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CN112272707B - 用于乙醇生产的改善的酵母 - Google Patents

用于乙醇生产的改善的酵母 Download PDF

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CN112272707B CN201980012994.XA CN201980012994A CN112272707B CN 112272707 B CN112272707 B CN 112272707B CN 201980012994 A CN201980012994 A CN 201980012994A CN 112272707 B CN112272707 B CN 112272707B
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Abstract

本文描述了在布达佩斯条约下保藏的且分别具有登录号NRRL Y67549和NRRL Y67700的酿酒酵母菌株MBG5038和MBG5012，或显示酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的一个或多个性质或定义特征的菌株NRRL Y67549或Y67700的衍生物。还描述了包含所述酵母菌属酵母以及天然存在和/或非天然存在的组分的组合物，以及用于使用所述菌株从含淀粉材料生产乙醇的方法。

Description

用于乙醇生产的改善的酵母
序列表的引用
本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
对生物材料的保藏的引用
本申请含有对生物材料的保藏的引用，将其通过引用并入本文。
技术领域
本文描述了多种方法，例如，这些方法包括液化步骤，用于使用将可发酵糖转化为乙醇的酵母、从含淀粉材料生产乙醇。还描述了具有改进的将糖发酵为乙醇能力的酵母菌属酵母菌株，描述了用于产生具有改进的将糖发酵为乙醇能力的酵母菌属酵母菌株的方法，以及具有改进的将糖发酵为乙醇能力的酵母菌属酵母菌株在乙醇生产中的用途。最后，还描述了包含这些酵母菌属酵母菌株以及天然存在的和/或非天然存在的组分的组合物。
背景技术
从含淀粉材料生产乙醇是本领域中熟知的。生产作为生物燃料的乙醇已经成为了一大产业，其中2014年全世界生产了超过240亿加仑的乙醇。
工业上最常使用的商业方法，通常被称作“传统方法”，包括在高温(约85℃)下典型地使用细菌α-淀粉酶液化糊化淀粉，随后典型地在葡糖淀粉酶和酿酒酵母的存在下厌氧进行同时糖化发酵(SSF)。
用于生产用作燃料的乙醇的酵母，如在玉米乙醇工业中，要求若干特性，以确保乙醇有效生产的成本。这些特性包括乙醇耐受性、低副产品产量、快速发酵、和限制残留在发酵中的剩余糖量的能力。这些特性对工业方法的可行性具有明显的作用。
酵母菌属的酵母表现出生产乙醇所需的许多特性。具体地，酿酒酵母的菌株在燃料乙醇工业中广泛用于乙醇生产。酿酒酵母的菌株被广泛用于燃料乙醇工业，可以在发现于，例如，玉米醪发酵中的发酵条件下生产高产量乙醇。这种菌株的实例是在称为ETHANOL的可商购乙醇酵母产品中使用的酵母。
将酿酒酵母的菌株用于燃料乙醇工业中来发酵糖如葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖，以通过糖酵解途径来生产乙醇。这些糖从如下来源中获得，如：玉米和其他谷物、糖汁、糖蜜、葡萄汁、果汁、和淀粉根菜类，并且可以包括将纤维素材料分解成葡萄糖。
尽管目前用于燃料乙醇工业中的酿酒酵母的菌株非常适合乙醇生产，但是由于作为燃料的乙醇的需求量增加，和玉米的新菌株中可用性的增加，对乙醇生产的效率的改进存在越来越多的需求。
因此，需要能够改进工业规模发酵中乙醇生产的效率的酵母菌属的新的稳健的酵母菌株。
此外，尽管在过去数十年乙醇生产方法有显著的改进，但是仍然希望并需要提供可以用于商业规模乙醇方法中的从含淀粉材料和酵母生产乙醇的方法。
发明内容
本文尤其描述了从含淀粉材料生产乙醇的方法，以及适用于此类方法的酵母。
第一方面涉及从含淀粉材料生产乙醇的方法，这些方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用α-淀粉酶液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号(1815University Street,Peoria,IL,USA)的美国农业研究服务专利菌种保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)北方地区研究中心(Northern Regional Research Center，NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酿酒酵母菌株MBG5038的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酿酒酵母菌株MBG5012的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
在一些实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
如本文所用，术语酿酒酵母菌株MBG5038和/或酿酒酵母菌株MBG5012的“性质”和“定义特征”包括在相同条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所(National Measurement Institute,Victoria,Australia)、在登录号V14/007039下保藏)相比，至少增加的乙醇提升(即乙醇产量)。其他“性质”和“定义特征”尤其包括降低的乙醛生产、增加的温度耐受性和减少的甘油生产。例如在本文所述的方法中使用的本文所述的发酵生物可以具有一个或多个上述“性质”和“定义特征”。
本文所述的发酵生物生物，特别是与酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物具有大致相同的性质的酿酒酵母，或与酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物具有大致相同的性质的酿酒酵母，具有酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的以下性质和/或定义特征中的一种或多种，例如全部；
在相同方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加的乙醇提升(即乙醇产量)；
在相同方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，降低的乙醛生产；
在相同方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加的温度耐受性；
在相同方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油生产。
本文所述的发酵生物可以具有上述“性质”或“定义特征”中的一种或多种，例如全部。
根据乙醇生产方法，步骤i)中的液化是通过使含淀粉材料处于高于初始糊化温度的温度下，典型地在80℃-90℃之间，使用α-淀粉酶来进行的。液化的pH优选地是在4.5和6.0之间，如在4.8和5.8之间。α-淀粉酶的实例可以发现于下文的“液化期间存在的和/或添加的α-淀粉酶”部分中。在一个实施例中，该α-淀粉酶是热稳定性细菌α-淀粉酶。在一个实施例中，该α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1所示的α-淀粉酶。适合的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的实例可以在下文“热稳定性α-淀粉酶”部分中发现，并且包括来自具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的下组中的一种：I181*+G182*，和任选地N193F，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
在pH 4.5和5.5，0.12mM CaCl2下，与参照α-淀粉酶(在C-末端被截短至485-495个氨基酸长(例如约491个氨基酸长)、具有突变I181*+G182*和任选地取代N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶)相比，具有增加的热稳定性的其他适合的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的实例可以在通过引用特此并入的WO 2011/082425中发现。(还参见以下实例1)
步骤i)中的液化可以使用α-淀粉酶和蛋白酶的组合来进行。该蛋白酶可以是如下蛋白酶，该蛋白酶具有如在80℃/70℃下确定的相对活性的、超过20％的热稳定性值。适合的蛋白酶的实例描述于下文“液化期间存在的和/或添加的蛋白酶”部分中。
该蛋白酶可以是真菌来源的，如丝状真菌来源的。适合的真菌蛋白酶的具体实例是从以下菌株衍生的金属蛋白酶的蛋白酶变体：嗜热子嚢菌属的菌株，优选地金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是菌株金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670，这些蛋白酶变体被披露为WO2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分、或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分、或本文具有以下取代或取代的组合中的一个的SEQ ID NO:3：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；以及
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
其他适合的蛋白酶变体的实例可以发现于通过引用特此并入的WO 2011/072191中(还参见以下实例2)。
适合的蛋白酶还包括细菌蛋白酶。适合的细菌蛋白酶可以是从火球菌属菌株，优选地强烈火球菌菌株衍生。在一个实施例中，蛋白酶是US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶。
在一个实施例中，在液化步骤i)中存在或添加0.5-50微克强烈火球菌蛋白酶/克DS，如1-5微克强烈火球菌蛋白酶/克DS，如约1.5或3微克强烈火球菌蛋白酶/克DS。
在一个实施例中，将液化步骤i)中添加的α-淀粉酶和/或蛋白酶进一步与葡糖淀粉酶组合。因此，在液化步骤i)期间，还可以存在或添加葡糖淀粉酶。该葡糖淀粉酶可以是热稳定的。这意味着在85℃，pH 5.3下，该葡糖淀粉酶具有至少20％，如至少30％，优选地至少35％的热稳定性，如在实例4(热稳定性)中描述所确定的。在一个实施例中，液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶在pH 5.0的pH最佳值下具有至少90％，优选地至少95％，优选地至少97％的相对活性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性，如在实例4(pH最佳值)中描述所确定的。
液化步骤i)中存在的和/或添加的适合的葡糖淀粉酶可以源自青霉属菌株，例如作为WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:9或14披露的草酸青霉菌的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中SEQ ID NO:2所示的、具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14中所示成熟序列进行编号)的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，如WO2013/053801中所披露的变体。在一个实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
P11F+T65A+Q327F；以及
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
其他适合的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体的实例可以发现于通过引用结合的WO2013/053801中(还参见以下实例15)。
在一个实施例中，在液化中使用的葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有在pH 4.0下如实例15中所描述的确定为DSC Td的至少70℃，优选地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃的热稳定性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有在pH 4.0下如实例15中所描述的确定为DSC Td的在70℃和95℃之间范围内的(如在80℃和90℃之间)热稳定性。
在一个实施例中，在液化中使用的葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有在pH 4.8下如实例15中所描述的确定为DSC Td的至少70℃，例如至少75℃、至少80℃、至少81℃、至少82℃、至少83℃、至少84℃、至少85℃、至少86℃、至少87％、至少88℃、至少89℃、至少90℃、或至少91℃的热稳定性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有在pH 4.8下如实例15中所描述的确定为DSC Td的在70℃和95℃之间范围内的(如在80℃和90℃之间)热稳定性。
在一个实施例中，液化中使用的葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有如实例16中描述所确定的至少100％，如至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、或至少125％的残余活性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有如实例16中所描述的确定为残余活性的在100％和130％之间范围内的热稳定性。
此外，在一个实施例中，在液化期间，还可以存在与α-淀粉酶、蛋白酶和/或葡糖淀粉酶组合的支链淀粉酶。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵或同时糖化发酵中可以存在和/或添加葡糖淀粉酶。该葡糖淀粉酶可以与液化中使用的热稳定性葡糖淀粉酶相同。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加的由酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达的葡糖淀粉酶是真菌来源的，如丝状真菌来源的。在一个实施例中，葡糖淀粉酶源自曲霉属的菌株，例如黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，例如里氏木霉；或篮状菌属的菌株，例如埃默森篮状菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属的菌株。
在一个实施例中，糖化和/或发酵中存在和/或添加的由酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达的葡糖淀粉酶源自埃默森篮状菌，如本文的SEQ ID NO:19所示的葡糖淀粉酶。在另一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，例如在本文的SEQ ID NO:15所示的篱边粘褶菌。在另一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，例如在本文的SEQ IDNO:17所示的密粘褶菌。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加的由酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达的葡糖淀粉酶是披露于WO 2014/177546(通过引用特此并入)中的密粘褶菌葡糖淀粉酶的变体，尤其是具有以下取代或取代的组合中的一个的变体：V59A；S95P；A121P；T119W；S95P+A121P；V59A+S95P；S95P+T119W；V59A+S95P+A121P；和S95P+T119W+A121P，尤其是S95P+A121P(使用本文的SEQ ID NO:17进行编号)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶与α-淀粉酶和任选地蛋白酶组合。该α-淀粉酶可以是真菌或细菌来源的。
与葡糖淀粉酶组合而存在和/或添加的由酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达的α-淀粉酶可以源自根毛霉属菌株，优选地是微小根毛霉菌株，如WO 2013/006756中SEQ ID NO:3所示的α-淀粉酶，如具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，如本文的SEQ ID NO:16所示的α-淀粉酶杂合体。
在一个实施例中，存在和/或添加的由酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达的α-淀粉酶源自微小根毛霉，例如具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，例如本文SEQ ID NO:16披露的α-淀粉酶，并且可以具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，例如G128D+D143N(使用SEQ ID NO:16进行编号)。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵或SSF中存在和/或添加蛋白酶，这可能导致乙醇产量增加。如，例如在美国专利号5,231,017(通过引用特此并入)中所描述的，该蛋白酶可以例如是酸性真菌蛋白酶。在糖化和/或发酵或SSF中还可以存在和/或添加蛋白酶，以提高油产量。
在一个实施例中，在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在和/或添加纤维素分解酶组合物。此类组合物的实例可见于下文“糖化和/或发酵期间存在和/或添加的纤维素分解酶组合物”部分中。在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物与葡糖淀粉酶一起存在和/或添加，如下文“在糖化和/或发酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶”部分中所披露的一种葡糖淀粉酶。
第二方面涉及从含淀粉材料例如颗粒状淀粉生产乙醇的方法，这些方法包括：
(i)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酿酒酵母菌株MBG5038的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酿酒酵母菌株MBG5012的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
在一些实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料例如颗粒状淀粉生产乙醇的方法，该方法包括：
(i)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：葡糖淀粉酶和α-淀粉酶、以及任选地蛋白酶；并且
其中该发酵生物是酵母菌属酵母菌株，其提供：
在相同发酵条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，乙醇产量提升；
在相同方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，降低的乙醛生产；
在相同方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加的温度耐受性；和/或
在相同方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油生产。
在一个实施例中，发酵生物是具有定义特征(例如，酿酒酵母菌株MBG5038的高乙醇产量提升和/或减少的甘油生产)的酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物。在一些实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，发酵生物是具有定义特征(例如，酿酒酵母菌株MBG5012的高乙醇产量提升和/或减少的甘油生产)的酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物。在一些实施例中，酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
使用的合适酶的实例，特别是葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素分解酶组合物等，在下文“生淀粉水解过程中使用的酶和酶共混物”部分中进行了描述。
第三方面提供了(1)在布达佩斯条约下保藏的且具有NRRL登录号NRRL Y67549的酿酒酵母酵母菌株，或酿酒酵母菌株NRRL Y67549的衍生物。在一些实施例中，酿酒酵母菌株NRRL Y67549的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶；或(2)在布达佩斯条约下保藏的且具有NRRL登录号NRRL Y67700的酿酒酵母酵母菌株，或酿酒酵母菌株NRRL Y67700的衍生物。在一些实施例中，酿酒酵母菌株NRRL Y67700的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
第四方面提供了产生酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)的衍生物的方法，该方法包括：
(a)在允许第一酵母菌株和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，将第一酵母菌株与第二酵母菌株一起培养，其中该第二酵母菌株是酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)；和
(b)分离杂合菌株；以及
(c)任选地使用步骤(b)中分离的杂合菌株作为第一酵母菌株和/或第二酵母菌株来重复步骤(a)和(b)。在一些实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
第五方面提供了产生具有酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)的定义特征的酵母菌属菌株的方法，该方法包括：
(a)提供：(i)第一酵母菌株；和(ii)第二酵母菌株，其中第二酵母菌株是酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)；
(b)在允许第一酵母菌株和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，培养第一酵母菌株和第二酵母菌株；
(c)筛选或选择酿酒酵母MBG5038的衍生物；
(d)任选地用从步骤(c)筛选或选择的菌株作为第一和/或第二菌株重复步骤(b)和(c)，直到获得显示出酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的定义特征的衍生物。在一些实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
第六方面提供了产生酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)的重组衍生物的方法，该方法包括：
(a)用一种或多种编码葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的表达载体转化酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)；以及
(b)分离转化的菌株。
第七方面提供了由第四、第五、或第六方面的方法产生的酵母菌属菌株。
第八方面提供了具有酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)的定义特征或酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)的定义特征的酵母菌属菌株。
第九方面提供了生产乙醇的方法，该方法包括将第一、第四或第五方面的菌株与包含可发酵糖的底物在促进可发酵糖发酵生成乙醇的条件下一起孵育。
第十方面提供了第三、第六或第七方面的菌株在乙醇生产中的用途。
第十一方面提供了生产酒糟(distiller’s grain)的方法，该方法包括：
(a)将第三、第七或第八方面的酵母菌属菌株与包含可发酵糖的底物在允许可发酵糖发酵生成乙醇和酒糟的条件下一起孵育；
(b)分离该酒糟。
第十二方面提供了由第十方面的方法产生的酒糟。
第十三方面提供了第三、第七或第八方面的菌株在酒糟生产中的用途。
第十四方面提供了第三、第七或第八方面的菌株在酵母菌属菌株生产中的用途，该酵母菌属菌株显示酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)的一个或多个定义特征。
第十五方面提供了包含第三、第七或第八方面的酵母菌属菌株的组合物。
还描述了包含本文所述的酿酒酵母菌株(例如酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012)或其衍生物、以及天然存在和/或非天然存在的组分的组合物。
附图说明
图1显示了在非应激条件下以不同的醪液固体(mash solid)(％)发酵的酿酒酵母菌株MBG5038的提高的乙醇产量。
图2显示了在非应激条件下以不同的醪液固体(％)发酵的酿酒酵母菌株MBG5038的降低的甘油生产。
图3显示了在升高水平的有机酸存在下发酵的酿酒酵母菌株MBG5038的提高的乙醇产量。
图4显示了在升高水平的有机酸存在下发酵的酿酒酵母菌株MBG5038的减少的残留葡萄糖。
图5显示了在非应激条件下以较高的醪液固体(％)发酵的酿酒酵母菌株MBG5012的提高的乙醇产量。
图6显示了在非应激条件下以较高的醪液固体(％)发酵的酿酒酵母菌株MBG5012的减少的残留葡萄糖。
图7显示了在升高水平的有机酸存在下发酵的酿酒酵母菌株MBG5012的提高的乙醇产量。
图8显示了在升高水平的有机酸存在下发酵的酿酒酵母菌株MBG5012的减少的残留葡萄糖。
定义
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
催化结构域：术语“催化结构域”意指含有该酶的催化机构的酶的区域。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，之后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中片段具有支链淀粉酶活性。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何物质，包括但不限于从与其性质上相关的一种或多种或所有天然存在的组分至少部分除去的任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然中发现的物质，由人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，在宿主细胞中进行重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如宿主细胞可以经遗传修饰以表达本发明的多肽。来自该宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。
成熟多肽：术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(诸如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后其最终形式的多肽。本领域已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)中的两种的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
如本文所用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“一种细胞”包括多种此类细胞。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本文提及“约”值或参数包括针对该值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。
如本文所用，除了由于表达语言或必需含义情况下另有要求外，词语“包含(comprise)”或变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”以包容性意义使用，即指定所述特征的存在，但不排除各种实施例中存在或加入了其他特征。
具体实施方式
方法
本文描述了用于在包括液化、糖化和发酵的过程中从含淀粉材料生产乙醇的方法。在发酵期间，通过酵母将在糖化期间产生的可发酵糖转化为乙醇。在第一方面中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用α-淀粉酶液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酿酒酵母菌株MBG5038的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酿酒酵母菌株MBG5012的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
在一些实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
步骤ii)和iii)可以顺序进行或同时(SSF)进行。在一个实施例中，步骤ii)和iii)同时(SSF)进行。
在发酵期间添加的氮源
通常，发酵生物如酵母(包括酿酒酵母)需要充分的氮源用于增殖和发酵。可使用许多氮源，且这些氮源是本领域熟知的。该氮源可以是有机的，如尿素、DDG、湿滤饼或玉米醪，或无机的，如氨或氢氧化铵。在一个实施例中，该氮源是尿素。
液化步骤i)
根据本文所述的方法，步骤i)中的液化可以通过使含淀粉材料在高于初始糊化温度的温度下经受α-淀粉酶和任选地蛋白酶、和/或葡糖淀粉酶来进行。液化中还可以存在和/或添加其他酶如支链淀粉酶和植酸酶。
液化步骤i)可以进行0.5-5小时，如1-3小时，如典型地约2小时。
术语“初始糊化温度”意指含淀粉材料糊化开始的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可以根据植物物种、植物物种的具体品种、以及生长条件而变化。给定的含淀粉材料的初始糊化温度可以是使用Gorinstein和Lii,1992,[淀粉]44(12):461-466所述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度所确定的。
液化典型地是在从70℃-100℃范围内的温度下进行的。在一个实施例中，液化中的温度是在75℃-95℃之间，如在75℃-90℃之间，在80℃-90℃之间，或在82℃-88℃之间，如约85℃。
在步骤i)中的液化之前，可以进行喷射蒸煮(jet-cooking)步骤。该喷射蒸煮可在110℃-145℃、120℃-140℃、125℃-135℃、或约130℃的温度进行约1-15分钟，进行约3-10分钟，或约5分钟。
液化期间的pH可以在4与7之间，如pH 4.5-6.5，pH 5.0-6.5，pH 5.0-6.0，pH 5.2-6.2，或约5.2、约5.4、约5.6或约5.8。
在一个实施例中，该方法在步骤i)之前还包括以下步骤：
a)优选地通过干磨来减小含淀粉材料的粒度；
b)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
该含淀粉起始材料(如全谷物)可例如通过磨制减少粒度，以打开结构、增大表面积并且允许进一步加工。通常存在两种类型的方法：湿磨和干磨。在干磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离。湿磨常常应用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域中都是众所周知的。在一个实施例中，使该含淀粉材料经受干磨。在一个实施例中，将粒度减小至在0.05至3.0mm之间、例如0.1-0.5mm，或使得至少30％、至少50％、至少70％、或至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05至3.0mm筛网、例如0.1-0.5mm筛网的筛子。在另一个实施例中，至少50％，例如至少70％、至少80％、或至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。
该水性浆料可以包含含淀粉材料的从10-55w/w-％干固体(DS)，例如25-45w/w-％干固体(DS)、或30-40w/w-％干固体(DS)。
最初，可以将α-淀粉酶，任选地蛋白酶，任选地葡糖淀粉酶添加到水性浆料中来开始液化(稀释)。在一个实施例中，这些酶中仅有一部分(例如，约1/3)被添加到该水性浆料中，而这些酶中的剩余部分(例如，约2/3)在液化步骤i)期间被添加。
α-淀粉酶的实例的非穷尽列表可以发现于下文的“液化期间存在的和/或添加的α-淀粉酶”部分中。在一个实施例中，该α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。细菌α-淀粉酶典型地是热稳定的。在一个实施例中，该α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:1所示的α-淀粉酶。
在一个实施例中，与参照α-淀粉酶(截短至约491个氨基酸(即，从480-495个氨基酸)、具有突变I181*+G182*、任选地具有N193F取代的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号))相比，该α-淀粉酶具有改进的稳定性，通过在pH 4.5和5.5下以及在温度75℃和85℃下将参照α-淀粉酶和变体与0.12mM CaCl2一起孵育，随后使用底物(超级淀粉酶测定试剂盒，E33651，分子探针公司(Molecular Probes))进行残余活性测定所确定的。这描述于实例1中。
适合的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的实例可以在下文“热稳定性α-淀粉酶”部分中发现，并且包括来自具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的下组中的一种：I181*+G182*，和任选地取代N193F，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
在pH 4.5和5.5，0.12mM CaCl2下，与参照α-淀粉酶(C-末端截短至485-495个氨基酸长(例如约491个氨基酸长)、具有突变I181*+G182*和任选地N193F取代的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶)相比，具有增加的热稳定性的其他适合的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的实例可以在通过引用特此并入的WO 2011/082425中发现。(还参见以下实例1)
步骤i)中的液化可以使用α-淀粉酶和蛋白酶的组合来进行。该蛋白酶可以是以下蛋白酶，该蛋白酶具有如实例2中描述所确定的(相对活性)确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值。适合的蛋白酶的实例描述于下文“液化期间存在的和/或添加的蛋白酶”部分中。
该蛋白酶可以是真菌来源的，如丝状真菌来源的。适合的真菌蛋白酶的具体实例是从以下菌株衍生的金属蛋白酶的蛋白酶变体：嗜热子嚢菌属的菌株，例如金黄色嗜热子囊菌的菌株，如菌株金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670，这些蛋白酶变体被披露为WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分、或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分、或本文具有以下取代或取代的组合中的一个的SEQ ID NO:3：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；以及
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
金黄色嗜热子囊菌蛋白酶的适合变体的更多实例可以发现于通过引用特此并入的WO 2011/072191中(还参见以下实例2)。
适合的蛋白酶还包括细菌蛋白酶。适合的细菌蛋白酶可以是从火球菌属菌株，例如强烈火球菌菌株衍生。在一个实施例中，蛋白酶是US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶。
在一个实施例中，将液化步骤i)中添加的α-淀粉酶和/或蛋白酶进一步与葡糖淀粉酶组合。因此，在液化步骤i)期间，还可以存在或添加葡糖淀粉酶。该葡糖淀粉酶可以是热稳定的。这意味着在85℃，pH 5.3下，该葡糖淀粉酶具有如实例4(热稳定性)中描述所确定的至少20％，如至少30％，优选地至少35％的热稳定性。在一个实施例中，液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶在pH 5.0的pH最佳值下具有至少90％，例如至少95％，或至少97％的相对活性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少至少80％、例如至少85％、或至少90％的pH稳定性，如在实例4(pH稳定性)中描述所确定的。
液化步骤i)中存在的和/或添加的适合的葡糖淀粉酶可以源自青霉属菌株，尤其是作为WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:9或14披露的草酸青霉菌的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中SEQ ID NO:2所示的、具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:14中所示成熟序列进行编号)的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，如WO 2013/053801中所披露的变体。在一个实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
P11F+T65A+Q327F；以及
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
其他适合的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体的实例可以发现于通过引用并入的WO2013/053801中(还参见以下实例10-16，如表15中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)。
此外，根据本文所述的方法，在液化期间，还可以存在与α-淀粉酶、蛋白酶和/或葡糖淀粉酶组合的支链淀粉酶。
糖化与发酵
葡糖淀粉酶是由在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)或同时糖化发酵(SSF)中存在和/或添加的酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达的。由糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)或同时糖化发酵(SSF)中添加的酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达的葡糖淀粉酶通常不同于任选地在液化步骤i)中添加的葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是与真菌α-淀粉酶一起表达或添加的。葡糖淀粉酶的实例可见于下文“糖化和/或发酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶”部分。
当依序进行糖化和发酵时，糖化步骤ii)可以在本领域中熟知的条件下进行。例如，糖化步骤ii)可持续长达从约24至约72小时。在一个实施例中，进行预糖化。预糖化在30℃-65℃，典型地约60℃的温度典型地进行40-90分钟。在一个实施例中，在同时糖化发酵(SSF)中，预糖化之后是发酵过程中的糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-70℃，典型地约60℃的温度下并且典型地在4与5之间的pH下、如约pH 4.5下进行。
同时糖化发酵(“SSF”)广泛地用于工业规模的发酵产物生产方法中，尤其是乙醇生产方法中。当进行SSF时，同时进行糖化步骤ii)和发酵步骤iii)。不存在针对糖化的保持阶段，意指可以将发酵生物(如酵母)以及一种或多种酶一同添加。然而，还考虑了分开添加发酵生物以及一种或多种酶。SSF典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、或约32℃的温度下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。在一个实施例中，该pH在4-5之间。
在一个实施例中，在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在和/或添加纤维素分解酶组合物。此类纤维素分解酶组合物的实例可见于下文“糖化和/或发酵期间存在和/或添加的纤维素分解酶组合物”部分。该纤维素分解酶组合物与葡糖淀粉酶一起存在和/或添加，如下文“糖化和/或发酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶”部分中所披露的一种葡糖淀粉酶。
含淀粉材料
任何适合的含淀粉起始材料可以与本文所述的方法一起使用。通常基于期望的发酵产物(在此是乙醇)来选择起始材料。含淀粉起始材料的实例包括谷类、块茎或谷物。具体地，该含淀粉材料可以是玉米、小麦、大麦、黑麦、西非高粱(milo)、西米、木薯(cassava)、木薯淀粉(tapioca)、高粱、燕麦、水稻、豌豆、豆类、或甘薯、或其混合物。还考虑了糯型(waxytype)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。
在一个实施例中，该含淀粉起始材料是玉米。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是小麦。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是大麦。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是黑麦。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是西非高粱。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是西米。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是木薯。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是木薯淀粉。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是高粱。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是水稻。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是豌豆。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是豆类。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是甘薯。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是燕麦。
发酵
在发酵培养基中进行发酵。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。利用本文所述的方法，该发酵培养基可以包含用于一种或多种发酵生物的营养素和一种或多种生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，并且包括氮源例如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。
发酵生物
本文所述的方法中可以使用酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物，或酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。在一个实施例中，该发酵生物与酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012具有大致相同的性质，由于其在相同的方法条件下与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，提供了乙醇产量的增加。
在一个实施例中，与酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012具有大致相同性质的发酵生物菌株具有以下性质和定义特征中的至少一种或多种，例如全部：
