CN103429749B

CN103429749B - 用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法

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Publication number: CN103429749B
Application number: CN201180067303.XA
Authority: CN
Inventors: 黄鸿志; 王云; 陈晔; 徐丰; 任海彧
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Cofco Corp; Novo Nordisk AS
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Cofco Corp; Novo Nordisk AS
Priority date: 2010-12-10
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2016-12-14
Anticipated expiration: 2031-12-09
Also published as: CN103429749A

Abstract

本发明涉及用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，其包括将经酸预处理的含木素纤维素材料和经碱预处理的含木素纤维素材料混合，水解和发酵；涉及用于将含木素纤维素材料降解或转化为包含单糖和寡糖的水解物的方法，其包括将经酸预处理的含木素纤维素材料和经碱预处理的含木素纤维素材料混合，和水解；涉及用于处理含木素纤维素材料的方法，其包括将经酸预处理的含木素纤维素材料和经碱预处理的含木素纤维素材料混合。本发明进一步涉及根据本发明用于产生发酵产物的方法制备的发酵产物。

Description

用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法

技术领域

公开了用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法。

发明背景

含木素纤维素材料，或生物质，可用于产生可发酵的糖，所述糖接着可用于产生发酵产物如可再生的燃料和化学品。含木素纤维素材料是纤维素纤维包裹于木质素和半纤维素鞘中的复合结构。从含木素纤维素材料产生发酵产物包括预处理、水解和发酵含木素纤维素材料。

木素纤维素的结构并不直接易受(accessible)酶水解。因此，预处理所述含木素纤维素材料以打断木质素封闭(seal)并破坏纤维素的晶体结构，这可导致半纤维素级分的溶解和糖化。然后可通过酶法例如通过纤维素分解酶来水解纤维素级分，其中纤维素分解酶将糖聚合物降解为可发酵的糖。然后通过发酵生物将这些可发酵的糖转化为所需的发酵产物，所述产物可任选地通过例如蒸馏来回收。

从含木素纤维素材料产生发酵产物目前非常昂贵。因此，存在对于提供其它的从含木素纤维素材料产生发酵产物的工艺的需要。

发明内容

本发明涉及用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，其包括将经酸预处理的含木素纤维素材料和经碱预处理的含木素纤维素材料混合，水解(糖化)和发酵；涉及用于将含木素纤维素材料降解或转化为包含单糖和寡糖的水解物的方法，其包括将经酸预处理的含木素纤维素材料和经碱预处理的含木素纤维素材料混合，和水解；涉及用于处理含木素纤维素材料的方法，其包括将经酸预处理的含木素纤维素材料和经碱预处理的含木素纤维素材料混合。本发明进一步涉及根据本发明用于产生发酵产物的方法制备的发酵产物。

在一个方面，本发明涉及用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，其包括：

(a)用酸性试剂预处理含木素纤维素材料以获得经酸预处理的含木素纤维素材料，和用碱性试剂预处理含木素纤维素材料以获得经碱预处理的含木素纤维素材料；

(b)将经酸预处理的含木素纤维素材料与经碱预处理的含木素纤维素材料混合；

(c)用酶组合物水解混合的含木素纤维素材料；和

(d)添加发酵生物以产生发酵产物。

在一个方面，本发明涉及用于将含木素纤维素材料降解或转化为包含单糖和寡糖的水解物的方法，其包括：

(b)将经酸预处理的含木素纤维素材料与经碱预处理的含木素纤维素材料混合；和

(c)对混合的含木素纤维素材料进行至少部分水解以获得包含单糖和/或寡糖的水解物。

在一个方面，本发明涉及用于处理含木素纤维素材料的方法，其包括：

(a)用酸性试剂预处理含木素纤维素材料以获得经酸预处理的含木素纤维素材料，和用碱性试剂预处理含木素纤维素材料以获得经碱预处理的含木素纤维素材料；和

(b)将经酸预处理的含木素纤维素材料与经碱预处理的含木素纤维素材料混合。

在一个方面，本发明涉及根据本发明用于产生发酵产物的方法制备的发酵产物。

在用酸性预处理的常规方法中，在水解之前添加碱性试剂如氢氧化钠以中和经酸预处理的含木素纤维素材料；且在用碱性预处理的常规方法中，在水解之前添加酸如硫酸以中和经碱预处理的含木素纤维素材料。但是在本发明中，通过将经酸预处理的含木素纤维素材料和经碱预处理的含木素纤维素材料混合，在水解之前无需向经酸预处理的含木素纤维素材料和/或经碱预处理的含木素纤维素材料添加其它化学品。

通过本发明的方法，改善了水解和/或发酵。混合的经预处理的含木素纤维素材料的葡萄糖转化相当于经酸预处理的含木素纤维素材料，并远好于经碱预处理的含木素纤维素材料。混合的经预处理的含木素纤维素材料的木糖转化在所有经测试的经预处理的含木素纤维素材料中是最佳的。混合的经预处理的含木素纤维素材料的最终乙醇产率亦好于经酸预处理的含木素纤维素材料。混合的经预处理的含木素纤维素材料的葡萄糖转化甚至好于经NREL预处理的含木素纤维素材料和在最佳条件下通过酸预处理的含木素纤维素材料。不拘于任何具体理论，但认为在混合的经预处理的含木素纤维素材料中，与在经酸预处理的含木素纤维素材料或经碱预处理的含木素纤维素材料中相比，减少了通过预处理和中和产生的副产物例如硫酸盐的含量。

通过本发明的方法，可节省处理废水的成本。在常规方法中，在所述酸预处理或碱预处理之后使用洗涤(例如通过水)调整pH或减少水解和/或发酵的抑制剂。因为产生了大量废水，所以存在处理废水的需要。但在本发明的一个优选方法中，通过将经酸预处理的含木素纤维素材料和经碱预处理的含木素纤维素材料混合，无需洗涤经预处理的含木素纤维素材料。

定义

纤维素分解酶或纤维素酶

术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selectionstrategies,2006,Biotechnology Advances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities,Pure Appl.Chem.59:257-68)确立的。

就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素在50℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。典型条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠pH5，1mM MnSO₄，50℃，72小时，通过HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。

内切葡聚糖酶

术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40℃，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。

纤维二糖水解酶

术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulosedegradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trends inBiotechnology15:160-167;Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本发明而言，根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279;van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters,149:152-156;van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters,187:283-288;以及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，可采用Lever等的方法来评价玉米秸秆中的纤维素水解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可用于确定对荧光性二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-lactoside)的纤维二糖水解酶活性。

β-葡糖苷酶

术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶活性是根据由Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties,J.Basic Microbiol.42:55-66所述的基本步骤确定的。一单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃，pH4.8从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷在含有0.01%20的50mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。

具有纤维素分解增强活性的多肽

术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶水解纤维素材料的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料所导致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中的纤维素，其中总蛋白包含50-99.5%w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在50℃历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3%的米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白重量的2-3%的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(Novozymes A/S,Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解程度所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，并且最优选至少20倍。

