，SPEZYMETMDELTA AA，GC358，GC980，以及SPEZYMETMRSL(DaniscoA/S)，以及以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
糖源生成酶
术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(均为麦芽糖生成者)以及普鲁兰酶和α-葡糖苷酶。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本发明的产生发酵产物如乙醇的方法时。所产生的碳水化合物可直接或间接转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可使用糖源生成酶的混合物。特别涵盖的混合物为包含至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶)的混合物。
在本发明的一个优选实施方案中，葡糖淀粉酶活性(AGU)和酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)之间的比例(即AGU每FAU-F)可为0.1至100AGU/FAU-F，特别是2至50AGU/FAU-F，如10-40AGU/FAU-F的范围，特别是当进行一步发酵(生淀粉水解-RSH)时，即当步骤(a)中的糖化和步骤(b)中的发酵同时进行时(即无液化步骤)。
在常规的淀粉至乙醇工艺(即包括液化步骤(a))中，所述比例可优选如EP140,410-B1中定义，特别是当糖化和发酵同时进行时。
葡糖淀粉酶
所述葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等,1984,EMBO J.3(5):1097-1102)，或其变体，如WO92/00381,WO00/04136和WO01/04273(来自Novozymes,Denmark)中公开的那些；WO84/02921中公开的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Hata等,1991,Agric.Biol.Chem.,55(4):941-949)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等,1996,Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等,1995,Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等,1994,Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等,1996,Biochemistry,35:8698-8704)；以及在位置A435和S436导入Pro残基(Li等,1997,Protein Eng.10:1199-1204)。
其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等，1998,ApplMicrobiol Biotechnol.50:323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)。
细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)，均在WO2006/069289中公开的瓣环栓菌(Trametes cingulata)、纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)和大白桩菇(Leucopaxillusgiganteus)，或PCT/US2007/066618中公开的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)的葡糖淀粉酶；或其混合物。杂合体葡糖淀粉酶可用于本发明。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例在WO2005/045018中公开。具体实例包括实施例1的表1和4中公开的杂合体葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。
所述葡糖淀粉酶，可与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高序列同一性程度，即，与上面提及的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG200L；AMG300L；SANTMSUPER，SANTMEXTRAL，SPIRIZYMETMPLUS，SPIRIZYMETMFUEL，SPIRIZYMETMB4U，SPIRIZYME ULTRATM和AMGTME(来自Novozymes A/S，Denmark)；OPTIDEXTM300，GC480TM和GC147TM(来自Danisco US Inc，USA)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM)；G-ZYMETMG900，G-ZYMETM和G990ZR(来自Danisco US Inc.)。
所述葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS，特别是在1-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS，如0.5AGU/g DS的量，或以0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，特别是0.01-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/gDS的量添加。
β-淀粉酶
“β-淀粉酶”(E.C3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1,4-α-葡糖苷键的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到β-淀粉酶的名称。
