DE69231995T2

DE69231995T2 - Verfahren zur Herstellung/Sekretion eines Proteins durch einen transformiertenSchimmelpilz unter Verwendung von Expressions-/Sekretions- Regulationsregionenaus Aspergillus

Info

Publication number: DE69231995T2
Application number: DE69231995T
Authority: DE
Inventors: Johannes Gouka; Wouter Musters; Hein Stam; Antonius Van Den Hondel; Maria Verbakel
Original assignee: Unilever PLC; Unilever NV
Current assignee: Unilever PLC; Unilever NV
Priority date: 1991-12-09
Filing date: 1992-12-09
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: WO1993012237A1; FI111958B; DE69231995D1; JP2866739B2; AU3158393A; DK0672149T3; ATE204022T1; JPH07501453A; EP0672149A1; ES2159519T3; ZA929539B; CA2123416C; AU664223B2; EP0672149B1; US5705358A; CA2123416A1; FI942691L; FI942691A0

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und fakultativ zur Sekretion eines Proteins durch einen transformierten Schimmelpilz, in den unter Zuhilfenahme per se bekannter rekombinanter DNA-Techniken ein Expressionsvektor eingeführt worden ist, wobei der Vektor ein oder mehrere Schimmelpilz-abgeleitete expressions- und/oder sekretionsregulierende Regionen umfaßt, die die Expression eines das Protein kodierenden Gens kontrollieren und fakultativ die Sekretion des so produzierten Proteins kontrollieren. Ein solches Verfahren ist aus verschiedenen Veröffentlichungen bekannt, in denen die Herstellung von Proteinen unter Zuhilfenahme von transformierten Schimmelpilzen beschrieben wird. So wird in der nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung PCT/EP 91/01135 (UNILEVER, im Prioritätsjahr publiziert am 26. Dezember 1991 als WO 91/19782) u. a. die Herstellung eines homologen Endoxylanase II-Proteins durch einen transformierten Aspergillus-Stamm beschrieben.
Es sind auch andere Wege zur Herstellung von Proteinen durch transformierte Schimmelpilze, insbesondere unter Verwendung von aus Aspergillus-Schimmelpilzen stammenden Promotoren, bekannt.
- Ward, M. et al. (GENENCOR, 1990) haben die Herstellung des Milch-gerinnenden Enzyms Chymosin oder seines Vorläufers Prochymosin durch einen transformierten Aspergillus niger var. awamori beschrieben. Es wurde gefolgert, daß die Herstellung eines Fusionsproteins, in dem Prochymosin am N- Terminus mit dem C-Terminus der Aspergillus Protein Glucoamylase verbunden ist, zu einer wesentlich höheren Sekretion führte, als die Herstellung des Prochymosins allein, wobei in beiden Fällen die Glucoamylasesignalsequenz vor dem Protein stand und das Protein unter der Kontrolle des Glucoamylasepromotors stand.
- In CA-A-2024448 (ALLELIX BIOPHARMACE) "Recombinant DNA expression construct - containing promoter for use in Aspergillus", veröffentlicht am 1. März 1991, wird der konstitutive Promotor des Aspergillus nidulans Aldehyddehydrogenase-Gens und seine Verwendung zur Herstellung eines heterologen Proteins in einem transformierten Schimmelpilz beschrieben.
- In EP-A-0436858 (GREEN CROSS CORP.) "Promoter of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene - derived from Aspergillus orizae, used in new expression system in yellow-green or black koji mould", veröffentlicht am 17. Juni 1991, wird die Verwendung des Promotors und Terminators des GAPDH-Gens in einem Vektor zum Transformieren eines Schimmelpilzes zur Herstellung fremder Proteine beschrieben.
Und:
- In EP-A-0439997 (CIBA GEIGY AG) "A. niger pyruvate kinase promoter - used to construct vectors for expression of structural genes in suitable hosts", veröffentlicht am 7. August 1991, wird die Überproduktion eines homologen Genprodukts oder eines heterologen Genprodukts in A. niger beschrieben.
Schimmelpilze sind bei der Herstellung von Proteinen und Metaboliten häufig verwendete Organismen. Ein biotechnolgisch sehr wichtiger Aspekt von Schimmelpilzen besteht darin, daß sie zu einer sehr effizienten Protein-Produktion und, falls erwünscht, -Sekretion in das Medium fähig sind. Es ist darüber hinaus möglich, Schimmelpilze auf gut kontrollierte Art in großen Bioreaktoren anzuziehen. Die Kombination aus den Möglichkeiten durch Fermentation fungale Biomasse kosteneffizient herzustellen und der hohen spezifischen Expression pro Zelle machen Schimmelpilze zu zur Produktion von sowohl heterologen als auch homologen Proteinen außerordentlich interessanten Wirten. Zur effizienten Herstellung dieser heterologen und homologen Proteine ist die Verwendung eines effizienten, in Schimmelpilzen wirksamen Promotors essentiell. Zur Sekretion eines Proteins in das Medium werden spezifische Sequenzen benötigt, die dies ermöglichen. Im Zusammenhang mit einer möglichen Toxizität des zu produzierenden Proteins für die Schimmelpilzzelle ist es darüber hinaus wichtig, daß die Aktivität eines Promotors reguliert werden kann, d. h. zu geeigneten Zeitpunkten angeschaltet werden kann. Daher ist ein induzierbarer Promotor bevorzugt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung basiert auf der Verwendung eines nicht vorveröffentlichten Promotors, der unten detaillierter beschrieben ist, sowie auf der Verwendung von anderen expressions- und/oder sekretionsregulierenden Regionen, wie einem Terminator und einer eine Signalsequenz kodierenden DNA-Sequenz und einer mindestens einen essentiellen Teil eines reifen endogenen Schimmelpilzproteins kodierenden DNA-Sequenz. In Studien zur Expression von Proteinen in Schimmelpilzen wurde gefunden, daß das Enzym Endoxylanase Typ II (exlA) nach Induktion der Expression des exlA Gens effizient produziert und darüber hinaus effizient in das Medium sekretiert wurde. Zur Produktion dieses Proteins wurde das kodierende Gen zusammen mit seinem eigenen Promotor kloniert. Im Vergleich zu anderen Schimmelpilzpromotoren erwies sich der Endoxylanase II-Promotor als besonders effizient. Es wurde gefunden, daß die Expression des für das Endoxylanase II-Enzym kodierenden Gens (reguliert von seinem eigenen Promotor) durch verschiedene Mediumkomponenten effizient induziert wurde, einschließlich Weizenkleie, Xylan und Xylose. Es wurde gefunden, daß diese Induktion in verschiedenen Schimmelpilzstämmen effizient abläuft (s. WO 91/19782, UNILEVER). Dies ergab eine Möglichkeit, einen effizient induzierbaren Promotor sowie andere schimmelpilzabgeleitete expressions- und/oder sekretionsregulierende Regionen zu erhalten, einschließlich Transkriptionsterminatorsignale und Sekretionssignale, die möglicherweise zur Herstellung von heterologen und homologen Proteinen in Schimmelpilzen verwendet werden können. Das Promotorfragment, Terminatorfragment und die Sekretionssignale des Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II-Gens wurden kloniert und anschließend weitergehend definiert. Das E. coli β-Glucoronidase-Gen (uidA) wurde als Beispiel für die Produktion eines heterologen Proteins in einem transformierten Schimmelpilz herangezogen. Die Promotor- und Terminatorsequenzen des Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II-Gens wurden zur Konstruktion eines Expressionsvektors verwendet. Mit Hilfe dieses Expressionsvektors wurde ein für die E. coli β-Glucoronidase kodierendes heterologes Gen in Schimmelpilzen unter der Kontrolle des Endoxylanase II (exlA) Promotors exprimiert. Durch Verwendung von exlA-Sekretionssignalen können die heterologen und homologen Proteine auch sekretiert werden. Als weiteres Beispiel für die Verwendung des exlA-Promotors und Terminators zur Herstellung eines heterologen Proteins wurde ein für eine Thermomyces lanuginosa Lipase kodierendes Gen in den Expressionsvektor unter der Kontrolle der exlA-regulatorischen Sequenz eingeführt und zur Herstellung und Sekretion von Thermomyces lanuginosa Lipase verwendet. NOVO-NORDISK, eine Enzymherstellerfirma in Dänemark, vermarktet unter dem Handelsnamen "Lipolase" eine von Thermomyces lanuginosa abgeleitete Lipase, die jedoch von einem anderen Mikroorganismus produziert wird. Um zu verdeutlichen, daß die exlA-Signalsequenz zur direkten Sekretion von anderen Proteinen als exlA verwendet werden kann, wurde eine für eine reife Lipaseaminosäuresequenz aus Thermomyces lanuginosa kodierende DNA-Sequenz mit der exlA-Signalsequenz fusioniert und unter die Kontrolle der exlA-regulatorischen Sequenz im oben erwähnten Expressionsplasmid gestellt und die Sekretion von Thermomyces lanuginosa Lipase wurde demonstriert.
Natürlich können die heterologen Gene, deren Expression in dieser Beschreibung beispielhaft aufgeführt ist, durch irgendeine ein erwünschtes Protein kodierende DNA-Sequenz (kodierend für Enzyme, Protein usw.) ersetzt werden, die aus einem weiten Bereich von Organismen stammen (Bakterien, Hefen, Schimmelpilze, Pflanzen, Tiere und Menschen), so daß das erwünschte Protein durch Schimmelpilze produziert werden kann.
Daher besteht eine Ausführungsform der Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von anderen Proteinen als der Endoxylanase Typ II in transformierten Schimmelpilzen unter Verwendung von aus dem Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II (exlA) Gen abgeleiteten expressionsregulierenden Sequenzen, wie dem Promotor oder Terminator oder funktionellen Derivaten dieser regulatorischen Sequenzen. In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, nach dem in Schimmelpilzen produzierte Proteine, falls erwünscht, in das Medium sekretiert werden können unter Verwendung einer die Signalsequenz kodierenden DNA-Sequenz, insbesondere der Präsequenz oder Präprosequenz des Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II-Gens oder funktioneller Derivate dieser Sequenzen Schließlich stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von Protein bereit, in dem ein Vektor verwendet wird, der mindestens einen essentiellen Teil der DNA-Seauenz umfaßt, die das reife Endoxylanase II-Protein kodiert, da es bekannt ist, daß bei Schimmelpilzen eine verbesserte Sekretion eines heterologen Proteins erhalten werden kann, indem es zunächst als Fusionsprotein produziert wird, das ein Teil eines endogenen Schimmelpilzproteins umfaßt (s. auch Ward, M. et al. / GENENCOR, oben erwähntes Zitat).