家族61糖苷水解酶

术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据HenrissatB.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。

半纤维素分解酶或半纤维素酶

术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom,D.和Shoham,Y.Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology,2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附接于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指定为以数字标记的GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和最新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752测量。

木聚糖降解活性或木聚糖分解酶

术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如，内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recent progress in the assaysof xylanolytic enzymes,2006,Journal of the Science of Food and Agriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novelcarbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune,FEBS Letters580(19):4597-4601；Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely,和Kubicek,,1997,The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctionalbeta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal321:375-381。

总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity,Journal ofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37℃在0.01%X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH6中确定。一单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6从200mM磷酸钠pH6缓冲液中作为底物的0.2%AZCL阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的天青精。

就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述典型条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白/g底物，50mM乙酸钠pH5，50℃，24小时，如Lever,1972,A new reaction forcolorimetric determination of carbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。

木聚糖酶

术语“木聚糖酶”意指催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解的1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)。就本发明而言，木聚糖酶活性是以0.01%X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH6中0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37℃确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6从200mM磷酸钠pH6缓冲液中作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的天青精(azurine)。

β-木糖苷酶

术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xyloside xylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH5从含有0.01%20的100mM柠檬酸钠中作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。

乙酰木聚糖酯酶

术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物，在含有0.01%TWEEN^TM20的50mM乙酸钠pH5.0中确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。

阿魏酸酯酶

术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酸酯酶(hydroxycinnamoyl esterase)、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶是使用0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物在50mM乙酸钠pH5.0中确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25℃每分钟释放出1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。

α-葡糖醛酸糖苷酶

术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5，40℃每分钟释放出1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶

术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。

发明详述

(c)用酶组合物水解混合的含木素纤维素材料；和

(d)添加发酵生物以产生发酵产物。

含木素纤维素材料

术语“木素纤维素”或“含木素纤维素材料”或“木素纤维素材料”或“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cellwall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，见于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键键合，其帮助稳定细胞壁基质。

纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可为，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.;Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16;Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology24/25:695-719;Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。

在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。

在另一个方面，纤维素材料是芦竹。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属(miscanthus)。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。

在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是枞树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。

在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。

在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergent plant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。

纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。

在一个优选实施方案中，所述含木素纤维素材料选自玉米秸秆、玉米穗轴、玉米纤维、柳枝稷、麦秆、稻秆、甘蔗渣和藻类，及其组合。

玉米秸秆对于高级生物乙醇产生是主要的木素纤维素材料之一。在一个优选实施方案中，将玉米秸秆用作生物质。

不同级分的玉米秸秆包含细胞类型的不同排列。其化学和物理结构暗示所需的预处理方法对于不同级分可具有显著差异。在一个优选实施方案中，用酸性试剂预处理直立至地面上超过三英尺的玉米秸秆；和/或用碱性试剂预处理直立至地面上1-3英尺的玉米秸秆。

预处理。与本发明的方法组合，可使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等,2007,Substrate pretreatment:The keyto effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93;Galbe和Zacchi,2007,Pretreatment of lignocellulosicmaterials for efficient bioethanol production,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65;Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatments to enhance the digestibility oflignocellulosic biomass,Bioresource Technol.100:10-18;Mosier等,2005,Featuresof promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass,BioresourceTechnol.96:673-686;Taherzadeh和Karimi,2008,Pretreatment of lignocellulosicwastes to improve ethanol and biogas production:A review,Int.J.of Mol.Sci.9:1621-1651;Yang和Wyman,2008,Pretreatment:the key to unlocking low-costcellulosic ethanol,Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.2:26-40)。

纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调节/调理(conditioning)。

常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧、离子性液体和γ辐射预处理。

可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可接触纤维素和其它级分，例如，半纤维素。将纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-250℃，例如160-200℃，或170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-60分钟，例如1-30分钟，1-20分钟，3-12分钟，或4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆炸放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,Bioresource Technology855:1-33;Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成为单糖和寡糖。去除木质素仅至有限的程度。

化学预处理：术语“化学处理”指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。此种预处理可将晶体纤维素转化为无定形纤维素。合适的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体和有机溶剂预处理。

经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至5%w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523;Sassner等.,2006,Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,见上文;Schell等,2004,Bioresource Technol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。

还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。

用氧化钙或氢氧化钙，在85-150℃的温度进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966;Mosier等,2005,Bioresource Technol.96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900和WO2006/110901公开了使用氨的预处理方法。

湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151;Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574;Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理优选以1-40%干物质，例如2-30%干物质，或5-20%干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。

湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30%的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO2006/032282)。

氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-150℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60%(Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141;Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-糖复合物受切割。

机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”指任何促进颗粒大小减少的预处理。举例而言，此种预处理可涉及各种类型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。

纤维素材料可经物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可与下述结合：汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波辐射)，或其组合。在一个方面，高压指优选约100至400psi，例如约150至约250psi的范围的压力。在另一个方面，高温指约100至300℃，例如约140至约200℃范围的温度。在一个优选的方面，机械或物理预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、使用蒸汽枪水解器系统，例如来自Sunds Defibrator AB,Sweden的Sunds Hydrolyzer中进行。所述物理和化学预处理可视需要顺序进行或同时进行。

因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行物理(机械)或化学预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatmentof biomass,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh和Singh,1993,Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion oflignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosic biomass:a review,于Enzymatic Conversion ofBiomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编,ACS Symposium Series566,American Chemical Society,Washington,DC,第15章;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production fromrenewable resources,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241;Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331;和Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。

依照本发明，预处理所述含木素纤维素材料，即用酸性试剂预处理所述含木素纤维素材料以获得经酸处理的含木素纤维素材料，和用碱性试剂预处理所述含木素纤维素材料以获得经碱处理的含木素纤维素材料。

本发明中使用的用酸性试剂对含木素纤维素材料的预处理可为任何本领域中已知的酸预处理。

在本发明的一个优选实施方案中，用酸性试剂对含木素纤维素材料的预处理包括用酸性试剂浸泡所述含木素纤维素材料。

在本发明的一个优选实施方案中，用酸性试剂对含木素纤维素材料的预处理包括用酸性试剂浸泡所述含木素纤维素材料和对所述含木素纤维素材料进行蒸汽爆炸。

在本发明的一个优选实施方案中，所述酸预处理使用氢氯酸、磷酸、硫酸、亚硫酸、碳酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、琥珀酸和/或可转化为酸的化学品如氯化氢、磷酸酐、二氧化硫、二氧化碳；或其混合物进行。在本发明的一个更优选实施方案中，所述酸为硫酸。

在本发明的一个优选实施方案中，水溶液中酸性试剂的浓度为0.05-10%(w/w)，优选0.1-5%(w/w)，更优选0.3-2.5%(w/w)。

可将酸与生物质和混合物接触数分钟至数秒范围的时间。在本发明的一个优选实施方案中，酸预处理进行1分钟至300分钟，优选30分钟至250分钟，更优选60分钟至150分钟的时间。