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加了乙醇产量；
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，降低了乙醛产生；
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加了温度耐受性；以及
在相同的方法条件下，如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少了甘油产生。
在一个实施例中，使用相同的方法设置和条件，例如本文所述的条件，与酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012具有大致相同性质的发酵生物比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)提供大于1.0％，例如大于2.0％，例如大于2.5％，例如约2.9％的乙醇产量提升。
在一个实施例中，在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，与酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012具有大致相同性质的发酵生物降低乙醛产生大于10％，例如大于20％、大于30％、大于40％、大于45％，例如在5％-60％之间，例如30％-50％。
在一个实施例中，在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，与酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012具有大致相同性质的发酵生物增加了温度耐受性。
由于发酵温度可能在一定程度上波动，因此增加的温度耐受性是一个优势。在发酵初期，设备通常不主动给发酵加热。因此，温度可能因酵母的代谢而自然升高。该设备可以使用热交换器控制早期发酵温度，因此温度不会过高。在一年的大部分时间里，设备可以容易地控制早期温度，并且峰值温度典型地为约34℃。但是，在夏季，热交换器中使用的冷却水不够冷，无法控制温度。因此，在没有冷却器(即水制冷系统)的设备中，早期发酵温度可达到36.5℃以上，这会给酵母带来压力。
在一个实施例中，在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，与酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012具有大致相同性质的发酵生物减少甘油产生大于3％，例如大于4％、大于5％、大于6％、大于7％，例如在2％-15％之间，例如5％-10％。
回收
在发酵(例如，SSF)后，可以将乙醇从发酵培养基中分离。可蒸馏该浆料以回收/提取所希望的发酵产物(即，乙醇)。可替代地，可通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物(即，乙醇)。还可通过汽提或本领域中熟知的其他方法来回收发酵产物(即，乙醇)。
液化中存在和/或添加的α-淀粉酶
本文使用的α-淀粉酶可任选地与蛋白酶和/或葡糖淀粉酶和/或任选的支链淀粉酶一起存在于和/或添加到液化中，例如，如WO 2012/088303(诺维信公司)或WO 2013/082486(诺维信公司)中所披露，将参考文献都通过引用并入。
在液化步骤i)中添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。在一个实施例中，该α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，其在一定温度下可以是稳定的。
酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012可以表达本文所述的任何α-淀粉酶，包括下文所述的任何细菌的、杂合的和/或热稳定的α-淀粉酶。
细菌α-淀粉酶
术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。本文所用的细菌α-淀粉酶可例如源自芽孢杆菌属(Bacillus)(有时也称作地芽孢杆菌属(Geobacillus))的菌株。在一个实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可以源自其他芽孢杆菌属菌种。
细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:1的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG)，WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(BAN)，以及WO 99/19467中的SEQ ID NO:4或本文的SEQ ID NO:21的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(BLA)(所有序列都通过引用特此并入)。在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是分别与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQ ID NO:1所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
在一个实施例中，该α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以在重组产生过程中是天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以在C-末端处被截短，使得其为480-495个氨基酸长，如约491个氨基酸长，例如使得其缺乏功能性淀粉结合结构域(与WO99/19467中的SEQ ID NO:3相比)或本文的SEQ ID NO:1。
该芽孢杆菌α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体。这样的变体的实例可见于以下任一者中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(各自通过引用特此并入)。具体的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中披露(通过引用特此并入)并包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(通常称为BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179、G180、I181和/或G182处的一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失-参见例如第20页，第1-10行(通过引用特此并入)，例如与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或氨基酸R179和G180的缺失，使用WO 99/19467(该参考文献通过引用并入并入)中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1进行编号。在一些实施例中，该芽孢杆菌α-淀粉酶(如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶)具有与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1所示的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于位置181和182的缺失的双缺失，并且进一步任选地包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在与WO 99/19467中的SEQ ID NO:4或本文的SEQ ID NO:21所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242和/或E188P变体的S239相对应的位置处具有取代。
在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，例如S242Q变体(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)。
在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的E188变体，例如E188P变体(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)。
在一个实施例中，该细菌α-淀粉酶可以是截短的芽孢杆菌属α-淀粉酶。在一个实施例中，截短是这样的，例如，以使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是约491个氨基酸长，例如从480至495个氨基酸长，或者使得其缺乏功能性淀粉结合结构域。
细菌杂合α-淀粉酶
该细菌α-淀粉酶也可以是杂合细菌α-淀粉酶，例如包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:4中所示)的445个C-末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:5中所示)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶。在一个实施例中，该杂合体具有以下取代中的一个或多个，尤其是全部：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌进行编号)或本文的SEQ ID NO:21。在一些实施例中，这些变体具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，例如E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5或本文的SEQ ID NO:21进行位置编号)。
在一个实施例中，该细菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，其披露于Richardson等人(2002),The Journal of Biological Chemistry[生化杂志],277卷,29期,7月19日发表,267501-26507页中，称作BD5088或其变体。此α-淀粉酶与WO 2007134207中的SEQ ID NO:2所示的相同。成熟酶序列在位置1处的起始“Met”氨基酸之后开始。
热稳定的α-淀粉酶
该α-淀粉酶可以是热稳定α-淀粉酶，如热稳定细菌α-淀粉酶，例如来自嗜热脂肪芽孢杆菌。在一个实施例中，在本文所述的方法中使用的α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl2下具有至少10的T1/2(min)，如在实例1中描述所确定的。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少15的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少20的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少25的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少30的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少40的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少50的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少60的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在10-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在15-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在20-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在25-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在30-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在40-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在50-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在60-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，例如源自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，例如，如在WO 99/019467中披露为SEQ ID NO:3(本文的SEQ ID NO:1)的嗜热脂肪芽孢杆菌，其中在位置R179、G180、I181和/或G182处具有一个或两个氨基酸缺失，特别是具有R179和G180缺失、或具有I181和G182缺失、具有如下突变列表中的突变。
在一些实施例中，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F，进一步包含以下取代或取代的组合中的一个：
V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+S242Q；
E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
K220P+N224L+S242Q+Q254S；
M284V；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V。
在一个实施例中，该α-淀粉酶选自下组：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，其具有双缺失I181*+G182*、以及任选的取代N193F，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)。
应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。特别地，截短是这样的，以使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地是从480-495个氨基酸长，例如约491个氨基酸长，例如使得其缺乏功能性淀粉结合结构域。
在一个实施例中，该α-淀粉酶变体可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQ ID NO:1所示的序列具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％同一性程度的酶。
在一个实施例中，将该细菌α-淀粉酶(例如芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体)以在0.01-10KNU-A/g DS之间的浓度给出到液化中，例如，在0.02和5KNU-A/g DS，如0.03和3KNU-A，优选地0.04和2KNU-A/g DS，如尤其地0.01和2KNU-A/g DS之间。在一个实施例中，将该细菌α-淀粉酶(例如芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体)以在0.0001-1mg EP(酶蛋白)/g DS之间的浓度给出到液化中，例如0.0005-0.5mg EP/g DS，如0.001-0.1mg EP/g DS。
液化中存在和/或添加的蛋白酶
在本文所述的方法中，蛋白酶可任选地与α-淀粉酶、和任选的葡糖淀粉酶、和/或支链淀粉酶一起存在于和/或添加到液化中。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。
在一个实施例中，根据本文所述的方法使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)、优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶。
为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。
蛋白酶底物的实例为酪蛋白，例如Azurine-Crosslinked Casein(天青精交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。在下文“材料与方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定”是优选的测定。
在一个实施例中，通过在“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定确定的，热稳定蛋白酶具有蛋白酶196变体或蛋白酶Pfu的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的蛋白酶活性。
对于在本文所述的方法中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。
在一个实施例中，该蛋白酶是真菌来源的。
蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体，只要所述蛋白酶具有本文定义的热稳定性特性。在一个实施例中，热稳定的蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在一个实施例中，在本文所述的方法中使用的热稳定蛋白酶是真菌来源的，如真菌金属蛋白酶，如源自嗜热子囊菌属的菌株、优选金黄色嗜热子囊菌的菌株、尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670(分类为EC 3.4.24.39)的真菌金属蛋白酶。
在一个实施例中，该热稳定蛋白酶是以下各项的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1和如本文的SEQ ID NO:3所示的成熟部分，该变体进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；以及
D79L+S87P+D142L。
在一个实施例中，该热稳定蛋白酶是以下金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:3的成熟部分，该变体具有以下取代或取代的组合中的一个：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；以及
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在一个实施例中，蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:3的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。
该热稳定蛋白酶还可以源自任何细菌，只要该蛋白酶具有热稳定性特性。
在一个实施例中，该热稳定蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，如强烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。
在一个实施例中，该蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))中的SEQ ID NO:1、或本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶。
在一个实施例中，热稳定的蛋白酶是本文的SEQ ID NO:13或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:13具有至少80％的同一性，例如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的同一性的蛋白酶。强烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio,Japan)。
强烈火球菌蛋白酶是热稳定的蛋白酶。发现商用产品强烈火球菌蛋白酶(PfuS)在pH 4.5下具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性，如实例2中描述所确定的。
在一个实施例中，在本文所述的方法中使用的热稳定性蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，如实例2中描述所确定的。
在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，如超过105％，如超过110％，如超过115％，如超过120％的热稳定性。
在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20％与50％之间，如在20％与40％之间，如20％与30％之间的热稳定性。在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50％与115％之间，如在50％与70％之间，如在50％与60％之间，如在100％与120％之间，如在105％与115％之间的热稳定性。
在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的、超过10％的热稳定性值，如实例2中描述所确定的。
在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。
在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10％与50％之间，如在10％与30％之间，如在10％与25％之间的热稳定性。
在一个实施例中，该蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在80℃下的残余活性；和/或该蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在84℃下的残余活性。
“相对活性”以及“残余活性”的测定是如在实例2中描述的进行的。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃下可以具有高于90，例如高于100的热稳定性，如使用实例3中披露的Zein-BCA测定法所确定的。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法所确定的。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃下具有在60％-120％之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
在一个实施例中，通过AZCL-酪蛋白测定法所确定的，该热稳定性蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％的活性。
液化步骤i)中表达的、存在的和/或添加的葡糖淀粉酶
葡糖淀粉酶可任选地表达于、存在于和/或添加到液化步骤i)中。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶与α-淀粉酶和/或任选的蛋白酶和/或支链淀粉酶一起或单独添加。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶在85℃下具有至少20％、至少30％、或至少35％的相对活性热稳定性，如实例4(热稳定性)中描述所确定的。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶在pH 5.0的pH最佳值下具有至少90％，例如至少95％、至少97％、或100％的相对活性，如实例4(pH最佳值)中描述所确定的。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性，如在实例4(pH稳定性)中描述所确定的。
在一个实施例中，在液化中使用的葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有在pH 4.0下如实例15中所描述的确定为DSC Td的至少70℃，优选地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃的热稳定性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有在pH 4.0下如实例15中所描述的确定为DSC Td的在70℃和95℃之间范围内的(如在80℃和90℃之间)热稳定性。
在一个实施例中，在液化中使用的葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有在pH 4.8下如实例15中所描述的确定为DSC Td的至少70℃，优选地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃、如至少91℃的热稳定性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有在pH 4.8下如实例15中所描述的确定为DSC Td的在70℃和95℃之间范围内的(如在80℃和90℃之间)热稳定性。
在一个实施例中，液化中使用的葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有如实例16中描述所确定的至少100％，如至少105％、如至少110％、如至少115％、如至少120％、如至少125％的残余活性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有如实例16中所描述的确定为残余活性的在100％和130％之间范围内的热稳定性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(例如真菌来源的，如丝状真菌)是来自青霉属的菌株，例如草酸青霉菌的菌株，特别是在WO 2011/127802(将其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的以及本文的SEQ ID NO:9或14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:9或14所示的成熟多肽至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的以及本文的SEQ ID NO:9和14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:14所示的成熟序列进行编号)。如WO 2013/036526(将其通过引用特此并入)中披露的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自草酸青霉菌。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及本文的SEQ ID NO:9或14中显示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体。在一个实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及本文的SEQ ID NO:9或14中显示的、在位置79处具有Val(V)(使用本文的SEQ ID NO:14进行编号)的草酸青霉葡糖淀粉酶。
涵盖的草酸青霉葡糖淀粉酶变体披露于WO 2013/053801(其通过引用由此并入)中。
在一个实施例中，这些变体对蛋白酶降解具有降低的敏感度。
在一个实施例中，这些变体与亲本相比具有改善的热稳定性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有对应于PE001变体的K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步包含以下改变或改变的组合中的一个：
T65A；Q327F；E501V；Y504T；Y504*；T65A+Q327F；T65A+E501V；T65A+Y504T；T65A+Y504*；Q327F+E501V；Q327F+Y504T；Q327F+Y504*；E501V+Y504T；E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V；T65A+Q327F+Y504T；T65A+E501V+Y504T；Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+Y504*；T65A+E501V+Y504*；Q327F+E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504*；E501V+Y504T；T65A+K161S；T65A+Q405T；T65A+Q327W；T65A+Q327F；T65A+Q327Y；P11F+T65A+Q327F；R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；P11F+T65A+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+S105P+Q327W；T65A+S105P+Q327F；T65A+Q327W+S364P；T65A+Q327F+S364P；T65A+S103N+Q327F；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；S255N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；和P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
在一个实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体具有对应于PE001变体的K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步包含以下取代或取代的组合中的一个：
P11F+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。
该葡糖淀粉酶能以从0.1-100微克EP/g，如0.5-50微克EP/g，如1-25微克EP/g，如2-12微克EP/g DS的量添加。
液化步骤i)中存在的和/或添加的支链淀粉酶
任选的支链淀粉酶可以与α-淀粉酶和/或任选的蛋白酶和/或葡糖淀粉酶一起存在于和/或添加到液化步骤i)期间。
支链淀粉酶可以是在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)或同时糖化发酵(SSF)中存在的和/或添加的。
支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖水解酶)是以其水解例如支链淀粉(amylopectin)和支链淀粉(pullulan)中的α-1,6-葡糖苷键的能力为特征的脱支酶(debranching enzyme)。
考虑的支链淀粉酶包括来自美国专利号4,560,651(通过引用特此并入)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌(Bacillus amyloderamificans)的支链淀粉酶、WO 01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的支链淀粉酶、WO 01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:4的脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)的支链淀粉酶，以及来自WO01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸性支链淀粉芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)的支链淀粉酶，以及还有描述于FEMS Mic.Let.[FEMS微生物学通讯](1994)115,97-106中的支链淀粉酶。
考虑的另外的支链淀粉酶包括来自沃斯氏火球菌(Pyrococcus woesei)、特别是来自WO 92/02614中披露的沃斯氏火球菌DSM号3773的支链淀粉酶。
在一个实施例中，该支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶包括X47结构域，如披露于作为WO 2011/087836公开的US 61/289,040(将其通过引用特此并入)中。更具体地，该支链淀粉酶可以源自热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)和热水高温球菌，例如热水高温球菌支链淀粉酶，示于SEQ IDNO:11中，刚好在X47结构域之后的X4位点截短(即，本文的SEQ ID NO:11和12中的氨基酸1-782)。该支链淀粉酶还可以是嗜热高温球菌和热水高温球菌支链淀粉酶杂合体或具有截短位点X4的、披露于作为WO 2011/087836公开的US 61/289,040(将其通过引用特此并入)中的以及披露于本文的SEQ ID NO:12中的热水高温球菌/嗜热高温球菌杂合酶。
在另一个实施例中，该支链淀粉酶是包括披露于WO 2011/076123(诺维信公司)中的X46结构域的一种支链淀粉酶。
该支链淀粉酶能以有效量添加，该有效量包括约0.0001-10mg酶蛋白/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白/克DS。支链淀粉酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定描述于下文的“材料与方法”部分中。
适合的可商购支链淀粉酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYMETM D2(诺维信公司，丹麦)、OPTIMAX L-300(杜邦-丹尼斯科公司(DuPont-Danisco)，美国)、以及AMANO 8(安能满公司(Amano)，日本)。
糖化和/或发酵中表达、存在和/或添加的葡糖淀粉酶
在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中可以表达、存在和/或添加葡糖淀粉酶。该葡糖淀粉酶可以源自任何适合的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自由以下组成的组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,1984,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中披露的那些(来自诺维信公司，丹麦)；WO 84/02921中披露的泡盛曲霉葡糖淀粉酶；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学](1991),55(4),第941-949页)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人,(1996),Prot.Eng.[蛋白质工程]9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人,(1995),Prot.Eng.[蛋白质工程]8,575-582)；N182(Chen等人,(1994),Biochem.J[生物化学杂志]301,275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,(1996),Biochemistry[生物化学],35,8698-8704)；以及在A435和S436位置引入Pro残基(Li等人,(1997),Protein Eng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。
其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(以前命名为罗尔伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii[来自罗尔伏革菌的粗淀粉降解葡萄糖淀粉酶的纯化及性质]”Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森篮状菌(WO 99/28448)、雷塞氏篮状菌(美国专利号Re.32,153)、杜氏篮状菌(Talaromyces duponti)、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。在一个实施例中，糖化和/或发酵期间使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。
涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。
涵盖的真菌葡糖淀粉酶包括WO 2006/069289中披露的瓣环栓菌(SEQ ID NO:20)、纸质刺孢孔菌(Pachykytospora papyracea)、和大白桩蘑(Leucopaxillus giganteus)；或WO 2007/124285中披露的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)；或其混合物。还考虑了杂合葡糖淀粉酶。实例包括WO 2005/045018中披露的杂合葡糖淀粉酶。具体实例包括实例1的表1和表4中披露的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用特此并入)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别是如WO 2011/066576中描述的密孔菌属的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)，包括如本文的SEQ ID NO:18所披露的血红密孔菌葡糖淀粉酶，或来自粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，特别是如WO 2011/068803中描述的粘褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:15(即，篱边粘褶菌葡糖淀粉酶)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是本文的SEQ ID NO:17(即，WO 2014/177546中披露为SEQ ID NO:3的密粘褶菌葡糖淀粉酶)。在另一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自黑层孔属的菌株，特别是披露于WO 2012/064351中的黑层孔属的菌株(SEQ ID NO:2)(全部参考文献通过引用特此并入)。
还考虑了如下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶展现与上述葡糖淀粉酶中的任一种的高同一性，即，分别与上述酶序列的成熟部分中的任一个(例如本文的SEQ ID NO:15、17、18或19中的任一个，优选本文的SEQ ID NO:15或本文的SEQ ID NO:17)具有至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，如0.1-2AGU/g DS。
葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：1-1,000μg EP/g DS，优选10-500μg/g DS，尤其是在25-250μg/g DS之间。
该葡糖淀粉酶作为进一步包含α-淀粉酶的共混物添加。在一个实施例中，该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，尤其是酸性真菌α-淀粉酶。该α-淀粉酶典型地具有副活性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含WO 99/28448中作为SEQID NO:34和本文的SEQ ID NO:19披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和在WO 06/069289中作为SEQ ID NO:2和/或本文的SEQ ID NO:20披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，其包含WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:19)、WO 06/69289中作为SEQ ID NO:2和本文的SEQ IDNO:20披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:19)、WO 06/69289中披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:20)、以及WO 2006/069290的表5中作为V039或本文的SEQ ID NO:16披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含如在WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2(本文的SEQ ID NO:15)所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶(特别地具有以下取代：G128D+D143N)。
在一个实施例中，该α-淀粉酶可以源自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，如WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3所示的，或亚灰树花菌属(Meripilus)，优选大型亚灰树花菌的菌株。在一个实施例中，该α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，如WO 2006/069290的表5中作为V039或本文的SEQ ID NO:16披露的。
在一个实施例中，该微小根毛霉α-淀粉酶或具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶具有以下取代或取代组合中的至少一个：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；和G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:16进行编号)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包含篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，WO2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:15)和微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包含如在WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:15所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶，以及WO 2013/006756中的SEQ IDNO:3或本文的SEQ ID NO:16披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉淀粉酶(具有以下取代：G128D+D143N)。
包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER，SANTMEXTRA L，SPIRIZYMETM PLUS，SPIRIZYMETM FUEL，SPIRIZYMETM B4U，SPIRIZYMETM ULTRA，SPIRIZYMETM EXCEL、SPIRIZYME ACHIEVETM和AMGTM E(来自诺维信公司)；OPTIDEXTM 300，GC480，GC417(来自杜邦-丹尼斯科公司(DuPont-Danisco))；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900，G-ZYMETM和G990 ZR(来自杜邦-丹尼斯科公司)。
糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的纤维素分解酶组合物
包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的纤维素分解酶组合物可以存在于糖化或发酵或同时糖化发酵(SSF)中。
合适的纤维素分解酶组合物的实例可见于WO 2008/151079和WO 2013/028928中，将其通过引用而并入。
