CN101389645B - 具有木聚糖酶活性的多肽和编码它的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的具有木聚糖酶活性的多肽和分离的编码所述多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体，载体，和宿主细胞，以及生产和使用所述多肽的方法。

Description

具有木聚糖酶活性的多肽和编码它的多核苷酸

发明背景

发明领域

本发明涉及分离的具有木聚糖酶活性的多肽和分离的编码所述多肽的多核苷酸。本发明还涉及核酸构建体，载体，和包含所述多核苷酸的宿主细胞以及生产和利用所述多肽的方法。

相关技术的描述

木聚糖，植物半纤维素的主要组分，是通过β-1，4-木糖苷键连接的D-木糖的聚合物。通过酸或酶水解可以将木聚糖降解为木糖和木糖寡聚物(xylo-oligomers)。木聚糖的酶水解产生游离的糖，而无用酸形成的副产物(例如，呋喃)。

能够降解木聚糖和其它植物细胞壁多糖的酶对于食品工业来说是重要的，主要是对于烘烤和在水果及蔬菜加工如果汁生产或酿酒中，在这些领域利用它们的是催化植物细胞壁多糖的主链或侧链的降解的能力(Visser等，XylansandXylanases，ProceedingsofanInternationalSymposium，Wageningen，TheNetherlands，ElsevierSciencePublishers，1992)。

木聚糖酶的其它应用为生产酒精燃料的农业肥料的酶学降解，动物饲料的酶学处理以水解戊聚糖，制造溶解木浆以产生纤维素，和木浆的生物漂白[DetroymR.W.In：OrganicChemicalsfromBiomass，(CRCPress，BocaRaton，Fla.，1981)19-41；PaiceandJurasek，J.WoodChem.Technol.4：187-198；PommierandFuentes，1989，TappiJournal187-191；Senior等，1988，Biotechnol.Letters10：907-9121]。

WO92/17573公开了源自Humicolainsolens的基本上纯的木聚糖酶和编码所述木聚糖酶的重组DNA，所述木聚糖酶用作烘培剂，食品或饲料添加剂，并用于纸和纸浆的制备。

WO92/01793公开了源自Aspergillustubigensis的木聚糖酶。提到，但未显示相关的木聚糖酶可以源自其它丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus)，Disporotrichum，青霉属(Penicillium)，链孢菌属(Neurospora)，镰孢霉属(Fusarium)和木霉属(Trichoderma)。木聚糖酶开始可用于面包或动物饲料的制备，酿造和减小粘性或提高谷类淀粉的过滤性。

Shei等，1985，Biotech.andBioeng.Vol.XXVII，pp.533-538，和Fournier等，1985，Biotech.andBioeng.Vol.XXVII，pp.539-546，描述了分离自黑曲霉(Aspergillusniger)的木聚糖内切酶的纯化和特征鉴定。

WO91/19782和EP463706公开了源自黑曲霉来源的木聚糖酶及其重组产物，用于烘培，酿造，造纸，和农业肥料的处理。

WO03/012071公开了烟曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶的核苷酸序列。

本发明的目的是提供新的具有木聚糖酶活性的多肽和编码所述多肽的核酸。

发明概述

本发明涉及分离的具有木聚糖酶活性的多肽，其选自：

(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO：2的氨基酸18-364具有至少65％的同一性，与SEQIDNO：4的氨基酸20-323具有至少85％的同一性，或者与SEQIDNO：6的氨基酸20-397具有至少80％的同一性；

(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸至少在低严格条件下与(i)SEQIDNO：1的核苷酸52-1145，(ii)包含在SEQIDNO：1的核苷酸52-1145中的cDNA序列，或者(iii)(i)或(ii)的互补链相杂交；或者至少在中等高的严格条件下与(iv)SEQIDNO：3的核苷酸58-1400或者SEQIDNO：5的核苷酸107-1415，(v)包含在SEQIDNO：3的核苷酸58-1400或SEQIDNO：5的核苷酸107-1415中的cDNA序列，或者(vi)(iv)或(v)的互补链相杂交；和

(c)变异体，其包含SEQIDNO：2的氨基酸18-364，SEQIDNO：4的氨基酸20-323，或者SEQIDNO：6的氨基酸20-397的一个或多个氨基酸的保守性取代、删除，和/或插入。

本发明还涉及编码具有木聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸，选自：

(a)编码具有一种氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQIDNO：2的氨基酸18-364具有至少65％的同一性，与SEQIDNO：4的氨基酸20-323具有至少85％的同一性，或者与SEQIDNO：6的氨基酸20-397具有至少80％的同一性；

(b)一种多核苷酸，其与SEQIDNO：1的核苷酸52-1145具有至少65％的同一性，与SEQIDNO：3的核苷酸58-1400具有至少85％的同一性，或者与SEQIDNO：5的核苷酸107-1415具有至少80％的同一性；和

(c)一种多核苷酸，其至少在低严格条件下与(i)SEQIDNO：1的核苷酸52-1145，(ii)包含在SEQIDNO：1的核苷酸52-1145中的cDNA序列，或者(iii)(i)或(ii)的互补链相杂交；或者至少在中等高的严格条件下与(iv)SEQIDNO：3的核苷酸58-1400或者SEQIDNO：5的核苷酸107-1415，(v)包含在SEQIDNO：3的核苷酸58-1400或SEQIDNO：5的核苷酸107-1415中的cDNA序列，或者(vi)(iv)或(v)的互补链相杂交。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体，重组表达载体，和重组宿主细胞。

本发明还涉及生产这种具有木聚糖酶活性的多肽的方法，包含：(a)在有益于生产所述多肽的条件下培养包含含有编码所述多肽的多核苷酸的核酸构建体的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及将所述多肽用于处理纸浆，用于生产木糖或者木糖寡糖的加工，用作改善食品或饲料消化性的食品或饲料改进酶，用于烘焙，和用于酿酒的方法。

本发明进一步涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中所述基因可操作地连接到编码信号肽的核苷酸序列上，所述核苷酸序列由SEQIDNO：1的核苷酸1-51，SEQIDNO：3的核苷酸1-57，或者SEQIDNO：5的核苷酸1-106或其cDNA组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列来说是外源的。

附图简述

图1A和1B显示烟曲霉GH10A家族木聚糖酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQIDNOs：1和2)。对预测的信号肽下划线并将预测的内含子用斜体排字。

图2显示pAlLo1的限制性酶切图谱。

图3显示pBM121b的限制性酶切图谱。

图4显示pBM120a的限制性酶切图谱。

图5显示pSMO208的限制性酶切图谱。

图6显示pSMO210的限制性酶切图谱。

图7A和7B显示烟曲霉GH10B家族木聚糖酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQIDNOs：3和4)。对预测的信号肽下划线并将预测的内含子用斜体排字。

图8显示pJLin162的限制性酶切图谱。

图9A和9B显示烟曲霉GH10C家族木聚糖酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQIDNOs：5和6)。对预测的信号肽下划线并将预测的内含子用斜体排字。

图10显示pHyGe009的限制性酶切图谱。

图11显示pHyGe001的限制性酶切图谱。

定义

木聚糖酶活性：术语“木聚糖酶”这里被定义为1，4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1，4-β-D-木聚糖苷键(xylosidiclinkage)的内部水解。为了本发明的目的，用0.2％的AZCL-阿拉伯糖木聚糖作为底物在0.01％TritonX-100和200mM磷酸钠缓冲液pH6中于37℃测定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶活性被定义为在37℃，pH6下于200mM磷酸钠pH6缓冲液中每分钟由作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖木聚糖(arabinoxylan)产生1.0μmol的天青精(azurine)。

本发明的多肽与由显示为SEQIDNO：2的氨基酸18-364，SEQIDNO：4的氨基酸20-323，或SEQIDNO：26的氨基酸20-397的氨基酸序列组成的多肽具有至少20％，优选至少40％，更加优选至少50％，更加优选至少60％，更加优选至少70％，更加优选至少80％，甚至更加优选至少90％，最优选至少95％，甚至最优选至少100％的木聚糖酶活性。

GH10家族木聚糖酶：术语“糖甙水解酶家族10”或者“GH10家族”在这里被定义为根据HenrissatB.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类，Biochem.J.280：309-316，以及HenrissatB.，andBairochA.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases，Biochem.J.316：695-696落入糖甙水解酶家族10的多肽。

分离的多肽：如本文所用的术语“分离的多肽”指一种多肽，其是至少20％纯的，优选至少40％纯的，更加优选至少60％纯的，甚至更加优选至少80％纯的，最优选至少90％纯的，甚至最优选至少95％纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”这里多示一种多肽制品，其最多包含10％，优选最多8％，更加优选最多6％，更加优选最多5％，更加优选最多4％，更加优选最多3％，甚至更加优选最多2％，最优选最多1％，甚至最优选最多0.5％重量比的与它天然相关联的其它多肽物质。所以，优选基本上纯的多肽为至少92％纯的，优选至少94％纯的，更加优选至少95％纯的，更加优选至少96％纯的，更加优选至少96％纯的，更加优选至少97％纯的，更加优选至少98％纯的，甚至更加优选至少99％，最优选至少99.5％纯的，甚至最优选100％纯的重量比的存在于制品中的全部多肽物质。

本发明的多肽优选为基本上纯的形式。特别地，优选所述多肽为“本质上纯的形式”，即，所述多肽在本质上不含与天然相关联的其它多肽物质。这可以，例如，通过公知的重组方法或通过经典的纯化方法制备所述多肽而实现。

这里，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。

同一性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关系通过参数“同一性”进行描述。

为了本发明的目的，通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS5：151-153)利用LASERGENE^TMMEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以同一性表格和下列多个比对参数来测定两个氨基酸序列之间的同一性程度：缺口罚分(gappenalty)10，缺口长度罚分10。配对间的比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口(window)＝5，对角线(diagonals)＝5。

为了本发明的目的，通过Wilbur-Lipman方法(WilburandLipman，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80：726-730)利用LASERGENE^TMMEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以同一性表格和下列多个比对参数来测定两个核苷酸序列之间的同一性程度：缺口罚分10，缺口长度罚分10。配对间的比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口＝20。

多肽片段：术语“多肽片段”在这里被定义为具有一个或多个氨基酸缺失自SEQIDNO：2，4，或者6，或其同源序列氨基和/或羧基末端的多肽，其中所述片段具有木聚糖酶活性。

优选地，SEQIDNO：2的片段包含至少300氨基酸残基，更加优选至少315氨基酸残基，并且最优选至少330氨基酸残基。

优选地，SEQIDNO：4的片段包含至少255氨基酸残基，更加优选至少270氨基酸残基，并且最优选至少285氨基酸残基。

优选地，SEQIDNO：6的片段包含至少320氨基酸残基，更加优选至少340氨基酸残基，并且最优选至少360氨基酸残基。

亚序列：术语“亚序列”在这里被定义为具有一个或多个核苷酸缺失自SEQIDNO：1，3，或者5，或其同源性序列的5’和/或3’端的核苷酸序列，其中所述亚序列编码具有木聚糖酶活性的多肽片段。

优选地，SEQIDNO：1的亚序列包含至少900个核苷酸，更加优选至少945个核苷酸，并且最优选至少990个核苷酸。

优选地，SEQIDNO：3的亚序列包含至少765个核苷酸，更加优选至少810个核苷酸，并且最优选至少855个核苷酸。

优选地，SEQIDNO：5的亚序列包含至少960个核苷酸，更加优选至少1020个核苷酸，并且最优选至少1080个核苷酸。

等位基因变体：术语“等位基因变体”在这里表示占据相同染色体位置的任何两个或多个基因的选择性形式。等位基因变异通过突变天然发生，并且可以导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽不变)或者可以编码具有变化氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体所编码的多肽。

分离的多核苷酸：如本文所用的术语“分离的多核苷酸”指一种多核苷酸，其是至少20％纯的，优选至少40％纯的，更加优选至少60％纯的，甚至更加优选至少80％纯的，最优选至少90％纯的，和甚至最优选至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所测定的。