可将酸与生物质和化合物在本领域中已知的温度相接触。在本发明的一个优选实施方案中，酸预处理在130℃至270℃，优选150℃至230℃，更优选160℃至200℃的温度进行。

优选地，所述酸预处理是用有机和/或无机酸进行的连续的稀酸或弱酸处理。弱酸处理意指处理pH处于约pH1至5，优选约pH1至3的范围。尽管如此，甚至这种弱酸预处理仍在对于水解和/或发酵不具吸引力的相对较低pH进行。通常的纤维素分解和半纤维素分解酶和/或通常发酵生物的活性在该pH范围较低。因此，为了取得有效的酶水解和/或发酵，升高pH是必需的。一种升高pH的方法是通过在酶水解和/或发酵之前洗涤经酸预处理的生物质。然而，这导致大量水的使用。作为昂贵的额外工艺步骤，洗涤在产业规模是不合算且不可持续的。另一种升高经预处理的材料的pH的方式是通过用碱如氢氧化钠(NaOH)中和酸。但这导致低价值的盐作为副产物形成。本发明的方法完善地解决了在用酸性试剂进行预处理之后木素纤维素的低pH值的问题。

在本发明中使用的用碱性试剂对含木素纤维素材料进行的预处理可为任何本领域中已知的碱性预处理。

在本发明的一个优选实施方案中，用碱性试剂对含木素纤维素材料的预处理包括用碱性试剂浸泡所述含木素纤维素材料。

在本发明的一个优选实施方案中，所述碱性试剂选自下组：氢氧化钙(Ca(OH)₂)，氧化钙(CaO)，氨(NH₃)，氢氧化钠(NaOH)，碳酸钠(NaCO₃)，氢氧化钾(KOH)，尿素，和/或其组合。

在本发明的一个优选实施方案中，水溶液特别是硫酸中碱性试剂的浓度是0.1-50%(w/w)，优选0.5-40%(w/w)，更优选5-25%(w/w)。

在本发明的一个优选实施方案中，对于用碱性试剂的预处理，含木素纤维素材料的总固体为1-80%(w/w)，优选5-50%(w/w)，更优选8-30%(w/w)。

可将碱性试剂与生物质和混合物接触数分钟至数秒范围的时间。在一个优选实施方案中，用碱性试剂对含木素纤维素材料进行的预处理进行1分钟至300分钟，优选30分钟至250分钟，更优选60分钟至150分钟的时间。

优选地，所述碱性预处理是在温和温度进行的碱性预处理，例如，在50℃至120℃，优选约70℃至约100℃。

优选地，所述碱预处理的pH处于约pH8.0至14.0，优选约pH10.0至12.0的范围。尽管如此，在相对较高pH进行的碱预处理对于水解和/或发酵不具吸引力。通常的纤维素分解和半纤维素分解酶和/或通常发酵生物的活性在该pH范围较低。因此，为了取得有效的酶水解和/或发酵，降低pH是必需的。一种降低pH的方法是通过在酶水解之前洗涤经预处理的生物质。然而，这导致大量水的使用。作为昂贵的额外工艺步骤，洗涤在产业规模是不合算且不可持续的。另一种降低经预处理的材料的pH的方式是通过用酸如硫酸和乙酸，或用CO₂中和碱。但这导致低价值的盐作为副产物形成。本发明的方法完善地解决了在用碱性试剂进行预处理之后木素纤维素的高pH值的问题。

或者，或与本发明的优选实施方案组合，在进一步的一些实施方案中，将酸预处理和/或碱预处理在其它化学预处理、机械预处理和/或生物预处理之前进行，之后进行，与其它化学预处理、机械预处理和/或生物预处理组合，和/或整合。

在一个优选实施方案中，对生物质进行化学和机械预处理两者。所述化学和机械预处理可视需要顺序或同时进行。在本发明的一个优选实施方案中，用酸性试剂对含木素纤维素材料的预处理包括用酸性试剂浸泡所述含木素纤维素材料和对所述含木素纤维素材料进行蒸汽爆炸。

在本发明的一个优选实施方案中，用碱性试剂对含木素纤维素材料的预处理包括用酸性或碱性试剂在约50℃至约150℃，优选约70℃至约120℃的范围的温度下浸泡所述含木素纤维素材料。

根据本发明，所述纤维素材料可在水解之前或过程中预处理。优选地，预处理在水解之前进行。在此情况下，预处理有时称为预水解。或者，预处理可与水解同时进行，如添加一种或多种纤维素分解酶或其它酶活性同时进行，以释放例如可发酵的糖如葡萄糖或麦芽糖。

混合

在本发明的方法中，在酸预处理和碱预处理之后，将经酸预处理的含木素纤维素材料与经碱预处理的含木素纤维素材料混合。在一个优选实施方案中，将混合的含木素纤维素材料调整至pH3-8，优选pH4-6，特别是pH5左右。

预料不到的是通过将经酸预处理的含木素纤维素材料与经碱预处理的含木素纤维素材料混合，水解和/或发酵与对于经酸预处理的含木素纤维素材料或经碱预处理的含木素纤维素材料相比得到改善。混合的经预处理的含木素纤维素材料的葡萄糖转化相当于经酸预处理的含木素纤维素材料，并远好于经碱预处理的含木素纤维素材料。混合的经预处理的含木素纤维素材料的木糖转化在所有经测试的经预处理的含木素纤维素材料中是最佳的。混合的经预处理的含木素纤维素材料的最终乙醇产率亦好于经酸预处理的含木素纤维素材料。混合的经预处理的含木素纤维素材料的葡萄糖转化甚至好于经NREL预处理的含木素纤维素材料和在最佳条件下用酸预处理的含木素纤维素材料。不拘于任何具体理论，但认为在混合的经预处理的含木素纤维素材料中，与在经酸预处理的含木素纤维素材料或经碱预处理的含木素纤维素材料中相比，减少了通过预处理和中和产生的副产物的含量，从而改善了水解和/或发酵。

通过将经酸预处理的含木素纤维素材料与经碱预处理的含木素纤维素材料混合，无需添加大量化学品包括碱和酸，以供在水解之前进行pH中和，并因此可节省所述化学品。在用酸预处理的常规方法中，添加碱如氢氧化钠以中和经酸预处理的含木素纤维素材料；而在用碱预处理的常规方法中，添加酸如硫酸以中和经碱预处理的含木素纤维素材料。

在本发明的一个优选实施方案中，可洗涤经预处理的生物质。然而，洗涤并不是必需要求的。在一个优选实施方案中，不洗涤经预处理的生物质。通过将经酸预处理的含木素纤维素材料与经碱预处理的含木素纤维素材料混合，无需处理废水，并因此节省了处理废水的成本。在常规方法中，洗涤，如通过水的洗涤，在酸预处理或碱预处理之后用于调整pH和/或减少对于水解和/或发酵的抑制剂。洗涤在产业规模是不合算且不可持续的。