Kurze Beschreibung der Figuren und Tabellen

Fig. 1 zeigt die DNA-Sequenz des 2,1 kb PstI-PstI- Fragments von Aspergillus niger var. awamori, das in dem Plasmid pAW14B vorliegt, wobei das Fragment ein Gen enthält, das für eine Endoxylanase II kodiert, bezeichnet als exlA Gen. Das Translationsstart- und das Translationsstoppkodon sind doppelt unterstrichen. Das 49 bp Intron ist unterstrichen. Das N-terminale Ende des reifen Proteins ist gekennzeichnet. Die Aminosäuresequenz des Proteins (sowohl der Prä(Pro)-Form als auch des reifen Proteins) ist unter Verwendung des Einbuchstabencodes angegeben.
Fig. 2 zeigt die Restriktionsskarte der genomischen DNA- Region von Aspergillus niger var. awamori, umfassend das exlA Gen, kloniert in die Phagen Lambda 1 und Lambda 14. Die verwendeten Abkürzungen stehen für: S: SalI; E: EcoRI; H: HindIII; P: PstI; P*: PstI; B: BamHI; S#: SalI-Stelle von dem Polylinker des Lambda-EMBL3 herrührend; und D: Sau3A. Der dicke Strich zeigt ein 1,2 kb PstI*-BamHI-Fragment an, das mit Xy106 hybridisiert. P*- und PstI*-Symbole werden verwendet, um die beiden vorliegenden PstI-Stellen zu unterscheiden.
Fig3 zeigt das Plasmid pAW14B, erhalten durch Insertion eines 5,3 kb SalI-Fragments, umfassend das exlA Gen von Aspergillus niger var. awamori in die SalI-Stelle von pUC19.
Fig. 4 zeigt das Plasmid pAW15-1, erhalten durch Ersatz des BspHI-AflII-Fragments, umfassend das exlA offene Leseraster in pAW14B mit einem NcoI-AflII-Fragment, umfassend die E. coli uidA-kodierende Sequenz. Daher umfaßt das Plasmid pAW15-1 das E. coli uidA-Gen unter der Kontrolle des A. niger var. awamori-Promotors und -Terminators.
Fig. 5 zeigt das Plasmid pAW15-7, erhalten durch Insertion eines 2,6 kb NotI-Fragments, umfassend das E. coli Hygromycinresistenzgen, unter der Kontrolle des A. nidulans gpdA-Promotors und des A. nidulans trpc-Terminators in der EcoRI-Stelle von pAW15-1.
Fig. 6 zeigt das Plasmid pAWTL1, erhalten durch Ersatz des BspHI-AflII-Fragments, umfassend das exlA offene Leseraster in pAW14B mit einem BspHI-AflII-Fragment, umfassend eine Nukleotidsequenz, die die T. lanuginosa Lipase zusammen mit ihrer eigenen Prä-Pro-Sequenz kodiert. Daher umfaßt das Plasmid pAWTL1 das T. lanuginosa Lipase-Gen zusammen mit seiner eigenen die Prä-Pro-Sequenz kodierenden Region unter der Kontrolle des A. niger var. awamori Promotors und Terminators.
Fig. 7 zeigt das Plasmid pAWTL2, erhalten durch Ersatz des Nurl-AflII-Fragments, umfassend die Region, die das reife exlA-Protein in pAW14B kodiert durch ein NruI-AflII-Fragment, das eine den reifen Teil der T. lanuginosa Lipase kodierende Nukleotidsequenz umfaßt. Daher umfaßt das Plasmid pAWTL2 das T. lanuginosa Lipase-Gen, fusioniert mit der exlA Prä-Pro- Sequenz kodierenden Region unter der Kontrolle des A. niger var. awamori-Promotors und -Terminators.
Fig. 8 zeigt das Plasmid pTL1, umfassend eine die T. lanuginosa Lipase kodierende Nukleotidsequenz zusammen mit ihrer eigenen Prä-Pro-Sequenz unter der Kontrolle des A. niger gpdA-Promotors und des A. nidulans trpC-Terminators, eingesetzt in den Polylinker von pUC18. Die für die Prä-Pro- Sequenz der T. lanuginosa Lipase kodierende Region ist durch "ss" gekennzeichnet.
Fig. 9 zeigt die Sequenz, die das für die T. lanuginosa Lipase kodierende offene Leseraster umfaßt, wie sie innerhalb des Plasmids pTL1 enthalten ist. Das N-terminale Ende des reifen Proteins ist gekennzeichnet.
Tabelle A zeigt verschiedene von der n-terminalen Aminosäuresequenz des Endoxylanase II-Proteins abgeleitete Sonden. Diese Sonden wurden für die Isolierung des exlA-Gens verwendet, s. Punkt 1.1 in Beispiel 1.
Die Anzahl der in der "gemischten Sonde" vorhandenen Oligonukleotide wird in Klammern angegeben. Diese Anzahl ist durch Einbeziehen von 1, 2, 3 oder 4 verschiedenen Basen in jeder dritten Position erhalten, abhängig von der Anzahl der Kodons für eine Aminosäure. In Xyl04 wurden die Nukleotide auf Grundlage der Hybridisierung G-C und G-T und/oder auf Grundlage der bevorzugten Kodons in Aspergillus niger Glucoamylase ausgewählt. In Xyl05 und Xyl06 werden nicht alle möglicherweise vorkommenden Basen an der dritten Position des Kodons eingeführt, um nicht mehr als 256 Oligonukleotide in der Mischung zu erhalten. Die Sequenz der Oligonukleotide ist zu der des kodierenden Stranges der DNA komplementär, die der korrespondierenden mRNA ähnelt.
Xyl01: Eine Mischung von 256 Oligos mit einer Länge von 23 Desoxynukleotiden der Sequenz, die zu dem Teil des kodierenden Stranges komplementär ist, der für die Aminosäuren 5-12 kodiert.
Xyl04: Ein Oligo mit einer Länge von 47 Desoxynukleotiden der Sequenz, die zu dem Teil des kodierenden Stranges komplementär ist, der für die Aminosäuren 2-17 kodiert.
Xyl05: Eine Mischung von 144 Oligos mit einer Länge von 23 Desoxynukleotiden der Sequenz, die zu dem Teil des kodierenden Stranges komplementär ist, der für die Aminosäuren 10-17 kodiert.
Xyl06: Eine Mischung von 256 Oligos mit einer Länge von 47 Desoxynukleotiden der Sequenz, die zu dem Teil des kodierenden Stranges komplementär ist, der für die Aminosäuren 2-17 kodiert.
Tabelle B zeigt verschiedene einzelsträngige Subklone von Lambda 1- und Lambda 14-Fragmenten, die zur Bestimmung der Sequenz des exlA-Gens verwendet wurden, s. Punkt 1.2 von Beispiel 1.
Tabelle C zeigt die Ergebnisse der E. coli β- Glucoronidase-Produktion durch nicht-transformierte und transformierte Stämme des Schimmelpilzes Aspergillus niger var. a wamori, s. Punkt 2.2 in Beispiel 2.
Tabelle D zeigt, daß nach Induktion des exlA-Promotors durch Xylose funktionelle Lipase produziert und sekretiert wurde und daß die Sekretion eines heterologen (Thermomyces lanuginosa) reifen Proteins in Aspergillus niger var. awamori durch Verwendung der exlA-Signalsequenz (s. AWLPL2-2) oder der Thermomyces lanuginosa Signalsequenz (s. AWLPL1-2) kontrolliert wurde, s. Punkt 3.2 in Beispiel 3.
Tabelle E zeigt verschiedene Nukleotidsequenzen von Oligonukleotiden, die in den in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Konstruktionen verwendet wurden, s. Punkte 1.4, 2.1, 3.1.1, 3.1.2, 3.1.3 und 3.1.4. Die Sequenzauflistungszahlen beziehen sich auf die im offiziellen Format vorgegebenen Auflistungen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Da das Endoxylanase II-Gen unter geeigneten Kulturbedingungen von Aspergillus niger var. awamori sehr effizient exprimiert und das resultierende Protein sehr effizient sekretiert wird, betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere das Klonen der regulatorischen Regionen des Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II (exlA)-Gens, wie die Promotorsequenz, Terminatorsequenz und Signalsequenz, und die Verwendung dieser Komponenten für die Entwicklung eines Verfahrens zur Produktion von Proteinen in Schimmelpilzen. Die Erfindung betrifft daher allgemein ein Verfahren, das aus Schimmelpilzen ableitbare Nukleinsäuresequenzen verwendet und mindestens eine regulatorische Region umfaßt, die von einem ein Polypeptid mit Endoxylanase II-Aktivität kodierendem Gen ableitbar ist. Diese Nukleinsäuresequenz kann mit Nukleinsäuresequenzen kombiniert werden, die andere homologe oder heterologe Gene kodieren, um diese Gene unter die Kontrolle von mindestens einer exlA-regulatorischen Sequenz zu bringen. "Nukleinsäuresequenz", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden jeder Länge, sowohl Ribonukleinsäure-(RNA)Sequenzen als auch Desoxyribonukleinsäure-(DNA)Sequenzen. Prinzipiell betrifft dieser Begriff die primäre Struktur des Moleküls. Daher beinhaltet dieser Begriff sowohl einzel- als auch doppelsträngige DNA sowie einzelsträngige RNA und Modifikationen davon.
Im allgemeinen betrifft der Begriff "Protein" eine molekulare Kette von Aminosäuren mit einer biologischen Aktivität, und er betrifft nicht eine spezifische Länge des Produktes und dieses kann, wenn erforderlich, in vivo oder in vitro modifiziert werden. Diese Modifikation kann z. B. in Form von Amidierung, Carboxylierung, Glycolysierung oder Phosphorylierung erfolgen, so daß u. a. Peptide, Oligopeptide und Polypeptide einbezogen sind. In dieser Beschreibung werden die beiden Begriffe Polypeptid und Protein synonym verwendet, es sei denn, eine spezifische Bedeutung wird aus dem Kontext klar.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Vektors, der Nukleinsäuresequenzen enthält, wie sie für die Herstellung von anderen Proteinen als Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II (exlA) beschrieben sind und betrifft auch die Verwendung von Mikroorganismen, die die Vektoren oder Nukleinsäuresequenzen zur Herstellung der Proteine enthalten.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von modifizierten Sequenzen der oben genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen für die Herstellung von anderen Proteinen als der Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II (exlA), wobei die modifizierten Sequenzen auch eine regulatorische Aktivität aufweisen. Der Begriff "eine modifizierte Sequenz" deckt Nukleinsäuresequenzen mit einer regulatorischen Aktivität ab, die gleich oder besser als die der Nukleinsäuresequenz ist, die von Schimmelpilzen ableitbar ist, und die mindestens eine regulatorische Region enthalten, die aus dem für ein Protein mit Endoxylanase II-Aktivität kodierenden Gen ableitbar ist. Eine solche äquivalente Nukleinsäuresequenz kann in bezug auf eine oder mehrere Nukleotide Substitution, Deletion oder Insertion oder einer Kombination aus den vorgenannten unterworfen worden sein, was zu einer modifizierten Nukleinsäuresequenz ohne damit einhergehendem Verlust der regulatorischen Aktivität führt. Verfahren zur Herstellung von anderen Proteinen als der Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II (exlA), die solche modifizierten Nukleinsäuresequenzen verwenden, fallen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Insbesondere fallen Verfahren zur Herstellung von anderen Proteinen als Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II (exlA) in den Schutzbereich der Erfindung, die modifizierte Sequenzen verwenden, die zur Hybridisierung mit den nicht modifizierten Nukleinsäuresequenzen fähig sind und mindestens die regulatorische Aktivität der nicht modifizierten Sequenz erhalten.
Der in den Ansprüchen verwendete Ausdruck "funktionelle Derivate" betrifft solche modifizierten Sequenzen.