在优选的实施例中，该纤维素分解酶组合物源自木霉属、腐质霉属、或金孢子菌属的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉、特异腐质霉、和/或勒克瑙金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶，例如源自曲霉属的菌株的β-葡糖苷酶，如米曲霉，如披露于WO 2002/095014中的米曲霉β-葡糖苷酶，或披露于WO2008/057637中的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉，如披露于WO 2005/047499中的烟曲霉β-葡糖苷酶(本文的SEQ ID NO:29)或披露于WO 2012/044915中的烟曲霉β-葡糖苷酶变体(诺维信公司)，如具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文的SEQ ID NO:29进行编号)；或源自青霉属的菌株，如WO 2007/019442中披露的巴西青霉的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如源自嗜热子囊菌属，如金黄色嗜热子囊菌的菌株，如WO 2005/074656中作为SEQ IDNO:2和本文的SEQ ID NO:30所描述的该多肽；或源自梭孢壳属，如土生梭孢壳霉的菌株，如WO 2005/074647中作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所描述的该多肽；或源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如WO 2010/138754中作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所描述的该多肽；或源自青霉属的菌株，如埃默森青霉的菌株，如WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:31披露的该多肽。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如WO 2013/028928中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:32中披露的Cel7a CBHI，或源自木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含纤维素二糖水解酶II(CBH II，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，作为WO 2013/028928中的SEQ ID NO:4或本文的SEQ IDNO:33披露的)；或源自木霉属的菌株，如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，如土生梭孢壳霉的菌株，如来自土生梭孢壳霉的纤维素二糖水解酶II CEL6A。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、以及CBH I。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I、以及CBH II。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:30)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:30)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:29)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含作为WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:31披露的、具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61A多肽，以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQID NO:2或本文的SEQ ID NO:29)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用SEQ ID NO:29进行编号)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含一种或多种以下组分：
(i)烟曲霉纤维素二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维素二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；以及
(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属物种GH61多肽；或其同系物。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉，其包含源自埃默森青霉的菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:31)，具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:29)变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(WO 2012/044915中披露的)；作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:32披露的烟曲霉Cel7A CBH1以及作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18或本文的SEQ ID NO:33披露的烟曲霉CBH II。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物以0.0001-3mg EP/g DS，优选0.0005-2mg EP/g DS，优选0.001-1mg/g DS，更优选0.005-0.5mg EP/g DS，并且甚至更优选0.01-0.1mg EP/g DS给予。
优选方法的实例
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶(例如，本文的SEQ ID NO:1)液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵或SSF中添加蛋白酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，这些方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶(其包含在位置I181+G182处的双缺失，以及任选的N193F取代)液化该含淀粉材料；(使用SEQ IDNO:1进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶，例如源自粘褶菌属菌株(如篱边粘褶菌或密粘褶菌)的葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(1)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶(例如SEQ ID NO:1)；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
任选地草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)使用α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌，特别是包含在位置I181+G182处的双缺失和任选的N193F取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)并且在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl2下具有至少10的T1/2(min)的α-淀粉酶，在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下液化该含淀粉材料：
α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，特别是在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)的嗜热脂肪芽孢杆菌；
蛋白酶，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
任选地草酸青霉菌葡糖淀粉酶
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，这些方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S：
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶，如来自粘褶菌属菌株(如篱边粘褶菌菌株)的葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F，并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S：
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
任选地SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F，以及进一步任选地具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)，
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
任选地支链淀粉酶；
具有K79V取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；
ii)使用选自下组的葡糖淀粉酶进行糖化：源自曲霉属菌株的葡糖淀粉酶，优选地黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌，或黑层孔属的菌株；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料；
α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌，其具有在位置I181+G182处的双缺失和任选的取代N193F，并且在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；
任选地支链淀粉酶；
草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；以及
任选地支链淀粉酶；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；
任选地支链淀粉酶；以及
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用选自下组的葡糖淀粉酶进行糖化：源自曲霉属菌株的葡糖淀粉酶；或木霉属菌株；篮状菌属菌株；密孔菌属菌株；粘褶菌属菌株；以及黑层孔属菌株；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，在5.0和6.5之间的pH下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
源自强烈火球菌的蛋白酶，优选本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是一种包括以下步骤的方法：
i)在80℃-90℃之间的温度下，在5.0和6.5之间的pH下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
源自强烈火球菌的蛋白酶，优选地本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶，其以1-5微克蛋白酶/克DS(如约1.5或3微克蛋白酶/克DS)的剂量存在和/或添加；以及
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，发酵生物增加了乙醇产量。
生淀粉水解过程
该方面涉及使用适于在生产乙醇的过程和方法中使用的发酵生物和酵母菌株的、改进的生产乙醇的生淀粉水解过程。
更具体地说，本方面涉及从含淀粉材料例如颗粒状淀粉生产乙醇的方法，这些方法包括：
(i)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酵母菌属菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酵母菌属菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个方面中，是从含淀粉材料例如颗粒状淀粉生产乙醇的方法，该方法包括：
(i)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中
在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：葡糖淀粉酶和α-淀粉酶、以及任选地蛋白酶；并且
该发酵生物是酵母菌属酵母菌株，其提供以下改进中的一种或多种，例如全部：
在相同的发酵条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，乙醇产量提升；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，降低的乙醛产生；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加的温度耐受性；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油产生。
在一个实施例中，方法中使用的发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)、或酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)。在一个实施例中，方法中使用的发酵生物是表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物。
与在相同条件下使用酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)作为发酵生物进行的对应方法相比，使用本文所述的酵母进行的生淀粉水解方法可产生以下一个或多个(例如全部)改进：
在相同的发酵条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，乙醇产量提升；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，降低的乙醛产生；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加的温度耐受性；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油产生。
使用的合适酶的实例，特别是葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素分解酶组合物等，在下文“生淀粉水解过程中使用的酶和酶共混物”部分中进行了描述。
在一个实施例中，以下酶是在糖化和/或发酵中表达、存在和/或添加的：瓣环栓菌葡糖淀粉酶，例如本文的SEQ ID NO:20所示的瓣环栓菌葡糖淀粉酶，以及α-淀粉酶。在一个实施例中，该α-淀粉酶是微小根毛霉α-淀粉酶，优选具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，特别是本文的SEQ ID NO:16所示的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个实施例中，以下酶是在糖化和/或发酵中表达、存在和/或添加的：密粘褶菌葡糖淀粉酶，例如，本文的SEQ ID NO:17所示的密粘褶菌葡糖淀粉酶，尤其是进一步具有以下取代中的一个或多个的密粘褶菌葡糖淀粉酶：S95P、A121P，尤其是S95P+A121P，以及α-淀粉酶。在一个实施例中，该α-淀粉酶源自微小根毛霉，例如具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，特别是具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，作为WO 2006/069290的表5中的V039或本文的SEQ ID NO:16披露的。
在该方法的一个实施例中，以下酶是在糖化和/或发酵中表达、存在和/或添加的：密粘褶菌葡糖淀粉酶，优选本文的SEQ ID NO:17所示的密粘褶菌葡糖淀粉酶，优选是进一步具有以下取代中的一个或多个的密粘褶菌葡糖淀粉酶：S95P、A121P，尤其是S95P+A121P，以及α-淀粉酶。该α-淀粉酶可以源自微小根毛霉，优选具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，特别是本文的SEQ ID NO:16所示的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，优选具有以下取代中的一个或多个的微小根毛霉α-淀粉酶：G128D、D143N，尤其是G128D+143N。
在一个实施例中，以下酶是在糖化和/或发酵中表达、存在和/或添加的：血红密孔菌葡糖淀粉酶，优选本文的SEQ ID NO:18所示的血红密孔菌葡糖淀粉酶，以及α-淀粉酶。在一个实施例中，该α-淀粉酶源自微小根毛霉，优选具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，例如具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，作为WO2006/069290的表5中的V039或本文的SEQ ID NO:16披露的，例如进一步具有以下取代中的一个或多个的微小根毛霉：G128D、D143N(例如，G128D+D143N)。
在一个实施例中，蛋白酶是在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的。在一个实施例中，该蛋白酶是金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶。在一个实施例中，该金属蛋白酶源自嗜热子嚢菌属的菌株，例如金黄色嗜热子囊菌的菌株，例如金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670(例如披露为WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或本文的SEQ ID NO:3的成熟多肽的金属蛋白酶)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉，优选地进一步包含具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:30)和烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:29)，或源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，其优选地进一步包含埃默森青霉菌GH61A多肽(例如披露为WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:31的埃默森青霉菌GH61A多肽)，以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如披露为WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:29的烟曲霉β-葡糖苷酶)或其变体(例如具有以下取代之一或全部的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y)，烟曲霉CBH1(例如作为WO2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:32披露的烟曲霉CBH1)，以及烟曲霉CBH II(例如，作为WO2011/057140中的SEQ ID NO:18或本文的SEQ ID NO:33披露的烟曲霉CBH II)。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶与α-淀粉酶的比率为在99:1与1:2之间，如在98:2与1:1之间，如在97:3与2:1之间，如在96:4与3:1之间，如97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、90:10、85:15、83:17或65:35(mg EP葡糖淀粉酶:mg EPα-淀粉酶)。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶与α-淀粉酶的比率为在100:1与1:2之间，如在90:1与1:1之间，如在80:1与2:1之间，如在70:1与3:1之间，如16:1(确定为AGU:FAU-F)。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的总剂量是从10-1,000μg/g DS，例如从50-500μg/g DS，例如75-250μg/g DS。
在一个实施例中，添加的纤维素分解酶组合物的总剂量是从10-500μg/g DS，例如从20-400μg/g DS，例如20-300μg/g DS。
在一个实施例中，添加的蛋白酶的剂量是从1-200μg/g DS，例如从2-100μg/g DS，例如3-50μg/g DS。
在一个实施例中，同时进行糖化步骤(a)和发酵步骤(b)。
在一个实施例中，该发酵生物是一种非重组酵母菌属菌株，例如是使用美国专利号8,257,959-BB中所描述和涉及的方法产生的非重组酿酒酵母菌株。
生淀粉水解过程中使用的酶和酶共混物
葡糖淀粉酶和α-淀粉酶可以存在于和/或添加到糖化步骤(i)和/或发酵步骤(ii)(例如同时糖化发酵(SSF))中。任选地，也存在和/或添加蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物。还可以存在和/或添加其他酶，如支链淀粉酶、果胶酶、和/或海藻糖酶。
下文描述了合适的和具体考虑的酶和酶组合(例如共混物)的非穷尽列表。
在一个实施例中，以下酶是在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的：栓菌属葡糖淀粉酶，优选本文的SEQ ID NO:20所示的瓣环栓菌葡糖淀粉酶，以及α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自瓣环栓菌，例如是本文的SEQ ID NO:20所示的葡糖淀粉酶，或选自由以下组成的组的葡糖淀粉酶：
(i)包含本文的SEQ ID NO:20的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个实施例中，以下酶是在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的：粘褶菌属葡糖淀粉酶，优选密粘褶菌葡糖淀粉酶，尤其是本文的SEQ ID NO:17所示的密粘褶菌葡糖淀粉酶，以及α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，例如是本文的SEQ ID NO:17所示的葡糖淀粉酶，或选自由以下组成的组的葡糖淀粉酶：
(i)包含本文的SEQ ID NO:17的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个实施例中，粘褶菌属葡糖淀粉酶(例如SEQ ID NO:17所示的密粘褶菌葡糖淀粉酶)具有以下取代中的一个：V59A；S95P；A121P；T119W；S95P+A121P；V59A+S95P；S95P+T119W；V59A+S95P+A121P；或S95P+T119W+A121P，尤其是S95P+A121P(使用SEQ ID NO:17进行编号)。
本文所述方法中使用的α-淀粉酶通常是真菌α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶。在一个实施例中，该α-淀粉酶源自根毛霉属，例如具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，例如具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，作为WO 2006/069290的表5中的V039或本文的SEQ ID NO:16披露的。
在一个实施例中，该α-淀粉酶是本文的SEQ ID NO:16所示的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的根毛霉属α-淀粉酶或微小根毛霉α-淀粉酶，例如具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C，尤其G128D+D143N(使用SEQ ID NO:16进行编号)。
在一个实施例中，该α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)α-淀粉酶，其包含本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在一个实施例中，以下酶是在糖化和/或发酵中存在和/或添加的：本文的SEQ IDNO:20所示的瓣环栓菌葡糖淀粉酶和源自微小根毛霉的α-淀粉酶，优选具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，特别是具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，作为WO 2006/069290的表5中的V039或本文的SEQ IDNO:16披露的。
在一个实施例中，以下酶是在糖化和/或发酵中存在和/或添加的：粘褶菌属葡糖淀粉酶，优选本文的SEQ ID NO:17所示的密粘褶菌葡糖淀粉酶，以及源自微小根毛霉的α-淀粉酶，优选具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，特别是具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，作为WO 2006/069290的表5中的V039或本文的SEQ ID NO:16披露的。
在一个实施例中，存在和/或添加的酶包含本文的SEQ ID NO:17所示的具有以下取代中的一个或多个的密粘褶菌葡糖淀粉酶：S95P、A121P，尤其是S95P+A121P(使用本文的SEQ ID NO:17进行编号)，以及源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，优选本文的SEQ ID NO:16所示的α-淀粉酶，优选是具有以下取代中的一个或多个的α-淀粉酶：G128D、D143N，尤其尤其G128D+D143N(使用SEQ ID NO:16进行编号)。
在一个实施例中，以下酶是在糖化和/或发酵中存在和/或添加的：密孔菌属葡糖淀粉酶，特别是本文的SEQ ID NO:18所示的血红密孔菌葡糖淀粉酶，以及具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，特别是本文的SEQ ID NO:16所示的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加的酶包含密孔菌属葡糖淀粉酶，例如本文的SEQ ID NO:18所示的血红密孔菌葡糖淀粉酶，以及α-淀粉酶，特别是源自微小根毛霉的具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，优选本文的SEQ ID NO:16所示的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，其优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，尤其是G128D+D143N。
在本文所述的方法中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加的酶包括：i)葡糖淀粉酶和ii)α-淀粉酶；并且可以任选地进一步包含iii)纤维素分解酶组合物和/或iv)蛋白酶。
在一个实施例中，该蛋白酶是金属蛋白酶，优选源自嗜热子嚢菌属的菌株，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670，如作为WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或本文的SEQ ID NO:3的成熟多肽披露的金属蛋白酶。
在一个实施例中，该蛋白酶(特别是源自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:3的成熟多肽的蛋白酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的蛋白酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加的酶包含：本文的SEQ IDNO:20所示的瓣环栓菌葡糖淀粉酶；以及源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，例如本文的SEQ ID NO:16所示的α-淀粉酶，并且可以具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N(例如，G128D+D143N))；以及进一步任选的源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，例如，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:30)和烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:29)；或源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，例如其进一步包含作为WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:31披露的埃默森青霉菌GH61A多肽，以及作为WO 2005/047499中的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:29披露的烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体(例如具有以下取代中的一个、优选地以下取代的全部的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y)，作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:32披露的烟曲霉Cel7A CBH1以及作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18或本文的SEQ ID NO:33披露的烟曲霉CBH II。
在一个实施例中，糖化和/或发酵中存在和/或添加的酶包含：本文的SEQ ID NO:17所示的优选地具有以下取代中的一个或多个的密粘褶菌葡糖淀粉酶：S95P、A121P、尤其是S95P+A121P；以及源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，优选本文的SEQ ID NO:16所示的α-淀粉酶，优选地其具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，尤其G128D+D143N；以及进一步任选地源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，优选地其进一步包含具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:30)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:29)；或源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，优选地其进一步包含作为WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:31披露的埃默森青霉菌GH61A多肽，以及作为WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQID NO:29披露的烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体(优选具有以下取代中的一个、优选地以下取代的全部的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y)，作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:32披露的烟曲霉Cel7A CBH1以及作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18或本文的SEQ ID NO:33披露的烟曲霉CBH II。
在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加的酶包含：本文的SEQ IDNO:18所示的血红密孔菌葡糖淀粉酶；以及α-淀粉酶，该α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，优选本文的SEQ ID NO:16所示的α-淀粉酶，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，尤其G128D+D143N；以及进一步任选地源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，优选地其进一步包含具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:30)；或源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，优选地其进一步包含作为WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:31披露的埃默森青霉菌GH61A多肽，以及作为WO 2005/047499中的SEQID NO:2或本文的SEQ ID NO:29披露的烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体(优选具有以下取代中的一个、优选地以下取代的全部的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y)，作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:29披露的烟曲霉Cel7A CBH I以及作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18或本文的SEQ ID NO:33披露的烟曲霉CBH II。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是下文“纤维素分解酶组合物”部分中描述的纤维素分解酶组合物。
可以在本文所述的方法中与葡糖淀粉酶和α-淀粉酶同时添加任选的纤维素分解酶组合物、蛋白酶或其他酶。可以将例如酶组合物形式的酶添加到糖化和/或发酵中，优选同时糖化发酵(即一步法)。应理解，还可以单独地或作为两种、三种、四种或更多种酶组分/组合物添加酶。在一个实施例中，作为一种共混物组合物添加葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，并且分开地添加任选的纤维素分解酶组合物和/或任选的蛋白酶。在另一个实施例中，作为一种酶组合物添加葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和纤维素分解酶组合物，并且分开地添加任选的蛋白酶。在一个实施例中，还可以作为一种酶组合物添加所有酶，该酶组合物包含葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、纤维素分解酶组合物、和/或蛋白酶、以及任选地其他酶，这些其他酶包括支链淀粉酶、海藻糖酶和/或果胶酶(例如果胶裂解酶或多聚半乳糖醛酸酶)。
还可以存在其他酶。以下进一步描述具体考虑的酶。
葡糖淀粉酶
本文所述方法中使用的葡糖淀粉酶可以是任何来源的，例如细菌或真菌来源的。优选真菌葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶可以是源自栓菌属的菌株，例如瓣环栓菌菌株的葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:20)；或源自刺孢孔菌(Pachykytospora)的菌株，例如纸质刺孢孔菌的菌株；或源自白桩菇属(Leucopaxillus)的菌株，例如大白桩菇的菌株(均披露于WO 2006/069289中)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(特别是源自瓣环栓菌的菌株)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:20的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌(例如本文的SEQ ID NO:19)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(例如源自埃默森篮状菌的菌株的葡糖淀粉酶)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:19的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:19的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在另一实施例中，该葡糖淀粉酶源自青霉属的菌株，例如草酸青霉菌的菌株。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(例如源自草酸青霉菌的菌株的葡糖淀粉酶)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:14的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自粘褶菌属的菌株，例如源自篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，例如是在WO 2011/068803中披露为SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16中的任一个的葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:15。在另一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/068803中的SEQ IDNO:18(通过引用特此并入)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(例如源自篱边粘褶菌的菌株的葡糖淀粉酶)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:15的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:15的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在另一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别是源自血红密孔菌的菌株，例如WO 2011/066576中描述的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/066576中的SEQ ID NO:4或本文的SEQ ID NO:18所示的葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(例如源自血红密孔菌的菌株的葡糖淀粉酶)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:18的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
还涵盖了以下葡糖淀粉酶，这些葡糖淀粉酶展现出与上述葡糖淀粉酶的任一种的高同一性，例如，与上述酶序列的成熟部分中的任一个具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％的同一性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(例如源自密粘褶菌的菌株的葡糖淀粉酶)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:17的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(例如SEQ ID NO:17所示的、源自密粘褶菌的葡糖淀粉酶)具有以下取代中的一个：V59A；S95P；A121P；T119W；S95P+A121P；V59A+S95P；S95P+T119W；V59A+S95P+A121P；或S95P+T119W+A121P，尤其是S95P+A121P。在一个实施例中，SEQID NO:18所示的密粘褶菌葡糖淀粉酶具有以下取代中的一个：V59A；S95P；A121P；T119W；S95P+A121P；V59A+S95P；S95P+T119W；V59A+S95P+A121P；或S95P+T119W+A121P，尤其是S95P+A121P(使用本文的SEQ ID NO:17进行编号)。将WO 2014/177546中披露的所有密粘褶菌葡糖淀粉酶变体(特别是SEQ ID NO:3中的变体)通过引用并入本文。
葡糖淀粉酶变体可以包含与SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的氨基酸序列。
α-淀粉酶
本文所述方法中使用的α-淀粉酶可以是任何来源的，例如真菌或细菌来源的。在一个实施例中，该α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶，即，具有低于pH 7的最适pH。
在一个实施例中，该α-淀粉酶可以源自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，例如是WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3所示的α-淀粉酶(参见例如实例1中的表1，将其通过引用特此并入)，或源自亚灰树花菌属，优选大型亚灰树花菌的菌株。
在一个实施例中，该α-淀粉酶源自微小根毛霉，例如具有接头和淀粉结合结构域(SBD)(优选黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD))的α-淀粉酶，作为WO 2006/069290(其通过引用并入)的表5中的V039或本文的SEQ ID NO:16披露的。
在一个实施例中，该α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，披露于WO 2013/006756(通过引用并入)或本文的SEQ ID NO:16中。
在一个实施例中，微小根毛霉α-淀粉酶或具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶具有以下取代或取代的组合中的至少一个：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C，尤其G128D+D143N(使用本文的SEQ ID NO:16进行编号)。
在一个实施例中，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个实施例中，α-淀粉酶是具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶的变体，其中该α-淀粉酶变体包含以下氨基酸序列，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的同一性。
在一个实施例中，α-淀粉酶变体具有上述取代中的一个，例如：G128D、Y141W、D143W或K192R(使用SEQ ID NO:16进行编号)。
在一个实施例中，α-淀粉酶(使用本文的SEQ ID NO:16进行编号)具有以下取代：Y141W+D143N。
在一个实施例中，α-淀粉酶具有以下取代：G128D+Y141W+D143N。
在一个实施例中，α-淀粉酶具有以下取代：G128D+Y141W+D143N+K192R。
在一个实施例中，α-淀粉酶具有以下取代：G128D+D143N(使用SEQ ID NO:16进行编号)。
变体可以包含与SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的氨基酸序列。
蛋白酶
存在和/或添加到糖化和/或发酵中的酶可以任选地进一步包含蛋白酶。蛋白酶可以是任何来源的，例如真菌或细菌来源。
在一个实施例中，该蛋白酶是真菌来源的。
在一个实施例中，该蛋白酶是源自嗜热子嚢菌属的菌株的金属蛋白酶，优选源自金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670，如作为WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或本文的SEQ ID NO:3的成熟多肽披露的金属蛋白酶。
在一个实施例中，该蛋白酶(例如源自金黄色嗜热子囊菌的菌株的蛋白酶)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:3的成熟多肽的蛋白酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的蛋白酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。
在一个实施例中，该蛋白酶是细菌来源的。
在一个实施例中，该蛋白酶源自火球菌属的菌株，例如强烈火球菌的菌株，如US6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:5所示的蛋白酶。
