DE69232197T2

DE69232197T2 - Klonierung und Expression von Genen, kodierend für Enzyme aus Pilzen, die Arabinan abbauen

Info

Publication number: DE69232197T2
Application number: DE69232197T
Authority: DE
Inventors: Peter Michael Andreoli; Janna Gardina Bakhuis; Yves Coutel; Leendert Hendrik De Graaff; Michel Johannes Anthonie Flipphi; Abraham Harder; Peter Van Der Veen; Margaretha Van Heuvel; Jacob Visser
Original assignee: DSM NV
Current assignee: Koninklijke DSM NV
Priority date: 1991-03-27
Filing date: 1992-03-20
Publication date: 2002-03-28
Anticipated expiration: 2012-03-21
Also published as: IE920964A1; DE69232197D1; NZ242124A; CA2084056A1; EP0506190B1; AU1575592A; FI925359L; PL296926A1; NO924576D0; ATE208821T1; WO1992017592A1; NO924576L; US5863783A; PL170943B1; AU651194B2; JPH06500022A; EP0506190A1; FI925359A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Klonierung und die Expression von Genen, welche für aus einem Pilz stammende Enzyme kodieren.

Hinterrund der Erfindung

Die Zusammensetzung der Zellwand von Pflanzen ist komplex und unterschiedlich. Polysaccharide werden hauptsächlich in Form von langen Celluloseketten (dem Hauptbestandteil der Zellwand von Pflanzen), Hemicellulose (enthaltend verschiedene β- Xylanketten) und Pektinsubstanzen (bestehend aus Galacturonanen und Rhamnogalacturonanen; Arabinanen; und Galactanen und Arabinogalactanen) gefunden. Vom Standpunkt der Nahrungsmittelindustrie aus sind die Pektinsubstanzen, insbesondere die Arabinane, zu einem der wichtigsten Bestandteile der pflanzlichen Zellwände geworden (Whitaker, J. R. (1984) Enzyme Microb. Technol., 6, 341).
Arabinane bestehen aus einer Hauptkette von α-L-Arabinoseuntereinheiten, die α-(1-> 5) miteinander verbunden sind. Seitenketten sind α-(l-> 3) oder manchmal α-(l-> 2) mit der α- (1-> 5)-L-Arabinanhauptkette verbunden. Im Apfel beispielsweise liegt ein Drittel der gesamten Arabinose in den Seitenketten vor. Das Molekulargewicht von Arabinan beträgt üblicherweise etwa 15 kDa.
Enzyme, die in der Lage sind, Arabinane abzubauen, werden in der Nahrungsmittelindustrie immer wichtiger. Bei der Saftherstellung beispielsweise hat die Forderung, die Ausbeuten zu erhöhen um die Herstellungskosten zu vermindern, die Modifikation von herkömmlichen Verfahren notwendig gemacht. Die Verwendung von enzymatischen Vorbehandlungen des Fruchtfleisches mit spezifischen, enzymatischen Produkten vor dem Auspressen erhöht die Ausbeute an Saft drastisch, indem die Zellwandpolysaccharide löslich gemacht werden.
Eine nachhaltige Trübung jedoch, die allgemein als "Arabinantrübung" bezeichnet wird, war die Ursache für Probleme bei der Herstellung konzentrierter Säfte. Die Arabinantrübung tritt häufiger in konzentrierten als in nicht konzentrierten Säften auf. Dies kann anzeigen, daß die Wasseraktivität einen Einfluß auf die Löslichkeit von Arabinan hat. Des weiteren wurde gefunden, daß diese Trübung zwischen 60 und 80ºC löslich ist.
Es wurde auch gefunden, daß, während verzweigtes Arabinan in konzentriertem, gekühltem Apfelsaft und Birnensaft löslich ist, das lineare, von Seitenketten befreite α-(1-> 5)-L- Arabinan viel weniger löslich ist. Dieses von Seitenketten befreite α-(1-> 5)-L-Arabinan wird aus dem L-Arabinan durch die Einwirkung eines Arabinanseitenketten abbauenden Enzyms gebildet, welches in den kommerziellen Pektinenzympräparationen aus Aspergillus niger vorhanden ist, die üblicherweise verwendet werden, um die Saftausbeute nach der Fruchtfleischbehandlung, aber vor dem Auspressen, zu erhöhen.
Andererseits werden von Seitenketten befreite Arabinane als wünschenswert für andere Anwendungsbereiche angesehen. Die WO 90/06343 beschreibt die Befreiung von Seitenketten von Zuckerrübenaraban durch die Einwirkung von α-L-Arabinofuranosidase ohne Endo-Arabinaseaktivität, die unter Verwendung von Ionenaustauscher- und Gelfiltrationschromatographieverfahren aus einem Kulturfiltrat von Aspergillus niger oder einer kommerziellen Pektinasemischung isoliert wird. Das von Seitenketten befreite Araban kann als Fettersatz in Nahrungsmitteln verwendet werden.
Es ist bekannt, daß Arabinan abbauende Enzyme von einer Vielzahl von Pflanzen und Mikroorganismen produziert werden, darunter Pilzen wie solchen der Gattungen Aspergillus, Corticium, Rhodotorula (Kaji, A. (1984) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 42, 383), Dichotomitus (Brillouet et al. (1985) Carbohydrate Research, 144, 113), Ascomycetes und Basidomycetes (Sydow, G. (1977), DDR Patentanmeldung Nr. 124,812).
Insbesondere ist bekannt, daß der filamentartige Pilz Aspergillus niger drei verschiedene Arabinan abbauende Enzyme produziert: eine α-L-Arabinanase mit einem Molekulargewicht von etwa 35 kDa und zwei α-L-Arabinofuranosidasen mit Molekulargewichten von etwa 118 bzw. 60 kDa (Rombouts et al. (1988) Carbohydrate Polymers, 9, 25). [N. B. von der Veen et al. ((1991) Arch. Microbial., 157, 23) berichten Molekulargewichte von 43, 83 bzw. 67 kDa für die selben drei Enzyme.]
Die 35 kDa Arabinase (auch als ABN A bekannt) weist Endo-Aktivität auf und spaltet ausschließlich 1-> 5-Bindungen. Die Aktivität dieses Enzyms nimmt ab, wenn die 1,5-α-L- Arabinansequenzen kürzer werden und die Konzentration an Arabinosedimeren und -trimeren zunahm (Rombouts et al., siehe oben). [N. B. von der Veen et al. (1991) berichteten ein Molekulargewicht von 43 kDa.]
Die 118 kDa α-L-Arabinofuranosidase (auch bekannt als Arabinofuranosidase A, ABF A oder EXO A) spaltet ausschließlich 1-> 5-Bindungen mit einer Aktivität vom Exo-Typ, wie durch die Anhäufung von Arabinosemonomeren gezeigt wird. Dieses Enzym zeigt die höchste Aktivität an Substraten mit niedrigem Molekulargewicht (Rombouts et al., siehe oben). [N. B. von der Veen et al. (1991) berichteten ein Molekulargewicht von 83 kDa.]
Die 60 kDa α-L-Arabinofuranosidase (auch bekannt als Arabinofuranosidase B, ABF B oder EXO B) weist ebenfalls Aktivität vom Exotyp auf, spaltet vornehmlich 1-> 3 und 1-> 2 α-L- Arabinane, obwohl sie auch die Fähigkeit zur Spaltung von 1-> 5 α-L-Arabinanen zeigt. Wieder werden nur Arabinosemonomere nach Abbau eines α-L-Arabinan-haltigen Substrats gefunden (Rombouts et al., siehe oben). [N. B. von der Veen et al. (1991) berichteten ein Molekulargewicht von 67 kDa.]
Das ABF B Enzym aus A. niger hat ebenfalls die Fähigkeit gezeigt, 1-> 6-Bindungen zwischen einer endständigen Arabinofuranosyleinheit und der dazwischen liegenden Glucose von Monoterpenyl-α-L-Arabinofuranosylglucosiden zu spalten (Gunata et al. (1989) Europäische Patentanmeldung Nr. 332.281; Gunata et al. (1990) J. Agric. Food Chem 38, 772).
Enzyme mit einer ähnlichen Aktivität wie der des ABF B Enzyms aus A. niger wurden auch in anderen Pilzen wie Dichotomitus squalens (Brillouet et al., siehe oben), Corticium rolfsii und Rhodotorula flava (Kaji, A., siehe oben) gefunden.
Eine mögliche Lösung des Problems der Trübungsbildung in Säften könnte die Verwendung einer Enzymformulierung sein, die ein verbessertes Gleichgewicht zwischen der Endo- Arabinanase (ABN A) und den ABF A und ABF B Enzymen aufweist, oder alternativ dazu, Enzyme mit ähnlichen Aktivitäten, d. h. eine oder mehrere Arbinofuranosidasen erhalten aus einem anderen Mikroorganismus, welche in der Lage ist, 1-> 3 und 1-> 2α-L-Arabinane sowie 1-> 5α-L-Arabinane zu spalten. Eine normale Fermentation von A. niger ergibt jedoch keine ausreichende Ausbeute an den gewünschten Arabinofuranosidasen. Darüber hinaus wäre es von Vorteil, wenn man die Menge der ABF A, ABF B und ABN A Aktivitäten für optimale Ergebnisse bei spezifischen Anwendungen abschwächen könnte.
Die Fähigkeit des ABF B Enzyms, die endständige 1-> 6-Bindung von Monoterpenyl-α-L- Arabinofuranosylglucosiden zu spalten, kann verwendet werden, um die Freisetzung von Aromakomponenten aus verschiedenen Fruchtsäften zu unterstützen und dadurch deren Geschmack zu verbessern (Gunata, Z. et al. (1989 und 1990), siehe oben). Es wäre jedoch vorzuziehen, ein gereinigtes ABF B oder ABF B-artiges Enzym für diesen Zweck einzusetzen, da die Gegenwart von anderer enzymatischer Aktivität andere wichtige Bestandteile des Saftes abbauen und dadurch eine nachteilige Auswirkung auf die endgültige Qualität des Saftes haben könnte.
