CN1902310B - 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的分离多肽和编码所述多肽的分离多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞，以及生产和使用所述多肽的方法。

Description

具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸

关于受到联邦政府资助的研究与开发的发明权利的声明 

本发明是在受到政府资助的由能源部签订的主要合同DE-AC36-98GO10337的NREL转包合同NO.ZCO-30017-02下做出的。政府拥有本发明的一些权利。 

发明背景 

发明领域

本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的分离多肽和编码所述多肽的分离多核苷酸。本发明还涉及含有所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用所述多肽的方法。

相关领域的描述

纤维素是单糖葡萄糖通过β-1，4-连接键共价键合的聚合物。许多微生物产生水解β-连接葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在任意位置消化纤维素聚合物，使其易受纤维二糖水解酶的攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的水溶性β-1，4-连接二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。

将纤维素原料转变成乙醇具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋物质、以及乙醇燃料的清洁性。现在认为木材、农业残余物、草本作物、和城市固体废物是生产乙醇的原料。这些物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转变成葡萄糖，就容易通过酵母将葡萄糖发酵成乙醇。由于容易通过各种酵母将葡萄糖发酵成乙醇，而纤维二糖则不能，因此在水解结束时残余的任何纤维二糖都代表着乙醇产量的损失。更重要的是，纤维二糖是内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的有效抑制剂。纤维二糖在水解过程中的累积极度不利于乙醇生产。

纤维二糖的累积在酶促水解中已经成为一个主要问题，因为产生纤维素酶的微生物几乎不产生β-葡糖苷酶。β-葡糖苷酶的量少导致将纤维二糖水解成葡萄糖的能力不足。已有几种方法用于在将纤维素转变成葡萄糖时增加β-葡糖苷酶的量。

一种方案是使用几乎不产生纤维素酶的微生物产生β-葡糖苷酶，且向内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶中外源性的添加β-葡糖苷酶，从而增强水解。然而对于将生物量(biomass)转变成乙醇的商业生产而言，所需数量太昂贵了。

第二种方案是在进行纤维素水解的同时通过酵母进行葡萄糖发酵。这个过程称为同步糖化和发酵(SSF)。在SSF系统中，葡萄糖发酵从溶液中除去了葡萄糖。然而SSF系统在商业上尚不可行，因为对于所需要的50℃条件而言，28℃的酵母操作温度太低了。

克服β-葡糖苷酶不足的第三种方案是在宿主中过度表达β-葡糖苷酶，从而增加β-葡糖苷酶的产量。

Ximenes等人，1996，Current Microbiology 32：119-123；Hang和Woodams，1994，Lebensmittel-Wissenschaft and Technologie 27：587-589；以及Kitpreechavanich等人，Agricultural and Biological Chemistry 50：1703-1712公开了来自烟曲霉(Aspergilllus fumigatus)的β-葡糖苷酶。

在本领域非常有利的是，为了提高工艺效率而使用热稳定的β-葡糖苷酶将纤维素物质转变成单糖、二糖、和多糖。

本发明的一个目的是提供具有β-葡糖苷酶活性的新型多肽和编码所述多肽的核酸。

发明概述

本发明涉及选自下列的具有β-葡糖苷酶活性的分离多肽：

(a)具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸具有至少85％的同一性；

(b)由如下核苷酸序列编码的多肽，该核苷酸序列在至少高严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸，(ii)SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互补链发生杂交；和

(c)在SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸含有一个或多个氨基酸的保 守替代、删除、和/或插入的变体。

本发明还涉及选自下列的编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离多核苷酸：

(a)编码具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，该氨基酸本发明还涉及编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的植物。

位氨基酸具有至少85％的同一性；

(b)与SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸具有至少85％同一性的多核苷酸；和

(c)在至少高严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸，(ii)SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互补链发生杂交的多核苷酸。

本发明还涉及含有多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、和重组宿主细胞。

本发明还涉及生产这些具有β-葡糖苷酶活性的多肽的方法，包括在有助于生产所述多肽的条件下培养包含核酸构建体的重组宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的多核苷酸；并(b)回收所述多肽。

本发明还涉及含有具有β-葡糖苷酶活性的多肽的洗涤剂组合物。

本发明还涉及编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的植物。

本发明还涉及使用具有β-葡糖苷酶活性的多肽将纤维素物质转变成单糖、二糖和多糖。

本发明还涉及包含编码一种蛋白质的基因的核酸构建体，其中所述基因可操作连接由SEQ ID NO：1第1至57位核苷酸组成的编码信号肽的核苷酸序列，其中所述基因对于第一种和第二种核苷酸序列而言是外源的。

附图简述

图1A和1B显示了烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶的基因组DNA序列和推导氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1和2)。预测的信号肽标以下划线，预测的内含子以斜体表示。

图2显示了pAlLo1的限制性图谱。

图3显示了pBANe10的限制性图谱。

图4显示了pAILo2的限制性图谱。

图5显示了pEJG97的限制性图谱。

图6显示了pMJ04的限制性图谱。

图7显示了pMJ06的限制性图谱。

图8显示了pMJ09的限制性图谱。

图9显示了pEJG107的限希制性图谱。

图10显示了烟曲霉β-葡糖苷酶在50℃和65℃的热稳定性。

图11显示了烟曲霉β-葡糖苷酶在70℃的热稳定性。

图12显示了烟曲霉β-葡糖苷酶在65℃对纤维二糖的水解。

定义

β-葡糖苷酶活性：这里术语“β-葡糖苷酶”定义为β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，它催化末端非还原的β-D-葡萄糖残基水解而释放β-D-葡萄糖。对本发明而言，可根据Venturi等人所描述的基本程序来测定β-葡糖苷酶活性(参见Venturi等人，2002，J.Basic Microbiol.42：55-66)，不同的只是使用不同于这里所描述的条件。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为在50℃、pH5下，在100mM柠檬酸钠、0.01％吐温(Tween)-20中每分钟从4mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃苷底物中产生1.0μmol对硝基酚。

GH3AA家族β-葡糖苷酶：这里术语“GH3AA家族β-葡糖苷酶”定义为根据Coutinho，P.M.和Henrissat，B.，1999，Carbohydrate-active enzymes：anintegrated database approach，在《Recent Advances in CarbohydrateBioengineering》中，H.J.Gilbert、G.Davies、B.Henrissat、和B.Svensson编，The Royal Society of Chemistry，Cambridge，pp.3-12中描述的家族3糖苷水解酶。

本发明的多肽具有由SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸所示氨基酸序列组成的多肽的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，且甚至最优选至少100％的β-葡糖苷酶活性。

分离的多肽：这里使用的术语“分离的多肽”指至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，还更优选至少80％纯，最优选至少90％纯，且甚至最优选至少95％纯的多肽，这是通过SDS-PAGE测定的。

基本上纯的多肽：这里术语“基本上纯的多肽”指一种多肽制剂，其中包含至多10％、优选至多8％、更优选至多6％、更优选至多5％、更优选至多 4％、至多3％、甚至更优选至多2％、最优选至多1％、且甚至最优选至多0.5％重量的与该多肽制剂天然相关的其它多肽物质。因此，优选的是基本上纯的多肽是制剂中存在的全部多肽物质的重量的至少92％纯的，优选至少94％纯的，更优选至少95％纯的，更优选至少96％纯的，更优选至少96％的纯的，更优选至少97％纯的，更优选至少98％纯的，甚至更优选至少99％纯的，最优选至少99.5％纯的，且甚至最优选100％纯的。

优选的是本发明的多肽以基本上纯的形式存在。特别是，优选多肽是以“基本上纯的形式”存在，即该多肽制剂基本上不含其它与之天然相关的多肽物质。例如，这可通过采用众所周知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来完成。

这里术语“实质上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”含义相同。

同一性：这里用参数“同一性”来描述两种氨基酸序列之间或两种核苷酸序列之间的相关性。

对本发明来说，两种氨基酸序列之间的同一性程度可通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)用同一性表及后面的多重对比参数进行测定：缺口(gap)罚分10和缺口长度罚分10。成对对比参数：Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口(windows)＝5和对角线＝5。

对本发明来说，两种核苷酸序列之间的同一性程度可通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the NationalAcademy of Science USA 80：726-730)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM 软件(DNASTAR公司，Madison，WI)用同一性表及后面的多重对比参数进行测定：缺口罚分10和缺口长度罚分10。成对对比参数：Ktuple＝3，缺口罚分＝3，和窗口(windows)＝20。

多肽片段：这里术语“多肽片段”定义为从SEQ ID NO：2其同源序列的氨基和/或羧基末端或删除一个或多个氨基酸的多肽，其中所述片段具有β-葡糖苷酶活性。优选的是，一种片段含有至少770个氨基酸残基，更优选至少800个氨基酸残基，且最优选至少830个氨基酸残基。

子序列：这里术语“子序列”定义为由SEQ ID NO：1或其同源序列的5′和/或3′末端删除一个或多个核苷酸的核苷酸序列，其中子序列编码具有β- 葡糖苷酶活性的多肽片段。优选的是，子序列含有至少2310个核苷酸，更优选至少2400个核苷酸，且最优选至少2490个核苷酸。

等位变体：这里术语“等位变体”指占据同一染色体基因座的基因的两种或多种可变形式中的任一种。等位变异可由突变自然引起，并可引起种群内多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有变化)或可编码氨基酸序列改变的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：这里使用的术语“分离的多核苷酸”指至少20％纯的，优选至少40％纯的，更优选至少60％纯的，甚至更优选至少80％纯的，最优选至少90％纯的，且甚至最优选至少95％纯的多肽，这是通过琼脂糖电泳测定的。

基本上纯的多核苷酸：这里使用的术语“基本上纯的多核苷酸”指不含其它外来的或不需要的核苷酸的多核苷酸制剂，并且其存在的形式适于在基因工程蛋白质生产系统内进行使用。因此，基本上纯的多核苷酸包含至多10％、优选至多8％、更优选至多6％、更优选至多5％、更优选至多4％、更优选至多3％、甚至更优选至多2％、最优选至多1％、且甚至最优选至多0.5％重量的其它与之天然相关的多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5′和3′非翻译区，诸如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸是从重量上至少90％纯的、优选至少92％纯的、更优选至少94％纯的、更优选至少95％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少97％纯的、甚至更优选至少98％纯的、最优选至少99％纯的、且甚至最优选至少99.5％纯的。优选的是本发明的多核苷酸以实质上纯的形式存在。特别是，优选的是这里公开的多核苷酸以″基本上纯的形式″存在，即多核苷酸制剂基本上不含其它与之天然相关的多核苷酸物质。这里术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”含义相同。多核苷酸可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成、合成来源或其任意组合。

cDNA：这里术语“cDNA”定义为DNA分子，它可通过逆转录由真核细胞获得的成熟的、经过剪接的mRNA分子而制备。cDNA缺乏通常在相应基因组DNA中存在的内含子序列。最初的初级RNA转录本是mRNA的前体，它在成为成熟剪接的mRNA之前要经过一系列加工步骤。这些步骤包括通过称为剪接的过程除去内含子序列。因此，由mRNA衍生的cDNA缺乏所有的内含子序列。

