JP2002515252A

JP2002515252A - 糸状菌変異体細胞においてポリペプチドを生産するための方法

Info

Publication number: JP2002515252A
Application number: JP2000549742A
Authority: JP
Inventors: ワーレイスナー，ジル; クリステンセン，トフ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2002-05-28
Also published as: WO1999060136A1; AU4188099A; CN1301307A; EP1078080A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、増加した量のポリペプチドを生産するための方法であって（ａ）ポリペプチドの生産に適した栄養培地中で親糸状菌細胞の変異体を培養し、ここで（ｉ）変異体細胞はポリペプチドをコードする第１の核酸配列並びにＤＤＣ２及び反応ＤＤＣ３ポリペプチド又はその相同体をコードする１又は複数の第２の核酸配列の改変を含み、そして（ii）変異体細胞は、同じ条件下で培養した時に親細胞より多くのポリペプチドを生産し；そして（ｂ）変異体細胞の栄養培地からポリペプチドを回収することを含む方法に関する。本発明は、第２の核酸配列、第２の核酸配列によりコードされるポリペプチド、及び核酸構成物、細胞発現ベクター、並びにその配列を含む宿主細胞にも関する。本発明に、更に糸状菌細胞の変異体及び変異体細胞を得るための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、糸状菌細胞の変異体においてポリペプチドを生産するための方法、
糸状菌細胞の変異体、及びその変異体を得るための方法に関する。

【０００２】関連技術の記載細胞を変異誘発することによりポリペプチドの生産を改変するためにいくつか
の方法が用いられている。例えば、タンパク質の生産は、変異誘発の頻度を増加
させるために変異誘発（変異誘導）剤として化学、物理及び生物剤で細胞を処理
することに関する古典的な変異誘発により変異体細胞を生産することにより変化
されている。

【０００３】ポリペプチドの生産を増加させるための広く用いられる方法は、そのポリペプ
チドをコードする遺伝子の多重のコピーを生産するための増幅である。例えば、
米国特許第５，５７８，４６１号は、選択マーカーの増幅されたコピーを含む細
胞を好適な選択剤の存在下で細胞を培養することにより選択することができる、
遺伝子と縦一列に並んだ増幅可能な選択マーカー遺伝子の相同的組換えを介する
封入を開示する。

【０００４】更に、ポリペプチドの生産は、１つのプロモーターを異なるプロモーターで、
又は１つのシグナルペプチド領域を別のもので置換することにより増加されてい
る。例えば米国特許第５，６４１，６７０号を参照のこと。ポリペプチドの分泌
は、分泌タンパク質の過剰生産（Ruohonenら、1997、Yeast, 13 : 337〜351）、
及び超分泌細胞を生産すること（米国特許第５，３１２，７３５号）によっても
変えられている。

【０００５】ポリペプチドの生産は、そのポリペプチドを生産するための条件下でそのポリ
ペプチドを加水分解することができるプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を破
壊することによっても増加されている。本発明の目的は、商業的に有意な量のポリペプチドを生産するために変異体糸
状菌株中のポリペプチドの生産を増加させるための改良された方法を供すること
である。

【０００６】発明の概要本発明は、ポリペプチドを生産するための方法であって、（Ａ）親糸状菌細胞の変異体細胞を、該変異体細胞が同じ条件下で培養した時
に前記親細胞より多くの前記ポリペプチドを生産する該ポリペプチドの生産に資
する条件下で培養するステップであって、前記変異体細胞が前記ポリペプチドを
コードする第１の核酸配列、並びに（ｉ）配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のアミノ酸２１〜
８３と少くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする核酸配列；（ii）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１又は配列番号：４のヌ
クレオチド１０４１〜１２２９と少くとも５０％の相同性を有する核酸配列；（iii)（ａ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１もしくは配列番
号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ｂ）少くとも１００ヌクレオチド
の（ａ）のサブ配列、又は（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の相補鎖、と低ストリン
ジエンシー条件下でハイブリダイスする核酸配列；（iv）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む配列番号：
２又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体をコー
ドする核酸配列；（ｖ）（ｉ），（ii）；又は（iii)の対立遺伝子変異体；並びに（vi）（ｉ），（ii），（iii)、又は（ｖ）のサブ配列であってＤＤＣ２又は
ＤＤＣ３ポリペプチド活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするもの
からなる群から選択される１又は複数の第２の核酸配列の改変を含むステップと
、（Ｂ）前記変異体細胞の培養培地から前記ポリペプチドを回収するステップと
、を含む方法に関する。

【０００７】本発明は、糸状菌細胞の変異体及びその変異体細胞を得るための方法にも関す
る。本発明は、ＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチドをコードする単離された第２の
核酸配列、その第２の核酸配列によりコードされる単離されたＤＤＣ２又はＤＤ
Ｃ３ポリペプチド、その第２の核酸配列を含む組換え発現ベクター、及び宿主細
胞にも関する。

【０００８】発明の詳細な記載本発明は、増加した量のポリペプチドを生産するための方法であって、親糸状
菌細胞の変異体細胞を前記ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し、
その変異体細胞の培養培地から前記ポリペプチドを単離することを含み、ここで
前記変異体細胞は前記ポリペプチドをコードする第１の核酸配列及び改変、例え
ば親細胞に対して外来性である１又は複数の第２の核酸配列の破壊又は欠失を含
み、ここで前記改変は同じ条件下で培養した時に前記親細胞と比べて変異体細胞
による前記ポリペプチドの生産を増強する方法に関する。

【０００９】本発明の方法において１又は複数の第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のアミノ酸２１〜
８３と少くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする核酸配列；（ii）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１又は配列番号：４のヌ
クレオチド１０４１〜１２２９と少くとも５０％の相同性を有する核酸配列；（iii)（ａ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１もしくは配列番
号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ｂ）少くとも１００ヌクレオチド
の（ａ）のサブ配列、又は（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の相補鎖、と低ストリン
ジエンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列；（iv）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む配列番号：
２又は配列番号：５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体をコードする
核酸配列；（ｖ）（ｉ），（ii）、又は（iii)の対立遺伝子変異体；及び（vi）（ｉ），（ii），（iii)、又は（ｖ）のサブ配列であって、ＤＤＣ２又
はＤＤＣ３ポリペプチド活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするも
のを有する。

【００１０】ＤＤＣ及び／又はＤＤＣポリペプチド活性は、本明細書において消滅され及び
より好ましくは除去された時にポリペプチドの生産を増加させ又は増強する１つ
の（又は複数の）活性として定義される。第１の実施形態において、第２の核酸配列は、ＤＣＣ２ポリペプチド活性を有
する少くとも約５０％、好ましくは少くとも約６０％、好ましくは少くとも約７
０％、より好ましくは少くとも約８０％、更により好ましくは少くとも９０％、
最も好ましくは少くとも約９５％、そして更に最も好ましくは少くとも約９７％
の配列番号：２のアミノ酸１９〜６４（即ち成熟ポリペプチド）との同一性の程
度（以後、“ＤＣＣ２相同ポリペプチド”又は“ＤＣＣ２ポリペプチド”）、又
はＤＣＣ３ポリペプチド活性を有する少くとも約５０％、好ましくは少くとも約
６０％、好ましくは少くとも約７０％、より好ましくは少くとも約８０％、更に
より好ましくは少くとも約９０％、最も好ましくは少くとも約９５％、そして更
に最も好ましくは少くとも約９７％の配列番号：５のアミノ酸２１〜８３（即ち
成熟ポリペプチド）との同一性の程度（以後、“ＤＣＣ３相同ポリペプチド”又
は“ＤＣＣ３ポリペプチド”）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする。好ましい実施形態において、相同ポリペプチドは、配列番号：２のア
ミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のアミノ酸２１〜８３から、５アミノ酸、好
ましくは４アミノ酸、より好ましくは３アミノ酸、更により好ましくは２アミノ
酸、そして最も好ましくは１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有する。

【００１１】本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、アイデン
ティティーテーブル及び次の多重アラインメントパラメータ、１０のギャップ・
ペナルティー及び１０のギャップ長ペナルティーでＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^TM ＭＥ
ＧＡＬＩＧＮ^TMソフトウエアー（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用いてＣｌｕ
ｓｔａｌ法（Higgins, 1989, CABIO 5 : 151〜153）により決定される。ペアワ
イズアラインメントパラメータはＫｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティー＝３
、ウインドウ＝５、及びダイアゴナル＝５であった。

【００１２】好ましくは、第２の核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドもしくはその対立遺伝子変異体；又はそのＤＣＣ２ポリペプチド活性を有す
るフラグメントをコードする。より好ましい実施形態において、第２の核酸配列
は、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＤＣＣ２ポリペプチドをコードする。別
の好ましい実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸１９
〜６４を含むポリペプチドもしくはその対立遺伝子変異体；又はそのＤＣＣ２ポ
リペプチド活性を有するフラグメントをコードする。別の好ましい実施形態にお
いて、第２の核酸配列は配列番号：２のアミノ酸１９〜６４を含むポリペプチド
をコードする。別の好ましい実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号：
２のアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその対立遺伝子変異体；又はそ
のＤＣＣ２ポリペプチド活性を有するフラグメントをコードする。別の好ましい
実施形態において、第２の核酸配列は配列番号：２のアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドをコードする。別の好ましい実施形態において、第２の核酸配列は、配
列番号：２のアミノ酸１９〜６４からなるポリペプチドもしくはその対立遺伝子
変異体；又はそのＤＤＣ２ポリペプチド活性を有するフラグメントをコードする
。別の好ましい実施形態において、第２の核酸配列は配列番号：２のアミノ酸１
９〜６４からなるポリペプチドをコードする。

【００１３】好ましくは、第２の核酸配列は、配列番号：５のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドもしくはその対立遺伝子変異体；又はそのＤＣＣ３ポリペプチド活性を有す
るフラグメントをコードする。より好ましい実施形態において、第２の核酸配列
は、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＤＣＣ３ポリペプチドをコードする。別
の好ましい実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号：５のアミノ酸２１
〜８３を含むポリペプチドもしくはその対立遺伝子変異体；又はそのＤＣＣ３ポ
リペプチド活性を有するフラグメントをコードする。別の好ましい実施形態にお
いて、第２の核酸配列は配列番号：５のアミノ酸２１〜８３を含むポリペプチド
をコードする。別の好ましい実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号：
５のアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその対立遺伝子変異体；又はそ
のＤＣＣ３ポリペプチド活性を有するフラグメントをコードする。別の好ましい
実施形態において、第２の核酸配列は配列番号：５のアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドをコードする。別の好ましい実施形態において、第２の核酸配列は、配
列番号：５のアミノ酸２１〜８３からなるポリペプチドもしくはその対立遺伝子
変異体；又はそのＤＤＣ３ポリペプチド活性を有するフラグメントをコードする
。別の好ましい実施形態において、第２の核酸配列は配列番号：５のアミノ酸１
９〜６４からなるポリペプチドをコードする。

【００１４】第２の核酸配列は、遺伝コードの縮重の点で、各々配列番号：１又は配列番号
：４と異なる配列番号：２又は配列番号：５のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードする核酸配列も包含する。本発明は、ＤＤＣポリペプチド活性を有す
る配列番号：２のフラグメントをコードする配列番号：１のサブ配列及びＤＤＣ
３ポリペプチド活性を有する配列番号：５のフラグメントをコードする配列番号
：４のサブ配列にも関する。

【００１５】配列番号：１又は配列番号：４のサブ配列は、５’及び／又は３’端からの１
又は複数のヌクレオチドが削除されていることを除いて、各々配列番号：１又は
配列番号：４により包含される核酸配列である。好ましくは、配列番号：１のサ
ブ配列は少くとも１１４ヌクレオチド、より好ましくは少くとも１３８ヌクレオ
チド、最も好ましくは少くとも１６２ヌクレオチドを含み、好ましくは、配列番
号：４のサブ配列は、少くとも１５９ヌクレオチド、より好ましくは少くとも１
８９ヌクレオチド、そして最も好ましくは少くとも２１９ヌクレオチドを含む。

【００１６】配列番号：２又は配列番号：５のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ
及び／又はカルボキシ末端から削除された１又は複数のアミノ酸を有するポリペ
プチドである。好ましくは、配列番号：２のフラグメントは少くとも３８アミノ
酸残基、より好ましくは少くとも４６アミノ酸残基、そして最も好ましくは少く
とも５４アミノ酸残基を含む。好ましくは、配列番号：５のフラグメントは少く
とも５３アミノ酸残基、より好ましくは少くとも６３アミノ酸残基、そして最も
好ましくは少くとも７３アミノ酸残基を含む。

【００１７】対立遺伝子変異体は、同じ染色体座を占有する遺伝子の２又はそれ超の別の形
態のいずれかをいう。対立遺伝子変異は、突然変異から自然に発生し、集団内に
多形性を生じ得る。遺伝子変異はサイレント（コードされるポリペプチドに変化
なし）であっても変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよ
い。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコ
ードされるポリペプチドである。

【００１８】第２の実施形態において、第２の核酸配列は、活性をＤＤＣ２ポリペプチドを
コードする、少くとも約５０％、好ましくは少くとも約６０％、好ましくは少く
とも約７０％、より好ましくは少くとも約８０％、更により好ましくは少くとも
９０％、最も好ましくは少くとも約９５％、更に最も好ましくは少くとも９７％
の配列番号：１の成熟ポリペプチドコーディング配列（即ちヌクレオチド１０１
４〜１１５１）との相同性の程度を有し；又は対立遺伝子変異体もしくはＤＤＣ
２ポリペプチド活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする配列番号：
１のサブ配列、又は活性なＤＤＣ３ポリペプチドをコードする少くとも約５０％
、好ましくは少くとも約６０％、好ましくは少くとも７０％、より好ましくは少
くとも約８０％、更により好ましくは少くとも約９０％、最も好ましくは少くと
も約９５％、そして更に最も好ましくは少くとも約９７％の配列番号：４の成熟
ポリペプチドコーディング配列（即ちヌクレオチド１０４１〜１２２９）との相
同性の程度を有し：又は対立遺伝子変異体及びＤＤＣ３ポリペプチド活性を有す
るポリペプチドフラグメントをコードする配列番号：４のサブ配列である。本発
明の目的のために、２つの核酸配列の間の相同性の程度は、アイデンティティー
テーブル及び次の多重アラインメントパラメータ：１０のギャップ・ペナルティ
ー及び１０のギャップペナルティーでＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^TM ＭＥＧＡＬＩＧＮ ^TM ソフトウエアー（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用いてＷｉｌｂｕｒ−ｌｉ
ｐｍａｎ法（Wilbur及びLipman, 1983, Proceedings of the National Academy
of Science USA 80 : 726〜730）により決定される。ペアワイズアラインメント
パラメータはＫｔｕｐｌｅ＝３、ギャップ・ペナルティー＝３及びウインドウ＝
２０であった。