已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(Fogarty和Kelly,1979,Progress in Industrial Microbiology,15,112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自Novozymes A/S,Denmark的NOVOZYMTMWBA和来自Danisco,US Inc.,USA的SPEZYMETMBBA1500。
产麦芽糖淀粉酶
淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由Novozymes A/S得到。产麦芽糖的α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048，4,604,355和6,162,628，其通过提述并入本文。
在一个优选实施方案中，所述产麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。
蛋白酶
蛋白酶可在糖化、发酵或同时糖化和发酵过程中添加。所述蛋白酶可为任何蛋白酶。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。酸性真菌蛋白酶是优选的，但也可使用其它蛋白酶。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶为酸性蛋白酶，即，特征为能够在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。
酸性真菌蛋白酶可来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、丝核菌属(Sclerotium)、球拟酵母属(Torulopsis)和嗜热子囊菌属(Thermoascus)。具体而言，所述蛋白酶可来源于棘孢曲霉(WO95/02044)，泡盛曲霉(Hayashida等,1977Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933)，黑曲霉(参见，例如，Koaze等,1964,Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)，斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)或米曲霉，如pepA蛋白酶，来自米黑毛霉(Mucor miehei)和微小毛霉(Mucor pusillus)的酸性蛋白酶，作为WO03/048353中的SEQ ID NO:2公开的来自橙橘嗜热子囊菌的金属蛋白酶(AP025)
所述蛋白酶可为中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌，且具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列。所述蛋白酶可与在Swissprot中可作为登录号P06832获得的氨基酸序列具有至少90%序列同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或特别是至少99%同一性。
所述蛋白酶可与WO2003/048353中作为SEQ ID NO:1公开的氨基酸序列具有至少90%的同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或特别为至少99%同一性。
所述蛋白酶可为选自下组的木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。
在一个实施方案中，所述蛋白酶来源于曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施例中，所述蛋白酶来源于根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株。在另一个涵盖的实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酶制备物，优选来源于曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及来源于根毛霉属(优选曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。
天冬氨酸蛋白酶描述于，例如，Handbook of Proteolytic Enzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编,Academic Press,San Diego,1998,270章。天冬氨酸蛋白酶的合适实例包括，例如，Berka等,1990,Gene96:313;Berka等,1993,Gene125:195-198;以及Gomi等,1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100中公开的那些，其通过提述并入本文。
商业上可得到的产品包括
Figure BDA00003004058100171
ESPERASETM，FLAVOURZYMETM，PROMIXTM，
Figure BDA00003004058100172
NOVOZYMTMFM2.0L，以及iZyme BA(可从Novozymes A/S,Denmark获得)和GC106TM和来自Danisco US,Inc.,USA的SPEZYMETMFAN。
所述蛋白酶可以以0.0001-1mg酶蛋白每克DS，优选0.001到0.1mg酶蛋白每克DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以0.0001到1LAPU/g DS，优选0.001到0.1LAPU/g DS和/或0.0001到1mAU-RH/g DS，优选0.001到0.1mAU-RH/g DS的量存在。
组合物
在该方面，本发明涉及组合物，其包含一种或多种脱酰胺酶。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种其它糖酶，如α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶或真菌α-淀粉酶，优选酸性真菌α-淀粉酶。
所述组合物可包含一种或多种糖源生成酶，如特别是葡糖淀粉酶，β-淀粉酶，产麦芽糖淀粉酶，普鲁兰酶，α-葡糖苷酶，或其组合。