在一个实施例中，该蛋白酶(例如源自强烈火球菌的蛋白酶)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:5的成熟多肽的蛋白酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的蛋白酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。
纤维素分解酶组合物
存在和/或添加到糖化和/或发酵中的酶可以任选地进一步包括纤维素分解酶组合物。该纤维素分解酶组合物可以由一种或多种纤维素分解酶组成或包含一种或多种纤维素分解酶。该纤维素分解酶组合物可以是任何来源的。在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含真菌来源的纤维素分解酶。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物源自木霉属的菌株，例如里氏木霉；或腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉；或金孢子菌属的菌株，例如勒克瑙金孢子菌；或青霉属的菌株，例如斜卧青霉。在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉的菌株。
该纤维素分解酶组合物可以包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、和内切葡聚糖酶。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的多肽：
β-葡糖苷酶(BG)；
纤维二糖水解酶I(CBHI)；
纤维二糖水解酶II(CBHII)；
或其混合物。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。如在WO 2011/041397(通过引用并入)中所述限定和确定纤维素分解增强活性。
术语“具有纤维素分解增强活性的GH61多肽”是指通过具有纤维素分解活性的酶增强纤维素材料的水解的GH61多肽。出于本文所述方法的目的，通过在以下条件下测量纤维素分解酶水解纤维素材料而导致的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：在PCS(预处理的玉米秸秆)中的1-50mg的总蛋白/g纤维素，其中总蛋白由以下组成：50-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白，以及与对照水解(具有相等的总蛋白加载，但不具有增强的纤维素分解活性，在PCS中的1-50mg的纤维素分解蛋白/g纤维素)进行比较在50℃持续1-7天具有增强的纤维素分解活性的0.5-50％w/w的GH61多肽蛋白。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2％-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组地产生的)或总蛋白重量的2％-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014中所描述在米曲霉中重组地产生的)的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下的CELLUCLASTTM 1.5L(诺维信公司，巴格斯瓦尔德丹麦)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
该纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶，优选地源自曲霉属的菌株如米曲霉的β-葡糖苷酶，如WO 2002/095014中披露的β-葡糖苷酶或WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白(参见SEQ ID NO:74或76)，或如烟曲霉的β-葡糖苷酶，如在WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的EQ ID NO:8中披露的β-葡糖苷酶，或WO 2012/044915中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或源自青霉属的菌株，如WO 2007/019442中披露的巴西青霉的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株，例如是烟曲霉β-葡糖苷酶(本文的SEQ ID NO:29)、或其变体，该变体包含一个或多个选自由以下组成的组的取代：L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E以及F512Y；如具有以下取代的其变体：
F100D+S283G+N456E+F512Y；
L89M+G91L+I186V+I140V；
I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
在一个实施例中，该亲本β-葡糖苷酶与本文的SEQ ID NO:29的成熟多肽具有至少60％的同一性，例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同一性。
在β-葡糖苷酶是β-葡糖苷酶变体的情况下，它与本文的SEQ ID NO:29的成熟多肽具有至少60％的同一性，例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、但小于100％的同一性。
在纤维素分解酶组合物包含GH61多肽的情况下，它可以是源自嗜热子囊菌属如金黄色嗜热子囊菌的菌株的多肽，如WO 2005/074656中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ IDNO:30所述的多肽；或源自梭孢壳属如土生梭孢壳霉的菌株的多肽，如WO 2005/074647中作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所述的多肽(通过引用特此并入)；或源自曲霉属的菌株如烟曲霉的菌株的多肽，如WO 2010/138754中作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2描述的多肽(通过引用特此并入)；或来自青霉属的菌株如埃默森青霉的菌株的多肽，如WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:31披露的多肽。
在一个实施例中，该GH61多肽(例如源自嗜热子囊菌属的菌株的GH61多肽)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:30的成熟多肽的GH61多肽；
(ii)包含以下氨基酸序列的GH61多肽，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:30的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。
在一个实施例中，该GH61多肽(例如源自青霉属的菌株的GH61多肽)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:31的成熟多肽的GH61多肽；
(ii)包含以下氨基酸序列的GH61多肽，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:31的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ IDNO:32披露的Cel7a CBHI，或源自木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，该纤维二糖水解酶I(例如源自烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:32的成熟多肽的纤维二糖水解酶I；
(ii)包含氨基酸序列的纤维二糖水解酶I，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:32的成熟多肽具有至少60％、如至少70％，例如少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个实施例中，包含在本文所述的酶组合物中的纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II；如披露为本文的SEQ ID NO:33的纤维二糖水解酶II，或源自木霉属的菌株，如里氏木霉；或源自梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
在一个实施例中，纤维二糖水解酶II(例如源自烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II)选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:33的成熟多肽的纤维二糖水解酶II；
(ii)包含以下氨基酸序列的纤维二糖水解酶II，该氨基酸序列与本文的SEQ IDNO:33的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含源自青霉属的菌株(例如埃默森青霉菌菌株)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(例如披露为WO 2011/041397中的SEQID NO:2或本文的SEQ ID NO:31的GH61多肽)，以及β-葡糖苷酶。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、以及CBH I。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含源自青霉属的菌株(例如埃默森青霉菌菌株)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(例如披露为WO 2011/041397中的SEQID NO:2或本文的SEQ ID NO:31的GH61多肽)、β-葡糖苷酶以及CBHII。
在一个实施例中，包含在本文所述的酶组合物中的纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBHI、和CBHII。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含源自青霉属的菌株(例如埃默森青霉菌菌株)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(例如披露为WO 2011/041397中的SEQID NO:2或本文的SEQ ID NO:31的GH61多肽)、β-葡糖苷酶、CBH I、和CBH II。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ IDNO:30)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:30)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:29)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含披露为WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:31的埃默森青霉菌GH61A多肽，以及披露为WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:29的烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体(该变体具有以下取代中的一个、优选地以下取代的全部：F100D、S283G、N456E、F512Y)，以及任选的烟曲霉CBH I(例如作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:32披露的烟曲霉CBH1)以及烟曲霉CBH II(例如，作为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18或本文的SEQ ID NO:33披露的烟曲霉CBH II)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含一种或多种以下组分
(i)烟曲霉纤维素二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维素二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体。
在一个实施例中，烟曲霉β-葡糖苷酶(本文的SEQ ID NO:29)包括选自由以下组成的组的一个或多个取代：L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E、和F512Y；例如具有以下取代或取代的组合中的一个的其变体：
F100D+S283G+N456E+F512Y；
L89M+G91L+I186V+I140V；以及
I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y(使用SEQ ID NO:29进行编号)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物进一步包含本文的SEQ ID NO:31所示的青霉属物种GH61多肽；或包含以下氨基酸序列的GH61多肽，该氨基酸序列与本文的SEQ IDNO:31的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。
支链淀粉酶
存在和/或添加到糖化和/或发酵中的酶可以任选地进一步包括支链淀粉酶。支链淀粉酶可以是任何来源的，例如真菌或细菌来源。
在一个实施例中，该支链淀粉酶源自芽孢杆菌属物种的菌株，例如脱支芽孢杆菌的菌株。
海藻糖酶
存在和/或添加到糖化和/或发酵中的酶可以任选地进一步包括海藻糖酶。
海藻糖酶可以是任何来源的，例如真菌或细菌来源。
在一个实施例中，该海藻糖酶是真菌来源的，例如源自木霉属的菌株，例如里氏木霉。
果胶酶
存在和/或添加到糖化和/或发酵中的酶可以任选地进一步包括果胶酶，例如果胶裂解酶(也称为果胶裂合酶)和/或多聚半乳糖醛酸酶、或其组合。
果胶酶可以是任何来源的，例如真菌或细菌来源。
在一个实施例中，果胶酶是果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)。
在一个实施例中，果胶裂解酶源自曲霉属的菌株，例如黑曲霉。
在一个实施例中，果胶酶是多聚半乳糖醛酸酶(EC.3.2.1.15)。
在一个实施例中，多聚半乳糖醛酸酶源自曲霉属的菌株，例如棘孢曲霉。
在一个实施例中，果胶酶是果胶裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶的组合。在一个实施例中，果胶酶是源自黑曲霉的果胶裂解酶和源自棘孢曲霉的多聚半乳糖醛酸酶的组合。
适用于生淀粉水解过程的酶(例如共混物)的实例
在一个实施例中，用于本文所述的方法的酶(例如共混物)包含葡糖淀粉酶和α-淀粉酶、以及任选地蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物。还可以使用其他任选的酶。
在一个实施例中，在本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含来自瓣环栓菌的葡糖淀粉酶(例如，SEQ ID NO:20)、以及来自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶(例如SEQ ID NO:16)，或由其组成。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含具有以下取代中的一个或多个的密粘褶菌葡糖淀粉酶(例如本文的SEQ ID NO:17)：S95P、A121P，优选S95P+A121P，以及α-淀粉酶，优选源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶(本文的SEQ ID NO:16所示的)，优选地其具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N。
在另一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含本文的SEQ IDNO:18所示的血红密孔菌葡糖淀粉酶，以及α-淀粉酶，优选源自微小根毛霉的具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，优选源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，特别是本文的SEQ ID NO:16所示的α-淀粉酶，优选地其具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，尤其是G128D+D143N。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含本文的SEQ IDNO:15所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶，以及α-淀粉酶，优选源自微小根毛霉的具有接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，优选本文的SEQ ID NO:16所示的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，优选地其具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含本文的SEQ IDNO:20所示的瓣环栓菌葡糖淀粉酶，以及α-淀粉酶，优选本文的SEQ ID NO:16示出的、源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)α-淀粉酶，其具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含
i)真菌葡糖淀粉酶；
ii)真菌α-淀粉酶；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II；
iv)任选地蛋白酶。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(共混物)包含
i)瓣环栓菌葡糖淀粉酶；
ii)微小根毛霉α-淀粉酶、或其变体；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含埃默森青霉菌GH61A多肽，具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y，以及任选的烟曲霉CBH I和烟曲霉CBH II；
iv)任选地来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含
i)瓣环栓菌葡糖淀粉酶；
ii)微小根毛霉α-淀粉酶、或其变体；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含埃默森青霉菌GH61A多肽，具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y，以及任选的烟曲霉CBH I和烟曲霉CBH II；
iv)任选地来自强烈火球菌的蛋白酶。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含
i)源自瓣环栓菌的葡糖淀粉酶；
ii)源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶、或其变体；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物；
iv)任选地来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体，和/或来自强烈火球菌的蛋白酶。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含
i)真菌葡糖淀粉酶；
ii)真菌α-淀粉酶；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II；
iv)果胶酶，优选果胶裂解酶或多聚半乳糖醛酸酶、或其组合。
在一个实施例中，果胶酶是源自黑曲霉的果胶裂解酶和源自棘孢曲霉的多聚半乳糖醛酸酶的组合。
在一个实施例中，果胶酶是果胶裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶的组合。在一个实施例中，果胶酶是源自黑曲霉的果胶裂解酶和源自棘孢曲霉的多聚半乳糖醛酸酶的组合。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含
i)真菌葡糖淀粉酶；
ii)真菌α-淀粉酶；
iii)果胶酶，优选果胶裂解酶或多聚半乳糖醛酸酶、或其组合；
iv)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II；
v)蛋白酶。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含
i)真菌葡糖淀粉酶；
ii)真菌α-淀粉酶；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II；
iv)任选地蛋白酶。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含
i)瓣环栓菌葡糖淀粉酶；
ii)微小根毛霉α-淀粉酶、或其变体；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含埃默森青霉菌GH61A多肽，具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y，以及任选的烟曲霉CBH I和烟曲霉CBH II；
iv)源自黑曲霉的果胶裂解酶或源自棘孢曲霉的多聚半乳糖醛酸酶、或其组合；
v)来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体，和/或来自强烈火球菌的蛋白酶。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(共混物)包含
i)本文的SEQ ID NO:18所示的具有以下取代中的一个或多个的密粘褶菌葡糖淀粉酶：S95P、A121P，例如S95P+A121P；
ii)本文的SEQ ID NO:13所示的、源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含埃默森青霉菌GH61A多肽，具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y，以及任选的烟曲霉CBH I和烟曲霉CBH II；
任选地iv)来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含
i)本文的SEQ ID NO:18所示的血红密孔菌葡糖淀粉酶；
ii)本文的SEQ ID NO:16所示的、源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含埃默森青霉菌GH61A多肽，具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y，以及任选的烟曲霉CBH I和烟曲霉CBH II；
任选地iv)来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含
i)本文的SEQ ID NO:15所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶；
ii)本文的SEQ ID NO:16所示的、源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含埃默森青霉菌GH61A多肽，具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y，以及任选的烟曲霉CBH I和烟曲霉CBH II；
任选地iv)来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体。
在一个实施例中，本文所述的方法中使用的酶(例如共混物)包含
i)本文的SEQ ID NO:20所示的瓣环栓菌葡糖淀粉酶；
ii)本文的SEQ ID NO:16所示的、源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N；
iii)源自里氏木霉的菌株的纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物进一步包含埃默森青霉菌GH61A多肽，具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y，以及任选的烟曲霉CBH I和烟曲霉CBH II；
任选地iv)来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体。
生淀粉水解过程的实例
在一个实施例中，从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括：
(i)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中
在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：葡糖淀粉酶和α-淀粉酶、以及任选的蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物；并且
该发酵生物是在相同的发酵条件下与ETHANOL REDTM相比提供乙醇产量提升的酵母菌属菌株。
在一个实施例中，该方法提供以下改进中的一个或多个，例如全部：
在相同的发酵条件(例如本文所述的条件)下，与ETHANOL REDTM相比，乙醇产量提升；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与ETHANOL REDTM相比，降低的乙醛产生；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与ETHANOL REDTM相比，增加的温度耐受性；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与ETHANOL REDTM相比，减少的甘油产生。在一个实施例中，用于从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括：
(i)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中
在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：葡糖淀粉酶和α-淀粉酶、以及任选的蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物；并且
该发酵生物是酵母菌属酵母，其提供以下改进中的一种或多种，例如全部：
提升乙醇产量；
降低乙醛产生；
增加温度耐受性；以及
减少葡萄糖产生。
在一个实施例中，该方法提供以下改进中的一个或多个，例如全部：
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，比ETHANOL REDTM(ER)提升乙醇产量大于0.5％，例如大于1.0％、大于2.0％、大于2.5％，例如约2.9％、例如在0.5％和5％之间、例如在1％-3％之间；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与ETHANOL REDTM相比，降低乙醛产生大于10％，优选大于20％，更优选大于30％，甚至更优选大于40％，尤其大于45％，例如在5％-60％之间，例如30％-50％；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与ETHANOL REDTM相比，增加温度耐受性；以及
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与ETHANOL REDTM相比，减少甘油产生大于3％，优选大于4％，更优选大于5％、，甚至更优选大于6％，尤其大于7％，例如在2％-15％之间，例如5％-10％。
在一个实施例中，是从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括：
(i)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：葡糖淀粉酶和α-淀粉酶、以及任选地蛋白酶；以及
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酿酒酵母菌株MBG5038的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酿酒酵母菌株MBG5012的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
在一个实施例中，从含淀粉材料生产乙醇的方法包括：
(a)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵；
其中
在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：
i)源自瓣环栓菌、密粘褶菌、篱边粘褶菌、或血红密孔菌的葡糖淀粉酶；
ii)源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶、或其变体；
iii)源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物；
iv)任选地来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体，和/或来自强烈火球菌的蛋白酶；并且
其中
该发酵生物是酵母菌属酵母菌株，其提供以下改进中的一种或多种，例如全部：
在相同的发酵条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，乙醇产量提升；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，降低的乙醛产生；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加的温度耐受性；
在相同的方法条件(例如本文所述的条件)下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油产生。
在一个实施例中，从含淀粉材料生产乙醇的方法包括：
(a)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵；
其中
在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：
i)SEQ ID NO:17中披露的源自密粘褶菌的葡糖淀粉酶，其具有以下取代：S95P+A121P；
ii)本文的SEQ ID NO:16所示的、源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶、或其变体，其具有以下取代：G128D+D143N；
iii)源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物；
iv)任选地来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体；以及
其中
该发酵生物是酵母菌属酵母菌株，其在相同的发酵条件下与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，提供乙醇产量提升(例如，在本文所述的条件下，与ETHANOL相比，提供至少1.0％、至少2.0％、至少2.5％、例如在0.5％-5％之间、例如在1％-3％之间的乙醇产量提升)。
在一个实施例中，从含淀粉材料生产乙醇的方法包括：
(a)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵；
其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：
i)SEQ ID NO:18所示的源自血红密孔菌的葡糖淀粉酶；
ii)本文的SEQ ID NO:16所示的、源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶、或其变体，其具有以下取代：G128D+D143N；
iii)源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物；
iv)任选地来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体；并且
其中该发酵生物是酵母菌属酵母菌株，其在相同的发酵条件下与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，提供乙醇产量提升(例如，在相同的条件下，与ETHANOL相比，提供至少0.5％、至少1.0％、至少2.0％、至少2.5％、例如在0.5％-5％之间、例如在1％-3％之间的乙醇产量提升)。
在一个实施例中，从含淀粉材料生产乙醇的方法包括：
(a)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵；
其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：
i)SEQ ID NO:15所示的源自篱边粘褶菌的葡糖淀粉酶；
ii)本文的SEQ ID NO:16所示的、源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶、或其变体，其具有以下取代：G128D+D143N；
iii)源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物；
iv)任选地来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体；
其中该发酵生物是酵母菌属酵母菌株，其在相同的发酵条件下与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，提供乙醇产量提升(例如，在实例18中定义的条件下，与ETHANOL相比，提供至少0.5％、至少1.0％、至少2.0％、至少2.5％、例如在0.5％-5％之间、例如在1％-3％之间的乙醇产量提升)。
在一个实施例中，从含淀粉材料生产乙醇的方法包括：
(a)在低于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵；
其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：
i)SEQ ID NO:20所示的源自瓣环栓菌的葡糖淀粉酶；
ii)本文的SEQ ID NO:16所示的、源自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的α-淀粉酶、或其变体，其具有以下取代：G128D+D143N；
iii)源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物；
iv)任选地来自金黄色嗜热子囊菌的蛋白酶、或其变体；并且
其中该发酵生物是酵母菌属酵母菌株，其在相同的发酵条件下与ETHANOL REDTM相比，提供乙醇产量提升(例如，在实例18中定义的条件下，与ETHANOL REDTM相比，提供至少0.5％、至少1.0％、至少2.0％、至少2.5％、例如在0.5％-5％之间、例如在1％-3％之间的乙醇产量提升)。
表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的酿酒酵母菌株MBG5038或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物的用途。
表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的酿酒酵母菌株MBG5012或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物的用途。
酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物，或酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酵母菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物可以用于提高发酵中的乙醇产量。
在一个实施例中，已经使待发酵的液化醪液经受α-淀粉酶和从0.5-50微克蛋白酶/克DS，如1-5微克蛋白酶/克DS，如约1.5或3微克蛋白酶/克DS。
该蛋白酶可以是细菌蛋白酶。该蛋白酶可以源自细菌火球菌属菌株，如强烈火球菌菌株(pfu蛋白酶)，如或本文的SEQ ID NO:13。该蛋白酶可以是本文的SEQ ID NO:13中所披露的蛋白酶或是与本文的SEQ ID NO:13具有至少80％同一性，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的蛋白酶。
用于液化的α-淀粉酶可以是细菌来源的，如来自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如本文的SEQ ID NO:1所示的α-淀粉酶。在一个实施例中，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体选自具有以下突变的组：I181*+G182*以及任选的取代N193F，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
在一个实施例中，已经使待发酵的液化醪液经受α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和从0.5-50微克蛋白酶/克DS，如1-5微克蛋白酶/克DS，如约1.5或3微克蛋白酶/克DS。该葡糖淀粉酶可以源自青霉属菌株，尤其是本文的SEQ ID NO:9或14中所披露的草酸青霉菌菌株。
该葡糖淀粉酶可以是具有K79V取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体(使用SEQ IDNO:14所示的成熟序列进行编号)。
在一个实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
P11F+T65A+Q327F；以及
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
酵母
在一个实施例中，是表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的、在布达佩斯条约下保藏于美国农业研究服务专利菌种保藏中心(NRRL)、具有保藏登录号NRRL Y67549的酿酒酵母菌株(酿酒酵母菌株MBG5038)或其衍生物。
在一个实施例中，是表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的、在布达佩斯条约下保藏于美国农业研究服务专利菌种保藏中心(NRRL)、具有保藏登录号NRRL Y67700的酿酒酵母菌株(酿酒酵母菌株MBG5012)或其衍生物。
世界燃料乙醇的大部分是在底物(如玉米醪)中通过工业规模发酵基于淀粉的糖来生产。在工业规模发酵期间，酵母遇到各种各样的生理挑战，这些挑战包括可变浓度的糖，高浓度的酵母代谢产物如乙醇、甘油、有机酸，渗透胁迫，连同来自污染微生物(如野生酵母和细菌)的潜在竞争。其结果是，许多酵母菌属菌株，特别是天然存在的那些不适合用于工业发酵。酵母菌属的广泛使用的可商购的工业菌株(即，用于工业规模发酵)是例如在产品ETHANOL REDTM中所使用的酿酒酵母菌株。该菌株非常适合于工业乙醇生产，然而需要改进的酿酒酵母的菌株。
申请人已经生产了菌株NMI V14/004037(参见，WO 2015/143324和WO 2015/143317)，其是比天然存在的酿酒酵母菌株和用于燃料乙醇行业的酿酒酵母菌株(例如ETHANOL REDTM)从玉米醪产生更高水平的乙醇的酿酒酵母菌株。具体地，在玉米醪发酵期间，菌株NMI V14/004037的来自葡萄糖的乙醇产量高于其他工业菌株(例如ETHANOLREDTM)。这意味着在玉米醪发酵期间，菌株NMI V14/004037可以比ETHANOL REDTM产生更多的乙醇/克葡萄糖。
申请人进一步生产了菌株号V15/004035、V15/004036和V15/004037(参见，WO2016/153924)，它们在工业规模发酵中遇到的条件(例如在玉米醪发酵期间遇到的条件)下，能够从葡萄糖获得与菌株V14/004037相同或相似的乙醇产量，并且这些乙醇产量比用于乙醇工业的可商购工业酿酒酵母菌株和天然存在的酿酒酵母菌株高。
申请人进一步生产了如本文所述的菌株号NRRL Y67549和NRRL Y67700，它们表现出如实例中所述的改进的性质。
申请人进一步生产了如本文所述的菌株号NRRL Y67549和NRRL Y67700的衍生物，它们表达葡糖淀粉酶并表现出如实例中所述的改进的性质。
典型地，从玉米醪发酵产生的乙醇是从与玉米醪同源的糖发酵产生的。与玉米醪同源的糖是源自玉米的糖，而不是从外源性来源添加的糖。
在发酵的最初20小时内迅速产生乙醇的能力、在发酵50小时后乙醇的产量以及在发酵50小时内利用玉米醪底物中存在的大量葡萄糖的能力都是可以将本文的菌株与天然存在的菌株和可商购的酿酒酵母工业菌株相区分的特征。
此外，酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)、和酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)能够在半胱氨酸是唯一氮源的介质中生长。因此，酿酒酵母菌株MBG5038和MBG 5012利用作为唯一氮源的半胱氨酸的能力是将该菌株与以下菌株相区分的另一个特征：
(a)不利用作为唯一氮源的半胱氨酸的酵母菌属污染菌株；以及
(b)在乙醇工业中使用的不具有酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的乙醇生产能力的其他菌株；和/或不利用作为唯一氮源的半胱氨酸。
由于其利用作为唯一氮源的半胱氨酸的能力，酿酒酵母菌株MBG5038和MBG5012易于与目前乙醇工业中使用的酵母菌属菌株(如Ethanol)区分开来。
该菌株也可以是酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物。如本文所用，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的“衍生物”是衍生自所述菌株的菌株，如通过诱变、重组DNA技术、交配、细胞融合、或酵母菌株之间的胞导。衍生自酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的菌株可以是直接后代(即，在酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012和另一种菌株或其自身之间交配的产物)、或远缘后代(其由酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012和另一种菌株或其自身之间进行初始交配，随后大量后续交配而产生)。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物是在允许第一酵母菌株和酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012之间的DNA组合的条件下，通过将第一酵母菌株与酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012一起培养而产生的杂合菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的重组衍生物已通过遗传修饰酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012(或其另一衍生物)以表达本文所述的α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶来制备。
在一个实施例中，是产生酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)、或酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)的重组衍生物的方法，该方法包括：
(a)用一种或多种编码葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的表达载体转化酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)；以及
(b)分离转化的菌株。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物可以通过以下来制备：
(a)在允许第一酵母菌株和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，将第一酵母菌株与第二酵母菌株一起培养，其中该第二酵母菌株是酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)；和
(b)分离杂合菌株；以及
(c)任选地使用步骤(b)中分离的杂合菌株作为第一酵母菌株和/或酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物来重复步骤(a)和(b)。