基本上纯的多核苷酸：如本文所用的术语“基本上纯的多核苷酸”指不含其它外来的或不希望的核苷酸并且以适用于遗传改造蛋白质生产系统内的形式存在的多核苷酸制品。因而，基本上纯的多核苷酸最多包含10％，优选最多8％，更加优选最多6％，更加优选最多5％，更加优选最多4％，更加优选最多3％，甚至更加优选最多2％，最优选最多1％，甚至最优选最多0.5％重量比的与它天然相关联的其它多核苷酸物质。不过，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸在重量上是至少90％纯的，优选至少92％纯的，更加优选至少94％纯的，更加优选至少95％纯的，更加优选至少96％纯的，更加优选至少97％纯的，甚至更加优选至少98％纯的，最优选至少99％，甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选是基本上纯的形式。特别地，优选本文公开的多核苷酸为“本质是纯的形式”，即，所述多核苷酸制品在本质上不含与它天然相关联的其它多核苷酸物质。在这里，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。所述多核苷酸可以是基因组的，cDNA，RNA，半合成性，合成性来源的，或其任意组合。

cDNA：术语″cDNA″在这里被定义为可以由获自真核细胞的成熟的剪切过的mRNA分子反转录制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。最初的原始RNA转录本是mRNA的前体，所述mRNA在变成成熟的剪切过的mRNA之前经过一系列步骤进行加工。这些步骤包括通过称作剪切的过程去除内含子序列。所以，源自mRNA的cDNA缺少任何内含子序列。

核酸构建体：如本文所用的术语″核酸构建体″指一种核酸分子，不管是单链还是双链的，其分离自天然发生的基因或者对其进行修饰以便以不会存在于自然界中的方式包含核酸的片段。当所述核酸构建体包含本发明的编码序列表达所必需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

控制序列：术语“控制序列”在这里被定义为包括对于编码本发明多肽的多核苷酸的表达必需或有益的组分。每种控制序列对于编码所述多肽的核苷酸序列来说可以是天然的或外源的或者彼此是天然的或外源的。这些控制序列包括，但不限于，前导物，多聚腺苷化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列，和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，转录和翻译终止信号。所述控制序列可以与连接子一起提供，以便引入促进控制序列与编码多肽的核苷酸序列编码区连接的特异限制性位点。

可操作性连接的：术语“可操作性连接的”在这里表示一种构型，其中相对于多核苷酸序列的编码序列将控制序列置于合适的位置，从而使得所述控制序列指导表达多肽编码序列的表达。

编码序列：当在本文中使用时术语“编码序列”意指核苷酸序列，其直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列。所述编码序列的边界在遗传上由开放阅读框决定，其通常以ATG起始密码子或备选起始密码子如GTG和TTG开始，并以终止密码子如TAA，TAG和TGA终止。所述编码序列可以是DNA，cDNA，或者重组的核苷酸序列。

表达：术语“表达”包括任何涉及生产多肽的步骤，包括，但不限于，转录，转录后修饰，翻译，翻译后修饰，和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在这里被定义为一种线性或者环状的DNA分子，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸，并且其可操作地连接到提供其表达的其它核苷酸上。

宿主细胞：术语″宿主细胞″，如本文所用的，包括易接受包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化，转染，转导等等的任何细胞类型。

修饰：术语“修饰”在这里意指由SEQIDNO：2的氨基酸18-364，SEQIDNO：4的氨基酸20-323，或者SEQIDNO：6的氨基酸20-397，或其同源序列组成的多肽的任何化学修饰，以及编码该多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一或多个氨基酸的取代，缺失和/或插入，以及一个或多个氨基酸侧链的替换。

人工变体：当在这里使用时，术语“人工变体”意指由表达SEQIDNO：1，3，或5，或其同源序列，或其成熟编码区的经修饰核苷酸序列的生物产生的具有木聚糖酶活性的多肽。所述经修饰核苷酸序列通过人工干预获得，这种人工干预是通过在SEQIDNO：1，3，或5中公开的核苷酸序列，或其同源序列，或其成熟编码区的修饰而实现的。

发明详述

具有木聚糖酶活性的多肽

在第一方面，本发明涉及具有氨基酸序列的分离多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO：2的氨基酸18-364(即，成熟多肽)具有至少65％，优选至少70％，更加优选至少75％，更加优选至少80％，更加优选至少85％，甚至更加优选至少90％，最优选至少95％，甚至最优选至少97％，98％，或者99％的同一性程度，其具有木聚糖酶活性；与SEQIDNO：4的氨基酸20-323(即，成熟多肽)具有至少85％，优选至少90％，更加优选至少95％，并且最优选至少97％，98％，或者99％的同一性程度，其具有木聚糖酶活性；或者与SEQIDNO：6的氨基酸20-397(即，成熟多肽)具有至少80％，优选至少85％，更加优选至少90％，更加优选至少95％，并且最优选至少97％，98％，或者99％的同一性程度，其具有木聚糖酶活性(下文中称作″同源性多肽″)。在优选的方面，所述同源性多肽具有与SEQIDNO：2的氨基酸18-364，SEQIDNO：4的氨基酸20-323，或者SEQIDNO：6的氨基酸20-397有十个氨基酸，优选五个氨基酸，更加优选四个氨基酸，甚至更加优选三个氨基酸，最优选两个氨基酸，甚至最优选一个氨基酸不同的氨基酸序列。

本发明的多肽优选包含SEQIDNO：2的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段。在优选的方面，多肽包含SEQIDNO：2的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽包含SEQIDNO：2的氨基酸18-364，或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQIDNO：2的氨基酸18-364。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：2的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：2的氨基酸18-364，或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：2的氨基酸18-364组成。

本发明的多肽还优选包含SEQIDNO：4的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段。在优选的方面，多肽包含SEQIDNO：4的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽包含SEQIDNO：4的氨基酸20-323，或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQIDNO：4的氨基酸20-323。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：4的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：4的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：4的氨基酸20-323，或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：4的氨基酸20-323组成。

本发明的多肽还优选包含SEQIDNO：6的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段。在优选的方面，多肽包含SEQIDNO：6的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽包含SEQIDNO：6的氨基酸20-397，或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQIDNO：6的氨基酸20-397。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：6的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：6的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：6的氨基酸20-397，或其等位基因变体；或其具有木聚糖酶活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQIDNO：6的氨基酸20-397组成。

在第二方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性的分离多肽，其由在极低严格条件，优选低严格条件，更加优选中等严格条件，更加优选中等高严格条件，甚至更加优选高严格条件，并且最优选极高严格条件下与(i)SEQIDNO：1的核苷酸52-1145，SEQIDNO：3的核苷酸58-1400，或者SEQIDNO：5的核苷酸107-1415，(ii)包含在SEQIDNO：1的核苷酸52-1145，SEQIDNO：3的核苷酸58-1400，或者SEQIDNO：5的核苷酸107-1415中的cDNA，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或者(iv)(i)，(ii)，或(iii)的互补链杂交的多核苷酸编码(J.Sambrook，E.F.Fritsch，andT.Maniatis，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2dedition，ColdSpringHarbor，NewYork)。SEQIDNO：1，3，或5的亚序列包含至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。而且，所述亚序列可编码具有木聚糖酶活性的多肽片段。

SEQIDNO：1，3，或5的核苷酸序列，或其亚序列，以及SEQIDNO：2，4，或6的氨基酸序列，或其片段，可以用来设计核酸探针以便根据本领域公知的方法从不同属或种的菌株中鉴定和克隆编码具有木聚糖酶活性的多肽的DNA。特别地，这些探针可以用于与目标属或种的基因组或cDNA进行杂交，随后进行标记的Southern印迹操作，以便鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可以比完整的序列短很多，但长度至少为14，优选至少25，更加优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。不过，优选所述核酸探针长度为至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度可以为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更加优选至少400个核苷酸，或者最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如长度为至少600个核苷酸，优选至少700个核苷酸，更加优选至少800个核苷酸，或者最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针都可以使用。一般对所述探针进行标记以检测相应的基因(例如，用³²P，³H，³⁵S，生物素，或者抗生物素蛋白)。这些探针为本发明所包括。

所以，可以对制备自这些其它生物的基因DNA或cDNA文库筛选与上述探针杂交并编码具有木聚糖酶活性的多肽的DNA。通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术可以分离来自这些其它生物的基因组或者其它DNA。可以将来自文库或分离DNA的DNA转移至并固定于硝酸纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO：1，3，或5，或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用于Southern斑点印迹中。

为了本发明的目的，杂交显示核苷酸序列在极低到极高严格条件下与相应于SEQIDNO：1，3，或5中所示核苷酸序列，包含在SEQIDNO：1，3，或5中的cDNA序列，其互补链，或其亚序列的经标记的核酸探针杂交。利用X射线胶片能够检测所述核酸在这些条件下探针杂交的分子。

在优选的实施方案中，所述核酸探针是编码SEQIDNO：2的多肽，或其亚序列的核酸序列。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是SEQIDNO：1。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是SEQIDNO：1的成熟多肽编码区。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是包含在大肠杆菌(Escherichiacoli)NRRLB-30706中的质粒pSMO210中含有的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是包含在大肠杆菌NRRLB-30706中的质粒pSMO210中含有的成熟多肽编码区。

在另一个优选的实施方案中，所述核酸探针是编码SEQIDNO：4的多肽，或其亚序列的核酸序列。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是SEQIDNO：3。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是SEQIDNO：3的成熟多肽编码区。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是包含在大肠杆菌(Escherichiacoli)NRRLB-30702中的质粒pJLin162中含有的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是包含在大肠杆菌NRRLB-30702中的质粒pJLin162中含有的成熟多肽编码区。

在优选的实施方案中，所述核酸探针是编码SEQIDNO：6的多肽，或其亚序列的核酸序列。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是SEQIDNO：5。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是SEQIDNO：5的成熟多肽编码区。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是包含在大肠杆菌(Escherichiacoli)NRRLB-30703中的质粒pHyGe009中含有的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有木聚糖酶活性的多肽。在另一种优选的实施方案中，所述核酸探针是包含在大肠杆菌NRRLB-30703中的质粒pHyGe009中含有的成熟多肽编码区。

对于长度至少为100个核苷酸的长探针，极低到极高严格条件被定义为在42℃于5XSSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA，对于极低和低严格的25％甲酰胺，对于中等和中等-高严格的35％甲酰胺，或对于高和极高严格的50％甲酰胺中的预杂交和杂交，以及随后任选地12-24个小时的标准Southern斑点印迹操作。

对于长度至少为100个核苷酸的长探针，优选至少在45℃(极低严格)，更加优选至少在50℃(低严格)，更加优选至少在55℃(中等严格)，更加优选至少在60℃(中等-高严格)，甚至更加优选至少在65℃(高严格)，并且最优选至少在70℃(极高严格)用2XSSC，0.2％SDS将载体材料最后洗涤三次，每次15分钟。

对于长度为大约15个核苷酸到大约70个核苷酸的短探针，严格条件被定义为在低于用根据Bolton和McCarthy(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48：1390)的计算算出的T_m大约5℃到大约10℃下于0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mMATP，和0.2mg酵母RNA每ml下按照标准的Southern斑点印迹程序最佳地进行12-24个小时的预杂交，杂交，和杂交后洗涤。

对于长度为大约15个核苷酸到大约70个核苷酸的短探针，在6XSCC加0.1％SDS中将所述载体材料洗涤一次15分钟并在低于算出的T_m大约5℃到10℃下利用6XSSC洗涤两次每次15分钟。

在第三方面，本发明涉及包含SEQIDNO：2，4，或6，或其同源性序列；或其成熟多肽的一个或多个氨基酸的保守性取代、缺失，和/或插入的人工变体。优选地，氨基酸变化是性质变化很小的，即，并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代或插入；小缺失，一般为一到大约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端的蛋氨酸残基；高达大约20-25个残基的小连接肽；或通过改变静电或另一种功能而有利于纯化的小延伸，如多组氨酸片段，抗原表位或结合性结构域。

保守性取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬氨酰胺)，疏水性氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，和小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和蛋氨酸)的组内。一般不改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且，例如，由H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，TheProteins，AcademicPress，NewYork的描述。最常发生的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly。

除了20个标准氨基酸之外，可以将氨基酸(如4-羟脯氨酸，6-N-甲基赖氨酸，2-氨基异丁酸，异缬氨酸，和α-甲基丝氨酸)取代野生型多肽的氨基酸残基。可以将有限数目的非保守性氨基酸，并非由遗传密码子编码的氨基酸，以及非天然氨基酸取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”已在蛋白质合成后进行修饰，和/或在其侧链中具有与标准氨基酸不同的化学结构。非天然氨基酸可以进行化学合成，并且优选地，是可以商购的，并且包括六氢吡啶羧酸，噻唑烷羧酸，脱氢脯氨酸，3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