水解(糖化)。

在水解(也称作糖化)步骤中，将(例如经预处理的)纤维素材料水解以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶组合物以酶法在本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽存在下进行。组合物的酶可以同时或顺序加入。

酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的水性环境中进行。在一个方面，水解在适于酶组分的活性，即对于酶组分最佳的条件下进行。水解可以以补料批式或连续的过程进行，其中将纤维素材料逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。

糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约120小时，例如约16至约72小时，或约24至约48小时。温度优选约25℃至约70℃，例如约30℃至约65℃，约40℃至约60℃，或约50℃至55℃的范围。pH优选约3至约8，例如约3.5至约7，约4至约6，或约pH5.0至约pH5.5的范围。干燥固体含量优选约5至约50wt%，例如约10至约40wt%，或20至约30wt%。

酶组合物可包含任何可用于降解或转化纤维素材料的蛋白。

在一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如几种)选自下组的蛋白/多肽：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。在另一个方面，所述纤维素酶优选为一种或多种(例如几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维素酶优选为一种或多种(例如几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。

在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)纤维素分解酶和一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)选自下组的酶：纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。

在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含香豆酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿魏酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露糖苷酶(例如β-甘露糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含木聚糖酶。在一个优选的方面，所述木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。

在另一个方面，所述酶组合物包含酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含棒曲霉素。在另一个方面，所述酶组合物包含漆酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木质素分解酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是产生H₂O₂的酶。在另一个方面，所述酶组合物包含果胶酶。在另一个方面，所述酶组合物包含过氧化物酶。在另一个方面，所述酶组合物包含蛋白酶。在另一个方面，所述酶组合物包含膨胀素。

在本发明的工艺中，酶可在糖化、糖化和发酵、或发酵之前或过程中添加。

所述酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可为野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白和重组蛋白的组合。举例而言，一种或多种(例如几种)组分可为细胞的天然蛋白，其用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(例如几种)其他组分。酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。

用于本发明工艺中的酶可为任何适用于如例如发酵液配制物或细胞组合物，含或不含细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。

具有纤维二糖水解酶活性的酶和多肽的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，同步糖化和发酵的酵母)。

在一个方面，纤维素分解或半纤维素分解酶对于纤维素材料的有效量是约0.1至约50mg，例如约0.1至约40mg，约0.5至约25mg，约0.75至约20mg，约0.75至约15mg，约0.5至约10mg，或约2.5至约10mg每g纤维素材料。

在另一个方面，具有纤维二糖水解酶活性的多肽对于纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，例如约0.01至约40mg，约0.01至约30mg，约0.01至约20mg，约0.01至约10mg，约0.01至约5mg，约0.025至约1.5mg，约0.05至约1.25mg，约0.075至约1.25mg，约0.1至约1.25mg，约0.15至约1.25mg，或约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。

在另一个方面，具有纤维二糖水解酶活性的多肽对于纤维素分解或半纤维素分解酶的有效量是约0.005至约1.0g，例如约0.01至约1.0g，约0.15至约0.75g，约0.15至约0.5g，约0.1至约0.5g，约0.1至约0.25g，或约0.05至约0.2g每g纤维素分解或半纤维素分解酶。

具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽，以及任何可用于纤维素材料的降解的蛋白/多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(在本文中统称为具有酶活性的多肽)酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得的”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或异源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(例如几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的片段和/或突变体或通过本领域已知的氨基酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定位诱变或重排)获得的变体。

具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、热酸菌属(Acidothermus)、Thermobifidia或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有酶活性。

在一个方面，所述多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有酶活性。

在一个方面，所述多肽是具有酶活性的卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个方面，所述多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。

还可以使用具有酶活性的多肽经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。

酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单独组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是外源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中提纯这样的蛋白质来制备。

在一个方面，所述一种或多种(例如几种)纤维素分解酶包含商业性纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业的纤维素分解酶制备物的实例包括，例如，Ctec(Novozymes A/S)、CTec2(Novozymes A/S)、CELLUCLAST^TM(Novozymes A/S)、NOVOZYM^TM188(Novozymes A/S)、CELLUZYME^TM(Novozymes A/S)、CEREFLO^TM(Novozymes A/S)和ULTRAFLO^TM(Novozymes A/S)，ACCELERASE^TM(Genencor Int.)、LAMINEX^TM(Genencor Int.)、SPEZYME^TMCP(Genencor Int.)，NL(DSM)、S/L100(DSM)，ROHAMENT^TM7069W 和LDI(Dyadic International,Inc.)、LBR(Dyadic International,Inc.)或150L(Dyadic International,Inc.)。所述纤维素酶以固体的约0.001至约5.0wt%，例如固体的0.025至约4.0wt%，或固体的约0.005至约2.0wt%的有效量添加。

可以用于本发明的工艺的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039；WO93/15186;美国专利5,275,944；WO96/02551；美国专利5,536,655，WO00/70031，WO05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。

可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I；GENBANK^TM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene63:11-22，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II；GENBANK^TM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANK^TM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,Molecular Microbiology13:219-228；GENBANK^TM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research18:5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株No.VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号M15665)。

可用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)纤维二糖水解酶II(WO2011/059740)，嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I，嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II，特异腐质霉(Humicola insolens)纤维二糖水解酶I，嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)纤维二糖水解酶II(WO2009/042871)，Thielavia hyrcanie纤维二糖水解酶II(WO2010/141325)，土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A，WO2006/074435)，里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I，里氏木霉纤维二糖水解酶II，和褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)纤维二糖水解酶II(WO2010/057086)。

可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不限于，来自棘孢曲霉(Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288)，烟曲霉(WO2005/047499)，黑曲霉(Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980)，米曲霉(WO2002/095014)，巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT20888(WO2007/019442和WO2010/088387)，土生梭孢霉(WO2011/035029)，以及褐孢长毛盘菌(WO2007/019442)的β-葡糖苷酶。

所述β-葡糖苷酶可为融合蛋白。在一个方面，所述β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白(WO2008/057637)或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)。

其它可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶公开于使用根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat B.和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696的分类的许多糖基水解酶家族中。

其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025847、WO99/031255、WO2002/101078、WO2003/027306、WO2003/052054、WO2003/052055、WO2003/052056、WO2003/052057、WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、WO2004/048592、WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050、WO2005/093073、WO2006/074005、WO2006/117432、WO2007/071818、WO2007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263以及美国专利No.5,686,593。

在本发明的方法中，可使用任何具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

在一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽包含下述基序：

[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[FW]-[TF]-K-[AIV]，

其中X为任意氨基酸，X(4,5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而X(4)是在4个连续位置的任意氨基酸。