【００１９】第３の実施形態において、第２の核酸配列は、極めて低いストリンジエンシー
条件、好ましくは低ストリンジエンシー条件、より好ましくは中ストリンジエン
シー条件、より好ましくは中−高ストリンジエンシー条件、更により好ましくは
高ストリンジエンシー条件、最も好ましくは極めて高いストリンジエンシー条件
下で、（ａ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１又は配列番号：４
のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ｂ）少くとも１００ヌクレオチドの（ａ
）のサブ配列、又は（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の相補鎖と同じ条件下でハイブ
リダイズする極酸プローブとハイブリダイズする（J. Sambrook, E. F. Fritsch
及びT. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd editi
on. Cold Spring Harbor, New York)。配列番号：１又は配列番号：４のサブ配
列は、少くとも１００ヌクレオチド又は好ましくは少くとも２００ヌクレオチド
であり得る。更に、サブ配列は、ＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチド活性を有す
るポリペプチドフラグメントをコードし得る。

【００２０】配列番号：１もしくは配列番号：４の核酸配列、又はそのサブ配列及び配列番
号：２もしくは配列番号：５のアミノ酸配列又はそのフラグメントは、当該技術
分野で公知の方法に従って異なる属又は種の株がＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプ
チド活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定し、クローン化するた
めに、核酸プローブをデザインするために用いることができる。特に、このよう
なプローブは、その中の対応する遺伝子を同定し単離するために、標準的なサザ
ンブロット手順の後、関心の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼ
ーションのために用いることができる。このようなプローブは、全体の配列より
かなり短くなり得るが、少くとも１５、好ましくは少くとも２５、より好ましく
は少くとも３５ヌクレオチド長であるべきである。より長いプローブも用いるこ
とができる。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの両方を用いることができる。プローブ
は、典型的には、（例えば³²Ｐ，³ Ｈ，³⁵Ｓ、ビオチン、又はアビジンで）対応
する遺伝子を検出するために標識された。このようなプローブは、本発明に包含
される。

【００２１】これにより、このような他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは
、上述のプローブとハイブリダイズする及びＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチド
活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングすること
ができる。このような他の生物からのゲノム又は他のＤＮＡは、アガロースもし
くはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技術により分離することが
できる。ライブラリーからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡはニトロセルロース又
は他の好適な担体材料に移してそれ上に固定化することができる。配列番号：１
もしくは配列番号：４と相同なクローンもしくはＤＮＡ又はそのサブ配列を同定
するために、担体材料はサザン・ブロットにおいて用いられる。本発明の目的の
ために、ハイブリダイゼーションは、核酸配列が、配列番号：１もしくは配列番
号：５に示す核酸配列、その相補鎖、又はそのサブ配列に対応する標識された核
酸プローブに、極めて低い〜極めて高いストリンジエンシー条件下でハイブリダ
イズすることを示す。核酸プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子
は、Ｘ線フィルムを用いて検出される。

【００２２】好ましい実施形態において、核酸プローブは配列番号：１である。別の好まし
い実施形態において、核酸プローブは配列番号：２のポリペプチド又はそのサブ
配列をコードする核酸配列である。別の好ましい実施形態において、核酸プロー
ブは、ＤＤＣ２ポリペプチド活性を有する成熟ポリペプチドをコードする配列番
号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１である。別の好ましい実施形態におい
て、核酸プローブは大腸菌ＤＳＭ１２０６０内に含まれるコスミド１８Ｈ７内に
含まれる核酸配列である。ここでその核酸配列はＤＤＣ２ポリペプチド活性を有
するポリペプチドをコードする。より好ましい実施形態において、核酸プローブ
は、大腸菌ＤＳＭ１２６０内に含まれるコスミド１８Ｈ７内に含まれる成熟ＤＤ
Ｃ２ポリペプチドコーディング領域である。

【００２３】好ましい実施形態において、核酸プローブは配列番号：４である。別の好まし
い実施形態において、核酸プローブは配列番号：５のポリペプチド又はそのサブ
配列をコードする核酸配列である。別の好ましい実施形態において、核酸プロー
ブは、ＤＤＣ３ポリペプチド活性を有する成熟ポリペプチドをコードする配列番
号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９である。別の好ましい実施形態におい
て、核酸プローブは大腸菌ＤＳＭ１１９２４内に含まれるコスミド３４Ｇ１２内
に含まれる核酸配列である。ここでその核酸配列はＤＤＣ３ポリペプチド活性を
有するポリペプチドをコードする。より好ましい実施形態において、核酸プロー
ブは、大腸菌ＤＳＭ１１９２４内に含まれるコスミド３４Ｇ１２内に含まれる成
熟ＤＤＣ３ポリペプチドコーディング領域である。

【００２４】少くとも１００ヌクレオチド長の長いプローブのために、極めて低い〜極めて
高いストリンジエンシー条件は、標準的なサザンブロット手順の後、４２℃で５
×ＳＳＰＥ，０．３％ＳＤＳ，２００μｇ／mlせん断酸性サケ精子ＤＮＡ、及び
極めて低い、及び低ストリンジエンシーについて２５％ホルムアミド、中及び中
−高ストリンジエンシーについて３５％ホルムアミド、又は高及び極めて高いス
トリンジエンシーについて５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーション
及びハイブリダイゼーションとして定義される。

【００２５】少くとも１００ヌクレオチド長の長いプローブのために、担体材料は、最終的
に３回、各々１５分、２×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは少くと
も４５℃（極めて低いストリンジエンシー）、より好ましくは少くとも５５℃（
中ストリンジエンシー）、より好ましくは少くとも６０℃（中−高ストリンジエ
ンシー）、更により好ましくは少くとも６５℃（高ストリンジエンシー）、及び
最も好ましくは少くとも７０℃（極めて高いストリンジエンシー）で洗浄される
。

【００２６】約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長である短いプローブのために、ス
トリンジエンシー条件は、標準的なサザンブロット手順の後、０．９ＭＮａＣ
ｌ，０．０９ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，Ph７．６，６mM ＥＤＴＡ，０．５％Ｎ
Ｐ−４０，１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１mMピロリン酸ナトリウム、１mM塩
基リン酸ナトリウム、０．１mM ＡＴＰ、及びml当り０．２mgのイーストＲＮＡ
中で、Bolton及びMcCarthy（1962, Proceedings of the National Academy of S
cience USA 48 : 1390)に従う計算を用いて計算されたＴｍ下約５℃〜約１０℃
でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び洗浄後ハイブ
リダイゼーションとして定義される。

【００２７】約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド長である短いプローブのために、担
体材料は、１５分、６×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳで１回、そして１５分、６×Ｓ
ＳＣを用いて、計算したＴｍ下約５℃〜約１０℃で各々２回洗浄される。第２の核酸配列は、（ａ）（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１
５１、（ii）（ｉ）のサブ配列、又は（iii)（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖と、
又は（ｉ）配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２９９、（ii）（ｉ）のサ
ブ配列、又は（iii)（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖と極低、低、中、中−高、高
又は極言ストリンジエンシー条件下でＤＮＡをハイブリダイズさせることにより
；及び（ｂ）核酸配列を単離することにより得ることができる。サブ配列は、好
ましくは、少くとも１００ヌクレオチドの配列、例えばＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポ
リペプチド活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする配列である。

【００２８】第４の実施形態において、第２の核酸配列は、１又は複数のアミノ酸の置換、
欠失、及び／又は挿入を含む配列番号：２又は配列番号：５のアミノ酸配列を有
するポリペプチドの変異体をコードする。変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、１もしくは複数のアミノ酸残基の挿入
もしくは欠失及び／又は１もしくは複数のアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基で
の置換により、配列番号：２もしくは配列番号：５のアミノ酸配列、又はその成
熟ポリペプチドから異なり得る。好ましくは、アミノ酸変換は、小さな性質のも
の、即ちタンパク質のホールディング及び／又は活性に大きく作用しない保存性
アミノ酸置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０アミノ酸のもの；小さなアミ
ノ−又はカルボキシ末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基；約２０〜２５
残基までの小さなリンカーペプチド；又は生味の電荷又は別の機能を変化させる
ことにより精製を容易にする小さな伸長、例えばポリヒスチジントラクス、抗原
性エピトープ又は結合ドメインである。

【００２９】保存性置換の例は塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸
性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及
びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳
香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さな
アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグルー
プ内である。比活性を一般に変化させないアミノ酸置換は当該技術分野で知られ
ており、例えばH. Neurath及びR. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic
Press, New Yorkにより記載される。最も一般的におこる変換はAla/Ser, Val/I
le, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/P
he, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu、及びAsp/Gly 並
びに逆のものである。

【００３０】変異体配列は、配列番号：１又は配列番号：４のポリペプチドコーディング部
分、例えばそのサブ配列として供される核酸配列に基づいて、及び／又はその核
酸配列によりコードされるポリペプチドの別のアミノ酸配列にならないが、その
ポリペプチドの生産のための意図した産生生物のコドン用法に対応するヌクレオ
チド置換の導入により、又は異なる２アミノ酸配列により得るヌクレオチド置換
の導入により作製することができる。ヌクレオチド置換の一般的な記載について
は例えばFordら、1991, Protein Expression and Purification 2 : 95〜107を
参照のこと。

【００３１】このような置換が分子の機能にとって重大である領域の外で行うことができ、
欠失活性をポリペプチドを生ずることは当業者に明らかであろう。第２の核酸配
列によりコードされるポリペプチドの活性にとって本質的であり、それゆえ好ま
しくは置換にかけられないアミノ酸残基は、当該技術分野で知られた手順、例え
ば部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発によって同定すること
ができる（例えばCunning hem及びWells, 1989, Science 244 : 1081〜1085を参
照のこと）。後者の技術において、変異は分子内の各々の正に荷電した残基に導
入され、得られた変異体分子又は分子の活性にとって重大であるアミノ酸残基を
同定するためにＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチド活性についてテストされる。

【００３２】基質−酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学又はホトアフィニティ
ーラベリングのような技術により決定した三次元構造の分析によっても決定する
ことができる（例えばde Vosら、1992, Science 255 : 306〜312；Smithら、199
2, Journal of Molecular Biology 224 : 899〜904；Wlodaverら、1992, FEBS L
etters 309 : 59〜64を参照のこと）。

【００３３】好ましい実施形態において、ＤＤＣ２及びＤＤＣ３ポリペプチドをコードする
２つの第２の核酸配列が、改変される。より好ましい実施形態において、各々配
列番号：１及び配列番号：４に含まれるＤＤＣ２又はＤＤＣ３核酸配列が改変さ
れる。第２の核酸配列は、いずれかの属の微生物から得ることができる。本発明の目
的のために、所定のソースとあわせて本明細書に用いられる“から得られる”と
の用語は、核酸配列によりコードされるポリペプチドが、そのソースにより又は
そのソースからの核酸配列が挿入されている細胞により生産されることを意味す
る。好ましい実施形態において、第２の核酸配列によりコードされるポリペプチ
ドは細胞外に分泌される。

【００３４】第２の核酸配列は、真菌ソース、及びより好ましくはイースト株、例えばカン
ジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クノレイベロマ
イセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマ
イセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スキゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚ
ｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤハロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株；又
はより好ましくは糸状菌株、例えばアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏ
ｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリ
バシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、
ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）
、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）
、マイロテシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ネオカルリマスチクス（Ｎｅｏ
ｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシ
ロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、スキゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏ
ｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスク
ス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポク
ラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａ）株から得ることができる。

【００３５】好ましい実施形態において、第２の核酸配列は、サッカロマイセス・カールス
バーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）
、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉａｓ
ｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロマイセス・オビホル
シス株から得られる。

【００３６】別の好ましい実施形態において、第２の核酸配列は、アスペルギルス・アクレ
アトウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・
アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ホエ
チドウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジ
ャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス
・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギル
ス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザ
エ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、フサリウム・バクトリジオイデ
ス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリ
ス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロツクウエレンセ
（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモルム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕ
ｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓ
ｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチクラトウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｅｔｉｃｕ
ｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、フ
サリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリ
ウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリ
ウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉ
ｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｕｌｐｈｕｒｅｕ
ｍ）、フサリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フ
サリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏ
ｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナトウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕ
ｍ）、ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ヒ
ュミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコル・
ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍ
ｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・ク
ラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロケヌ
ム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・ハ
ルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・
コニンジイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロ
ンギブラキアトウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕ
ｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）、又
はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）から得られ
る。

【００３７】より好ましい実施形態において、ＤＣＣ２ポリペプチドをコードする第２の核
酸配列は、アスペルギルス・オリザエ株、最も好ましくはアスペルギルス・オリ
ザエＩＦＯ４１７７又はその変異体株から得られ、例えば配列番号：２のアミノ
酸配列のポリペプチドである。別のより好ましい実施形態において、核酸配列は
、大腸菌ＤＳＭ１２０６０内に含まれるコスミド１８Ｈ７内に含まれる配列であ
る。別の好ましい実施形態において、核酸配列は、配列番号：１のヌクレオチド
１０１４〜１１５１である。

【００３８】別のより好ましい実施形態において、ＤＤＣ３ポリペプチドをコードする第２
の核酸配列はアスペルギルス・オリザエ株から及び最も好ましくはアスペルギル
ス・オリザエＩＦＯ４１７７又はその変異体株から得られ、例えば配列番号：２
のアミノ酸配列のポリペプチドである。別のより好ましい実施形態において、核
酸配列は大腸菌ＤＳＭ１１９２４内に含まれるコスミド３４Ｇ１２内に含まれる
配列である。別の好ましい実施形態において、核酸配列は配列番号：４のヌクレ
オチド１０４１〜１２２９である。

【００３９】上述の種について、本発明は知られている種の名前にかかわらず、完全及び不
完全状態、並びに他の分類学上の等価物、例えばアナモルフを包含することが理
解されよう、当業者は、適切な等価物の同一性を直ちに認識するであろう。例え
ば、ポリペプチドは、Raper, K. D.及びFennel. D. I. 1965, The Genus Asperg
illus, The Wilkins Company, Baltimoreにより定義されるようなアスペルギル
スの分類学上の等価物である微生物から、知られている種の名前にかかわらず、
得ることができる。アスペルギリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）は、小胞内で終わる
未知のテレオモルフ状態の分生子柄から構成されるアスペルギルムを特徴とし、
小柄（ｓｔｅｒｉｇｍａｔａ）又は小梗（ｐｈｉａｔｉｄｅｓ）と様々に呼ばれ
る同時に形成される特殊化細胞の１又は２の層、及び分生子と呼ばれる無性的に
形成された胞子を有する栄養胞子真菌である。アスペルギルスの周知のテレオモ
ルフは、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）、ネオサルトルヤ（Ｎｅｏｓａｒｔ
ｏｒｙａ）及びエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）を含む。アスペルギルスの
株及びそのテレオモルフは、the American Type Culture Collection (ATCC). D
eutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centra
albureau Voor Schimmelcultures (CBS)、及びAgricultural Research Service
Patent Culture Collection. Northern Regional Research Center (NRRL)のよ
うないくつかのカルチャーコレクションで公に直ちにアクセスできる。更にこの
ような核酸配列は、同定し、そして上述のプローブを用いて、天然（例えば土、
コンポスト、水素）から単離された微生物を含む他のソースが得ることができる
。自然環境から微生物を単離するための技術は当該技術分野で公知である。次に
、核酸配列は、別の微生物のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを同様にスクリー
ニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードする核酸配列
をプローブで検出した後、その配列は、当業者に周知の技術を利用することによ
り単離し又はクローン化することができる（例えばSambrookら、1989、前掲を参
照のこと）。