在一个实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表现出酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的一个或多个定义特征。分别使用酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012来产生表现出酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的一个或多个定义特征的酵母菌属的衍生物。在这方面，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012构成了制备分别具有酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的定义特征的其他菌株的基础。例如，表现出酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的一个或多个定义特征的酵母菌属菌株可以分别源自酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012，使用如下方法，如：经典交配、细胞融合、或酵母菌株之间的胞导、诱变或重组DNA技术。
在一个实施例中，表现出酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的一个或多个定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物可以通过以下产生：
(a)在允许第一酵母菌株和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，将第一酵母菌株与第二酵母菌株一起培养，其中该第二酵母菌株是酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)；
(b)筛选或选择酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物，如筛选或选择与第一菌株相比在玉米醪中具有增加的乙醇生产的衍生物；
(c)任选地用筛选的或选择的菌株作为第一酵母菌株和/或第二酵母菌株重复步骤(a)和(b)，直到获得表现出酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的一个或多个定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物。
如果可以使用方法(如经典交配、细胞融合或胞导)将第一酵母菌株的DNA与第二酵母菌株组合，则该第一酵母菌株可以是酵母的任何菌株。典型地，该第一酵母菌株是酵母菌属菌株。更典型地，该第一酵母菌株是酿酒酵母菌株。酿酒酵母是如由Kurtzman(2003)FEMS Yeast Research[FEMS酵母研究]第4卷第233-245页所定义的。第一酵母菌株可以具有所希望的性质，这些性质旨在与酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的定义特征组合。该第一酵母菌株可以是例如任何酿酒酵母菌株，像例如ETHANOL还应当理解的是，第一酵母菌株可以是酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)。
在允许酵母菌株之间DNA组合的条件下，培养该第一和第二酵母菌株。如本文所用，在酵母菌株之间的“DNA的组合”是指酵母菌株的所有或部分基因组的组合。酵母菌株之间DNA组合可以通过适用于将至少两种酵母细胞的DNA组合的任何方法来进行，并且可以包括例如，交配方法，该交配方法包括酵母菌株的孢子形成以产生单倍体细胞，并且随后将兼容单倍体细胞进行杂交；胞导；或细胞融合如原生质体融合。
在一个实施例中，在允许第一酵母菌株和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，培养第一酵母菌株与第二酵母，该培养包括：
(i)使该第一酵母菌株和该第二酵母菌株形成孢子；
(ii)使第一酵母菌株产生的孢子萌发并将其与第二酵母菌株产生的孢子杂交。
在一个实施例中，生产表现出酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的一个或多个定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物的方法，该方法包括：
(a)提供：(i)第一酵母菌株；和(ii)第二酵母菌株，其中第二酵母菌株是酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)；
(b)使该第一酵母菌株和该第二酵母菌株形成孢子；
(c)使第一酵母菌株的孢子萌发并将其与第二酵母菌株的萌发的孢子杂交；
(d)筛选或选择酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物，如筛选或选择与第一菌株相比在玉米醪中在20hr发酵中具有增加的乙醇生产、和/或与第一菌株相比在玉米醪发酵期间具有较高来自葡萄糖的乙醇产量的衍生物；
(e)任选地用筛选或选择的菌株作为第一和/或第二酵母菌株来重复步骤(b)至(d)。
用于将酵母菌株并且具体地是酵母菌属菌株形成孢子、萌发和杂交的方法是本领域中已知的，并且描述于例如，Ausubel,F.M.等人,(1997)Current Protocols inMolecular Biology[当代分子生物学实验手册],第2卷,第13.2.1至13.2.5页(JohnWilley&Sons Inc[约翰·威利父子公司])；第7章，“Sporulation and Hybridisation ofyeast[酵母的孢子形成和杂交]”由R.R.Fowell,在“The Yeasts[酵母]”第1卷,A.H.Rose和J.S.Harrison(编辑),1969,Academic Press[学术出版社]。
在一个实施例中，该酵母菌株可以在允许细胞融合的条件下进行培养。使用细胞融合技术用于产生种内或种间杂合体的方法描述于例如，Spencer等人(1990),YeastTechnology[酵母技术],Spencer JFT和Spencer DM(编辑),Springer Verlag[施普林格出版公司],纽约。
在另一个实施例中，该酵母菌株可以在允许胞导的条件下进行培养。用于胞导的方法描述于例如，Inge-Vechymov等人(1986)Genetika[遗传学]22:2625-2636；Johnston(1990),Yeast technology[酵母技术],Spencer JFT和Spencer DM(编辑),SpringerVerlag[施普林格出版公司],纽约。
在一个实施例中，筛选或选择酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物包括筛选或选择与第一菌株相比在玉米醪的最初20小时的发酵中具有增加的乙醇生产的衍生物、和/或筛选或选择与第一菌株相比在玉米醪中具有较高来自葡萄糖的乙醇产量的杂合体。
如本文所用，“来自葡萄糖的乙醇产量”是如果将底物中的所有葡萄糖用于发酵，则将从葡萄糖获得的乙醇的产量。在一个实施例中，来自葡萄糖的乙醇产量计算如下：
(G x 0.51)+E
其中
G＝含葡萄糖的底物发酵后剩余的葡萄糖的重量/体积％；以及
E＝含葡萄糖的底物发酵后存在的乙醇的重量/体积％。
可以通过筛选以下一种或多种特征来筛选或选择衍生物的乙醇产量：
(a)在相同条件下，在玉米醪发酵中，生产乙酸盐的％w/v处于从高于由菌株Ethanol所产生的量至由酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012所产生的量的范围内；
(b)在相同条件下，在玉米醪发酵中，生产％w/v甘油与％w/v乙酸盐的比处于从小于由Ethanol所产生的％w/v甘油与％w/v乙酸盐的比至由酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012所产生的％w/v甘油与％w/v乙酸盐的比的范围内；
(c)在相同条件下，在玉米醪发酵中，生产％w/v乙醇与％w/v乙酸盐的比处于从小于由Ethanol所产生的％w/v乙醇与％w/v乙酸盐的比至由酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012所产生的％w/v乙醇与％w/v乙酸盐的比的范围内。
用于确定由菌株产生乙醇、甘油和乙酸盐的量的方法在本领域中是已知的。例如，用于确定在玉米醪发酵期间由菌株产生的乙醇、甘油和乙酸盐的量的测试方法描述于例如WO 2011/035392中。一旦所产生的乙醇、甘油和乙酸盐的量是已知的，那么乙醇/乙酸盐和甘油/乙酸盐的比率可以很容易确定。因此，使用已知的方法，可以很容易地针对乙醇、乙酸盐和/或甘油的生产水平来筛选菌株。
在一个实施例中，表现出酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的一个或多个定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物可以是酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的突变体。用于生产酵母菌属酵母突变体、并且尤其是酿酒酵母突变体的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如Lawrence C.W.(1991)Methods in Enzymology[酶学方法],194:273-281中。
在另一个实施例中，表现出酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的一个或多个定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物可以是酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的重组衍生物。酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的重组衍生物是通过使用重组DNA技术将核酸分别引入酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012而产生的菌株。用于将核酸引入酵母菌属酵母细胞、并且具体地是酵母菌属菌株的方法是本领域中已知的并且描述于例如Ausubel,F.M.等人(1997),Current Protocols in Molecular Biology[当代分子生物学实验手册],第2卷,第13.7.1至13.7.7页中，其由John Wiley&Sons Inc[约翰·威利父子公司]出版。
还描述了使用本文描述的菌株用于生产乙醇的方法。在一种形式中，将酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)与包含可发酵糖的底物一起在允许发酵的条件下孵育。该可发酵糖可以是葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖和蔗糖中的一种或多种。典型地，该可发酵糖是葡萄糖。当酿酒酵母菌株MBG5038和MBG5012非常适合于在玉米醪中的发酵时，可以设想该菌株还可以适用于其他发酵方法。因此，底物中可发酵糖的来源可以是例如，水解的淀粉、水解的纤维素、糖蜜、蔗汁、葡萄汁、果汁、葡萄糖、麦芽糖糊精、原糖汁、半乳糖、蔗糖、或任何其他形式的可发酵糖。在一种形式中，底物中的可发酵糖的来源是水解的淀粉。典型地，该淀粉获得自底物如玉米醪。在制备底物中，典型地研磨谷物，并且在导致淀粉水解和释放可发酵糖(如葡萄糖)的条件下，将水和一种或多种水解酶混合。用于水解淀粉的典型的酶包括α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、支链淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、或其混合物。适用于水解的酶可以从例如诺维信或杰能科公司获得。在一种形式中，以玉米醪形式提供底物。玉米醪通常通过以下生产：(a)将玉米研磨成粉；(b)将粉与水混合；以及·(c)水解玉米粉中的淀粉。用于制备玉米醪的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如Thomas,K.C.等人,(2001)Journal of Applied Microbiology[应用微生物学杂志],第90卷,第819-828页。用于制备其他基于淀粉的底物(包括高粱、淀粉流及其组合)的方法在本领域中也是已知的，并且描述于例如Kwiatkowski J.R.等人,(2003)Industrial Crops and Products[工业作物和产物]23:288-296以及Bothast R.J.和Schlicher M.A.(2005)Applied MicrobialBiotechnology[应用微生物技术]67:19-25。
在允许可发酵糖发酵的温度下进行发酵。典型地，进行发酵的温度是从25℃-34℃。
该发酵产生在溶液中包含乙醇和剩余糖的酒精醪液和包含残余固体(包括酵母)的颗粒部分。使用本领域中已知的方法(如蒸馏或过滤)将乙醇从醪液中分离。
用于发酵和蒸馏的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如Kwiatkowski J.R.等人,(2003)Industrial Crops and Products[工业作物和产物]23:288-296以及BothastR.J.和Schlicher M.A.(2005)Applied Microbial Biotechnology[应用微生物技术]67:19-25。
还考虑了生产酒糟的方法。酒糟可以从发酵中所产生的残余固体使用本领域中已知的并且描述于例如美国专利7,572,353中的方法来生产。因为酿酒酵母菌株MBG5038和MBG5012减少了发酵后残余的剩余糖的水平，因此从使用酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的发酵产生的酒糟具有降低的葡萄糖含量，并且因此更稳定且不易发生炭化、焦糖化或被不想要的微生物污染。
此外，酒糟中的较低甘油含量是一种方法优势，因为需要较少时间干燥酒糟。此外，酒糟中较少甘油导致改进的可流动性，并且进一步导致具有较高营养含量(例如，较高蛋白)的酒糟。
另一个方面提供了干燥或压缩的酵母，其包含酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)，通常具有酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的定义特征。
另一个方面提供了包含酿酒酵母菌株MBG5038(或酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物)或酿酒酵母菌株MBG5012(或酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物)的组合物。该组合物可以是例如膏状酵母、压缩的酵母、湿酵母、干酵母、半干酵母、粉碎的酵母、稳定液体酵母或冷冻酵母。制备此类酵母组合物的方法是本领域已知的。
在一些实施例中，酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012的衍生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。已经产生了表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的衍生物，以通过降低酶的成本来提高乙醇产量并改善工艺经济性，因为水解淀粉所需的部分或全部必需酶是由酵母生物产生的。
因此，本发明的一方面涉及包含一种或多种编码葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的表达载体的酵母菌株，其中该酵母衍生自亲本酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012；并且其中该葡糖淀粉酶选自可得自粘褶菌属、密孔菌属、栓菌属的葡糖淀粉酶。
因此，本发明的另一方面涉及包含一种或多种编码葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的表达载体的酵母菌株，其中该酵母衍生自亲本酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012；并且其中该α-淀粉酶选自微小根毛霉或土曲霉α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自密粘褶菌、篱边粘褶菌、或冷杉粘褶菌(Gloeophyllum abietinum)葡糖淀粉酶。
在另一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:17的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是SEQ ID NO:17所示的具有以下取代中的一个的密粘褶菌葡糖淀粉酶：V59A；S95P；A121P；T119W；S95P+A121P；V59A+S95P；S95P+T119W；V59A+S95P+A121P；或S95P+T119W+A121P，尤其是S95P+A121P；并且其中该葡糖淀粉酶与SEQ IDNO:17的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个具体实施例中，该葡糖淀粉酶选自瓣环栓菌葡糖淀粉酶。更具体地，该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:20的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:20的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个具体实施例中，该葡糖淀粉酶选自血红密孔菌葡糖淀粉酶。更具体地，该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:18的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在另一个具体实施例中，该α-淀粉酶是如SEQ ID NO:16所示的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，优选具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C，尤其G128D+D143N(使用SEQ ID NO:16进行编号)，并且其中该α-淀粉酶与SEQ ID NO:16的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
在一个实施例中，该α-淀粉酶是土曲霉α-淀粉酶。更具体地，该α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含WO 2017/087330(其内容通过引用并入)的SEQ ID NO:6的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与WO 2017/087330的SEQ IDNO:6的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
组合物
本方面涉及一种配制的酵母菌属酵母组合物，该酵母菌属酵母组合物包含本文所述的酵母菌株和天然存在的和/或非天然存在的组分。
如上所述，本文所述的酵母菌属酵母菌株可以是任何活的形式，包括粉碎的、干燥的，包括活性干燥和速溶的、压缩的、膏状(液体)形式等。在一个实施例中，酿酒酵母菌株是干酵母，例如活性干酵母或速溶酵母。在一个实施例中，该酿酒酵母菌株是粉碎的酵母。在一个实施例中，该酿酒酵母菌株是压缩的酵母。在一个实施例中，该酿酒酵母菌株是膏状酵母。
在一个实施例中是组合物，该组合物包含本文所述的酵母菌属酵母(特别是酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012)和选自由以下组成的组的一种或多种组分：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、以及抗氧化剂和其他加工助剂。
表面活性剂
本文所述的组合物可包含本文所述的酵母菌属酵母(特别是酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012)和任何适合的表面活性剂。在一个实施例中，该一种或多种表面活性剂是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、和/或非离子表面活性剂。
乳化剂
本文所述的组合物可包含本文所述的酵母菌属酵母(特别是酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012)和任何适合的乳化剂。在一个实施例中，该乳化剂是山梨聚糖的脂肪酸酯。在一个实施例中，该乳化剂选自下组：山梨聚糖单硬脂酸酯(SMS)、单双甘酯的柠檬酸酯、聚甘油酯、丙二醇的脂肪酸酯。
在一个实施例中，该组合物包含本文所述的酵母菌属酵母(特别是酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012)和Olindronal SMS、Olindronal SK、或Olindronal SPL，包括欧洲专利号1,724,336(将其通过引用特此并入)中涉及的组合物。针对活性干酵母，这些产品可以从奥地利的布塞蒂公司(Bussetti)商购获得。
树胶
本文所述的组合物可包含本文所述的酵母菌属酵母(特别是酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012)和任何适合的树胶。在一个实施例中，该树胶选自下组：槐树豆胶、瓜尔胶、黄芪胶、阿拉伯胶、黄原胶和阿拉伯树胶，具体地针对膏状、压缩和干酵母。
溶胀剂
本文所述的组合物可包含本文所述的酵母菌属酵母(特别是酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012)和任何适合的溶胀剂。在一个实施例中，该溶胀剂是甲基纤维素或羧甲基纤维素。
抗氧化剂
本文所述的组合物可包含本文所述的酵母菌属酵母(特别是酿酒酵母菌株MBG5038或MBG5012)和任何适合的抗氧化剂。在一个实施例中，该抗氧化剂是丁羟茴醚(BHA)和/或丁羟甲苯(BHT)、或抗坏血酸(维生素C)，具体地针对活性干酵母。
可在以下编号的段落中进一步描述本发明：
段落1.一种用于从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用α-淀粉酶液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落2.如段落1所述的方法，其中该发酵生物具有以下性质和定义特征中的至少一种或多种，例如全部：
在相同的方法条件下，例如本文所述的方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加了乙醇产量；和/或
在相同的方法条件下，例如本文所述的方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油产生。
段落3.如段落1或2所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，该发酵生物比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)提供大于0.5％的乙醇产量提升，例如大于1.0％、大于2.0％、大于2.5％、例如约2.9％、例如在0.5％和5％之间、例如在1％-3％之间。
段落4.如段落1-3中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物降低乙醛产生大于10％，例如大于20％、大于30％、大于40％、大于45％、例如5％-60％、例如30％-50％。
段落5.如段落1-4中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物增加了温度耐受性。
段落6.如段落1-5中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物减少甘油产生大于3％，例如大于4％、大于5％、大于6％、大于7％、例如2％-15％、例如5％-10％。
段落7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中该发酵生物：
(a)在玉米醪发酵中的相同条件下，例如本文所述的条件下，在发酵的最初20小时内，产生比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)更高的乙醇滴度；
(b)在玉米醪发酵中的相同条件下，例如本文所述的条件下，在发酵50小时后，剩余比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)更少的残余葡萄糖；
(c)在玉米醪发酵中的相同条件下，例如本文所述的条件下，在发酵50小时后，具有比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)更高的乙醇产量。
段落8.如段落1-7中任一项所述的方法，其中在糖化或发酵或SSF中添加蛋白酶。
段落9.如段落1-8中任一项所述的方法，在液化步骤i)之前进一步包括以下步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度，优选通过干磨进行；
y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
段落10.如段落1-9中任一项所述的方法，其中至少50％，例如至少70％、至少80％、至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。
段落11.如段落1-10中任一项所述的方法，其中液化中的pH在4-7之间，例如pH4.5-6,5、例如pH 5.0-6.5、例如pH 5.0-6.0、例如pH 5.2-6.2、例如约5.2、例如约5.4、例如约5.6、例如约5.8。
段落12.如段落1-11中任一项所述的方法，其中液化中的温度范围是70℃-100℃，例如75℃-95℃、75℃-90℃、80℃-90℃、或82℃-88℃，例如约85℃。
段落13.如段落1-12中任一项所述的方法，其中在步骤i)中的液化之前进行喷射蒸煮步骤。
段落14.如段落13所述的方法，其中该喷射蒸煮在110℃-145℃、例如120℃-140℃、例如125℃-135℃、或约130℃的温度下进行持续约1-15分钟，例如持续约3-10分钟，或约5分钟。
段落15.如段落1-14中任一项所述的方法，其中糖化和发酵是顺序进行或同时(SSF)进行。
段落16.如段落1-15中任一项所述的方法，其中糖化在从20℃-75℃、例如从40℃-70℃、例如约60℃的温度下，并且在4和5之间的pH下进行。
段落17.如段落1-16中任一项所述的方法，其中发酵或同时糖化发酵(SSF)在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃、或约32℃的温度下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
段落18.如段落1-17中任一项所述的方法，其中发酵产物是在发酵之后，例如通过蒸馏回收的。
段落19.如段落1-18中任一项所述的方法，其中发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
段落20.如段落1-19中任一项所述的方法，其中该含淀粉起始材料是全谷物。
段落21.如段落1-20中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料源自玉米、小麦、大麦、黑麦、西非高粱、西米、木薯、树薯粉(manioc)、木薯淀粉、高粱、燕麦、水稻或马铃薯。
段落22.如段落1-21中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中使用或添加的α-淀粉酶是细菌来源的。
段落23.如段落1-22中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1所示的α-淀粉酶。
段落24.如段落23所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是在C-末端截短的，优选为485-495个氨基酸长，如约491个氨基酸长。
段落25.如段落23或24中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有在位置I181+G182处的双缺失，并且任选地具有取代N193F、或R179+G180缺失(使用SEQID NO:1进行编号)。
段落26.如段落23-25中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242具有取代，例如S242Q取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
段落27.如段落23-26中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188具有取代，例如E188P取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
段落28.如段落1-27中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶在pH4.5、85℃、0.12mMCaCl2下具有至少10的T1/2(min)，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70。
段落29.如段落1-28中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加的α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，这些变体除I181*+G182*以及任选的取代N193F之外还具有以下取代或取代的组合中的一个：
V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+S242Q；
E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
K220P+N224L+S242Q+Q254S；
M284V；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V。
段落30.如段落1-29中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加的α-淀粉酶选自包含以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：I181*+G182*以及任选的取代N193F，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)。
段落31.如段落1-30中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在和/或添加葡糖淀粉酶。
段落32.如段落31所述的方法，其中在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属的菌株。
段落33.如段落1-32中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自埃默森篮状菌，如本文的SEQ ID NO:19所示的葡糖淀粉酶。
段落34.如段落1-33中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:19的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:19的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落35.如段落1-34中任一项所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，例如本文的SEQ ID NO:15所示的葡糖淀粉酶。
段落36.如段落1-35中任一项所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:15的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:15的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落37.如段落1-36中任一项所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，例如本文的SEQ ID NO:17所示的葡糖淀粉酶。
段落38.如段落1-37中任一项所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:17的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落39.如段落1-38中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是在糖化和/或发酵中与α-淀粉酶组合存在的和/或添加的。
段落40.如段落39所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。
段落41.如段落40或41所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶源自根毛霉属菌株，优选菌株微小根毛霉，例如WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3所示的α-淀粉酶，例如具有接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，特别是具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如本文的SEQ ID NO:16所示的α-淀粉酶杂合体。
段落42.如段落39-41中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
段落43.如段落39-42中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶是SEQ ID NO:16所示的具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；和G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:16进行编号)。
段落44.如段落39-43中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，优选如本文的SEQ ID NO:16披露的，例如其具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，例如G128D+D143N(使用SEQ ID NO:16进行编号)。
段落45.如段落39-44中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶变体与本文的SEQ IDNO:16的多肽的成熟部分具有至少75％同一性，优选至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％的同一性。
段落46.如段落1-42中任一项所述的方法，其中使用以下进行液化步骤i)：
α-淀粉酶；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
任选地葡糖淀粉酶。
段落47.如段落46所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过25％的热稳定性值。
段落48.如段落46-47所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％，例如超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，例如超过105％，例如超过110％，例如超过115％，例如超过120％的热稳定性。
段落49.如段落46-48中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20％与50％之间，例如在20％与40％之间，例如在20％与30％之间的热稳定性。
段落50.如段落46-49中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50％与115％之间，例如在50％与70％之间，例如在50％与60％之间，例如在100％与120％之间，例如在105％与115％之间的热稳定性。
段落51.如段落46-50中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，例如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。
段落52.如段落46-51中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10％与50％之间，例如在10％与30％之间，例如在10％与25％之间的热稳定性。
段落53.如段落46-52中任一项所述的方法，其中该蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
段落54.如段落46-53中任一项所述的方法，其中该蛋白酶在85℃下具有在60％-120％之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
段落55.如段落46-54中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是真菌来源的。
段落56.如段落46-55中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是源自嗜热子囊菌属菌株的金属蛋白酶的变体，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670。
段落57.如段落46-56中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:3，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；以及
D79L+S87P+D142L。
段落58.如段落46-57中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:3，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
D79L+S87P+A112P+D142L：
D79L+S87P+D142L；以及
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
段落59.如段落46-58中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体与WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:3具有至少75％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％同一性。
段落60.如段落46-59中任一项所述的方法，其中本文的SEQ ID NO:3所示的金黄色嗜热子囊菌蛋白酶的蛋白酶变体包含以下取代或取代的组合中的一个：
D79L S87P D142L；D79L S87P A112P D142L；D79L Y82F S87P A112P D142L；S38TD79L S87P A112P A126V D142L；D79L Y82F S87P A112P A126V D142L；A27K D79L S87PA112P A126V D142L；S49P D79L S87P A112P D142L；S50P D79L S87P A112P D142L；D79LS87P D104P A112P D142L；D79L Y82F S87G A112P D142L；S70V D79L Y82F S87G Y97WA112P D142L；D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L；S70V D79L Y82F S87G A112PD142L；D79L Y82F S87G D104P A112P D142L；D79L Y82F S87G A112P A126V D142L；Y82FS87G S70V D79L D104P A112P D142L；Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L；和A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L。
段落61.如段落46-60中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是细菌来源的。
段落62.如段落46-61中任一项所述的方法，其中该蛋白酶源自火球菌属菌株，优选强烈火球菌菌株。
段落63.如段落46-62中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是US 6,358,726中的SEQ ID NO:1、或本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶。
段落64.如段落46-63中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是与US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:13具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的蛋白酶。
段落65.如段落46-64中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加0.5-100微克强烈火球菌蛋白酶/克DS，例如1-50微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如1-10微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如1.5-5微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如约或大于1.5微克强烈火球菌蛋白酶/克DS。
段落66.如段落46-65中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加2-100微克强烈火球菌蛋白酶/克DS，例如2.5-50微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如2.5-10微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如2.5-5微克强烈火球菌蛋白酶克DS，尤其约3微克强烈火球菌蛋白酶/克DS。
段落67.如段落1-66中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)期间存在和/或添加葡糖淀粉酶。
段落68.如段落67所述的方法，其中在液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在85℃、pH 5.3下具有至少20％、例如至少30％、或至少35％的热稳定性。
段落69.如段落67或68所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在pH5.0的pH最佳值下具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％的相对活性。
段落70.如段落67-68中任一项所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性。
段落71.如段落67-70中任一项所述的方法，其中液化步骤i)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶源自青霉属菌株，尤其是如WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的或本文的SEQ ID NO:9或14的草酸青霉菌菌株。
段落72.如段落67-71中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2所示的成熟多肽或本文的SEQ ID NO:9或14具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
段落73.如段落67-72中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的、具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:14所示的成熟序列进行编号)的变体，例如WO 2013/053801中披露的变体。
段落74.如段落67-73中任一项所述的方法，其中该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