In der Natur werden mikrobielle, Arabinan abbauende Enzyme immer zusammen mit anderen Enzymen produziert, die Polysaccharid abbauende Aktivitäten aufweisen, wie Pektinasen, Xylanasen, Acetylxylanesterasen, Acetylesterasen, Galactanasen und Cellulasen. Wie oben erwähnt, werden diese Aktivitäten für einige Anwendungsgebiete nicht benötigt oder sind unerwünscht. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß wegen der relativ geringen Expressionsmenge in Wildtypstämmen die Arabinan-abbauenden Enzyme etwas schwierig voneinander und von anderen Enzymen, die A. niger produziert, zu isolieren sind.
Es ist bekannt, daß Fermentationsbedingungen verändert werden können, um die Produktion eines Enzyms, das von Interesse ist, zu begünstigen. Es ist auch bekannt, daß die Klonierung eines Gens, welches für das gewünschte Enzym kodiert, und dessen Überexpression in dessen natürlichem Wirt oder in einem anderen geeigneten Expressionswirt die Produktion des Enzyms, das von Interesse ist, spezifisch steigern wird. Diese letztgenannte Methode ist insbesondere zweckdienlich, wenn das Enzym, das von Interesse ist, in erhöhten Mengen gewonnen werden soll oder in einer Form, die frei ist von anderer, unerwünschter enzymatischer Aktivität.
Es ist klar, daß es günstig wäre, die Arabinan abbauende Aktivität mittels rekombinanter DNS-Techniken zu erhöhen. Die Gene, welche für die Arabinan abbauende Aktivität von A. niger kodieren, waren jedoch bisher nicht verfügbar. Es wäre daher von großer Bedeutung, Gene zu erhalten, die für die Arabinan abbauende Aktivität pilzlichen Ursprungs kodieren und welche in deren natürlichem Wirt zur Expression gebracht werden können, oder, in alternativer Weise, in anderen mikrobiellen Wirten, in denen hohe Expressionsmengen von einem oder mehreren Arabinan-abbauenden Enzymen erreicht werden können.
Die Expression von rekombinanter, bakterieller α-L-Arabinofuranosidase wurde bereits von Schwarz et al. ((1990) Biochem. Biophys. Res. Commun., 170, 368) beschrieben. Das Gen, das für eine bakterielle Arabinofuranosidase kodiert, wurde aus Clostridium stercorarium isoliert und in einem E. coli-Wirt exprimiert.
Ein Gen, das für eine Arabinosidase kodiert, wurde aus dem anaeroben Bakterium Bacteriodes ovatus kloniert und in E. coli exprimiert, wie von Whitehead & Hespell ((1990) J. Bacteriol., 172, 2408) beschrieben.
E. coli-Expressionswirte werden jedoch, unter manchen Umständen, wegen der Erzeugung unerwünschter Nebenprodukte, wie Toxinen, als unsicher für die Herstellung von Proteinen durch rekombinante DNS-Methoden angesehen. Des weiteren führt die Expression in E. coli dazu, daß sich große Mengen an heterologem Protein in der Zelle anhäufen. Eine nachfolgende Reinigung des gewünschten Proteins aus der Menge der intrazellulären Proteine von E. coli kann manchmal schwierig sein.
Ferner wird man, da bakterielle Gene keine Introns enthalten, mit wenigen Problemen bei der Klonierung und Expression solcher Gene in prokaryontischen Wirten konfrontiert. Andererseits ist die Expression eukaryontischer Gene nicht immer so unkompliziert. Es ist gut bekannt, daß aus eukaryontischen Stämmen isolierte Gene Introns enthalten können. Dies führt schon von Natur aus zu Komplikationen bei der Klonierung und Expression dieser Gene, sollte ein prokaryontischer Wirt bevorzugt werden.
Des weiteren bestehen bestimmte Unterschiede zwischen den physikalischen Eigenschaften Arabinan-abbauender Enzyme pilzlicher Herkunft und denen aus Bakterien. Im allgemeinen weisen Enzyme aus Pilzen ein pH-Optimum im Bereich von ≤ 3,0-6,0 auf. Wenige Pilzarten produzieren Arabinan abbauende Enzyme mit pH-Optima so niedrig wie pH 2,0. Diese pH- Optima sind im allgemeienen erheblich niedriger verglichen mit ähnlichen Enzymen aus Bakterienstämmen, die ein pH-Optimum im Bereich von pH 5,0 bis 7,0 haben (Karimi und Ward (1989) J. Indust. Microbiol., 4, 173; Lee und Forsberg (1987) Can. J. Microbiol., 33, 1011). Es ist somit klar, daß bakterielle Arabinan abbauende Enzyme weniger geeignet sind zur Verwendung für, beispielsweise, Verfahren, die niedrigere pH-Bedingungen erfordern.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt gereinigte und isolierte DNS-Moleküle pilzlicher Herkunft zur Verfügung, welche für ein Enzym mit Arabinan-abbauender Aktivität kodieren, wie in den beigefügten Patentansprüchen angegeben.
Auch ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung DNS-Konstrukte für die gesteigerte mikrobielle Expression der DNS-Moleküle der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen. Die zur Verfügung gestellten DNS (oder Expressions)-Konstrukte enthalten das DNS- Molekül, das für das gewünschte Arabinan abbauende Enzym mit entweder dessen nativen 5' und 3' regulatorischen Bereichen kodiert oder, gemäß einer alternativen Ausführungsform, werden hybride DNS-Konstrukte zur Verfügung gestellt, in denen das DNS-Molekül funktionsfähig mit regulatorischen Bereichen, wie einem Promotor, Sekretionsleader und Terminationsssignalen, verbunden ist, welche ausgewählt werden können, um die optimale Expression des Enzyms in dem gewünschten Expressionswirt und, falls gewünscht, die Sekretion daraus, zu gewährleisten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung mikrobielle Expressionswirte zur Verfügung zu stellen, die mit einem oder mehreren DNS-Konstrukten der vorliegenden Erfindung transformiert sind, welche zu einer gesteigerten Expression in der Lage sind und, falls gewünscht, zur Sekretion des Arabinan-abbauenden Enzyms pilzlicher Herkunft.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung Verfahren für die Herstellung großer Mengen Arabinan-abbauender Enzyme, die von Interesse sind, zur Verfügung zu stellen, welche mit Vorteil in industriellen Verfahren verwendet werden können. Üblicherweise handelt es sich u n industrielle Verfahren, welche die Aktivität Arabinanabbauender Enzyme bei einem niedrigeren pH-Wert benötigen als solche, bei denen ähnliche Enzyme bakterieller Herkunft funktionieren.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Schematisches Diagramm des Reinigungsverfahrens für die Gewinnung des a- L-Arabinofuranosidase (ABF B) Enzyms aus A. niger.
Fig. 2 Aminosäuresequenz des N-Terminus des ABF B Proteins aus A. niger (Formel 1) und der Nucleotidsequenz des Oligonucleotidgemischs AB 1719 (Formel 1a).
Fig. 3 Aminosäuresequenz des N-Terminus des 15 kDa CNBr-Fragments des ABF B Proteins aus A. niger (Formel 3) und die Nucleotidsequenz des Oligonucleotidgemischs AB 2306 (Formel 3a).
Fig. 4 Teilweise Restriktionsenzymkarte des hybridisierenden Phagenklons 7
Fig. 5 Nucleotidsequenz des abfB Gens aus A. niger (Formel 4).
Fig. 6 Aminosäuresequenz (Formel 5) des ABF B Proteins aus A. niger, abgeleitet aus der abfB Gensequenz und bestätigt durch die abfB cDNS-Sequenz.
Fig. 7 Physikalische Karte von pAB 6-1. Der 14,5 kb HindIII DNS-Einschub in pUC19 enthält den gesamten Amyloglucosidase (AG) Locus aus A. niger.
Fig. 8 Schematische Ansicht der Herstellung von AG/abfB Genfusionen mittels Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Sequenzen aller verwendeten Oligonucleotidprimer sind im Text angegeben.
Fig. 9 Schematische Darstellung des Zusammenbaus von pAGabfB2 und pAGabfB3. Die verwendeten Symbole bedeuten:
: Sequenzen, welche für das 18 Aminosäuren-Signalpeptid des Amyloglucosidase (AG) Gens (gLaA) aus A. niger kodieren.
: Sequenzen, die für das reife ABF B Protein kodieren
Amp: das Ampicillinresistenzgen
ori: der Ursprung der Replikation von E. coli
AG: der Amyloglucosidase (AG) Promotor aus A. niger
Fig. 10 Zusammenbau der Expressionskassette pAGabfB4. Die verwendeten Symbole bedeuten:
pyrA: das Gen aus A. niger, das für die Orotidin-5'- phosphatdecarboxylase kodiert
Die übrigen Symbole entsprechen denen aus den Legenden von Fig. 9.
Fig. 11 Der Aufbau der Expressionskassette pAGabfB5. Die verwendeten Symbole bedeuten:
amdS: das Gen aus A. nidulans, das für eine Acetamidase kodiert Die übrigen Symbole entsprechen denen aus den Legenden von Fig. 9.

Detailierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt gereinigte und isolierte DNS-Moleküle zur Verfügung, die aus Pilzen erhältlich sind, sowie genetische Varianten davon, welche für Enzyme kodieren, die Arabinan abbauende Aktivität aufweisen, wie in Patentanspruch 1 angegeben. Genetische Varianten bestehen aus DNS-Molekülen, welche für Arabinan abbauende Proteinmutanten kodieren, und degenerierten DNS-Moleküle, bei welchen die gewünschte Aktivität des dadurch exprimierten Enzyms erhalten geblieben ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch DNS-Konstrukte (hierin ebenfalls als Expressionskonstrukte bezeichnet) für die Expression eines oder mehrerer Arabinanabbauender Enzyme in einem gewünschten Expressionswirt zu Verfügung. Die angegebenen DNS-Konstrukte können DNS-Moleküle enthalten, welche für das gewünschte Arabinan- abbauende Enzym mit seinen natürlichen, regulatorischen 5'- und 3'-Bereichen kodieren. Alternativ dazu werden hybride DNS-Konstrukte angegeben, die ein für das Arabinan abbauende Enzym kodierendes DNS-Molekül enthalten, welches funktionsfähig mit regulatorischen Abschnitten, wie einem Promotor, Sekretions- und Terminationssignalen aus homologen oder heterologen Organismen verbunden ist, wobei diese regulatorischen Abschnitte in der Lage sind, die gesteigerte Expression des Strukturgens in einem geeigneten Wirt zu lenken. Vorzugsweise ist das Expressionskonstrukt in das Genom des ausgewählten Wirt integriert.
Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren Vektoren, vorzugsweise Plasmide, für die Klonierung und/oder Transformation von mikrobiellen Wirtsorganismen mittels der Einführung des DNS-Konstrukts für die Expression des gewünschten Arabinan-abbauenden Enzyms in den mikrobiellen Wirt zur Verfügung.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung mikrobielle Wirtsorganismen zur Verfügung, die mit einem oder mehreren Vektoren transformiert sind, von denen jeder wenigstens eines der vorstehend beschriebenen DNS-Konstrukte enthält. Mikrobielle Expressionswirte können unter Bakterien, Hefen oder Pilzen ausgewählt werden.
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist der Begriff "gesteigerte Expression" als die Expression des DNS-Konstrukts definiert, wobei das interessierende, Arabinan abbauende Enzym in größeren Mengen produziert wird als denen, die üblicherweise in den homologen Wildtyporganismen gefunden werden. In dem selben Zusammenhang bedeutet gesteigerte Expression auch die Expression in einem heterologen Organismus, der üblicherweise ein solches Arabinan-abbauendes Enzym nicht produziert, außer wenn ein DNS-Molekül, das für das interessierende, Arabinan abbauende Enzym kodiert, zusammen mit geeigneten regulatorischen Abschnitten in den heterologen Expressionswirt eingebaut wird. Die Nachkommen dieser Expressionswirte werden natürlich ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "homolog" alles das, was natürlich ist an dem DNS-Molekül, welches für das interessierende, Arabinan abbauende Enzym kodiert, einschließlich dessen regulatorischer Bereiche. Ein homologer Wirt ist definiert als die Art, aus der ein solches DNS-Molekül isoliert werden kann.
Der Begriff "heterolog" ist somit definiert als all das, was nicht natürlich ist an dem DNS- Molekül, das selbst für das interessierende, Arabinan abbauende Enzym einschließlich regulatorischer Bereiche, kodiert. Ein "heterologer" Wirt ist definiert als jede mikrobielle Art außer denen, aus denen das Gen, welches für das Arabinan abbauende Enzym kodiert, isoliert worden ist.
Innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "interessierendes, Arabinan abbauendes Enzym" so verstanden, daß er aus Pilzen stammende, Arabinanabbauende Enzyme mit einschließt.
Arabinan abbauende Aktivität, wie in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung definiert, ist die Fähigkeit eines Enzyms, Arabinosereste, entweder Monomere oder Oligomere, aus Arabinanhauptketten oder Arabinan enthaltenden Seitenketten anderer Hemicellulosehauptkettenstrukturen, wie Arabinoxylanen oder Arabinogalactanen, freizusetzen, oder sogar die Freisetzung von Arabinosemonomeren mittels Spaltung der 1-> 6 Bindung zwischen der endständigen Arabinofuranosyleinheit und der dazwischen liegenden Glucosyleinheit von Monoterpenyl-α-L-arabinofuranosylglucosiden.
Die "Arabinan abbauende Aktivität" gemäß der vorliegenden Erfindung ist a) die Fähigkeit, (1-> 2)-α-L-arabinosidische Bindungen zu spalten;
b) die Fähigkeit, (1→3)-α-L-arabinosidische Bindungen zu spalten;
d) die Fähigkeit, die 1→6 Bindung zwischen der endständigen Arabinofuranosyleinheit und der dazwischen liegenden Glucosyleinheit von Monoterpenyl-α-L-arabinofuranosylglucosiden zu Spalten.
Die am meisten bevorzugten Arabinan-abbauenden Enzyme sind α-L-Arabinofuranosidasen, die 1) Arabinan abbauende Aktivität auf (1-> 5)-α-L-arabinosidische Bindungen vom Exotyp; oder 2) Arabinan abbauende Aktivität auf (1→3)-α-L-arabinosidische Bindungen und (1→2)- α-L-arabinosidische Bindungen vom Exotyp; oder 4) die Fähigkeit zur Spaltung der 1→6 Bindung zwischen der endständigen Arabinofuranosyleinheit und der dazwischen liegenden Glucosyleinheit von Monoterpenyl-α-L-arabinofuranosylglucosiden haben.
Bevorzugte DNS-Moleküle, welche für Arabinan abbauende Enzyme der vorliegenden Erfindung kodieren, sind diejenigen, die aus fadenförmigen Pilzen der Gattungen Aspergillus (insbesondere A. niger, A. niger var. tubigensis (siehe auch Kusters-von Someren (1991) Curr. Genet., 19, 21), A. niger var. awamori, A. nidulans (mit Ausnahme des abfA Gens) und A. aculeatis), Dichotomitus (insbesondere D. squalens), Corticium (insbesondere C. rolfsii), Penicillium (insbesondere P. chrysogenum) und Rhodotorula (insbesondere R. flava). Ganz besonders bevorzugt ist die α-L-Arabinofuranosidase (ABF B), die aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigensis oder Aspergillus niger var. awamori erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls DNS-Sequenzen mit ein, die unter wenig stringenten Bedingungen mit den aus den oben beschriebenen Pilzen erhältlichen DNS- Sequenzen hybridisieren, die sich jedoch davon in der Codonsequenz wegen der Degenerierung des genetischen Codes oder durch Variation durch Kreuzung unter Arten unterscheiden können.
Arabinofuranosidasen mit der gewünschten Aktivität können durch verschiedene Methoden identifiziert werden, die für die vorliegende Erfindung nicht kritisch sind. Beispielsweise sind Tests auf das Vorhandensein von Paranitrophenol oder Arabinosemonomeren ein Indiz für die Fähigkeit des Enzyms, 1→3- oder 1-> 2-α-L-arabinosidische Bindungen unter Verwendung von Paranitrophenyl-α-L-arabinosid oder anderen arabinosidhaltigen Substraten zu spalten, unter Verwendung von Methoden wie denen, die von Rombouts et al. ((1988), siehe oben) oder von der Veen et al. ((1991), siehe oben) beschrieben wurden. Die Fähigkeit eines Enzyms, 1→5-α-L-arabinosidische Bindungen zu spalten, kann bestimmt werden unter Verwendung eines Arabinansubstrats aus einem Apfelsaftultrafiltrationsretentat (UFR) und testen auf die Anwesenheit von kleinen Arabinosemonomeren, wie von Rombouts et al., oben angegeben, beschrieben. In alternativer Weise kann die Endo-1,5-α-L-Arabinaseaktivität eines Kulturfiltrats unter Verwendung eines Testkits, wie Arabina-ZymeTM-Tabletten, hergestellt von Megazyme Pty. Ltd. (North Rocks, New South Wales, Australien), gemessen werden.
Sobald ein interessierendes, Arabinan-abbauendes Enzym identifiziert worden ist, kann das DNS-Molekül, welches für solch ein Arabinan-abbauendes Enzym kodiert, aus dem fadenförmigen Pilz, welcher dieses natürlicherweise produziert, erhalten werden, indem der Pilz in einem geeigneten Medium kultiviert, das gewünschte Arabinan abbauende Enzym unter Verwendung bekannter Methoden, wie solcher, die in Fig. 1 (ABF B Enzym) oder bei Rombouts et al. ((1988), siehe oben) oder von der Veen et al. ((1991, siehe oben) beschrieben sind, isoliert und zumindest ein Teil der Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins bestimmt wird.
DNS-Proben können anschließend erhalten werden, indem Oligonucleotide konstruiert werden, die auf der abgeleiteten Teilaminosäuresequenz basieren. Aminosäuresequenzen können vom N-Terminus des gesamten Proteins und/oder vom N-Terminus interner Peptidfragmente her, die durch proteolytischen oder chemischen Aufschluß des gesamten Proteins erhalten wurden, bestimmt werden. Wenn man die DNS-Probe(n) einmal erhalten hat, werden diese verwendet, um eine genomische oder cDNS-Bibliothek zu screenen.
Eine genomische Bibliothek kann hergestellt werden, indem die chromosomale DNS aus einem Pilz mit einem Restriktionsenzym, das die DNS-Sequenz von vier aufeinanderfolgenden Nucleotiden erkennt, beispielsweise Sau3A, teilweise verdaut wird und die daraus resultierenden Bruchstücke in einem geeigneten Plasmid oder Lambdaphagenvektor, beispielsweise Lambda GEM-11, kloniert werden.
Alternativ dazu kann eine cDNS-Bibliothek hergestellt werden, indem cDNS, die aus mRNS synthetisiert wurde, die aus Pilzzellen isoliert wurde, bei denen die Synthese von Arabinan- abbauendem Enzym induziert wurde, in einem geeigneten Phagenvektor, beispielsweise Lambda gt10, kloniert wird, wie von Harmsen et al. (1990) Curr. Genet., 18, 161, beschrieben.
Nach Ausplattieren einer genügenden Menge an Kolonien oder Plaques kann die genomische oder cDNS-Bibliothek mit einer geeigneten DNS-Probe gescreent werden.
Wenn dieses Verfahren nicht zum Erfolg führt, kann die genomische oder cDNS-Bibliothek auf andere Weise mit DNS-Proben durchsucht werden, die aus mRNS von nicht-induzierten und induzierten Zellen erhalten wurde. Induzierte mRNS wird aus Zellen gewonnen, die auf Medien gezüchtet wurden, die Arabinan als Kohlenstoffquelle enthielten, während nichtinduzierte mRNS aus Zellen isoliert werden muß, die mit einer Kohlenstoffquelle gezüchtet wurden, die nicht Arabinan, beispielsweise Glucose, ist. Unter den Klonen, die nur mit der induzierten cDNS-Probe hybridisieren, kann ein für das das gewünschte Arabinan abbauende Enzym kodierende Gen gewonnen werden. In alternativer Weise kann ein Gen, das für das interessierende, Arabinan abbauende Enzym kodiert, durch Kreuz-Hybridisierung mit einem Gen eines verwandten Arabinan-abbauenden Enzyms identifiziert werden.
Im Falle des ABF B Enzyms werden Oligonucleotidproben über die N-terminale Aminosäuresequenz (siehe Fig. 2, Formel 1) eines Arabinan-abbauenden Enzyms mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 60 kDa (in glycosilierter Form) erhalten, welches aus einem Aspergillus niger Kulturfiltrat und/oder über die Aminosäuresequenz eines internen Peptidfragments (siehe Fig. 3, Formel 3), erhalten durch die Verdauung des Enzyms mit CNBr, gereinigt wurde. Die Oligonucleotidgemische AB1719 (Fig. 2, Formel 1a) und AB2306 (Fig. 3, Formel 3a) sind komplementär zu der entsprechenden, abgeleiteten Arabinofuranosidase-mRNS. Vier positive Phagenklone wurden durch Screenen der Lambda GEM-11-Bibliothek mit dem N-terminalen Oligogemisch AB 1719 erhalten, wobei die Lambda GEM-11-Bibliothek durch teilweise Sau3A verdaute, aus Aspergillus niger isolierte DNS hergestellt wurde.
Aus den vier Phagenklonen isolierte DNS hybridisierte mit dem N-terminalen Oligonucleotidgemisch AB 1719 (siehe Fig. 2, Formel 1a). Ein 2,8 kB SacI Fragment würde erhalten (siehe Fig. 4) und sequenziert. Die Nucleotidsequenz und die dafür kodierende Aminosäuresequenz sind in den Fig. 5 und 6 gezeigt (Formeln 4 bzw. 5). Das SacI Fragment, in dem Plasmid pGBabfB1, wurde in dem E. coli-Stamm DH5α beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures (Baarn, Niederlande, am 11 März 1991 unter der Zugangsnummer CBS 156.91) hinterlegt.
Das abfB Gen kodiert für ein Protein mit einer Länge von 499 Aminosäuren, welches ein abgeleitetes Molekulargewicht von 52523 Da (Fig. 6, Formel 5) aufweist, erhalten aus der abfB Gensequenz (Fig. 5) und bestätigt durch die abfB cDNS-Sequenz. Der N-terminalen Aminosäuresequenz, wie in Beispiel 12.2 (Formel 14) bestimmt, geht eine 18 Aminosäuren lange, hydrophobe Sequenz voraus. Die aus den CNBr-Peptiden bestimmten Aminosäuresequenzen (Formeln 15, 16 und 17) finden sich in der Sequenz von Aminosäureposition 203 bis Position 219, 267 bis 286 bzw. 294 bis 312. Das reife ABF B Protein ist 481 Aminosäuren lang und das nicht-glycosilierte Protein hat ein abgeleitetes Molekulargewicht von 50663 Da und einen theoretischen IEP von 3,8.