或者，氨基酸变化可以是这样的性质，即改变多肽的物理-化学特性。例如，氨基酸变化可以提高多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等等。

根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变可以鉴定亲本多肽中的必需氨基酸(CunninghamandWells，1989，Science244：1081-1085)。在后一种技术中，在分子中的每个残基上引入单个丙氨酸突变，对得到的突变分子测试分子的生物学活性以鉴定对于分子活性关键的氨基酸残基。还见，Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性位点或其它生物学相互作用还可以通过结构的物理分析进行测定，如通过诸如核磁共振、结晶学、电子衍射，或者光亲和性标记的技术，结合推定接触位点氨基酸的突变所测定的。见，例如，deVos等，1992，Science255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309：59-64。必需氨基酸的特性(identities)还可以由与根据本发明的多肽相关的多肽的特性来推断。

利用诱变、重组，和/或改组(shuffling)的已知方法，后接相关的筛选方法，如由Reidhaar-OlsonandSauer，1988，Science241：53-57；BowieandSauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2152-2156；WO95/17413；或者WO95/22625所公开的方法，制成并测试单一或多重氨基酸取代。其它可以使用的方法包括致错PCR，噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)，和定区诱变(Derbyshire等，1986，基因46：145；Ner等，1988，DNA7：127)。

诱变/改组方法可以结合高通量的自动筛选方法以检测由宿主细胞表达的克隆的，经诱变的多肽(Ness等，1999，NatureBiotechnology17：893-896)。可以从宿主细胞中回收编码活性多肽的经诱变的DNA分子并利用本领域的标准方法迅速进行测序。这些方法快速测定目标多肽的单个氨基酸残基的重要性，并且可以应用到未知结构的多肽上。

SEQIDNO：2的氨基酸18-364，SEQIDNO：4的氨基酸20-323，或者SEQIDNO：6的氨基酸20-397的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数为10，优选9，更加优选8，更加优选7，更加优选最多6，更加优选5，更加优选4，甚至更加优选3，最优选2，甚至最优选1。

具有木聚糖酶活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获自任何属的微生物。为了本发明的目的，如本文所用的术语“获自”连同给定来源将意为由核苷酸序列编码的多肽由一种来源或插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株生产。在优选的方面，所述获自给定来源的多肽被细胞外分泌。

本发明的多肽可以是细菌性多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌性多肽如杆菌属(Bacillus)多肽，例如，嗜碱芽胞杆菌(Bacillusalkalophilus)，解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，短芽胞杆菌(Bacillusbrevis)，环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)，凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)，灿烂芽胞杆菌(Bacilluslautus)，迟缓芽胞杆菌(Bacilluslentus)，地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)，巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)，嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)，枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)，或者苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)多肽；或者链霉菌属(Streptomyces)多肽，例如，变青链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)多肽；或者革兰氏阴性细菌性多肽，例如，大肠杆菌或者假单胞菌属(Pseudomonas)sp.多肽。

本发明的多肽还可以是真菌性多肽，更加优选为酵母多肽如念珠菌属(Candida)、克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、Schizosaccharomyces，或者Yarrowia多肽；或者更加优选丝状真菌性多肽如枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰刀菌属(Fusarium)、腐殖菌属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)多肽。

在优选的方面，多肽是具有木聚糖酶活性的卡尔斯伯糖酵母(Saccharomycescalsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomycesdiastaticus)、Saccharomycesdouglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形糖酵母(Saccharomycesoviformis)多肽。

在另一个优选的方面，多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeateus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusforetidus)、日本曲霉(AspergillusJaponicus)、构巢曲霉((Aspergillusnidulans))、黑曲霉、米曲霉、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、近念珠状镰孢(Fusariumtorulosum)、Fusariumtrichothecioides、有毒镰孢(Fusariumvenenatum)、Humicolainsolens、Humicolalanuginosa、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Trichodermaharzianum、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、Trichodermareesei或绿色木霉(Trichodermaviride)多肽。

在更加优选的实施方案中，所述多肽是烟曲霉多肽，例如，具有SEQIDNO：2，4，或6的氨基酸序列的多肽。

应当理解的是，对于前述物种来说，本发明包括理想的和不理想的状态，以及其它分类学等同物，例如，无性型，而不管已知物种的名称如何。本领域技术人员将会轻易地识别适当等同物的身份。

在许多培养物保藏中心这些物种的菌株可以轻易地被公众获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM)，CentraalbureauVoorSchimmelcultures(CBS)，以及农业研究服务专利培养物保藏中心，北方地区研究中心(NRRL)。

另外，利用上述探针，可以从其它来源包括分离自自然界(例如，土壤，堆肥，水，等)的微生物中鉴定并获得这些多肽。从自然产地分离微生物的技术是本领域公知的。随后通过类似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库可以获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就可以通过利用本领域普通技术人员公知的技术分离或克隆所述多核苷酸(见，例如，Sambrook等，1989，同上)。

本发明的多肽还包括融合的多肽或可剪切的融合多肽，其中将另一种多肽融合在所述多肽或其片段的N末端或C末端上。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到本发明的核苷酸序列(或其部分)上而产生融合的多肽。生产融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码所述多肽的编码序列从而使它们在框内并使融合的多肽在相同启动子和终止子的控制之下。

多核苷酸

本发明还涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸。

在优选的方面，所述核酸序列在SEQIDNO：1中给出。在另一种更加优选的实施方案中，所述核酸序列是包含在大肠杆菌(Escherichiacoli)NRRLB-30706中的质粒pSMO210中含有的序列。在另一个优选的方面，所述核酸序列是SEQIDNO：1的成熟多肽编码区。在另一个更加优选的方面，所述核酸序列是包含在大肠杆菌(Escherichiacoli)NRRLB-30706中的质粒pSMO210中含有的成熟多肽编码区。本发明还包括编码具有SEQIDNO：2或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核酸，其在遗传密码子的简并性方面与SEQIDNO：1不同。本发明还涉及编码具有木聚糖酶活性的SEQIDNO：2的片段的SEQIDNO：1的亚序列。

在另一种优选的实施方案中，所述核酸序列在SEQIDNO：3中给出。在另一种更加优选的实施方案中，所述核酸序列是包含在大肠杆菌(Escherichiacoli)NRRLB-30702中的质粒pJLin162中含有的序列。在另一个优选的方面，所述核酸序列是SEQIDNO：3的成熟多肽编码区。在另一个更加优选的方面，所述核酸序列是包含在大肠杆菌(Escherichiacoli)NRRLB-30702中的质粒pJLin162中含有的成熟多肽编码区。本发明还包括编码具有SEQIDNO：4或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核酸，其在遗传密码子的简并性方面与SEQIDNO：3不同。本发明还涉及编码具有木聚糖酶活性的SEQIDNO：4的片段的SEQIDNO：3的亚序列。

在优选的实施方案中，所述核酸序列在SEQIDNO：5中给出。在另一种更加优选的实施方案中，所述核酸序列是包含在大肠杆菌(Escherichiacoli)NRRLB-30703中的质粒pHyGe009中含有的序列。在另一个优选的方面，所述核酸序列是SEQIDNO：5的成熟多肽编码区。在另一个更加优选的方面，所述核酸序列是包含在大肠杆菌(Escherichiacoli)NRRLB-30703中的质粒pHyGe009中含有的成熟多肽编码区。本发明还包括编码具有SEQIDNO：6或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核酸，其在遗传密码子的简并性方面与SEQIDNO：5不同。本发明还涉及编码具有木聚糖酶活性的SEQIDNO：6的片段的SEQIDNO：5的亚序列。

本发明还涉及在SEQIDNO：1，3，或5的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变的突变型多核苷酸，其中所述突变型核苷酸序列分别编码由SEQIDNO：2的氨基酸18-364，SEQIDNO：4的氨基酸20-323，或者SEQIDNO：6的氨基酸20-397组成的多肽。

用来分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的并且包括从基因组DNA中分离，从cDNA中制备，或其组合。例如，通过利用公知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共有结构特征的克隆DNA片段可以影响从这种基因组DNA中克隆本发明的多核苷酸。见，例如，Innis等，1990，PCR：AGuidetomethodsandApplication，AcademicPress，NewYork。可以使用其它核酸扩增方法如连接酶链式反应(LCR)，连接激活转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。所述多核苷酸可以克隆自曲霉属的菌株，或另一种或相关生物，因而，例如，可以是所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因或物种变体。

本发明还涉及具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQIDNO：1的成熟多肽编码序列(即，SEQIDNO：1的核苷酸52-1145)具有至少65％，优选至少70％，更加优选至少75％，更加优选至少80％，更加优选至少85％，更加优选至少90％，甚至更加优选至少95％，并且最优选至少97％，98％，或者99％同一性的同一性程度，其编码活性多肽。

本发明还涉及具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQIDNO：3的成熟多肽编码序列(即，核苷酸58-1400)具有至少85％，优选至少90％，更加优选至少95％，并且最优选至少97％，98％，或者99％同一性的同一性程度，其编码活性多肽。

本发明还涉及具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQIDNO：5的成熟多肽编码序列(即，核苷酸107-1415)具有至少80％，优选至少85％，更加优选至少90％，甚至更加优选至少95％，并且最优选至少97％，98％，或者99％同一性的同一性程度，其编码活性多肽。

编码本发明多肽的核苷酸序列的修饰对于与所述多肽基本上相似的多肽的合成可能是必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指所述多肽的非天然发生形式。这些多肽可以以某些改造方式有别于分离自其天然来源的多肽，例如，在特异活性、热稳定性、最适pH等等方面不同的人工变体。可以在如SEQIDNO：1，3，或者5的多肽编码区所示核苷酸序列的基础上构建变异序列，例如，其亚序列，和/或通过导入核苷酸取代，其不引起另一种由核酸序列编码的多肽的氨基酸序列，但其对应于意欲生产所述酶的宿主生物的密码子用法，或者通过导入可以引起不同氨基酸序列的核苷酸取代进行构建。对于核苷酸取代的一般性描述，见，例如，Ford等，1991，ProteinExpressionandPurification2：95-107。

对于本领域技术人员来说显而易见这些取代可以在分子功能关键区之外进行并且仍然导致活性多肽。根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变可以鉴定由本发明分离多核苷酸编码的多肽的活性所必需的氨基酸残基，并且因此优选不进行取代(见，例如，CunninghamandWells，1989，Science244：1081-1085)。在后一种技术中，在分子中的每个带正电残基上引入突变，对得到的突变分子测试木聚糖活性以鉴定对于分子活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点还可以通过三维结构的分析确定，如通过诸如核磁共振、结晶学或者光亲和性标记的技术所测定的(见，例如，deVos等，1992，Science255：306-312；Smith等，1992，JournalofMolecularBiology224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLetters309：59-64)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离多核苷酸，其在极低严格条件，优选低严格条件，更加优选中等严格条件，更加优选中等-高严格条件，甚至更加优选高严格条件，并且最优选极高严格条件下与(i)SEQIDNO：1的核苷酸52-1145，SEQIDNO：3的核苷酸58-1400，或者SEQIDNO：5的核苷酸107-1415，(ii)包含在SEQIDNO：1的核苷酸52-1145，SEQIDNO：3的核苷酸58-1400，或者SEQIDNO：5的核苷酸107-1415中的cDNA，或(iii)(i)或(ii)的互补链；或如本文所定义的其等位基因变体和亚序列杂交(Sambrook等，1989，同上)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其通过(a)将一组DNA在极低，低，中等，中等-高，高，或极高严格条件下与(i)SEQIDNO：1的核苷酸52-1145，SEQIDNO：3的核苷酸58-1400，或者SEQIDNO：5的核苷酸107-1415，(ii)包含在SEQIDNO：1的核苷酸52-1145，SEQIDNO：3的核苷酸58-1400，或者SEQIDNO：5的核苷酸107-1415中的cDNA，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和(b)分离编码具有木聚糖酶活性的多肽的杂交多核苷酸而获得。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作连接到一种或多种指导编码序列在合适的宿主细胞中表达的控制序列上，所述表达是在与所述控制序列相容的条件下进行的。

可以以多种方式对编码本发明多肽的分离多核苷酸进行操作以提供所述多肽的表达。根据表达载体的不同，在多核苷酸序列插入载体之前对它进行操作可以是有利的或必需的。利用重组DNA修饰多核苷酸的技术是本领域公知的。

所述控制序列可以是适合的启动子序列，被宿主细胞识别的核苷酸序列用于表达编码本发明多肽的多核苷酸。所述启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。所述启动子可以是任何在选定的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列，包括突变的，截短的，和杂合的启动子，并且可以获自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