在另一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种脱酰胺酶并进一步包含一种或多种发酵生物如酵母和/或细菌。发酵生物的实例可见于上文“发酵生物”部分。
用途
在该方面，本发明涉及脱酰胺酶在发酵工艺中的用途。在一个实施方案中，脱酰胺酶用于改善发酵产物收率/得率(yield)。在另一个实施方案中，脱酰胺酶用于增加发酵生物的生长。
转基因植物材料
在该方面，本发明涉及用一个或多个脱酰胺酶基因转化的转基因植物材料。
在一个实施方案中，本发明涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，其经编码脱酰胺酶的多核苷酸序列转化，从而表达和产生脱酰胺酶。所述脱酰胺酶可从植物或植物部分回收，但在本发明的上下文中，所述含有重组脱酰胺酶的植物或植物部分可用于一个或多个上文涉及和描述的本发明的方法或工艺。
所述转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(bluegrass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉米。
双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)
植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及构成这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
表达脱酰胺酶的转基因植物或植物细胞可以依照本领域公知的方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码脱酰胺酶的一个或多个表达构建体组入植物宿主基因组，并且将所得的经修饰的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体便利地是包含编码脱酰胺酶的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定在其中整合了该表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达所述酶而确定。例如，编码脱酰胺酶的基因的表达可为组成型的或诱导型的，或可为发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,Plant Physiology86:506所述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV启动子、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell21:285-294，Christensen等1992,Plant Mol.Biol.18,675-689;Zhang等,1991,Plant Cell3,1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant and CellPhysiology39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,Journal of Plant Physiology152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plantand Cell Physiology39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,Plant Physiology102:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Molecular Biology26:85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Molecular and General Genetics248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Molecular Biology22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度改变，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，以及重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现脱酰胺酶在植物中的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码脱酰胺酶的多核苷酸序列之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可得到的那些。
将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology8:535；Shimamoto等,1989,Nature338:274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)是产生转基因双子叶植物的优选方法(综述参见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Molecular Biology19:15-38)，而且也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物更经常使用其它的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的优选方法是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant Journal2:275-281；Shimamoto,1994,Current OpinionBiotechnology5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Molecular Biology21:415-428所描述的。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择其中并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植株。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