核酸构建体：这里所使用的术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，它是由天然存在的基因分离的，或是经过修饰而以非天然存在的方式含有核酸区段。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。

控制序列：这里术语“控制序列”定义为包括所有对表达编码本发明多肽的多核苷酸所必需的或有利的组分。对编码多肽的核苷酸序列来说，各个控制序列可以是天然的或外来的。这些控制序列包括，但不局限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。为了引入特异限制性位点以便于控制序列与编码多肽的核苷酸序列编码区连接，控制序列可以带有接头。

可操作连接：这里术语“可操作连接”指这样一种构造，其中控制序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，以使控制序列可指导多肽编码序列的表达。

编码序列：这里所使用的术语“编码序列”意指核苷酸序列，它直接规定了其蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放读码框确定，所述开放阅读框通常起始于ATG起始密码子或备选起始密码子诸如GTG和TTG。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

表达：术语“表达”包括生产多肽涉及的所有步骤，包括但不局限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

表达载体：这里术语“表达载体”定义为线状的或环状的DNA分子，它含有编码本发明多肽的多核苷酸，且其与提供其表达的其它核苷酸可操作连接。

宿主细胞：这里所使用的“宿主细胞”包括易于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导、等等的所有细胞类型。

修饰：这里术语“修饰”是指对由SEQ ID NO：2或其同源序列第20至863位氨基酸组成的多肽的任何化学修饰以及对编码该多肽的DNA的基因操作。修饰可以是一个或多个氨基酸的替代、缺失和/或插入，以及一个或多个氨基酸侧链的替换。

人工变体：这里所使用的术语“人工变体”是指具有β-葡糖苷酶活性的多肽，它是由表达经修饰的核苷酸序列SEQ ID NO：1或其同源序列或其成熟编码区的生物体产生的。经修饰的核苷酸序列可通过人工干预对SEQ ID NO：1中所公开的核苷酸序列或其同源序列或其成熟编码区进行修饰来获得。

发明详述

具有β-葡糖苷酶活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的分离多肽，所述多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸(即成熟多肽)具有至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％、且甚至最优选至少97％的同一性程度(下文的“同源多肽”)。在一个优选的方面，同源多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸相差10个氨基酸、优选5个氨基酸、更优选4个氨基酸、甚至更优选3个氨基酸、最优选2个氨基酸、且甚至最优选1个氨基酸。

本发明的多肽优选含有氨基酸序列SEQ ID NO：2或其等位变体；或其具有β-葡糖苷酶活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含氨基酸序列SEQ IDNO：2。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸或其等位变体；或其具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸。在另一个优选的方面，多肽由氨基酸序列SEQ ID NO：2或其等位变体；或其具有β-葡糖苷酶活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由氨基酸序列SEQ ID NO：2组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸或其等位变体；或其具有β-葡糖苷酶活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ IDNO：2第20至863位氨基酸组成。

在第二个方面，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有β-葡糖苷酶活性的分离多肽，该多核苷酸在非常低的严谨度条件、优选低严谨度条件、更优选中等严谨度条件、更优选中等-高严谨度条件、甚至更优选高严谨度条件、且最优选非常高的严谨度条件下与(i)SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸；(ii)SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸所含cDNA序列；(iii)，(i)或(ii)的子序列，或(iv)，(i)、(ii)或(iii)的互补链发生杂交(J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO：1的子序列包含至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。另外，子序列可能编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽片段。

根据本领域众所周知的方法，可以使用核苷酸序列SEQ ID NO：1或其子序列以及氨基酸序列SEQ ID NO：2或其片段来设计核酸探针，用于从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的DNA。特别是，遵循标准的Southern印迹程序，可以将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA进行杂交，从而鉴定和分离其中的相应基因。这些探针可以比完整序列短得多，但是长度应当是至少14个、优选至少25个、更优选至少35个、且最优选至少70个核苷酸。然而，优选的是核酸探针的长度是至少100个核苷酸。例如，核酸探针的长度可以是至少200个核苷酸、优选至少300个核苷酸、更优选至少400个核苷酸、或最优选至少500个核苷酸。可以使用甚至更长的探针，例如长度是至少600个核苷酸、优选至少700个核苷酸、更优选至少800个核苷酸、或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针都可使用。通常将探针进行标记，用于检测相应的基因(例如用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)。本发明涵盖这些探针。

因此可从这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA库中筛选出与上述探针发生杂交且编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的DNA。来自这些其它生物体的基因组或其它DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移并固定在硝酸纤维素或其它适宜载体材料上。为鉴定与SEQ ID NO：1或其子序列同源的克隆或DNA，将载体材料用于Southern印迹。

对本发明而言，杂交是指在极低至极高的严谨度条件下将核苷酸序列与经标记的核酸探针进行杂交，其中核酸探针相当于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列、SEQ ID NO：1所含cDNA序列、其互补链、或其子序列。在这些条件下与核酸探针发生杂交的分子可用X射线胶片检测。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸。在另一个优选的方面，核酸探针是编码多肽SEQ ID NO：2或其子序列的多核苷酸序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1或其互补链。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。在另一个优选的方面，核酸探针是包含在质粒pEJG113中的多核苷酸序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRL B-30695中，其中其多核苷酸序列编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一个优选的方面，核酸探针是包含在质粒pEJG113中的成熟多肽编码区，所述质粒包含在大肠杆菌NRRL B-30695中。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针来说，极低至极高的严谨度条件规定为遵循标准Southern印迹程序，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml经剪切且经变性的鲑精DNA、和用于极低和低严谨度的25％甲酰胺、用于中等和中等-高严谨度的35％甲酰胺或高和极高严谨度的50％甲酰胺中进行最佳12-24小时的预杂交和杂交。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针来说，最后优选在至少45℃(极低严谨度)、更优选在至少50℃(低严谨度)、更优选在至少55℃(中等严谨度)、更优选至少在60℃(中等-高严谨度)、甚至更优选在至少65℃(高严谨度)、且最优选在至少70℃(极高严谨度)下将载体材料用2×SSC、0.2％SDS洗涤3次，每次15分钟。

对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针来说，严谨度条件规定为遵循标准Southern印迹程序，在比根据Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)计算的Tm计算值低大约5℃至大约10℃的温度下，在每毫升0.9M NaCl、0.09MTris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X Denhardt氏溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP、和0.2mg/ml酵母RNA中进行最佳12至24小时的预杂交、杂交、和杂交后的洗涤。

对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针来说，将载体材料在比Tm计算值低大约5℃至10℃的温度下在6X SCC加0.1％SDS中洗涤1次15分钟，然后用6X SSC洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及SEQ ID NO：2或其同源序列或其成熟多肽的含有一个或多个氨基酸保守替代、删除、和/或插入的人工变体。优选的是，氨基酸改变的性质较小，也就是说不会明显影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸替代；一般是1个至大约30个氨基酸的小段删除；小段氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端的甲硫氨酸残基；可达大约20-25个残基的小段接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而易于纯化的小段延伸，诸如多组氨酸序列段、抗原性表位、或结合结构域。

保守替代的例子在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)各组 内。通常不改变特异活性的氨基酸替代是本领域所熟知的，例如H.Neurath和R.L.Hill在《The Proteins》中所述(1979，Academic Press，New York)。最常发生的替代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

除20种标准氨基酸之外，也可用非标准氨基酸(诸如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸、和α-甲基丝氨酸)来替代野生型多肽的氨基酸残基。可用有限数目的非保守氨基酸，并非由遗传密码编码的氨基酸，和非天然氨基酸来替代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后受到修饰，和/或在它们的侧链上具有与标准氨基酸不同的化学结构。可化学合成非天然氨基酸，优选的是可在市场上买到的，包括2-哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的，氨基酸改变是本质是改变多肽的物理化学特性的氨基酸改变。例如，氨基酸改变可提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最佳pH等等。

可根据本领域已知方法来确定亲本多肽中的关键氨基酸，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一技术中，在分子中的每个残基处引入单一的丙氨酸突变，并对得到的突变体分子检验生物学活性(即β-葡糖苷酶活性)从而确定对分子活性至关重要的氨基酸残基。也可参见Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，通过诸如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记测定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。例如参见de Vos等人，1992，Science 255：06-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.309：59-64。也可从与本发明多肽相关多肽的同一性分析来推断关键氨基酸的身份。

可用已知的诱变、重组、和/或改组方法来进行单一或多个氨基酸的替代和检测，随后进行相应的筛选程序，诸如Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所公开的。可使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人，1991，Biochem.30： 10832-10837；U美国专利号5,223,409；WO 92/06204)、和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等人，1986，Gene 46：145；Ner等人，1988，DNA 7：127)。

可将诱变/改组方法与高通量、自动筛选方法相结合，用于检测由宿主细胞表达的克隆的、经诱变多肽的活性。可使用本领域的标准方法从宿主细胞回收编码活性多肽的经诱变DNA分子并迅速测序。这些方法可快速测定所研究多肽中单个氨基酸残基的重要性，并可应用于结构未知的多肽。

SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸中氨基酸替代、缺失、和/或插入的总数为10、优选9、更优选8、更优选7、更优选至多6、更优选5、更优选4、甚至更优选3、最优选2、且甚至最优选1。

具有β-葡糖苷酶活性的多肽的来源

可从任何属的微生物中获得本发明的多肽。对本发明来说，这里所使用的与指定来源相关的术语“从...中获得”是指由核苷酸序列编码的多肽是由来源或来自于来源的核苷酸序列已经插入其中的菌株产生的。在一个优选的方面，从指定来源获得的多肽分泌到细胞外。

本发明的多肽可以是真菌多肽，且更优选酵母多肽，诸如假丝酵母属(Candida)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia属多肽；或更优选丝状真菌多肽，诸如小枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptocoecus)、Filibasidium属、镰孢属(Fusarium)、腐质菌属(Humicola)、Magnaporthe属、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix属、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces属、裂褶菌属(Shizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉属(Thielavia)、Tolypocladium属、或木霉属(Trichoderma)多肽。

在一个优选的方面，多肽是具有β-葡糖苷酶活性的卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、道拉斯糖酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗糖酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地糖酵母 (Saccharomyces norbensis)、或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个优选的方面，多肽是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷孢镰孢(Fusarium cereals)、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporium)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariums sulphureum)、近念珠状镰孢(Fusarium torulosum)、单端孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、有毒镰孢(Fusarium venenatum)、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在另一个优选的方面，多肽是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、或米曲霉(Aspergillus oryzae)多肽。