适于指导本发明核酸构建体转录，尤其是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的例子为获自下列的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)levansucrase基因(sacB)、地衣型芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)生麦淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣型芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、和原核β-乳糖酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA75，3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80：21-25)。其它启动子披露于ScientificAmerican，1980，242：74-94中的“获自重组细菌的有用蛋白”一文；以及Sambrook等，1989，同上。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体转录的合适启动子的例子为获自编码以下酶的基因的启动子：米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉(Aspergillusniger)酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、Fusariumvenenatum淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)，FusariumvenenatumDaria(WO00/56900)，FusariumvenenatumQuinn基因(WO00/56900)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰岛素样蛋白酶(WO96/00787)，Trichodermareeseiβ-葡萄糖苷酶，Trichodermareesei纤维二糖水解酶I，Trichodermareesei纤维二糖水解酶II，Trichodermareesei葡聚糖内切酶I，Trichodermareesei葡聚糖内切酶II，Trichodermareesei葡聚糖内切酶III，Trichodermareesei葡聚糖内切酶IV，Trichodermareesei葡聚糖内切酶V，Trichodermareesei木聚糖酶I，Trichodermareesei木聚糖酶II，Trichodermareeseiβ-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)；及其突变的，载短的，和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子获自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)基因、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)，和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。其它可用于酵母宿主的启动子描述于Romanos等，1992，Yeast8：423-488中。

所述控制序列还可以是合适的转录终止子序列，即被宿主细胞识别以终止转录的序列。该终止序列可操纵地连接于编码所述多肽的核苷酸序列的3′末端。任何能在所选择的宿主细胞中起作用的终止子均可用于本发明中。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获自编码以下酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲酶葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获自编码酿酒酵母烯醇化酶基因、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)基因，和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。其它可用于酵母宿主细胞的终止子描述于Romanos等1992，同上中。

所述控制序列还可以是合适的前导序列，即mRNA的非翻译区，其对于宿主细胞的翻译是重要的。所述前导序列可操纵地连接于编码所述多肽的核苷酸序列的5′末端。任何能在所选择的宿主细胞中起作用的前导序列均可用于本发明中。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列获自编码米曲霉TAKA淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。

用于酵母宿主细胞的合适前导序列获自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)。

所述控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，该序列可操纵地连接于所述核苷酸序列的3′-末端，而且其在转录时由所述宿主细胞识别，作为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。任何适用于所选择的宿主细胞的多聚腺苷酸化序列都可以用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化序列得自编码以下酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

Guo和Sherman(1995，分子细胞生物学15：5983-5990)描述了可用于酵母宿主细胞的多聚腺苷酸化序列。

控制序列还可以是编码连在多肽氨基端的氨基酸序列的信号肽编码区，引导编码多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列编码序列的5’端可以在先天上含有信号肽编码区，该编码区在翻译阅读框中与编码分泌多肽的编码区片段天然连接在一起。另外，所述编码序列的5′末端可以含有一个相对于所述编码分泌多肽的编码序列部分是外源的信号肽编码区。当所述编码区天然不包含信号肽编码区时，可能需要该外源信号肽编码区。另外，该外源信号肽编码区可简单地取代所述天然信号肽编码区以增强所述多肽的分泌。不过，任何能够将表达的脂酶引导至所选择的宿主细胞的分泌途径中的信号肽编码区，即分泌到培养基中，均可用于本发明中。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自芽孢杆菌NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶、地衣形芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣形芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因。Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57：109-137描述了其它信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicolainsolens纤维素酶和Humicolalanuginosa脂酶的基因。

在优选的方面，所述信号肽编码区是编码SEQIDNO：2的氨基酸1-17的SEQIDNO：1的核苷酸1-51。

在优选的方面，所述信号肽编码区是编码SEQIDNO：4的氨基酸1-19的SEQIDNO：3的核苷酸1-57。

在优选的方面，所述信号肽编码区是编码SEQIDNO：6的氨基酸1-19的SEQIDNO：5的核苷酸1-106，或其cDNA。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)α-因子和酿酒酵母转化酶基因。Romanos等，1992，同上描述了其它有用的信号肽编码区。

控制序列还可以是编码位于多肽氨基末端之氨基酸序列的前肽编码区。所得的多肽称为原酶或多肽原(在某些情况下为酶原)。多肽原通常是无活性的并可从所述多肽原前肽通过催化或自我催化裂解而转变为成熟有活性的多肽。所述多肽编码区可得自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、啤酒糖酵母α因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(WO95/33836)的基因。

当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基端时，前肽区与多肽的氨基端紧邻，而信号肽区和前肽区的氨基端紧邻。

还优选加入能调节与细胞生长相关的异源多肽表达的调控序列。调控系统的实例包括应答化学或物理刺激，包括在有调控化合物存在的情况下，而导致基因表达的开启或关闭的那些。原核生物系统中的调节序列包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调控序列的其它实例为允许进行基因扩增的序列。在真核生物系统中，这些包括存在氨甲蝶呤时扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及在重金属时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码所述多肽的核酸序列应与所述调节序列可操作相连。

表达载体

本发明还涉及含有本发明的多核苷酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可将本文所述的各种核酸和调控序列连接在一起以产生重组表达载体，其可以包含一个或多个方便的限制位点以便允许编码多肽的核苷酸序列在这类位点插入或置换。或者，本发明的核苷酸序列可以通过将该核苷酸序列或含有该序列的核酸构建体插入适当表达载体来表达。在创建表达载体的过程中，可将编码序列定位在表达载体中从而使编码序列与适当调控序列可操作性地连接以便表达。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可方便地进行重组DNA操作并且能使核酸序列表达。载体的选择将一般决定于载体与引入了该载体的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体形式存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒，染色体外元件，小染色体(minichrmosome)或人工染色体。载体可含有任何确保自我复制的手段。或者，载体可以是引入宿主细胞后整合到基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。另外，可使用单个载体或质粒，或一起含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选含有一个或多个可选择标记，其能容易地选择出转化、转染等细胞。可选择标记是一种基因，其产物能提供对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型的转变等。

细菌可选择标记的实例是来源于枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予了抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。适合于酵母宿主细胞的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。可用于丝状真菌细胞中的可选择标记包括，但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)，及它们的等同物。优选用于曲霉细胞中的为构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有使所述载体可以稳定整合到宿主细胞基因组中或者载体在细胞中不依赖于基因组而自我复制的元件。

为了整合到宿主细胞基因组中，所述载体可依赖于编码多肽的多核苷酸序列或载体上任何其它元件来通过同源或非同源重组而稳定整合到基因组中。或者，载体可能含有其它核苷酸序列，这些序列可指导通过同源重组在染色体的精确位置整合进入宿主细胞基因组。为了提高在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够量的与相应靶序列高度同源的核酸，例如100-10000个碱基对，优选400-10000个碱基对，最优选地800-10000个碱基对，以便提高同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。另外，整合元件还可以是非编码的或编码的核苷酸序列。另一方面，通过非同源重组可将载体整合到宿主细胞的基因组中。

为了进行自主复制，所述载体还可含有能够使载体在所研究的宿主细胞中自主复制的复制起始点。所述复制起始点可以是介导自主复制的任何质粒复制子，其在细胞中发挥作用。术语“复制起始点”或“质粒复制子”在此被定义为一种核苷酸序列，其能够使得质粒或载体在体内进行复制。

细菌性复制起始点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起始点，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起始点。

用于酵母细胞的复制起始点的实例是2micron复制起始点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合，以及ARS4和CEN6的组合。

可用于丝状真菌细胞中的复制起始点为AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene98：61-67；Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15：9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离以及包含所述基因的质粒或载体的构建可以根据在WO00/24883中公开的方法实现。

可将一个以上拷贝的本发明多核苷酸序列插入到宿主细胞中以提高基因产物的生产。通过将至少一个以上额外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括可扩增的选择性标记基因与所述多核苷酸序列可以获得所述核苷酸拷贝数的增加，其中通过在存在适当的选择剂的条件下培养含扩增拷贝的选择性标记基因，由此增加了核酸序列的拷贝数的细胞可筛选所述细胞。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如Sambrook等，1989，同上文)。

宿主细胞

本发明还涉及含有本发明多核苷酸的重组宿主细胞，其优选在多肽的重组生产中使用。将含有本发明的多核苷酸的载体引入宿主细胞中，使载体以上述染色体整合体的形式或自主复制的染色体外载体的形式维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，由于在复制期间发生的突变其与亲本细胞并不相同。对宿主细胞的选择很大程度上决定于编码所述多肽的基因和它的来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。

有用的单细胞是细菌细胞如革兰氏阳性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌细胞，例如嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillusclausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌细胞，例如，浅变青链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和假单胞菌菌种。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞是嗜碱性芽孢杆菌。

将表达载体引入细菌宿主细胞可以，例如通过原生质体转化(见，例如，Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学168：111-115)，利用感受态细胞(见，例如，Young和Spizizin，1961，细菌学杂志81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志56：209-221)，电穿孔(见，例如，Shigekawa和Dower，1988，生物技术6：742-751)，或接合作用(见，例如，Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志169：5771-5278)而实现。

宿主细胞还可以是真核生物例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在优选的方面，所述宿主细胞是真菌细胞。此处所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等在Ainsworth和Bisby真菌词典，第8版，1995，CAB国际，大学出版社，Cambridge，UK中进行的定义)，以及卵菌门(Oomycota)(被Hawksworth等引用，1995，同上，171页)和全部的产有丝分裂孢子的真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，同上)。

在更优选的方面，真菌细胞是酵母细胞。此处所用的“酵母”包括产囊孢子酵母(ascosporogenousyeast)(Endomycetales)、产担子孢子酵母(basidiosporogenousyeast)、以及属于半知菌(FungiImperfecti)的酵母(Blastomycetes)。因为将来酵母的分类可能会有变化，为了本发明的目的，酵母应该按照BiologyandActivitiesofYeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中描述的那样定义。

在还要更优选的方面，所述酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉森酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、糖酵母属、裂殖酵母属、或Yarrowia的细胞。

在最优选的方面，所述酵母宿主细胞是卡尔斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、Saccharomycesdouglasii、克鲁维糖酵母、Saccharomycesnorbensis、或卵型糖酵母的细胞。在另一最优选的实施方案中，所述酵母宿主细胞是乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)的细胞。在另一最优选的实施方案中，所述酵母宿主细胞是Yarrowialipolytica的细胞。

在另一更优选的方面，所述真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(如Hawksworth等，1995，同上所定义)的所有丝状形式。丝状真菌的特征是由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖以及其它复合多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝的延长进行营养生长，碳分解代谢为专性需氧型。相反，酵母例如啤酒糖酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而碳分解代谢可能为发酵型。

在甚至更优选的方面，所述丝状真菌宿主细胞是支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、Bjerkandera、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)，隐球菌属(Cryptococcus)，Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Phanerochaete、Phlebia、Piromyces、Pleurotus、裂褶菌属(Schizophyllum)、Talaromyces、Thermoascus、草根霉属(Thielavia)、Tolypocladium、Trametes，或木霉属(Trichoderma)的细胞。

在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一最优选的方面，所述丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusariumbactrdidoides)、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、近念珠状镰孢(Fusariumtorulosum)、Fusariumtrichothecioide或有毒镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在另一最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是Bjerkanderaadusta、Ceriporiopsisaneirina、Ceriporiopsisaneirina、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、Ceriporiopsissubvermispora、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、Coriolushirsutus、Humicolainsolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢霉、产紫青霉、Trichodermaharzianum、康宁氏木霉、Trichodermalongibrachiatum、Trichodermareesei、或绿色木霉细胞。

真菌细胞可通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁以其本身已知的方式再生等的过程来转化。用于转化曲霉属和木霉属种宿主细胞的适宜方法描述于EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81：1470-1474中。用于转化镰孢属的适宜方法见Malardier等1989，Gene78：147-156和WO96/00787。酵母可用Becker和Guarente在Abelson，J.N.andSimon，M.I.，editors，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology，MethodsinEnzymology，Volume194，pp182-187，AcademicPress，Inc.，NewYork；Itoetal.，1983，JournalofBacteriology153：163；以及Hinnen等1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75：1920中描述的方法转化。