【００４０】第２の核酸配列は、配列番号：１の成熟ポリペプチドコーディング配列内に少
くとも１の突然変異を含む変異体核酸配列であって、配列番号：２のアミノ酸１
９〜６４からなるポリペプチドをコードするもの、又は配列番号：４の成熟ポリ
ペプチドコーディング配列内に少くとも１の突然変異を含む変異体核酸配列であ
って配列番号：５のアミノ酸２１〜８３からなるポリペプチドをコードするもの
であり得る。

【００４１】ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローン化するために用いる技
術は当該技術分野で周知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製
、又はそれらの組合せを含む。このようなゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列
のクローニングは、例えば公知のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）又は共有する構
造的特徴を有するクローン化されたＤＮＡフラグメントを検出するための発現ラ
イブラリーの抗体スクリーニングを用いることにより行うことができる。例えば
Innisら1990, PCR : A Guide to Methods and Application, Academic Press, N
ew Yorkを参照のこと。他の核酸増幅手順、例えばリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、
連結活性化転写（ＬＡＴ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を用いるこ
とができる。第２の核酸配列は、アスパルギルスの株、又は他のもしくは関連す
る生物からクローン化することができ、これにより、例えばその核酸配列のポリ
ペプチドコーディング領域の対立遺伝子又は種変異体であり得る。

【００４２】変異体糸状菌細胞は、当該技術分野で公知の方法、例えば挿入、破壊、置換又
は削除を用いて、本明細書に記載される１又は複数の第２の核酸配列の発現を減
少させ又は排除することにより作製することができる。改変又は不活性化すべき
第２の核酸配列は、例えば、活性のために本質的であるコーディング領域もしく
はその一部、又はそのコーディング領域の発現のために必要とされる調節又は制
御要素であり得る。例えば、このような調節又は制御配列の例は、プロモーター
又はその機能的部分、即ち核酸配列の発現に作用するために十分な一部分であり
得る。改変の可能な他の調節配列には、これらに限らないが、リーダー、ホツア
デニル化配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、及び転
写アクティベーターがある。

【００４３】第２の核酸配列の改変又は不活性化は、親細胞を変異誘発にかけ、そして第２
の核酸配列の発現が削減され又は除去されている変異体細胞について選択するこ
とにより行うことができる。特異的でもランダムであってもよい変異誘発は、例
えば好適な物理又は化学変異誘発剤の使用、好適なオリゴヌクレオチドの使用に
より、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることにより行うことができ
る。更に、変異誘発は、これらの変異誘発法のいずれかの組合せの使用によって
行うことができる。

【００４４】本目的のために好適な物理又は化学変異誘発剤の例には、紫外（ＵＶ）照射、
ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｍ
ＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、硝酸、エチルメタンスルホネート（
ＥＭＳ）、重亜硫酸ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチドアナログがある。このような剤を用いる場合、変異誘発は、典型的には、変異誘発すべき親細胞
を、好適な条件下で選択された変異誘発剤の存在下でインキュベートし、そして
第２の核酸配列の発現が減少した又は全くない変異体細胞について選択すること
により行われる。

【００４５】第２の核酸配列の改変又は不活性化は、その配列又はその転写もしくは翻訳の
ために必要とされる調節因子中の１又は複数のヌクレオチドの導入、置換、又は
除去によっても行うことができる。例えば、ヌクレオチドは、終止コドンの導入
、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームの変化を生じるように
挿入し又は除去することができる。このような改変又は不活性化は、当該技術分
野で周知の方法に従って、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ生成変異誘発により行
うことができる。原則として、改変は、生体内で、即ち改変すべき第２の核酸配
列を発現する細胞で直接、行うことができるが、以下に例示されるように、試験
管内で改変を行うことが好ましい。

【００４６】選択された糸状菌細胞による第２の核酸配列の発現を減少させ又は除去するた
めの便利な方法の例は、遺伝子置換、遺伝子削除、又は遺伝子破壊の技術に基づ
く。例えば、遺伝子破壊法において、関心の内在性遺伝子又は遺伝子フラグメン
トに対応する核酸配列は試験管内で変異誘発されて欠損核酸配列を作り出し、そ
れは次に親細胞に形質転換されて欠失遺伝子を作り出す。相同的組換えにより、
その欠失核酸配列は内在性遺伝子又は遺伝子フラグメントにおきかわる。欠失遺
伝子又は遺伝子フラグメントは、核酸配列が改変又は破壊されている形質転換体
の選択のために用いることができるマーカーもコードする。

【００４７】あるいは、第２の核酸配列の改変又は不活性化は、その遺伝子の核酸配列に相
補的であるヌクレオチド配列を用いて確立されたアンチセンス技術によって行う
ことができる。より詳しくは、糸状菌細胞による遺伝子の発現は、細胞内で転写
され得、細胞内で生産されたｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる第２の
核酸配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を導入することにより削減され
又は除去され得る。相補アンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダ
イズするのを許容する条件下で翻訳されるタンパク質の量は、これにより削減さ
れ又は排除される。

【００４８】配列番号：１又は配列番号：４の第２の核酸配列に相同であり又は相補的であ
る核酸配列は、以下に記載のいずれかの微生物源から得ることができる。核酸配
列のソースの選択は、糸状菌細胞に依存するが、好ましいソースは真菌源、例え
ばイースト及び糸状菌である。好ましい糸状菌ソースには、これらに限らないが
、アクレモニウム、アスペルギルス、フサリウム、ヒュミコラ、マイセリオフト
ラ、ムコル、ニューロスポラ、ペニシリウム、フアネロカエテ、チエラビア、ト
リポクラジウム、及びトリコデルマがある。好ましいイーストソースには、これ
らに限らないが、カンジダ、ハンセヌラ、クルイベロマイセス、ピキア、サッカ
ロマイセス、スキゾサッカロマイセス、及びヤロビアがある。更に、核酸配列は
、糸状菌細胞に対してネイティブであってもよい。

【００４９】本発明の方法は変異体糸状菌細胞を得るために特定の順番に限られない。本明
細書に記載されるような第２の核酸配列の改変は、ポリペプチドの生産のための
細胞の作製においていずれのステップで親細胞に導入してもよい。変異体糸状菌
細胞の第２の核酸配列は、異種ポリペプチドをコードする第１の核酸配列の導入
の前に既に改変されていることが好ましい。

【００５０】本発明の方法において、糸状菌細胞は野生型細胞又はその変異体であり得る。
好ましくは、糸状菌細胞はアクレモニウム、アスペルギルス、アウレオバシジウ
ム、クリプトコッカス、フィリバシジウム、フサリウム、ジベレラ、ヒュミコラ
、マグナポルテ、ムコル、マイセリオフトラ、マイロテシウム、ネオカリマスチ
クス、ニューロスポラ、パエシロマイセス、ペニシリウム、ピロマイセス、スキ
ゾフィルム、タウロマイセス、サーモアスクス、チエラビア、トリポクラジウム
、又はトリコデルマ細胞である。

【００５１】好ましい実施形態において、糸状菌細胞は、アスペルギルス、アクレアトウス
、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ホエチドウス、アスペルギルス
・ジャポニクス、アスペルギルス・ニジュランス、アスペルギルス・ニゲル、又
はアスペルギルス・オリザエ細胞である。別の好ましい実施形態において糸状菌細胞は、フサリウム・バクトリジオイデ
ス、フサリウム・クロックウエレンセ（フサリウム・セレアリスの同義語）、フ
サリウム・クルモルム、フサリウム・グラシネアルム、フサリウム・グラミヌム
、フサリウム・ヘテロスポルム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシス
ポルム、フサリウム・レチクラトウム、フサリウム・ロゼウム、フサリウム・サ
ンブシヌム、フサリウム・サルコキロウム、フサリウム・ソラニ、フサリウム・
スポロトリコイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロスム、フ
サリウム・トリコテシオイデス、又はフサリウム・ベネアトウム細胞である。

【００５２】別の好ましい実施形態において、糸状菌細胞はジベレラ・プリカリス（Ｇｉｂ
ｂｅｒｅｌｌａｐｕｌｉｃａｒｉｓ）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌ
ｌａｚｅａｅ）、ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌ
ｅｎｓ）、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ
）、ムコル・シエヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフトラ・サー
モフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、マイロ
テシウム・ロリジン（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍｒｏｒｉｄｉｎ）、ニューロス
ポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）、又はペニシリウム・
プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）細胞で
ある。

【００５３】別の好ましい実施形態において、糸状菌細胞は、トリコデルマ・ハハジアヌム
（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンジイ
（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンボブラキ
マトウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリ
コデアルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコ
デルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｖｉｄｅ）細胞である。

【００５４】変異体糸状菌細胞は、当該技術分野で周知の方法を用いて第１の核酸配列によ
りコードされるポリペプチドの生産のために適した栄養培地内で培養される。例
えば、細胞は、好適な培地及び異種ポリペプチドが発現され及び／又は単離され
るのを許容する条件下で行われる研究室又は工業発酵槽内で、振とうフラスコ培
養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、フエドバッチ、又は固相発酵を含む
）によって培養することができる。培養は、当該技術分野で周知の手順を用いて
、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む好適な栄養培地内で行われる。好適な培地
は、商業的供給元から利用でき、又は公開されている組成に従って（例えばAmer
ican Type Culture Collectionのカタログで）調製することができる。ポリペプ
チドは、分泌されるなら、培地から直接、回収することができる。

【００５５】ポリペプチドは、そのポリペプチドに特有の当該技術分野で周知の方法を用い
て検出することができる。これらの検出法には、特定の抗体の使用、酵素産物の
形成、酵素基質の消失、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又はいずれかの他の当該技術分野で
周知の方法がある。例えば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を測定するた
めに用いることができて、酵素活性を決定するための手順は多くの酵素について
当該技術分野で周知である。

【００５６】得られたポリペプチドは、当該技術分野で周知の方法により単離することがで
きる。例えば、ポリペプチドは、これらに限らないが、遠心、ろ過、抽出、噴霧
乾燥、エバポレーション、又は沈殿を含む慣用的な手順により、栄養培地から単
離することができる。次に、単離されたポリペプチドはこれらに限らないが、ク
ロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォ
ーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば調製用等電点電気泳動）、
溶解度の差（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出を含む種々の周知の方法
により更に精製することができる（例えばProtein Purification, J. -C. Janso
n及びLars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989）。

【００５７】第１の核酸配列によりコードされるポリペプチドは、変異体糸状菌細胞に対し
てネイティブ又は外来のいずれのポリペプチドであってもよい。用語“ポリペプ
チド”は、本明細書において、特定の長さのコードされた産物をいい、それゆえ
ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含する。用語“異種ポリペプチ
ド”は、本明細書において、糸状菌細胞に対してネイティブでないポリペプチド
として定義される。変異体糸状菌細胞は、異種ポリペプチドをコードする核酸配
列の１又は複数のコピーを含み得る。

【００５８】好ましい実施形態において、ポリペプチドはホルモン、ホルモン変異体、酵素
、レセプター又はその部分、抗体又はその部分、又はリポーターである。より好
ましい実施形態において、ポリペプチドはオキシドレダクターゼ；トランスフェ
ラーゼ；ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。更によ
り好ましい実施形態において、ポリペプチドはアミノペプチダーゼ、アミラーゼ
、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチ
ナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン、グリコシルトランスフェラーゼ、デ
オキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、イン
ペルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダー
ゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリアーゼ、フィターゼ、ポリ
フェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグ
ルタミナーゼ又はキシラナーゼである。

【００５９】関心のポリペプチドをコードする第１の核酸配列は、原核生物、真核生物、又
は他のソースから得ることができる。本発明の方法において、変異体糸状菌細胞は、細胞に対してネイティブである
ポリペプチドの組換え生産のために用いることもできる。ネイティブポリペプチ
ドは、便利には、例えばポリペプチドをコードする遺伝子を、異なるプロモータ
ーの制御下において、ポリペプチドの発現を増強し、シグナルペプチドの使用に
より細胞の外への関心のネイティブポリペプチドの送出を促進し、そして細胞に
より通常、生産されるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させる
ことができる。

【００６０】本発明は、用語“異種ポリペプチド”の範囲内に、発現が細胞に対してネイテ
ィブでない遺伝子要素の使用に関連する範囲で、糸状菌細胞に対してネイティブ
である内在性ポリペプチドのこのような組換え生産、又は宿主細胞内で通常おこ
らない様式で機能するように操作されているネイティブ要素の使用も包含する。ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し又はクローン化するために用いる
技術は本明細書に記載される。本ポリペプチドをコードする核酸配列は、ゲノム
、ｃＤＮＡ，ＲＮＡ、半合成、合成源、又はそれらのいずれかの組合せのもので
あり得る。

【００６１】本発明の方法において、ポリペプチドは、ポリペプチドの工作された変異体で
あってもよい。本発明の方法において、ポリペプチドは、そのポリペプチド又はそのフラグメ
ントのＮ末端又はＣ末端に別のポリペプチドが融合されている融合又はハイブリ
ッドポリペプチドを更に含み得る。融合ポリペプチドは、１つのポリペプチドを
コードする核酸配列（又はその部分）を、別のポリペプチドをコードする核酸配
列（又はその部分）に融合させることにより生産される。融合ポリペプチドを生
産するための技術は当該技術分野において周知であり、ポリペプチドをコードす
るコーディング配列を、それらが枠内にあり、融合ポリペプチドの発現が同じプ
ロモーター及びターミネーターの制御下にあるように連結することを含む。ハイ
ブリッドポリペプチドは、１又は複数が変異体糸状菌細胞に対して異種であり得
る少くとも２の異なるポリペプチドから得られる部分又は完全なポリペプチド配
列の組合せを含み得る。

【００６２】関心のポリペプチドをコードする単離された第１の核酸配列は、ポリペプチド
の発現を供するための種々の方法で操作することができる。発現は、これらに限
らないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むポリペプチド
の生産に関連するいずれかのステップを含むと理解されよう。ベクターへの挿入
前の核酸配列の操作は、発現ベクターに依存して要求され又は必要とされ得る。
クローニング法を利用する核酸配列を修飾するための技術は当該技術分野で公知
である。

【００６３】 “核酸構成物”は、本明細書において天然の遺伝子から単離され、又はさもな
ければ天然に存在しないであろう様式で組み合わされ又は並べられた核酸フラグ
メントを含むよう改変された一本鎖又は二本鎖の核酸分子として定義される。核
酸構成物との用語は、その核酸構成物がコーディング配列の発現のために要求さ
れる全ての調節配列を含む場合に発現カセットとの用語と同義である。本明細書
に定義される用語“コーディング配列”は、ｍＲＮＡに転写され、ポリペプチド
に翻訳される配列である。コーディング配列の境界は、一般に、ｍＲＮＡの５’
端にオープンリーディングフレームのちょうど上流に位置したＡＴＧ開始コドン
及びｍＲＮＡの３’端にオープンリーディングフレームのちょうど下流に位置す
る転写ターミネーターにより決定される。コーディング配列は、これらに限らな
いが、ゲノム、ｃＤＮＡ，ＲＮＡ、半合成、合成、組換え、又はそれらのいずれ
かの組合せを含み得る。