用于在植物中产生脱酰胺酶的方法包括在有助于产生脱酰胺酶的条件下培养包含编码所述脱酰胺酶的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。
如上所述，所述转基因植物材料可用于上文所述的本发明的方法或工艺。
所述转基因植物能够以与相应的未修饰的植物材料相比增加的量表达一种或多种脱酰胺酶。
经修饰的发酵生物
在该方面，本发明涉及用编码脱酰胺酶的多核苷酸转化的经修饰的发酵生物，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达脱酰胺酶。
在一个优选实施方案中，所述发酵条件根据本发明而定义。在一个优选实施方案中，所述发酵生物是微生物，如酵母或丝状真菌，或细菌。其它发酵生物的实例可见于“发酵生物”部分。
发酵生物可用脱酰胺酶编码基因使用本领域已知的技术进行转化。
本文中描述并要求保护的发明不限于本文中公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的几个方面。意图将任何等同的实施方案包括在本发明的范围内。事实上，根据前文的描述，除了本文中说明和记载的修饰之外对本发明的各种修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。意欲使这些修饰也落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包含定义的本公开为准。
此处引用了多篇参考文献，将它们的公开内容通过提述以其整体并入。
材料和方法
方法
同一性
两种氨基酸序列或两种核苷酸序列之间的关系是通过参数“同一性”描述的。
就本发明而言，两种氨基酸序列之间的同一性程度可通过Clustal方法(Higgins,1989,CABIOS5:151-153)使用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)及同一性表和下述多重比对参数来确定：缺口罚分为10和缺口长度罚分为10。逐对比对参数(Pairwise alignment parameter)为K元组(Ktuple)=1、缺口罚分(gap penalty)=3、窗口(windows)=5和对角线(diagonals)=5。
就本发明而言，两种核苷酸序列之间的同一性程度可通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman,1983,Proceedings of the National Academy of ScienceUSA80:726-730)使用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)及同一性表和下述多重比对参数来确定：缺口罚分为10和缺口长度罚分为10。逐对比对参数为K元组(Ktuple)=3、缺口罚分(gap penalty)=3和窗口(windows)=20。
脱酰胺酶活性测定法：
脱酰胺酶活性可通过使用来自Wako,目录#277-14401的Ammonia试剂盒(Modified Fujii-Okuda方法)追踪氨的形成来测量。
测定原理：
1.氨通过酶的脱酰胺作用而产生。
2.氨与酚在碱性条件下反应形成二氧苯胺(dioxyphenylamine)。该反应由五氰基亚硝基铁(III)酸钠(硝普钠)催化。“Color Reagent Solution A”含有酚和硝普钠。“Color Reagent Solution B”提供碱性反应条件。
3.然后将中间物通过添加次氯酸钠(“Color Reagent Solution C”)来氧化以形成吲哚酚蓝。该化合物在630nm吸收可见光。
测定步骤：
1.将适当缓冲液(就pH和不消耗形成的氨而言)中的10微升酶溶液转移至1.5mL Eppendorf试管。
2.将其与240微升底物溶液(8-10mM Z-Gln-Gly(Sigma C-6154))混合。
3.在37℃振荡(750rpm)温育15分钟。
4.将样品(反应混合物)转移至冰上。
5.将200微升反应混合物与来自Ammonia试剂盒的800微升“Deproteinizing Reagent Solution”在1.5ml Eppendorf管中混合，涡旋。
6.在16100xG，10℃离心5分钟。
7.将400微升上清转移至新的1.5ml Eppendorf管，并添加来自Ammonia试剂盒的400微升的“Color Reagent Solution A”。涡旋。
8.添加来自Ammonia试剂盒的200微升“Color Reagent Solution B”。涡旋。
9.添加来自Ammonia试剂盒的400微升“Color Reagent Solution C”。涡旋。
10.显色：将样品在37℃振荡(750rpm)温育20分钟。
11.将样品转移至冰上，并允许冷却10分钟。
12.在完成测定1小时之内在630nm读取吸光度。
标准曲线：
编号 标准溶液 标准溶液的稀释液* NH3-N的浓度
1 100微升 300微升 100微克/dL
2 200微升 200微升 200微克/dL
3 300微升 100微升 300微克/dL
4 400微升 0微升 400微克/dL
*来自Wako的Ammonia试剂盒的一部分
1.将200微升稀释的标准溶液(根据上述方案)与800微升来自Ammonia试剂盒的“Deproteinizing Reagent Solution”混合。涡旋。
2.自上述第6步起进行测定。
试剂空白：
1.将200微升缓冲液与800微升来自Ammonia试剂盒的“DeproteinizingReagent Solution”混合。涡旋。
2.自上述第6步起进行测定法。
计算：
将标准溶液的吸光度(减去空白)沿纵坐标，针对氨浓度沿横坐标作图。
在反应过程中形成的氨：
氨-氮(毫克/dL)=((AS-AB)/(A400-AB))*400
AS：样品的吸光度
AB：空白的吸光度
A400：上表中标准溶液编号4的吸光度
将在上述反应条件下每分钟释放1微摩尔氨的酶量定义为一个单位，并基于下式进行计算：
U/ml=0.39*((AS-AB)/(A400-AB))
葡糖淀粉酶活性
葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测量。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸(盐)0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。