生产方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，所述方法包括：(a)在有益于生产所述多肽的条件下培养在野生型形式下能够生产所述多肽的细胞；和(b)回收所述多肽。优选地，所述细胞是曲霉属的并且更加优选烟曲霉的细胞。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，所述方法包括：(a)在有益于生产所述多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，所述方法包括：(a)在有益于生产所述多肽的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变型核苷酸序列，其在SEQIDNO：1的成熟多肽编码区中具有至少一个突变，其中所述突变型核苷酸序列编码这样一种多肽，其由SEQIDNO：2的氨基酸18-364，SEQIDNO：4的氨基酸20-323，或SEQIDNO：26的氨基酸20-397组成；和(b)回收所述多肽。

在本发明的生产方法中，使用本领域已知的方法，在适于生产该多肽的营养培养基中培养这些细胞。例如，该细胞可以在实验室或工业发酵罐中，用适当的培养基，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批、或固态发酵)进行培养。使用本领域已知的方法，在含有碳和氮源以及无机盐的适当培养基中进行培养。适当的培养基可以从供应商处得到，或者可以根据已经公布(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)的组成来制备。如果该多肽分泌至营养培养基中，可直接从该培养基回收多肽。如果该多肽未分泌到培养基中，可从细胞裂解物回收它。

利用本领域已知的对于所述多肽特异性的方法可以检测所述多肽。这些检测方法可以包括使用特异性抗体、形成酶产物，或酶底物的消失。例如，可以利用酶测定法来测定如本文所述的多肽的活性。

得到的多肽可以通过本领域已知的方法进行回收。例如，该多肽可以通过传统方法从培养基中回收，包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥(spray-drying)、蒸发，或沉淀。

本发明的多肽可以通过本领域已知的各种方法进行纯化，包括但不限于，层析(例如，离子交换、亲和性、疏水性、层析聚焦，和大小排阻层析)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差异溶解度(differentialsolubility)(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE，或提取(参见，例如，蛋白纯化，J.-C.Janson和LarsRyden编辑，VCH出版社，纽约，1989)以获得基本上纯的多肽。

植物

本发明还涉及用编码具有本发明的具有木聚糖酶活性之多肽的核苷酸序列转化的转基因植物、植物部分，或植物细胞以便以可回收的数量表达并生产所述多肽。可从植物或植物部分回收所述多肽。或者，可以使用含所述重组多肽的植物或植物部分以便例如改善食品或饲料的质量，例如提高营养价值、适口性和流变特性(rheologicalproperties)，或破坏抗营养因子。

所述转基因植物可以是双子叶的(adicot)或单子叶的(amonocot)。单子叶植物的实例是草，如草地早熟禾(meadowgrass)(蓝草(bluegrass)、早熟禾属(Poa))、草料草(foragegrass)如Festuca、Lolium、温带草(temperategrass)，如剪股颖属(Agrostis)和谷类植物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、和玉米。

双子叶植物的实例是烟草、豆类，如羽扇豆(lupins)、马铃薯、甜菜(sugarbeet)、豌豆(pea)、黄豆(bean)和大豆(soybean)，以及十字花科植物(芸苔科(Brassicaceae))，例如花椰菜、油菜籽和紧密相关的模型植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎，以及包含这些部分的个别组织，例如，表皮、叶肉、实质(parewnchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞室，如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧物酶体和胞质也被认为是植物部分。此外，无论什么组织来源的细胞均可被认为是植物部分。同样地，植物部分诸如分离来有利于本发明利用的特定组织或细胞也被认为是植物部分，例如，胚、胚乳、糊粉粒和种皮。

本发明还包括这些植物、植物部分和植物细胞的子代。

按照本领域已知的方法可以构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码本发明多肽的一种或多种表达构建体掺入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并将所得的经修饰的植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞来构建所述植物或植物细胞。

方便地，所述表达构建体是核酸构建体，所述核酸构建体含有与在所选植物或植物部分中表达所述核苷酸序列所需的适宜调节序列可操作相连的、编码本发明多肽的核酸序列。另外，所述表达构建体可含有用于鉴定所述表达载体已整合至其中的那些宿主细胞的选择性标记以及将所述构建体导入目标植物中所需的DNA序列(后者取决于所用的DNA导入方法)。

调控序列，如启动子和终止子序列和任选的信号或转位序列(transit)的选择取决于，例如何时、何处以及如何表达所述多肽。例如，编码本发明多肽之基因的表达可以是组成型或诱导型，或是发育、阶段或组织特异性的，且可将所述基因产物靶向至特异性的组织或植物部分如种子或叶。调控序列可参见Tague等1988，PlantPhysiology86：506。

对于组成型表达，可使用35S-CaMV，玉米遍在蛋白1，和水稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell21：285-294)。器官特异性启动子可以是例如来自贮存库(sink)组织例如种子、马铃薯块茎和果实(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)或来自代谢库(sink)组织例如分生组织(Ito等1994，PlantMol.Biol.24：863-878)的启动子，种子特异性启动子例如来自稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等1998，PlantandCellPhysiology39：885-889)，来自蚕豆(Viciafaba)的豆球蛋白B4和未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152：708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39：935-941)，来自Brassicanapus的贮存蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其它种子特异性启动子，例如WO91/14772描述的那些。另外，所述启动子可以是叶特异性启动子例如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102：991-1000)，小球藻病毒腺苷酸甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248：668-674)或创伤诱导型启动子例如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22：573-588)。同样地，启动子可以被非生物处理，如温度、干旱或盐度的变化所诱导，或被外源应用的激活启动子的物质所诱导，例如，乙醇，雌激素，植物激素如乙烯，脱落酸，和赤霉酸以及重金属。

还可将启动子增强子用于在植物中使本发明的多肽表达水平更高。例如，所述启动子增强子可以是位于所述启动子和编码本发明多肽之核苷酸序列间的内含子。例如Xu等，1993，同上，公开了稻肌动蛋白1基因的第一内含子提高表达的用途。

选择性标记基因和所述表达构建体的任何其它部分可选自本领域现有的其它相应基因。

按照本领域已知的常规方法，例如土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物弹射(biolistic)转化和电穿孔将核酸构建体导入植物基因组(Gasser等，1990，Science244：1293；Porykus，1990，BiolTechnology8：535；Shimamotoetal.，1989，Nature338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumegaciens)-介导的转移是用于产生转基因双子叶植物的选择方法(有关综述，参见HooykasandSchilperoort，1992，PlantMolecularBiology19：15-38)并且还可用来转化单子叶植物，尽管通常对这些植物使用其它转化方法。目前，用于产生转基因单子叶植物的选择方法是对胚胎愈伤组织或正在发育的胚胎进行粒子(用转化DNA包被的显微金或钨颗粒)轰击(Christou，1992，PlantJournal2：275-281；Shimamoto，1994，CurrentOpinionBiotechnology5：158-162；Vasiletal.，1992，BiolTechnology10：667-674)。用于转化单子叶植物的另一种方法是基于Omirulleh等1993，PlantMolecularBiology21：415-428所述的原生质体转化。

转化后，按照本领域熟知的方法筛选已掺入所述表达构建体的转化体，并再生成完整植株。通常设计转化方法来在再生期间或在随后的世代中通过利用，例如，两种分离的T-DNA构建体的共转染或由特异性重组酶进行选择基因的位点特异性剪切来选择性消除选择基因。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，所述方法包括：(a)在有益于生产所述多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码本发明的具有木聚糖酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

木聚糖酶活性的去除或减弱

本发明还涉及产生亲本细胞的突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸序列，或其部分，当在相同条件下培养时这导致形成比亲本细胞产生更少多肽的突变体细胞。

通过利用本领域公知的方法减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达，例如，插入，破坏，替换，或缺失，可以构建所述突变体细胞。在优选的方面，将所述核苷酸序列灭活。待修饰或灭活的核苷酸序列可以是，例如，对于活性必需的编码区或其部分，或编码区的表达所必需的调控元件。这种调控或控制区的例子可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响所述核苷酸序列表达的部分。对于可能的修饰的其它控制序列包括，但不限于，前导区，多聚腺苷化序列，前肽序列，信号肽序列，转录终止子，和转录激活子。

通过将亲本细胞进行诱变并选择核苷酸序列的表达得以减弱或消除的突变体细胞可以进行所述核苷酸序列的修饰或灭活。例如，通过使用合适的物理或化学诱变剂，通过使用合适的寡核苷酸，或通过将DNA序列进行PCR生成的诱变，可以进行特异性或随机的诱变。另外，通过使用这些诱变剂的任意组合可以进行所述诱变。

适于本发明目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外线(UV)辐射，羟胺，N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，O-甲基羟胺，亚硝酸，ethylmethanesulphonate(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸，和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，一般通过在合适条件下存在选定诱变剂时孵育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择展示减弱的或无基因表达的突变体细胞来进行所述诱变。

通过导入、取代，或去除基因中的一个或多个核苷酸或其转录或翻译所必需的调控元件可以实现所述核苷酸序列的修饰或灭活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或灭活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰核苷酸序列的细胞上进行，但优选如下面所例的那样在体外进行所述修饰。

消除或减弱由细胞进行的核苷酸序列的表达的便利途径的例子是基于基因替换，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生破坏性的核酸序列，随后将其转化入亲本细胞中以产生破坏基因。通过同源重组，所述破坏性核酸序列替代了内源性核苷酸序列。有利的是所述破坏性核苷酸序列还编码可用于选择所述核苷酸序列被修饰或破坏的转化子的标记。在特别优选的实施方案中，用可选择的标记，如本文所述的那些来破坏所述核苷酸序列。

或者，可以通过使用与所述核苷酸序列互补的序列的成熟的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或灭活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减弱或消除细胞进行的所述核苷酸序列的表达，所述序列可以在细胞中转录并且能够杂交到细胞中产生的mRNA上。在允许所述互补反义核苷酸序列杂交到mRNA上的条件下，由此减弱或消除翻译的蛋白质的量。

本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其控制序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。

这样生成的多肽缺陷型突变体细胞作为表达同源和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及生产同源或异源多肽的方法，其包括(a)在有益于生产所述多肽的条件下培养突变体细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在这些被定义为并非宿主细胞天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然多肽，或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上被改变的天然蛋白质。

在另一方面，本发明涉及通过在发酵之前、之中，或发酵完成之后向发酵肉汤中添加有效量的能够抑制木聚糖酶活性的试剂进行细胞发酵，从发酵肉汤中回收目标产物，并且任选地将回收的产物作进一步纯化，来生产基本上无木聚糖酶活性的蛋白质产品的方法，所述细胞通过产生本发明的多肽以及目标蛋白产物。

在另一方面，本发明涉及通过在允许产物表达的条件下培养细胞，将得到的培养物肉汤进行组合的pH和温度处理以便基本上减弱木聚糖酶活性，和从发酵肉汤中回收产物，来生产基本上无木聚糖酶活性的蛋白质产品的方法。或者，所述组合的pH和温度处理可以对回收自培养物肉汤的酶制品进行。所述组合的pH和温度处理可以任选地与木聚糖酶抑制剂处理组合使用。

按照本发明的这方面，有可能去除至少至少60％，优选至少75％，更加优选至少85％，还要更加优选至少95％，并且最优选至少99％的木聚糖酶活性。通过使用这种方法可以获得木聚糖酶活性的完全去除。

优选在pH4-5和温度80-90℃下进行所述组合的pH和温度处理持续足够的时期以取得所需效果，其中一般30-60分钟是足够的。

通过本领域已知的方法可以实施用于目标产物的培养和纯化的方法。

本发明的生产基本上无木聚糖酶活性的产品的方法在生产真核多肽中特别有用，特别是真菌蛋白质如酶。所述酶可以选自，例如，淀粉分解酶，脂肪分解酶，蛋白水解酶，细胞分解酶，氧化还原酶，或植物细胞壁降解酶。这些酶的例子包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶(chitinase)、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖内切酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-或β-葡糖苷酶、haloperoxidase、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、苯酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶，或另一种木聚糖酶。所述木聚糖酶型细胞还可以用来表达药学相关(interests)的异源蛋白质如激素，生长因子，受体等等。

应当理解术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，还包括那些已通过氨基酸取代，缺失或添加，或其它这些修饰以提高活性，耐热性，pH耐受性等等进行了修饰的多肽，例如酶。