【００６４】用語“調節配列”は、異種ポリペプチドの発現のために必要であるか又は有利
である全ての成分を含むとして本明細書で定義される。各々の調節配列は、ポリ
ペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブであっても外来性であっても
よい。このような調節配列には、これらに限らないが、リーダー、ポリアデニル
化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、及び転写ターミネー
ターを含む。最小で、調節配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグ
ナルを含む。調節配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列のコーディン
グ領域への調節配列の連結を容易にする特定の制御部位を導入する目的のための
リンカーを供することができる。用語“作用可能に結合”とは調節配列が異種ポ
リペプチドの生産を指示するように、ＤＮＡ配列のコーディング配列に対する位
置に適切におかれる配置として本明細書で定義される。

【００６５】調節配列は、核酸配列の発現のために糸状菌細胞により認識される核酸配列で
ある好適なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列は、異種ポリペプチ
ドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、変異体、トランケー
ト化、及びハイブリッドプロモーターを含む糸状菌細胞において転写活性を示す
いずれかの核酸配列であり得、そしてその細胞に対して同種又は異種である細胞
外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。

【００６６】本発明の方法において、核酸構成物の転写を指示するための好適なプロモータ
ーの例は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘ
イアスパラチックプロテアーゼ、アスペルギルス・ニゲル中性α−アミラーゼ、
アスペルギルス・ニゲル酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル又はア
スペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコル・ミエヘイ
リパーゼ、アスペルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・
オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス、アセ
トアミダーゼ、アスペルギルス・オリザエアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、フサ
リウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ（米国特許第４，２８８，６
２７号）をコードする遺伝子から得られるプロモーター、並びにそれらの変異、
トランケート及びハイブリッドプロモーターである。特に好ましいプロモーター
はＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（アスペルギルス・ニゲル中性α−アミラーゼ及
びアスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子
からのプロモーターのハイブリッド、グルコアミラーゼ及びＴＡＫＡアミラーゼ
プロモーターである。

【００６７】調節配列は、転写を終了させるために糸状菌細胞により認識される配列である
好適な転写・ターミネーター配列でもあり得る。ターミネーター配列は、異種ポ
リペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作用可能に連結される。糸状菌細
胞において機能的であるいずれのターミネーターも本発明に用いることができる
。

【００６８】好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、
アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスアン
トラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニゲルα−グルコシダーゼ、及びフ
ザリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得
られる。

【００６９】調節配列は、糸状菌細胞による転写のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域
である好適なリーダー配列でもあり得る。リーダー配列は、異種ポリペプチドを
コードする核酸配列の５’末端に作用可能に結合される。糸状菌細胞において機
能的であるいずれのリーダー配列も本発明に用いることができる。好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ及びアス
ペルギルス・ニジュランストリホスリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が得
られる。

【００７０】調節配列は、核酸配列の３’末端に作用可能に結合し、転写された時に転写さ
れたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を加えるためのシグナルとして糸状菌細胞に
より認識される配列であるポリアデニル化配列でもあり得る。糸状菌細胞内で機
能的であるいずれのポリアデニル化配列も用いることができる。好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラー
ゼ、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス
アントラニレートシンターゼ、及びアスペルギルス・ニゲルα−グルコシダーゼ
から得られる。

【００７１】調節配列は、異種ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコード
し、細胞の分泌経路にそのコードされたポリペプチドを方向づけるシグナルペプ
チドコーディング領域であってもよい。核酸配列のコーディング配列の５’端は
、固有的に、分泌されるポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメン
トに翻訳読み枠内で天然で連結しているシグナルペプチドコーディング領域を含
み得る。あるいは、コーディング配列の５’端は、そのコーディング配列に対し
て外来性であるシグナルペプチドコーディング領域を含み得る。外来シグナルペ
プチドコーディング領域は、そのコーディング配列がシグナルペプチドコーディ
ング領域を通常、含まない場合に要求され得る。あるいは、外来シグナルペプチ
ドコーディング領域は、ポリペプチドの分泌を増強するために天然のシグナルペ
プチドコーディング領域に単におきかわることができる。しかしながら、発現さ
れた異種ポリペプチドを糸状菌細胞の分泌経路に向かわせるいずれのシグナルペ
プチドコーディング領域も本発明に用いることができる。

【００７２】糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、アスペ
ルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル中性アミラー
ゼ、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラ
チックプロテイナーゼ、ヒュミコラ・インソレンスセルラーゼ、及びヒュミコラ
・ラヌギノサリパーゼのための遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディン
グ領域である。

【００７３】調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置したアミノ酸配列をコードする
プロペプチドコーディング領域でもあり得る。得られたポリペプチドは、プロ酵
素又はプロポリペプチド（又は特定の場合、チモーゲン）として知られる。プロ
ポリペプチドした一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの
触媒又は自己触媒開裂により成熟な活性ポリペプチドに変換することができる。
プロペプチドコーディング領域は、リゾムコル・ミエヘイアスパラチックプロテ
イナーゼ遺伝子、又はマイセリオフトラ・サーモフィララッカーゼ遺伝子から得
ることができる（ＷＯ９５／３３８３６）。

【００７４】シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ酸端
に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し
、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。核酸構成物は、異種ポリペプチドの発現を指示するために有利である１又は複
数の因子、例えば転写アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロ
ン、及びプロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も含み
得る。糸状菌細胞内で機能的であるいずれの因子も本発明に用いることができる
。これらの因子の１又は複数をコードする核酸は、その異種ポリペプチドをコー
ドする核酸配列とタンデムである必要はない。

【００７５】糸状菌細胞の増殖に関連して異種ポリペプチドの発現の制御を許容する制御配
列を加えることも要求され得る。制御システムの例は、制御化合物の存在を含む
、化学的又は物理的刺激に対して遺伝子の発現が応答をターンオン又はオフする
ものである。ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニゲルグ
ルコアミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエグルコアミラーゼ
プロモーターを制御配列として用いることができる。制御配列の他の例は、遺伝
子増幅を許容するもの、例えば重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子であ
る。これらの場合、異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、制御配列に作用
可能に結合されよう。

【００７６】上述の種々の核酸及び調節配列を一緒に連結させて、異種ポリペプチドをコー
ドする核酸配列の挿入又は置換を許容する１又は複数の便利な制限部位を含み得
る組換え発現ベクターを作り出すことができる。あるいは、異種ポリペプチドを
コードする核酸配列は、その配列又はその配列を含む核酸構成物を、発現のため
の好適なベクターに挿入することにより発現させることができる。発現ベクター
を形成することにおいて、コーディング配列は、そのコーディング配列が発現及
びおそらくは分泌のための好適な調節配列に作用可能に結合されるようにベクタ
ー内に位置する。

【００７７】組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に便利にかけることができ、異種ポリ
ペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらし得るいずれのベクター（例えば
プラスミド又はウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベ
クターを導入すべき糸状菌細胞とのそのベクターの適合性に依存するであろう。
ベクターは、直鎖又は閉環状プラスミドであってよい。ベクターは、自己複製ベ
クター、即ちその複製が染色体複製と独立している染色体外存在物として存在す
るベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロソーム、又は人工染色
体であり得る。ベクターは、自己複製を確実にするためのいずれかの手段を含み
得る。あるいは、ベクターは、糸状菌細胞に導入した時に、ゲノム内に組み込ま
れ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであり得る。ベクタ
ーシステムは、糸状菌細胞のゲノム内に導入される全ＤＮＡ、又はトランスポゾ
ンを一緒に含む単一ベクターもしくはプラスミド又は２もしくはそれ超のベクタ
ーもしくはプラスミドであり得る。

【００７８】ベクターは、好ましくは、形質転換された糸状菌細胞の容易な選択を許容する
１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その産物が殺生物又はウイ
ルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性を供する遺伝子である
。糸状菌宿主細胞に用いるための選択マーカーは、これらに限らないが、ａｍｄ
Ｓ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラー
ゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（
ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（ニトレートレダクター
ゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、ｓＣ
（スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐｃ（アントラニレー
トシンターゼ）、並びに他の種からの等価物を含む群から選択することができる
。糸状菌細胞に用いるために好ましいのは、アスペルギルス・ニジュランス又は
アスペルギルス・オリザエのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子並びにストレプトマイ
セス・ヒグロスコピクスのｂａｒ遺伝子である。

【００７９】ベクターは、好ましくは、糸状菌細胞ゲノムへのベクターの安定な組込み又は
細胞のゲノムと独立した細胞内のベクターの自己複製を許容する要素を含む。 “導入”とは、ベクターが染色体組込み物として又は自己複製染色体ベクター
として維持されるように核酸配列を含むベクターを糸状菌細胞に導入することを
意味する。組込みは、細胞内に安定に維持される可能性が高いので一般に有利で
あると考えられている。ベクターの染色体への組込みは、相同的組換え、非相同
性組換え、又は転移により行われる。

【００８０】発現ベクターの糸状菌細胞への導入は、それ自体知られた様式での、プロトプ
ラスト形成、そのプロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生からなる方法に
関する。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための好適な手順は、ＥＰ２３８
０２３及びYeltonら1984, Proceedinsg of the National Academy of Sciences
USA 81 : 1470〜1474に記載される。フサリウム種を形質転換する好適な方法はM
alardierら、1989, Gene. 78 : 147〜156及びＷＯ９６／００７８７により記載
される。

【００８１】糸状菌細胞のゲノムへの組込みのために、ベクターは、異種ポリペプチドをコ
ードする核酸配列又は相同的又は非相同的組換えによるゲノムへのベクターの安
定を組込むためのベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。あるいは、ベク
ターは、糸状菌細胞のゲノムへの相同的組換えによる組込みを指示するための更
なる核酸配列を含み得る。その更なる核酸配列は、ベクターが、染色体内の正確
な位置でゲノムに組み込まれることを可能にする。正確な位置での組込みの可能
性を増加させるために、組込み要素は、好ましくは、相同的組換えの可能性を増
加させるために対応する標的配列と高い相同性を有する十分な数の核酸、例えば
１００〜１，５００塩基対、好ましくは４００〜１，５００塩基対、及び最も好
ましくは８００〜１，５００塩基対を含むべきである。組込み要素は、糸状菌細
胞のゲノム内の標的配列と相同であるいずれの配列であってもよい。更に、組込
み要素は、非コーディング又はコーディング核酸配列であり得る。他方、ベクタ
ーは、非相同的組換えにより細胞のゲノムに組込むことができる。

【００８２】自己複製のために、ベクターはそのベクターが問題の糸状菌細胞内で自律的に
複製するのを可能にする複製の起点を更に含み得る。組換え発現ベクターを作製するために本明細書に記載される要素を連結するた
めに用いる手順は当業者に公知である（例えばJ. Sambrook, E. F. Fritsch、及
びT. Maniatus, 1989, Moleculer Cloning, A Laboratory Manual. 2d edition.
Cold Spring Harbor. New Yorkを参照のこと）。

【００８３】本発明の別の態様において、変異体糸状菌細胞は、関心のポリペプチドの生産
、回収及び／又は適用に有害であり得るタンパク質をコードする１又は複数の第
３の核酸配列の改変を更に含み得る。その改変は、１又は複数の第３の核酸配列
の発現を減少させ又は除去して、同じ条件下で培養した時に第３の核酸配列の改
変のない変異体細胞より多くのポリペプチドを生産することができる変異体細胞
を生じる。

【００８４】第３の核酸配列は、いずれかのタンパク質又は酵素をコードし得る。例えば、
酵素は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプ
チダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキスト
リングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボスクレアーゼ、エステラーゼ
、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グル
コシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マ
ンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダー
ゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分
解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼであり
得る。第３の核酸配列は、好ましくは、タンパク質分解酵素、例えばアミノペプ
チダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、又はプロテアーゼをコードする。

【００８５】本発明は、変異体糸状菌細胞を生産するための方法であって、（Ａ）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のアミノ酸
２１〜８３と少くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードする核酸配列；（ii）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１又は配列番号：４のヌ
クレオチド１０４１〜１２２９と少くとも５０％の相同性を有する核酸配列；（iii)（ａ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１もしくは配列番
号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ｂ）少くとも１００ヌクレオチド
の（ａ）のサブ配列、又は（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の相補鎖、と低ストリン
ジエンシー条件下でハイブリダイスする核酸配列；（iv）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む配列番号：
２又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体をコー
ドする核酸配列；（ｖ）（ｉ），（ii）；又は（iii)の対立遺伝子変異体；並びに（vi）（ｉ），（ii），（iii)、又は（ｖ）のサブ配列であってＤＤＣ２又は
ＤＤＣ３ポリペプチド活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするもの
を有する親糸状菌細胞の１又は複数の核酸配列を改変し；そして（Ｂ）その改変された核酸配列を含むステップ（Ａ）からの変異体を同定する
ことを含む方法にも関する。

【００８６】本発明は、ポリペプチドを生産するための変異体糸状菌細胞であって、前記ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、並びに（ａ）配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のアミノ酸２１〜
８３と少くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする核酸配列；（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１又は配列番号：４のヌ
クレオチド１０４１〜１２２９と少くとも５０％の相同性を有する核酸配列；（ｃ）（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１もしくは配列番
号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ii）少くとも１００ヌクレオチド
の（ｉ）のサブ配列、又は（iii)（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖、と低ストリン
ジエンシー条件下でハイブリダイスする核酸配列；（ｄ）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む配列番号：
２又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体をコー
ドする核酸配列；（ｅ）（ａ），（ｂ）；又は（ｃ）の対立遺伝子変異体；並びに（ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ）、又は（ｅ）のサブ配列であってＤＤＣ２又は
ＤＤＣ３ポリペプチド活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするもの
からなる群から選択される第２の核酸配列の改変を含む変異体糸状菌細胞にも関
する。

【００８７】本発明は、本明細書に記載される核酸配列によりコードされる単離されたＤＤ
Ｃ２及びＤＤＣ３ポリペプチド、並びにそのフラグメント、対立遺伝子変異体、
及び変異体にも関する。その単離されたポリペプチドは、（ａ）配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のアミノ酸２１〜
８３と少くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１もしくは配列番
号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ii）少くとも１００ヌクレオチド
の（ｉ）のサブ配列、又は（iii)（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖、と低ストリン
ジエンシー条件下でハイブリダイスする核酸配列によりコードされるポリペプチ
ド；（ｃ）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む配列番号：
２又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体；（ｄ）（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；並びに（ｅ）（ａ），（ｂ）、又は（ｄ）のフラグメントであってＤＤＣ２又はＤＤ
Ｃ３ポリペプチド活性を有するフラグメントからなる群から選択される。

【００８８】本発明の単離されたＤＤＣ２及びＤＤＣ３ポリペプチドは、配列番号：２又は
配列番号：５のポリペプチドの活性の少くとも２０％、好ましくは少くとも４０
％、より好ましくは少くとも６０％、更により好ましくは少くとも８０％、更に
より好ましくは少くとも９０％、そして最も好ましくは少くとも１００％を有す
る。