Die Verfügbarkeit eines für ein interessierendes, Arabinan-abbauendes Enzym kodierendes DNS-Moleküls ermöglicht die Konstruktion eines mutierten, Arabinan-abbauenden Enzyms durch auf eine Stelle gerichtete Mutagenese. Wenn die Tertiärstruktur des Arabinan- abbauenden Enzyms bekannt ist und dessen katalytische und substratbindende Domänen lokalisiert sind, können Aminosäuren für eine Mutagenese ausgewählt werden (beispielsweise mit der Hilfe von Computermodellen), die am wahrscheinlichsten die katalytische und/oder substratbindende Funktion beeinflussen. Wenn die Tertiärstruktur des Proteins nicht verfügbar ist, können entweder Zufallsmutanten entlang der gesamten kodierenden Sequenz erzeugt werden, oder die Tertiärstruktur des Proteins kann durch Vergleich mit ähnlichen, bekannten, Arabinan-abbauenden Enzymen, die aus einem anderen Mikroorganismus isoliert wurden, vorhergesagt werden.
Um den Einbau des DNS-Fragments, welches das selbe für das Arabinan abbauende Enzym kodierende DNS-Molekül enthält, in Expressionskonstrukte mit einem oder mehreren heterologen regulatorischen Bereichen zu erleichtern, kann die Polymerasekettenreaktion (PCR) (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (1989) H. A. Ehrlich, ed., Stockton Press, New York) verwendet werden, um geeignete Restriktionsenzymstellen in die 5'- und 3'-Enden der kodierenden Sequenz einzuführen. Die Wahl der Restriktionsstellen hängt von der Nucleotidsequenz des Expressionsvektors ab, d. h. von der Gegenwart anderer Restriktionsstellen innerhalb des DNS-Moleküls.
Um eine gesteigerte Expression des DNS-Konstrukts für die Produktion des interessierenden, Arabinan-abbauenden Enzyms in der ursprünglichen (homologen) Spezies der Herstellung zu erreichen, oder alternativ dazu in einem heterologen Pilzstamm, kann das DNS-Molekül, welches für das interessierende Enzym kodiert, einschließlich dessen regulatorischer Bereiche in den ausgewählten Expressionswirt eingeführt werden, um die Kopienanzahl des Konstrukts, und als Folge daraus die Proteinexpression, zu erhöhen.
Wenn ein heterologer Expressionswirt bevorzugt und ein Hefe- oder Bakterienstamm ausgewählt wird, wird ein nicht unterbrochenes (ohne Introns) DNS-Molekül für den Zusammenbau eines heterologen Expressionskonstrukts verwendet, um die Möglichkeit zu vermeiden, daß Spleißsignale auf dem genomischen Fragment durch den heterologen Wirt nicht erkannt werden. Dieses nicht unterbrochene DNS-Molekül kann aus einer cDNS- Bibliothek erhalten werden, aufgebaut aus mRNS, die aus Zellen isoliert wurde, die für die Synthese von Arabinan-abbauenden Enzymen induziert wurden. Diese Bibliothek kann mit einem Oligonucleotid oder einer cDNS-Probe durchsucht werden, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurden. Alternativ dazu kann ein nicht unterbrochenes DNS-Molekül durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion erhalten werden, indem geeignete 5'- und 3'-Oligonucleotide auf dem ersten Strang der cDNS, die aus RNS von Arabinan-induzierten Zellen synthetisiert wurde, verwendet wird.
Gesteigerte Expression des DNS-Moleküls, das für das interessierende, Arabinan abbauende Enzym kodiert, kann auch durch die Auswahl von heterologen regulatorischen Bereichen, beispielsweise des Promotors, des Sekretionsleaders und Terminationsbereichen, erreicht werden, welche einer Steigerung der Expression, und falls dies gewünscht wird, der Sekretionsmenge des interessierenden Proteins in dem ausgewählten Expressionswirt, dienen und/oder um die induzierbare Steuerung der Expression des interessierenden, Arabinan abbauenden Enzyms zu gewährleisten.
Neben dem natürlichen Promotor des für das interessierende, Arabinan abbauende Enzym kodierenden Gens können andere Promotoren zur Steuerung von dessen Expression verwendet werden. Der Promotor kann nach seiner Effizienz für die Steuerung der Expression des interessierenden, Arabinan-abbauenden Enzyms in dem gewünschten Expressionswirt ausgewählt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann ein konstitutiver Promotor ausgewählt werden, um die Expression des gewünschten, Arabinan-abbauenden Enzyms zu leiten. Solch ein Expressionskonstrukt kann weitere Vorteile bringen, da dieses die Notwendigkeit umgeht, die Expressionswirte auf einem Medium zu kultivieren, welches Arabinane als induzierende Substrate enthält.
Beispiele für starke konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die für die Verwendung in pilzlichen Expressionswirten bevorzugt sind, sind diejenigen, welche erhältlich sind aus Promotoren von Pilzgenen für Xylanase (xlnA), Phytase, ATP-Synthetase, Untereinheit 9 (oliC), Triosephosphatisomerase (tpi), Alkoholdehydrogenase (adhA), α-Amylase (amy), Amyloglucosidase (AG - aus dem glaA Gen), Acetamidase (amdS) und Glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenase (gpd).
Beispiele für starke Hefepromotoren sind diejenigen, die erhältlich sind aus den Genen für Promotoren der Alkoholdehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglyceratkinase und Triosephosphatisomerase.
Beispiele für starke bakterielle Promotoren sind die Promotoren für α-Amylase und Spo2 sowie die Promotoren aus extrazellulären Proteasegenen.
Auch Hybridpromotoren können mit Vorteil verwendet werden, um die induzierbare Regulation des Expressionskonstrukts zu verbessern.
Oft ist es wünschenswert, daß das interessierende, Arabinan abbauende Enzym aus dem Expressionswirt in das Kulturmedium abgesondert wird, aus welchem das Arabinanabbauende Enzym leichter gewonnen werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die natürliche Sekretionsleadersequenz des interessierenden, Arabinan-abbauenden Enzyms verwendet werden, um die Sekretion des exprimierten Arabinan-abbauenden Enzyms zu bewirken.
Ein Anstieg der Expression des Arabinan-abbauenden Enzyms resultiert jedoch manchmal in der Produktion von Protein in geringeren Mengen als denen, die der Expressionswirt prozessieren und absondern kann, wodurch ein Flaschenhals geschaffen wird derart, daß sich das Proteinprodukt in der Zelle anhäuft. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung auch heterologe Leadersequenzen zur Verfügung, um die effizienteste Sekretion von Arabinanabbauendem Enzym aus dem gewählten Expressionswirt zu gewährleisten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Sekretionsleadersequenz auf der Grundlage des gewünschten Expressionswirts ausgewählt werden. Es kann ein heterologer Sekretionsleader gewählt werden, der homolog zu den anderen regulatorischen Bereichen des Expressionskonstrukts ist. Beispielsweise kann der Leader des stark sekretierten Amyloglucosidase (AG) Proteins zusammen mit dem Amyloglucosidase (AG) Promotor selbst sowie in Kombination mit anderen Promotoren verwendet werden. Hybride Signalsequenzen können ebenfalls mit Vorteil in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Beispiele für bevorzugte heterologe Sekretionsleadersequenzen sind die, welche aus dem pilzlichen Amyloglucosidase (AG) Gen (glaA - sowohl die 18 als auch die 24 Aminosäurenversionen, z. B. aus Aspergillus), dem α-Faktor Gen (Hefen, z. B. Saccharomyces und Kluyveromyces) oder dem α-Amylase Gen (Bacillus) stammen.
Im allgemeinen werden Terminatoren nicht als kritische Elemente für die gesteigerte Expression von Genen angesehen. Wenn dies gewünscht wird, kann ein Terminator unter den selben Genen wie die Promotoren ausgewählt werden, oder alternativ dazu kann der homologe Terminator eingesetzt werden.
Zusätzlich zu dem oben genannten genomischen Fragment kann die transformierende DNS einen Selektionsmarker enthalten, um Zellen innerhalb der Gesamtheit der nicht transformierten Zellen unterscheiden zu können, die das gewünschte Gen enthalten. Dieser Selektionsmarker, der mit den geeigneten 5' und 3' regulatorischen Sequenzen ausgestattet ist, kann auf dem selben DNS-Molekül sitzen, welches das gewünschte Gen enthält, oder er kann auf einem davon verschiedenen Molekül liegen. Im letztgenannten Fall muß eine Co- Transformation durchgeführt werden. Das Verhältnis Expressionsvektor/Selektionsvektor muß in der Weise angepaßt werden, daß ein hoher Prozentsatz der ausgewählten Transformanden den Vektor ebenfalls enthält, der das Expressionskonstrukt des interessierenden, Arabinan-abbauenden Enzyms beinhaltet.
Die am meisten geeigneten Selektionssysteme für industrielle Mikroorganismen sind die, welche durch die Gruppe der Selektionsmarker gebildet werden, die keine Mutation des Wirtsorganismuses benötigen. Beispiele für Selektionsmarker aus Pilzen sind die Gene Wir Acetamidase (amdS), ATP Synthetase, Untereinheit 9 (oliC), Orotidin-5'- Phosphatdecarboxylase (pyrA), Phleomycin (Durand et al. (1991) Curr. Genet., 19, 149) und Benomylresistenz (benA). Beispielhaft für Selektionsmarker nicht aus Pilzen sind das bakterielle G418 Resistenzgen (dieses kann auch in Hefen, aber nicht in Pilzen verwendet werden), das Ampicillin Resistenzgen (E. coli), das Neomycin Resistenzgen (Bacillus) und das uidA Gen aus E. coli, das für die β-Glucuronidase (GUS) kodiert.
Nachdem das gewünschte Expressionskonstrukt zusammengesetzt worden ist, wird es in einen geeigneten Klonierungswirt, z. B. E. coli, transformiert, um das Konstrukt zu vermehren. Danach wird das Expressionskonstrukt in einen geeigneten Expressionswirt eingeführt, wobei das Expressionskonstrukt vorzugsweise in das Genom integriert wird. Gewisse Wirte, wie z. B. Bacillusarten, können sowohl als Klonierungs- als auch als Expressionswirte verwendet werden, wodurch ein zusätzlicher Transformationsschritt vermieden wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von Organismen als Wirte für die Produktion des interessierenden, Arabinan-abbauenden Enzyms verwendet werden. Wenn mehr als ein interessierendes, Arabinan-abbauendes Enzym hergestellt werden soll, können mehrere Vektoren, von denen jeder ein Expressionskonstrukt Wir ein interessierendes, Arabinan-abbauendes Enzym (z. B. ABF A, ABF B und/oder ABN A) enthält, in den selben Expressionswirt eingeführt werden. Alternativ dazu kann jedes gewünschte Arabinanabbauende Enzym unabhängig in verschiedenen Wirten hergestellt werden.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein homologer Expressionswirt verwendet werden. Dies beinhaltet die Einführung des Expressionskonstrukts zurück in den Stamm, aus dem das für das Arabinan abbauende Enzym kodierende DNS- Molekül isoliert worden war, entweder in einer erhöhten Anzahl von Genkopien oder, wie oben beschrieben, unter der Kontrolle von heterologen regulatorischen Bereichen oder beidem.
Gemäß einer anderen Ausführungsform können ein oder mehrere interessierende, Arabinanabbauende Enzyme hergestellt werden, indem ein oder mehrere, für das interessierende, Arabinan abbauende Enzym kodierende DNS-Molekül(e), von denen jedes von geeigneten regulatorischen Bereichen gesteuert wird, in heterologe Wide, wie Bakterien, Hefen oder Pilze, eingebaut und exprimiert werden. Dazu wird ein für das interessierende, Arabinanabbauende Enzym kodierendes DNS-Molekül vorzugsweise unter der Kontrolle von Promotor- und Terminatorsequenzen aus dem heterologen Wirt exprimiert. Zusätzlich kann es notwendig sein, die natürliche Sekretions-Leadersequenz des Gens für das interessierende, Arabinan abbauende Enzym durch die mit dem Expressionswirt homologe Leadersequenz zu ersetzten, um die effizienteste Expression und Sekretion des Produkts zu erreichen.
Faktoren wie die Größe (Molekulargewicht), die Notwendigkeit für richtige Glycosylierung oder die Erwünschtheit der extrazellulären Sekretion eines interessierenden, Arabinanabbauenden Enzyms spielen eine wichtige Rolle bei der Auswahl des Expressionswirts.
Das Gram-negative Bakterium E. coli wird vielfach als Wirt für heterologe Genexpression verwendet. Es tendieren jedoch große Mengen an heterologem Protein dazu sich innerhalb der Zelle anzuhäufen. Die nachfolgende Reinigung des gewünschten Proteins aus der Gesamtheit der intrazellulären Proteine von E. coli kann manchmal schwierig sein.