在另一方面，本发明涉及通过本发明的方法生产的基本上无木聚糖酶活性的蛋白质产品。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的木聚糖酶活性随着例如，至少1.1的富集系数得以升高。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶学组分，例如，单组分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶学活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶(carbohydrase)、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖内切酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、haloperoxidase、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、peptidogultaminase、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶，或另一种木聚糖酶。额外的酶可以，例如，由属于曲霉属的微生物生产，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢霉属，优选杆孢状镰孢、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、近念珠状镰孢(Fusariumtoruloseum)、Fusariumtrichothecioides或有毒镰孢；腐殖菌属，优选Humicolainsolens或Humicolalanuginosa；木霉属，优选Trichodermaharzianum、康宁木霉、长枝木霉、Trichodermareese或绿色木霉。

所述多肽组合物可以按照本领域已知的方法制备或者可以为液体或干燥组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒或微粒的形式。包括在所述组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法进行稳定化。

下面给出本发明的多肽组合物的优选用途的例子。本发明的多肽组合物的剂量以及使用所述组合物的其它条件可以根据本领域已知的方法来确定。

用途

通过用有效量的多肽处理材料，本发明的具有木聚糖酶活性的多肽可以用于几种应用中以降解或转变包含木聚糖的材料(见，例如，WO2002/18561)。

所述多肽可以用于根据美国专利号5,658,765的纸浆的处理方法。

根据美国专利号5,658,765所述多肽还可以用于木聚糖或木糖寡糖的生产方法。

根据美国专利号6,245,546所述多肽还可以用作提高饲料消化性的饲料增强酶以提供其使用的效率。

根据美国专利号5,693,518所述多肽可以用于烘培。

根据WO2002/24926所述多肽还可以用于酿造。

信号肽

本发明还涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，所述基因可操作性地连接到由下述组成的信号肽组成的核苷酸序列上，SEQIDNO：1的核苷酸1-51，SEQIDNO：3的核苷酸1-57，或SEQIDNO：5的核苷酸1-106，或其cDNA，其分别编码由SEQIDNO：2的氨基酸1-17，SEQIDNO：4的氨基酸1-19，或者SEQIDNO：6的氨基酸1-19，其允许将蛋白质分泌入培养基中，其中所述基因对于所述核苷酸序列来说是外源的。

本发明还涉及包含这些核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及生产蛋白质的方法，其包括：(a)在适于生产所述蛋白质的条件下培养这种重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

可以将第一和第二核苷酸序列单独地与其它控制序列或者组合其它控制序列可操作地连接到外源基因上。这些其它的控制序列同上所述。如早先所述，当信号肽和前肽区都存在于蛋白质的氨基末端时，所述前肽区位于紧靠蛋白质氨基末端而信号肽区位于紧靠前肽区的氨基末端。

所述蛋白质对于宿主细胞来说可以是原生的或异源的。术语“蛋白质”在这里并不意指特定长度的编码产物，并且因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包括两种或多种组合来形成编码产物的肽。所述蛋白质还包括杂合的多肽，其包含获自至少两种不同蛋白质的部分或全部多肽序列的组合，在所述两种不同蛋白质中一种或多种对于宿主细胞来说可以是异源的或原生的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质的天然发生的等位基因变体或经改造的变体。

优选地，所述蛋白质是激素或其变体，酶，受体或其部分，抗体或其部分，或报告蛋白。在更加优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，或脂酶。在还要更加优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶，或木聚糖酶。

所述基因可以获自任何原核的，真核的，或其它来源。

通过下列实施例对本发明作进一步介绍，其不应被视为限制本发明的范围。

实施例

材料

用作缓冲剂和底物的化学品是至少试剂级别的商业产品。

菌株

米曲霉BECh2菌株(Δalp，Δamy，CPA-，KA-，Δnp1)用于表达烟曲霉木聚糖酶。烟曲霉PaHa34用作木聚糖酶家族10的来源。

培养基

最小培养基由每升6g的NaNO₃，0.52g的KCl，1.52gKH₂PO₄，1mlCOVE微量元素溶液，20gNoble琼脂，1％葡萄糖，和0.5％MgSO₄·7H₂O组成。

COVE板由每升342.3g蔗糖，20mlCOVE盐溶液，10ml的1M乙酰胺，10ml的1.5MCsCl₂，和25gNoble琼脂组成。

COVE盐溶液由每升26gKCl，26gMgSO₄·7H₂O，76gKH₂PO₄，和50mlCOVE微量元素溶液组成。

COVE微量元素溶液由每升0.04gNa₂B₄O₇·10H₂O，0.4gCuSO₄·5H₂O，1.2gFeSO₄·7H₂O，0.7gMnSO₄·H₂O，0.8gNa₂MoO₂·2H₂O，和10gZnSO₄·7H₂O组成。

MY25培养基由每升25g麦芽糖糊精，2gMgSO₄·7H₂O，10gKH₂PO₄，2g柠檬酸，2gK₂SO₄，2g尿素，10g酵母提取物，和1.5mlAMG微量金属溶液组成，调节至pH6。

AMG微量金属溶液由每升14.3gZnSO₄·7H₂O，2.5gCuSO₄·5H₂O，0.5gNiCl₂·6H₂O，13.8gFeSO₄·7H₂O，8.5gMnSO₄·H₂O，和3g柠檬酸组成.

LB培养基由每升10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，和5gNaCl组成.

2XYT培养基由每升16g胰蛋白胨，10g酵母提取物，和5gNaCl组成。

2XYT板由每升16g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5gNaCl和15gNoble琼脂组成。

SOC培养基由每升20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，2ml5MNaCl，和2.5ml的1MKCl组成。

实施例1：在烟曲霉基因组序列中的木聚糖酶家族10的鉴定

利用来自Aspergilluskawachii的木聚糖酶家族10蛋白质序列(登录号P33559)作为询查序列进行烟曲霉部分基因组序列(TheInstituteforGenomicResearch，Rockville，MD)的tfasty检索(Pearson，W.R.，1999，inBioinformaticsMethodsandProtocols，S.MisenerandS.A.Krawetz，ed.，pp.185-219)。基于在氨基酸水平上与查询序列的高度相似性几个基因被鉴定为推定的GH10家族同源物。鉴定出大约3000bp的三个基因组区，和查询序列在氨基酸水平上具有大于70％的同一性。

实施例2：烟曲霉基因组DNA提取

于37℃和240rpm将烟曲霉生长于挡板摇动烧瓶中的250ml的马铃薯葡萄糖培养基里。通过过滤收集菌丝体，在TE(10mMTris-1mMEDTA)中洗涤两次，并在液氮中冷冻。通过研钵和研杵将冷冻的菌丝体研磨成细粉，将其重悬于含有10mMTris，100mMEDTA，1％TritonX-100，0.5M胍-HCl，和200mMNaCl的pH8.0缓冲液中。加入20mg每升的不含DNA酶的RNA酶A并将裂解于在37℃孵育30分钟。通过离心去除细胞碎片，并利用Maxi500柱(QIAGENInc.，Valencia，CA)分离DNA。所述柱在10ml的QBT中平衡，其用30ml的QC洗涤，并用15ml的QF洗脱(所有缓冲液来自QIAGENInc.，Valencia，CA)。将DNA沉淀在异丙醇中，在70％乙醇中洗涤，并通过离心回收。将DNA重悬于TE缓冲液中。

实施例3：pAlLo1表达载体的构建

通过修饰pBANe6构建表达载体pAlLo1(美国专利号6,461,837)，其包含来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶(NA2-tpi启动子)，黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子序列(AMG终止子)，和构巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)的启动子的杂合体。通过利用Big-Dye^TM终止化学法(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA)进行测序来确证所有诱变步骤。通过首先由定点诱变在来自amdS选择标记的位置2051，2722，和3397上消除三个NcoI限制性位点来进行pBANe6的修饰。设计让所有的改变“沉默”而让amdS基因产物的实际蛋白质序列保持不变。使用下列引物(下划线的核苷酸代表改变的碱基)根据生产商的说明书用GeneEditor^TM体外定点诱变试剂盒(Promega，Madison，WI)同时进行这三个位点的去除：

AMDS3NcoMut(2050)：

5’-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3’(SEQIDNO：7)

AMDS2NcoMut(2721)：

5’-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3’(SEQIDNO：8)

AMDS1NcoMut(3396)：

5’-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3’(SEQIDNO：9)

随后利用QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)将包含所有三种预期序列变化的质粒进行定点诱变，以便在AMG终止子的末端于位置1643上消除NcoI限制性位点。使用下列引物(下划线的核苷酸代表改变的碱基)进行诱变：

诱变AMG终止子序列的上游引物：

5’-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3’(SEQIDNO：10)

诱变AMG终止子序列的下游引物：

5’-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’(SEQIDNO：11)

pBANe6修饰的最后一步是利用QuickChange^TM定点诱变试剂盒在多聚接头的开始处添加新的NcoI限制性位点并利用下列引物(下划线的核苷酸代表改变的碱基)生成pAlLo1(图2)。

诱变NA2-tpi启动子的上游引物：

5’-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3’(SEQIDNO：12)

诱变NA2-tpi启动子的下游引物：

5’-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3’(SEQIDNO：13)

实施例4：pBM120a表达载体的构建

构建质粒pBM120a以获得包含双NA2启动子(NA2-NA2-tpi)的质粒以驱动曲霉菌物种中的基因表达，以及包含氨苄青霉素抗性基因的质粒用于在大肠杆菌中进行选择。

设计引物来从pJaL721(WO03/008575)中PCR扩增所述双NA2启动子。添加限制性酶切位点SalI和NcoI(下划线的)用于将所述启动子克隆入曲霉属表达质粒pAlLo1。

5’GTCGACATGGTGTTTTGATCATTTTA-3’(SEQIDNO：14)

5’CCATGGCCAGTTGTGTATATAGAGGA-3’(SEQIDNO：15)

通过使用ExpandHighFidelityPCRSystem(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)进行PCR来扩增目标片段。PCR扩增反应混合物包含1μl的0.09μgpJaL721，1μl的每种引物(50pmol/μl)，5μl具有15mMMgCl₂的10XPCR缓冲液，1μl的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(10mMeach)，37.25μl的水，和0.75μl(3.5U/μl)的DNA聚合酶混合物。使用EppendorfMastercycler热循环仪以下列设置扩增所述片段：1个循环于94℃2分钟；10个循环于94℃15秒，55℃30秒，72℃1.25分钟；15个循环每个循环于94℃15秒，55℃30秒，72℃1.25分钟每个连续循环加5秒延伸；1个循环于72℃7分钟；和10℃保持。将十微升的这种PCR反应物与1μl的10XDNA加样染料(25％甘油，10mMTrispH7.0，10mMEDTA，0.025％溴酚蓝，0.025％二甲苯腈蓝)混合并利用40mMTris碱-20mM醋酸钠-1mM二钠EDTA(TAE)缓冲液在1.0％(w/v)琼脂糖凝胶上跑电泳。在Nucleotech凝胶成像系统(Nucleotech，SanMateo，CA)上以UV光观察到1128bp的PCR产物。根据生产商的说明书将PCR产物直接连接入pPC2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。用吸液管将1μl体积的新鲜PCR产物，3μl双蒸水，和1μlTOPO克隆载体进行混合并在实验台顶上温育5分钟。

温育后，将2μl混合物用来转化OneShot感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。将2μl体积的连接混合物加入大肠杆菌细胞中并在冰上温育5分钟。随后，将细胞在42℃热激30秒，随后置于冰上2分钟。将250μl体积的SOC培养基加入到这些细胞中并将混合物于37℃和250rpm下温育1小时。温育后将菌落铺在添加了100μg氨苄青霉素每ml的2XYT板上并于37℃过夜孵育进行质粒的选择。用无菌牙签挑取生长在板上的八个菌落并于37℃，250rpm过夜生长在15mlFalcon管中，所述Falcon管包含添加了100μg氨苄青霉素每ml的3mlLB培养基。利用QIAGEN机器人方案分离质粒(QIAGEN，Valencia，CA)。

用EcoRI消化4μl体积的得到的质粒小量制备物。通过如前对于PCR反应所述的琼脂糖凝胶层析和UV分析来分析消化反应。利用1μl质粒模板，1.6ng的M13引物(正向或者反向)(MWGBiotech；HighPoint；NC)，和水至6μl来对包含插入片段的分离的质粒进行测序。利用染料终止化学法以AppliedBiosystemsModel377SequencerXL进行DNA测序。将得到的质粒命名为pBM121b(图3)。

用SalI和NcoI消化5μl体积的pBM121b。通过如上所述的琼脂糖凝胶电泳来分析消化反应物，并将其连接到载体pAlLo1上，所述载体之前已经用SalI和NcoI进行了剪切。将得到的表达质粒命名为pBM120a(图4)。