【００８９】ＤＤＣ２及びＤＤＣ３ポリペプチドは、真菌源、より好ましくは、イースト株
、例えばカンジダ、ハンセヌラ、クルイベロマイセス、ビキア、サッカロマイセ
ス、スキゾサッカロマイセス、又はセロビア株；又は糸状菌株、例えばアクレモ
ニウム、アスペルギルス、アウレオバシジウム、クリプトコッカス、フィリバシ
ジウム、フサリウム、ジベレラ、ヒュミコラ、マグナポルテ、ムコル、マイセリ
オフトラ、マイロテシウム、ネオカリマスチクス、ニューロスポラ、パエシロマ
イセス、ペニシリウム、ピロマイセス、スキゾフィルム、タラロマイセス、サー
モアスクス、チエラビア、トリポクラジウム、又はトリコデルマ株から得ること
ができる。より好ましい実施形態において、本発明のＤＤＣ２ポリペプチドは、
アスペルギルス・オリザエ株、最も好ましくはアスペルギルス・オリザエＩＦＯ
４１７７又はその変異体株から得られ、例えば配列番号：２のアミノ酸配列のポ
リペプチドである。

【００９０】別のより好ましい実施形態において、本発明のＤＤＣ３ポリペプチドは、アス
ペルギルス・オリザエ株、最も好ましくはアスペルギルス・オリザエＩＦＯ４１
７７又はその変異体から得られ、例えば配列番号：２のアミノ酸配列のポリペプ
チドである。上述の種のために、本発明は完全及び不完全状態の両方、及び他の分類学的等
価物、例えばアナモルフを、上述のようにそれらが知られている種名にかかわら
ず、理解されよう。

【００９１】ＤＤＣ２及びＤＤＣ３ポリペプチドは、本明細書に記載される技術を用いて単
離することができる。本明細書に用いる場合、“単離された”ポリペプチドは、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、本質的に他のポリペプチドを含まない、例え
ば少くとも約２０％純度、好ましくは少くとも約４０％純度、より好ましくは約
６０％純度、更により好ましくは約８０％純度、最も好ましくは約９０％純度、
そして更に最も好ましくは約９５％純度のポリペプチドである。

【００９２】本発明は、本明細書に記載されるようなＤＤＣ２及びＤＤＣ３ポリペプチド並
びにそれらのフラグメントをコードする単離された核酸配列にも関する。好ましい実施形態において、核酸配列は配列番号：１に記載される。別の好ま
しい実施形態において、核酸配列は大腸菌ＤＳＭ１２０６０内に含まれるコスミ
ド１８Ｈ７に含まれる配列である。別の好ましい実施形態において、核酸配列は
配列番号：１のポリペプチドコーディング領域である。別の好ましい実施形態に
おいて、核酸配列は、大腸菌ＤＳＭ１２０６０内に含まれるコスミド１８Ｈ７に
含まれるポリペプチドコーディング領域である。

【００９３】別の好ましい実施形態において、核酸配列は配列番号：４に示される。別の好
ましい実施形態において、核酸配列は配列番号：４のポリペプチドコーディング
領域である。別の好ましい実施形態において、核酸配列は、大腸菌ＤＳＭ１１９
２４に含まれるコスミド３４Ｇ１２に含まれる配列である。別の好ましい実施形
態において、核酸配列は、大腸菌ＤＳＭ１１９２４に含まれるコスミド３４Ｇ１
２に含まれるポリペプチドコーディング領域である。

【００９４】本発明は、配列番号：１又は配列番号：４のポリペプチドコーディング配列内
に少くとも１の突然変異を含む単離された変異体核酸配列であって、各々配列番
号：２又は配列番号：５からなるポリペプチドをコードするものにも関する。ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し又はクローン化するために用いる
技術は当該技術分野で周知であり本明細書に記載される。

【００９５】本明細書に用いる用語“単離された核酸配列”は、他の核酸配列を本質的に含
まない、例えばアガロース電気泳動により決定して少くとも約２０％純度、好ま
しくは少くとも約４０％純度、より好ましくは少くとも約６０％純度、更により
好ましくは少くとも約８０％純度、そして最も好ましくは少くとも約９０％純度
である核酸配列をいう。例えば、単離された核酸配列は、核酸配列をその天然の
位置から、それが再生されるであろう異なる部位に再配置するための遺伝子操作
に用いられる標準的なクローニング手順によって得ることができる。クローニン
グ法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、要求される核酸フラグメン
トの切り出し及び単離、そのフラグメントのベクター分子への挿入、及びその組
換えベクターの、その核酸配列の多重コピー又はクローンが複製されるであろう
宿主細胞への組込みに関し得る。その核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ，ＲＮＡ、
半合成、合成源、又はそれらの組合せであり得る。

【００９６】本発明のＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチドをコードする核酸配列の改変は、
ＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチドと実質的に類似であるポリペプチドの合成の
ために必要であり得る。ＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチドに“実質的に類似”
との用語は、そのポリペプチドの非天然型をいう。これらのポリペプチドは、そ
のネイティブソースが単離されたＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチドからいくつ
かの工学的方法において異なり得、例えば比活性、熱安定性、pH至適性等で異な
る変異体である。その変異体ポリペプチドは、先に記載の通り作製することがで
きる。

【００９７】本発明は、（ａ）極低、低、中、中−高、高又は極高ストリンジェンシー条件
下で、ＤＮＡを、（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１、（ii
）（ｉ）のサブ配列、又は（iii)（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖と；又は（ｉ）
配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ii）（ｉ）のサブ配列、又
は（iii)（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖とハイブリダイズさせ；そして（ｂ）そ
のＤＮＡから核酸配列を単離することにより生産された単離された核酸配列にも
関する。そのサブ配列は、好ましくは、ＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチド活性
を有するポリペプチドフラグメントをコードする配列のような少くとも１００ヌ
クレオチドの配列である。

【００９８】本発明は更に、変異体核酸配列を生産するための方法であって、配列番号：１
又は配列番号：４のポリペプチドコーディング配列に少くとも１の突然変異を導
入することを含み、ここでその変異体核酸配列は、各々配列番号：２又は配列番
号：５からなるポリペプチド、又はそのＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチド活性
を有するフラグメントをコードする方法に関する。

【００９９】１つのヌクレオチドと別のヌクレオチドに交換するための核酸配列への突然変
異の導入は、当該技術分野で周知の方法のいずれかを用いて部位特異的変異誘発
により行うことができる。特に役立つのは、関心の挿入物及び要求される変異を
含む２つの合成プライマーと共にスーパーコイル状の二重鎖ＤＮＡベクターを利
用する方法である。各々がベクターの反応の鎖に相補的であるオリゴヌクレオチ
ドプライマーは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにより温度サイクルの間に伸長する
。プライマーの組込みにより、スタガード・ニック（Staggered nicks)を含む変
異体プラスミドが形成される。温度サイクルの後、その生成物は、メチル化及び
ヘシメチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎｔで処理され親ＤＮＡテンプレートを消化
し、変異を含む合成ＤＮＡについて選択する。当該技術分野で周知の他の手順も
用いることができる。

【０１００】本発明は、配列の発現のための、本明細書に記載されるような配列番号：１も
しくは配列番号：４の核酸配列、そのサブ配列又は相同体を含む核酸構成物、組
換え発現ベクター、及び宿主細胞にも関する。その構成物及びベクターは、本明
細書に記載されるように作製することができる。宿主細胞は、その核酸配列の発
現のために適したいずれかの細胞であり得、好ましくは真菌細胞、より好ましく
は本明細書に記載される群から選択される糸状菌細胞である。用語“宿主細胞”
は、複製の間におこる突然変異により親細胞と同一でない親細胞のいずれの子孫
も包含する。宿主細胞の選択は、かなりの程度、そのポリペプチドをコードする
遺伝子及びそのソースにするであろう。

【０１０１】本発明は、ＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチドを生産するための方法であって
、（ａ）そのポリペプチドを生産することができる野生型である株と、ＤＤＣ２
又はＤＤＣ３ポリペプチドの生産のために資する条件下で培養し；そして（ｂ）
その培養培地からポリペプチドを回収することを含む方法にも関する。好ましく
は、その株は、アスペルギルス属の株、より好ましくはアスペルギルス・オリザ
エである。

【０１０２】本発明は、本発明のＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチドを生産するための方法
であって、（ａ）宿主細胞を、ＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチドの生産のため
に適する条件下で培養し；そして（ｂ）その培養培地からＤＤＣ２又はＤＤＣ３
ポリペプチドを回収することを含む方法にも関する。本発明の生産方法において、細胞は、本明細書に記載されるように、当該技術
分野で周知の方法を用いてＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチドの生産のために適
した栄養培地中で培養される。得られたＤＤＣ２又はＤＤＣ３ポリペプチドは、
本明細書に記載されるような当該技術分野で知られた方法により回収し、精製す
ることができる。

【０１０３】シグナルペプチド本発明は、配列番号：２のアミノ酸１〜１８からなるシグナルペプチドをコー
ドする配列番号：１のヌクレオチド９６０〜１０１３又は配列番号：５のアミノ
酸１〜２０からなるシグナルペプチドをコードする配列番号：４のヌクレオチド
９８１〜１０４０からなる核酸配列に作用可能に結合したタンパク質をコードす
る遺伝子を含む核酸構成物であってその遺伝子がその核酸配列に対して外来性で
あるものにも関する。

【０１０４】本発明は、このような核酸構成物を含む、組換え発現ベクター及び組換え宿主
細胞にも関する。本発明は、タンパク質を生産するための方法であって、（ａ）そのタンパク質
の生産のために適した条件下でこのような組換え宿主細胞を培養し、そして（ｂ
）そのタンパク質を回収することを含む方法にも関する。

【０１０５】その核酸配列は、他の調節配列と共に外来遺伝子に作用可能に結合させること
ができる。このような他の調節配列は上述される。そのタンパク質は、宿主細胞に対してネイティブであっても異種であってもよ
い。用語“タンパク質”は、本明細書においてコードされる産物の長さを問わず
、それゆえペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含する。用語“タンパ
ク質”は、そのコードされる産物を形成するように組み合わされた２又はそれ超
のポリペプチドも包含する。そのタンパク質は、１又は複数が宿主細胞に対して
異種でもネイティブでもよい。少くともこの異なるタンパク質から得られる部分
又は完全なポリペプチド配列の組合せを含む、ハイブリッドポリペプチドを含む
。タンパク質は、更に、上述のタンパク質及びハイブリッドタンパク質の天然の
対立遺伝子及び工学的変異体を含む。

【０１０６】好ましくは、タンパク質は、ホルモン、ホルモン変異体、酵素、レセプターも
しくはその部分、抗体もしくはその部分、又はリポーターである。より好ましい
実施形態において、タンパク質はオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、
ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。更により好まし
い実施形態において、タンパク質は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボ
ヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、
クチナーゼ、シクロデキストリン、グリコシルトランラスフェラーゼ、デオキシ
リボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルタ
ーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペ
クチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ
、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシ
ラナーゼである。

【０１０７】その遺伝子は、原核生物、真核生物又は他のソースのいずれかから得ることが
できる。本発明は、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでないこと、下の例
により更に記載される。実施例材料緩衝液及び基質として用いる化学物質は少くとも試薬グレードの商用製品であ
った。

【０１０８】実施例１：アスペルギルス・オリザエ株ＨＣ４．０１及び２７に上るＣＡＲＥ
ＺＹＭＥ^TMの生産細胞及びβ−１，４−エンドグルカナーゼ（ＣＡＲＥＺＹＭＥ^TM）を生産する
アスペルギルス・オリザエを、ＷＯ９１／１７２４３に記載されるように作製し
た。ＣＡＲＥＺＹＭＥ^TMはNovo Nordisk ACS, Bagsvaerd, Denmarkにより生産さ
れるトリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum)セルラーゼである。
アスペルギルス・オリザエＡ１５６０−Ｔ４０中のｐＳＸ３２０の形質転換体ｎ
ｏ．２７（ＷＯ９１／１７２４３）を、すぐれた株を作り出すために変異誘発の
ために選択した。形質転換体Ｎｏ２７は、ＮＴＧにより変異誘発されており、プ
レート形態が変化している株を単離した。これらのＨＣ４．０１と呼ぶものは振
とうフラスコ発酵において及びタンク発酵においてＣＡＲＥＺＹＭＥ^TM収量の増
加を示した。アスペルギルス・オリザエ株ＨＣ４．０１及びｎｏ．２７の間の差
を更にキャラクタライズするための試みにおいて、２つの株からのｍＲＮＡ調製
物をディフェレンシャルディスプレイ法により比較した。

【０１０９】アスペルギルス・オリザエ株ＨＣ４．０１及び２７を、Nutriose、イーストエ
キス、ＭｇＳＯ₄ −７Ｈ₂ Ｏ、クエン酸、Ｋ₂ ＳＯ₄ ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、尿素、ト
リメチルグリシン及び微量金属溶液から構成されるマリッターフェド・バッチ中
で５日間、３４℃、pH７、８００〜１１００rpm で並べて増殖させた。ＣＡＲＥＺＹＭＥ^TM活性を、Novo Nordisk ACS Bagsvaerd, Denmark から得た
精製されたＣＡＲＥＺＹＭＥ^TM標準と比べて、pH７の１％ＣＭＣ溶液の粘度変化
（減少）として測定した。

【０１１０】４８時間目に、２つの株により生産されたＣＡＲＥＺＹＭＥ^TMレベルは異なり
始めた。実施例２：ディフェレンシャルディスプレイアスペルギルス・オリザエ株ＨＣ４．０１及び２７の表現型における差のため
の遺伝子ベースを、示差ｍＲＮＡディスプレイにより分析した。これらの実験に
用いたプライマーを表１に列記する。プライマーは、５′端に４ヌクレオチド、
次にＨｉｎｄIII 制限酵素部位を含んだ。オリゴ（ｄＴ₁₂Ｎ₂ ）プライマーのセ
ットを用いて、４８時間目の２つの細胞系のｍＲＮＡ集団を１２の副次集団に分
け、ｃＤＮＡを生産させた。次にこのｃＤＮＡをオリゴ（ｄＴ₁₂Ｎ₂ ）プライマ
ーの同じセット及び１セットのランダムプライマーを用いてＰＣＲ増幅により更
に分けた。次にこれらの反応からのアンプソコンをポリアクリルアミドゲル電気
泳動を変性させることにより分解した。２つの細胞系の間で異なって発現された
遺伝子を、フットプリントを並べて比べた時にレーンの１つにおけるバンドの欠
如により同定した。

【０１１１】ＲＮＡを、Wahleithner 5, 1996, Current Genetics 29 : 395-403により記載
される手順に従って４８時間目に各々の細胞系の凍結した菌糸体から調製した。
ゲルＤＮＡフラグメントを製造元の説明に従ってMessage Clean Kit (Gen-Hunte
r Corp., Nashville, TN）を用いてＤＮａｓｅ処理により除去した。各々の固定されたｄＴ₁₂Ｎ₂ プライマーについて、アスペルギルス・オリザエ
株ＨＣ４．０１及び２７からの全ＲＮＡ３．７５μｇＴＣ、２つの別個の反応で
、１．０μＭのプライマー、１５μＬの５×第１鎖合成緩衝液（Life Technolog
ies, Gaithersburg, MD)、１０μＭジチオトレイトール、及び２０μＭｄＮＴ
Ｐと、７５μＬの最終容量で混合した。その溶液を６５℃で５分、インキュベー
トし、氷上で迅速に冷やし、５００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ II^TM 逆転写酵素（Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加えた。３７℃で１時間
のインキュベーションの後、その反応を９５℃で５分の熱処理により停止させ、
その第１鎖サンプルを−２０℃で保存した。