T65A；Q327F；E501V；Y504T；Y504*；T65A+Q327F；T65A+E501V；T65A+Y504T；T65A+Y504*；Q327F+E501V；Q327F+Y504T；Q327F+Y504*；E501V+Y504T；E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V；T65A+Q327F+Y504T；T65A+E501V+Y504T；Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+Y504*；T65A+E501V+Y504*；Q327F+E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504*；E501V+Y504T；T65A+K161S；T65A+Q405T；T65A+Q327W；T65A+Q327F；T65A+Q327Y；P11F+T65A+Q327F；R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；P11F+T65A+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+S105P+Q327W；T65A+S105P+Q327F；T65A+Q327W+S364P；T65A+Q327F+S364P；T65A+S103N+Q327F；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+K79A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K79G+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K79I+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K79L+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K79S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；S255N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；和P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
段落75.如段落67-74中任一项所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶是草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：P11F+T65A+Q327F；和P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用本文的SEQ ID NO:14进行编号)。
段落76.如段落67-75中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶变体与本文的SEQID NO:14的多肽的成熟部分具有至少75％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％同一性。
段落77.如段落1-76中任一项所述的方法，进一步地其中在液化和/或糖化期间存在支链淀粉酶。
段落78.如段落1-77中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落79.如段落1-78中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶(其包含在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的N193F取代(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号))液化该含淀粉材料；
ii)使用源自粘褶菌属菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落80.如段落1-79中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
任选地草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落81.如段落1-80所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)使用α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌的、包含在位置I181+G182处的双缺失和任选的N193F取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)并且在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)的α-淀粉酶，在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落82.如段落1-81所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
蛋白酶，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
任选地草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落83.如段落1-82所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：E129V+K177L+R179E；V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
和E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶，如来自粘褶菌属菌株(如篱边粘褶菌菌株)的葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落84.如段落1-83所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F，并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
任选地SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落85.如段落1-84所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F，并且进一步任选地具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)，
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落86.如段落1-85中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；
具有K79V取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶(使用本文的SEQ ID NO:14进行编号)；以及
任选地支链淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落87.如段落1-86所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；
ii)使用选自下组的葡糖淀粉酶进行糖化：源自曲霉属菌株的葡糖淀粉酶，优选地黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属的菌株；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落88.如段落1-87所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料；
α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌，其具有在位置I181+G182处的双缺失和任选的取代N193F，并且在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；
草酸青霉菌葡糖淀粉酶；以及
任选地支链淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落89.如段落1-88所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；以及
任选地支链淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落90.如段落1-89所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；以及
任选地支链淀粉酶；
ii)使用选自下组的葡糖淀粉酶进行糖化：源自曲霉属菌株的葡糖淀粉酶；或木霉属菌株；篮状菌属菌株；密孔菌属菌株；粘褶菌属菌株；以及黑层孔属菌株；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落91.如段落1-90中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，在5.0和6.5之间的pH下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
源自强烈火球菌的蛋白酶，优选本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落92.如段落1-91中任一项所述的方法，其中在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在纤维素分解酶组合物。
段落93.如段落1-92中任一项所述的方法，其中该发酵生物与酿酒酵母菌株MBG5038或具有酿酒酵母菌株MBG5038的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物具有大致相同的性质，因为它提供以下性质或定义特征中的一种或多种，例如全部：
在相同的方法条件下，例如如本文所述，与酿酒酵母菌株Ethanol (在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，乙醇产量增加；和/或
在相同的方法条件下，例如如本文所述，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油产生。
段落94.如段落1-93中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，该发酵生物比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)提供大于0.5％的乙醇产量提升，例如大于1.0％、大于2.0％、大于2.5％、约2.9％、例如在0.5％和5％之间、例如1％-3％。
段落95.如段落1-94中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物降低乙醛产生大于10％，例如大于20％、大于30％、大于40％、大于45％、例如5％-60％、例如30％-50％。
段落96.如段落1-95中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物增加了温度耐受性。
段落97.如段落1-96中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物减少甘油产生大于3％，例如大于4％、大于5％、大于6％、大于7％、例如2％-15％、例如5％-10％。
段落98.如段落1-97中任一项所述的方法，其中该发酵生物是一种非重组酵母菌属菌株，例如非重组酿酒酵母菌株。
段落99.如段落1-98中任一项所述的方法，其中该发酵生物能够利用作为唯一氮源的半胱氨酸。
段落100.一种用于从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物具有以下性质和定义特征中的一种或多种，例如全部：
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加了乙醇产量；
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，降低的乙醛产生；
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加的温度耐受性；
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油产生。
段落101.如段落100所述的方法，其中该发酵生物是酿酒酵母。
段落102.如段落100或101所述的方法，其中该发酵生物是非重组酿酒酵母。
段落103.如段落1-102中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，在5.0和6.5之间的pH下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
源自强烈火球菌的蛋白酶，优选地本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶，其以1-5微克蛋白酶/克DS(如约1.5或3微克蛋白酶/克DS)的剂量存在和/或添加；
任选地SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落104.如段落100-103中任一项所述的方法，其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落105.如段落104所述的方法，其中在糖化和/或发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在或添加蛋白酶。
段落106.在布达佩斯条约下保藏的且具有NRRL登录号NRRL Y67549的酵母菌属酵母菌株，或菌株NRRL Y67549的衍生物。
段落107.一种产生酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)的衍生物的方法，该方法包括：
a.在允许第一酵母菌株和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，将第一酵母菌株与第二酵母菌株一起培养，其中该第二酵母菌株是酿酒酵母菌株MBG5038或其衍生物；和
b.分离杂合菌株；以及
c.任选地使用步骤(b)中分离的杂合菌株作为第一酵母菌株和/或第二酵母菌株来重复步骤(a)和(b)。
段落108.一种产生表现出酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5038的衍生物的方法，该方法包括：
(a)提供：
(i)第一酵母菌株；以及
(ii)第二酵母菌株，其中第二酵母菌株是酿酒酵母菌株MBG5038或其衍生物；
(b)在允许第一和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，培养第一酵母菌株和第二酵母菌株；
(c)筛选或选择酿酒酵母MBG5038的衍生物。
段落109.如段落108所述的方法，其中步骤(c)包括筛选或选择表现出酿酒酵母菌株MBG5038的一个或多个定义特征的杂合菌株。
段落110.如段落108所述的方法，该方法包括另外的步骤：
(d)用从步骤(c)筛选或选择的菌株作为第一和/或第二菌株重复步骤(b)和(c)，直到获得表现出酿酒酵母菌株MBG5038的定义特征的衍生物。
段落111.如段落109或110所述的方法，其中该培养步骤(b)包括：
(i)使该第一酵母菌株和该第二酵母菌株形成孢子；
(ii)将该第一酵母菌株产生的萌发的孢子与该第二酵母菌株产生的萌发的孢子进行杂交。
段落112.一种通过如段落107至111中任一项所述的方法产生的酵母菌属菌株。
段落113.一种具有酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67549下保藏)的定义特征的酵母菌属菌株。
段落114.一种生产乙醇的方法，该方法包括在允许可发酵糖发酵生成乙醇的条件下将如段落106、112或113中任一项所述的菌株与包含可发酵糖的底物一起孵育。
段落115.如段落106、112或113中任一项所述的菌株在乙醇生产中的用途。
段落116.一种生产酒糟的方法，该方法包括：
(a)在允许可发酵糖发酵生成乙醇和酒糟的条件下，将如段落106、112或113中任一项所述的酵母菌属菌株与包含可发酵糖的底物一起孵育；
(b)分离该酒糟。
段落117.一种通过如段落116所述的方法产生的酒糟。
段落118.如段落106、112或113所述的菌株在酒糟生产中的用途。
段落119.如段落106、112或113所述的菌株在酵母菌属菌株生产中的用途，该酵母菌属菌株具有酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)的定义特征。
段落120.酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)在产生与酿酒酵母菌株MBG5038具有大致相同性质的酵母菌属菌株或表现出酿酒酵母菌株MBG5038的一个或多个定义特征的酵母菌属菌株中的用途。
段落121.酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5038或其衍生物具有大致相同性质的菌株在如段落1-120中任一项所述的方法中的用途。
段落122.一种组合物，该组合物包含如权利要求106、112或113中任一项所述的酵母菌属酵母以及一种或多种天然存在和/或非天然存在的组分。
段落123.如权利要求122所述的组合物，其中这些组分选自由以下组成的组：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂和抗氧化剂。
段落124.如段落122或123所述的组合物，其中该酵母菌属酵母是酿酒酵母菌株MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)。
段落125.如段落122-124中任一项所述的组合物，其中该酵母菌属酵母是处于活力形式，具体地处于干燥、膏状或压缩形式。
段落126.一种从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括：
(a)糖化该含淀粉材料；以及
(b)使用发酵生物进行发酵；
其中
糖化和/或发酵在至少葡糖淀粉酶和任选地α-淀粉酶的存在下进行；
该发酵生物是酿酒酵母；
并且其中由该发酵生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
段落127.如段落126所述的方法，其中该含淀粉材料是经糊化的或未经糊化的淀粉。
段落128.如段落127所述的方法，其中液化步骤在糖化步骤之前，并且其中液化步骤在至少细菌α-淀粉酶(例如来自芽孢杆菌属物种，尤其来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶)的存在下进行。
段落129.如段落126-128中任一项所述的方法，其中该酿酒酵母是MBG5038(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏)或者与MBG5038或具有菌株MBG5038的定义特征的MBG5038的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落130.如段落126-129所述的方法，其中该发酵生物是表达葡糖淀粉酶的MBG5038的重组衍生物。
段落131.如段落126-130所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是粘褶菌属葡糖淀粉酶，优选密粘褶菌、篱边粘褶菌、或冷杉粘褶菌葡糖淀粉酶。
段落132.如段落126-131所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:17的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落133.如段落131或132所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是SEQ ID NO:17所示的具有以下取代之一的密粘褶菌葡糖淀粉酶：V59A；S95P；A121P；T119W；S95P+A121P；V59A+S95P；S95P+T119W；V59A+S95P+A121P；或S95P+T119W+A121P，尤其是S95P+A121P。
段落134.如段落126-130中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是由该发酵生物表达的，并且是栓菌属葡糖淀粉酶，优选是瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
段落135.如段落134所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:20的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:20的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落136.如段落126-130中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是由该发酵生物表达的，并且是密孔菌属葡糖淀粉酶，特别是血红密孔菌葡糖淀粉酶。
段落137.如段落136所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:18的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落138.如段落126-137中任一项所述的方法，其中该发酵生物是表达α-淀粉酶的MBG5038的重组衍生物。
段落139.如段落126-138所述的方法，其中该α-淀粉酶由该发酵生物表达并且源自微小根毛霉或土曲霉。
段落140.如段落139所述的方法，其中该α-淀粉酶是如SEQ ID NO:16所示的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，优选是具有以下取代或取代组合中的至少一个的α-淀粉酶：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C，尤其G128D+D143N，并且其中该α-淀粉酶与SEQ ID NO:16的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落141.如段落139所述的方法，其中该α-淀粉酶是选自由以下组成的组的土曲霉α-淀粉酶：
(i)包含WO 2017/087330的SEQ ID NO:6的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与WO 2017/087330的SEQ IDNO:6的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落142.一种酿酒酵母菌株，其中该菌株是MBG5038的衍生物，其包含一种或多种编码葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的表达载体。
段落143.如段落142所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶选自可得自粘褶菌属、密孔菌属、或栓菌属的葡糖淀粉酶。
段落144.如段落143所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶选自密粘褶菌、篱边粘褶菌、或冷杉粘褶菌葡糖淀粉酶。
段落145.如段落144所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:17的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落146.如段落143-145中任一项所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶是SEQ IDNO:17所示的具有以下取代之一的密粘褶菌葡糖淀粉酶：V59A；S95P；A121P；T119W；S95P+A121P；V59A+S95P；S95P+T119W；V59A+S95P+A121P；或S95P+T119W+A121P，尤其是S95P+A121P。
段落147.如段落143所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶是瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
段落148.如段落147所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:20的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:20的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
149：如段落143所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶是血红密孔菌葡糖淀粉酶。
段落150.如段落149所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:18的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落151.如段落142所述的酵母菌株表达载体，其中该α-淀粉酶选自微小根毛霉或土曲霉α-淀粉酶。
段落152.如段落151所述的酵母菌株，其中该α-淀粉酶是如SEQ ID NO:16所示的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，优选是具有以下取代或取代组合中的至少一个的α-淀粉酶：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C，尤其G128D+D143N，并且其中该α-淀粉酶与SEQ ID NO:16的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落153.如段落151所述的酵母菌株，其中该α-淀粉酶是选自由以下组成的组的土曲霉α-淀粉酶：
(i)包含WO 2017/087330的SEQ ID NO:6的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与WO 2017/087330的SEQ IDNO:6的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落154.一种用于从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用α-淀粉酶液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落155.如段落155所述的方法，其中该发酵生物具有以下性质和定义特征中的至少一种或多种，例如全部：
在相同的方法条件下，例如本文所述的方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加了乙醇产量；和/或
在相同的方法条件下，例如本文所述的方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油产生。
段落156.如段落154或155所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，该发酵生物比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)提供大于0.5％的乙醇产量提升，例如大于1.0％、大于2.0％、大于2.5％、例如约2.9％、例如在0.5％和5％之间、例如在1％-3％之间。
段落157.如段落154-156中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物降低乙醛产生大于10％，例如大于20％、大于30％、大于40％、大于45％、例如5％-60％、例如30％-50％。
段落158.如段落154-157中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的方法条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物增加了温度耐受性。
段落159.如段落154-158中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物减少甘油产生大于3％，例如大于4％、大于5％、大于6％、大于7％、例如2％-15％、例如5％-10％。
段落160.如段落154-159中任一项所述的方法，其中该发酵生物：
(a)在玉米醪发酵中的相同条件下，例如本文所述的条件下，在发酵的最初20小时内，产生比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)更高的乙醇滴度；
(b)在玉米醪发酵中的相同条件下，例如本文所述的条件下，在发酵50小时后，剩余比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)更少的残余葡萄糖；
(c)在玉米醪发酵中的相同条件下，例如本文所述的条件下，在发酵50小时后，具有比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)更高的乙醇产量。
段落161.如段落154-160中任一项所述的方法，其中在糖化或发酵或SSF中添加蛋白酶。
段落162.如段落154-161中任一项所述的方法，在液化步骤i)之前进一步包括以下步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度，优选通过干磨进行；
y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
段落163.如段落154-162中任一项所述的方法，其中至少50％，例如至少70％、至少80％、至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。
段落164.如段落154-163中任一项所述的方法，其中液化中的pH在4-7之间，如pH4.5-6,5、如pH 5.0-6.5、如pH 5.0-6.0、如pH 5.2-6.2、如约5.2、如约5.4、如约5.6、如约5.8。
段落165.如段落154-164中任一项所述的方法，其中液化中的温度范围是70℃-100℃，例如75℃-95℃、75℃-90℃、80℃-90℃、或82℃-88℃，例如约85℃。
段落166.如段落154-165中任一项所述的方法，其中在步骤i)中的液化之前进行喷射蒸煮步骤。
段落167.如段落166所述的方法，其中该喷射蒸煮在110℃-145℃、例如120℃-140℃、例如125℃-135℃、或约130℃的温度下进行持续约1-15分钟，例如持续约3-10分钟，或约5分钟。
段落168.如段落154-167中任一项所述的方法，其中糖化和发酵是顺序进行或同时(SSF)进行。
段落169.如段落154-168中任一项所述的方法，其中糖化是在从20℃-75℃、例如从40℃-70℃、例如约60℃的温度下，并且在4和5之间的pH下进行。
段落170.如段落154-169中任一项所述的方法，其中发酵或同时糖化发酵(SSF)在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃、或约32℃的温度下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
段落171.如段落154-170中任一项所述的方法，其中发酵产物是在发酵之后，例如通过蒸馏回收的。
段落172.如段落154-171中任一项所述的方法，其中发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
段落173.如段落154-172中任一项所述的方法，其中该含淀粉起始材料是全谷物。
段落174.如段落154-173中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料源自玉米、小麦、大麦、黑麦、西非高粱、西米、木薯、树薯粉、木薯淀粉、高粱、燕麦、水稻或马铃薯。
段落175.如段落154-174中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中使用或添加的α-淀粉酶是细菌来源的。
段落176.如段落154-175中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1所示的α-淀粉酶。
段落177.如段落176所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是在C-末端截短的，优选为485-495个氨基酸长，如约491个氨基酸长。
段落178.如段落176或177中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F、或R179+G180缺失(使用SEQID NO:1进行编号)。
段落179.如段落176-178中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242具有取代，例如S242Q取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
段落180.如段落176-179中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188具有取代，例如E188P取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
段落181.如段落154-180中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70。
段落182.如段落154-181中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加的α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，这些变体除I181*+G182*以及任选的取代N193F之外还具有以下取代或取代的组合中的一个：
V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+S242Q；
E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
K220P+N224L+S242Q+Q254S；
M284V；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V。
段落183.如段落154-182中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加的α-淀粉酶选自包含以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：I181*+G182*以及任选的取代N193F，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)。
段落184.如段落154-183中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加葡糖淀粉酶。
段落185.如段落184所述的方法，其中在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属的菌株。
段落186.如段落154-185中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自埃默森篮状菌，如本文的SEQ ID NO:19所示的葡糖淀粉酶。
段落187.如段落154-186中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:19的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:19的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落188.如段落154-187中任一项所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，例如本文的SEQ ID NO:15所示的葡糖淀粉酶。
段落189.如段落154-188中任一项所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:15的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:15的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落190.如段落154-189中任一项所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，例如本文的SEQ ID NO:17所示的葡糖淀粉酶。
段落191.如段落154-190中任一项所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:17的成熟多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落192.如段落154-191中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是在糖化和/或发酵中与α-淀粉酶组合存在的和/或添加的。
段落193.如段落192所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。
段落194.如段落192或193所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶源自根毛霉属菌株，优选菌株微小根毛霉，例如WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3所示的α-淀粉酶，例如具有接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，特别是具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如本文的SEQ ID NO:16所示的α-淀粉酶杂合体。
段落195.如段落192-194中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
段落196.如段落192-195中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶是SEQ ID NO:16所示的具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；和G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:16进行编号)。
段落197.如段落192-196中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，优选如本文的SEQ ID NO:16披露的，例如其具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，例如G128D+D143N(使用SEQ IDNO:16进行编号)。
段落198.如段落192-197中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶变体与本文的SEQID NO:16的多肽的成熟部分具有至少75％同一性，优选至少80％、例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％的同一性。
段落199.如段落154-198中任一项所述的方法，其中使用以下进行液化步骤i)：
α-淀粉酶；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
任选地葡糖淀粉酶。
段落200.如段落199所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过25％的热稳定性值。
段落201.如段落199或200所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％、例如超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，例如超过105％，例如超过110％，例如超过115％，例如超过120％的热稳定性。
段落202.如段落199-201中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20与50％之间，例如在20％与40％之间，例如20％与30％的热稳定性。
段落203.如段落199-202中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50％与115％之间，例如在50％与70％之间，例如在50％与60％之间，例如在100％与120％之间，例如在105％与115％之间的热稳定性。
段落204.如段落199-203中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，例如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。
段落205.如段落199-204中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10％与50％之间，例如在10％与30％之间，例如在10％与25％之间的热稳定性。
段落206.如段落199-205中任一项所述的方法，其中该蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
段落207.如段落199-206中任一项所述的方法，其中该蛋白酶在85℃下具有在60％-120％之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
段落208.如段落199-207中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是真菌来源的。
段落209.如段落199-208中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是源自嗜热子囊菌属菌株的金属蛋白酶的变体，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670。
段落210.如段落199-209中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:3，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；以及
D79L+S87P+D142L。
段落211.如段落199-210中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:3，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
D79L+S87P+A112P+D142L：
D79L+S87P+D142L；以及
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
段落212.如段落199-211中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体与WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:3具有至少75％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％同一性。
段落213.如段落199-212中任一项所述的方法，其中本文的SEQ ID NO:3所示的金黄色嗜热子囊菌蛋白酶的蛋白酶变体包含以下取代或取代的组合中的一个：
D79L S87P D142L；D79L S87P A112P D142L；D79L Y82F S87P A112P D142L；S38TD79L S87P A112P A126V D142L；D79L Y82F S87P A112P A126V D142L；A27K D79L S87PA112P A126V D142L；S49P D79L S87P A112P D142L；S50P D79L S87P A112P D142L；D79LS87P D104P A112P D142L；D79L Y82F S87G A112P D142L；S70V D79L Y82F S87G Y97WA112P D142L；D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L；S70V D79L Y82F S87G A112PD142L；D79L Y82F S87G D104P A112P D142L；D79L Y82F S87G A112P A126V D142L；Y82FS87G S70V D79L D104P A112P D142L；Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L；和A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L。
段落214.如段落199-213中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是细菌来源的。
段落215.如段落199-214中任一项所述的方法，其中该蛋白酶源自火球菌属菌株，优选强烈火球菌菌株。
段落216.如段落199-215中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是US 6,358,726中的SEQ ID NO:1、或本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶。
段落217.如段落199-216中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是与US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:13具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的蛋白酶。