Im Gegensatz zu E. coli sind Bakterien der Gattung Bacillus wegen ihrer Fähigkeit, Proteine in das Kulturmedium zu sekretieren, sehr geeignet als heterologe Wirte. Andere als Wirte geeignete Bakterien sind diejenigen aus den Gattungen Streptomyces und Pseudomonas.
In Abhängigkeit von der Art des DNS-Moleküls, das für das interessierende, Arabinanabbauende Enzym kodiert, und/oder der Erwünschtheit einer weiteren Prozessierung des exprimierten Proteins, können eukaryontische Wirte, wie Hefen oder Pilze, bevorzugt sein. Im allgemeinen sind Hefezellen gegenüber Pilzzellen bevorzugt, da diese leichter zu manipulieren sind. Einige Proteine werden jedoch entweder nur wenig von Hefezellen sekretiert oder sie werden in einigen Fällen nicht richtig prozessiert (z. B. Hyperglycosylierung in Hefen). Unter diesen Umständen sollte ein Pilzwirtsorganismus gewählt werden.
Ein heterologer Wirt kann auch ausgewählt werden, wenn das interessierende, Arabinanabbauende Enzym in einer Form produziert wird, die im wesentlichen frei ist von anderen Polysaccharid-abbauenden Enzymen. Dies kann erreicht werden, indem ein Wirt ausgewählt wird, der üblicherweise solche Proteine nicht produziert, wie Kluyveromyces lactis.
Beispiele für bevorzugte Expressionswirte, die vom Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden, sind Pilze, wie Asperg llus Arten (beschrieben in den europäischen Patentanmeldungen 184.438 und 284.603) und Trichoderma Arten; Bakterien, wie Bacillus Arten (beschrieben in den europäischen Patentanmeldungen 134.048 und 253.455), Streptomyces Arten und Pseudomonas Arten; und Hefen, wie Kluyveromyces Arten (beschrieben in den europäischen Patentanmeldungen 96.430 und 301.670) sowie Saccharomyces Arten.
Besonders bevorzugte Expressionswirte können ausgewählt werden unter Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigensis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis und Saccharomyces cerevisiae.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Produktion von interessierenden, Arabinan- abbauenden Enzymen durch die Kultivierung mikrobieller Expressionswirte bewirkt, die mit einem oder mehreren DNS-Konstrukten der vorliegenden Erfindung in einem herkömmlichen Nährfermentationsmedium transformiert wurden.
Das Fermentationsmedium besteht aus einem üblichen Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle (z. B. Glucose, Maltose, Melassen, etc.), eine Stickstoffquelle (z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, etc.), eine organische Stickstoffquelle (z. B. Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton, etc.) und anorganische Nährstoffquellen (z. B. Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen, etc.) enthält. Gegebenenfalls kann ein induzierendes Mittel (z. B. Zuckerrübenarabinan) zugegeben werden.
Die Auswahl des geeigneten Mediums kann auf der Auswahl der Expressionswirte und/oder auf den regulatorischen Erfordernissen des Expressionskonstrukts basieren. Solche Medien sind dem Fachmann wohlbekannt. Falls dies gewünscht wird, kann das Medium zusätzliche Bestandteile enthalten, welche die transformierten Expressionswirte gegenüber anderen, möglicherweise verunreinigenden Mikroorganismen begünstigen.
Die Fermentation wird über eine Zeitdauer von 0,5 bis 20 Tagen in einem diskontinuierlichen Verfahren oder einem diskontinuierlichen Verfahren mit Zuführung bei einer Temperatur im Bereich zwischen 0 und 45ºC und einem pH-Wert zwischen 2 und 10 durchgeführt. Bevorzugte Fermentationsbedingungen sind eine Temperatur im Bereich zwischen 20 und 37ºC und ein pH-Wert zwischen 3 und 9. Die geeigneten Bedingungen werden auf der Basis der Auswahl des Expressionswirts ausgesucht.
Nach der Fermentation werden die Zellen mittels Zentrifugation oder Filtration aus der Fermentationsnährlösung entfernt. Nach der Entfernung der Zellen kann das interessierende, Arabinan abbauende Enzym dann gewonnen und, falls dies gewünscht wird, mittels herkömmlicher Mittel gereinigt und isoliert werden.
Das Produkt wird entweder in flüssiger oder trockener Form haltbar konfektioniert. Für bestimmte Anwendungen kann es bevorzugt sein, das Enzym an einer festen Matrix zu immobilisieren.
Die interessierenden, Arabinan-abbauenden Enzyme, die mittels der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, können entweder allein oder als Gemisch aus Arabinan-abbauenden Enzymaktivitäten (d. h. als Kombinationen aus ABF A und/oder ABF B und/oder ABN A Aktivitäten) und gegebenenfalls zusammen mit anderen ausgewählten Enzymen in einer Vielzahl von Verfahren eingesetzt werden, welche den Einsatz von Arabinan-abbauenden Enzymen erfordern. Darüber hinaus sind die pilzlichen Arabinan-abbauenden Enzyme der vorliegenden Erfindung, die im allgemeinen niedrigere pH-Optima aufweisen als Arabinanabbauende Enzyme bakterieller Herkunft, besonders gut geeignet für den Einsatz bei industriellen Prozessen, die bei einem niedrigen pH-Wert durchgeführt werden.
Es wurde gefunden, daß aufgrund der Tatsache, daß das ABF A Enzym nur auf niedrigoligomere Arabinoside einwirkt, das ABF B Enzym vorzugsweise die L-Arabinose Seitenkettenreste (mit einiger Endoaktivität) hydrolisiert und das ABN A optimal auf lineares Arabinan einwirkt, Gemische aus dem ABF A und/oder ABF B Enzym synergistisch agieren, wenn sie mit Endoarabinase (ABN A) Aktivität kombiniert werden. Die vorliegende Erfindung erlaubt dem Fachmann, Gemische aus den gewünschten Arabinan-abbauenden Aktivitäten herzustellen, die optimale Anteile an den gewünschten Aktivitäten für spezielle industrielle Anwendungen aufweisen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß die Arabinan-abbauenden Enzyme, die mittels der vorliegenden Erfindung produziert wurden, bei der Herstellung von konzentrierten Säften, insbesondere Fruchtsäften (z. B. Apfel, Birne und ähnlichen) oder Gemüsesäften, eingesetzt werden können, um die "Arabinantrübung" zu eliminieren.
Die Zugabe einer Menge an beispielsweise ABF B in eine Enzymzubereitung (wie sie beispielsweise von einer Aspergillus Art erhalten wird), die wiederum vor dem Pressen zu dem Fruchtfleisch zugegeben wird, gewährleistet eine erhöhte Ausbeute des erhaltenen Saftes ohne die Anwesenheit der unerwünschten Arabinantrübung sowohl in konzentrierten als auch in nicht konzentrierten Formen des Saftes. Ein Gemisch aus allen drei erfindungsgemäß hergestellten, Arabinan-abbauenden Enzymen kann ergänzend bei der Verarbeitung von konzentrierten Säften aus Früchten mit höheren Mengen an Arabinanen (z. B. Birnensaft) eingesetzt werden. Zusätzliche enzymatische Aktivität, wie Pektinaseaktivität, kann ebenfalls für optimale Ergebnisse zugesetzt werden, wie der Fachmann feststellen kann.
Ferner verbessert der Zusatz von erfindungsgemäß hergestellten, Arabinan-abbauenden Enzymen in Frucht- und Gemüsesäfte die Filtrierbarkeit von Säften wie Traubensaft. Um die Arabinogalactane abzubauen, die dafür bekannt sind, Viskosität zu verursachen, wird der Saft zuerst mit einem Enzymgemisch behandelt, das große Mengen an erfindungsgemäß hergestellten Arabinasen und Arabinofuranosidasen aufweist, gefolgt von einer Behandlung mit β-1-3- und β-1-6-Galactanasen.
Alternativ dazu können α-L-Arabinofuranosidasen, insbesondere das ABF B Enzym, verwendet werden, um die Freisetzung von Aromastoffen aus Substraten, wie Säften oder Weinen, zu unterstützen, wie bei Gunata et al. ((1989) und (1990), siehe oben) beschrieben. Dies wird in einem zweistufigen Verfahren erreicht, wobei der erste Schritt den Einsatz von α-L-Arabinofuranosidase, vorzugsweise mit ABF Bartiger Aktivität, umfaßt, um die Freisetzung von in Frucht- und Gemüsesaft enthaltenen Arabinoseresten aus Monoterpentyl- α-L-arabinofuranosylglucosiden mittels Spaltung der (1→6)-Bindung zwischen einer endständigen Arabinofuranosyleinheit und der dazwischen liegenden Glucose eines Monoterpenyl-α-L-arabinofuranosylglucosids zu katalysieren. Die α-L-Arabinofuranosidase liegt vorzugsweise in gereinigter Form vor, um den unerwünschten Abbau von anderen Bestandteilen des Saftes zu vermeiden, welcher sich nachteilig auf die endgültige Qualität des Safts auswirken könnte. Das sich ergebende desarabinosylierte Monoterpenylglucosid wird dann mit β-Glucosidase behandelt, um das freie Terpenol zu erhalten. Falls dies gewünscht wird, können beide Reaktionsschritte in dem selben Reaktionsgefäß ausgeführt werden, ohne die Notwendigkeit das Zwischenprodukt zu isolieren (Gunata et al., (1989), siehe oben).
Die Freisetzung dieser Aromabestandteile verbessert den Geschmack des Safts oder des Weins. Im Fall von Wein gewährleistet die Steuerung der Freisetzung von Aromabestandteilen darüber hinaus einen gleichmäßigeren Geschmack, wodurch der unerwünschte Effekt von "schlechten Weinjahrgängen" reduziert oder eliminiert wird.
Arabinan abbauende Enzyme können auch zu Tiernahrung zugegeben werden, die reich an Arabinanen ist. Wenn diese Nahrungsmitteln (einschließlich Silage) für Tiere mit einem Magen (z. B. Geflügel oder Schwein) zugegeben werden, wobei die Nahrungsmittel Getreide, wie Gerste, Weizen, Mais, Roggen oder Hafer, oder Getreideabfallprodukte, wie Weizenkleie oder Maiskleie, enthalten, verbessert das Enzym signifikant den Abbau von pflanzlichen Zellwänden, was zu einer verbesserten Verwertung der Pflanzennährstoffe durch das Tier führt. Als Konsequenz daraus sind die Wachstumsgeschwindigkeit und/oder die Nahrungsmittelumsetzung verbessert. Darüber hinaus können die Arabinan-abbauenden Enzyme verwendet werden, um die Viskosität von Nahrungsmitteln zu verringern, die Arabinane enthalten.
Ein Arabinan-abbauendes Enzym kann vorab zu dem Nahrungsmittel oder der Silage zugegeben werden, wenn ein Vor-Einweichen oder feuchte Kost bevorzugt werden. In vorteilhafterer Weise fahren die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten, Arabinan- abbauenden Enzyme fort, Arabinane in den Nahrungsmitteln in vivo zu hydrolysieren. Arabinan abbauende Enzyme aus Pilzen, welche im allgemeinen niedrigere pH-Optima aufweisen, können wichtige Nährstoffe in so sauren Umgebungen wie dem Magen des Tieres freisetzen, welches ein Nahrungsmittel aufnimmt, das durch ein Arabinan-abbauendes Enzym ergänzt wurde.
Ein weiteres Einsatzgebiet für die erfindungsgemäß hergestellten, Arabinan-abbauenden Enzyme ist die Zellstoff und Papierindustrie. Es wird oft berichtet, daß die Anwendung von Xylanasen vorteilhaft bei der Entfernung von Ligninen und Terpenoiden aus Zellulose- und Hemicelluloseresten einer Hemicellulosehauptkette ist, einem wesentlichen Schritt bei der Verarbeitung von Holz, Holzzellstoff oder von Holz abgeleiteten Produkten für die Papierherstellung. Die Zugabe von erfindungsgemäß hergestellten, Arabinan-abbauenden Enzymen zu dem Xylanasebehandlungsschritt unterstützt den Abbau einer Arabinan-haltigen Hemicellulosehauptkette und erleichtert somit eine verbesserte, effizientere Entfernung von sowohl Ligninen als auch Terpenoiden. Die Anwendung von Arabinan-abbauenden Enzymen ist besonders vorteilhaft bei der Verarbeitung von Weichhölzern, bei denen die Hemicellulosehauptkette Arabinoglucuronxylane enthält.
Ferner können die mittels der vorliegenden Erfindung hergestellten, Arabinan abbauenden Enzyme in anderen Verfahren eingesetzt werden, wie bei der Erhöhung der Ausbeute bei der enzymatischen Hydrolyse von Zuckerrübenmasse, wobei die erhaltene hydrolisierte Fraktion in Kulturmedium für Mikroorganismen verwendet werden kann; und bei der Hydrolyse von Sykomore, Gummiarabicum oder landwirtschaftlichen Überbleibseln wie Weizenstroh.
Die folgenden Beispiele werden zur Verfügung gestellt, um den Fachleuten eine vollständige Offenbarung und Beschreibung anzugeben, wie die Erfindung durchzuführen und zu verwenden ist und sie sind nicht vorgesehen, um den Umfang dessen einzuschränken, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen. Es wurden Anstrengungen unternommen, daß die Genauigkeit der verwendeten Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur, pH-Wert etc.) sichergestellt ist, doch sollten einige experimentelle Fehler und Abweichungen in Kauf genommen werden. Sofern nichts anderes angeben ist, bezieht sich Temperatur auf Grad Celsius und der Druck ist Atmosphärendruck oder nahezu Atmosphärendruck.