AMG温育：
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 乙酸(盐)0.1M
pH： 4.30±0.05
温育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL
颜色反应：
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M;0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
温育温度 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
α-淀粉酶活性(KNU)
α-淀粉酶活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对于改性马铃薯淀粉的降解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackish blue)，但在淀粉降解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，将其和有色玻璃标准(colored glassstandard)进行比较。
一个千Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；以及pH5.6)糊精化5260mg的淀粉干物质MerckAmylum Solubile所需的酶量。
酸性α-淀粉酶活性
当根据本发明使用时，酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)或FAU-F测量。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量，其相对于酶标准物来确定。一AFAU定义为在下面提及的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-葡糖苷键以形成具有不同链长的寡糖和糊精。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法(reversecolorimetry)在规定的分析条件下测定淀粉浓度的降低作为淀粉酶活性。
α-淀粉酶
淀粉+碘→糊精+寡糖
λ=590nm40℃，pH2.5
蓝色/紫色t=23秒脱色
Figure BDA00003004058100251
Figure BDA00003004058100261
FAU-F的确定
FAU-F真菌α-淀粉酶单位(Fungamyl)是相对于已声明强度的酶标样测量的。
Figure BDA00003004058100262
蛋白酶测定方法AU(RH)
蛋白分解活性可用变性的血红蛋白作为底物来确定。在用于确定蛋白分解活性的Anson-Hemoglobin方法中，消化变性的血红蛋白，然后将未消化的血红蛋白用三氯乙酸(TCA)沉淀。用酚试剂确定TCA可溶性产物的量，所述酚试剂遇到酪氨酸和色氨酸呈蓝色。
一Anson单位(AU-RH)定义为在标准条件下(即，25℃，pH5.5和10分钟反应时间)以使得每分钟释放的TCA可溶产物量与一毫当量的酪氨酸遇到酚试剂给出相同的颜色的起始速率消化血红蛋白的酶量。
AU(RH)方法描述于EAL-SM-0350，并可应要求从Novozymes A/SDenmark获得。
蛋白酶测定方法(LAPU)
1亮氨酸氨基肽酶单位(LAPU)是在下述条件下每分钟分解1微摩尔底物的酶量：26mM的L-亮氨酸对硝基苯胺作为底物，0.1M Tris缓冲液(pH8.0)，37℃，10分钟反应时间。
LAPU描述于EB-SM-0298.02/01，其可应要求从Novozymes A/S Denmark获得。
产麦芽糖淀粉酶活性(MANU)的确定
一MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位，Maltogenic Amylase Novo Unit)可定义为在37℃，在每ml的0.1M柠檬酸(盐)缓冲液，pH5.0中10mg麦芽三糖(Sigma M8378)底物的浓度反应30分钟，每分钟释放一微摩尔麦芽糖所需的酶量。
材料：
α-淀粉酶A(AA)：组成为带黑曲霉葡糖淀粉酶接头的微小根毛霉α-淀粉酶和WO2006/069290(Novozymes A/S)中表5中作为V039公开的SBD的杂合α-淀粉酶。
脱酰胺酶：在美国专利号6,251,651中的SEQ ID NO:6公开的来源于粘金黄杆菌(Chryseobacterium gleum)的脱酰胺酶。
葡糖淀粉酶(GA)：在WO2006/069289中的SEQ ID NO:2公开的来源于瓣环栓菌(Trametes cingulata)并可从Novozymes A/S获得的葡糖淀粉酶。
酵母：可从Red Star/Lesaffre,USA获得的RED STARTM。
实施例
实施例1：在一步同时糖化和发酵(SSF)工艺中脱酰胺酶对α-淀粉酶(AA) 和葡糖淀粉酶(GA)的作用
所有处理通过微尺度发酵评估。将四百一十克磨碎的黄色马齿型玉米(dent corn)(具有大约0.5mm的平均粒度)添加至590g自来水。对该混合物补充3.0ml的1g/L青霉素储液和1g的尿素。将该浆料的pH用40%H2SO4调整至4.5。干固体(DS)水平确定为35wt%。将大约5g的该浆料添加至20ml小瓶。每个小瓶以表1中显示的剂量添加α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和脱酰胺酶，然后每5g浆料添加200微升酵母繁殖物。实际酶剂量基于每个小瓶中玉米浆料的准确重量。
表1
Figure BDA00003004058100271
将小瓶在32℃无搅拌温育，并每日混合一次。对每个处理重复运行一式九次发酵。运行三个重复用于24小时、48小时和70小时时间点分析。将小瓶在24、48和70小时涡旋并通过HPLC分析。用于HPLC分析的样品通过添加50微升40%H2SO4停止反应，离心和过滤通过0.45微米过滤器来制备。将样品储藏在4℃直至进行分析。使用配置有7.8x300mm 
Figure BDA00003004058100282
HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)并与折射率(RI)检测器偶联的AgilentTM1100HPLC系统(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)来确定乙醇浓度。
结果提供于表2。
表2
在不同时间和不同浓度的脱酰胺酶的乙醇收率(g/L)
Figure BDA00003004058100281
结果显示在48和70小时之后，乙醇产量的商业上显著的增加和更高的发酵动力学。
通过下述编号的段落进一步描述本发明：
[1]一种产生发酵产物的方法，其包括：
(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)用葡糖淀粉酶将糊精糖化为糖；
(c)添加脱酰胺酶；和
(d)使用发酵生物发酵糖。
[2]段[1]的方法，其中所述含淀粉材料通过液化转化为糊精。
[3]段[2]的方法，其中所述液化包括在95-140℃的温度进行喷射蒸煮。
[4]段[2]或[3]的方法，进一步包括在30-65℃的温度进行通常40-90分钟的预糖化。
[5]段[2]至[4]任一项的方法，其中所述糖化在20-75℃范围的温度进行。
[6]段[2]至[5]任一项的方法，进一步包括在糖化之前进行预糖化。
[7]段[2]至[6]任一项的方法，其中所述脱酰胺酶在含淀粉材料至糊精的转化过程中添加。
[8]段[2]至[7]任一项的方法，其中所述脱酰胺酶在糊精至糖的糖化过程中添加。
[9]段[2]至[8]任一项的方法，其中所述脱酰胺酶在预糖化过程中添加。
[10]段[2]至[9]任一项的方法，其中所述脱酰胺酶在发酵过程中添加。
[11]段[2]至[10]任一项的方法，其中所述糖化和发酵同时进行。
[12]段[11]的方法，其中所述糖化和发酵在20℃-40℃范围的温度进行。
[13]段[11]的方法，其中通过用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度下处理所述含淀粉材料而将所述含淀粉材料转化为糊精并将所述糊精糖化为糖。
[14]段[13]的方法，其中含淀粉材料至糊精的转化，糊精至糖的糖化，和糖的发酵在单个步骤中进行。
[15]段[13]或[14]的方法，其中所述α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、发酵生物和脱酰胺酶同时或顺序添加。
[16]段[13]至[15]任一项的方法，其在25℃-40℃的温度进行。
[17]段[1]至[16]任一项的方法，其中所述含淀粉材料选自下组：大麦、豆类、木薯、谷类、玉米、买罗高粱、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、树薯、小麦和全谷粒，或其任意混合物。
[18]段[1]至[17]任一项的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇(例如乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐/酯、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)和激素。
[19]段[18]的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
[20]段[1]至[19]任一项的方法，进一步包括回收所述发酵产物。
[21]段[20]的方法，其中所述发酵产物通过蒸馏回收。
[22]脱酰胺酶在发酵方法中的用途。
[23]段[22]的用途，其中所述发酵方法是用于产生乙醇的方法。
[24]一种修饰的发酵生物，其用编码脱酰胺酶的多核苷酸转化，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达所述脱酰胺酶。
[25]一种组合物，其包含脱酰胺酶、葡糖淀粉酶和α-淀粉酶。
[26]段[25]的组合物，其进一步包含普鲁兰酶。

Claims (15)

1.一种产生发酵产物的方法，其包括：
(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；
(b)用葡糖淀粉酶将糊精糖化为糖；
(c)添加脱酰胺酶；和
(d)使用发酵生物发酵糖。
2.权利要求1的方法，其中所述脱酰胺酶在含淀粉材料至糊精的转化过程中添加。
3.权利要求2的方法，其中所述脱酰胺酶在糊精至糖的糖化过程中添加。
4.权利要求2或3的方法，其中所述脱酰胺酶在发酵过程中添加。
5.权利要求2-4任一项的方法，其中所述糖化和发酵同时进行。
6.权利要求1的方法，其中通过用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度下处理所述含淀粉材料而将所述含淀粉材料转化为糊精并将所述糊精糖化为糖。
7.权利要求6的方法，其中含淀粉材料至糊精的转化，糊精至糖的糖化，和糖的发酵在单个步骤中进行。
8.权利要求6或7的方法，其中所述α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、发酵生物和脱酰胺酶同时或顺序添加。
9.权利要求6-8任一项的方法，其在25℃至40℃的温度进行。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇(例如乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐/酯、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)和激素。
11.权利要求10的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
12.权利要求1-11任一项的方法，进一步包括回收所述发酵产物。
13.脱酰胺酶在发酵方法中的用途。
14.一种修饰的发酵生物，其用编码脱酰胺酶的多核苷酸转化，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达所述脱酰胺酶。
15.一种组合物，其包含脱酰胺酶、葡糖淀粉酶和α-淀粉酶。
CN2011800480075A 2010-08-02 2011-08-02 产生发酵产物的方法 Pending CN103140586A (zh)

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