Der Begriff "ein Teil der" deckt Nukleinsäuresequenzen ab, die eine Subsequenz der Nukleinsäuresequenz sind, die aus einem Schimmelpilz ableitbar ist und mindestens eine regulatorische Region umfassen, die von einem für ein Polypeptid mit Endoxylanase II-Aktivität kodierenden Gen ableitbar ist. Insbesondere betrifft die Verbindung ein Verfahren, das ein von dem Schimmelpilz des Genus Aspergillus ableitbare Nukleinsäuresequenz verwendet. Ein geeignetes Beispiel eines Schimmelpilzes, von dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz abgeleitet werden kann, ist ein Aspergillus der Spezies Aspergillus niger, insbesondere Aspergillus niger var. awamori. Insbesondere ist der Stamm Aspergillus niger var. awamori CBS 115.52 (ATCC 11358) besonders geeignet zum Ableiten einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz. Vorzugsweise umfaßt die Nukleinsäuresequenz zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren mindestens einen Promotor als regulatorische Region. Die Nukleinsäuresequenz zur Verwendung in einem Verfahren gemäß der Erfindung kann auch eine Induzierer- oder Verstärkersequenz umfassen, die einen höheren Grad der Expression irgendeiner Nukleinsäuresequenz ermöglicht, die in geeigneter Weise mit dem Promotor verbunden ist. Es ist für die Nukleinsäuresequenz zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren auch möglich, ein Terminationssignal als regulatorische Region zu umfassen. Die Nukleinsäuresequenz zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren kann eines oder mehrere regulatorische Regionen umfassen. Eine Nukleinsäuresequenz zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren kann allein den Promotor als regulatorische Region oder eine Kombination dessen mit einem Verstärker oder einem anderen funktionellen Element umfassen. Eine Nukleinsäuresequenz zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren kann darüber hinaus Terminatorsequenzen umfassen, obwohl diese nicht immer zur effizienten Expression des erwünschten Expressionsproduktes benötigt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Nukleinsäuresequenz darüber hinaus eine Sequenz umfassen, die ein zur Sekretion eines Genproduktes aus dem Schimmelpilz notwendiges sekretorisches Signal kodiert. Dies ist bevorzugt, wenn die intrazelluläre Produktion eines erwünschten Expressionsproduktes nicht hinreichend ist und die extrazelluläre Produktion des erwünschten Expressionsproduktes benötigt wird. Sekretorische Signale umfassen z. B. die Prä-Pro- oder Prä-Sequenz des Endoxylanase II-Gens. Ein vom Endoxylanase II-Gen ableitbares sekretorisches Signal eines Aspergillus Schimmelpilzes wird besonders bevorzugt. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete spezifische Ausführungsform der Nukleinsäuresequenz hängt jedoch von der Zielsetzung ab, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erreicht werden soll. "Signalseauenz", wie hierin verwendet, betrifft allgemein eine Aminosäuresequenz, die für die Initiierung des Exports eines Proteins oder einer Polypeptidkette verantwortlich ist. Eine Signalsequenz kann, wenn der Export eines wachsenden Proteins oder einer wachsenden Polypeptidkette initiiert worden ist, an einer spezifischen Stelle von dem reifen Protein abgetrennt werden. Der Begriff beinhaltet auch Vorlaufsequenzen (Leader-Sequenzen) oder Vorlaufpeptide (Leader-Peptide). Die hierin bevorzugte Signalsequenz ist die in Fig. 1 angegebene abgeleiteten Signalsequenz des Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II-Gens.
Die Signalsequenz und die Terminationssequenz wurden aus einer genomischen Bibliothek mit Hilfe von DNA-Oligonukleotiden isoliert, die durch Proteinsequenzanalyse von Endoxylanase II aus Aspergillus niger var. awamori chromosomalen DNA- Fragmenten abgeleitet waren, die das gesamte Endoxylanase II (exlA) Gen von Aspergillus niger var, awamori einschließlich der regulatorischen Regionen, wie des Promotors, umfassen. Die regulatorischen Regionen des Endoxylanase II (exlA)-Gens wurden für die Herstellung und, falls erwünscht, Sekretion von anderen Proteinen als der Endoxylanase II, z. B. heterologen Proteinen, durch Aspergillus niger var. awamori verwendet. Die Erfindung betrifft daher insbesondere ein Verfahren, in dem ein oder mehrere regulatorische Regionen des Aspergillus niger var. awamori Endoxylanase II-Gens oder äquivalenten Nukleinsäuresequenzen zur Herstellung von anderen Proteinen als der Endoxylanase II in Aspergillus niger var. awamori verwendet werden. Der Begriff "äquivalente Nukleinsäuresequenz" hat die gleiche Bedeutung wie oben für "eine modifizierte Nukleinsäuresequenz" angegeben.
In den unten angeführten Beispielen wurde das Expressions- und Sekretionspotential des erhaltenen exlA-Promotors und der erhaltenen exlA-Signalsequenz durch Konstruktion von neuen Vektoren zur Expression eines heterologen β-Glucuronidase-Gens und zur Produktion und Sekretion einer heterologen Lipase in Aspergillus getestet. Die resultierenden Konstrukte wurden in Aspergillus niger var. awamori getestet.
Daher stellt die Erfindung in allgemeiner Form ein Verfahren zur Herstellung und fakultativ zur Sekretion von einem anderen Protein als dem Endoxylanase Typ II-Protein aus Aspergillus niger var. awamori durch einen transformierten Schimmelpilz bereit, in den unter Zuhilfenahme von per se bekannten rekombinanten DNA-Techniken ein Expressionsvektor eingeführt worden ist, wobei der Vektor schimmelpilz-abgeleitete expressions- und/oder sekretionsregulierende Regionen umfaßt, wobei in dem Verfahren mindestens eine expressions- und/oder sekretionsregulierende Region ausgewählt ist aus (1) den expressions- und/oder sekretionsregulierenden Regionen des Endoxylanase II-Gens (exlA Gen) von Aspergillus niger var. awamori, vorliegend auf dem Plasmid pAW14B (Fig. 3), das in einem transformierten E. coli-Stamm 314109 vorliegt, der beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, unter der Nummer CBS 237.90 am 31. Mai 1990 hinterlegt worden ist und (2) funktionellen Derivaten davon, die auch eine expressions- und/oder sekretionsregulierende Aktivität aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die ausgewählte expressionsregulierende Region ein Promotor und der Vektor umfaßt ein Gen, das für das Protein unter der Kontrolle des Promotors kodiert, wobei letzterer ausgewählt ist aus (1) dem Promotor des Endoxylanase II-Gens (exlA Gen) von Aspergillus niger var. awamori, vorliegend auf dem Plasmid pAW14B (Fig. 3), das in einem transformierten E. coli-Stamm JM109 vorliegt, der beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, unter der Nummer CBS 237.90 am 31. Mai 1990 hinterlegt worden ist und (2) funktionellen Derivaten davon, die ebenfalls Promotoraktivität aufweisen. Stärker bevorzugt ist der Promotor gleich dem am 5'-Teil stromaufwärts des exlA-Gens vorliegenden Promotor, der eine Größe von etwa 2,5 kb aufweist und zwischen der SalI Restriktionsstelle an Position 0 und dem Startkodon ATG des exlA-Gens im Plasmid pAW14B lokalisiert ist, insbesondere umfaßt der Promotor mindestens die Polynukleotidsequenzen 1- 350 gemäß Fig. 1.
Dieser Promotor kann durch Weizenkleie, Xylan, Xylose oder eine Mischung oder jede Kombination daraus induziert werden, die in einem Medium vorliegt, in dem der transformierte Schimmelpilz inkubiert wird, wobei die Verwendung von Xylose als Induktionsmittel bevorzugt ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die ausgewählte expressionsregulierende Region ein Terminator, und der Vektor umfaßt ein das Protein kodierendes Gen, gefolgt von dem Terminator, wobei der letztgenannte ausgewählt ist aus (1) dem Terminator des Endoxylanase II-Gens (exlA Gen) von Aspergillus niger var. awamori, vorliegend auf dem Plasmid pAW14B (Fig. 3), das in einem transformierten E. coli-Stamm JM109 vorliegt, der beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, unter der Nummer CBS 237.90 am 31. Mai 1990 hinterlegt worden ist und (2) funktionellen Derivaten davon, die ebenfalls Terminatoraktivität aufweisen. Vorzugsweise ist der Termintor gleich dem auf dem 3' Teil stromabwärts des exlA-Gens vorliegenden Terminator, mit einer Größe von etwa 1,0 kb unmittelbar stromabwärts des Stoppkodons (TAA) des exlA-Gens im Plasmid pAW14B lokalisiert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung und Sekretion eines anderen Proteins als dem Endoxylanase Typ II Protein aus Aspergillus niger var. awamori durch einen transformierten Schimmelpilz, wobei in dem Verfahren die ausgewählte sekretionsregulierende Region eine für eine Signalsequenz kodierende DNA-Sequenz ist und der Vektor ein Gen umfaßt, das für das Protein kodiert, dem die die Signalsequenz kodierende DNA-Sequenz vorangeht, wobei letztgenannte ausgewählt ist aus (1) der DNA-Sequenz, die die Signalsequenz des Endoxylanase II-Gens (exlA-Gens) von Aspergillus niger var. awamori kodiert (Fig. 3), vorliegend auf dem Plasmid pAW14B, das in einem transformierten E. coli-Stamm JM109 vorliegt, der beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, unter der Nummer CBS 237.90 am 31. Mai 1990 hinterlegt worden ist und (2) funktionellen Derivaten davon, die ebenfalls die Sekretion des Proteins steuern. Vorzugsweise geht dem das Protein kodierenden Gen (1) auch mindestens ein essentieller Teil der DNA- Sequenz (2) voraus, die das reife Endoxylanase II-Protein kodiert, wobei die DNA-Sequenz (2) zwischen der eine Signalsequenz (3) kodierenden DNA-Sequenz und dem Gen (1) vorliegt.
Eine bevorzugte Signalsequenz ist die durch die Polynukleotide 351-431 der in Fig. 1 angegebenen DNA-Sequenz kodierte Signalsequenz, wobei das Polynukleotid der DNA-Sequenz in Plasmid pAW14B DNA-Sequenz vorausgeht, die das reife exlA Polypeptid kodiert.
Zusammenfassend kann in einem Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins der zur Transformation eines Schimmelpilzes verwendete Vektor einen exlA-abgeleiteten Promotor, wie vorstehend beschrieben, oder einen exlA-abgeleiteten Terminator, wie vorstehend beschrieben, oder eine exlAabgeleitete Signalsequenz, wie vorstehend beschrieben, oder zumindest einen essentiellen Teil des exlA-Strukturgens oder jede Kombination dieser expressions- und/oder sekretionsregulierenden Regionen umfassen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele verdeutlicht, ohne daß sie auf diese eingeschränkt ist. Alle zur Manipulation und Analyse von Nukleinsäurematerialien verwendeten Techniken wurden im wesentlichen ausgeführt, wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben, wenn nicht anders angezeigt.