在一个更优选的方面，多肽是烟曲霉多肽，SEQ ID NO：2的多肽。

对上述物种，应理解的是，不管已知的种名是什么，本发明既包括完全阶段和不完全阶段，还包括其它分类学等价物，例如无性型。本领域技术人员可很容易地识别出适当等价物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏机构为公众所得到，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures，CBS)、和农业研究机构专利培养物保藏中心北部研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern RegionalResearch Center，NRRL)。

此外，利用上述探针可从其它来源，包括从自然界(例如土壤、堆肥、 水等)中分离出的微生物中鉴定和获得这些多肽。从自然环境中分离微生物的技术在本领域技术是熟知的。然后可通过类似地筛选这样一种微生物的基因组或cDNA文库来获得多核苷酸。一旦用探针检测出编码多肽的多核苷酸序列，就可通过本领域技术人员所熟知的技术(例如参见Sambrook等人，1989，同上)分离或克隆此多核苷酸。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。可通过将编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合至本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。对于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，包括连接编码多肽的编码序列使之处于同一阅读框中，并使融合多肽的表达受相同启动子和终止子的控制。

多核苷酸

本发明还涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸。在一个优选的方面，核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。在另一个更加优选的方面，核苷酸序列是质粒pEJG113中所含的序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30695中。在另一个优选的方面，核苷酸序列是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。在另一个更加优选的方面，核苷酸序列是质粒pEJG113中所含的成熟多肽编码区，所述质粒包含在大肠杆菌NRRL B-30695中。本发明还涵盖编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽或其成熟多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1因遗传密码的简并性而不同。本发明还涉及编码具有β-葡糖苷酶活性的SEQ ID NO：2之片段的SEQ ID NO：1之子序列。

本发明还涉及在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一处突变的突变型多核苷酸，其中突变型核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸组成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域是已知的，包括从基因组DNA中分离，从cDNA中制备，或者两者的组合。例如，通过利用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或用抗体筛选表达文库以检测出具有共同结构特征的克隆DNA片段，可以实现从这些基因组DNA克隆本发明的多核苷酸序列。例如参见Innis等人，1990，PCR：A Guide to Methods andApplication，Academic Press，New York。还可以使用其它核酸扩增程序，诸如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)、和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可从曲霉属菌株或者另外的或相关的生物体中克隆得到多核苷酸，因此它可以是例如核苷酸序列中多肽编码区的等位或物种变体。

本发明还涉及具有如下核苷酸序列的编码活性多肽的多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列(即第58至3057位核苷酸)具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少为95％、且最优选至少97％的同一性程度。

为了合成与本发明多肽实质上类似的多肽，可能必需修饰编码多肽的核苷酸序列。术语与多肽“实质上类似”是指多肽的非天然存在形式。这些多肽可能因某些改造而区别于从其天然来源分离的多肽，例如在比活、热稳定性、最佳pH等方面不同的变体。可以在SEQ ID NO：1多肽编码区所呈现的核苷酸序列基础上构建变体序列，例如其子序列，和/或通过引入，它们不会导致由核苷酸序列编码的多肽具有另一种氨基酸序列、而是使之符合意图用来生产酶的宿主生物体的密码子使用率的核苷酸取代，或通过引入可导致不同氨基酸序列的核苷酸替代。对于核苷酸替代的一般说明可参见例如Ford等人，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

对本领域技术人员而言，很明显的是这些种替代可在分子功能的关键区域外面进行并且仍然可得到活性多肽。可根据本领域的已知方法来鉴别对于由本发明的分离多核苷酸所编码的活性多肽来说至关重要因此优选不进行替代的氨基酸残基，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如参见Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一种技术中，在分子中每一带正电荷残基处引入突变，然后对得到的突变分子检测β-葡糖苷酶活性以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可通过三维结构分析来确定，其中三维结构可由诸如核磁共振分析、晶体学、或光亲和标记这类技术进行测定(例如参见de Vos等人，1992，Science 255：306-312；Smith等人，1992，Journal of Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离多核苷酸，它在极低的严谨度条件、优选低严谨度条件、更优选中等严谨度、更优选中等-高严谨度条件、甚至更优选高严谨度条件、且最优选极高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸，(ii)SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸所含cDNA 序列，或(iii)，(i)或(ii)的互补链；或本文所述其等位变体和子序列发生杂交(Sambrook等人，1989，同上)。

本发明还涉及通过(a)在极低、低、中等、中等-高、高、或极高严谨度条件下将一群DNA与(i)SEQ ID NO：1第58至3057位核苷酸，(ii)SEQID NO：1第58至3057位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链进行杂交；并(b)分离发生杂交的多核苷酸来获得的编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包含可操作连接至一种或多种控制序列的本发明的分离多核苷酸的核酸构建体，所述控制序列在适当宿主细胞中在与控制序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可利用多种方法操作编码本发明多肽的分离多核苷酸以提供多肽的表达。根据表达载体的不同，可能希望或必需在将多核苷酸序列插入载体之前对其进行操作。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是为本领域所熟知的。

控制序列可以是适当的启动子序列，即受到宿主细胞识别、用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列包含调节多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中表现出转录活性的任意核苷酸序列，包括突变的、截短的、和杂合的启动子，并且其可从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因中获得。

在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体转录的启动子的适当实例是来自米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、有毒镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、有毒镰孢Daria(WO 00/56900)、有毒镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、瑞氏木霉β-葡糖苷酶、瑞氏木霉纤维二糖水解酶I、瑞氏木霉内切葡聚糖酶I、瑞氏木霉内切葡聚糖酶II、瑞氏木霉内切葡聚糖酶III、瑞氏木霉内切葡聚糖酶IV、瑞氏木霉内切葡聚糖酶V、瑞氏木霉木聚糖酶I、瑞氏木霉木聚糖酶II、瑞氏木霉β-木糖苷酶基因的启 动子，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的杂合启动子)；及其突变、截短、和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子是从啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母半乳糖激酶(GAL1)、啤酒糖酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、啤酒糖酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、啤酒糖酵母金属硫蛋白(CUP1)、和啤酒糖酵母3-磷酸甘油酸激酶基因中所获得的。Romanos等人在1992，Yeast 8：423-488中描述了其它对酵母宿主细胞有用的启动子。

控制序列也可以是适当的转录终止子序列，所述序列可由宿主细胞识别来终止转录。终止子序列可操作连接于编码多肽的核苷酸序列的3′端。任一在所选择的宿主细胞中起作用的终止子都可用于本发明。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯(anthranilate)合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因中获得。

对于酵母宿主细胞终止子优选从啤酒糖酵母烯醇化酶、啤酒糖酵母细胞色素C(CYC1)、和啤酒糖酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因中获得。Romanos等人在1992同上引文中描述了其它对酵母宿主细胞有用的终止子。

控制序列还可以是适当的前导序列，它是对宿主细胞翻译很重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核苷酸序列的5′端。任一在所选择的宿主细胞中起作用的前导序列都可用于本发明。

对于丝状真菌宿主细胞前导序列优选从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶基因中获得。

对于酵母宿主细胞优选的前导序列可从啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母3-磷酸甘油酸激酶、啤酒糖酵母α-因子、和啤酒糖酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因中获得。

控制序列也可是聚腺苷酸化序列，它是可操控连接于核苷酸序列3′端的序列，当转录时可被宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加到转录的mRNA上的信号。任一在所选择的宿主细胞中起作用的聚腺苷酸化序列都可用于本发明。

对于丝状真菌宿主细胞聚腺苷酸化序列优选来自于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。

Guo和Sherman等人在1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990中描述了对酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列。

控制序列还可以是信号肽编码区，它编码的氨基酸序列连接于多肽的氨基末端并指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5′端可固有的包含信号肽编码区，此信号肽编码区在翻译读码框中与编码分泌多肽的编码区段天然连接。或者，编码序列的5′端可以包含对编码序列是外来的信号肽编码区。如果编码序列天然不含信号肽编码区，则需要外来的信号肽编码区。或者，外来的信号肽编码区可简单地替换天然信号肽编码区以便增进多肽的分泌。然而，任一可指导表达的多肽进入所选择宿主细胞分泌途径的信号肽编码区均可用于本发明。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是来自于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶、Humicola insolens内切葡聚糖酶V、和Humicolalanuginosa脂肪酶的基因。

在一个优选的方面，信号肽编码区是编码SEQ ID NO：2第1至19位氨基酸的SEQ ID NO：1第1至57位核苷酸。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽来自于啤酒糖酵母α-因子和啤酒糖酵母转化酶的基因。Romanos等人在1992年同上引文中描述了其它有用的信号肽编码区。

控制序列也可是前肽编码区，它编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽称为前酶或前多肽(或有时候称作酶原)。前多肽一般是无活性的，并可通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转变成成熟有活性的多肽。前肽编码区可来自枯草杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草杆菌中性蛋白酶(nprT)、啤酒糖酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜热毁丝霉漆酶的基因(WO 95/33836)。

当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端时，前肽区位于靠近多肽氨基末端的位置，信号肽区位于靠近前肽区的氨基末端位置。

还可能需要加上调节序列以使多肽的表达可以相对于宿主细胞的生长进行调节。调节系统的实例是能响应化学或物理刺激(包括存在调节化合物)而引起基因表达的开启或关闭的那些。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1 系统。在丝状真菌中，可使用TAKAa-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是允许基因扩增的那些。在真核生物系统中，这些包括在氨甲喋呤存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及有重金属存在时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列可与调节序列可操作连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、转录和翻译终止信号的重组表达载体。可以将本文所述的各种核酸和控制序列连接起来产生重组表达载体，此重组表达载体可包括一个或多个适当的限制位点使得在这些位点可插入或替换编码多肽的核苷酸序列。或者，本发明的核苷酸序列可通过将核苷酸序列或含有序列的核酸构建体插入适当的表达载体进行表达。构建表达载体时，将编码序列置于载体中以使编码序列与适当的表达控制序列可操作连接。

重组体表达载体可以是可方便地接受重组DNA操作并能引起核苷酸序列表达的任一载体(例如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与引入此载体的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性的或闭合环状的质粒。

载体可以是自主复制载体，即载体可以染色体外实体的形式存在，其复制独立于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可包含任何用于确保自我复制的手段。或者，载体可以是这样的一种载体，它在引入宿主细胞时，整合到基因组中并与整合的染色体一起复制。此外，可使用单一载体或质粒，或是一起含有待引入宿主细胞基因组的全部DNA的两种或多种载体或质粒，或者转座子。