段落218.如段落199-217中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加0.5-100微克强烈火球菌蛋白酶/克DS，例如1-50微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如1-10微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如1.5-5微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如约或大于1.5微克强烈火球菌蛋白酶/克DS。
段落219.如段落199-218中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)中存在和/或添加2-100微克强烈火球菌蛋白酶/克DS，例如2.5-50微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如2.5-10微克强烈火球菌蛋白酶/克DS、例如2.5-5微克强烈火球菌蛋白酶克DS，尤其约3微克强烈火球菌蛋白酶/克DS。
段落220.如段落154-219中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)期间存在和/或添加葡糖淀粉酶。
段落221.如段落220所述的方法，其中在液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在85℃、pH 5.3下具有至少20％、例如至少30％、或至少35％的热稳定性。
段落222.如段落220或221所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在pH 5.0的pH最佳值下具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％的相对活性。
段落223.如段落220-222中任一项所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性。
段落224.如段落220-223中任一项所述的方法，其中液化步骤i)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶源自青霉属菌株，尤其是如WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的或本文的SEQ ID NO:9或14的草酸青霉菌菌株。
段落225.如段落220-224中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2所示的成熟多肽或本文的SEQ ID NO:9或14具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
段落226.如段落220-225中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的、具有K79V取代(使用本文的SEQID NO:14所示的成熟序列进行编号)的变体，例如WO 2013/053801中披露的变体。
段落227.如段落220-226中任一项所述的方法，其中该草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
T65A；Q327F；E501V；Y504T；Y504*；T65A+Q327F；T65A+E501V；T65A+Y504T；T65A+Y504*；Q327F+E501V；Q327F+Y504T；Q327F+Y504*；E501V+Y504T；E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V；T65A+Q327F+Y504T；T65A+E501V+Y504T；Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+Y504*；T65A+E501V+Y504*；Q327F+E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504*；E501V+Y504T；T65A+K161S；T65A+Q405T；T65A+Q327W；T65A+Q327F；T65A+Q327Y；P11F+T65A+Q327F；R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；P11F+T65A+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+S105P+Q327W；T65A+S105P+Q327F；T65A+Q327W+S364P；T65A+Q327F+S364P；T65A+S103N+Q327F；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+K79A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K79G+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K79I+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K79L+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K79S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；S255N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；和P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
段落228.如段落220-227中任一项所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶是草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：P11F+T65A+Q327F；和P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用本文的SEQ ID NO:14进行编号)。
段落229.如段落220-228中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:14的多肽的成熟部分具有至少75％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％同一性。
段落230.如段落154-229中任一项所述的方法，进一步地其中在液化和/或糖化期间存在支链淀粉酶。
段落231.如段落154-230中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落232.如段落154-231中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶(其包含在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的N193F取代(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号))液化该含淀粉材料；
ii)使用源自粘褶菌属菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落233.如段落154-232中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
任选地草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落234.如段落154-233所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)使用α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌的、包含在位置I181+G182处的双缺失和任选的N193F取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)并且在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)的α-淀粉酶，在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落235.如段落154-234所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
蛋白酶，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
任选地草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落236.如段落154-235所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：E129V+K177L+R179E；V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
和E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶，如来自粘褶菌属菌株(如篱边粘褶菌菌株)的葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落237.如段落154-236所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F，并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
任选地SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落238.如段落154-237所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F，并且进一步任选地具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)，
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落239.如段落154-238中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有在位置I181+G182处的双缺失、以及任选的取代N193F(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；
具有K79V取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶(使用本文的SEQ ID NO:14进行编号)；以及
任选地支链淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落240.如段落154-239所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；
ii)使用选自下组的葡糖淀粉酶进行糖化：源自曲霉属菌株的葡糖淀粉酶，优选地黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属的菌株；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落241.如段落154-240所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料；
α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌，其具有在位置I181+G182处的双缺失和任选的取代N193F，并且在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；
草酸青霉菌葡糖淀粉酶；以及
任选地支链淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落242.如段落154-241所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
在0.5和10微克之间的强烈火球菌蛋白酶/g DS；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；以及
任选地支链淀粉酶；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落243.如段落154-242所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选源自强烈火球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；以及
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；以及
任选地支链淀粉酶；
ii)使用选自下组的葡糖淀粉酶进行糖化：源自曲霉属菌株的葡糖淀粉酶；或木霉属菌株；篮状菌属菌株；密孔菌属菌株；粘褶菌属菌株；以及黑层孔属菌株；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落244.如段落154-243中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，在5.0和6.5之间的pH下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
源自强烈火球菌的蛋白酶，优选本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶；
SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落245.如段落154-244中任一项所述的方法，其中在糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在纤维素分解酶组合物。
段落246.如段落154-245中任一项所述的方法，其中该发酵生物与酿酒酵母菌株MBG5012或具有酿酒酵母菌株MBG5012的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物具有大致相同的性质，因为它提供以下性质或定义特征中的一种或多种，例如全部：
在相同的方法条件下，例如如本文所述，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，乙醇产量增加；和/或
在相同的方法条件下，例如如本文所述，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油产生。
段落247.如段落段落154-246中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，该发酵生物比酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)提供大于0.5％的乙醇产量提升，例如大于1.0％、大于2.0％、大于2.5％、约2.9％、例如在0.5％和5％之间、例如1％-3％。
段落248.如段落154-247中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物降低乙醛产生大于10％，例如大于20％、大于30％、大于40％、大于45％、例如5％-60％、例如30％-50％。
段落249.如段落154-248中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物增加了温度耐受性。
段落250.如段落154-249中任一项所述的方法，其中在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，该发酵生物减少甘油产生大于3％，例如大于4％、大于5％、大于6％、大于7％、例如2％-15％、例如5％-10％。
段落251.如段落154-250中任一项所述的方法，其中该发酵生物是一种非重组酵母菌属菌株，例如非重组酿酒酵母菌株。
段落252.如段落154-251中任一项所述的方法，其中该发酵生物能够利用作为唯一氮源的半胱氨酸。
段落253.一种用于从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物具有以下性质和定义特征中的一种或多种，例如全部：
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加了乙醇产量；
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，降低的乙醛产生；
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，增加的温度耐受性；
在相同的方法条件下，例如本文所述的条件下，与酿酒酵母菌株Ethanol(在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏)相比，减少的甘油产生。
段落254.如段落253所述的方法，其中该发酵生物是酿酒酵母。
段落255.如段落253或254所述的方法，其中该发酵生物是非重组酿酒酵母。
段落256.如段落154-255中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80℃-90℃之间的温度下，在5.0和6.5之间的pH下，使用以下项液化该含淀粉材料：
源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182、以及任选的取代N193F；并且任选地进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
源自强烈火球菌的蛋白酶，优选地本文的SEQ ID NO:13所示的蛋白酶，其以1-5微克蛋白酶/克DS(如约1.5或3微克蛋白酶/克DS)的剂量存在和/或添加；
任选地SEQ ID NO:14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，其具有以下取代或取代的组合中的一个：
K79V；
K79V+P11F+T65A+Q327F；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落257.如段落153-256中任一项所述的方法，其中该发酵生物是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的酿酒菌属菌株MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落258.如段落257所述的方法，其中在糖化和/或发酵或同时糖化发酵(SSF)中存在或添加蛋白酶。
段落259.在布达佩斯条约下保藏的且具有NRRL登录号NRRL Y67700的酵母菌属酵母菌株，或菌株NRRL Y67700的衍生物。
段落260.一种产生酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)的衍生物的方法，该方法包括：
d.在允许第一酵母菌株和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，将第一酵母菌株与第二酵母菌株一起培养，其中该第二酵母菌株是酿酒酵母菌株MBG5012或其衍生物；以及
e.分离杂合菌株；以及
f.任选地使用步骤(b)中分离的杂合菌株作为第一酵母菌株和/或第二酵母菌株来重复步骤(a)和(b)。
段落261.一种产生表现出酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)的定义特征的酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物的方法，该方法包括：
(d)提供：
(j)第一酵母菌株；以及
(iii)第二酵母菌株，其中第二酵母菌株是酿酒酵母菌株MBG5012或其衍生物；
(e)在允许第一和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，培养第一酵母菌株和第二酵母菌株；
(f)筛选或选择酿酒酵母MBG5012的衍生物。
段落262.如段落261所述的方法，其中步骤(c)包括筛选或选择表现出酿酒酵母菌株MBG5012的一个或多个定义特征的杂合菌株。
段落263.如段落261所述的方法，该方法包括另外的步骤：
(d)用从步骤(c)筛选或选择的菌株作为第一和/或第二菌株重复步骤(b)和(c)，直到获得表现出酿酒酵母菌株MBG5012的定义特征的衍生物。
段落264.如段落262或263所述的方法，其中该培养步骤(b)包括：
(i)使该第一酵母菌株和该第二酵母菌株形成孢子；
(ii)将该第一酵母菌株产生的萌发的孢子与该第二酵母菌株产生的萌发的孢子进行杂交。
段落265.一种通过如段落260-264中任一项所述的方法产生的酵母菌属菌株。
段落266.一种具有酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRLY67700下保藏)的定义特征的酵母菌属菌株。
段落267.一种生产乙醇的方法，该方法包括在允许可发酵糖发酵生成乙醇的条件下将如段落259、265或266中任一项所述的菌株与包含可发酵糖的底物一起孵育。
段落268.如段落259、265或266中任一项所述的菌株在乙醇生产中的用途。
段落269.一种生产酒糟的方法，该方法包括：
(c)在允许可发酵糖发酵生成乙醇和酒糟的条件下，将如段落259、265或266中任一项所述的酵母菌属菌株与包含可发酵糖的底物一起孵育；
(d)分离该酒糟。
段落270.一种通过如段落269所述的方法产生的酒糟。
段落271.如段落259、265或266所述的菌株在酒糟生产中的用途。
段落272.如段落259、265或266所述的菌株在酵母菌属菌株生产中的用途，该酵母菌属菌株具有酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)的定义特征。
段落273.酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)在产生与酿酒酵母菌株MBG5012具有大致相同性质的酵母菌属菌株或表现出酿酒酵母菌株MBG5012的一个或多个定义特征的酵母菌属菌株中的用途。
段落274.酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与酿酒酵母菌株MBG5012或其衍生物具有大致相同性质的菌株在如段落154-273中任一项所述的方法中的用途。
段落275.一种组合物，该组合物包含如段落259、265或266中任一项所述的酵母菌属酵母以及一种或多种天然存在和/或非天然存在的组分。
段落276.如段落275所述的组合物，其中这些组分选自由以下组成的组：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂和抗氧化剂。
段落277.如段落275或276所述的组合物，其中该酵母菌属酵母是酿酒酵母菌株MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)。
段落278.如段落275-277中任一项所述的组合物，其中该酵母菌属酵母是处于活力形式，具体地处于干燥、膏状或压缩形式。
段落279.一种从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括：
(a)糖化该含淀粉材料；以及
(b)使用发酵生物进行发酵；
其中
糖化和/或发酵在至少葡糖淀粉酶和任选地α-淀粉酶的存在下进行；
该发酵生物是酿酒酵母；
并且其中由该发酵生物表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
段落280.如段落279所述的方法，其中该含淀粉材料是经糊化的或未经糊化的淀粉。
段落281.如段落280所述的方法，其中液化步骤在糖化步骤之前，并且其中液化步骤在至少细菌α-淀粉酶(例如来自芽孢杆菌属物种，尤其来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶)的存在下进行。
段落282.如段落279-281中任一项所述的方法，其中该酿酒酵母是MBG5012(在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏)或者与MBG5012或具有菌株MBG5012的定义特征的MBG5012的衍生物具有大致相同性质的发酵生物。
段落283.如段落279-282所述的方法，其中该发酵生物是表达葡糖淀粉酶的MBG5012的重组衍生物。
段落284.如段落279-283所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是粘褶菌属葡糖淀粉酶，优选密粘褶菌、篱边粘褶菌、或冷杉粘褶菌葡糖淀粉酶。
段落285.如段落279-284所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:17的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落286.如段落284或285所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是SEQ ID NO:17所示的具有以下取代之一的密粘褶菌葡糖淀粉酶：V59A；S95P；A121P；T119W；S95P+A121P；V59A+S95P；S95P+T119W；V59A+S95P+A121P；或S95P+T119W+A121P，尤其是S95P+A121P。
段落287.如段落279-283中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是由该发酵生物表达的，并且是栓菌属葡糖淀粉酶，优选是瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
段落288.如段落287所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:20的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:20的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落289.如段落279-283中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是由该发酵生物表达的，并且是密孔菌属葡糖淀粉酶，特别是血红密孔菌葡糖淀粉酶。
段落290.如段落289所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:18的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落291.如段落279-290中任一项所述的方法，其中该发酵生物是表达α-淀粉酶的MBG5012的重组衍生物。
段落292.如段落279-291所述的方法，其中该α-淀粉酶由该发酵生物表达并且源自微小根毛霉或土曲霉。
段落293.如段落292所述的方法，其中该α-淀粉酶是如SEQ ID NO:16所示的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，优选是具有以下取代或取代组合中的至少一个的α-淀粉酶：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C，尤其G128D+D143N，并且其中该α-淀粉酶与SEQ ID NO:16的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落294.如段落292所述的方法，其中该α-淀粉酶是选自由以下组成的组的土曲霉α-淀粉酶：
(i)包含WO 2017/087330的SEQ ID NO:6的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与WO 2017/087330的SEQ IDNO:6的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
段落295.一种酿酒酵母菌株，其中该菌株是MBG5012的衍生物，其包含一种或多种编码葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶的表达载体。
段落296.如段落295所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶选自可得自粘褶菌属、密孔菌属、或栓菌属的葡糖淀粉酶。
段落297.如段落296所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶选自密粘褶菌、篱边粘褶菌、或冷杉粘褶菌葡糖淀粉酶。
段落298.如段落297所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:17的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落299.如段落296-298中任一项所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶是SEQ IDNO:17所示的具有以下取代之一的密粘褶菌葡糖淀粉酶：V59A；S95P；A121P；T119W；S95P+A121P；V59A+S95P；S95P+T119W；V59A+S95P+A121P；或S95P+T119W+A121P，尤其是S95P+A121P。
段落300.如段落296所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶是瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
段落301.如段落300所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:20的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:20的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落302：如段落296所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶是血红密孔菌葡糖淀粉酶。
段落303.如段落302所述的酵母菌株，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含SEQ ID NO:18的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落304.如段落295所述的酵母菌株表达载体，其中该α-淀粉酶选自微小根毛霉或土曲霉α-淀粉酶。
段落305.如段落304所述的酵母菌株，其中该α-淀粉酶是如SEQ ID NO:16所示的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，优选是具有以下取代或取代组合中的至少一个的α-淀粉酶：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C，尤其G128D+D143N，并且其中该α-淀粉酶与SEQ ID NO:16的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
段落306.如段落304所述的酵母菌株，其中该α-淀粉酶是选自由以下组成的组的土曲霉α-淀粉酶：
(i)包含WO 2017/087330的SEQ ID NO:6的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与WO2017/087330的SEQ IDNO:6的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
本文引用了多个参考，其披露内容通过引用以其全部内部并入本文。
生物材料保藏
已在布达佩斯条约的条款下，在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)保藏了以下生物材料，并且给出以下登录号：
下列生物材料已在布达佩斯条约的条款下保藏在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所，并给出以下登录号：
保藏物 登录号 保藏日期
Ethanol V14/007039 2014年3月19日
该菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由专利与商标委员依据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的人能够获得该培养物。该保藏物代表所保藏菌株的基本上纯的培养物。需要按一些国家的国外专利法要求提供保藏物，在这些国家提交该主题申请的副本，或其后续文本。然而应理解，保藏物的可用性不构成将本发明主题用于由政府行为批准的专利权的实践的许可。
材料与方法
材料：
α-淀粉酶369(“AA369”)：具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：
I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V，截短至491个氨基酸(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)；
草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体PE498(“PoAMG498”)：具有以下突变的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体：K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用本文的SEQ ID NO:14进行编号)：
蛋白酶Pfu(“PFU”)：本文的SEQ ID NO:13所示的源自强烈火球菌的蛋白酶。
葡糖淀粉酶SA(“GSA”)包含共混物，该共混物包含WO 99/28448中所披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:19)，作为WO 06/69289中的SEQ ID NO:2和本文的SEQ ID NO:20披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶，以及作为本文的SEQ ID NO:16披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其具有以下突变：G128D+D143N)(活性比AGU:AGU:FAU(F)：约30:7:1)。
酵母：
ETHANOL REDTM(“ER”)：可从美国富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)获得的酿酒酵母。
方法
同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本文所述的目的，可以通过程序“比对”确定两个氨基酸序列之间的同一性程度以及两个核苷酸序列之间的同一性程度，该程序是尼德尔曼-翁施比对(Needleman-Wunsch alignment)(即总体对比)。使用该程序进行多肽以及核苷酸序列的比对。使用缺省评分矩阵BLOSUM50进行多肽比对，以及使用缺省同一性矩阵进行核苷酸比对。对多肽而言，缺口第一个残基的罚分为-12，对核苷酸而言该罚分为-16。对多肽而言，缺口另外残基的罚分为-2，对核苷酸而言该罚分为-4。
“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological Sequence Analysis[用于生物序列分析的改进的工具]”,PNAS 85:2444-2448，和W.R.Pearson(1990)“Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA[使用FASTP和FASTA进行的快速且灵敏的序列比较]”Methods in Enzymology[酶学方法]183:63-98)。FASTA蛋白比对使用史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)进行，对缺口大小没有限制(参见“Smith-Watermanalgorithm[史密斯-沃特曼算法]”,T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]147:195-197)。
蛋白酶测定
AZCL-酪蛋白测定
边搅拌边将蓝色底物AZCL-酪蛋白的0.2％溶液悬浮于pH 9的Borax/NaH2PO4缓冲液中。边搅拌边将该溶液分散在微量滴定板(每孔100微升)上，添加30微升酶样品并且将这些板在Eppendorf热混器中在45℃和600rpm下孵育持续30分钟。使用变性的酶样品(100℃煮沸持续20min)作为空白对照。孵育之后通过将微量滴定板转移到冰上来终止该反应并且通过在4℃以3000rpm离心持续5分钟将着色的溶液与固体分离。将60微升的上清液转移到微量滴定板并且使用伯乐酶标仪(BioRad Microplate Reader)测量在595nm处的吸光度。
pNA测定
将50微升含蛋白酶样品添加到微量滴定板并且通过添加100微升1mM pNA底物(5mg溶解于100微升DMSO中并进一步用pH 9.0的Borax/NaH2PO4缓冲液稀释至10mL)开始该测定。监测OD405在室温的增加作为蛋白酶活性的量度。
葡糖淀粉酶活性(AGU)能以葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量葡糖淀粉酶活性。
诺维信葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
可使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性地反应，形成NADH，使用光度计在340nm下测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。
AMG孵育
底物：麦芽糖23.2mM
缓冲液：乙酸盐0.1M
pH：4.30±0.05
孵育温度：37℃±1℃
反应时间：5分钟
酶工作范围：0.5-4.0AGU/mL
显色反应
GlucDH：430U/L
变旋酶：9U/L
NAD：0.21mM
缓冲液：磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH：7.60±0.05
孵育温度：37℃±1℃
反应时间：5分钟
波长：340nm
更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
能以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，其相对于酶标准品确定。1AFAU定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，水解淀粉分子内部区域中的α-1，4-糖苷键以形成具有不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度和淀粉浓度成正比。使用反向比色法在指定的分析条件下将酶活性确定为淀粉浓度的降低。
λ＝590nm
蓝色/紫色t＝23sec.脱色
标准条件/反应条件
底物：可溶性淀粉，大约0.17g/L
缓冲液：柠檬酸盐，大约0.03M
碘(I2)：0.03g/L
CaCl2：1.85mM
pH：2.50±0.05
孵育温度：40℃
反应时间：23秒
波长：590nm
酶浓度：0.025AFAU/mL
酶工作范围：0.01-0.04AFAU/mL
更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
α-淀粉酶活性(KNU)
可以使用马铃薯淀粉作为底物确定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来追踪。最初形成黑蓝色，但淀粉分解期间蓝色变弱并且逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。
一千诺维信α淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件(即，在37℃+/-0.05℃；0.0003MCa2+；和pH 5.6)下，将5260mg可溶的淀粉干物质Merck Amylum糊精化的酶量。
更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
α-淀粉酶活性(KNU-A)
相对于已知强度的酶标准品，以KNU(A)千诺维信单位(A)测量α淀粉酶活性。
样品中的α淀粉酶和试剂盒中的α-葡糖苷酶将底物(4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽七糖苷(亚乙基-G7PNP))水解成葡萄糖和黄色的对硝基苯酚。
通过Konelab 30观察对硝基苯酚的形成速率。这是反应速率及由此酶活性的表达。
该酶是具有酶分类号EC 3.2.1.1的α-淀粉酶。
关于确定KNU-A活性的文件夹EB-SM-5091.02-D可从丹麦诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
α-淀粉酶活性KNU(S)
样品中的BS-淀粉酶和试剂盒中的酶α-葡糖苷酶将底物(4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α-D-麦芽七糖苷(亚乙基-G7PNP))水解成葡萄糖和黄色对硝基苯酚。
通过Konelab 30观察对硝基苯酚的形成速率。这是反应速率及由此酶活性的表达。
反应条件
反应：
pH：7.15
温度：37℃
反应时间：180sec
检测：
波长：405nm
测量时间：120sec
单位定义
相对于已知强度的酶标准品，以KNU(S)(千诺维信单位)(嗜热脂肪(sterarothermophilus))测量嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶(BS-淀粉酶)的活性。
这种分析方法更详细地描述于可从丹麦的诺维信公司索取获得的EB-SM-0221.02(通过引用并入)中。
FAU(F)的测定
相对于已知强度的酶标准品测量FAU(F)真菌α-淀粉酶单位(Fungal Alpha-Amylase Units(Fungamyl))。
反应条件
温度：37℃
pH：7.15
波长：405nm
反应时间：5min
测量时间：2min
更详细描述这种标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
支链淀粉酶活性(NPUN)的确定
相对于诺维信支链淀粉酶标准品测量NPUN中的内切-支链淀粉酶活性。一个支链淀粉酶单位(NPUN)定义为在标准条件(0.7％红色普鲁兰(red pullulan)(麦格酶公司(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)下每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。
将1mL稀释的样品或标准品在40℃孵育2分钟。添加0.5mL 2％红色普鲁兰、0.5MKCl、50mM柠檬酸(pH 5)并混合。将管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml 80％乙醇终止。将管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm下测量上清液的OD并使用标准曲线计算活性。
本发明将在以下实例中进行更详细的描述，这些实例被提供用以说明本发明而决不意图限制本发明要求的范围。本文引用的所有参考文献针对在本文中进行的描述通过引用具体结合。
实例
实例1：α-淀粉酶变体的稳定性
通过将参比α-淀粉酶(具有突变I181*+G182*+N193F的、截短至491个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(以本文的SEQ ID NO:1进行编号))及其α-淀粉酶变体在pH 4.5和5.5下以及在温度75℃和85℃用0.12mM CaCl2进行孵育，随后使用底物(超级淀粉酶测定试剂盒(Ultra Amylase assay kit)，E33651，分子探针公司(Molecular Probes))进行残余活性测定来确定该参比α-淀粉酶及变体的稳定性。
使纯化的酶样品在酶稀释缓冲液(10mM乙酸盐、0.01％Triton X100、0.12mMCaCl2，pH 5.0)中稀释至0.5和1或5和10ppm(微克/毫升)的工作浓度。将二十微升酶样品转移至48孔PCR MTP并且将180微升稳定性缓冲液(150mM乙酸盐、150mM MES、0.01％TritonX100、0.12mM CaCl2，pH 4.5或5.5)添加至每个孔并且混合。测定使用两种浓度的酶来重复两次执行。在75℃或85℃孵育之前，取出20微升并且储存在冰上作为对照样品。在PCR仪(在75℃和85℃)中进行孵育。孵育之后，将样品在残余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％Triton X100、0.12mM CaCl2，pH 5.5)中稀释至15ng/mL并且将25微升稀释酶转移至黑色384-MTP。使用EnzChek底物通过将25微升底物溶液(100微克/毫升)添加至每个孔来测定残余活性。使用485-P nm的激发滤光器以及555nm的发射滤光器(荧光读取器是Polarstar，BMG公司)每分钟测量荧光持续15分钟。对于每个设置，将残留活性相对于对照样品标准化。
假定对数式衰减，那么使用方程T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)来计算半衰期时间(T1/2(min))，其中T是以分钟为单位的测定孵育时间，并且％RA是在测定中确定的％残余活性。
使用此测定设置，针对参比α-淀粉酶及其变体确定半衰期时间，如表1中所示。
表1.
ND：未确定
这些结果证明α-淀粉酶变体比参比α-淀粉酶具有显著更高的半衰期和稳定性。
实例2：蛋白酶变体的制备以及热稳定性测试
菌株与质粒