Beispiel 1 Klonieren und Charakterisieren des Endoxylanase II-Gens (exlA) und assoziierte Regulationssequenzen von Aspergillus niger var. awamori

1.1. Isolierung des Aspergillus niger var. awamori exlA- Gens

Zur Isolierung des exlA-Gens aus chromosomaler DNA von Aspergillus niger var. awamori wurden verschiedene Sonden synthetisiert, die aus Mischungen von Polynukleotiden bestehen (Tabelle A). Die Zusammensetzung dieser Mischungen wurde von der N-terminalen Aminosäuresequenz von gereinigtem Endoxylanase II-Protein abgeleitet.
Durch Southern blot-Analyse wurde festgestellt, daß in Verdauen chromosomaler DNA - unter stringenten Bedingungenb - nur eine Bande mit den verwendeten Sonden hybridisiert. In EcoRI, SalI und BamHI Verdau von Aspergillus niger var. awamori DNA hybridisiert eine Bande von 4,4 bzw. 5,3 bzw. 9,5 kb mit Xyl01, Xyl04 und Xyl06. Mit Xyl05 wurde bei 41ºC kein klares Signal gefunden. Auf Basis dieses Ergebnisses wurde eine Genbank von Aspergillus niger var. awamori DNA-bei 65ºC mit der Oligonukleotidmischung Xyl06 als Sonde hybridisiert. Von den 65000 getesteten Plaques (entsprechend dem 32-fachen des Genoms) hybridisierten 3 Plaques (Lambda 1, 14 und 63) mit dieser Sonde. Nach Hybridisierung von Verdauen von Lambda 1 und Lambda 14 DNA mit Xyl06 wurde eine hybridisierende Bande von > 10 kb im EcoRI Verdau von Lambda 1 gefunden. Die Größe der Hybridisierungsbande in dem Lambda 14 und dem chromosomalen EcoRI Verdau betrug 4,4 kb. Im SalI Verdau von Lambda 1 hybridisiert eine 4,4 kb Bande, im SalI Verdau von Lambda 14 ist es, wie in chromosomaler DNA, eine 5,3 kb Bande. Auch ein 1,2 kb PstI-BamHI-Fragment (Fig. 2) hybridisiert mit Xyl06. Auf Basis des Restriktionsmusters mit verschiedenen Enzymen und der Kreuzhybridisierung von Lambda 1 und Lambda 14 Verdauen mit dem 5,3 kb SalI-Fragment von Lambda 14 wurde bestätigt, daß diese Lambdas überlappende Fragmente des Genoms von Aspergillus niger var. awamori enthalten. Darüber hinaus bestätigte die homologe Hybridisierung von gesamter induzierter RNA mit Lambda 1, bzw. Lambda 14 bzw. dem 5,3 kb SalI-Fragment von Lambda 14 die Gegenwart der exlA-Sequenzen in diesen Lambdas. Man fand Hybridisierung mit einer Xylan-induzierten MRNA von etwa 1 kb. Deren Größe entspricht der des mit Xyl06 hybridisierenden mRNA-Moleküls. Tabelle A Von der N-terminalen Aminosäuresequenz des Endoxylanase II-Proteins abgeleitete Sonden Aminosäuresequenz
Die Anzahl der in den "gemischten" Sonden vorliegenden Oligonukleotide ist in Klammern angegeben; diese Anzahl wird durch Einbeziehen von 1, 2, 3 oder 4 verschiedenen Basen in jeder dritten Position erhalten, abhängig von der Anzahl der Kodons für eine Aminosäure. In Xyl04 wurde auf Basis der Hybridisierung G-C und G-T und/oder auf Basis der bevorzugten Kodons in Aspergillus niger Glucoamylase ein G ausgewählt. In Xyl05 und Xyl06 wurden nicht alle möglicherweise vorkommenden Basen an der dritten Position des Kodons eingefügt, um nicht mehr als 256 Oligonukleotide in der Mischung zu erhalten. Die Sequenz der Oligonukleotide ist zu der des kodierenden Stranges komplementär.
Xyl01: Eine Mischung von 256 Oligos mit einer Länge von 23 Desoxynukleotiden der Sequenz, die zu dem Teil des kodierenden Stranges komplementär ist, der für die Aminosäuren 5 bis 12 kodiert.
Xyl04: Ein Oligo mit einer Länge von 47 Desoxynukleotiden der Sequenz, die zu dem Teil des kodierenden Stranges komplementär ist, der für die Aminosäuren 2 bis 17 kodiert.
Xyl05: Eine Mischung von 144 Oligos mit einer Länge von 23 Desoxynukleotiden der Sequenz, die zu dem Teil des kodierenden Stranges komplementär ist, der für die Aminosäuren 10 bis 17 kodiert.
Xyl06: Eine Mischung von 256 Oligos mit einer Länge von 47 Desoxynukleotiden der Sequenz, die zu dem Teil des kodierenden Stranges komplementär ist, der für die Aminosäuren 2 bis 17 kodiert.

1. 2. Subklonieren des Aspergillus niger var. awamori Gens

Die mit Lambda 1 (4,6 kb) bzw. Lambda 14 (5,3 kb) hybridisierenden SalI-Fragmente wurden in zwei Orientierungen in die SalI-Stelle von pUC19 kloniert, was zu dem Plasmid pAWl (A und B) bzw. dem Plasmid pAW14 (A und B, s. Fig. 3) führte. Das mit Xyl06 hybridisierende 1,2 kb PstI*-BamHI- Fragment und das angrenzende 1,0 kb BemHI-PstI-Fragment von pAW14A bzw. pAW1A wurde in die mit BamHI und PstI geschnittenen M13mp18 und M13mp19 subkloniert, was zu den m18/m19AW-Vektoren von Tabelle B führt.