本发明载体优选包含一种或多种选择标记，所述选择标记允许易于挑选转化的、转染的、转导的等细胞。选择标记是一种基因，其产物提供抗微生物剂或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型至原养型等等。

适于酵母宿主细胞的标记有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。在丝状宿主细胞中使用的选择标记包括但不局限于：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、和trpC(邻氨基苯甲酸酯合酶)，以及其等 价物。优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者允许载体在细胞中不依赖于基因组自主复制的元件。

对整合到宿主细胞基因组来说，载体可依赖编码多肽的多核苷酸序列或任何其它载体元件通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可包含附加的核苷酸序列用于指导通过同源重组在染色体确定位置整合进入宿主细胞基因组中。为提高在精确位置整合的可能性，整合元件应优选包含足够数目的与对应靶序列具有高度同一性的核酸，诸如100-10,000个碱基对、优选400-10,000个碱基对、且最优选800-10,000个碱基对，从而提高同源重组的几率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码或编码核苷酸序列。另一方面，载体可通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对自主复制来说，载体还可包含能使载体在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是任何在细胞中起作用的调节自主复制的质粒复制因子。这里的术语“复制起点”或“质粒复制因子”是指能使质粒或载体在活体内复制的核苷酸序列。

可用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2μm复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中可用的复制起点的实例有AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene 98：61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883中所公开的方法来完成。

可将本发明多核苷酸一个以上的拷贝插入宿主细胞中以提高基因产物的产量。提高多核苷酸拷贝数可通过将序列的至少一个附加拷贝整合进宿主细胞基因组中或通过将可扩增的选择标记基因加入多核苷酸来获得，在其中包含选择标记基因的扩增拷贝的细胞，以及因此多核苷酸的附加拷贝可在适当的选择试剂存在下通过培养此细胞筛选出。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员所熟知的(例如参见Sambrook等人，1989，引文同上)。

宿主细胞

本发明还涉及包含本发明多核苷酸的重组宿主细胞，它们可有利地用于多肽的重组生产。如前所述，可将含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞以使载体保持为染色体的整合体或作为自主复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”包括所有那些由于在复制期间出现的突变而不同于亲本细胞的亲本细胞的后代。宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因和它的来源。

宿主细胞可以是真核细胞，诸如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。这里所使用的“真菌”包括子囊菌门(Acomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等人在《Ainsworth and BisbysDictionary of The Fungi》，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义的)，以及卵菌门(Oomycota)(如参见Hawksworth等人在1995，同上引文的第171中所引用的)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，如上引文)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。这里所使用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目Endomycetales)、产担孢子酵母、和属于不完全真菌的酵母(芽生菌纲Blastomycetes)。由于酵母的分类今后还会变化，对于本发明来说，酵母应该是如在《Biology and Activities of Yeast》(Skinner，F.A.、Passmore，S.M.、和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9，1980)中所定义的。

在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊氏酵母属(Hansenula)、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属、或Yarrowia属细胞。

在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、道拉斯糖酵母、克鲁弗糖酵母、诺第糖酵母、或卵形糖酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门亚门的所有丝状体(如Hawksworth等人， 1995，在上述引文中所定义的)。丝状真菌通常是以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、及其他复合多糖组成的菌丝壁为特征。营养生长表现为菌丝伸长，碳代谢是专性需氧的。相反，酵母诸如啤酒糖酵母的营养生长表现为单细胞菌体的出芽而碳代谢可以是发酵性的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是小枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球酵母属、Filibasidium属、镰孢属、腐质菌属、Magnaporthe属、毛霉属、毁丝霉属、Neocallimastix属、脉孢霉菌、拟青霉属、青霉属、Phanerochaete属、射脉菌属(Phlebia)、Piromyces属、侧耳菌属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、热子囊菌属、草根霉属、Tolypocladium属、拴菌属(Trametes)、或木霉属的细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、谷孢镰孢、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、近念珠状镰孢、单端孢镰孢、或有毒镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、灰色鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、Humicolainsolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢霉、产紫青霉、Phanerochaete chrysosporium、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、Pleurotuseryngii、Thielavia terrestris、Trametes villosa、Trametes versicolor、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、瑞氏木霉、或绿色木霉细胞。

真菌细胞可以本身已知的方式通过涉及原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁再生的过程进行转化。EP 238 023和Yelton等人，1984，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述了适合曲霉属和木霉属宿主细胞转化的过程。Malardier等人，1989，Gene 78：147-159和WO 96/00787中描述了转化镰孢属物种的适当方法。可利用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编的《Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology》，Methods in Enzymology，Vol.194，pp 182-187，AcademicPress公司，New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153：163；及Hinnen等人，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA75：1920中所描述的程序转化酵母。

生产方法

本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞能够在其野生型产生多肽；和(b)回收所述多肽。优选地，所述细胞是曲霉属细胞，更优选的是烟曲霉细胞。

本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养包含如下突变型核苷酸序列的宿主细胞，所述突变型核苷酸序列在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区中具有至少一处突变，其中突变型核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸组成的多肽，和(b)回收所述多肽。

在本发明的生产方法中，利用本领域众所周知的方法在适于生产所述多肽的培养基中培养细胞。例如，细胞培养可在实验室或工业发酵罐中在适当的培养基和可使所述多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、补料-分批、或固态发酵)来进行。培养可通过本领域已知的程序在含有碳和氮源以及无机盐的合宜的营养培养基中进行。适宜的培养基可从商业供应商获得，或者可根据已公布的配方来制备(例如参见美国典型培养物保藏中心的目录)。如果多肽分泌到培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，那么可从细胞裂解产物中进行回收。

可利用本领域已知的对所述多肽特异的方法来检测所述多肽。这些检测方法可包括特异抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，酶试验可用来测定本文所述多肽的活性。

所得多肽可通过本领域已知的方法回收。例如，多肽可通过常规流程从培养基中回收，包括但不局限于：离心、过滤、萃取、喷射-干燥、蒸发、或沉淀。

本发明的多肽可通过本领域已知的多种程序纯化，包括但不局限于：层析(例如离子交换、亲合、疏水、层析聚焦、和大小排阻)、电泳(例如制备性等电聚焦)、差异溶解(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(例如参见《Protein Purification》，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH出版，NewYork，1989)，以获得基本上纯的多肽。

β-葡糖苷酶活性的消除或降低

本发明还涉及生产亲本细胞突变体的方法，包括破坏或缺失编码本发明多肽的多核苷酸序列或其部分，这导致在突变体细胞产生的多肽比在相同条件下培养的亲本细胞少。

可使用本技术领域众所周知的方法通过降低或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达来构建突变体细胞，例如插入、破坏、替换、或缺失。在一个优选的方面，将核苷酸序列失活。例如，要修饰或失活的核苷酸序列可以是对活性必需的编码区或其部分，或编码区表达所需要的调控元件。这种调控或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响核苷酸序列表达的部分。可修饰的其它控制序列包括但不局限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子、和转录激活因子。

核苷酸序列的修饰或失活可通过将亲本细胞诱变，并选择所述核苷酸序列的表达降低或消除的突变体细胞来进行。所述诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适宜的物理或化学诱变剂、通过使用适宜的寡核苷酸、或通过对DNA序列PCR产生诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任意组合来进行。

适于本发明目的的物理或化学的诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸、和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，诱变一般是在适宜条件下在所选的诱变处理试剂的存在下通过保温用于诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞来进行的。

核苷酸序列的修饰或失活可通过在基因中或在其转录或翻译所需要的调控元件中引入、替换、或消除一个或多个核苷酸来进行。例如，可插入或消除核苷酸从而形成终止密码子的引入、起始密码子的消除、或开放读码框 的改变。这些修饰或灭活可根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生诱变来完成。虽然大体上，修饰可在活体内进行，即直接在表达要被修饰的核苷酸序列的细胞上进行，优选的是如下面实例中所示在活体外进行修饰。

适宜的消除或降低细胞核苷酸序列表达的方法的实例是以基因替换、基因缺失、或基因破坏技术为基础的。例如，在基因破坏方法中，将相当于内源核苷酸序列的核酸在活体外进行诱变以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷的核酸序列替换内源核苷酸序列。所希望的是，缺陷的核苷酸序列还编码可用于选择核苷酸序列已经修饰或破坏了的转化体的标记。在一个尤其优选的实施方案中，例如用本文所述选择标记来破坏核苷酸序列。

或者，核苷酸序列的修饰或失活可通过已建立的反义技术使用与核苷酸序列互补的序列来进行。更具体地说，细胞核苷酸序列的表达可通过引入与基因核苷酸序列互补的序列来降低或消除，其中所述基因可在细胞中转录并能与细胞中所产生的mRNA发生杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA发生杂交的条件下，所翻译蛋白质的量由此降低或消除。

本发明此外涉及在编码所述多肽的多核苷酸序列或其控制序列中包含破坏或缺失的亲本细胞的突变体细胞，这导致突变体细胞产生的所述多肽比亲本细胞少或不产生多肽。

这样构建的多肽缺陷的突变体细胞作为宿主细胞用于同源和/或异源多肽的表达尤其有效。因此，本发明还涉及生产同源或异源多肽的方法，包括(a)在有助于生产多肽的条件下培养突变体细胞；和(b)回收所述多肽。这里的术语“异源多肽”是指对宿主细胞来说不是天然的多肽，经过修饰改变了天然序列的天然蛋白，或是经过重组DNA技术处理宿主细胞从而定量改变了其表达的天然蛋白。

在另一个方面，本发明涉及通过发酵生成本发明多肽和目的蛋白质产物二者的细胞来生产基本上没有β-葡糖苷酶活性的蛋白质产物的方法，其中在发酵完成之前、当中、或之后通过往发酵液中加入有效量的可抑制β-葡糖苷酶活性的试剂，并从发酵液中回收目的产物，以及任选进行回收产物的进一步纯化。

在另一个方面，本发明涉及通过下列步骤来生产基本上没有β-葡糖苷酶 活性的蛋白质产物的方法，在允许产物表达的条件下培养细胞，并使所得培养液进行pH和温度联合处理以便实质上降低β-葡糖苷酶活性，并从培养液中回收产物。或者，pH和温度联合处理可在从培养液中回收的酶制品上进行。pH和温度联合处理可任选结合使用用β-葡糖苷酶抑制剂的处理。

根据本发明的这个方面，可能消除至少60％、优选至少75％、更优选至少85％、还更优选至少95％、且最优选至少99％的β-葡糖苷酶活性。通过使用所述方法可实现完全消除β-葡糖苷酶活性。

pH和温度联合处理优选在pH为5和温度为70℃进行足够的一段时间以达到预期的效果，其中一般30-60分钟就足够了。

可使用本领域已知的方法进行培养和目的产物的纯化。

本发明用于生产基本上不含β-葡糖苷酶的产物的方法在真核多肽的生产中特别有利，尤其是真菌蛋白质，诸如酶。例如，酶可选自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维分解酶、氧化还原酶、或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤代过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、苯酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。β-葡糖苷酶缺陷的细胞还可用于表达药学感兴趣的异源蛋白，诸如激素、生长因子、受体等等。