包含上述所示的基序的分离的多肽可进一步包含：

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]，

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，

其中X为任意氨基酸，X(1,2)为在1个位置或2个连续位置的任意氨基酸，X(3)为3个连续位置的任意氨基酸，而X(2)为2个连续位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。

在一个优选的实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽进一步包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽进一步包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽进一步包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。

在第二个方面，所述具有纤维素分解增强活性的分离的多肽包含下述基序：

[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]，

其中X为任意氨基酸，X(4,5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而X(3)为3个连续位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。

可用于本发明的方法的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的实例包括但不限于：来自土生梭孢霉(WO2005/074647，WO2008/148131，和WO2011/035027)，橙橘嗜热子囊菌(WO2005/074656和WO2010/065830)，里氏木霉(WO2007/089290)，嗜热毁丝霉(WO2009/085935，WO2009/085859，WO2009/085864，WO2009/085868)，烟曲霉(WO2010/138754)的GH61多肽，来自嗜松青霉(WO2011/005867)，嗜热子囊菌属菌种(WO2011/039319)，青霉属菌种(WO2011/041397)，和Thermoascus crustaceous(WO2011/041504)的GH61多肽。

在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在根据WO2008/151043所述的可溶性活化二价金属阳离子，例如硫酸锰的存在下使用。

在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从经预处理的纤维素材料(如经预处理的玉米秸秆(PCS))获得的液剂的存在下使用。

所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一个或多个(几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；联苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛(acrolein acetal)；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物(solvate)。

所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述化合物可包含一个或多个(例如几个)另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色离子(flavylium ion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin)；槲皮素(quercetin)；杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin)；山奈酚(kaempferol)；桑素(morin)；金合欢素(acacetin)；柚皮素(naringenin)；异鼠李黄素(isorhamnetin)；芹菜苷配基(apigenin)；花青素(cyanidin)；花色素苷(cyanin)；kuromanin；花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)；或它们的盐或溶剂合物。

所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自如下的任选取代的模块：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氢噻吩-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基(diazepinyl)、氮杂环庚三烯基(azepinyl)、硫杂环庚三烯基(thiepinyl)、哌啶基和氧杂环庚三烯基(oxepinyl)。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1,2-二羟乙基)-3,4-二氢呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己醛糖酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronic acidγ-lactone)；葡糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(furoin)；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它们的盐或溶剂合物。

所述含氮化合物可为任何具有一个或多个氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或氧化亚氮(nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy)；5,6,7,8-四氢生物蝶呤；6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。

所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q₀；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌；1,4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)；或它们的盐或溶剂合物。

所述含硫化合物可为任何包含一个或多个硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide)，磺酸和磺酸酯的模块。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1,2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。

在一个方面此种如上所述的化合物对纤维素材料的有效量，作为对纤维素的糖单元的摩尔比例为约10^-6至约10，例如约10^-6至约7.5，约10^-6至约5，约10^-6至约2.5，约10^-6至约1，约10^-5至约1，约10^-5至约10^-1，约10^-4至约10^-1，约10^-3至约10^-1，或约10^-3至约10^-2。在另一个方面，此种如上所述的化合物的有效量为约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M，约0.75μM至约0.5M，约1μM至约0.25M，约1μM至约0.1M，约5μM至约50mM，约10μM至约25mM，约50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM至约5mM，或约0.1mM至约1mM。

术语“液剂(liquor)”意指在本文中所述的条件下，通过处理浆料中的木素纤维素和/或半纤维素材料，或其单糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等，所产生的溶液相，即水相、有机相或其组合，及其可溶性内含物。用于GH61多肽的纤维素分解增强的液剂可通过，任选在催化剂例如酸的存在下，任选在有机溶剂的存在下，且任选与所述材料的物理破坏相组合来藉由施加热和/或压力来处理木素纤维素材料或半纤维素材料(或原料)，然后将溶液从剩余固体分离来产生。此类条件确定在通过纤维素酶制备物水解纤维素底物过程中，通过液剂和GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。所述液剂可使用本领域中的标准方法如过滤、沉积或离心从经处理的材料分离。

在一个方面，所述液剂对纤维素的有效量为约10^-6至约10g每g纤维素，例如约10^-6至约7.5g，约10^-6至约5，约10^-6至约2.5g，约10^-6至约1g，约10^-5至约1g，约10^-5至约10^-1g，约10^-4至约10^-1g，约10^-3至约10^-1g，或约10^-3至约10^-2g每g纤维素。

在一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶包含商业性半纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业性半纤维素分解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYME^TM(Novozymes A/S)、HTec(NovozymesA/S)、Htec2(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、HC(Novozymes A/S)、Xylanase(Genencor)、XY(Genencor)、XC(Genencor)、TX-200A(AB Enzymes)、HSP6000Xylanase(DSM)、DEPOL^TM333P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)、DEPOL^TM740L(Biocatalysts Limit，Wales，UK)和DEPOL^TM762P(BiocatalystsLimit，Wales，UK)。

可用于本发明工艺的木聚糖酶的实例包括但不限于来自棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790;WO94/21785)、烟曲霉(WO2006/078256)、嗜松青霉(WO2011/041405)、青霉属菌种(WO2010/126772)、土生梭孢霉NRRL8126(WO2009/079210)和褐孢长毛盘菌GH10(WO2011/057083)的木聚糖酶。

可用于本发明工艺的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)和埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)的β-木糖苷酶。

可用于本发明工艺的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自棘孢曲霉(WO2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)(GeneSeqP登录号AAB82124)、特异腐质霉(Humicola insolens)DSM1800(WO2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(WO2005/001036)、嗜热毁丝霉(Wo2010/014880)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号q7s259)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)(Uniprot登录号Q0UHJ1)和土生梭孢霉NRRL8126(WO2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。

可用于本发明工艺的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于来自特异腐质霉DSM1800(WO2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartorya fischer)(UniProt登录号A1D9T4)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号Q9HGR3)、橘灰青霉(WO2009/127729)和土生梭孢霉(WO2010/053838和WO2010/065448)的阿魏酸酯酶。

可用于本发明工艺的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自黑曲霉(Aspergillus niger)(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉(Humicolainsolens)DSM1800(WO2006/114094和WO2009/073383)和巨多孔菌(M.giganteus)(WO2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。

可用于本发明工艺的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自棒曲霉(Aspergillus clavatus)(UniProt登录号alcc12)、烟曲霉(SwissProt登录号Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)(SwissProt登录号Q0CJP9)、特异腐质霉(WO2010/014706)、橘灰青霉(WO2009/068565)、埃默森踝节菌(UniProt登录号Q8X211)和里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)的α-葡糖醛酸糖苷酶。

用于本发明工艺的具有酶活性的多肽可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett，J.W.和LaSure，L.(编)，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组合物制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-Hill Book Company，NY，1986)。