Tabelle B Einzelsträngige Subklone von Lambda 1 und Lambda 14 Fragmenten

Fragment resultierende Vektoren

pAW1ABamHI-PsrIz*(1.2 kb) m18AW1A-1/m19AW1A-1
pAW14ABamHI-PstI*(1.2 kb) m18AW14A-1/mI9AW14A-1
pAW1APstI-BamHI(1.0 kb) m18AW1A-2/m19AW1AW1A-2
pAW14APstI-BamHI(1.0 kb) m18AW14A-2/m19AW14A-2

1. 3 Bestimmung der Transkriptionsrichtung des exlA-Gens

Die Transkriptionsrichtung des exlA-Gens wurde durch Spot-Blot Hybridisierung von ss-DNA von m18AW14A-1 und m19AW14A-1 mit Xyl06 bestimmt. Man fand heraus, daß ss-DNA von m19AW14A-1 (5'-PstI*-BamHI-3') mit dieser Sonde hybridisiert. Da die Sequenz von Xyl06 gleich dem nicht kodierenden Strang ist, enthält m19AW14A-1 den kodierenden Strang. Auf Basis dessen wurde die in Fig. 2 gezeigte Transkriptionsrichtung bestimmt. Diese Richtung wird durch Ergebnisse eines Primer-Extensions-Experiments bestätigt.

1. 4 Identifikation des exlA-Gens

Die DNA-Sequenz eines Teiles der Promotorregion wurde mit Xyl06 als Primer (5-Teil des Gens) durch Sequenzanalyse von pAW14B bestimmt. In dieser Region wurde ein Primer Xyl11 (s. Tabelle E) ausgewählt, mit dem die DNA-Sequenz des komplementären Stranges von m18AW14A-1 und m18AW1A-1 bestimmt wurde. Die Ergebnisse zeigten, daß diese Vektoren eine DNA- Sequenz enthielten, die im wesentlichen zu der von Xyl06 gleich war, während die von der Basenpaarsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des reifen Endoxylanase II-Proteins identisch war. Daher ist das Klonieren von zumindest dem 5'-Ende des exlA Gens bewiesen worden. Die Gegenwart des gesamten exlA Gens in den Vektoren pAW14 und pAW1 erschien auf Basis der Position des 5'-Endes des Gens auf den SalI-Fragmenten (Fig. 2) und der Größe der exlA mRNA (ca. 1 kb) plausibel.

1. 5 Sequenzanalyse

Die Nukleotidsequenz des exlA Gens und der umgebenden Regionen wurde sowohl im m13AW14 als auch m13AW1 Subklon in zwei Richtungen durch das Didesoxy-Verfahren (Sanger et al. 1977) bestimmt. Die Sequenz um die stromabwärts von der PstI*-Seite lokalisierte BamHI-Seite (Fig. 2) wurde durch Sequenzanalyse von doppelsträngiger pAW14- und pAW1-DNA bestimmt. Kompressionen wurden durch Verwendung von dITP anstelle von dGTP aufgeklärt. Es wurde eine identische exlA- Sequenz in den unabhängigen Klonen Lambda 1 und Lambda 14 etabliert. Die vollständige Nukleotidsequenz des 2,1 kb PstI*-PstI-Fragments, das das gesamte Prä-Pro-Endoxylanase II-Gen und die Promotor- und Terminatorsequenzen des Endoxylanase II-Gens umfaßt, ist in Fig. 1 gezeigt. Dem reifen Endoxylanase II-Protein geht ein Leitpeptid von 27 Aminosäuren voraus. Eine vorhergesagte Erkennungsstelle für die Signalpeptidase liegt zwischen den Alaninresten an den Positionen 16 und 17 vor (..-T-A-F-A-↓-A-P-V-..) (Van Heijne, 1986). Aus der Länge des Leitpeptids kann abgeleitet werden, daß in dem Protein eine zweite Prozessierungsstelle vorliegt. Die Spaltung der Bindungen zwischen Arg (27) und Ser (28) wird vermutlich durch eine KEX2-ähnliche Endoprotease ausgeführt (Fuller et al., 1988).

1.6 Lokalisierung des Introns

In dem exlA Gen wurde auf Basis des Vorliegens von Sequenzen, die "Donor"- und "Acceptor"-Stellen von Introns in Aspergilli entsprechen, das Vorliegen eines Introns von entweder 49 oder 76 bp (581-629 oder 581-656, s. Fig. 1) vorhergesagt. Es wurde ein definitiver Nachweis der Abwesenheit der 76 bp Introns durch Isolierung eines von Endoxylanase II abgeleiteten Peptids mit der Sequenz Tyr-Ser-Ala-Ser-Gly... erhalten. Dieses Peptid kann nur in dem Protein lokalisiert sein, das mit der Nukleotidposition 652 beginnt (s. Fig. 1). Das exlA Gen umfaßt daher ein einzelnes 49 bp Intron (Position 581-629, s. Fig. 1).

1.7 Bestimmung des 3'-Endes des exlA Gens

Die Position des Stoppkodons des exlA Gens (Position 1033-1035 in Fig. 1) wurde von DNA-Sequenzdaten abgeleitet. Dieses Stoppkodon wurde bestätigt, da es sich zeigten daß die Aminosäuresequenz von einem der durch chemische Spaltung mit CNBr von Endoxylanase II abgeleiteten Peptide mit der C- terminalen Aminosäuresequenz identisch ist, die von DNA- Sequenzdaten abgeleitet wurde (Position 991-1032 in Fig. 1).

1.8 Evaluation von DNA und Proteindaten

Aufgrund der oben angegebenen Daten wurde festgestellt, daß das für Endoxylanase II von Aspergillus niger var. awamori kodierende Gen auf einen 5,3 kb SalI-Fragment kloniert worden war. Die DNA-Sequenz des Gens, die Position des Introns und die Länge der MRNA wurden festgestellt. Die festgestellte N-terminale Aminosäuresequenz des reifen Proteins wurde durch die DNA-Sequenz vollständig bestätigt. Auf Grundlage der oben genannten Daten kann geschlossen werden, daß das exlA Gen für ein Protein von 211 Aminosäuren kodiert und daß die ersten 27 Aminosäuren post-translational entfernt werden. Aus diesen Daten wurde die exlA-Signalsequenz abgeleitet.
Ebenso folgt die Nukleotidsequenz des exlA-Promotors aus der erhaltenen Sequenz (s. Fig. 1, Position 1-350). Ebenso folgt die Nukleotidsequenz des exlA-Terminators aus der erhaltenen Sequenz (s. Fig. 1, Position 1036-2059 oder ein Teil davon).

Beispiel 2 Expression des Escherichia coli β-Glucuronidase (uidA)-Gens unter Verwendung der exlA- Promotor- und Terminatorsequenzen

2.1 Konstruktion des uidA-Expressionsvektor

Das uidA-Expressionsplasmid (pAW15-1) wurde ausgehend vom Plasmid pAW14B konstruiert, das ein etwa 5,3 kb SalI-Fragment enthält, auf dem ein 0,7 kb Endoxylanase II (exlA)-Gen lokalisiert ist, zusammen mit 2,5 kb der 5'-flankierenden Sequenzen und 2,0 kb der 3'-flankierenden Sequenzen (Fig. 3). In pAW14B wurde die exlA-kodierende Region durch die uidA- kodierende Region ersetzt. Eine das erste Kodon (ATG) des exlA Gens umfassende BspHI-Stelle (5'-TCATGA-3') und eine das Stoppkodon (TAA) des exlA Gens umfassende AflII-Stelle (5'- CTTAAG-3') ermöglichte die Konstruktion von pAW15-1.
Die Konstruktion wurde wie folgt ausgeführt: pAW14B (7,9 kb) wurde partiell mit BspHI geschnitten (pAW14B enthält 5 BspHI-Stellen), und das linearisierte Plasmid (7,9 kb) wurde aus einem Agarosegel isoliert. Anschließend wurde das isolierte 7,9 kb-Fragment mit BsmI geschnitten, das einige Nukleotide stromabwärts der interessierenden BspHI-Stelle schneidet, um an den anderen BspHI-Stellen linearisierte Plasmide zu entfernen. Die Fragmente wurden auf einem Agarosegel separiert, und das 7,9 kb BspHI-BsmI-Fragment wurde isoliert. Dieses wurde partiell mit AflII geschnitten, und das resultierende 7,2 kb BspHI-AflII-Fragment wurde isoliert. Das uidA-Gen wurde aus einem 1,9 kb NcoI-AflII-Fragment aus pNOM-AflII isoliert, einem von pNOM102 abgeleiteten Plasmid (Roberts et al., 1989). In pNOM102 liegen zwei NcoI-Stellen vor, von denen eine am 5'-Ende des uidA-Gens lokalisiert ist und das ATG-Startkodon für die Translation des Gens umfaßt. Die zweite NcoI-Stelle ist einige Nukleotide stromabwärts des Stoppkodons lokalisiert. Um eine AflII-Stelle stromabwärts des uidA-Stoppkodons zu erhalten, wurde die letztgenannte NcoI-Stelle in eine AflII-Stelle umgewandelt: pNOM102 wurde partiell mit Ncol geschnitten und mit einem NcoI-AflII-Verbindungsstück (NcoI-AflII, s. Tabelle E) ligiert, was zu dem Vektor pNOM-AflII führte. Das 7,2 kb BspHI-AflII-Fragment von pAW14B wurde mit dem 1,9 kb NcoI-AflII-Fragment von pNOM- AflII ligiert, um den Vektor pAW15-1 zu ergeben (Fig. 4).
Der konstruierte Vektor (pAW15-1) kann anschließend durch konventionelle Co-Transformationstechniken in Schimmelpilze (z. B. Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus nidulans, usw.) transferiert werden und die β- Glucuronidase kann dann durch Induktion des Endoxylanase II- Promotors exprimiert werden. Der konstruierte Vektor kann auch mit konventionellen Selektionsmarkern ausgestattet werden (z. B. amdS oder pyrG, Hygromycin, etc.) und der Schimmelpilz kann mit dem resultierenden Vektor tranformiert werden, um das erwünschte Protein zu produzieren. Als ein Beispiel wurde der E. coli Hygromycinselektionsmarker in den uidA-Expressionsvektor eingeführt, was zu pAW15-7 führte (Fig. 4). Zu diesem Zwecke wurde ein das E. coli Hygromycinresistenzgen unter der Kontrolle des Aspergillus nidulans gpdA-Promotors und des Aspergillus nidulans trpc-Terminators enthaltendes Fragment verwendet. Diese Kassette wurde als 2,6 kb NotI- Fragment aus pBluekan7-1 isoliert, in dem die Hygromycinresistenzkassette durch NotI-Stellen flankiert ist. In pAW15-1 wurde eine NotI-Stelle durch Umwandlung der EcoRI-Stelle (1,2 kb stromaufwärts des ATG-Kodons vorliegend) unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids (Eco-Not, s. Tabelle E) in eine NotI-Stelle erzeugt, was zu pAW15-1-Not führte. Das 2,6 kb NotI-Fragment von pAWBluekan7-1 wurde isoliert und mit NotI-linearisiertem pAW15-1-Not ligiert. Der resultierende Vektor wurde pAW15-7 genannt (Fig. 5).