应理解的是术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，还包括经过氨基酸替代、删除或添加的修饰或是用以提高活性、热稳定性、pH耐受性等等其它类似修饰的多肽，例如酶。

在另一个方面，本发明涉及通过本发明方法生产的基本上没有β-葡糖苷酶活性的蛋白产物。

组合物

本发明还涉及包含本发明多肽的组合物。优选的是，组合物富集了这类多肽。术语“富集”是指组合物的β-葡糖苷酶活性已经提高，例如富集因子为至少1.1。

所述组合物可包含本发明的多肽作为主要的酶组分，例如单一组分组合物。或者，组合物可含有多种酶活性，诸如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。通过属于下列属的微生物可产生附加的酶，例如曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、谷孢镰孢、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、近念珠状镰孢、单端孢镰孢、或有毒镰孢；腐质菌属，优选Humicolainsolens或Humicola lanuginosa；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、瑞氏木霉、或绿色木霉。

可根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且所述多肽组合物可以液体或干燥组合物的形式存在。例如，多肽组合物可以颗粒或微粒的形式存在。可以本领域已知的方法稳定包含在组合物中的多肽。

在下面所给的实施例中优选使用本发明的多肽组合物。本发明多肽组合物的剂量和使用组合物的其它条件可根据本领域已知的方法来确定。

生物量降解为单糖、二糖、和多糖

本发明具有β-葡糖苷酶活性的多肽和宿主细胞可用于从生物量生产单糖、二糖、和多醣，作为化学或发酵原料，用于生产乙醇、塑料、或其他产品或中间体。具有β-葡糖苷酶活性的多肽可以是除去或未除去细胞的粗级发酵液的形式，或是半纯化或纯化酶制品的形式。或者，本发明的宿主细胞可在生物量的发酵过程中用作具有β-葡糖苷酶活性的多肽的来源。

生物量可包括但不局限于：木材资源、城市固体废物、废纸、和作物残余(例如参见Wiselogel等人，1995，《Handbook on Bioethanol》(Charles E.Wyman编)，pp.105-118，Taylor&Francis，Washington D.C.；Wyman，1994，Bioresource Technology 50：3-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry andBiotechnology 24/25：695-719；Mosier等人，1999，Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics，在《Advances inBiochemicalEngineering/Biotechnology》中，T.Scheper主编，Vol.65，pp.23-40，Springer-Verlag，New York)。

在生物量初生(primary)细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长之后产生的次生细胞壁也包含多糖，而且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此为线状的β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包含多种化合物，诸如具有多种取代基的复杂分支结构的木聚糖、木糖葡聚糖、阿糖木聚糖、和甘露聚糖。虽然纤维素通常是多形的，但在植物组织中发现的纤维素主要是以平行葡聚糖链的不溶性的晶体矩阵形式存在。半纤维素通常与纤维素以及另外的半纤维素以氢键结合，这有助于稳定细胞壁的基质。

主要有三大类别的葡糖水解酶用于分解纤维素生物量：

(1)“内切-1，4-β-葡聚糖酶”或1，4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.4)，它随机地作用于可溶的和不溶的1，4-β-葡聚糖底物。

(2)“外切-1，4-β-D-葡聚糖酶”，包括可从1，4-β-D-葡聚糖中释放葡萄糖并缓慢水解D-纤维二糖的1，4-β-D-葡聚糖葡糖水解酶(EC 3.2.1.74)和可从1，4-β-葡聚糖中释放D-纤维二糖的纤维二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)。

(3)“β-D-葡糖苷酶”或β-D-葡糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)，它可从纤维二糖和可溶性纤维糊精以及一系列糖苷中释放出D-葡萄糖单位。

这三类酶一起协同作用，导致从生物量中有效地解晶并水解天然纤维素，产生还原糖。

本发明具有β-葡糖苷酶活性的多肽可用于联合上述酶以进一步降解生物量底物的纤维素组分(例如参见Brigham等人，1995，在《Handbook onBioethanol》中(Charles E.Wyman编)，PP.119-141，Taylor&Francis，Washington D.C.；Lee，1997，Journal of Biotechnology 56：1-24)。

可通过酶促降解生物量并将释放的糖类转化成乙醇来制备乙醇。这种乙醇通常称为生物乙醇或生物燃料。它可以浓度从不到1％直至100％(燃料替代物)用作燃料添加剂或增量剂。

洗涤剂组合物

本发明具有β-葡糖苷酶活性的多肽可添加到洗涤剂组合物中并因此成为它的一种组分。

例如，可以将本发明的洗涤剂组合物配制成手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理污染织物的洗衣添加剂组合物和漂洗时添加的织物柔软剂组合物，或配制成用于普通家庭硬面清洗操作的洗涤剂组合物，或用于手洗或机洗洗碟操作的洗涤剂组合物。

在一个具体的方面，本发明提供了含有本发明具有β-葡糖苷酶活性的多肽的洗涤剂添加剂。

洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物中可包含一种或多种其它的酶，诸如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(如漆酶)、和/或过氧化物酶。

通常，酶组分的性质应该与所选择的洗涤剂相容(即最佳pH、与其它酶和非酶组分的相容性等等)，并且所述酶组分应该以有效量存在。

蛋白酶：

适宜的蛋白酶包括那些动物、植物或微生物起源的。优选微生物起源的。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是那些来源于芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、和枯草杆菌蛋白酶168(描述在WO89/06279中)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如起源于猪或牛的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO 89/06270和WO 94/25583中)。

有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、和WO 98/34946中所描述的变体，特别是在一个或多个如下位置发生替代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、和274。

优选的市场上可买到的蛋白酶包括Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM、和Kannase^TM(Novozymes A/S)、Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、FN2^TM、和FN3 ^TM(GenencorInternational Inc.)。

脂肪酶：

适宜的脂肪酶包括细菌或真菌起源的那些。包括经化学修饰的或经蛋白质工程改造的变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质菌属(同义词Thermomyces)的脂肪酶，例如EP 258068和EP 305216中所描述的Hlanuginosa(T.lanuginosus)或WO 96/13580中所描述的H.insolens；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P.alkaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、葱头假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、司徒茨氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌种菌株SD 705(WO 95/06720)和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)；芽孢杆菌属(Bacillus)脂肪酶，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Dartois等人，1993，Biochemica etBiophysics Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)、或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。

其它实例有诸如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、和WO 97/07202中所描述的脂肪酶变体。

优选的市场上可买到的脂肪酶包括Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM (Novozymes A/S)。

淀粉酶：

适宜的淀粉酶(α和/或β)包括细菌和真菌起源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。淀粉酶包括例如芽孢杆菌属例如地衣形芽孢杆菌(B.licheniformis)特定菌株来源的α-淀粉酶，详细说明描述在GB1,296,839中。

有用的淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、和WO 97/43424中所描述的变体，特别是在一个或多个如下位置发生替代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。

市场上可买到的淀粉酶有Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、和BAN^TM(Novozymes A/S)、Rapidase^TM和Purastar^TM(GenencorIntemationalInc.)。

纤维素酶：

适宜的纤维素酶包括细菌或真菌起源的那些。包括经化学修饰的或蛋白 质工程改造的突变体。适宜的纤维素酶包括来自下列属的纤维素酶：芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质菌属、镰孢属、草根霉属、小枝顶孢属，例如在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757、和WO 89/09259中公开的由Humicola insolens、嗜热毁丝霉、和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。

尤其适宜的纤维素酶是有益于保护颜色的碱性或中性纤维素酶。这些纤维素酶的实例有EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例有诸如在WO 94/07998、EP 0 531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307、和PCT/DK98/00299中描述的纤维素酶变体。

市场上可购买到的纤维素酶包括Celluzyme^TM、Carezyme^TM(NovozymesA/S)、Clazinase^TM、Puradax HA^TM(Genencor国际公司)、和KAC-500(B)^TM (Kao公司)。

过氧化物酶/氧化酶：

适宜的过氧化物酶/氧化酶包括源自植物、细菌、或真菌的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属例如灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中所描述的那些。

市场上可买到的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes A/S)。

可通过添加含一种或多种酶的独立的添加剂或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂将酶组分包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即独立的添加剂或组合添加剂，可配制成例如颗粒、液体、浆体等形式。优选的洗涤剂添加剂制剂为颗粒剂，尤其是无粉尘的颗粒剂；液体，尤其是稳定的液体；或浆体。

例如可如在美国专利US 4,106,991和4,661,452中所公开的方法制备无粉尘颗粒剂，并可任选使用本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例有平均摩尔质量为1000-20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；具有15-80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪醇，其中醇含12-20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单-、双-和三甘油酯。GB 1483591中给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。例如，液体酶制品可根据既定的方法通过加入多元醇 诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。受保护的酶可根据EP 238，216中所公开的方法制备。

本发明的洗涤剂组合物可采用任一种方便的形式，例如条、片、粉末、颗粒、膏、或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般含高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或者是不含水的。

洗涤剂组合物可含有一种或多种表面活性剂，可以是非离子的，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子的。表面活性剂的含量一般为0.1％-60％重量。

当洗涤剂包含阴离子表面活性剂时，它通常含有大约1％到大约40％的阴离子表面活性剂，诸如线状的烷基苯磺酸酯、α-石蜡磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯、二级烷基磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂。

当洗涤剂中包含非离子型表面活性剂时，它通常含有大约0.2％到大约40％的非离子型表面活性剂，诸如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

洗涤剂可包含0-65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，诸如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如购自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。实例有羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯诸如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可包含漂白系统，该系统可含有H₂O₂来源诸如过硼酸盐或过碳酸盐，可将其与形成过酸的漂白活化剂诸如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸酯相组合。或者，漂白系统可包含过氧酸，例如酰胺、亚胺、或砜型。

可使用常规的稳定剂稳定本发明洗涤剂组合物的酶组分，例如多元醇，诸如丙二醇或丙三醇；糖或糖醇；乳酸；硼酸，或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物诸如4-甲酰苯基硼酸；且所述的组合物可如WO92/19709和WO 92/19708中所描述的方法来配制。

洗涤剂还可包含其它的常规洗涤剂成分，诸如包括粘土的织物调节剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染色剂、杀菌剂、光漂白剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂、或芳香剂。

在洗涤剂组合物中的任一酶组分，尤其是本发明具有β-葡糖苷酶活性的多肽都可以相当于每升洗涤液0.01-100mg酶蛋白质的量加入，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白质，尤其每升洗涤液0.1-1mg酶蛋白质。