所述发酵可以是任何其结果为酶或蛋白表达或分离的培养细胞的方法。

因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。

发酵

可通过一种或多种(例如几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。

在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。

在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。

术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。

“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。

能发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母属和酵母属，例如Candida sonorensis、马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的菌株。

以其天然状态能发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属，优选休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)或Candida sonorensis；和毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773的菌株。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)，优选嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的菌株。不能够发酵戊糖如木糖和阿拉伯糖的生物通过本领域已知方法可经遗传修饰而发酵戊糖。

能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括，例如，凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)、Clostridium phytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)和运动发酵单胞菌(Philippidis，1996，见上文)。

其它发酵生物包括芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blankii、C.entomophilia、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和C.phytofermentans；大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产率(yield)的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.latic)、K.thermotolerans和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌，和发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株。

在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个更优选的方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida sonorensis。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida blankii。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida entomophiliia。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在另一个优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。

在一个优选的方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是Clostridiumphytofermentans在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选的方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。

商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如BIOFERM^TMAFT和XR(NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA)，ETHANOLRED^TM酵母(Red Star/Lesaffre，USA)、FALI^TM(Fleischmann’s Yeast，Burns PhilpFood Inc.，USA)，FERMIOL^TM(DSM Specialties)，GERT STRAND^TM(GertStrand AB，Sweden)以及SUPERSTART^TM和THERMOSACC^TM新鲜酵母(Ethanol Technology，WI，USA)。

在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。

通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression ofPichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等，1998，Genetically engineered Saccharomycesyeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859;Kotter和Ciriacy，1993，Xylose fermentation bySaccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190;Kuyper等，2004，Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation:a proof of principle，FEMS Yeast Research4:655-664;Beall等，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugarsby recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38:296-303;Ingram等，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolism pathwayin ethanologenic Zymomonas mobilis，Science267:240-243;Deanda等，1996，Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolicpathway engineering，Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470;WO2003/062430，Xylose Isomerase)。

在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是Candida sonorensis。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。

本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。

通常向降解的纤维素材料或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，例如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，例如约32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，例如约pH4-5、6或7。

在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在另一个方面，温度优选为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃，并且约32℃至约50℃，约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，例如约pH4至约pH7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约10⁵-10¹²，优选约10⁷-10¹⁰，特别是约2x10⁸活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The AlcoholTextbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，Nottingham UniversityPress，United Kingdom1999)中找到，其通过提述并入本文。

对于乙醇产生，在发酵之后，蒸馏发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的工艺获得的乙醇可用作，例如燃料乙醇，饮用乙醇即可饮用的中性酒精饮料，或工业乙醇。

发酵刺激剂可以与本文所述的任何工艺组合使用，以进一步改进发酵方法，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。

发酵产物

发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。

在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.,和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65:207-241;Silveira，M.M.,和Jonas，R.，2002，The biotechnologicalproduction of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam，P.,和Singh，D.，1995，Processes for fermentative production of xylitol–a sugar substitute，Process Biochemistry30(2):117-124;Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping，World Journal of Microbiology andBiotechnology19(6):595-603。

在另一个优选的方面，所述发酵产物是烷烃。所述烷烃是未支化或支化的烷烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十二烷。

在另一个优选的方面，所述发酵产物是环烷烃。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环辛烷。

在另一个优选的方面，所述发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是辛烯。

在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard，A.,和Margaritis，A.，2004，Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamicacid)production and other microbial biopolymers，Biotechnology andBioengineering87(4):501-515。

在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya,和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production bycontinuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，WaterScience and Technology36(6-7):41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass andBioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass formethane production:A review。

在另一个优选的方面，所述发酵产物是异戊二烯。

在另一个优选的方面，所述发酵产物似乎酮。应理解的是，术语“酮”涵盖了含有一个或多个酮模块的酮。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek，2003，见上文。

在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen，R.,和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。

在另一个优选的方面，所述物质是聚酮化合物。

SHF，SSF，SSCF，HHF，SHCF，HHCF，DMC，和CBP：水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)，有时也称为合并的生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖和戊糖单体，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Production andUtilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan,J.,和Himmel,M.,1999,Enzymes,energy and theenvironment:A strategic perspective on the U.S.Department of Energy’s researchand development activities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶法糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd,L.R.,Weimer,P.J.,van Zyl,W.H.,和Pretorius,I.S.,2002,Microbial celluloseutilization:Fundamentals and biotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，本领域中已知的任何方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的工艺。

常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza,Flávio Faria de Moraes,Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel,2003,Optimal controlin fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis,Acta Scientiarum.Technology25:33-38;Gusakov,A.V.,和Sinitsyn,A.P.,1985,Kinetics of the enzymatichydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu,S.K.,和Lee,J.M.,1983,Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,O.V.,1996,Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactorwith intensive stirring induced by electromagnetic field,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。

回收

可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。

本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。

本文中引用了多个参考文献，其通过全文提述并入本文。本发明通过下述实施例进一步描述，其不应视作对本发明范围的限制。

实施例

实施例1：混合的经预处理的玉米秸秆(混合的PCS)与用酸预处理的玉米秸秆(酸性PCS)和用碱预处理的玉米秸秆(碱性PCS)相比性能更佳。

未经洗涤的酸性PCS：将玉米秸秆磨制至约1cm，并在50℃，10%总固体(TS)浸泡于1.0%(w/w)的硫酸溶液2小时。然后将原料脱水至约40%TS并使用蒸汽爆炸在170℃处理5.5分钟。

未经洗涤的碱性PCS：将玉米秸秆磨制至约1cm，并在90℃，15%TS，浸泡于1.5%(w/w)的氢氧化钠溶液2小时。

混合的PCS：将具有39.10%的TS的未经洗涤的酸性预处理玉米秸秆(PCS)44.95g与具有15.28%的TS的未经洗涤的碱性PCS100g混合使得混合PCS的pH为pH5.0。混合PCS的最终TS为22.67%。

酸性PCS：将未经洗涤的酸性PCS用50%氢氧化钠调整至pH5.0。

碱性PCS：将未经洗涤的碱性PCS用10摩尔硫酸调整至pH5.0。

将混合的PCS，酸性PCS和碱性PCS分别以12.6%的起始TS和20g的总重量进行水解。使用里氏木霉纤维素酶组合物(可从Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark获得的CELLIC^TMCTec2)以5.3%(w/w)的里氏木霉纤维素酶组合物对纤维素的比例进行酶水解。水解工艺在50℃和pH5.0进行。除非另行指明，总水解时间为72小时。在水解终止后，通过高效液相色谱(HPLC)分析糖。