Beispiel 1

Enzymbestimmungen

Der Proteingehalt, der für die Bestimmung der spezifischen enzymatischen Aktivität verwendet wurde, wurde nach der Methode von Lowry et al. ((1951) J. Biol. Chem. 193, 265) gemessen, außer es ist etwas anderes angegeben.
Arabinofuranosidaseaktivität kann bestimmt werden, indem 0,250 ml Enzymlösung zu 8 mM p-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranosid (PNA - in 0,1 M Natriumacetatpuffer; pH 4,4) zugegeben werden. Nach 10 min Inkubation bei 40ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml 0,5 M Glycin-Natriumpuffer, pH 9,0, gestoppt. Die Konzentration an p-Nitrophenol (pNP) wurde durch Ablesen der Extinktion bei 400 nm bestimmt. 1 nkat Aktivität entspricht der Freisetzung von 1 nmol pNP pro Sekunde unter den Testbedingungen. Alternativ dazu kann die Arabinofuranosidaseaktivität in Einheiten pro Milliliter (U/ml) angegeben werden, wobei eine Einheit der Arabinofuranosidaseaktivität als die Enzymmenge definiert ist, die 1 umol pNP pro Minute aus PNA freisetzt (siehe von der Veen et al. (1991), oben).
Die Aktivitäten von β-D-Glucopyranosidase und α-L-Rhamnopyranosidase wurden unter den gleichen Bedingungen gemäß deren Einwirkung auf p-Nitrophenyl-β-D- Glucopyranosidsubstrat bzw. α-L-Rhamnopyranosidsubstrat bestimmt.
Die Endoaktivität von 1,5-α-L-Arabinase eines Kulturfiltrats wurde unter Verwendung des von Megazyme Pty. Ltd. (North Rocks, New South Wales, Australien) hergestellten ArabinaZymeTM Test-Kits nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt und berechnet. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als die Menge an Enzym, die benötigt wird, um 1 umol an Arabinose reduzierenden Zuckeräquivalenten aus linearem Carboxymethyl-(1-> 5)-α-L- arabinan pro Minute unter den Testbedingungen freizusetzen,

Beispiel 2

Reinigung von Aspergillus niger α-L-Arabinofuranosidase B (ABF B)

Eine schematische Übersicht des Verfahrens, das für die Reinigung des α-L- Arabinofuranosidase B (ABF B) Enzyms aus einem aus dem A. niger HEM Stamm erhaltenen Kulturflltrat verwendet wurde, ist in Fig. 1 gezeigt. Fünf Schritte wurden für die Reinigung verwendet: 1) fraktionierte Ausfällung mit Ammoniumsulfat; 2) Größenausschluß; 3) Ionenaustauschchromatographie; 4) Gelpermeation; und 5) Adsorptionschromatographie.
Eluierte Fraktionen wurde auf Arabinan abbauende, Rhamnosidase- und Glucopyranosidase- Aktivität mittels der in Beispiel 1 beschriebenen kolorimetrischen Verfahren untersucht. Der Proteingehalt wurde mit einem Bradford Mikrotest auf einer Titrationsmikroplatte (Margaret et al. (1985) Anal. Biochem. 147, 144) bestimmt. Chromatographieexperimente wurden bei 5ºC durchgeführt.

Beispiel 2.1: Fraktionierte Ausfällung mit (NH&sub4;)SO&sub4;

Die Probe eines Kulturfiltrats, die erhalten wurde von einem A. niger Stamm HEM und die unter anderem das ABF B Enzym enthielt, wurde mit verdünnter Essigsäure auf einen pH- Wert von 5,5 eingestellt (den isoelektrischen Punkt von α-L-Arabinofuranosidase) und durch fraktionierte Ausfällung mit (NH4)&sub2;SO&sub4; bei einer Konzentration von 50, 60, 70, 80 und 90% Sättigung bei einer Temperatur von 5ºC gewonnen. Der Niederschlag wurde in Natriumacetatpuffer (pH 4,5; 0,05 M) löslich gemacht und im gleichen Puffer dialysiert, um Salze zu entfernen. Die Eigenschaften der verschiedenen Fraktionen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Enzymatische Aktivität der Niederschläge

Beispiel 2.2: Größenausschluß mit BIO GEL P10

Eine BIO-GEL P10-Säule (BIO-RAD; Richmond, Va., USA) wurde mit Natriumacetatpuffer (pH 4,5; 0,05 M) bei einer Durchflußmenge von 60 ml/Stunde voräquilibriert. Eine 100 ml Probe des 50% (NH4)&sub2;SO&sub4;-Niederschlags wurde auf die Säule aufgetragen. Proteine wurden unter den gleichen Bedingungen eluiert. 20 ml Fraktionen wurden gesammelt und auf ihre α- L-Arabinofuranosidaseaktivität getestet. Die Fraktionen 14 bis 22 wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration (Ausschlußgrenze = 10.000 · D) beim Ausgangsvolumen konzentriert.