2.2 Herstellung von E. coli β-Glucuronidase, ausgelöst durch exlA-Expressionsignale

pAW15-7 wurde zum Transformieren von Aspergillus niger var. awamori verwendet. Der Transformant AW15.7-1 wurde durch Hygromycinselektion identifiziert und durch Southern-Hybridisierungsanalyse der genomischen DNA dieses Transformanten wurde festgestellt, daß dieser Transformant eine einzelne Kopie des uidA-Gens enthält.
Aspergillus niger var. awamori (AW) und der Transformant AW15.7-1 wurden unter den folgenden Bedingungen aufgezogen: Schüttelkolben (500 ml) mit 200 ml synthetischen Media (pH 6,5) wurden mit Sporen inokuliert (Endkonzentration: 10E6/ml). Das Medium hatte die folgende Zusammensetzung (AW-Medium)
Die Inkubation erfolgte bei 30ºC, 200 U/min für 24 Stunden in einem Mk X-Inkubationsschüttler. Nach dem Anwachsen wurden die Zellen durch Filtration (0,45 um-Filter) entfernt, zweimal mit AW-Medium ohne Saccharose und Hefeextrakt (Salzlösung) gewaschen, in 50 ml Salzlösung resuspendiert und in 300 ml Schüttelkolben mit 50 ml Salzlösung transferiert, zu der Xylose auf eine Endkonzentration von 10 g/l (Induktionsmedium) zugegeben worden ist. Der Augenblick der Resuspension wird als "t = 0" bezeichnet (Induktionsstart). Die Induktion erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben. Die Proben wurden 15 und 22 Stunden nach der Induktion genommen. Die Biomasse wurde durch Filtration über Stoff gewonnen, durch Ausdrücken getrocknet und sofort in flüssigem Stickstoff gefroren. Das Mycelium wurde durch Mahlen des gefrorenen Myceliums zerstört und die β-Glucuronidaseaktivität wurde im wesentlichen, wie in Roberts et al. (1989) beschrieben, bestimmt.
Aus Tabelle C wird klar, daß der exlA-Promotor durch die Anwesenheit von Xylose spezifisch induziert wird und daß der exlA-Promotor und -Terminator zur Herstellung von E. coli β- Glucuronidase im Transformanten AW15.7-1 verwendet werden kann. Tabelle C β-Glucuronidaseproduktion
Transformanten wurden auf synthetischem Medium, wie im Text angegeben, für 24 Stunden angezogen und bei t = 0, wie im Text angegeben, in Induktionsmedium transferiert. Die β-Glucuronidaseaktivität im Mycelium wurde, wie im Text beschrieben, bestimmt und in willkürlichen Einheiten der Enzymaktivität pro mg Gesamtprotein ausgedrückt.

Beispiel 3 Produktion und Sekretion von Thermomyces lanuginosa Lipase unter Verwendung des/der exlA-Promotors,-Signalsequenz und Terminators

3.1 Konstruktion von Expressionsplasmiden auf Grundlage des exlA-Expressionssignals

3.1.1 Vektor

Das Plasmid pAW14A-Not war der Ausgangsvektor für die Konstruktion einer Serie von Expressionsplasmiden, die die exlA-Expressionssignale und das für die Thermomyces lanuginosa Lipase kodierende Gen enthalten. Das Plasmid pAW14A umfaßt ein chromosomales 5 kb SalI-Fragment aus Aspergillus niger var. awamori, auf dem das 0,7 kb exlA Gen lokalisiert ist, zusammen mit 2,5 kb der 5'-flankierenden Sequenzen und 2,0 kb der 3'-flankierenden Sequenzen (ähnlich dem pAW14B, s. Fig. 3). In pAW14A wurde die von dem pUC19- Polylinker stammende EcoRI-Stelle durch Insertion eines synthetischen Oligonukleotids (Eco-Not, s. Tabelle E) in eine NotI-Stelle umgewandelt, was zu pAW14A-Not führte.
Ausgehend von pAW14A-Not wurden Konstrukte hergestellt, in denen der exlA-Promotor (2,5 kb) mit dem Translationsinitiationskodon (ATG) des Thermomyces lanuginosa Lipase-Gens fusioniert worden ist. Es wurden auch Konstrukte hergestellt, in denen der exlA-Promotor und die für die ersten 27 Aminosäuren des exlA-Proteins kodierende DNA-Sequenz, die die Prä-Pro-Sequenz darstellt, mit den für das reife Lipasepolypeptid kodierenden Sequenzen fusioniert worden ist.
In beiden Serien der Expressionsvektoren wurde der exlA- Transkriptionsterminator verwendet.
Die folgenden Vektorfragmente wurden aus pAW14A-Not isoliert und für die Konstruktionen verwendet.
- Für die Fusion mit dem Translationsinitiationskodon der Lipase wurde ein 7,2 kb BspHI-AflII-Fragment aus pAW14A-Not isoliert. Dies ist ein zu dem für die Konstruktion von pAW15-1 isolierten (sh. Beispiel 2) ähnliches Fragment, und es wurde essentiell durch den gleichen Ansatz isoliert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Das Fragment enthält 2,5 kb Nukleotidsequenzen, die den exlA-Promotor bis zur BspHI-Stelle umfassen, die das ATG Kodon einschließt, und 2,0 kb Nukleotidsequenzen, die den exlA-Transkriptionsterminator beginnend mit der AflII-Stelle umfassen, die das Stoppkodon einschließt.
- Für die Fusion des exlA-Promotors und der das exlA-Prä-Pro-Peptid kodierenden Region (die ersten 27 Aminosäuren des exlA Gens) mit der kodierenden Region des reifen Lipasepolypeptids wurde ein teilverdautes 7,2 kb NruI-AflII- Fragment aus pAW14A-Not isoliert. Dieses Fragment enthält 2,5 kb Nukleotidsequenzen, die den exlA-Promotor und die kodierende Sequenz der ersten 26 Aminosäuren des exlA-Proteins (Prä-Pro-Sequenz) umfassen, das mit einer NruI-Stelle endet, so dass nur eine Aminosäure der exlA-Prosequenz fehlt. Darüber hinaus umfaßt das Fragment 2 kb Nukleotidsequenzen, die den exlA-Transkriptionsterminator umfassen, beginnenden mit der AflII-Stelle.
Das Thermomyces lanuginosa Lipase-Gen wurde aus dem Vektor pTL-1 isoliert, der eine 0,9 kb kodierende Region des Lipase-Gens umfaßt (Fig. 9), flankiert durch den Aspergillus niger glaA-Promotor und den Aspergillus nidulans trpC- Transkriptionsterminator (Fig. 8).

3.1.2. Fusion des Lipase-Gens mit der exlA Transkriptionsterminatorsequenz

Um eine Fusion des exlA-Transkriptionsterminators mit dem Lipase-Gen zu erhalten, wurde eine AflII-Stelle unmittelbar stromabwärts des Stoppkodons des Lipase-Gens erzeugt. In pTLla liegt eine HindIII-Stelle 5 Basenpaare stromabwärts des Stoppkodons des Lipase-Gens vor (Figur en 8 und 9), in der eine AflII-Stelle unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids erzeugt wurde. Die Konstruktion wurde wie folgt ausgeführt:
pTL-1 wurde mit HindIII unter Erzeugung eines 8,3 kb Fragmentes geschnitten, das aus einem Agarosegel isoliert und mit dem Oligonukleotid Hind-Afl (sh. Tabelle E) ligiert wurde. Im resultierenden Vektor pTL1-AflII ist die HindIII-Stelle verschwunden und eine AflII-Stelle ist unmittelbar stromabwärts des Stoppkodons des Lipase-Gens erzeugt worden, wodurch das Lipase-Gen zur Fusion mit dem exlA-Terminator an der AflII-Stelle hergestellt worden ist.