【０１１２】

【表１】

【０１１３】ＰＣＲ増幅反応を、各々のプライマー対（２４０の異なるプライマー対）で、
対照及び変異体ＲＮＡの両方について３回重複してセットアップした。その増幅
は、１．０μＬのｃＤＮＡ反応、２．０μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００mM
ＫＣｌ；１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH９．０；１５mM ＭｇＣｌ₂ ；１％（
ｗ／ｖ）ゼラチン；１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、１．５μＬの２
５mM ｄＮＴＰ、２．５μＬの１０mM５′アービトラリー（arbitrary)プライマ
ー、１．２５μＬの１０mM Ｔリッチプライマー、０．１５μＬの³²Ｐ−ｄＡＴ
Ｐ（2000 Ci 1mM, New England Nuclear-DuPont, Boston, MA)、及び２．５ユニ
ットのＴａｇＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）をＨ ₂ Ｏで２０μＬに調製した容量で構成された。反応を、９８℃で１０秒の１サイ
クル；９４℃で３０秒、４２℃で６０秒、及び７２℃で３０秒の４サイクル；並
びに９４℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の２５サイクルについて
プログラムしたサーチサイクラーを用いて行った。

【０１１４】各々のＰＣＲ反応の３．５μＬアリコートを、ホルムアミドシーケンシング染
色溶液中で変性させ、６％ポリアクリルアミド、７％尿素シーケンシングゲルで
分解した。１つのプライマー対からの３回重複対照及び変異体ＰＣＲ反応物を、
バンドパターンの比較のため隣接する列で電気泳動した。ゲルをWhatman ３Ｍ紙
上で乾燥させ、蛍光ルーラーテープで方向についてマークし、医療用Ｘ線フィル
ムのシートに一晩、露出した。ディフェレンシャルディスプレイ反応の未使用部
分はフラグメントスクリーニングに用いるために−２０℃に凍結した。

【０１１５】そのフィルム及びゲルを蛍光ルーラーからのトレースを用いてアラインした。
異なって示されたバンドをマークし、ゲルから外科用メスで切り出した。Whatma
n フィルターペーパーを含むゲルスライスを１０分、環境温度で浸漬し、次に１
５分、９５℃で１．５mLエッペンドルフ遠心チューブ中０．１mLの水中でインキ
ュベートした。その溶出されたＤＮＡを１０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、５μＬ
の１０mg／mLグリコーゲン、及び０．４５μＬの１００％エタノールの１０μＬ
の溶液を用いて沈殿させた。そのＤＮＡペレットを１０μＬの水中に再度懸濁し
、増幅のために最初に用いたのと同じプライマー対を用いて上述分と同じ条件下
だが６０℃のアニーソング温度を用いて４０回のＰＣＲで再び増幅した。

【０１１６】そのＰＣＲ増幅したバンドを、ＥｃｏＲＶで直鎖化し、Hadjeb及びBerkonitz,
1996, Biotechniques 20 : 20〜22に記載されるプロトコルに従ってＴＡ−テー
ル化されているＰＣＲ２．１（Invitrogen, La Jolla, CA）に連結した。連結物
をコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換し、得られたクローンを、Ｘ−ｇ
ａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
）を含むアガロースプレート上での青／白選択によりスクリーニングした。各々
の異なって示されたフラグメントについて、更なる分析のために６のコロニーを
採取した。

【０１１７】実施例３：異なって示されたフラグメントのスクリーニング実施例２に記載される６のコロニーのグループの各々をmL当り１００μｇのア
ンピシリンを補給したＬｕｒｉａ培地（１％バクトドプトン−０．５％イースト
エキス−０．５％塩化ナトリウム）３mL中で一晩、増殖させた。その細胞を遠心
により収集した。その細胞ペレットを、mL当り１００μｇのＲＮａｓｅＡを含む
１０mM ＥＤＴＡ−５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０緩衝液０．３mLに再度
懸し、０．３mLの１％ＳＤＳ−２００mM ＮａＯＨを加えることにより溶解した
。環境温度５分のインキュベーションの後、０．３mLの２．０Ｍ酢酸カリウムpH
５．５を加えた。そのライゼートを１５，０００xgで４℃で１０分の遠心により
不純物を除去した。その上清をエッペンドルフチューブに移し、次に０．７mLの
イソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。そのＤＮＡを４℃で１５，００
０xgでの１５分の遠心により収集した。そのペレットを０．１mLの１mM ＥＤＴ
Ａ−１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０中に再度懸濁し、そのサンプルを−２
０℃に保存した。

【０１１８】そのクローン化したフラグメントをそれらのもとのＰＣＲ反応にもどす再ハイ
ブリダイゼーション（−２０℃で保存した反応の未使用部分）により発現の差に
ついて最初にスクリーニングした。各々のコロニーからの調製されたＤＮＡをＨ ₂ Ｏで１：２０に希釈し、次にスロット・ブロット製造を用いて二重ナイロン膜
に適用した。各々の重複膜は、４つの別個のプライマー対を用いて同定されたこ
れらのフラグメントからのクローンを有した（即ちオリゴＥ及びプライマー０．
１，０．３，０．６及び０．８からのアンプリコンを含むレーンから切り出した
フラグメント）。その膜を真空オーブン中で８０℃で１〜２時間熱し、次に高ス
トリンジェンシー条件（５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、４２℃）下でハイブ
リダイズさせた。１つのフィルターについてのハイブリダイゼーションプローブ
は、変異体株からのｃＤＮＡを用いて増幅された三回重複反応からの変性産物を
含み、それらコロニーに対応する４つのプライマー対をスクリーニングし；他方
のフィルターについては対照株からｃＤＮＡを合成した。オリゴＤ並びにプライ
マー０．１，０．３，０．６、及び０．８並びにアスペルギルス・オリザエＨＣ
４．０１ｃＤＮＡを用いて生産されたフラグメントからコロニーを得たなら、こ
れらＰＣＲ反応をハイブリダイゼーション混合物に加えた。膜を、６５℃で０．
５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５分、１回洗浄し、Phosphor tmager (Molec
ular Dynamics, Sunnyvale, CA）で分析した。フラグメントをアスペルギルス・
オリザエＨＣ４．０１、ＤＮＡから増幅したが、アスペルギルス・オリザエ２７
ｃＤＮＡでないなら、クローンはアスペルギルス・オリザエＨＣ４．０１ＰＣＲ
反応にもどってハイブリダイズするだけのはずである。もとのディフェレンシャ
ルディスプレイと一致した２つのプローブのうちの一方のみとハイブリダイズす
るクローンを保存し、それらの挿入物をNorthern分析におけるプローブとして用
いた。

【０１１９】ノーザンブロット分析を、ホルムアルデヒドゲル電気泳動についてManiatisら
、1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press
Cold Spring Harbor, New York に従って行った。アスペルギルス・オリザエ株
２７及びＨＣ４．０１各々からの全ＲＮＡを含むフィルターを高ストリンジェン
シー条件（５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ，４２℃）下でハイブリダイズさせ
、最初のスロット・ブロットスクリーニングの後に陽性であるこれらのクローン
からのアガロースゲル精製ＤＮＡを放射能標識した。そのＤＮＡをα（³²Ｐ）ｄ
ＣＴＰ（Amersham, Arlington Height, IL）でのニック・トランスレーション（
Mcniatisら、前掲）により放射能標識し、緩衝液１mL当り約１×１０⁶ cpm の活
性でハイブリダイゼーション緩衝液に加えた。

【０１２０】２つの異なる挿入物は、それらがアスペルギルス・オリザエ２７ＲＮＡにハイ
ブリダイズし、アスペルギルス・オリザエＨＣ４．０１ＲＮＡにハイブリダイズ
しないハイブリダイゼーションの差を示した。これらのプラスミドを、ＤＤＣ２
の挿入物を伴うｐＴｏＣ３６７、ＤＤＣ３の挿入物を伴うｐＴｏＣ３７０とした
。

【０１２１】実施例４：ＤＤＣ２及びＤＤＣ３についてのｃＤＮＡの単離及びキャラクタリ
ゼーションｐＴｏＣ３６７（約２５０bp）からのＤＤＣ２挿入物を、製造元の説明に従っ
てＡＢＩ自動化ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA)で
配列決定し、遺伝子の転写の方向を示す一端にいわゆる“ポリＡテール”である
アデノシン残基のストレッチを含む部分的ｃＤＮＡ配列を得た。

【０１２２】二重本鎖ｃＤＮＡを以下のプロトコルに従って合成した。第１鎖ｃＤＮＡを形
成するために、アスペルギルス・オリザエ２７（２日目）からの全ＲＮＡの１．
０μｇを１mM CapSwitch^TM オリゴヌクレオチド（Clontech, Palo Alto, CA)及
び１mM ＣＤＳ／３′ＰＣＲプライマー（Oligo (dT)₃₀N.N 及びN₁=A.C 又はG)
（Clontech, Palo Alto, CA)と共に５μＬの最終溶量で加えて、７２℃で２分、
インキュベートし、次に２分、氷上で冷却した。その反応物を３０秒、遠心器で
遠心し、次に次のものを加えた：２．０μＬの５×第１鎖合成緩衝トランスクリ
プターゼ（Life Technologies, Gaithersburg, MD)、１．０μＬの２０mMジチオ
トレイトール、１．０μＬの１０mM ｄＮＴＰ、及び２０ユニットのＳｕｐｅｒ
Ｓｃｒｉｐｔ^TMII逆転写酵素（Life Technologies, Gaithersburg, MD)。４２
℃で１時間のインキュベーションの後、ｃＤＮＡを−２０℃に保存した。第２鎖
ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅により調製し、ここでは２μＬの第１鎖反応物を１０μＬ
の１０×ＰＣＲ緩衝液、２μＬの１０mM ｄＮＴＰ、２μＬの５′ＰＣＲプライ
マー、２μＬのＣＤＳ／３′ＰＣＲプライマー、及び２μＬの５０×Advantage
Klen Tagポリメラーゼ混合物（Clontech, Palo Alto, CA)と混合した。増幅は、
９５℃で１分の１サイクル、９５℃で１５秒及び６８℃で５分の２０サイクルに
ついてプログラムしたサーモサイクラーで行った。

【０１２３】ｐＴｏＣ３６７から得た挿入物の配列データに基づいて、ＤＤＣ２に特異的な
オリゴヌクレオチドをｃＤＮＡクローンを単離するために合成した。そのプライ
マーは遺伝子の転写と反対の方向に向いていた。プライマーは次の配列： 26186：CATCTCATTATCAGCCATTCC（配列番号：３９）を有した。

【０１２４】ｐＴｏＣ３７０から得られた挿入物の配列データに基づいて、ＤＤＣ３に特異
的なオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡクローンを単離するために合成した。それら
プライマーは遺伝子の転写と反対の方向に向いた。それらプライマーは次の配列
： 26183：CCCAACATACCCGGAAATCG（配列番号：４０） 26184：GCGGGTGGTTCGGGAACACC（配列番号：４１）を有した。

【０１２５】ＰＣＲ反応をプライマー２６１８６（ＤＤＣ２）及びCAP Finder Vit (Clonte
ch, Palo Alto, CA)からの５′プライマーと共にアスペルギルス・オリザエをｎ
ｏ．２７ｃＤＮＡで行った。６０℃のアニーリング温度で３０ＰＣＲサイクルを
行った。５′プライマーは、このキットで形成されたｃＤＮＡの５′端とハイブ
リダイズするであろうCAP Finder Kitの部分である。約４００bpのフラグメント
が得られた。

【０１２６】ＤＤＣ３ＰＣＲ産物を得るために、ネスティドＰＣＲを行った。最初のＰＣＲ
反応は、プライマー２６１８３及びCap Finder Kit (Clontech, Palo Alto, CA)
からの５′プライマーで、３０サイクル、６０℃のアニーリング温度で行った。
５′プライマーは、このキットで作られたｃＤＮＡの５′端にハイブリダイズす
るであろうClontech CAP Finder Kit の部分である。このＰＣＲ反応からのアリ
コートを、プライマー２６１８４及び５′ＣａｐＦｉｎｄｅｒプライマーとの
新しい反応のためのテンプレートとして用いた。また、その反応は６０℃の環境
温度で３０サイクル、行った。第２のＰＣＲ反応において、約４００bpのフラグ
メントを得た。

【０１２７】そのフラグメントをＰＣＲをベクター（tavitrogen, San Diego CA）にクロー
ン化し、製造元の説明に従ってＡＢＩ自動化ＤＮＡシーケンサーで配列決定した
。得られたＤＤＣ２全表ｃＤＮＡ配列及び縮重したアミノ酸配列を各々配列番号
：３及び２に示す。得られたＤＤＣ３全表ｃＤＮＡ配列及び縮重したアミノ酸配
列を各々配列番号：６及び５に示す。

【０１２８】Ｔｅｓｔｃｏｄｅ及びＣｏｄｏｎｐｒｅｔｅｒｅｎｃｅ（Genetics Computer
Group，Inc., Madison，NI）によるコーディング領域及びＤＤＣ２についてのｃ
ＮＤＡの翻訳についてのコンピューター分析は、６４アミノ酸のポリペプチドを
コードするオープン読み枠（配列番号：２）を示唆し、ＤＤＣ３については８３
アミノ酸のポリペプチドをコードするオープン読み枠（配列番号：５）を示唆し
た。プログラムＳｉｇｃｌｅａｒｅ（Genetics Computer Group．Inc．Madison,
NI)は、ＤＤＣ２ポリペプチドについて１８アミノ酸の分泌シグナルの反応を、
ＤＤＣ３ポリペプチドについて２０アミノ酸の分泌シグナルの反応を示唆し、こ
のことはそれらポリペプチドが分泌されることを示唆する。

【０１２９】ＤＤＣ３ポリペプチドは次の配列： DDGAIRIPVKGVPEPEKR（配列番号：５）の１８アミノ酸の３つの反復を含んだ。
３番目の反復は、その反復中の最後の２つのアミノ酸がＬｙｓ及びＡｒｇである
Ｃ末端のいくらかの誘導化を示した。この二塩基部位は、イースト及び真菌にお
いて分泌されるタンパク質の成熟化に関連するＫｅｘ２プロテアーゼのための開
発部位であることが知られている。その遺伝子構造は、ＤＤＣ３がおそらく３つ
の小さなペプチドに分泌され、プロセッシングされるタンパク質をコードするこ
とを示唆する。ＤＤＣ３の遺伝子構造はサッカロマイセスセレビシアロのα−因
子遺伝子の構造に似ている（Kurjanら、1982, Cell 30 : 933〜943）。