Beispiel 2.3: Anionenaustauschchromatographie mit DEAE ART LS

Eine DEAE ART LS Säule (5,2 · 36 cm; IBF Biotechnics, Frankreich) wurde mittels 0,05 M Natriumacetatpuffer von pH 4,5 bei einer Durchflußmenge von 100 ml/Stunde voräquilibriert. Eine Menge von 100 ml des aus Beispiel 2.2 (oben) erhaltenen α-L-Arabinofuranosidasepools wurde auf die Säule aufgetragen. Das Protein wurde unter Verwendung eines 0 bis 0,5 M Natriumchloridgradienten in Startpuffer eluiert. 15 ml Fraktionen wurden gesammelt und auf Enzymaktivitäten getestet.
Ein α-L-Rhamnosidasepeak erschien in der Nähe des Leervolumens der Säule, was zeigte, daß dieses Enzym bei diesem pH-Wert (Pool CY183 III-1) in neutraler oder kationischer Form vorlag. β-D-Glucopyranosidase und α-L-Arabinofuranosidase wurden bei Verwendung eines Natriumchloridgradienten jeweils getrennt mit guter Auflösung eluiert.
Die Fraktionen 164 bis 166 wurden vereinigt (Pool CY 183 III-3), ultrafiltriert und mit 50/50 w/w Glycerin stabilisiert. Die Eigenschaften der verschiedenen Pools sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Eigenschaften der mittels DEAE TRISACRYL ART LS gereinigten Glycosidasen
* α-L-Arabinofuranosidase
** α-L-Rhamnopyranosidase
*** β-D-Glucopyranosidase

Beispiel2.4: Gelpermeation

Eine BIO-GEL P60 Säule (2,8 · 30 cm; BIO-RAD; Richmond, Va., USA) wurde mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer (pH 8,8) bei einer Durchflußmenge von 30 ml/Stunde voräquilibriert. Eine Probe mit 5 ml α-L-Arabinofuranosidase, die mit 1/1 w/w Glycerin stabilisiert und durch DEAE ART LS Chromatographie (Beispiel 2.3, oben) erhalten worden war, wurde auf die Säule aufgetragen. Das eluierte Protein wurde mittels eines UV-Detektors bei einer Extinktion von 280 nm nachgewiesen.
5 ml Fraktionen wurden gesammelt und auf ihre Aktivität auf p-Nitrophenyl-α-L- arabinofuranosid untersucht. Proteine wurde in einem einzelnen, scharfen Peak eluiert, welcher die α-L-Arabinofuranosidaseaktivität enthielt.

Beispiel 2.5: Adsorptionschromato raphie mit BIO-GEL HTP

Eine BIO-GEL HTP Säule (2,8 · 20 cm; BIO-RAD; Richmond, Va., USA) wurde mit einem 0,01 M Natriumphosphatpuffer (pH 8,8) bei einer Durchflußmenge von 30 mb/Stunde voräquilibriert. Der α-L-Arabinofuranosidasepool aus BIO-GEL P60 (35 ml) (erhalten aus Beispiel 2.4, oben) wurde auf die voräquilibrierte BIO-GEL HTP Säule aufgebracht und bei einer Durchflußmenge von 30 ml/Stunde chromatographiert. Die Proteine wurden mit einem geeigneten Natriumphosphatpuffergradienten (pH 8,8) von 0,01 bis 0,2 M eluiert.
5 ml Fraktionen wurden gesammelt und auf ihre α-L-Arabinofuranosidase-, β-D- Glucopyranosidase- und α-L-Rhamnopyranosidaseaktivität untersucht. Die beiden letztgenannten Enzyme wurden unter den Standardbedingungen nicht gefunden. Das ABF B Enzym wurde mit dem ersten großen Peak eluiert.

Beispiel 3

Charakterisierung des gereinigten α-L-Arabinofuranosidase B (ABF B) Enzyms aus Aspergillus niger

Beispiel 3.1: Hochleistungsgrößenausschlußchromatographie (HPSEC) mit TSK 63000 SW

Um die Homogenität des Enzyms zu bestimmen und das Molekulargewicht abzuschätzen, wurden die Fraktionen 63, 64, 65, 66 und 67 (wie nach Beispiel 2, oben, erhalten) mittels einer TSK 63000 SW Säule (LKB, Produckter AB; Bromma, Schweden) unter den folgenden Bedingungen chromatographiert. 100 ul Aliquote jeder Fraktion wurden auf die TSK G3000 SW Säule injiziert, die mit Natrium-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,00; 0,1 M) bei einer Durchflußmenge von 0,5 ml/min voräquilibriert worden war. Die eluierten Proteine wurden spektrophotometrisch bei einer Extinktion von 280 nm erfaßt. 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt und die α-L-Arabinofuranosidaseaktivität wurde qualitativ mit dem kolorimetrischen Test auf einer Microtiterplatte gemessen.
Die Säule wurde mit Standardmolekulargewichtsproteinen (Pharmacia Gel filtration calibration kit; Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) kalibriert. Das Chromatographieprofil zeigt die große Homogenität des in den Fraktionen 63 bis 66 eluierten Proteins. Das Molekulargewicht des α-L-Arabinofuranosidase B Enzyms wurde mit etwa 70 kDa bestimmt, was dem Molekulargewicht des gleichen Enzyms, wie von von der Veen et al. ((1991), siehe oben) berichtet, ziemlich nahe kommt.

Beispiel 3.2: SDS-PAGE Elektrophorese

Die Fraktionen 62 bis 66 (erhalten nach Beispiel 2, oben) wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration konzentriert (Auschlußgrenze 10.000 · D). Die Eigenschaften dieser Probe wurden bestimmt und sind nachfolgend zusammengefaßt:
- Proteinkonzentration. 0.25 mg/ml
- Aktivität bei pNP-Arabinofuranosid: 38 nkat/ml
- Spezifische Aktivität: 153 nkat/mg
Die SDS PAGE Elektrophorese bestätigt die hohe Reinheit des Enzyms und das mittels HPSEC bestimmte Molekulargewicht.

Beispiel 4

Aminosäuresequenzbestimmung der N-Termini des reifen ABF B Proteins und zweier mittels CNBr erzeugter Peptidfragmente

Etwa 10 ug des gereinigten ABF B wurden mittels eines 7,5%-igen SDS-Polyacrylamidgels elektrophoretisch behandelt und auf eine Immobilon Membran (Millipore) elektrogeblottet, gemäß der von Matsudaira ((1987 J. Biol. Chem., 262, 10035) beschriebenen Methode. Die geeignete Bande wurde ausgeschnitten und für eine Sequenzbestimmung eingeschickt (Eurosequence, Groningen). Die folgende N-terminale Sequenz wurde erhalten:
Gly-Pro-Xaa-Asp-Ile-Tyr-Glu-Ala-Gly-Asp-Thr-Pro-Xaa-Val-Ala-Ala (Formel 1)
Etwa 100 ug des reinen ABF B wurden über Nacht in einem Volumen von 150 ul 0,15 CNBr in 70%-iger Ameisensäure verdaut. Die Verdauungsprodukte wurden mittels eines 15%-igen SDS-Polyacrylamidgels aufgetrennt und auf Immobilon (Millipore; Matsudaira, siehe oben) elektrogeblottet. Zwei Banden von 29 und 15 kDa wurden ausgeschnitten und sequenziert (Eurosequence, Groningen, Niederlande). Die folgenden Sequenzen wurden vom 29 kDa (Formel 2) bzw. 15 kDa (Formel 3) Fragment erhalten:
Gly-Pro-Xaa-Asp-Ile-Tyr-Glu-Ala-Gly-Asp-Thr-Pro-Xaa-Val-Ala-AIa (Formel 2)
Xaa-Lys-Glu-Xaa-Ala-Ile-Ile-Leu-Gly-Ile-Gly-Gly-Asp-Xaa-Xaa-Asn-Gly-Ala (Formel 3)
Die als Formel 2 angegebene Aminosäuresequenz ist identisch mit der N-terminalen Sequenz des ABF B Proteins (siehe Formel 1), die 29 kDa Bande stellt das N-terminale Fragment des Proteins dar, während das 15 kDa Fragment ein inneres Fragment darstellt.

Beispiel 5

Aufbau einer genomischen Aspergillus niger Bibliothek

5 g eines Mycels von A. niger HEM wurden in einem Mörser in flüssigem Stickstoffgemahlen bis ein feines, weißes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde in 35 ml TES (10 mM Tris·HCl, pH 7,5; 50 mM EDTA; 150 mM NaCl) + 1% SDS bei 55ºC für eine Dauer von 2-4 Stunden lysiert. Das Lysat wurde einmal mit einem Volumen Phenol und mehrere Male mit einem Volumen Phenol-Chloroform extrahiert, bis die Phasengrenzfläche nicht länger sichtbar war. Nach einer letzten Extraktion mit einem Volumen Chloroform wurde die DNS mit Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde in TE (10 mM Tris; 1 mM EDTA; pH 8,0) gelöst und RNase wurde in einer Konzentration von 1 ug/ml zugegeben.
10 ug dieser DNS wurden mit Sau3AI in solcher Weise verdaut, daß Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von 10-20 kb erhalten wurden. Die entstandenen Sau3AI Enden wurden teilweise unter Verwendung der Nucleotide dGTP und dATP mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und mit den halbseitigen LambdaGEMTM-11 XhoI Armen (Promega) ligiert. Diese Arme enthalten teilweise (mit dTTP und dCTP) gefüllte XhoI Schnittstellen und werden gebrauchsfertig vom Hersteller bezogen. Die ligierte DNS wurde unter Verwendung des Packagene in vitro Verpackungssystems (Promega) verpackt. Die Titration dieser primären genomischen Bibliothek auf E. coli MB406 führte zu 8000 Plaque-bildenden Einheiten (pfu).

Beispiel 6

Screenen der genomischen Bibliothek von A. niger auf das α-L-Arabinofuranosidase B (abfB) Gen und teilweise Charakterisierung hybridisierender Phagenklone