还可将本发明具有β-葡糖苷酶活性的多肽添加到如WO 97/07202所公开的洗涤剂制剂中，这里收入所述文献作为参考。

植物

本发明还涉及经编码本发明具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列转化而以可回收量表达和生产多肽的转基因植物、植株部分、或植物细胞。所述多肽可从植物或植株部分回收。或者，将含有重组多肽的植物或植株部分就此用于改善食物或饲料的质量，例如提高营养价值、可口性和流变性、或破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例有草，例如草地草(蓝草，早熟禾属(Poa))；草料草，诸如羊矛属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，例如剪股颖属(Agrostis)；和谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例有烟草，豆科作物诸如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、豆、和大豆，和十字花科植物(十字花科Brassicaceae)，诸如花椰菜、油菜籽、和亲缘很近的模式生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植株部分的实例有茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、和块茎，以及含有这些部分的单独组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、脉管组织、分生组织。特殊的植物细胞小室，诸如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体、和细胞质也认为是植株部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，也认为是植株部分。类似的，植株部分，诸如有利于本发明应用的特定的分离组织和细胞也认为是植株部分，例如胚、胚乳、糊粉、和种皮。

这些植物、植株部分、和植物细胞的后代也包括在本发明范围之内。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞的构建可根据本领域已知的方法进行。简而言之，植物或植物细胞的构建可通过将一种或多种编码本发 明多肽的表达构建体掺入植物宿主基因组中并将所得的经修饰植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞来进行。

表达构建体方便的是核酸构建体，它含有编码本发明多肽的多核苷酸且该多核苷酸可操作连接在所选定的植物或植株部分中表达此核苷酸序列所需的适当调控序列。而且，表达构建体可包含用于鉴定整合了此表达构建体的宿主细胞的选择标记，和将此构建体导入所讨论的植物所需要的DNA序列(后者取决于所用导入DNA的方法)。

例如，根据希望在何时、在何处、和怎样表达多肽来选择调控序列，诸如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成性的或可诱导的，或者是发育、阶段、或组织特异的，基因产物可以是靶向特定组织或植株部分诸如种子或叶。调控序列有例如Tague等人，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成性表达，可使用35S-CaMV、玉米泛蛋白1、和水稻肌动蛋白1启动子(Franck等人，1980，Cell 21：285-294；Christensen等人，1992，Plant Mol.Biol.18：675-689；Zhang等人，1991，Plant Cell3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织诸如种子、马铃薯块茎、和果实(Edwards和Coruzzi，1990，Ann Rev Genet 24：275-303)，或来自于代谢库组织诸如分生组织(Ito等人，1994，Plant Mol Biol 24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或清蛋白启动子(Wu等人，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)，来自蚕豆(Viciafaba)豆球蛋白B4和未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等人，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等人，1998，Plant and Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassicanapus)的贮藏蛋白napA启动子，或者本领域已知的任何其它种子特异启动子，例如WO 91/14772中所述。此外，启动子可以是叶特异性启动子，诸如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等人，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或者伤口诱导性启动子诸如马铃薯pin2启动子(Xu等人，1993，Plant MolecularBiology 22：573-588)。同样，启动子可通过非生物处理例如温度、干旱、 或盐度变化来诱导，或通过外源施加能激活启动子的物质，例如乙醇、雌激素、植物激素诸如乙烯、脱落酸和赤霉酸以及重金属来诱导。

还可使用启动子增强子元件，从而在植物中获得本发明多肽的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如Xu等人，1993，在同上引文中所公开的利用水稻肌动蛋白1基因的第一个内含子来增强表达。

选择标记基因和表达构建体的任何其它部分可选自本领域可利用的那些范围。

可根据本领域已知的常规技术将核酸构建体掺入植物基因组中，包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物射弹转化、和电穿孔法(Gasser等人，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等人，1989，Nature 338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)介导的基因转移是选择用于产生转基因双子叶植物的方法(其综述可参见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且也可用于转化单子叶植物，尽管这些植物常使用其它转化方法。目前，选择用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子轰击(以转化用DNA包被的金或钨微粒)胚的愈伤组织或发育中的胚(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil等人，1992，Bio/Technology 10：667-674)。如Omirulleh等人，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428中所描述的，单子叶植物转化的替代方法是基于原生质体转化来进行的。

在转化后，根据本领域熟知的方法选出已掺入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植株。通常转化程序设计成在再生期间或在后代中选择性清除选择基因，例如通过两种不同T-DNA构建体的共转化或通过特异重组酶进行的选择基因的位点特异切除来进行。

本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下，培养含有如下多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有β-葡糖苷酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

信号肽

本发明还涉及包含编码蛋白质的基因且该基因与如下核苷酸序列可操作连接的核酸构建体，所述核苷酸序列由SEQ ID NO：1第1至57位核苷酸组成并编码由SEQ ID NO：2第1至19位氨基酸组成的信号肽，其中基因对于第一和第二氨基酸序列而言是外源的。

本发明还涉及含有这种核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及生产所述蛋白质的方法，包括(a)在有助于生产所述蛋白质的条件下培养所述重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

对宿主细胞所述蛋白质可以是天然的或异源的。在这里术语“蛋白质”不是指规定长度的编码产物，而是涵盖肽、寡肽、和蛋白质。术语“蛋白质”还涵盖两种或多种多肽组合形成编码产物。蛋白质还包括杂合多肽，它包括来自于至少两种不同蛋白质的部分或完整多肽序列的组合，其中所述一种或多种蛋白质对宿主细胞可以是异源的或天然的。蛋白质还包括上述蛋白质和杂合蛋白的天然存在的等位的和改造的变异。

优选的是，蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道分子。在一个更优选的方面，蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或连接酶。在一个甚至更优选的方面，蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突变酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

所述基因可从任何原核的、真核的、或其它来源中获得。

本发明可通过下列实施例进一步说明，这些实施例不应视为限制本发明的范围。

实施例

材料

用作缓冲液和底物的化学制品至少是试剂级的商品。

菌株

使用米曲霉Jal250菌株(WO 99/61651)用于烟曲霉β-葡糖苷酶的表达。使用烟曲霉PaHa34作为GH3A家族β-葡糖苷酶的来源。

培养基

马铃薯葡萄糖培养基每升含39g马铃薯葡萄糖(Difco)。

PDA平板每升含39g马铃薯葡萄糖琼脂。

MDU2BP培养基每升含45g麦芽糖，1g MgSO₄·7H₂O，1g NaCl，2g K₂SO₄，12g KH₂PO₄，7g酵母提取物，2g尿素和0.5ml AMG微量金属溶液，pH调至5.0。

AMG微量金属溶液每升含14.3g ZnSO₄·7H₂O，2.5g CuSO₄·5H₂O，0.5gNiCl₂·6H₂O，13.8g FeSO₄·7H₂O，8.5g MnSO₄·H₂O，和3g柠檬酸。

Cove平板每升含342.3g蔗糖，20ml Cove盐溶液，10ml 1M乙酰胺，10ml5M CsCl₂，和25g Noble琼脂。

Cove盐溶液每升含26g KCl，26g MgSO₄·7H₂O，76g KH₂PO₄，和50mlCOVE微量金属溶液。

Cove微量金属溶液每升含0.04g Na₂B₄O₇·10H₂O，0.4g CuSO₄·5H₂O，1.2gFeSO₄·7H₂O，0.7g MnSO₄·H₂O，0.8g Na₂MoO₂·2H₂O，和10g ZnSO₄·7H₂O。

CIM培养基每升含20g纤维素，10g玉米浆干粉，1.45g(NH₄)₂SO₄，2.08gKH₂PO₄，0.28g CaCl₂，0.42g MgSO₄·7H₂O，和0.42ml微量金属溶液，pH调至6.0。

微量金属溶液每升含41.2mg FeCl₃·6H₂O，11.6mg ZnSO₄·7H₂O，5.4mgMnSO₄·H₂O，2.0mg CuSO₄·5H₂O，0.48mg H₃BO₃，和67.2mg柠檬酸。

实施例1：烟曲霉基因组序列中糖基水解酶家族GH3A基因的鉴定

利用检索棘孢曲霉β-葡糖苷酶蛋白质序列(登记号P48825)的检索，进行烟曲霉部分基因序列(The Institute for Genomic Research，Rockville，MD)的tblastn搜索(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res 25：3389-3402)。基于氨基酸水平与检索序列的高度相似性，鉴定得出几种基因是假定GH3A家族同系物。选择氨基酸水平与检索序列具有大于70％同一性的约3000bp的一个基因组区域用于进一步地研究。

实施例2：烟曲霉基因组DNA的提取

将烟曲霉在带挡板的摇瓶中在250ml马铃薯葡萄糖培养基中于37℃以240rpm进行培养。通过过滤收获菌丝体，在TE(10mM Tris-1mM EDTA) 中洗涤两次，并在液氮下冷冻。用研钵和研棒将冷冻的菌丝体研磨成细粉，将其重悬于含10mM Tris、100mM EDTA、1％Triton X-100、0.5M胍-HCl、和200mM NaCl的pH8.0的缓冲液中。以20mg/升的浓度加入不含DNA酶的RNA酶A，并将裂解液于37℃保温30分钟。通过离心除去细胞碎片，并使用Qiagen Maxi 500柱(QIAGEN公司，Chatsworth，CA)分离DNA。将柱子在10ml QBT中平衡，用30ml QC洗涤，并用15ml QF洗脱(所有缓冲液购自QIAGEN公司，Chatsworth，CA)。将DNA用异丙醇沉淀，用70％乙醇洗涤，并通过离心回收。将DNA重悬于TE缓冲液。

实施例3：pAILo2表达载体的构建

通过修饰pBANe6(美国专利6,461,837)构建pAILo1表达载体，它包含源自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶的杂合启动子(NA2-tpi启动子)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子序列(AMG终止子)、和构巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)。pBANe6的修饰是如下进行的，即首先通过定点诱变从amdS选择标记除去位于第2051、2722、和3397bp位的三个NcoI限制位点。所有改变设计为“沉默的”，使得amdS基因的实际蛋白质序列不改变。三个位点的清除是利用GeneEditor定点诱变试剂盒(Promega，Madison，WI)根据厂商的说明使用下面的引物(标有下划线的核苷酸代表改变的碱基)同时进行的：

AMDS3NcoMut(2050)：5’-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3’(SEQ ID NO：3)

AMDS2NcoMut(272 1)：5’-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3’(SEQID NO：4)

AMDS 1NcoMut(3396)：5’-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3’(SEQID NO：5)

然后将包含所有三种期望序列改变的质粒利用QuickChange诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)进行定点诱变，从而消除位于第1643位的AMG终止子末端的Nco I限制位点。使用下列引物(标有下划线的核苷酸代表改变的碱基)用于诱变：