实施例5：GH10A家族木聚糖酶基因的克隆和米曲霉表达载体的构建

设计下面显示的两种合成性寡核苷酸引物来由在实施例2中制备的基因组DNA中PCR扩增编码GH10A家族木聚糖酶基因的烟曲霉基因。使用InFusionCloneKit(BDBiosciences，PaloAlto，CA)将所述片段直接克隆入表达载体pBM120a中而无需限制性消化和连接。

正向引物：

5′-TACACAACTGGCC-3′(SEQIDNO：16)

反向引物：

5′-AGTCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQIDNO：17)

粗体字母代表编码序列。剩余序列与pBM120a的插入位点同源。

将五十皮摩尔的以上每种引物用于包含100ng的烟曲霉基因组DNA，1XExpandHighFidelity扩增缓冲液(Roche，Indianapolis，IN)，1.5μl10mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物，和2.5单位的ExpandHighFidelity聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)的PCR反应中，最终体积50μl。使用EppendorfMastercycler热循环仪以下列设置扩增所述片段：一个循环于94℃2分钟；和30个循环每个循环于94℃15秒，60℃30秒，和70℃3分钟。热激随后进入10℃保持循环。

利用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离所述反应产物，其中将1.1kb的产物从凝胶中剪切下来并利用QIAquick凝胶抽提试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)根据生产商的说明书进行纯化。

随后利用InfusionCloneKit将所述片段克隆入表达载体pBM120a中。用NcoI和PacI消化所述片段。通过如前所述的琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶纯化来纯化所述片段。在反应中将基因片段和消化的载体连接在一起致成表达质粒pSMO208(图5)，其中GH10A家族木聚糖酶基因的转录是在NA2-NA2-tpi启动子的控制之下。所述连接反应(20μl)由1XInFusion缓冲液(BDBiosciences，PaloAlto，CA)，1XBSA(BDBiosciences，PaloAlto，CA)，1μlInfusion酶(稀释1∶10)(BDBiosciences，PaloAlto，CA)，100ng用NcoI和PacI消化的pBM120a，和100ng烟曲霉木聚糖酶纯化PCR产物组成。将所述反应物于室温温育30分钟。将1μl的反应物用来转化大肠杆菌XL10SolopacGold细胞(Strata基因，LaJolla，CA)。通过限制性消化检测包含pSMO208的大肠杆菌并利用BioRobot9600(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)根据生产商的说明书制备质粒DNA。

实施例6：编码GH10A家族木聚糖酶基因的烟曲霉基因组序列的特征鉴定

以Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自动DNA测序仪(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA)用染料终止化学法(Giesecke等，1992，JournalofVirology方法38：47-60)和引物步移策略进行来自pSMO208的烟曲霉GH10A家族木聚糖酶基因的DNA测序。考查核苷酸序列数据的质量并在PHRED/PHRAP软件(UniversityofWashington，Seattle，WA)的辅助下将所有序列进行相互比较。

pSMO208的序列分析显示来自预测序列的24个碱基对的变化。DNA序列翻译成氨基酸导致8个氨基酸变化，包括在氨基酸位置130上的终止密码子。利用定点诱变去除终止密码子并将另一个氨基酸改变得与木聚糖酶一致序列更加一致。

实施例7：GH10A家族木聚糖酶基因的定点诱变和米曲霉表达载体的构建

为了消除在氨基酸位置130上的终止密码子，设计下面显示的两条合成性寡核苷酸引物来利用QuikChangeIIXL定点诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)PCR扩增包含单一bp变化的烟曲霉GH10A木聚糖酶基因。

5′-CCTCCAGGAACTGGACCGCCACAGAACTC-3′(SEQIDNO：18)

5′-GAGTTCTGTGGCGGTCCAGTTCCTGGAGG-3′(SEQIDNO：19)

将五十皮摩尔的以上每种引物用于包含10ngpSMO208，1XQuikChange扩增缓冲液(Stratagene，LaJolla，CA)，3μlQuikSolutionreagent，1μl10mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物，和2.5单位的ExpandHighFidelity聚合酶的PCR反应中，最终体积50μl。使用EppendorfMastercycler热循环仪以下列设置扩增所述片段：一个循环于95℃2分钟；18个循环每个循环于95℃50秒，60℃50秒，和68℃8分钟；和1个循环于68℃7分钟。热激随后进入10℃保持循环。将DpnI直接加入到扩增反应中并于35℃温育1小时。将2μl体积的DpnI消化的反应物用来转化大肠杆菌XL10GoldUltra感受态细胞。利用BioRobot由大肠杆菌转化子制备质粒DNA。

序列分析证实了去除终止子的单一碱基对变化，形成pSMO209。为了在氨基酸位置169上改变所述氨基酸，如下所示构建两个寡核苷酸。

997144：

5′-GCTATTAATGGGGACGGGACCTTTTCCTCCAGTGTG-3′(SEQIDNO：20)

997145：

5′-CACACTGGAGGAAAAGGTCCCGTCCCCATTAATAGC-3′(SEQIDNO：21)

将五十皮摩尔的以上每种引物用于包含10ngpSMO209，1XQuikChange扩增缓冲液，3μlQuikSolution试剂，1μl10mM的dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物，和2.5单位的ExpandHighFidelityDNA聚合酶的PCR反应中，最终体积50μl。使用EppendorfMastercycler热循环仪以下列设置扩增所述片段：一个循环于95℃2分钟；18个循环每个循环于95℃50秒，60℃50秒，和68℃8分钟；和1个循环于68℃7分钟。热激随后进入10℃保持循环(soakcycle)。将DpnI直接加入到扩增反应中并于35℃温育1小时。将2μl体积的DpnI消化的反应物用来转化大肠相菌XL10GoldUltra感受态细胞。序列分析证实了致成pSMO210的碱基变化(图6)。

将包含质粒pSMO210的大肠相菌SoloPackGold细胞(Stratagene，LaJolla，CA)保藏于AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter，1815UniversityStreet，Peoria，Illinois，61604，保藏号NRRLB-30706，保藏日为2004年2月6日。

实施例8：编码GH10A家族木聚糖酶的烟曲霉基因组序列的特征鉴定

以Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自动DNA测序仪(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA)用染料终止化学法(Giesecke等，同上)和引物步移策略进行来自pSMO210的烟曲霉GH10A家族木聚糖酶基因的DNA测序。考查核苷酸序列数据的质量并在PHRED/PHRAP软件的辅助下将所有序列进行相互比较。

基于和来自Myceliophthorathermophila的同源性木聚糖酶基因(登录号NP000134)的相似性构建pSMO210的烟曲霉GH10A序列的基因模型。核苷酸序列(SEQIDNO：1)和推导的氨基酸序列(SEQIDNO：2)显示于图1A和1B中。所述基因组片段编码364个氨基酸的多肽，中断以一个50bp的内含子。所述基因的％G+C含量为55.8％。利用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10：1-6)，预测了17个残基的信号肽。预测的成熟蛋白质包含347个氨基酸，分子量为40.4kDa。

使用ClustalW方法(Higgins，1989，CABIOS5：151-153)利用LASERGENE^TMMEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以同一性表格和下列多个比对参数来测定木聚糖酶序列的比较性比对：缺口罚分10，缺口长度罚分10。配对间的比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5，对角线＝5。比对显示烟曲霉GH10A家族木聚糖酶的推定氨基酸序列与Myceliophthorathermophila木聚糖酶的推定氨基酸序列(登录号NP000134)共有36％的同一性。

实施例9：GH10B家族木聚糖酶基因的克隆和米曲霉表达载体的构建

设计下面显示的两种合成性寡核苷酸引物来由在实施例2中制备的基因组DNA中PCR扩增编码GH10B家族木聚糖酶基因的烟曲霉基因。使用InFusionCloneKit将所述片段直接克隆入表达载体pBM120a中而无需限制性消化和连接。

正向引物：

5’-ACACAACTGGCC-3’(SEQIDNO：22)

反向引物：

5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQIDNO：23)

粗体字母代表编码序列。剩余序列与pBM120a的插入位点同源。

通过利用ExpandHighFidelityPCRSystem根据生产商的说明书进行PCR来扩增目标片段。每个PCR反应都包含250ng基因组DNA模板，200μMdATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物，1μM正向和反向引物，1X反应缓冲液，和2.6单位的ExpandHighFidelity酶混合物，最终体积50μl。使用EppendorfMastercycler热循环仪以下列设置扩增所述片段：一个循环于94℃2分钟；10个循环每个循环于94℃15秒，60℃30秒，和72℃1.25分钟；15个循环每个循环于94℃15秒，60℃30秒，和72℃1.25分钟于每个连续的循环加5秒延伸；1个循环于72℃7分钟；和10℃保持。

利用50mMTris碱-50mM硼酸-1mM二钠EDTA(TBE)缓冲液在0.7％琼脂糖凝胶中分离反应产物并将1.4kb的产物条带从凝胶中剪切下来并利用QIAquick凝胶抽提试剂盒根据生产商的说明书进行纯化。

随后利用InfusionCloneKit将所述片段克隆入表达载体pBM120a中。用NcoI和PacI消化所述片段。通过如前所述的琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶纯化来纯化消化的载体和PCR片段。在反应中将基因片段和消化的载体连接在一起致成表达质粒pJLin162(图8)，其中GH10B家族木聚糖酶基因的转录是在NA2-NA2-tpi启动子的控制之下。所述连接反应(50μl)由1XInFusion缓冲液，1XBSA，1μlInfusion酶(稀释1∶10)，100ng用NcoI和PacI消化的pBM120a，和50ng烟曲霉木聚糖酶纯化PCR产物组成。将所述反应物于室温温育30分钟。将2μl的反应物用来转化大肠杆菌SolopacGold超感受态细胞(Stratagene，LaJolla，CA)。通过限制性消化检测包含pJLin162质粒的大肠杆菌并利用BioRobot9600制备质粒DNA。

将包含质粒pJLin162的大肠杆菌SoloPackGold细胞保藏于AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter，1815UniversityStreet，Peoria，Illinois，61604，保藏号NRRLB-30702，保藏日2004年1月27日。

实施例10：编码GH10B家族木聚糖酶的烟曲霉基因组序列的特征鉴定

以Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自动DNA测序仪用染料终止化学法(Giesecke等，同上)和引物步移策略进行来自pJLin162的烟曲霉GH10B木聚糖酶基因的DNA测序。考查核苷酸序列数据的质量并在PHRED/PHRAP软件的辅助下将所有序列进行相互比较。

基于tfasty输出和与米曲霉xynF1(登录号AB011212)的比对构建所述序列的基因模型。利用MAFFT方法以反复改进和默认参数(Katoh等，2002，NucleicAcidsResearch30：3059)确定氨基酸序列的比较性比对。核苷酸序列(SEQIDNO：3)和推导的氨基酸序列(SEQIDNO：4)显示于图7A和7B中。所述基因组片段编码323个氨基酸的多肽，中断以57，51，56，52，55，58，49和52bp的八个内含子。所述基因的％G+C含量为55.5％。利用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，同上)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白质包含304个氨基酸，分子量为33kDa。

使用ClustalW方法(Higgins，1989，同上)利用LASERGENE^TMMEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以同一性表格和下列多个比对参数来测定木聚糖酶序列的比较性比对：缺口罚分10，缺口长度罚分10。配对间的比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5，对角线＝5。比对显示烟曲霉GH10B木聚糖酶的推定氨基酸序列与米曲霉木聚糖酶xynF1的推定氨基酸序列(登录号AB011212)共有74％的同一性。

实施例11：烟曲霉GH10B家族木聚糖酶基因在米曲霉BECh2中的表达

根据Christensen等，1988，Bio/Technology6：1419-1422的方法制备米曲霉BECh2原生质体。将2μgpJLin162，其用PmeI消化以去除氨苄青霉素抗性基因，用来转化米曲霉BECh2。

用pJLin162转化米曲霉BECh2产生大约300个转化子。将42个转化子转移到单独的COVE板上。将米曲霉BECh2转化子以及亲本菌株(作为阴性对照)的栓塞转移到包含0.1％AZCL-阿拉伯糖木聚糖底物(Megazyme，Ireland)的最小培养基板(调节到pH5)上。42个转化子全部都在栓塞周围形成蓝色区，表明木聚糖酶活性的表达。随后将42个转化子的孢子划线到新的COVE板上，随后于第二天挑取单个菌落。对于每个转化子挑取两个单个菌落。将孢子纯化的克隆在AZCL-阿拉伯糖木聚糖平板上再次进行测试，如上所述对每个转化子的木聚糖酶阳性克隆进行第二次孢子纯化。