发酵以1.5g/l的酵母加载在32℃，pH6.5，150rpm在8ml水解物中进行。在接种之后立即(0hr)和3日时取样以通过HPLC测量乙醇和剩余糖水平。

对于HPLC测量，将收集的样品使用0.22μm注射器式滤器(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤，并如下所述就糖含量分析滤过物。稀释于0.005MH₂SO₄的样品的糖浓度使用7.8×300mm HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)测量，即用0.005M H2SO4在65℃以0.7ml每分钟的流速洗脱，并通过来自由纯糖样品校正的折射率检测( 1100HPLC,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)的葡萄糖(或者木糖)信号的积分(integration)来进行定量。使用所得的葡萄糖(或者木糖)计算对于每个反应来自葡聚糖(或者木聚糖)的葡萄糖(或者木糖)产率的百分比。将测得的糖浓度针对合适的稀释因子进行调整。酶产生的糖的净浓度通过针对在零时点未洗涤的生物质中相应的背景糖浓度调整测得的糖浓度来确定。所有HPLC数据处理使用MICROSOFT EXCEL^TM软件(Microsoft,Richland,WA,USA)进行。

纤维素转化为葡萄糖的程度(或者木聚糖转化为木糖的程度)根据下述文献计算：Zhu,Y.等Calculating sugar yields in high solids hydrolysis of biomass.Bioresource Technology(2010),102(3):2897-2903。

对乙醇浓度类似糖含量地进行分析，且乙醇产率根据下述方程计算：

%乙醇产率=乙醇浓度/(糖(葡萄糖+木糖)浓度×0.5114)。

结果示于表1。可见混合的PCS的葡萄糖转化与酸性PCS相当，且远好于碱性PCS。混合的PCS的木糖转化在所有经测试的PCS中是最好的。混合的PCS的最终乙醇产率亦略好于酸性PCS。

表1：未经洗涤的PCS的葡萄糖，木糖转化和乙醇产率(%)

	葡萄糖转化(%)	木糖转化(%)	乙醇产率(%)
				碱性PCS	53.98	40.69	45.86
酸性PCS	88.06	75.16	64.92
				混合的PCS	85.24	83.80	68.71

为了产生1吨乙醇，玉米秸秆、硫酸和氢氧化钠的量示于表2。可见与碱性PCS和酸性PCS相比，对于混合的PCS使用了较少的化学品和原料。与碱性PCS和酸性PCS相比，混合的PCS对于玉米秸秆、硫酸和氢氧化钠具有较低的总成本。

表2：在全部工艺中原料和化学品的用量(吨)/1吨乙醇

	玉米秸秆(吨)	硫酸(吨)	氢氧化钠(吨)	计算的总成本(RMB)*
					碱性PCS	6.69	0.2	0.67	4287.5
酸性PCS	5.25	0.47	0.3	2842
					混合的PCS	5.18	0.26	0.23	2548

*基于单位价格(NaOH为2800RMB/吨，H₂SO₄为350RMB/吨，玉米秸秆为350RMB/吨)

实施例2：混合的级分PCS与NREL PCS相比性能更佳

基于高度，将生玉米秸秆切割为1英尺长的片段。地面0-1上英尺留在田地中不收获。直立至地面上1-2，2-3，3-4，4-5，5-6，6-7英尺的玉米秸秆标为F2、F3、F4、F5、F6。高于7英尺的玉米秸秆表位>F7。将分级的玉米秸秆用Thomas Wiley磨(Thomas Scientific,Swedesboro,NJ,USA)磨碎至2mm，用自来水洗涤，并在预处理之前干燥。

合并F4、F5、F6、>F7，并用稀酸(0.5%(w/w)溶液)以约18%(w/w)的总固体(TS)在Accelerated Solvent Extractor(ASE)(DIONEX,Sunnyvale,CA,USA)中在170℃预处理15分钟。将F2和F3混合并在下述条件下用NaOH预处理：11%(w/w)预处理总固体(TS)，1%(w/w)NaOH溶液，90℃进行60分钟。在预处理之后，将碱性PCS挤压至39%的总固体(TS)水平以去除可溶性木质素。然后将经酸预处理的F4、F5、F6、>F7与经挤压、碱预处理的F2和F3混合直至pH达到5。

将National Renewable Energy Laboratory(NREL)总玉米秸秆用1.1%(w/w)H₂SO₄溶液(其等价于5%(w/w生物质)H₂SO₄)在190℃预处理60秒。

对于与20%TS未洗涤的NREL PCS具有类似的纤维素加载的混合的PCS，水解在12.07%TS进行。将混合的PCS或NREL PCS中的里氏木霉纤维素酶组合物(可从Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark获得的CELLIC^TMCTec2)维持在里氏木霉纤维素酶组合物对纤维素的比例为2.82%(w/w)。在120小时的水解之后，对水解物取样，并如实施例1中所提及的通过HPLC进行分析。

混合的PCS和NREL PCS的组成示于表3。

表3PCS底物的组成(%)

	不溶性固体的级分(FIS)	葡聚糖	木聚糖	酸不溶性木质素
					混合的PCS	83.47	59.18	22.07	15.80
NREL PCS	56.30	52.93	2.43	31.77

混合的PCS的水解示于表4。结果说明混合的PCS与NREL PCS相比性能更佳。葡萄糖转化如实施例1中所提及进行计算。

表4：酸碱混合的PCS和NREL PCS的葡萄糖转化的比较

	葡萄糖转化(%)
		混合的PCS	65.59
NREL PCS	49.61

实施例3：混合的PCS与在最佳酸预处理条件下预处理的玉米秸秆(最佳酸性PCS)相比性能更佳

进行了对于玉米秸秆的最佳预处理条件的筛选。鉴定出在170℃用0.5%(w/w)硫酸预处理15分钟的玉米秸秆使用里氏木霉纤维素酶组合物(可从Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark获得的CELLIC^TMCTec2)具有最佳的葡萄糖转化。为了将混合PCS的水解与在最佳酸预处理条件下预处理的玉米秸秆的水解相比较，进行了下述稀酸预处理。评估了PCS的水解。

将全玉米秸秆用Thomas Wiley磨(Thomas Scientific,Swedesboro,NJ,USA)磨碎至2mm，用自来水洗涤，并在预处理之前进行干燥。

将磨碎的玉米秸秆用稀硫酸(0.5%(w/w)溶液以约18%(w/w)的总固体(TS)在Accelerated Solvent Extractor(ASE)(DIONEX,Sunnyvale,CA,USA)中在170℃预处理15分钟。

将磨碎的玉米秸秆用稀硫酸(0.5%(w/w)溶液以约20%(w/w)的总固体(TS)在沙浴反应器(Techne Inc.Burlington,NJ,USA)中在170℃预处理15分钟。

水解在15%TS进行。将混合的PCS或最佳酸性PCS中的里氏木霉纤维素酶组合物(可从Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark获得的CELLIC^TMCTec2)维持在里氏木霉纤维素酶组合物对纤维素的比例对于ASE PCS为2.82%(w/w)或对于沙浴PCS为4.24%(w/w)。在120小时的水解之后，对水解物取样，并如实施例1中所提及的通过HPLC进行分析。