用于诱变AMG终止子序列的上游引物：

5’-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3’ (SEQ ID NO：6)

用于诱变AMG终止子序列的下游引物：

5’-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’(SEQ ID NO：7)

修饰pBANe6的最后一步是利用QuickChange诱变试剂盒和下列引物(标有下划线的核苷酸代表改变的碱基)在多接头始端插入一个新的Nco I限制位点，从而产生pAILo1(附图2)。

用于诱变NA2-tpi启动子的上游引物：

5’-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3’(SEQ ID NO：8)

用于诱变NA2-tpi启动子的下游引物：

5’-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATAG-3’(SEQ ID NO：9)

用构巢曲霉pyrG基因替换pAILo1的amdS基因。将pBAN1eO(图3)质粒用作pyrG基因源。分析pBANe10序列表明pyrG标记包含在NsiI限制片段中，并且不Nco I或PacI限制位点。因为amdS的侧翼也有NsiI限制位点，所以用于转换选择标记的策略是进行NsiI限制片段的简单替换。用限制性内切酶NsiI消化来自pAILo1和pBANe10的质粒DNA，并利用标准程序通过琼脂糖凝胶电泳纯化产物。将源自pBANe10的含有pyrG基因的Nsi I片段连接至pAILo1主链以替换包含amdS基因的原始Nsi I DNA片段。通过限制消化分析重组克隆以测定它们是否含有正确的插入片段和方向是否正确。选择以反时针方向转录带有pyrG基因的克隆。新的质粒称为pAILo2(附图4)。

实施例4：GH3A家族β-葡糖苷酶基因的克隆和米曲霉表达载体的构建

设计如下的两条合成寡核苷酸引物从实施例2中所制备的基因组DNAPCR扩增编码假定GH3A家族β-葡糖苷酶的烟曲霉基因。无需限制消化和连接，使用InFusion Cloning Kit(BD Biosciences，Palo Alto，CA)将片段直接克隆到表达载体pAILo2中。

正向引物：5’-ACTGGATTTACCATGAGATTCGGTTGGCTCG-3’(SEQ IDNO：10)

反向引物：5’-AGTCACCTCTAGTTACTAGTAGACACGGGGC-3’(SEQ IDNO：11)

粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAILo2的插入位点是同源的。

将上述每种引物各50pmol用于终体积50μl的PCR反应，其中含有100ng烟曲霉基因组DNA、1×Pfx扩增缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1.5μl10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、2.5个单位的Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1μl 50mM MgSO₄、和2.5μl10×pCRxEnhancer溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。扩增条件为94℃2分钟，一个循环；每个循环94℃15秒、55℃30秒和68℃3分钟30个循环。然后将加热块转到4℃浸泡(soak)循环。

将反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mMEDTA二钠(TAE)缓冲液进行分离，其中从凝胶上切下3kb产物带，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)根据厂家的说明进行纯化。

然后用InFusion克隆试剂盒将片段克隆到pAILo2表达载体中。用限制性核酸内切酶Nco I和Pac I消化载体(使用厂家规定的条件)。通过凝胶电泳和Oiaquick凝胶纯化来纯化片段。将基因片段和切割载体在反应中连接起来，产生表达质粒pEJG97(图5)，其中GH3A家族β-葡糖苷酶基因的转录处于NA2-tpi启动子的控制之下。连接反应液(50μl)含有：1×InFusion缓冲液(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，1×BSA(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，1μl Infusion酶(1∶10稀释)(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，150ng经NcoI和PacI消化的pAlLo2，和50ng烟曲霉β-葡糖苷酶纯化PCR产物。

将反应液于室温保温30分钟。用1μl反应液转化大肠杆菌XL10 Solopac Gold细胞(Stratagene，La Jolla，CA)。通过限制消化检测含pEJG97质粒的大肠杆菌转化子，并使用BioRobot 9600(QIAGEN公司，Chatsworth，CA)制备质粒DNA。

实施例5：编码GH3A家族β-葡糖苷酶的烟曲霉基因组序列的鉴定

使用Perkin-Elmer Applied Biosystems377 XL型自动DNA测序仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystems公司，Foster City，CA)利用染料终止物化学法(Giesecke等人，1992，Journal of Virology Methods 38：47-60)和引 物步移策略对来自pEJG97的烟曲霉β-葡糖苷酶基因进行DNA测序。仔细检查核苷酸序列信息的质量，并且借助PHRED/PHRAP软件(University ofWashington，Seattle，WA)将所有序列互相比较。

基于对源自棘孢曲霉、黑曲霉、和川地曲霉(Aspergillus kawachii)同源基因的相似性，构建烟曲霉序列的基因模型。图1A和1B显示了核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。基因组片段编码863个氨基酸的多肽，由62、55、58、63、58、58、63、和51bp的8个内含子中断。基因的％G+C含量是54.3％，而成熟编码区是53.65％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)预测出19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有844个氨基酸，分子量91.7kDa。

通过Clustal W法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)用同一性表及后面的多重对比参数：缺口罚分10和缺口长度罚分10来确定β-葡糖苷酶序列的比较对比。成对对比参数：Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5，和对角线＝5。对比表明推导的烟曲霉β-葡糖苷酶基因氨基酸序列与推导的棘孢曲霉(登记号P48825)、黑曲霉(O00089)、和川地曲霉(P87076)β-葡糖苷酶氨基酸序列享有78％、76％、和76％的同一性。

实施例6：烟曲霉GH3A家族β-葡糖苷酶基因在米曲霉JAL250中的表达

根据Christensen等人，1988，Bio/Technology 6：1419-1422中所描述的方法制备米曲霉Jal250原生质体。用5μg pEJG97(以及作为载体对照的pAILo2)转化米曲霉JAL250。

用pEJG97转化米曲霉Jal250获得大约100个转化子。将10个转化子分离到单独的PAD板上。

用5ml 0.01％吐温20洗涤10个转化子中5个的汇合PDA板，分别接种到125ml玻璃摇瓶中的25ml MDU2BP培养基中，并于34℃以250rpm进行培养。培养5天后，使用8-16％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据厂家的指示分析取自每种培养物的0.5μl上清液。培养物的SDS-PAGE图谱表明某一转化体(命名为转化体1)具有大约130kDa的主带。

用10ml 0.01％吐温20洗涤转化体1的汇合板(在PDA上生长)，并将 其接种到装有400ml MDU2BP培养基的2升Fernbach瓶中，以产生用于鉴定酶的培养液。第5天收获烧瓶，并用0.22μm GP Express plus膜(Millipore，Bedford，MA)进行过滤。

实施例7：pMJ09的构建

使用如下所示的引物993429(反义)和993428(有义)通过PCR扩增源自瑞氏木霉RutC30基因组DNA的瑞氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1基因(cbhl)终止子来构建载体pMJ04。反义引物设计成在5′端具有Pac I位点且在有义引物的5′端具有Spe I位点。

引物993429(反义)：

5’-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3’(SEQ ID NO：12)

引物993428(有义)：

5’-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3’(SEQ ID NO：13)

扩增反应液(50μl)含有：1×ThermoPol反应缓冲液(New EnglandBiolabs，Beverlv，MA)，0.3mM dNTP，100ng瑞氏木霉RutC30基因组DNA(用Qiagen，Chatsworth，CA的DNeasy Plant Maxi试剂盒分离)，0.3μM引物993429，0.3μM引物993428、和2U Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)。将反应液在如下编程的Eppendorf Mastercycler 5333(Hamburg，Germany)中保温：30个循环，每个循环94℃30秒、55℃30秒、和72℃30秒(最后延伸15分钟)。

在1.0％琼脂糖凝胶上利用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液分离反应产物，由凝胶上切除229bp产物带条，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)根据厂家的说明进行纯化。

用PacI和SpeI消化得到的PCR片段，并利用Rapid Ligation Kit(Roche，Indianapolis，IN)连接到经过相同限制性内切酶消化的pAILo1中，产生pMJ04(图6)。

使用如下所示的引物993696(反义)和993695(有义)通过PCR扩增源自瑞氏木霉RutC30基因组DNA的瑞氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1基因(cbhl)启动子来构建载体pMJ06。反义引物设计成在有义引物的5′端具有SalI位点且在反义引物的5′端具有NcoI位点。

引物993695(有义)：

5’-ACTAGTCGACCGAATGTAGGATTGTT-3’(SEQ ID NO：14)

引物993696(反义)：

5’-TGACCATGGTGCGCAGTCC-3’(SEQ ID NO：15)

扩增反应液(50μl)的组成为：1×ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTP，100ng瑞氏木霉RutC30基因组DNA(用QIAGEN DNeasy Plant Maxi试剂盒制备)，0.3μM引物993696，0.3μM引物993695，和2U Vent聚合酶。将反应液在如下编程的Eppendorf Mastercycler 5333程序中保温：30个循环，每个循环94℃30秒，55℃30秒，和72℃60秒(最后延伸15分钟)。

在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离反应产物，由凝胶上切除988bp产物条带，并使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit凝胶提取试剂盒根据厂家的说明进行纯化。

用Nco I和SalI消化得到的PCR片段，并利用Rapid Ligation Kit连接到经过相同限制性内切酶消化的pMJ04中，产生pMJ06(图7)。

使用如下所示的引物993843(反义)和99344(有义)通过PCR扩增源自瑞氏木霉RutC30基因组DNA的瑞氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1基因(cbhl)终止子来构建表达载体pMJ09。反义引物设计成在5′端具有Pac I位点和Spe I位点且在有义引物的5′端具有Pvu I位点。

引物993844(有义)：

5’-CGATCGTCTCCCTATGGGTCATTACC-3’(SEQ ID NO：16)

引物993843(反义)：

5’-ACTAGTTAATTAAGCTCCGTGGCGAAAG-3’(SEQ ID NO：17)

扩增反应液(50μl)的组成为：1×ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTP，100ng瑞氏木霉RutC30基因组DNA(用QIAGEN DNeasy Plant Maxi试剂盒提取)，0.3μM引物993844，0.3μM引物993843，和2U Vent聚合酶。将反应液在如下编程的Eppendorf Mastercycler 5333程序中保温：30个循环，每个循环为94C 30秒，55℃30秒，和72℃60秒(最后延伸15分钟)。

在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离反应产物，从胶凝体中切除473bp产物条带，并使用QIAGEN QIAquick凝胶提取试剂盒根据厂家的说明进行纯化。