3.1.3. Fusion des exlA-Promotors mit dem Lipase-Gen (ATG- Fusion)

Als Startvektor wurde pTL1-AflII verwendet, um ein das Lipase-Gen umfassendes DNA-Fragment zu isolieren. Um das Lipase-Gen mit dem exlA-Promotor zu fusionieren, wurde die das ATG-Kodon (ATATGA) umfassende Region der Lipase in eine BspHI-Stelle (TCATGA) umgewandelt. Diese Stelle umfaßt immer noch die korrekte kodierende Sequenz des Lipase-Gens. Zu diesem Zweck wurde ein sythetisches DNA-Fragment verwendet, das aus den miteinander vereinigten (annealten) Oligonukleotiden BTFF09 und BTFF10 (sh. Tabelle E) besteht. Dieses synthetische Fragement enthält eine XhoI-Stelle zum Klonieren, gefolgt von einer BspHI-Stelle, die das ATG-Kodon und die nächsten 7 Basenpaare des Lipase-Gens bis zur SacI- Stelle umfaßt. Der Vektor pTL1-AflII wurde durch partiellen Verdau mit XhoI linearisiert, gefolgt durch Schneiden mit SacI, das nach Position +10 des das Lipase-Prä-Pro-Polypeptid kodierenden offenen Leserasters schneidet. Das 6,3 kb XhoI- SacI-Vektor-Fragment (resultierend aus einem Schnitt an der XhoI-Stelle im glaA-Promotor unter Belassung der internen XhoI-Stelle im Lipase-Gen (sh. Fig. 8) wurde aus einem Agarosagel isoliert und unter Erzeugung des Vektors pTLI-XS mit dem synthetischen XhoI-SacI-Fragment ligiert. Aus pTLI-XS wurde ein das Lipase-Gen umfassendes 0,9 kb BspHI-AflII- Fragment isoliert und unter Erzeugung des Expressionsvektors pAWTL-1 mit dem 7,2 kb BspHI-AflII-Fragment des pAW14A-Not ligiert (Fig. 6).

3.1.4. Fusion des exlA-Promotors und der die exlA-Prä- Pro-Sequenz kodierenden Region mit der kodierenden Sequenz des reifen Lipase-Proteins

Als Startvektor wurde pTL1-AflII verwendet, um ein das Lipase-Gen umfassendes DNA-Fragment zu isolieren. Um eine korrekte Fusion der das reife Lipasepolypeptid kodierenden Sequenz mit der exlA-Promotorsequenz und der das exlA- Verlaufpeptid kodierenden Sequenz zu erhalten, wurde ein synthetisches DNA-Fragment verwendet, das aus den Oligonukleotiden BTFF05 und BTFF06 (sh. Tabelle E) miteinander vereinigt (annealt) besteht. Dieses synthetische Fragment umfaßt Sequenzen, die die letzten Aminosäuren der exlA-Prä-Pro-Sequenz fusioniert mit den ersten 12 Kodons der reifen Lipase kodierenden Sequenz kodiert. Es enthält eine XhoI-Stelle zum klonieren und eine NruI-Stelle, die mindestens 3 Basenpaare der exlA-Prosequenz umfaßt. Das Fragment endet mit einer BglII-Stelle. Der Vektor pTL1-AflII wurde durch partiellen Verdau mit XhoI linearisiert, gefolgt von Schneiden mit BglII, das gerade innerhalb der für die reife Lipase kodierenden Region schneidet. Das 6,3 kb XhoI- BglII-Vektor-Fragment (resultierend aus einem Schnitt an der XhoI-Stelle im glaA-Promotor unter Belassung der internen XhoI-Stelle im Lipase-Gen, sh. Fig. 8, wurde aus einem Agarosagel isoliert und unter Erzeugung von pTL1-XB mit dem synthetischen XhoI-BglII-Fragment ligiert. Aus PTL1-XB wurde ein 0,83 kb NruI-AflII-Fragment isoliert, das die letzten drei Basenpaare der exlA-Prosequenz gefolgt von der das reife Lipase-Polypeptid bis zu AflII-Stelle unmittelbar hinter den Stoppkodon beginnenden Sequenz (sh. Beispiel 2) enthält. Dieses Fragment wurde zur Erzeugung des Expressionsvektors pAWTL2 (Fig. 7) mit dem 7,2 kb NruI-AflII-Fragment von pAW14A-Not ligiert.

3.2. Produktion und Sekretion von Thermomyces lanuginosa Lipase unter Verwendung des exlA-Promotors und Terminators

Die konstruierten Expressionsvektoren (pAWTL1 und pAWTL2) können anschließend durch konventionelle Kotransformationstechniken in Schimmelpilze transferiert werden (z. B. Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus nidulans etc.), und die Lipase kann dann durch Induktion des Endoxylanase II-Promotors exprimiert werden. Der konstruierte Vektor kann auch mit konventionellen Selektionsmarkern versehen werden (z. B. amdS oder pyrG, Hygromycin etc.), und der Schimmelpilz kann mit dem resultierenden Vektor transformiert werden, um das gewünschte Protein zu erzeugen, im wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben. Als Beispiel wurden Plasmide von pAWTL1 und pAWTL2 durch Einführen eines Aspergillus niger var. awamori pyrG-Gens abgeleitet und die resultierenden Plasmide wurden in den Stamm AWPYR eingeführt, einen vom Stamm CBS 115.52 (ATTCC 11385) abgeleiteten Aspergillus niger var. awamori Stamm in dem das pyrG-Gen unterbrochen worden ist. Auf diesem Weg wurde der Transformant AWLPL1-2 unter Verwendung des pAWTL1-Plasmids abgeleitet, während der Transformant AWLPL2-2 ausgehend vom pAWTL2- Plasmid abgeleitet wurde.
Der Transformant AWLPL1-2 (enthaltend die reife Thermomyces lanuginosa Lipase kodierende Region mit der Thermomyces lanuginosa Signalsequenz unter Kontrolle des Aspergillus niger var. awamori exlA-Promotors und Terminators) und der Transformant AWLPL2-2 (enthaltend die reife Thermomyces lanugiosa Lipase kodierende Region mit der Endoxylanase Signalsequenz unter der Kontrolle des Aspergillus niger var. awamori exlA-Promotors und Terminators) wurden in Schüttelkolben in AW-Medium, wie in Beispiel 2 beschrieben, angezogen. Die Inkubation erfolgte für 24 Stunden bei 30ºC und 200 U/min in einem Mk X Schüttelinkubator. Nach dem Anziehen wurden die Zellen durch Filtration (0,45 um Filter) gesammelt, zweifach mit AW-Medium ohne Saccharose und Hefeextrakt (Salzlösung) gewaschen, in 50 ml Salzlösung resuspendiert und in 300 ml Schüttelkolben transferiert, die 50 ml Salzlösung enthielten, der Xylose bis zu einer Endkonzentration von 10 g/l zugesetzt worden ist (Induktionsmedium). Der Moment der Resuspension wird als "t = 0" bezeichnet (Beginn der Induktion). Die Inkubation erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben. Proben wurden 15,22 und 39 Stunden nach der Induktion genommen. Die Proben wurden zum Entfernen der Biomasse über Stoff filtriert und das Filtrat wurde durch titrimetische Untersuchung unter Verwendung von Olivenöl als Substrat auf Lipaseaktivität analysiert.
Für jede Probe wurden 100 und 200 ul Filtrat einer gerührten Mischung von 5,0 ml Lipasesubstrat (Sigma, enthaltend Olivenöl als Substrat für die Lipase) und 25 ml Puffer (5 mM Tris-HCL-pH 9,0, 40 mM NaCl, 20 mM CaCl&sub2;) zugegeben. Die Messung wurde bei 30ºC ausgeführt und die Abspaltung von Fettsäuren wurde durch automatisierte Titration mit 0,05 M NaOH auf pH 9,0 unter Verwendung eines Mettler DL25 Titrators gemessen. Es wurde eine Kurve der Titrantmenge gegenüber die Zeit erhalten. Die Stärke der in der Probe enthaltenen Lipaseaktivität wurde aus der maximalen Steigung dieser Probe berechnet. Eine Einheit der enzymatischen Aktivität wird als Enzymmenge definiert, die 1 umol Fettsäure aus Olivenöl in einer Minute unter den oben genannten Bedingungen abspaltet. Solche Bestimmungen sind dem Fachmann bekannt.
Die Ergebnisse werden in Tabelle D gezeigt. Anhand dieser Ergebnisse ist es offensichtlich, daß nach Induktion des exlA-Promotors durch Xylose funktionelle Lipase produziert und sekretiert wird und daß die exlA-Signalsequenz die Sekretion von heterologen Proteinen in Aspergillus niger var. awamori steuern kann. Tabelle D. Produktion und Sekretion von Lipase
Transformanten wurden wie im Text angegeben für 24 Stunden in synthetischem Medium angezogen und bei t = 0 wie im Text angegeben in Induktionsmedium transferiert. Die Lipaseaktivität wurde in dem Medium durch titrimetrische Bestimmung unter Verwendung von Olivenöl als Substrat bestimmt und in willkürlichen Einheiten der Lipaseaktivität ausgedrückt. A und B repräsentieren Doppelexperimente. Tabelle E. Nukleotidsequenzen von in Konstruktionen verwendeten Oligonukleotiden
Sequenzauflistungszahlen betreffen die im offizillen Format vorgegebene Auflistung.