使用大肠杆菌DH12S(可获得自吉博科公司(Gibco BRL))用于酵母质粒拯救。pJTP000是在TPI启动子的控制之下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，构建自描述于WO 01/92502中的pJC039，在其中已经插入了金黄色嗜热子囊菌M35蛋白酶基因(WO 03048353)。
将酿酒酵母YNG318感受态细胞：MATa Dpep4[cir+]ura3-52、leu2-D2、his 4-539用于蛋白酶变体表达。这被描述于J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272(15),第9720-9727页,1997中。
培养基与底物
10X基础溶液：不包含氨基酸的酵母氮基(DIFCO)66.8g/l，琥珀酸盐100g/l，NaOH60g/l。
SC-葡萄糖：20％葡萄糖(即，终浓度为2％＝2g/100ml)100ml/l，5％苏氨酸4ml/l，1％色氨酸10ml/l，20％酪蛋白氨基酸25ml/l，10X基础溶液100ml/l。使用孔径大小为0.20微米的过滤器将溶液灭菌。将琼脂(2％)和H2O(大约761ml)一起热压处理，并且向琼脂溶液中添加分开灭菌的SC-葡萄糖溶液。
YPD：细菌蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，20％葡萄糖100ml/l。
YPD+Zn：YPD+0.25mM ZnSO4。
PEG/LiAc溶液：40％PEG4000 50ml，5M乙酸锂1ml。
96孔玉米素微滴度板：
每个孔包含200微升的0.05％-0.1％的玉米素(西格玛公司(Sigma))，0.25mMZnSO4以及1％的琼脂于20mM乙酸钠缓冲液中，pH 4.5。
DNA操纵
除非另外说明，否则使用如以下所述的分子生物学标准方法来进行DNA操纵和转化：Sambrook等人(1989),Molecular cloning:A laboratory manual[分子克隆：实验室手册],Cold Spring Harbor lab[冷泉港实验室],冷泉港,纽约州；Ausubel,F.M.等人(编辑)“Current protocols in Molecular Biology[当代分子生物学实验手册]”,John Wileyand Sons[约翰·威立父子公司],1995；Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(编辑)。
酵母转化
使用乙酸锂法进行酵母转化。混合0.5微升载体(由限制性内切核酸酶消化)以及1微升的PCR片段。将DNA混合物、100微升的YNG318感受态细胞、以及10微升的酵母标记载体DNA(YEAST MAKER carrier DNA)(克罗泰克公司(Clontech))添加到12ml聚丙烯管(Falcon2059)中。添加0.6ml PEG/LiAc溶液并轻轻混合。在30℃下并且200rpm孵育30min，并且随后在42℃下孵育30min(热休克)。转移至埃彭道夫管中并且离心5秒。移去上清液并且溶解于3ml的YPD中。在30℃以200rpm孵育该细胞悬浮液45min。将悬浮液倾倒在SC-葡萄糖板上并在30℃孵育3天以使菌落生长。通过Zymoprep酵母质粒小量制备试剂盒(ZYMO研究公司(ZYMO research))提取酵母总DNA。
DNA测序
通过电穿孔(伯乐基因脉冲发生器(BIO-RAD Gene Pulser))进行用于DNA测序的大肠杆菌转化。通过碱法(分子克隆公司(Molecular Cloning)，冷泉港)或使用质粒试剂盒制备DNA质粒。通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。使用PTC-200DNA引擎(DNA Engine)进行PCR。使用ABI PRISMTM 310基因分析器来测定所有的DNA序列。
蛋白酶表达载体的构建
使用引物对Prot F(SEQ ID NO:4)和Prot R(SEQ ID NO:5)扩增嗜热子囊菌属M35蛋白酶基因。将所得PCR片段连同pJC039载体引入酿酒酵母YNG318(描述于WO 2001/92502中)，用限制性内切酶消化以去除特异腐质霉角质酶基因。
回收在SC-葡萄糖板上的酵母克隆中的质粒以确认内部序列并称作pJTP001。
酵母文库和定点变体的构建
通过SOE PCR法(重叠延伸剪接(Splicing by Overlap Extension)，参见“PCR:Apractical approach[PCR：一种实用方法]”,第207-209页,Oxford University press[牛津大学出版社],编辑McPherson,Quirke,Taylor)、随后进行酵母体内重组来构建酵母文库和定点变体。
用于扩增和测序的通用引物
使用引物AM34(SEQ ID NO:6)和AM35(SEQ ID NO:7)，通过SOE法与简并引物(AM34+反向引物和AM35+正向引物)一起制备包含任何突变的片段的DNA片段或仅仅扩增整个蛋白酶基因(AM34+AM35)。
通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将所得纯化的片段与载体消化物混合。将混合溶液引入酿酒酵母中，以通过体内重组来构建文库或定点变体。
相对活性测定
将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种进包含YPD+Zn培养基的96孔微滴度板的孔中并在28℃下培养3天。将培养物上清液施加到96孔玉米素微滴定板并在至少2个温度(例如，60℃和65℃、70℃和75℃、70℃和80℃)下孵育超过4小时或过夜。玉米素在板中的浊度被测量为A630并且相对活性(较高/较低温度)被确定为热稳定性改进的一个指标。选择比亲本变体具有更高相对活性的克隆并确定这些序列。
残余活性测定
将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种进96孔微滴度板的孔中并在28℃下培养3天。将该培养物上清液在特定温度(80℃或84℃，4℃作为一个参考)下于20mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中孵育10min之后，使用偶氮-酪蛋白(麦格酶公司)在65℃下测定蛋白酶活性，从而确定残余活性。选择比亲本变体具有更高残余活性的克隆并确定这些序列。
偶氮-酪蛋白测定
将20微升样品与150微升底物溶液(4ml的在乙醇中的12.5％偶氮-酪蛋白，在96ml的20mM乙酸钠(pH 4.5)中，包含0.01％triton-100和0.25mM ZnSO4)混合并孵育4小时或更久。
添加20微升/孔的100％三氯乙酸(TCA)溶液之后，将该板离心并且吸取100微升的上清液以测量A440。
蛋白酶变体在米曲霉中的表达
使用包含蛋白酶变体基因的构建体来构建用于曲霉属的表达载体。曲霉属表达载体由表达盒组成，该表达盒是基于与构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的非翻译前导序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Pna2/tpi)、和黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)。质粒上还存在曲霉属选择性标记amdS，其来自能够在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的构巢曲霉。如描述于Lassen等人(2001),Applied and Environmental Micorbiology[应用与环境微生物学],67,4701-4707中，将蛋白酶变体的表达质粒转化进曲霉属中。针对每个构建体，分离、纯化并在摇瓶中培养10-20个菌株。
所表达的变体的纯化
1.调节0.22μm经过滤的发酵样品的pH至4.0。
2.将样品置于冰浴中，伴随磁力搅拌。以小量的等分试样添加(NH4)2SO4(对应于大约2.0-2.2M(NH4)2SO4，当添加该化合物时未考虑体积增加)。
3.(NH4)2SO4的最终添加之后，将该样品于冰浴中伴随轻柔的磁力搅拌孵育45min。
4.离心：日立(Hitachi)himac CR20G高速冷冻离心机，配备有R20A2转头，5℃，20,000rpm，30min。
5.将形成的沉淀物溶解于200ml 50mM乙酸钠(pH 4.0)中。
6.通过真空吸引器，使用0.22μm PES PLUS膜(易威奇公司(IWAKI))过滤该样品。
7.在冷室中，使用超滤法(来自赛多利斯公司(Vivascience)的Vivacell 250，配备有5kDa MWCO PES膜)将样品脱盐/缓冲液置换到50mM乙酸钠(pH 4.0)中。使用50mM乙酸钠(pH 4.0)将残余样品稀释至200ml。样品的导电性优选地小于5mS/cm。
8.将样品加载到用50mM乙酸钠(pH 4.0)平衡的阳离子交换柱上。使用3倍柱体积的结合缓冲液(50mM乙酸钠pH 4.0)将未结合样品从该柱洗出，并且使用线性梯度(0-100％洗脱缓冲液(50mM乙酸钠+1M NaCl，pH 4.0))，以10倍柱体积对样品进行洗脱。
9.通过内切-蛋白酶测定(参见下文)测定所收集的级分，随后对所选择的级分进行标准SDS-PAGE(还原条件)。基于内切-蛋白酶测定和SDS-PAGE，合并多个级分。
内切-蛋白酶测定
1.通过磁力搅拌溶解Protazyme OL片/5ml 250mM乙酸钠(pH 5.0)(底物：来自麦格酶公司(Megazyme)的、目录号PRAK 11/08的内切-蛋白酶Protazyme AK片)。
2.边搅拌边将250微升的底物溶液转移到1.5ml的埃彭道夫管。
3.向每个管中添加25微升的样品(空白对照是样品缓冲液)。
4.将这些管在50℃在热混器中振荡(1000rpm)孵育15分钟。
5.向每个管中添加250微升的1M NaOH，随后进行涡旋。
6.以16,100×G并且在25℃离心3min。
7.将200微升的上清液转移到MTP，并且记录590nm处的吸光度。
结果
表2.蛋白酶变体的相对活性。从SEQ ID NO:3的氨基酸1至177中成熟肽的N末端开始对一个或多个取代进行编号。
表3.蛋白酶变体的相对活性。从SEQ ID NO:3的氨基酸1至177中成熟肽的N末端开始对一个或多个取代进行编号。
表4.蛋白酶变体的相对活性。从SEQ ID NO:3的氨基酸1至177中成熟肽的N末端开始对一个或多个取代进行编号。
表5.蛋白酶变体的相对活性。从SEQ ID NO:3的氨基酸1至177中成熟肽的N末端开始对一个或多个取代进行编号。
表6.蛋白酶变体的相对活性。从SEQ ID NO:3的氨基酸1至177中成熟肽的N末端开始对一个或多个取代进行编号。
实例3：使用纯化的酶，所选择变体的温度特征曲线
纯化所选择的显示良好热稳定性的变体并且将经纯化的酶用于如下所述的玉米素-BCA测定中。将该酶在如所指出的升高的温度孵育60min之后，在60℃确定残余蛋白酶活性。
玉米素-BCA测定：
在不同温度通过变体蛋白酶进行玉米素-BCA测定以检测释放自玉米素的可溶性蛋白的定量。
方案：
1)混合10ul的10ug/ml酶溶液和100ul的0.025％玉米素溶液于微滴定板(MTP)中。
2)在不同温度孵育60min。
3)添加10ul的100％三氯乙酸(TCA)溶液。
4)以3500rpm离心MTP 5min。
5)取15ul至一个新的包含100ul BCA测定溶液的MTP(皮尔斯公司(Pierce)目录号：23225,BCA蛋白测定试剂盒)中。
6)在60℃孵育30min。
7)测量A562。
结果示出于表7中。与野生型蛋白酶相比较，所有的经测试的变体均显示改进的热稳定性。
表7.玉米素-BCA测定
实例4：草酸青霉菌葡糖淀粉酶的表征
该草酸青霉菌葡糖淀粉酶披露于本文的SEQ ID NO:9中。
底物。底物：在去离子水中的1％可溶性淀粉(西格玛(Sigma)S-9765)
反应缓冲液：0.1M乙酸盐缓冲液，pH 5.3
葡萄糖浓度测定试剂盒：和光葡萄糖检验试剂盒(LabAssay葡萄糖，和光株式会社(WAKO)，目录号298-65701)。
反应条件。将20微升的可溶性淀粉与50微升的乙酸盐缓冲液(pH 5.3)混合。添加30微升的酶溶液(50微克酶蛋白/ml)达到100微升最终体积，随后在37℃孵育15分钟。
葡萄糖浓度是通过和光试剂盒(Wako kits)测定。
所有这些工作都平行进行。
最适温度。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的最适温度，以上描述的“反应条件”-测定是在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃以及95℃下进行的。结果示出于表8中。
表8.最适温度
从这些结果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在给定条件下的最适温度是在50℃与70℃之间并且该葡糖淀粉酶在95℃维持超过80％活性。
热稳定性。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的热稳定性，对反应条件测定进行修改，其中将酶溶液和乙酸缓冲液在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃和95℃预孵育15min。孵育之后，向该溶液中添加20微升淀粉并且如上所述进行该测定。
结果示出于表9中。
表9.热稳定性
从这些结果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在预孵育15min后在高达70℃是稳定的，因为它维持超过80％活性。
最适pH。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的pH最佳值，在如下pH进行上述反应条件测定：pH 2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.07.0、8.0、9.0、10.0和11.0。使用以下缓冲液来代替在该反应条件测定中所描述的乙酸盐缓冲液：100mM的琥珀酸、HEPES、CHES、CAPSO、1mMCaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH用HCl或NaOH调整到2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或11.0。
结果示出于表10中。
表10.pH最佳值
从这些结果可知在给定条件下草酸青霉菌葡糖淀粉酶在pH 5.0具有最高活性。该草酸青霉菌葡糖淀粉酶在宽泛的pH范围内是有活性的，因为它在从pH 2至7维持超过50％活性。
pH稳定性。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的热稳定性，将反应条件测定进行修改，其中使用pH最佳值下描述的缓冲液，在具有pH 2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0 7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液中将酶溶液(50微克/mL)预孵育20小时。预孵育之后，向该溶液中添加20微升可溶性淀粉至100微升的最终体积并且如上所述进行该测定。
结果示出于表11中。
表11.pH稳定性
从这些结果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在预孵育20小时后从pH 3至pH 7是稳定的并且其在pH 8降低活性。
实例5：蛋白酶Pfu的热稳定性
使用如与实例2中相同的方法来检测购买自宝酒造生物公司(Takara Bio Inc)(日本)的强烈火球菌蛋白酶(Pfu S)的热稳定性。发现热稳定性(相对活性)在pH 4.5下是110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)。
实例6：草酸青霉菌菌株葡糖淀粉酶基因的克隆
草酸青霉菌菌株cDNA的制备。
通过按照cDNA末端系统的3’快速扩增技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA))的说明来合成cDNA。
草酸青霉菌菌株葡糖淀粉酶基因的克隆。
使用下文所示的、被设计成用来从5’端扩增葡糖淀粉酶基因的寡核苷酸引物来克隆草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因。
正义引物：5’-ATGCGTCTCACTCTATTATCAGGTG-3’(SEQ ID NO:22)
通过PCR用正义引物和AUAP(由cDNA末端系统的3’快速扩增提供)、通过使用Platinum HIFI Taq DNA聚合酶(美国加利福尼亚州卡尔斯巴市的英杰公司)来扩增全长基因。扩增反应是由5μl的10x PCR缓冲液、2μl的25mM MgCl2、1μl的10mM dNTP、1μl的10uM正义引物、1μl的10uM AUAP、2μl的第一链cDNA、0.5μl的HIFI Taq、以及37.5μl的去离子水构成的。PCR程序是：94℃，3min；10个循环：94℃持续40sec，60℃持续40sec、每循环降低1℃，68℃持续2min；25个循环：94℃持续40sec，50℃持续40sec，68℃持续2min；在68℃进行最终延伸持续10min。
使用pGEM-T载体系统(美国威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司(PromegaCorporation,Madison,WI,USA))，将获得的PCR片段克隆到pGEM-T载体(美国威斯康星州麦迪的逊市普洛麦格公司)中以产生质粒AMG 1。对插入到质粒AMG 1中的葡糖淀粉酶基因进行测序确认。含有质粒AMG 1(表示为NN059173)的大肠杆菌菌株TOP10于2009年11月23日保藏在德国微生物与菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，DSMZ)并且指定保藏号为DSM 23123。
实例7：克隆的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的表达
通过PCR使用以下所示的两种克隆引物F和引物R将草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因重新从质粒AMG 1克隆到曲霉菌表达载体中，这两种克隆引物是基于已知的序列和添加的标志来设计以用于通过IN-FUSIONTM策略直接克隆。
引物F：
5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC(SEQ ID NO:23)
引物R：
5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQ ID NO:24)
用质粒AMG 1来进行PCR反应以扩增全长基因。PCR反应是由40μg的质粒AMG 1DNA、1μl的每种引物(100μM)、12.5μl的2X扩展剂高保真主体混合物(Extensor Hi-FidelityMaster Mix，英国拜力公司(ABgene))、以及9.5μl的PCR级水组成。使用DYAD PCR仪(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA))进行PCR反应，该仪器的程序为：在94℃持续2分钟，随后进行94℃持续15秒、50℃持续30秒、以及72℃持续1分钟的25个循环；并且然后在72℃持续10分钟。
通过1.0％琼脂糖凝胶电泳使用1×TAE缓冲液来分离反应产物，其中将约1.9kb的PCR产物带从该凝胶中切除并根据制造商的说明使用PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，英国)进行纯化。根据制造商的说明，使用IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的BD生物科学公司(BDBiosciences,Palo Alto,CA,USA))，将与草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因对应的DNA克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉属表达载体中。这一线性化的载体构建是如WO 2005/042735A1所述的。
将2μl体积的连接混合物用于转化25μl的融合蓝色(Fusion Blue)大肠杆菌细胞(包括在IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒中)。在42℃热休克45sec并在冰中冷却之后，添加250μl的SOC培养基，并且将这些细胞在225rpm、在37℃孵育90min，随后铺在每ml含50μg氨苄西林的LB琼脂板上，并在37℃培养过夜。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm、在37℃孵育过夜。根据制造商的说明使用微型JETSTAR(德国Genomed公司)纯化来自所选择的菌落的质粒DNA。在异源表达之前通过桑格测序(Sanger sequencing)来验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因序列。选择这些质粒之一用于进一步表达，并将其命名为XYZ XYZ1471-4。
如WO 95/02043所述地制备黑曲霉MBin118的原生质体。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的XYZ1471-4质粒相混合，并且添加250微升的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem))(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2、以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)并轻轻混合。在37℃孵育该混合物30分钟并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(Cove,1996,Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]133:51-56)(1M)板上将原生质体与6％的低熔琼脂糖(惠泰克生物分子应用公司(Biowhittaker MolecularApplications))相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(1M)板以用于转化株选择(每板4ml顶层琼脂)。在37℃下孵育5天之后，挑取十六个转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2％麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶，即Griton XTPrecast凝胶(美国加利福尼亚州伯乐公司(BioRad,CA,USA))上分析来自每个孔的10μl培养液，以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力鉴别最好的转化株。在原始转化板上鉴别所选择的转化株并将其以孢子形式保存在20％甘油贮备物中并冷冻保存(-80℃)。
培养：在100ml的MLC培养基中接种所选择的转化株并在30℃在旋转振荡器上的500ml摇瓶中培养2天。将3ml的培养液接种到100ml的M410培养基中并在30℃培养3天。将培养液离心并使用0.2μm的膜滤器过滤上清液。
α-环糊精亲和凝胶。使十克环氧基活化的琼脂糖6B(英国查尔方特圣吉尔斯的通用电气医疗集团(GE Healthcare,Chalfont St.Giles,U.K))粉末悬浮在蒸馏水中并在烧结玻璃过滤器上用蒸馏水进行洗涤。使凝胶悬浮于偶合溶液(100ml的12.5mg/mlα-环糊精，0.5M NaOH)并在室温孵育一天，同时轻轻振荡。在烧结玻璃过滤器上使用蒸馏水洗涤该凝胶，并使其悬浮在pH 10的100ml的1M乙醇胺中，并在50℃孵育4小时以进行封闭。随后使用pH 8的50mM Tris-HCl和可替代地pH 4.0的50mM NaOAc洗涤该凝胶若干次。最后使用平衡缓冲液(50mM NaOAc，150mM NaCl，pH 4.5)将该凝胶装填在35-40ml的柱中。
从培养液纯化葡糖淀粉酶。通过0.22μm PES过滤器过滤来自具有葡糖淀粉酶基因的黑曲霉MBin118的发酵的培养液，并施加在之前在50mM NaOAc、150mM NaCl、pH 4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。
检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合α-环糊精亲和凝胶。然后相对于pH 5.0的20mM NaOAc，对经纯化的葡糖淀粉酶样品进行透析。最后通过SDS-PAGE检查纯度并且仅发现一条单独的带。
实例8：草酸青霉菌葡糖淀粉酶的定点变体的构建和表达
用实例7所述的质粒XYZ1471-4、使用以下所示的引物K79V F和K79VR(这两个引物被设计成用于将成熟序列的位置79处的赖氨酸(K)取代为缬氨酸(V))以及以下所示的引物F-NP003940和R-NP003940(这两个引物基于已知的序列和添加的标志来设计以用于通过IN-FUSIONTM策略直接克隆)进行两个PCR反应。
引物K79V F 18mer GCAGTCTTTCCAATTGAC(SEQ ID NO:25)
引物K79V R 18mer AATTGGAAAGACTGCCCG(SEQ ID NO:26)
引物F-NP003940:5’
ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC(SEQ ID NO:27)
引物R-NP003940:5’
AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQ ID NO:28)
在以下所述的条件下使用PTC-200DNA引擎进行PCR。
根据制造商的说明通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。根据制造商的说明，使用IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的BD生物科学公司)将所得的纯化的两个片段克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉属表达载体中。这一线性化的载体构建是如WO 2005/042735A1所述的。
使用连接混合物来转化大肠杆菌DH5α细胞(东洋公司(TOYOBO))。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm、在37℃孵育过夜。根据制造商的说明使用凯杰质粒微型试剂盒(凯杰公司)从所选择的菌落纯化质粒DNA。在异源表达之前验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶定点变体基因序列的序列，并选择这些质粒之一来用于进一步表达并且将其命名为pPoPE001。
如WO 95/02043所述地制备黑曲霉MBin118的原生质体。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的pPoPE001质粒相混合，并且添加250微升的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem))(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2、以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)并轻轻混合。在37℃孵育该混合物30分钟，并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(Cove,1996,Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]133:51-56)中将原生质体与1％的琼脂糖L(日本基因公司(Nippon Gene))相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖板上以用于转化株选择(每板4ml顶层琼脂)。在37℃下孵育5天之后，挑取十六个转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2％麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE凝胶上分析来自每个孔的10μl培养液以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力来鉴别最好的转化株。
实例9：定点Po AMG变体PE001的纯化
将所选择的变体转化株和表达实例6所述的野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的菌株培养在100ml的YP-2％麦芽糖培养基中，并且将培养物通过0.22μm PES过滤器过滤，并施加在之前于50mM NaOAc、150mM NaCl、pH 4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mM β-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。
检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合α-环糊精亲和凝胶。然后相对于pH 5.0的20mM NaOAc，对经纯化的葡糖淀粉酶样品进行透析。
实例10：PE001蛋白酶稳定性的表征
将40μl在50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中的酶溶液(1mg/ml)与1/10体积的1mg/ml蛋白酶溶液相混合，该蛋白酶是例如在Biochem J.[生物化学杂志]1975年4月；147(1):45-53中所述的曲霉酸性蛋白酶(aspergillopepsin)I、或从西格玛公司(Sigma)可商购的产品以及在Biochemical journal[生物化学杂志][0264-6021]Ichishima 2003年第371卷iss:Pt 2第541页中所述的奥瑞素(aorsin)，并且在4℃或32℃下孵育过夜。作为对照实验，将H2O而不是蛋白酶添加到样品之中。将样品装载在SDS-PAGE上以查看葡糖淀粉酶是否被蛋白酶切割。
在SDS-PAGE中，PE001仅示出与完整分子相对应的一条带，而野生型葡糖淀粉酶被蛋白酶降解并且示出60kCa的更低分子大小的一条带。
表12.蛋白酶处理之后的SDS-PAGE结果
N.D.：未检测到。
实例11：培养过程中更少切割
在32℃下将变体和野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的曲霉属转化株在含有4X稀释的、补充有10mM乙酸钠缓冲液的YP-2％麦芽糖培养基(pH 4.5)的6孔MT板中培养1周。
将培养物上清液装载在SDS-PAGE上。
表13.培养物上清液的SDS-PAGE结果
N.D.：未检测到。
在发酵过程中野生型葡糖淀粉酶被宿主蛋白酶切割，而变体则仅产生完整的分子。
实例12：与亲本相比，变体的葡糖淀粉酶活性
针对野生型草酸青霉菌的纯化的酶和变体葡糖淀粉酶检查如上文所述作为AGU测量的葡糖淀粉酶活性。
葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：0.1M醋酸盐，反应时间：6分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。
表14.
实例13：具有增强的热稳定性的葡糖淀粉酶变体的纯化
可以类似于实例8中描述的程序构建并表达显示出增加的热稳定性的变体。所有变体菌源自PE001。在YPM培养基中表达以后，将包含T65A或Q327F取代的变体如下进行微纯化：
通过经由0.22μm过滤器过滤除去菌丝体。向滤板(沃特曼公司(Whatman)，Unifilter 800μl，25-30μm MBPP)的孔中添加50μl柱材料(根据制造商的推荐，与Mini-Leak二乙烯砜活化的琼脂糖培养基偶联的α-环糊精)。通过两次添加200μl缓冲液，用结合缓冲液(200mM乙酸钠，pH 4.5)平衡该柱材料，剧烈震荡10min(海道尔夫公司(Heidolph)，Titramax 101，1000rpm)并且通过真空除去缓冲液(沃特曼公司，UniVac 3)。随后，添加400μl培养上清液和100μl结合缓冲液，并且在剧烈振荡下将板孵育30min。通过真空除去未结合的材料并且重复结合步骤。通常地，每个变体使用4个孔。然后通过添加200μl具有减少的离子强度的缓冲液(50/10/5mM乙酸钠，pH 4.5)进行三个洗涤步骤，振荡15min并且通过真空除去缓冲液。通过两次添加100μl洗脱缓冲液(250mM乙酸钠，0.1％α-环糊精，pH 6.0)洗脱结合的AMG，振荡15min并且通过真空收集在微量滴定板中的洗脱材料。将合并的洗脱物浓缩并且使用具有10kDa截留单位的离心过滤器(Millipore Microcon Ultracel YM-10)将缓冲液变为50mM乙酸钠，pH 4.5。将微纯化的样品保存在-18℃直到热稳定性测试。
实例14：蛋白质热解折叠分析(TSA，热转变测定(Thermal shift assay))
使用宝石橙(Sypro Orange)(英杰公司，S-6650)监测T65A和Q327F变体的蛋白质热解折叠并且使用实时PCR仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems)；一步一加(Step-One-Plus))进行。
在96孔板中，将25微升微纯化的、处于约100微克/ml的50mM乙酸盐(pH 4,5)中的样品与宝石橙(5:1)相混合(所得浓度＝5X；来自供应商的母液＝5000X)。用光学PCR密封件密封该平板。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。
使用宝石橙(Sypro Orange)(英杰公司，S-6650)监测E501V+Y504T变体的蛋白质热解折叠并且使用实时PCR仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems)；一步一加(Step-One-Plus))进行。
在96孔板中，在具有或不具有200ppm阿卡波糖(Acarbose)(西格玛公司A8980)的情况下，将15微升纯化的、处于约50微克/ml的50mM乙酸盐(pH 4,5)中的样品与宝石橙(1:1)相混合(所得浓度＝5X；来自供应商的母液＝5000X)。用光学PCR密封件密封该平板。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。
使用用于激发的内置(in-built)LED蓝光和ROX-滤波器(610nm，发射)每20秒监测荧光。
将Tm值计算为第一衍生物的最大值(dF/dK)(参考：Gregory等人；J BiomolScreen[生物分子筛选杂志]2009 14:700)。
表15a.
表15b.
实例15：通过差示扫描量热法(DSC)分析热稳定性
基本如在实例8中所描述构建在特定位置处具有取代和/或缺失的额外的位点特异性变体并且如在实例11中所描述进行纯化。
使用VP-毛细管差示扫描量热器(美国新泽西州皮斯卡塔韦的米克罗卡公司(MicroCal Inc.,Piscataway,NJ,USA))，通过差示扫描量热法(DSC)在pH 4.0或4.8处(50mM乙酸钠)测定纯化的Po-AMG PE001衍生的变体的热稳定性。在以200K/hr的恒定的程序化加热速率下，在选择的缓冲液(50mM乙酸钠，pH 4.0或4.8)中加热酶溶液后获得的热谱图(Cp对T)中，将热变性温度Td(℃)当作变性峰(主要的吸热峰)的顶端。
将样品和参比溶液(约0.3ml)从10℃下的储存条件装载到量热仪中(参考：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡10分钟，随后从20℃到110℃进行DSC扫描。以约+/-1℃的精确度测定变性温度。
分离的变体以及DSC数据披露于下表16中。
表16.
实例16：通过热应激测试和pNPG测定分析热稳定性
从来自实例15的经鉴别的取代变体之一(被鉴别为GA008)开始，通过热应激测定测试额外的变体，在该热应激测定中在83℃下热休克5min后，测定来自生长培养物的上清液的葡糖淀粉酶(AMG)活性。
在热休克以后，测量变体连同在非应激样品中的变体的残余活性。
Po-AMG pNPG活性测定的说明：
草酸青霉菌葡糖淀粉酶pNPG活性测定是一种光谱端点测定(spectrometricendpoint assay)，其中将样品一分为二并且进行热应激地和非热应激地测量。所以，数据输出是应激样品中的残余活性的量度。
生长：
向无菌微量滴定板(MTP)的每个孔中添加200μL富生长培养基(没有Dowfax的FTX-14)。将来自冻存物的感兴趣的菌株一式三份地直接接种在MTP中。在20个孔中接种基准物。将具有培养基的未接种的孔用作测定空白。将MTP放在包含湿巾的塑料箱中，以阻止孵育过程中来自这些孔的蒸发。将塑料箱在34℃放置4天。
测定：
将50μL上清液转移至50μL 0.5M NaAc(pH 4.8)中，以获得的准确的样品pH。
将50μL稀释物转移至PCR板上并且在PCR仪中在83℃下热应激5分钟。将剩余的一半稀释物保持在室温下。
将20μL的应激的和非应激的样品转移至标准MTP中。添加20μL pNPG-底物，以起始该反应。将该板在室温下孵育1小时。
终止该反应并且通过添加50μL 0.5M Na2CO3进行显色。在405nm处，在酶标仪(美谷分子仪器公司(Molecular Devices))上测量黄色。
缓冲液：
0.5M NaAc pH 4.8
0.25M NaAc pH 4.8
底物，6mM pNPG：
15mg在10mL 0.25NaAc(pH 4.8)中的4-硝基苯基D-吡喃葡萄糖苷
终止/显色溶液：
0.5M Na2CO3
数据处理：
在Excel中，来自应激和非应激样品两者的原始Abs405数据是用其对应的空白进行空白消减的。计算残余活性(％残余活性＝(Abs非应激-(Abs非应激-Abs应激))/Abs非应激*100％)并且相对于基准Po-amg0008绘图。
表17.
表18.
实例17：热稳定性变体的葡糖淀粉酶活性测试
已经使用在实例16中描述的pNPG测定证实了培养上清液中的在表15、16、和17中披露的所有上述变体的葡糖淀粉酶活性。
实例18：酿酒酵母菌株MBG5038和MBG5012的生产
菌株MBG5038和MBG5012源自育种和进化计划，这些计划对于玉米乙醇工业生产的重要特征而言以改进的发酵性能为目标。将能够利用作为唯一氮源的半胱氨酸并显示出增加的乙醇和温度耐受性的种群的菌株与组合了木糖利用率和低副产物产量的种群衍生的菌株交配(例如，根据美国专利号8,257,959中所述的育种方法)。将这些菌株与源自Ethanol的菌株交配，并筛选后代以鉴定具有增加的温度耐受性组合减少的副产物的菌株，从而最大化玉米醪发酵中乙醇的产量。针对其利用半胱氨酸的能力来筛选源自该育种程序的单倍体，并将其用于产生MBG5038(NRRLY67549)和MBG5038(NRRLY67700)。
实例19：在非应激条件下酿酒酵母菌株MBG5038的发酵
酿酒酵母菌株MBG5038和在以下条件下发酵：
醪液：Liquozyme LpH
固体：变化的
pH：5.0
葡糖淀粉酶：Spirizyme Achieve(诺维信公司)
葡糖淀粉酶剂量0.6AGU/g DS
分流(split)的葡糖淀粉酶分裂：50/50(在8h添加剩余物)
发酵时间：55h
温度32℃
规模：50g Ankom瓶
如图1和图2所示，与Ethanol相比，酿酒酵母菌株MBG5038表现出增加的乙醇产量和减少的甘油水平。
实例20：在应激条件下酿酒酵母菌株MBG5038的发酵
酿酒酵母菌株MBG5038和Ethanol在以下条件下发酵：
醪液：Avantec Amp
固体34.51％
葡糖淀粉酶：Spirizyme Excel(诺维信公司)
葡糖淀粉酶剂量：0.6AGU/g DS
发酵时间：54h
温度：32℃(7h)→35℃(16h)→32℃(31h)
规模：5g试管
如图3和图4所示，在有机酸(乳酸/乙酸)的存在下，与Ethanol相比，酿酒酵母菌株MBG5038表现出增加的乙醇产量和减少的残留葡萄糖。
实例21：在非应激条件下酿酒酵母菌株MBG5012的发酵
酿酒酵母菌株MBG5038和在以下条件下发酵：
醪液：补充有麦芽糖糊精的Avantec Amp
固体：35％最终(35％固体液化物+麦芽糖糊精以达到38％总固体)
pH：5.0
葡糖淀粉酶：Spirizyme Excel(诺维信公司)
葡糖淀粉酶剂量0.6AGU/g DS
分流的葡糖淀粉酶分裂：50/50(在8h添加剩余物)
发酵时间：54h
温度32℃
规模：5g试管
如图5和图6所示，与Ethanol相比，酿酒酵母菌株MBG5012表现出增加的乙醇产量和减少的残留葡萄糖。
实例22：在应激条件下酿酒酵母菌株MBG5012的发酵
酿酒酵母菌株MBG5012和Ethanol在以下条件下发酵：
醪液：Avantec Amp
固体34.51％
pH：5.0
葡糖淀粉酶：Spirizyme Excel(诺维信公司)
葡糖淀粉酶剂量：0.6AGU/g DS
发酵时间：54h
温度：32℃(7h)→35℃(16h)→32℃(31h)
规模：5g试管
如图7和图8所示，在有机酸(乳酸/乙酸)的存在下，与Ethanol相比，酿酒酵母菌株MBG5012表现出增加的乙醇产量和减少的残留葡萄糖。

Claims (14)

1.一种用于从含淀粉材料生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用α-淀粉酶液化该含淀粉材料；
ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用发酵生物进行发酵；
其中该发酵生物为：
(1)酿酒酵母菌株MBG5038，在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏；或
(2)酿酒酵母菌株MBG5012，在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏；以及
其中所述菌株MBG5038和菌株MBG5012能够利用半胱氨酸作为唯一氮源。
2.一种选自以下的酵母菌属菌株：
酿酒酵母菌株MBG5038，在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏；以及
酿酒酵母菌株MBG5012，在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏；以及
其中所述菌株MBG5038和菌株MBG5012能够利用半胱氨酸作为唯一氮源。
3.如权利要求2所述的酵母菌属酵母菌株，其中该菌株能够在作为唯一碳源的木糖上生长。
4.如权利要求2所述的酵母菌属酵母菌株，其中该菌株包含选自以下的一个或多个性质和定义特征：
(a)在玉米醪发酵中的相同条件下，在发酵的最初20小时内，产生比在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏的酿酒酵母菌株Ethanol更高的乙醇滴度；
(b)在玉米醪发酵中的相同条件下，在发酵50小时后，剩余比在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏的酿酒酵母菌株Ethanol更少的残余葡萄糖；
(c)在玉米醪发酵中的相同条件下，在发酵50小时后，具有比在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏的酿酒酵母菌株Ethanol更高的乙醇产量。
5.如权利要求2所述的酵母菌属酵母菌株，其中在相同方法条件下，该菌株能够比在澳大利亚维多利亚州国家计量研究所、在登录号V14/007039下保藏的酿酒酵母菌株Ethanol提供大于1.0％的乙醇产量提升。
6.一种生产分别显示菌株MBG5038或MBG5012的定义特征的在美国农业研究服务专利菌种保藏中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67549下保藏的酿酒酵母菌株MBG5038或在美国伊利诺伊州皮奥瑞亚的大学街1815号的美国农业研究服务专利菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)、在登录号NRRL Y67700下保藏的酿酒酵母菌株MBG5012的衍生物的方法，该方法包括：
(a)提供：
(i)第一酵母菌株；和
(ii)第二酵母菌株，其中该第二酵母菌株是上述菌株MBG5038、MBG5012；
(b)在允许第一和第二酵母菌株之间DNA组合的条件下，培养第一酵母菌株和第二酵母菌株；以及
(c)筛选或选择菌株的衍生物。
7.如权利要求6所述的方法，其中步骤(c)包括筛选或选择表现出上述菌株MBG5038或MBG5012的一个或多个定义特征的杂合菌株。
8.如权利要求6所述的方法，该方法包括另外的步骤：
(d)用从步骤(c)筛选或选择的菌株作为该第一和/或第二菌株重复步骤(b)和(c)，直到获得显示出上述菌株MBG5038或MBG5012的定义特征的衍生物。
9.如权利要求6所述的方法，其中该培养步骤(b)包括：
(i)使该第一酵母菌株和该第二酵母菌株形成孢子；和
(ii)将该第一酵母菌株产生的萌发的孢子与该第二酵母菌株产生的萌发的孢子进行杂交。
10.一种生产乙醇的方法，该方法包括将如权利要求2所述的菌株与包含可发酵糖的底物在允许可发酵糖发酵生成乙醇的条件下一起孵育。
11.一种生产酒糟的方法，该方法包括：
(a)将如权利要求2所述的酵母菌属菌株与包含可发酵糖的底物在允许可发酵糖发酵生成乙醇和酒糟的条件下一起孵育；和
(b)分离该酒糟。
12.一种组合物，该组合物包含如权利要求2所述的酵母菌属酵母菌株、和一种或多种选自以下的天然存在和/或非天然存在的组分：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、和抗氧化剂。
13.一种产生如权利要求2所述的酵母菌属酵母的重组衍生物的方法，该方法包括使用重组DNA技术将核酸引入如权利要求2所述的酵母菌属酵母。
14.如权利要求13所述的方法，其中该引入的核酸表达葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
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