用PvuI和Spe I消化得到的PCR片段，并利用Rapid Ligation Kit连接 到经过PacI和SpeI消化的pMJ06中，产生pMJ09(图8)。

实施例8：烟曲霉GH3A家族β-葡糖苷酶基因在瑞氏木霉中的表达

设计如下所示的两条合成寡核苷酸引物，用于PCR扩增源自实施例4中所述pEJG97的烟曲霉β-葡糖苷酶基因。无需限制消化和连接，使用InFusion Cloning Kit将片段克隆到表达载体pMJ09中。

正向引物：5’-GGACTGCGCACCATGAGATTCGGTTGGCTC-3’(SEQ IDNO：18)

反向引物：5’-TCGCCACGGAGCTTACTAGTAGACACGGGG-3’(SEQ IDNO：19)

粗体字母代表编码序列。其余序列与pMJ09的插入位点是同源的。

上述每种引物各取50pmol用于PCR反应液(50μL)，其中含有100ngpEJG97 DNA，1×Pfx扩增缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，1.5μL 10mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物，2.5个单位的PlatinumPfx DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，1μl 50mM MgSO₄，和2.5μl 10×PCRxEnhancer溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。扩增条件为一个循环的94℃2分钟；30个循环，每个循环为94℃ 15秒，55℃30秒，和68℃3分钟。然后将加热块转到4℃浸泡循环。

在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离反应产物，从凝胶中切除3kb产物条带，并使用QIAGEN QIAquick凝胶提取试剂盒根据厂家的说明进行纯化。

然后用Infusion克隆试剂盒将纯化的3kb片段克隆到pMJ09中。用NcoI和PacI消化载体。如上所述，通过凝胶电泳和Qiaquick凝胶纯化来纯化片段。在反应中将基因片段和消化载体连接起来，产生表达质粒pEJG107(图9)，其中GH3A家族β-葡糖苷酶基因的转录处于瑞氏木霉cbhl启动子的控制之下。所述连接液(50μl)的组成为：1×InFusion缓冲液，1×BSA，1μlInfusion酶(1∶10稀释)，100ng经Nco I和Pac I消化的pMJ09，和100ng烟曲霉β-葡糖苷酶纯化PCR产物。将反应液于室温保温30分钟。用1μl反应液转化大肠杆菌电击感受态SURE细胞(Stratagene，La Jolla，CA)。通过限制消化检测含pEJG107质粒的大肠杆菌转化体，并使用BioRobot 9600(QIAGEN公司，Chatsworth，CA)制备质粒DNA。

通过染料-终止物化学法(Giesecke等人，1992，Journal of VirologyMethods 38：47-60)和引物步移策略利用Perkin-Elmer Applied Biosystems 377XL型自动DNA测序仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystems公司，Foster City，CA)对源自pEJG107的烟曲霉β-葡糖苷酶基因进行DNA测序。仔细检查核苷酸序列信息的质量，并借助PHRED/PHRAP软件(University ofWashington，Seattle，WA)将所有序列互相比较。

根据Christensen等人，1998，上文引文的方法来制备瑞氏木霉RutC30原生质体。用5μg pEJG107转化瑞氏木霉RutC30。转化产生大约100个转化体。将60个转化体分离到单独的Cove/10mM尿苷板上，并于28℃保温。

从60个转化体中8个的板收集孢子，用无菌环刮取三次，并分别接种到装在125ml玻璃摇瓶中的25ml CIM培养基中，并于28℃以250rpm进行培养。培养5天后，用7.5％Tris SDS-PAGE凝胶(Biorad，Hercules，CA)根据厂家的指示对取自各培养物的0.5μl上清液进行分析。培养物的SDS-PAGE图谱表明其中一个转化体(命名为转化体1)具有大约130kDa的主带。

实施例9：烟曲霉β-葡糖苷酶的鉴定

将如实施例6所述获得的烟曲霉β-葡糖苷酶的3ml等分试样用BioradEcono-Pac 10DG脱盐柱(BioRad，Hercues，CA)脱盐，在pH5.0的100mM柠檬酸钠中产生大约4ml脱盐培养液。然后用Amicon Centricon Plus-20(Biomax-5，5kD截留，PES膜)将脱盐培养液浓缩至大约180μL，并用100mMpH5.0的柠檬酸钠稀释至大约500μl终体积。经过脱盐、浓缩的培养液的BCA测定(Smith等，1985，Anal Biochem 150：76-85)表明蛋白质浓度为1.00mg/ml。将第二个等分试样也脱盐以获得更多的物质，其得到的结果类似。

浓缩脱盐样品的SDS-PAGE(BioRad Criterion 7.5％Tris-HCl)表明主带为约130kD。从凝胶中切下130kD主带，并进行N端氨基酸测序。

对来自脱盐/浓缩培养液的烟曲霉β-葡糖苷酶评价在50℃、65℃和70℃的热稳定性。50℃和65℃的测定条件为：100mM pH5.0的柠檬酸钠，0.01％吐温-20，4mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷，[蛋白质]_AfumGH3A＝6.9×10^-6mg/ml，于50℃和65℃保温。在0.5、1、2、3、3.75和24小时采集 等分试样。向每个等分试样中加入1M pH10.0的碳酸钠，并通过405nm吸光度来测定对硝基苯基阴离子的浓度。70℃的测定条件为：100mM pH 5.0的柠檬酸钠，0.01％吐温-20，4mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷，[蛋白质]＝5.6×10^-6mg/ml。在0.25、0.5、1、2、4和5小时采集等分试样。向每个等分试样中加入1M pH10.0的碳酸钠，并通过405nm吸光度来测定对硝基苯基阴离子的浓度。注意，上述每种蛋白质浓度指测定中的总蛋白质浓度，因为它们都是作为培养液而不是纯化的酶来测定的。

图10和11显示了得到的结果。热稳定性定义为在对硝基苯基阴离子的适当转化率(＜15％)之内给定时间间隔的线性反应动力学。虽然在4小时和24小时之间没有时间点，但在50℃烟曲霉β-葡糖苷酶表现出在至少24小时内是稳定的。在65℃时它表现出至少在3.75小时内是稳定的，但此后稳定性逐渐下降，在24小时对对硝基苯基阴离子的转化率为65％。该转化率是相当高的，因此除了可能的热灭活之外，某些观察到的转化率下降可能是由于底物的消耗和/或产物的抑制。在70℃它好象可稳定1小时，并且可相当地稳定至2小时。

将含有源自如实施例6所述获得的烟曲霉的GH3A家族β-葡糖苷酶的培养液首先脱盐(BioRad Econo-Pac 10DG柱)并浓缩(Centricon Plus-20，Biomax-5，5kD截留)至0.92mg/ml的浓度(BCA测定)。然后，将它以0.037和0.0092μg/ml的总蛋白浓度与10mM纤维二糖在100mM pH5.0的柠檬酸钠加0.01％吐温-20中于65℃保温。在0.5、1、2、3、4、6和19小时采集等分试样。将等分试样煮沸6分钟以终止反应，并用Trinder测定(Sigma化学公司，St Louis，MO)和外部葡萄糖标准品测定葡萄糖浓度。图12显示了结果。在65℃在较少的蛋白质载量下(0.0092μg/ml)，β-葡糖苷酶似乎在6小时时维持其活性的90％，在19小时时为65％。在65℃β-葡糖苷酶似乎可适当稳定至6小时。

生物材料的保藏

下列生物材料已按照布达佩斯条约保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心，北方区域研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Center，1815 University Street，Peoria，Illinois 61604)，并给出下列登记号：

保藏物                    保藏号          保藏日期

大肠杆菌TOP10(pEJG113)    NRRL B-30695    2003-10-17

该菌株已经在如下条件下进行保藏，即根据37 C.F.R.§1.14和35 U.S.C§122，确保在本专利申请的审查过程中由授权的专利与商标官员所指定的人员能够获得该培养物。所述保藏物是所述保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交本申请副本或其后代的国家中，根据外国专利法的要求可以提供上述保藏物。但是，应该理解的是可以获得保藏物并不构成这样的许可，即实施本发明侵害了由政府授予的专利权。

本文描述并要求的发明并不限于本文所公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案意图在于举例说明本发明的几个方面。任何等同的实施方案意图包括在本发明的范围内。当然，根据上文描述，除本文所显示和描述的之外，对本发明的各种修改对本领域技术人员而言应是显而易见的。这些修改也应包括在所附权利要求的范围内。一旦出现冲突，将以包括定义在内的本公开为准。

本文引用了多份参考文献，完整收入其公开书作为参考。 

Claims (20)

1.选自下列的具有β-葡糖苷酶活性的分离多肽：

(a)由SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸序列组成的多肽；

和(b)在SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸的1或2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸处含有保守替代、删除、和/或插入的变体。

2.权利要求1的多肽，其由SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸组成。

3.权利要求1的多肽，由插入到大肠杆菌NRRL B-30695的质粒中的多核苷酸所编码。

4.编码权利要求1-3任一项的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸。

5.权利要求4的分离多核苷酸，其编码由SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸组成的多肽。

6.一种核酸构建体，包含可操作连接至一种或多种控制序列的权利要求4的多核苷酸，其中所述控制序列在表达宿主中指导所述多肽的生产。

7.包含权利要求6的核酸构建体的重组表达载体。

8.包含权利要求6的核酸构建体的重组宿主细胞。

9.生产权利要求1-3任一项的多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞在其野生型时能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。

10.生产权利要求1-3任一项的多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养包含如下核酸构建体的宿主细胞，该核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

11.生产具有突变型核苷酸序列的多核苷酸的方法，包括(a)将至少一种突变导入SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中，其中突变型核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2第20至863位氨基酸组成的多肽；并(b)回收包含突变型核苷酸序列的多核苷酸。

12.通过权利要求11的方法生产的突变型多核苷酸。

13.生产多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养包含编码所述多肽的权利要求12的突变型多核苷酸的细胞；并(b)回收所述多肽。

14.生产权利要求1-3任一项的多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养包含如下多核苷酸的转基因植物或植物细胞，该多核苷酸编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽；并(b)回收所述多肽。

15.包含权利要求1-3任一项的多肽和表面活性剂的洗涤剂组合物。

16.经过编码权利要求1-3任一项的多肽的多核苷酸转化的植物细胞，或选自叶、表皮、叶肉、薄壁组织、脉管组织和分生组织的植物部分。

17.降解含纤维素和半纤维素的生物量的方法，包括用有效量的权利要求1-3任一项的多肽处理生物量并回收经过降解的生物量。

18.权利要求17的方法，还包括用有效量的内切-1，4-β-葡聚糖酶和外切-1，4-β-D-葡聚糖酶处理生物量。

19.降解含纤维素和半纤维素的生物量的方法，包括用权利要求8的宿主细胞处理生物量并回收经过降解的生物量。

20.权利要求19的方法，还包括用有效量的内切-1，4-β-葡聚糖酶和外切-1，4-β-D-葡聚糖酶处理生物量。

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