Literaturzitate

- Fuller, R. S., Sterne, R. E. and Thorner J. (1988) Enzymes required for yeast prohormone processing. Ann. Rev. Physiol. 50, 345-362.
- von Heijne, G. (1986) A new method for preceding signal sequence cleavage sites. Nucl. Acids Res. 16, 4683- 4690.
- Roberts, N., Oliver, R. P., Punkt, P. J. und von den Hondel, C.A.M.J.J. (1989) Espression of the Escherichia coli β-glucuronidase gene in industrial and phytopathogenic filamentous fungi. Curr. Genet. 15, 177-180.
- Sambrook, J. Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning; A laboratory manual (2. Aufl.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
- Sanger, F., Nicklan, S. and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natlr. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.
- Ward, M., Wilson, L. J. Kodama, K. H., Rey, M. W. and Berka, R. M. (GENENCOR) (Mai 1990) Improved Production of Chymosin in Aspergillus by expression as a glucoamylasechymosin fusion. Bio/Technology 8, 435-440.
- CA-A-2024448 (ALLELIX BIOPHARMACE) "Recombinant DNA expression construct - containing promotor for use in Aspergillus", veröffentlicht am 1. März 1991.
- EP-A-0436858 (GREEN CROSS CORP.) "Promotor of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene - derived from Aspergillus orizae, used in new expression system in yellowgreen or black koji mould", veröffentlicht am 17. Juli 1991.
- EP-A-0439997 (CIBA GEIGY AG) "A. niger pyruvate kinase promotor - used to construct vectors for expression of structural genes in suitable hosts", veröffentlicht am 7. August 1991
- WO 91/19782 (UNILEVER) "Xylanase production", veröffentlicht am 26. Dezember 1991, also innerhalb des Prioritätsjahres.

Sequenzauflistungen

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder:
(A) Name: Unilever N. V.
(B) Straße: Weena 455
(C) Stadt: Rotterdam
(E) Land: Niederlande
(F) Postleitzahl: NL-3013 AL
(A) Name: Unilever PLC
(B) Straße: Unilever House Blackfriars
(C) Stadt: London
(E) Land: Vereinigtes Königreich
(F) Postleitzahl (ZIP): EC4P 4BQ
(ii) Titel der Erfindung: Verfahren zur Herstellung eines Proteins unter Verwendung eines Endoxylanase II (exlA) Expressionssignals
(iii) Anzahl der Sequenzen: 12
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Art des Mediums: Floppy disk
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebsystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(v) Augenblickliche Anmeldedaten:
Anmeldenummer:
(2) Information für Sequenz ID No.: 1
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 2059 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: Doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Anti-Sense: nein
(vi) Usprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Aspergillus niger var. awamori
(B) Stamm: CBS 115.52 (ATCC 11358)
(vii) Unmittelbare Quelle:
(B) Klon: pAW14B
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: intron
(B) Lokalisierung: 581..629
(C) Indentifizierungsverfahren: Experimentell
(D) andere Informationen: / Nachweis = Experimentell
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Promoter
(B) Lokalisierung: 1..350
(C) Indentifizierungsverfahren: Experimentell
(D) andere Informationen: / Nachweis = Experimentell
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Sig_Peptid
(B) Lokalisierung: 351..431
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Reif_Peptid
(B) Lokalisierung join (432..580, 630..1032)
(C) Indentifizierungsverfahren: Experimentell
(D) andere Informationen: /EC_Nummer = 3.2.1.8 / Produkt = "Endoxylanase II" / Nachweis = Experimentell / Gen = "exlA"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lokalisierung: join(351..580,630..1035)
(C) Indentifizierungsverfahren: Experimentell
(D) andere Informationen: /EC_Nummer = 3.2.1.8 / Produkt = "Prä-Pro-Endoxylanase II" / Nachweis = Experimentell / Gen = "exlA" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID No.: 1:
(2) Information für SEQ ID No.: 2:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 211 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID No.: 2:
(2) Information für SEQ ID No.: 3:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 886 Basepaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: Doppel
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lokalisierung: 1..876
(C) Indentifizierungsverfahren: Experimentell
(D) andere Informationen: / Produkt = "Thermomyces lanugiosa Prä-Pro-Lipase" / Nachweis = Experimentell
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Reif.-Peptid
(B) Lokalisierung: 67..873
(C) Indentifizierungsverfahren: Experimentell
(D) andere Informationen: / Produkt = "Thermomyces lanugiosa Lipase" / Nachweis = Experimentell (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID No.: 3:
(2) Information für SEQ ID No: 4:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 291 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 4:
(2) Information für SEQ ID No.: 5:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 23 Basepaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: Einzel
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 5:
(2) Information für SEQ ID No.: 6:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 23 Basepaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: einzel
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 6:
(2) Information für SEQ ID No.: 7:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 19 Basepaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: einzel
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 7:

Claims

1. Verfahren zur Herstellung und fakultativ zur Sekretion eines Proteins durch einen transformierten Schimmelpilz, in den mit Hilfe per se bekannter rekombinanter DNA-Techniken ein Expressionsvektor eingeführt worden ist, wobei der Vektor eine oder mehrere Schimmelpilz-abgeleitete expressions- und/oder sekretionsregulierende Regionen umfaßt, wobei mindestens eine der expressions- und/oder sekretionsregulierenden Regionen in dem Verfahren ausgewählt ist aus:

(1) den expressions- und/oder sekretionsregulierenden Regionen des Endoxylanase II-Gens (exlA Gen) von Aspergillus niger var. awamori, vorliegend auf dem Plasmid pAW14B (Fig. 3), das in einen transformierten E. coli-Stamm JM109 vorliegt, der beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, unter der Nummer CBS 237.90 am 31. Mai 1990 hinterlegt worden ist, und

(2) modifizierten Sequenzen daraus mit einer gleichen oder besseren regulatorischen Aktivität als die Nukleinsäuresequenz aus (1) und mit der Fähigkeit, mit der Nukleinsäuresequenz aus (1) zu hybridisieren.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die ausgewählte expressionsregulierende Region in dem Verfahren ein Promotor ist und der Vektor ein Gen umfaßt, das das Protein unter der Kontrolle des Promotors kodiert, wobei der letztgenannte ausgewählt ist aus:

(1) dem Promotor des Endoxylanase II-Gens (exlA Gen) von Aspergillus niger var. awamori, vorliegend auf dem Plasmid pAW14B (Fig. 3), das in einem transformierten E. coli-Stamm JM109 vorliegt, der beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, unter der Nummer CBS 237.90 am 31. Mai 1990 hinterlegt worden ist, und

(2) modifizierten Sequenzen daraus, die eine gleiche oder bessere regulatorische Aktivität aufweisen, als die Nukleinsäuresequenz aus (1) und die zum Hybridisieren mit der Nukleinsäuresequenz aus (1) fähig sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Promotor gleich ist zu dem auf dem 5'-Teil stromaufwärts des exlA Gens vorliegenden Promotor mit einer Größe von etwa 2,5 kb, lokalisiert zwischen der SalI-Restriktionsstelle auf Position 0 und dem Startkodon ATG des exlA Gens im Plasmid pAW14B.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Promotor mindestens die Polynukleotidsequenz 1-350 gemäß Fig. 1 umfaßt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Promotor durch Weizenkleie, Xylan oder Xylose oder eine Mischung oder irgendeine Kombination daraus induziert wird, vorliegend in einem Medium, in dem der transformierte Schimmelpilz inkubiert wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Promotor durch Xylose induziert wird, vorliegend in dem Medium, in dem der transformierte Schimmelpilz inkubiert wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in dem Verfahren die ausgewählte expressionsreguliernde Region ein Terminator ist und der Vektor ein Gen umfaßt, das das Protein kodiert, gefolgt durch den Terminator, wobei letzterer ausgewählt ist aus:

(1) dem Terminator des Endoxylanase II-Gens (exlA Gen) von Aspergillus niger var. awamori, vorliegend auf dem Plasmid pAW14B (Fig. 3), das in einem transformierten E. coli-Stamm JM109 vorliegt, der beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, unter der Nummer CBS 237.90 am 31. Mai 1990 hinterlegt worden ist, und

(2) modifizierten Sequenzen daraus mit einer zur Nukleinsäuresequenz aus (1) äquivalenten Terminatoraktivität, die zum Hybridisieren mit der Nukleinsäuresequenz aus (1) fähig sind.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Terminator gleich dem Terminator ist, der auf dem 3'-Teil stromabwärts des exlA Gens liegt, mit einer Größe von etwa 1,0 kb, lokalisiert unmittelbar stromabwärts des Stoppkodon (TAA) des exlA Gens im Plasmid pAW14B.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Vektor auch einen Promotor wie in Anspruch 2 beansprucht umfaßt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung und Sekretion eines Proteins durch einen transformierten Schimmelpilz, wobei die selektierte sekretionsregulierende Region eine eine Signalsequenz kodierende DNA-Sequenz ist und der Vektor ein Gen umfaßt, das das Protein kodiert und davor die Signalsequenz kodierende DNA-Sequenz, wobei die letztere ausgewählt ist aus:

(1) die die Signalsequenz des Endoxylanase II-Gens (exlA Gen) von Aspergillus niger var. awamori kodierende DNA-Sequenz, vorliegend auf dem Plasmid pAW14B (Fig. 3), das in einem transformierten E. coli-Stamm JM109 vorliegt, der beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, unter der Nummer CBS 237.90 am 31. Mai 1990 hinterlegt worden ist, und

(2) modifizierten Sequenzen daraus, die ebenfalls die Sekretion des Proteins regeln und die zum Hybridisieren mit der Nukleinsäuresequenz fähig sind.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei vor dem das Protein kodierenden Gen (1) auch mindestens ein essentieller Teil der DNA-Sequenz (2) liegt, die das reife Endoxylanase II-Protein kodiert, wobei die DNA-Sequenz (2) zwischen der die Signalsequenz (3) kodierenden DNA-Sequenz und dem Gen (1) liegt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Signalsequenz die durch die Polynukleotide 351-431 der in Fig. 1 angegebenen DNA-Sequenz kodierte Signalsequenz ist, wobei das Polynukleotid vor dem exlA Gen im Plasmid pAW14B liegt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der Vektor auch einen Promotor, wie in Anspruch 2 beansprucht, umfaßt oder einen Terminator, wie in Anspruch 7 beansprucht, oder beides.