【０１３０】ＤＤＣ２及びＤＤＣ３ポリペプチドの縮重したアミノ酸配列（各々配列番号：
２及び５）を、Fasta（Lipman及びPearson，1988，Proceedings of the Nationa
l Academy of Science USA 85 : 2444）及びBlast（Altschulら、Isso，Journal
of Molecular Biology 215 : 403）のような種々のサーチアルゴリズムによる
ＧｅｎｅＢａｎｋにおける配列と比較した。相同性は見い出されなかった。

【０１３１】実施例５：ＤＤＣ２及びＤＤＣ３ゲルクローンの単離ＤＤＣ２のｃＤＮＡクローンを、α（³²Ｐ）ｄＣＴＰ（Amersham, Arlington
Heighes, IL）でのニックトランスレーション（Sambrook ら、前掲）により放射
能標識し、緩衝液１mL当り約１×１０⁶ cpn の活性でハイブリダイゼーション緩
衝液に加え、アスペルギルス・オリザエＩＦＯ４１７７のコスミドライブラリー
に対するプローブとして用いた。コスミドライブラリーを、製造元の説明に従っ
て、Super Cos1 Cosmid Vector Kit（Stratagene，La Jolla）を用いて作製した
。

【０１３２】アスペルギルス・オリザエＩＦＯ４１７７のゲノムＤＮＡを、標準的手順（Ch
ristensenら、1988，Biotechnology 6 : 1419〜1422)により作ったプロトプラス
トから調製した。そのプロトプラストを単離した後、それらをLabofuge T (Heto
, Denmerk）中で５分、２５００rpmでの遠心によりペレット化した。次にそのペ
レットを、ＳｕｐｅｒＣｏｓ１キットからのマニュアルに示される通り、１０
mM ＮａＣｌ，２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０），１mM ＥＤＴＡ，１０
０μｇ１mLプロテイナーゼＫ及び０．５％ＳＤＳ中に懸濁した。ＤＮＡ調製の
残りのステップは、そのキットに添付の製造元の説明書に従って行った。ゲルＤ
ＮＡのサイズをＣＨＥＦ−ゲル製造（BioRad Laboratories, Hercules, CA)を用
いて電気泳動により分析した。１％アガロースゲルを１０〜５０秒パルスで２０
０ボルトで２０時間、行った。そのゲルをエチジウムブロマイドで染色して写真
をとった。そのＤＮＡはサイズで約５０〜１００kb超であることが見い出された
。そのＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分的に消化した。得られた消化したＤＮＡのサイ
ズは上述から同じ型のＣＨＥＦ−ゲル分析により測定して２０〜５０kbであった
。ＣｓＣｌ勾配でバンドになったＳｕｐｅｒＣｏｓ１コスミドを、製造元の説
明に従って調製した。連結及びパッケージングを、製造元の説明に従って同様に
行った。ライブラリーの滴定の後、１つの連結及びパッケージングからのパッケ
ージング混合物全てを大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ（Stratagene, La Jolla,
CA）にトランスフェクトし、mL当り５０μｇのアンピシリンを補給した。ＬＢプ
レート上にプレートした。約３８００のコロニーを得た。

【０１３３】１０のコロニーからのコスミド調製物は、全てが予想される大きさの挿入物を
有することを示した。それらコロニーを個々に採取して、mL当り１００μｇのア
ンピシリンを補給した１００μＬのＬｕｒｉａＢｒｏｔｈ培地を含むマイクロ
タイタープレートウェルに接種した。５０％グリセロール１００μＬを各々のウ
ェルに加え、全体のライブラリーを−８０℃に凍結した。全部で３８２２のコロ
ニーを保存した。これは、アスペルギルス・オリザエゲルの約４．４倍増幅を示
した。

【０１３４】全体のライブラリーをナイロン膜（Genome System, Inc., St.Conis, MO)上に
高密度でスポットした。³²Ｐ標識化ＤＤＣ２ｃＤＮＡをコスミド１８Ｈ７に高ス
トリンジェンシー条件下で（２×ＳＳＣ、６５℃）ハイブリダイズさせた。³²Ｐ
標識化ＤＤＣ３ｃＮＤＡを高スチリンジェンシー条件下（２×ＳＳＣ、６５℃）
でハイブリダイズさせ、コスミド３４Ｇには強いハイブリダイゼーションシグナ
ルを示した。

【０１３５】プラスミドＤＮＡをコスミド１８Ｈ７から調製し、両方ともｃＤＮＡ配列内に
含まれる次のプライマー： 30982：TGCAGATCTCCTGGTTTGCC（配列番号：４２） 30983：CTCCCTAAGGAATGCAAATGG（配列番号：４３）を用いて製造元の説明に従ってABI Automatic DNA Sequencer で配列決定した。

【０１３６】プラスミドＤＮＡもコスミド３４Ｇ１２から調製し、ｃＤＮＡ配列から作った
次のプライマー： 30984：CCATGAAGCTCTTCTCTACC（配列番号：４４） 30985：CTATTTCTCAGCGGGTGGTTCG（配列番号：４５）を用いて製造元の説明に従ってABI Automatic DNA Sequencer で配列決定した。

【０１３７】更に上流及び下流の配列を得るために新しいプライマーを合成した。得られたゲル核酸配列並びにＤＤＣ２及びＤＤＣ３の縮重したアミノ酸配列を
図１（各々配列番号：１及び２）及び図２（各々に配列番号４及び５）に各々示
す。実施例６：ＤＤＣ２のための欠失プラスミドの作製アスペルギルス・オリザエにおけるＤＤＣ２遺伝子の欠失のためにデザインし
たプラスミドを、開始コドンの上流の配列１kb及び終止コドンの下流の配列１kb
を、アスペルギルス・オリザエＰｙｒＧ遺伝子により分離されたベクターにクロ
ーン化することにより作製した。

【０１３８】５′フラグメントを、次のプライマー： 102012：GAAGATCTTGGGGGCAGTCAGTGACGGG（配列Ｇ番号：４６） 102013：TCCCCCGGGTATGATTTGATTAGGATG（配列番号：４７）と共にテンプレートとしてコスミド１８Ｈ７を用いてＰＣＲにより得た。３′フラグメントを、次のプライマー： 102014：TCCCCCGGGAGTGTTATTAATAAGGAGG（配列番号：４８） 102015：TGCACTGCAGGTATCTGTATCCCAGTCAGC（配列番号：４９）と共に上述と同じ条件下でテンプレートとしてコスミド１８Ｈ７を用いてＰＣＲ
により得た。

【０１３９】その５′ＰＣＲフラグメントを制限酵素ＳｍａＩ及びＢｇｌIIで切断し、その
切断フラグメントをアガロースゲルから精製した。その３′ＰＣＲフラグメント
をＳｍａＩ及びＰｓｔＩで切断し、その制限されたフラグメントをアガロースゲ
ルから精製した。その５′フラグメント及び３′フラグメントをＢｇｌII及びＰ
ｓｔＩで制限したｐＩＣ１９Ｈ（Marshら、1984，Gene 32 : 481〜485）にクロ
ーン化した。得られたプラスミドをＳｍａＩで切断し、アルカリホスファターゼ
（Boehringer Manuheim, Indianapolis, IN)で脱リン酸化した。アスペルギルス
・オリザエＰｙｒＧを含む３．５kb ＨｉｎｄIIIフラグメントをｐＪａＬ３３
５（ＰＣＴ／ＤＫ９６／００５２８）から単離し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノ
ウフラグメント（Promega, Madison, NI）及びｄＮＴｐとのインキュベーション
により平滑断面にした。それら２つのフラグメントを連結して図３に示すプラス
ミドｐＴｏＣ３９１とした。ｐＴｏＣ３９１は、アスペルギルス・オリザエＰｙ
ｒＧ株の形質転換のためにＰｒｕＩで直鎖化して、ＤＤＣ２遺伝子がｐｙｒＧ遺
伝子により置きかえられている形質転換体を作り出した。このようなＤＤＣ２変
異体株は、例えばサザン分析により又はＰＣＲ法により見い出すことができる。
ＤＤＣ２変異体株は、いずれの異種タンパク質のための発現宿主としても用いる
ことができる。このように単離されたＤＤＣ２変異体株は、ｐＪａＬ３３５上のｐｙｒＧ遺伝子に隣接する４００bp反復によりフルオロロニック酸（ｆｌｕｏｒ
ｏｒｏｎｉｃａｃｉｄ）に対する耐性の選択によりｐｙｒＧを容易に作り出す
ことができる。

【０１４０】実施例７：ＤＤＣ３のための欠失プラスミドの作製アスペルギルス・オリザエ中のＤＤＣ３の欠失のためにデザインしたプラスミ
ドを、開始コドンの上流の配列約１kb及び終止コドンの下流の配列約１kbを、そ
れら２つの挿入物がアスペルギルス・オリザエｐｙｒＧ遺伝子により分離されて
いるベクターにクローン化することにより作製した。

【０１４１】コスミド３４Ｇには、欠失プラスミドの作製を許容するために十分な上流配列
を含まなかった。より上流の配列をクローン化するために、逆ＰＣＲを用いた。
アスペルギルス・オリザエＩＦＯ４１７７（アスペルギルス・オリザエＡ１５６
０−Ｔ４０の親株）からのゲノムＤＮＡの³²Ｐ標識化ＤＤＣ３プローブでのサザ
ン分析は、約２．５kbのＮｓｉＩフラグメントを示した。そのゲノムＤＮＡをＮ
ｓｉＩで消化し、連結し、そして次のプライマー： 30985：CTATTTCTCAGCGGGTGGTTCG（配列番号：４５） 101449：CTCTATGTAACCAACTCCTGC（配列番号：５０）を用いる逆ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして用いた。

【０１４２】予想される大きさ（２．３kb）のフラグメントを得て、ベクターのＣＲII（In
vitrogen, San Diego CA）にクローン化した。そのフラグメントをABI Automate
d DNA Sequencerで配列決定した。その配列情報を用いて欠失プラスミドの作製のためのプライマーをデザインし
た。５′フラグメントを得るために用いたプライマーは次の通りであった： 116497：CGAAAGCTTACTCTCTGGAACAGG（配列番号：５１） 118141：CATGGAGCTCGATGGCCAAATGACTGATTCC（配列番号：５２）３′フラグメントを得るために用いたプライマーは次の通りであった： 116494：GACACTCGAGTAAGATATGCTGCAGAC（配列番号：５３） 116495：CATAAGCTTTCGAGTGATAATGTCTTGG（配列番号：５４）２つのＰＣＲ反応を、テンプレートとしてＩＦＯ４１７７ゲノムＤＮＡ及びプライマー対１１６４９７／１１８１４１７又は１１６４９４／１１
６４９５のいずれかを用いて行った。その５′ＰＣＲフラグメントを制限酵素Ｓ
ａｃＩ及びＨｉｎｄIII で切断し、その３′フラグメントをＨｉｎｄIII 及びＸ
ｈｏＩで切断し、そして両方の切断フラグメントをアガロースゲルから精製した
。そのフラグメントを、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩで制限したベクターｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ（Stratagene, La Jolla, CA）にクローン化した。得られたプラスミ
ドをＨｉｎｄIII で切断し、アルカリホスファターゼ（Boehringer Mannheim, I
ndianapolis, IN)で脱リン酸化し、そして次にｐｙｒＧ遺伝子を含むｐＪａＬ３
３５（ＰＬＴ／ＤＫ９６／００５２８）からの３．５kb ＨｉｎｄIII フラグメ
ントを連結した。それら２つのフラグメントを連結して図４に示すようなプラス
ミドｐＴｏＣ４０１を得た。ｐＴｏＣ４０１は、アスペルギルス・オリザエ（ｐ
ｙｒＧ ^- ）株の形質転換のためにＳａｃＩで直鎖化してＤＤＣ３遺伝子がｐｙｒ
Ｇ遺伝子で置換されている形質転換体を作り出した。このような変異体は、例え
ばサザン分析により又はＰＣＲ法により見い出すことができる。ＤＤＣ３変異体
株は、いずれの異種タンパク質のための発現宿主としても用いることができる。
この方法により単離されたＤＤＣ３変異体株は、ｐＪａＬ３３５上のｐｙｒＧ遺
伝子に隣接する４００bp反復によりフルオロロニック酸に対する耐性の選択によ
りｐｙｒＧ ^- を容易に作り出すことができる。

【０１４３】生物材料の寄託以下の生物材料は、ブタペスト条約によりDeutsche Sammlung von Microorgan
ismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, G
ermanyに寄託し、以下の受託番号を得た。寄託受託番号寄託日大腸菌ＤＨ５α＋コスミド１８Ｈ７ＤＳＭ１２０６０ 1998年３月３日大腸菌ＤＨ５α＋コスミド３４Ｇ１２ＤＳＭ１１９２４ 1998年１月19日その株は、その培養物へのアクセスが、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４及び３５
Ｕ．Ｓ．Ｃ§１２２で特許商標庁長官の決定に従い、本特許の係属中、利用でき
るであろうことを仮定する条件下で寄託された。その寄託は、寄託された株の実
質的に純粋な培養物である。寄託は、本願の対応特許又はその子が出願されてい
る国の外国特許法の要求に応じて利用できる。しかしながら、寄託の利用性は、
政府により特許された特許権を損ねて本発明を実施するライセンスを構成しない
ことが理解されるべきである。

【０１４４】本明細書に記載され、クレームされる本発明は、ここに開示される特定の実施
形態により範囲が減縮されるべきでない。なぜならこれらの実施形態は、本発明
のいくつかの態様を詳述することを意図するからである。いずれの等価を実施形
態も本発明の範囲内にあることを意図する。実際、本明細書に示され記載される
ものに加えて本発明の種々の改良が先の記載から当業者に明らかにするであろう
。このような改良も添付の請求の範囲内にあることを意図する。コンクリクトの
場合、定義を含む本開示が支配するであろう。

【０１４５】種々の引用が本明細書でなされているが、その開示内容はそれらの全体が引用
により組み込まれる。

【０１４６】

【表２】

【０１４７】

【表３】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、ＤＤＣ２のゲノム核酸配列及びその縮重したアミノ酸配列（各々配
列番号：１及び２）を示す。