结果

结果显示混合的PCS(参见实施例2，65.59%的葡萄糖转化)与最佳酸性PCS相比性能更佳。葡萄糖转化如实施例1中所提及的进行计算。

表5：最佳酸性PCS的水解性能

最佳PCS	葡萄糖转化(%)
		ASE酸性PCS	59.92
沙浴酸性PCS	47.65

Claims

1.一种用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，其包括：

(a)用酸性试剂预处理含木素纤维素材料破坏植物细胞壁的纤维素材料组分以获得经酸预处理的含木素纤维素材料，和用碱性试剂预处理含木素纤维素材料破坏植物细胞壁的纤维素材料组分以获得经碱预处理的含木素纤维素材料；

(c)用酶组合物水解混合的含木素纤维素材料；和

(d)添加发酵生物以产生发酵产物。

2.一种用于将含木素纤维素材料降解或转化为包含单糖和寡糖的水解物的方法，其包括：

(c)对混合的含木素纤维素材料进行至少部分酶水解以获得包含单糖和/或寡糖的水解物。

3.权利要求1或2的方法，其中用酸性试剂对含木素纤维素材料的预处理包括用酸性试剂浸泡所述含木素纤维素材料。

4.权利要求3的方法，其中用酸性试剂对含木素纤维素材料的预处理包括用酸性试剂浸泡所述含木素纤维素材料和对所述含木素纤维素材料进行蒸汽爆炸。

5.权利要求1或2的方法，其中所述酸性试剂选自下组：氢氯酸、磷酸、硫酸、亚硫酸、碳酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、琥珀酸、氯化氢、磷酸酐、二氧化硫、二氧化碳和/或其组合。

6.权利要求1或2的方法，其中水溶液特别是硫酸中酸性试剂的浓度为0.05-10％(w/w)。

7.权利要求6的方法，其中水溶液特别是硫酸中酸性试剂的浓度为0.1-5％(w/w)。

8.权利要求6的方法，其中水溶液特别是硫酸中酸性试剂的浓度为0.3-2.5％(w/w)。

9.权利要求1或2的方法，其中对于用酸性试剂的预处理，含木素纤维素材料的总固体为1-80％(w/w)。

10.权利要求9的方法，其中对于用酸性试剂的预处理，含木素纤维素材料的总固体为5-50％(w/w)。

11.权利要求9的方法，其中对于用酸性试剂的预处理，含木素纤维素材料的总固体为8-30％(w/w)。

12.权利要求1或2的方法，其中用酸性试剂对含木素纤维素材料的预处理进行1分钟至300分钟，和/或在130℃至270℃的温度进行。

13.权利要求12的方法，其中用酸性实际对含木素纤维素材料的预处理进行30分钟至250分钟。

14.权利要求12的方法，其中用酸性实际对含木素纤维素材料的预处理进行60分钟至150分钟。

15.权利要求12的方法，其中用酸性实际对含木素纤维素材料的预处理在150℃至230℃的温度进行。

16.权利要求15的方法，其中用酸性实际对含木素纤维素材料的预处理在160℃至200℃的温度进行。

17.权利要求1或2的方法，其中用碱性试剂对含木素纤维素材料的预处理包括用碱性试剂浸泡所述含木素纤维素材料。

18.权利要求17的方法，其中所述碱性试剂选自下组：氢氧化钙(Ca(OH)₂)，氧化钙(CaO)，氨(NH₃)，氢氧化钠(NaOH)，碳酸钠(NaCO₃)，氢氧化钾(KOH)，尿素，和/或其组合。

19.权利要求1或2的方法，其中水溶液特别是硫酸中碱性试剂的浓度是0.1-50％(w/w)。

20.权利要求19的方法，其中水溶液特别是硫酸中酸性试剂的浓度为0.5-40％(w/w)。

21.权利要求20的方法，其中水溶液特别是硫酸中酸性试剂的浓度为5-25％(w/w)。

22.权利要求1或2的方法，其中对于用碱性试剂的预处理，含木素纤维素材料的总固体为1-80％(w/w)。

23.权利要求22的方法，其中对于用碱性试剂的预处理，含木素纤维素材料的总固体为5-50％(w/w)。

24.权利要求22的方法，其中对于用碱性试剂的预处理，含木素纤维素材料的总固体为8-30％(w/w)。

25.权利要求1或2的方法，其中碱性试剂对含木素纤维素材料进行的预处理进行1分钟至300分钟；和/或在50℃至150℃范围的温度进行。

26.权利要求25的方法，其中碱性试剂对含木素纤维素材料进行的预处理进行30分钟至250分钟。

27.权利要求25的方法，其中碱性试剂对含木素纤维素材料进行的预处理进行60分钟至150分钟。

28.权利要求25的方法，其中碱性试剂对含木素纤维素材料进行的预处理在70℃至120℃范围的温度进行。

29.权利要求1或2的方法，其中所述含木素纤维素材料选自下组：玉米秸秆、玉米穗轴、玉米纤维、柳枝稷、麦秆、稻秆、甘蔗渣和藻类，及其组合。

30.权利要求1或2的方法，其中用酸性试剂预处理直立至地面上方超过三英尺的玉米秸秆；和/或用碱性试剂预处理直立至地面上方1-3英尺的玉米秸秆。

31.权利要求1或2的方法，其中将所述混合的含木素纤维素材料调整至pH 3-8左右。

32.权利要求31的方法，其中，将所述混合的含木素纤维素材料调整至pH 4-6左右。

33.权利要求31的方法，其中，将所述混合的含木素纤维素材料调整至pH 5左右。

34.权利要求1或2的方法，其中水解使用一种或多种选自下组的酶进行：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素，或其混合物。

35.权利要求34的方法，其中，所述纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶；和其中，所述半纤维素酶为一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。

36.权利要求1或2的方法，其中水解在25℃至70℃左右的温度进行。

37.权利要求36的方法，其中，水解在40℃至60℃的温度进行。

38.权利要求36的方法，其中，水解在50℃左右的温度进行。

39.权利要求1或2的方法，其中水解在3-8范围的pH进行。

40.权利要求39的方法，其中，水解在pH4-6范围进行。

41.权利要求39的方法，其中，水解在pH5左右进行。

42.权利要求1或2的方法，其中发酵在20℃至60℃的温度进行。

43.权利要求42的方法，其中，发酵在25℃至50℃的温度进行。

44.权利要求42的方法，其中，发酵在32℃至50℃的温度进行。

45.权利要求1或2的方法，其中发酵在3-7范围的pH，进行。

46.权利要求45的方法，其中，发酵在pH4-6进行。

47.权利要求45的方法，其中，发酵在pH4至pH5进行。

48.权利要求1或2的方法，其中所述发酵生物是酵母。

49.权利要求1或2的方法，其中所述发酵产物是醇，有机酸，酮，氨基酸，烷烃，环烷烃，或烯烃。

50.权利要求1或2的方法，其中水解和发酵同时或顺序进行。