将42个转化子中的34个的孢子收集在4ml的0.01％Tween20并且将200μl的孢子悬浮液单独接种到125ml塑料摇瓶中的25mlMY25培养基里并于34℃，250rpm孵育。在孵育后的三、四和五天，除去培养上清液并测定木聚糖酶活性。

如下所述对如上所述制备的培养上清液测定木聚糖酶活性。简言之，对于每个反应在0.02％TritonX-100中将135μl的测定缓冲液(400mM磷酸钠pH6缓冲液)混合以135μl的0.4％AZCL-阿拉伯糖木聚糖(在0.01％TritonX-100和200mM磷酸钠缓冲液中底物最终浓度为0.2％底物)。随后加入30μl的稀释上清液样品。将稀释的Shearzyme500L，一种来自Aspergillusaculeatus的纯化木聚糖酶(获自NovozymesA/S，Denmark)，以600FXU(真菌木聚糖酶单位)每ml用作标准。在EppendorfThermomixer(BrinkmannInstruments，NY)中于高速(1400rpm)37℃混合15分钟后，将样品置于冰上2分钟，随后于1510xg离心2分钟。离心后，于650nm测量150μl的上清液样品。通过相对于由Shearzyme500L生成的标准曲线测绘A₆₅₀值测定转化子的木聚糖酶活性。发现所有的转化子都表达木聚糖酶活性。0.5μl上清液的SDS-PAGE(BioRadCriterion10-20％SDS-PAGE)分析显示在大约30kDa有主带。

实施例12：GH10C家族木聚糖酶基因的克隆和米曲霉表达载体的构建

设计下面显示的两种合成性寡核苷酸引物来由在实施例2中制备的基因组DNA中PCR扩增编码GH10C家族木聚糖酶基因的烟曲霉基因。使用载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)来扩增所述基因PCR产物。通过用NcoI和PacI消化释放出基因片段并随后利用RapidDNALigationKit(BoehringerMannheim，Germany)连接到表达载体pBM120a上致成表达质粒pHyGe001。

正向引物：

5’-CC-3’(SEQIDNO：24)

反向引物：

5’-TTAATTAA-3’(SEQIDNO：25)

粗体字母代表编码序列。剩余序列添加来作为插入位点。

将五十皮摩尔的以上每种引物用于包含100ng烟曲霉基因组DNA，1XExpandHighFidelity扩增缓冲液，1.5μl的10mMdATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物，以及2.5单位的ExpandHighFidelity聚合物的PCR反应中，最终体积为50μl。使用EppendorfMastercycler热循环仪以下列设置扩增所述片段：一个循环于94℃2分钟；10个循环每个循环于94℃15秒，56.8℃30秒，和72℃1分钟和15秒；15个循环每个循环于94℃15秒，60℃30秒，和72℃1分钟于每个连续的循环加5秒延伸；和1个循环于72℃7分钟。热激后进行10℃保持循环。

利用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离反应产物，其中从凝胶中将1.4kb的产物条带剪切下来并使用QIAquick凝胶抽提试剂盒根据生产商的说明书进行纯化。

随后将所述片段克隆入表达载体pCR2.1-TOPO载体中。通过PCRCleanUpKit(QIAGEN，Valencia，CA)纯化基因片段。通过利用生产商指定的条件连接所述片段和pCR2.1-TOPO载体致成质粒pHyGe009(图10)。将2μl的反应物用来转化大肠杆菌OneShot感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。通过限制性消化来检测包含质粒pHyGe009的大肠杆菌转化子并利用BioRobot9600制备质粒DNA。

将来自pHyGe009的基因片段克隆入pBM120a表达载体中。通过用NcoI和PacI消化将基因片段从pHyGe009中释放出来并如前所述通过凝胶电泳和QIAquick凝胶纯化进行纯化。用NcoI和PacI消化pBM120a载体。利用RapidDNALigationKit将基因片段和消化的载体连接在一起致成表达质粒pHyGe001(图11)，其中GH10C家族木聚糖酶基因的转录在NA2-NA2-tpi启动子的控制之下。将5μl的反应用来转化大肠杆菌XL1-BlueSubcloning-Grade感受态细胞(Stratagene，LaJolla，CA)。通过限制性消化来检测包含pHyGe001质粒的大肠杆菌转化子并利用BioRobot9600制备质粒DNA。

将包含质粒pHyGe001的大肠杆菌TOP10保藏于AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter，1815UniversityStreet，Peoria，Illinois，61604，保藏号NRRLB-30703，保藏日2004年1月28日。

实施例13：编码GH10C家族木聚糖酶的烟曲霉基因组序列的特征鉴定

以Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自动DNA测序仪用染料终止化学法(Giesecke等，同上)和引物步移策略进行来自pHyGe009的烟曲霉GH10C木聚糖酶基因的DNA测序。考查核苷酸序列数据的质量并在PHRED/PHRAP软件的辅助下将所有序列进行相互比较。

基于tfasty输出和与Aspergillusaculeatus木聚糖酶(登录号P48825)的比对构建所述序列的基因模型。利用MAFFT方法以反复改进和默认参数(Katoh等，2002，同上)确定氨基酸序列的比较性比对。核苷酸序列(SEQIDNO：5)和推导的氨基酸序列(SEQIDNO：6)显示于图9A和9B中。所述基因组片段编码397个氨基酸的多肽，中断以49，65，48，和59的4个内含子。所述基因的％G+C含量为53％。利用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，同上)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白质包含378个氨基酸，分子量为40kDa。利用InterProScan软件(Zdobnov，E.M.andApweiler，R.，2001，InterProScan-anintegrationplatformforthesignature-recognition方法inInterPro，Bioinformatics17(9)：p.847-8)鉴定了纤维素结合结构域，其包含108bp，从核苷酸1305到核苷酸1412，编码36个氨基酸，推定的氨基酸序列为VAQKWGQCGGIGWTGPTTCVSGTTCQKLNDWYSQCL(SEQIDNO：6的氨基酸362-397)。

使用ClustalW方法(Higgins，1989，同上)利用LASERGENE^TMMEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以同一性表格和下列多个比对参数来测定木聚糖酶序列的比较性比对：缺口罚分10，缺口长度罚分10。配对间的比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5，对角线＝5。比对显示烟曲霉GH10C木聚糖酶基因的推定氨基酸序列与Aspergillusaculeatus木聚糖酶(登录号P48825)的推定氨基酸序列(登录号AB011212)共有67.8％的同一性。

实施例14：烟曲霉GH10C家族木聚糖酶基因在米曲霉BECh2中的表达

根据Christensen等，1988，同上的方法制备米曲霉BECh2原生质体。将3.9μg量的pHyGe001，其用PmeI消化以去除氨苄青霉素抗性基因，用来转化米曲霉BECh2。

用pHyGe001转化米曲霉BECh2产生大约49个转化子。将49个转化子转移到单独的COVE板上。将米曲霉BECh2转化子以及亲本菌株(作为阴性对照)的栓塞转移到包含0.1％AZCL-阿拉伯糖木聚糖底物(Megazyme，Ireland)的最小培养基板(调节到pH5)上。41个转化子在栓塞周围形成蓝色区，表明木聚糖酶活性的表达。随后将41个转化子的孢子划线到新的COVE板上，随后于第二天挑取单个菌落。对于每个转化子挑取两个单个菌落。将孢子纯化的克隆在AZCL-阿拉伯糖木聚糖平板上再次进行测试，如上所述对每个转化子的一个木聚糖酶阳性克隆进行第二次孢子纯化。

将41个转化子的孢子贮存液收集在5ml的0.01％Tween20中并且将200μl的孢子悬浮液单独接种到125ml塑料摇瓶中的25mlMY25培养基里并于34℃，250rpm孵育。在孵育后的三、四和五天，除去培养上清液并测定木聚糖酶活性。

如实施例11中所述对如上所述制备的培养上清液进行木聚糖酶测定。测定结果显示所有的转化子都表达木聚糖酶活性。10μl上清液的SDS-PAGE(BioRadCriterion10-20％SDS-PAGE)分析显示在大约50kDa有主带。

生物学材料的保藏

下列生物学材料已经在布达佩斯条约的条款下保藏于AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter，1815UniversityStreet，Peoria，Illinois，61604，并给出下列保藏编号：

保藏物保藏号保藏日期

大肠杆菌(pSMO210)NRRLB-307062004-02-06

大肠杆菌(pJLin162)NRRLB-307022003-01-27

大肠杆菌TOP10(pHyGe009)NRRLB-307032003-01-28

该菌株已经在如下条件下进行保藏，即根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C§122，确保在本专利申请的审查过程中由授权的专利与商标官员所指定的人员能够获得该培养物。所述保藏物是所述保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交本申请副本或其后代的国家中，根据外国专利法的要求可以提供上述保藏物。但是，应该理解的是可以获得保藏物并不构成这样的许可，即实施本发明侵害了由政府授予的专利权。

本文描述并要求的发明并不限于本文所公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案意图在于举例说明本发明的几个方面。任何等同的实施方案意图包括在本发明的范围内。当然，根据上文描述，除本文所显示和描述的之外，对本发明的各种修改对本领域技术人员而言应是显而易见的。这些修改也应包括在所附权利要求的范围内。一旦出现冲突，将以包括定义在内的本公开为准。

本文引用了各种参考文献，将其内容全部并入作为参考。

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

Claims (22)

1.分离的具有木聚糖酶活性的多肽，其选自：

由氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列为SEQIDNO:4，SEQIDNO:4的氨基酸20-323，SEQIDNO:6或SEQIDNO:6的氨基酸20-397。

2.权利要求1的多肽，其由SEQIDNO:4组成。

3.权利要求1的多肽，其由SEQIDNO:4的氨基酸20-323组成。

4.权利要求1的多肽，其由SEQIDNO:6组成。

5.权利要求1的多肽，其由SEQIDNO:6的氨基酸20-397组成。

6.权利要求1的多肽，其由包含在大肠杆菌NRRLB-30702中的质粒pJLin162，或者包含在大肠杆菌NRRLB-30703中的质粒pHyGe009所含有的多核苷酸编码。

7.分离的多核苷酸，其由编码权利要求1-6任一项的多肽的核苷酸序列组成。

8.权利要求7的分离的多核苷酸，在SEQIDNO:3,或5的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中突变核苷酸序列分别编码由SEQIDNO:4的氨基酸20-323，或者SEQIDNO:6的氨基酸20-397组成的多肽。

9.包含权利要求7的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连接到一种或多种指导多肽在表达宿主中的生产的控制序列上。

10.重组表达载体，其包含权利要求9的核酸构建体。

11.重组宿主细胞，其包含权利要求9的核酸构建体。

12.生产权利要求1-6任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于生产所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞的野生型形式可生产所述多肽；和(b)回收所述多肽。

13.生产权利要求1-6任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于生产所述多肽的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

14.生产亲本细胞的突变体的方法，其包括破坏或删除编码权利要求1-6任一项的多肽的核苷酸序列，这导致所述突变体比亲本细胞生产更少的所述多肽。

15.生产具有突变核苷酸序列的多核苷酸的方法，其包括：(a)将至少一个突变导入SEQIDNO:3,或5的成熟多肽编码序列中，其中突变核苷酸序列分别编码由SEQIDNO:4的氨基酸20-323，或者SEQIDNO:6的氨基酸20-397组成的多肽；和(b)回收包含突变核苷酸序列的多核苷酸。

16.通过权利要求15的方法生产的突变多核苷酸。

17.生产多肽的方法，其包括(a)在有益于生产所述多肽的条件下培养包含权利要求16的突变多核苷酸的细胞；和(b)回收所述多肽。

18.核酸构建体，其包含编码蛋白质的基因，所述基因可操作性地连接到由编码下述核苷酸组成的信号肽的核苷酸序列上，SEQIDNO:3的核苷酸1-57，或者SEQIDNO:5的核苷酸1-106或其cDNA，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。

19.重组表达载体，其包含权利要求18的核酸构建体。

20.重组宿主细胞，其包含权利要求18的核酸构建体。

21.生产蛋白质的方法，其包括(a)在有益于生产所述蛋白质的条件下培养权利要求20的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

22.生产权利要求1-6任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于生产所述多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码具有木聚糖酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。