【図１Ｂ】図１Ｂは、ＤＤＣ２のゲノム核酸配列及びその縮重したアミノ酸配列（各々配
列番号：１及び２）を示す。

【図２Ａ】図２Ａは、ＤＤＣ２のゲノム核酸配列及び縮重したアミノ酸配列（各々配列番
号：４及び５）を示す。

【図２Ｂ】図２Ｂは、ＤＤＣ２のゲノム核酸配列及び縮重したアミノ酸配列（各々配列番
号：４及び５）を示す。

【図３】ｐＴｏＣ３９１の制限地図を示す。

【図４】ｐＴｏＣ４０１の制限地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/30 9/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9/30 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/00 (Ｃ１２Ｎ 1/15 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:685） //(Ｃ１２Ｎ 1/15 (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:685）Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/15 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:69）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 9/30 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/30 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者ワーレイスナー，ジルアメリカ合衆国，ニューハンプシャー 03755，ハノーバー，リバークレストストリート 34 (72)発明者クリステンセン，トフデンマーク国，デーコー−2800 リングビー，ノエデバエンゲート３Ｆターム(参考） 4B024 BA01 BA07 BA08 BA10 BA11 BA53 BA63 CA04 DA06 DA11 EA06 FA01 GA11 GA19 GA25 HA01 HA03 4B050 CC04 DD03 EE10 4B064 AG01 AG15 AG20 AG27 CA05 CA19 CC24 4B065 AA58X AA60X AA60Y AA62X AA65X AA66X AA67X AA70X AA70Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA28 CA29 CA31 4H045 AA10 AA20 BA20 BA21 CA15 DA30 DA50 DA75 DA76 FA73 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリペプチドを生産するための方法であって、（Ａ）親糸状菌細胞の変異体細胞を、該変異体細胞が同じ条件下で培養した時
に前記親細胞より多くの前記ポリペプチドを生産する該ポリペプチドの生産に資
する条件下で培養するステップであって、前記変異体細胞が前記ポリペプチドを
コードする第１の核酸配列、並びに（ｉ）配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のアミノ酸２１〜
８３と少くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする核酸配列；（ii）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１又は配列番号：４のヌ
クレオチド１０４１〜１２２９と少くとも５０％の相同性を有する核酸配列；（iii)（ａ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１もしくは配列番
号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ｂ）少くとも１００ヌクレオチド
の（ａ）のサブ配列、又は（ｃ）（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖、と低ストリン
ジエンシー条件下でハイブリダイスする核酸配列；（iv）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む配列番号：
２又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体をコー
ドする核酸配列；（ｖ）（ｉ），（ii）；又は（iii)の対立遺伝子変異体；並びに（vi）（ｉ），（ii），（iii)、又は（ｖ）のサブ配列であってＤＤＣ２又は
ＤＤＣ３ポリペプチド活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするもの
からなる群から選択される１又は複数の第２の核酸配列の改変を含むステップと
、（Ｂ）前記変異体細胞の培養培地から前記ポリペプチドを回収するステップと
、を含む方法。
【請求項２】前記第１の核酸配列が前記糸状菌細胞に対してネイティブで
あることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記第１の核酸配列が前記糸状菌細胞に対して異種のポリペ
プチドをコードすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記ポリペプチドがホルモン、ホルモン変異体、酵素、レセ
プターもしくはその部分、抗体もしくはその部分、又はリポーターであることを
特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】前記酵素がオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒ
ドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼであることを特徴とする請
求項４に記載の方法。
【請求項６】前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒド
ラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチ
ナーゼ、シクロデキストリン、グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌ
クレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ
ルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、
ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン
分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タン
パク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナー
ゼであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記糸状菌細胞が、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒ
ｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フ
ィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マ
グナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフ
トラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、マイロテシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉ
ｕｍ）、ネオカリマスチクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｔｉｘ）、ニューロスポラ
（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ
）、スキゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア
（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、
又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であることを特徴とする請求
項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】前記糸状菌細胞がアスペルギルス細胞であることを特徴とす
る請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記アスペルギルス細胞がアスペルギルス・オリザエ（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）細胞であることを特徴とする請求項８に記
載の方法。
【請求項１０】前記アスペルギルス細胞がアスペルギルス・ニゲル（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）細胞であることを特徴とする請求項８に記載
の方法。
【請求項１１】前記第２の核酸配列が配列番号：２のアミノ酸１９〜６４
又は配列番号：５のアミノ酸２１〜８３と少くとも５０％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列であることを特徴とする請
求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】前記第２の核酸配列が配列番号：２のアミノ酸１９〜６４
又は配列番号：５のアミノ酸２１〜８３と少くとも６０％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列であることを特徴とする請
求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】前記第２の核酸配列が配列番号：２のアミノ酸１９〜６４
又は配列番号：５のアミノ酸２１〜８３と少くとも７０％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列であることを特徴とする請
求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】前記第２の核酸配列が配列番号：２のアミノ酸１９〜６４
又は配列番号：５のアミノ酸２１〜８３と少くとも８０％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列であることを特徴とする請
求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】前記第２の核酸配列が配列番号：２のアミノ酸１９〜６４
又は配列番号：５のアミノ酸２１〜８３と少くとも９０％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列であることを特徴とする請
求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】前記第２の核酸配列が配列番号：２のアミノ酸１９〜６４
又は配列番号：５のアミノ酸２１〜８３と少くとも９５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列であることを特徴とする請
求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】前記第２の核酸配列が配列番号：２又は配列番号：５のア
ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１〜１０の
いずれかに記載の方法。
【請求項１８】前記第２の核酸配列が配列番号：２もしくは配列番号：５
のアミノ酸配列からなるポリペプチド；又はそのＤＤＣ２もしくはＤＤＣ３ポリ
ペプチド活性を有するフラグメントをコードすることを特徴とする請求項１〜１
０のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】前記第２の核酸配列が配列番号：２又は配列番号：５のア
ミノ酸配列からなるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１８に記
載の方法。
【請求項２０】前記第２の核酸配列が配列番号：２のアミノ酸１９〜６４
又は配列番号：５のアミノ酸２１〜８３からなるポリペプチドをコードすること
を特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】前記第２の核酸配列が配列番号：１のヌクレオチド１０１
４〜１１５１又は配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９と少くとも５
０％の相同性を有する核酸配列であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれ
かに記載の方法。
【請求項２２】前記第２の核酸配列が配列番号：１のヌクレオチド１０１
４〜１１５１又は配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９と少くとも６
０％の相同性を有する核酸配列であることを特徴とする請求項２１に記載の方法
。
【請求項２３】前記第２の核酸配列が配列番号：１のヌクレオチド１０１
４〜１１５１又は配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９と少くとも７
０％の相同性を有する核酸配列であることを特徴とする請求項２２に記載の方法
。
【請求項２４】前記第２の核酸配列が配列番号：１のヌクレオチド１０１
４〜１１５１又は配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９と少くとも８
０％の相同性を有する核酸配列であることを特徴とする請求項２３に記載の方法
。
【請求項２５】前記第２の核酸配列が配列番号：１のヌクレオチド１０１
４〜１１５１又は配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９と少くとも９
０％の相同性を有する核酸配列であることを特徴とする請求項２４に記載の方法
。
【請求項２６】前記第２の核酸配列が配列番号：１のヌクレオチド１０１
４〜１１５１又は配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９と少くとも９
５％の相同性を有する核酸配列であることを特徴とする請求項２５に記載の方法
。
【請求項２７】前記第２の核酸配列が配列番号：１又は配列番号：４の核
酸配列であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】前記第２の核酸配列が、配列番号：１のヌクレオチド１０
１４〜１１５１又は配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９の核酸配列
を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】前記第２の核酸配列が、（ａ）配列番号：１のヌクレオチ
ド１０１４〜１１５１もしくは配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９
、（ｂ）少くとも１００ヌクレオチドの（ａ）のサブ配列、又は（ｃ）（ａ）も
しくは（ｂ）の相補鎖、と低ストリンジエンシー条件下でハイブリダイズする核
酸配列であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】前記第２の核酸配列が、（ａ）配列番号：１のヌクレオチ
ド１０１４〜１１５１もしくは配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９
、又は（ｂ）（ａ）の相補鎖、と低ストリンジエンシー条件下でハイブリダイズ
する核酸配列であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】前記第２の核酸配列が、（ａ）配列番号：１のヌクレオチ
ド１０１４〜１１５１もしくは配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９
、（ｂ）少くとも１００ヌクレオチドの（ａ）のサブ配列、又は（ｃ）（ａ）も
しくは（ｂ）の相補鎖、と中ストリンジエンシー条件下でハイブリダイズする核
酸配列であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】前記第２の核酸配列が、（ａ）配列番号：１のヌクレオチ
ド１０１４〜１１５１もしくは配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９
、又は（ｂ）（ａ）の相補鎖、と中ストリンジエンシー条件下でハイブリダイズ
する核酸配列であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】前記第２の核酸配列が、（ａ）配列番号：１のヌクレオチ
ド１０１４〜１１５１もしくは配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９
、（ｂ）少くとも１００ヌクレオチドの（ａ）のサブ配列、又は（ｃ）（ａ）も
しくは（ｂ）の相補鎖、と高ストリンジエンシー条件下でハイブリダイズする核
酸配列であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】前記第２の核酸配列が、（ａ）配列番号：１のヌクレオチ
ド１０１４〜１１５１もしくは配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９
、又は（ｂ）（ａ）の相補鎖、と高ストリンジエンシー条件下でハイブリダイズ
する核酸配列であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含
む、配列番号：２又は配列番号：５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異
体をコードする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】前記第２の核酸配列が、大腸菌ＤＳＭ１１９２４内に含ま
れるコスミド３４Ｇ１２内に含まれる核酸配列であることを特徴とする請求項１
〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】前記第２の核酸配列が、大腸菌ＤＳＭ１２０６０内に含ま
れるコスミド１８Ｈ７内に含まれる核酸配列であることを特徴とする請求項１〜
１０のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】前記変異体細胞が、１又は複数の第３の核酸配列の１又は
複数の改変を更に含み、ここで該改変は、前記１又は複数の第３の核酸配列の発
現を減少させ又は排除することを特徴とする請求項１〜３７のいずれかに記載の
方法。
【請求項３９】前記第３の核酸配列が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ
、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチ
ナーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ラッカー
ゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素
、ペルオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタ
ミナーゼ、又はキシラナーゼからなる群から選択される酵素であることを特徴と
する請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】ポリペプチドを生産するための変異体糸状菌細胞であって
、前記ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、並びに（ａ）配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のアミノ酸２１〜
８３と少くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする核酸配列；（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１又は配列番号：４のヌ
クレオチド１０４１〜１２２９と少くとも５０％の相同性を有する核酸配列；（ｃ）（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１もしくは配列番
号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ii）少くとも１００ヌクレオチド
の（ｉ）のサブ配列、又は（iii)（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖、と低ストリン
ジエンシー条件下でハイブリダイスする核酸配列；（ｄ）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む配列番号：
２又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体をコー
ドする核酸配列；（ｅ）（ａ），（ｂ）；又は（ｃ）の対立遺伝子変異体；並びに（ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ）、又は（ｅ）のサブ配列であってＤＤＣ２又は
ＤＤＣ３ポリペプチド活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするもの
からなる群から選択される第２の核酸配列の改変を含む変異体糸状菌細胞。
【請求項４１】１又は複数の第３の核酸配列の１又は複数の改変を更に含
む請求項４０に記載の変異体細胞であって、該改変は、前記１又は複数の第３の
核酸配列の発現を減少させ又は排除することを特徴とする変異体細胞。
【請求項４２】前記第３の核酸配列が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ
、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチ
ナーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ラッカー
ゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素
、ペルオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタ
ミナーゼ、及びキシラナーゼからなる群から選択される酵素をコードすることを
特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】請求項４０〜４２のいずれかに記載の変異体細胞を生産す
るための方法であって、（ａ）配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のアミノ酸２１〜
８３と少くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする核酸配列；（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１又は配列番号：４のヌ
クレオチド１０４１〜１２２９と少くとも５０％の相同性を有する核酸配列；（ｃ）（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１もしくは配列番
号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ii）少くとも１００ヌクレオチド
の（ｉ）のサブ配列、又は（iii)（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖、と低ストリン
ジエンシー条件下でハイブリダイスする核酸配列；（ｄ）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む配列番号：
２又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体をコー
ドする核酸配列；（ｅ）（ａ），（ｂ）；又は（ｃ）の対立遺伝子変異体；並びに（ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ）、又は（ｅ）のサブ配列であってＤＤＣ２又は
ＤＤＣ３ポリペプチド活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするもの
からなる群から選択される親糸状菌細胞の１又は複数の第２の核酸配列を改変す
ることを含む方法。
【請求項４４】（ａ）配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：
５のアミノ酸２１〜８３と少くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有す
るポリペプチド；（ｂ）（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１もしくは配列番
号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ii）少くとも１００ヌクレオチド
の（ｉ）のサブ配列、又は（iii)（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖、と低ストリン
ジエンシー条件下でハイブリダイスする核酸配列によりコードされるポリペプチ
ド；（ｃ）１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む配列番号：
２又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体；（ｄ）（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；並びに（ｅ）（ａ），（ｂ）、又は（ｄ）のフラグメントであってＤＤＣ２又はＤＤ
Ｃ３ポリペプチド活性を有するフラグメントからなる群から選択される単離されたポリペプチド。
【請求項４５】配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のア
ミノ酸２１〜８３と少くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項
４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】配列番号：２もしくは配列番号：５のアミノ酸配列からな
る請求項４４に記載のポリペプチド；又はそのＤＤＣ２もしくはＤＤＣ３ポリペ
プチド活性を有するフラグメント。
【請求項４７】配列番号：２又は配列番号：５のアミノ酸配列からなる請
求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】配列番号：２のアミノ酸１９〜６４又は配列番号：５のア
ミノ酸２１〜８３からなる請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４９】（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１も
しくは配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、（ii）少くとも１００
ヌクレオチドの（ｉ）のサブ配列、又は（iii)（ｉ）もしくは（ii）の相補鎖と
低ストリンジエンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされる
請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項５０】（ｉ）配列番号：１のヌクレオチド１０１４〜１１５１も
しくは配列番号：４のヌクレオチド１０４１〜１２２９、又は（ｉ）の相補鎖と
低ストリンジエンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされる
請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項５１】１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む
配列番号：２又は配列番号：５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体で
ある請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項５２】大腸菌ＤＳＭ１１９２４内に含まれるコスミド３４Ｇ１２
内に含まれる核酸配列によりコードされる請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項５３】大腸菌ＤＳＭ１２０６０内に含まれるコスミド１８Ｈ７内
に含まれる核酸配列によりコードされる請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項５４】請求項４４に記載のポリペプチドをコードする単離された
核酸配列。
【請求項５５】好適な発現宿主内で前記ポリペプチドの発現を指示する１
又は複数の調節配列に作用可能に結合した請求項５４に記載の核酸配列を含む核
酸構成物。
【請求項５６】請求項５５に記載の核酸構成物を含む組換え発現ベクター
。
【請求項５７】請求項５５に記載の核酸構成物を含む組換え宿主細胞。
【請求項５８】（ａ）前記ポリペプチドの生産に資する条件下で株を培養
し；そして（ｂ）その培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む請求
項４４に記載のポリペプチドを生産するための方法。
【請求項５９】（ａ）請求項５７に記載の宿主細胞を前記ポリペプチドの
生産に資する条件下で培養し；そして（ｂ）前記培養培地から前記ポリペプチド
を回収することを含むポリペプチドを生産するための方法。
【請求項６０】配列番号：１のヌクレオチド９６０〜１０１３又は配列番
号：４のヌクレオチド９８１〜１０４０からなるシグナルペプチドをコードする
核酸配列に作用可能に結合したタンパク質をコードする遺伝子であって前記核酸
配列に対して外来性である遺伝子を含む核酸構成物。
【請求項６１】請求項６０に記載の核酸構成物を含む組換え発現ベクター
。
【請求項６２】請求項６０に記載の核酸構成物を含む組換え宿主細胞。
【請求項６３】タンパク質を生産するための方法であって、（ａ）請求項
６２に記載の組換え宿主細胞を前記タンパク質の生産のために適した条件下で培
養し；そして（ｂ）該タンパク質を回収することを含む方法。