Details der molekularen Klonierungstechniken sind von Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben worden. Enzyminkubationen werden unter Befolgung der vom Hersteller beschriebenen Anweisungen durchgeführt.
Die in den Formeln 1 und 3 beschriebenen Aminosäuresequenzen wurden für den Aufbau der Oliginucleotidgemische AB 1719 und AB2306 (siehe Fig. 2 und 3) verwendet. Inosinnucleotide wurden verwendet, wenn der genetische Code um vier oder mehr Nucleotide degeneriert ist.
Southern Blots mit 10 ug chromosomaler DNS von A. niger HEM, die entweder mit BamHI, BgIII, EcoRI oder HinIII verdaut worden war, wurden über Nacht bei 35ºC in 6 · SSC, 5 · Denhardts Lösung, 0,5% SDS und 100 ug/ml denaturierter Kalbsthymus-DNS mit 15 umol dieser Oligogemische hybridisiert, wonach die Blots für zweimal 10 min bei 35ºC mit 6 · SSC, 0,1% SDS gewaschen wurden. Das Oligo AB 1719 (Fig. 2, Formel 1a) ergab ein Muster von mehreren distinkten Hybridisierungsbanden pro Enzymverdau.
Für das Screenen der genomischen Bibliothek aus A. niger HEM wurden 2 · 10³ pfu pro Platte auf drei Platten mit einem Durchmesser von 15 cm unter Verwendung von E. coli MB406 als Plattierungsbakterium ausplattiert. TB (10 g/l Bacto-tryptone; 5 g/l NaCl) Medium plus 0,9% bzw. 0,75% Agar wurden für den Boden und das Oberteil verwendet. Duplikatfilter (Nitrocellulose, Millipore) wurden von jeder Platte hergestellt und mit dem Oligo AB 1719 unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen gescreent, die ähnlich den für die Southern Blot Hybridisierungen verwendeten waren. Fünf in duplo Hybridisierungsplaques konnten entdeckt werden. Jeder Plaque wurde mit einer Pasteurpipette entfernt und die Phagen wurden von dem Agarpfopfen in 0,5 ml Phagenpuffer (20 mM Tris·HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 10 mM MgSO&sub4;) eluiert. Die Plaques wurden durch wiederholtes Ausplattieren der von den isolierten Agarpfropfen eluierten Phagen gereinigt und anschließend mit dem Oligo AB 1719 gescreent. Es wurde gefunden, daß die fünf Plaques in unterschiedlichem Ausmaß mit dem Oligo AB 1719 hybridisierten:
Plaque Hybridisierungssignal
7 +++++
8 +++++
12 ±
45 ++
53 +++++
Nach der Plaquereinigung wurde DNS aus den Phagen isoliert, die aus einem einzelnen Hybridisieungsplaque stammte. Nummer 12 wurde wegen des schwachen Hybridisierungssignals verworfen. Zwischen 30.000-50.000 Plaques wurden auf 15 cm Platten unter Verwendung von TB ohne NaCl und Agarose anstelle von Agar am Boden und am Oberteil ausplattiert. Nach Inkubierung über Nacht wurden die Phagen aus dem Oberteilagar durch 90 minütiges kontinuierliches Schütteln der Platte auf einer Schaukelplattform mit 15 ml Phagenpuffer eluiert. Nach der Hälfte erfuhren die Platten eine Vierteldrehung. Die Phagensuspension wurde von den Platten gesammelt und zentrifugiert, um alle Zellrückstände zu entfernen. DNase und RNase wurden bis zu einer Endkonzentration von 1 ug/ml zugegeben und die Phagensuspension wurde für 45 min bei 37ºC inkubiert. Die Phagen wurden mittels PEG eine Stunde lang auf Eis in 1 M NaCl und 10% PEG 6000 präzipitiert. Nach der Zentrifugation wurde das Phagenpellet in 1 ml Phagenpuffer pro Platte resuspendiert und unlöslicher Rückstand durch Zentrifugation entfernt. SDS und EDTA wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,2% und 15 mM zugegeben, wonach Proteinase K auf 50 ug/ml zugegeben und das Gemisch für 30 min bei 65ºC inkubiert wurde. Nach aufeinanderfolgenden Extraktionen mit gleichen Volumina Phenol, Phenol/Chloroform und Chloroform wurde die DNS aus der wäßrigen Phase mittels Isopropanol ausgefällt. Die DNS wurde in TE, das 0,1 ug/ml RNase enthielt, aufgelöst.
Von jeder Phagen-DNS wurde eine teilweise Restriktionskarte erstellt (siehe Fig. 4 - Phagenklon 7). Zwei der Phagenklone (8 und 53) enthielten ein Fragment der selben genomischen Region von A. niger, während die anderen (7 und 45) davon verschiedene genomische Fragmente enthielten.

Beispiel 7

Isolierung und Charakterisierung des abfB Gens

Phagen-DNS wurde vollständig mit Enzymen verdaut, welche eine Sequenz von vier aufeinanderfolgenden Nucleotiden erkennen, und die entstandenen Fragmente wurden in pTZ18R oder pUC18 ligiert. Die resultierenden Kolonien wurden auf Nitrocellulosemembranen übertragen und mit Oligo AB1719 gescreent, um Plasmide mit einem hybridisierenden Insert auszuwählen. Genügend kleine Inserts wurden sequenziert, um das Insert zu identifizieren. Die Sequenzanalyse eines 2,8 kb SacI Fragments des Phagenklons 7 wurde unter Verwendung eines SequenaseR Version 2.0 Reagenzkits (United States Biochemical) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das Ergebnis der Sequenzanalyse (Fig. 5, Formel 4) zeigt eine Sequenz, in der sowohl die Nucleotidsequenz des Oligos AB1719 als auch die Aminosequenz des N-Terminus des ABF B Proteins entdeckt werden konnten (vergleiche Formel 1 und Fig. 6, Formel 5).
Das 2,8 kb SacI Fragment wurde in das E. coli Plasmid pUC18 kloniert. Dem entstandenen Plasmid wurde die Bezeichnung pGBabfB gegeben und es wurde in dem E. coli Stamm DH5α bei dem Centraal Bureau voor Schimmelcultures (Baarn, Niederlande, am 11. März. 1991, unter der Zugangsnummer CBS 156.91) hinterlegt.

Beispiel 8

Einführung des abfB Gens in Aspergillus niger N 593 durch Co-Transformation

Die in Beispiel 6 erhaltene DNS des Phagenklons 7 wird durch Co-Transformation des Asperaillus niger Stamms N593 unter Verwendung des Aspergillus niger Gens pyrA als selektivem Marker auf das Plasmid pGW635 (Goosen et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 219, 282) und der DNS des Phagenklons 7 als co-transformierender DNS in Aspergillus niger eingeführt. Für die Co-Transformation wurden molare Verhältnisse von 1 : 20 an transformierenden DNS-Stücken zugegeben, um die Häufigkeit der Co-Transformation zu begünstigen.
Um die Co-Transformationshäufigkeiten zu testen wurde das Plasmid pNOM102 (Roberts et al. (1989) Curr. Genet., 15, 177), welches das E. coli uidA Gen beherbergt und für die β- Glucuronidase (GUS) kodiert, als co-transformierende DNS verwendet.
PYRA&spplus; Transformanden wurden anschließend auf X-Glucuronidmedium (Clontech, Palo Allo, CA, U. S. A.; Roberts et al. (1989), siehe oben) überführt und auf GUS Aktivität bewertet. Blaue Kolonien wurden als GUS+ Phänotyp bewertet, farblose als GUS-Phänotyp. Mit pNOM102 bzw. pGW635 Plasmiden für Transformation/Selektion co-transformierter A. niger ergab Co-Transformationshäufigkeiten von bis zu 85%.
Protoplasten wurden aus Mycelen hergestellt, indem für 20 Stunden bei 30ºC Aspergillus niger N593 auf Minimalmedium gezogen wurde, das mit 50 mM Glucose, 0,5% Hefeextrakt, 0,2% Casaminosäuren und 10 mM Uridin ergänzt worden war. Das Minimalmedium hatte die folgende Zusammensetzung (pro 1000 ml): 6,0 g NaNO&sub3;, 1,5 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,5 g KCl, 1 ml Visniaclösung (Visniac, W. & Santer, M. (1957) Bact. Rev., 21, 195), Kohlenstoffquelle wie angegeben, pH-Wert 6,0. Die Herstellung der Protoplasten von A. niger N593 und das Transformationsverfahren wurden wie von Goosen et al. (1987) Current Genet., 11, 499, beschrieben, durchgeführt.
Die entstandenen PYR+ Transformanden wurden isoliert, gereinigt und in Schüttelflaschen (siehe Beispiel 9) auf Arabinofuranosidaseproduktion getestet. Da für das transformierte Gen kein Plattentest verfügbar war, wurde ein von D. Seth (Biotech International Ltd., Australien) entwickelter Polymerasekettenreaktion (PCR) Amplifikationstest als Schnelltest verwendet, um die Transformanden zu identifizieren, die das nicht-selektierte Gen enthalten. Dieser PCR Amplifikationstest wurde wie folgt durchgeführt:
- Einige junge Mycelstränge von PYR+ Transformanden wurden in ein 1,5 ml Reagenzglas überführt;
- 50 ul einer 2%-igen SDS-Lösung wurden in dieses Reagenzglas hinzu gegeben und bei 95ºC 10 Minuten lang erwärmt;
- Die erwärmte Probe wurde 100-fach mit sterilisiertem, ultrareinem Wasser verdünnt;
- 5 ul der verdünnten Probe wurden für die PCR Amplifikation verwendet;
- Die Polymerasekettenreaktionen wurden gemäß dem Lieferanten der AmpliTaqTM Polymerase (Perkin Elmer Cetus) durchgeführt. Nach Denaturierung (8 Minuten bei 100ºC) und Zugabe von 1 ul AmpliTaqTM Polymerase wurden die Reaktionsgemische in einem PHC-2 DNS-Amplifikator (Techne) 25 Amplifikationszyklen (jeweils: 2' bei 94ºC; 2' bei 55ºC; 3' bei 72ºC) unterworfen. Nach dem letzten Zyklus wurde der Polymerisationsschritt bei 72ºC auf 7 Minuten ausgedehnt, um alle Stränge zu vervollständigen;
- Die PCR Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese untersucht. Die Co- Transformationshäufigkeiten für dieses pyrA/PCR Screening betrugen 5-45%.

Beispiel 9

Screening nach Co-Transformanden für die Expression des abfB Gens

Die in Beispiel 8 erhaltenen PYR+ Transformanden wurden auf die Expression des abfB Gens untersucht. Die DNS des Bakteriophagen Lambda 7 enthaltenden PYR+ Transformanden werden mittels des PCR Amplifikationstests ausgewählt.
Sporen dieser Transformanden wurden aus Zellen gesammelt, die für 5 Tage bei 34ºC auf Kartoffeldextroseagar (Difco) Platten gezogen worden waren.
Arabinofuranosidaseproduktion wurde in Schüttelflaschen unter den folgenden Bedingungen getestet:
Etwa 1 · 10&sup6; Sporen wurden in 100 ml Vorkulturmedium angeimpft, enthaltend (pro Liter): 30 g Saccharose, 2 g NaNO&sub3;, 1 g K&sub2;HPO&sub4;, 0,5 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,5 g KCL, 0,01 g FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 5 g Hefeextrakt, 10 g Malzextrakt und 3 g Carboxypolymethylen (B.F. Goodrich Company). Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,1 eingestellt.
Nach dem Wachstum für 48 Stunden bei 34ºC in einer Umlaufschüttelmaschine (250 upm) wurden 5 ml der gewachsenen Kultur in 100 ml eines Hauptkultur P Mediums überimpft, enthaltend (pro Liter): 5 g Sojamehl, 4,4 g Rübenpulpe, 3 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 3 g Glycin, 12 g (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4; und 0,24 g MnSO&sub4;·H&sub2;O. Der pH-Wert wurde mit H&sub3;PO&sub4; auf 6,2 eingestellt.
Das Mycel wurde für mindestens weitere 100 Stunden bei 34ºC und 250 upm weiter gezüchtet. In ausgewählten Abständen wurden Proben entnommen. Das Mycel wurde durch Filtration entfernt und das Kulturfiltrat mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und des in Beispiel 1 beschriebenen Arabinofuranosidasetests untersucht.
Die Ergebnisse der Arabinofuranosidasetests sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Arabinofuranosidaseproduktion durch Co-Transformation von A. niger N593 mit dem Lambdaklon 7
- bedeutet die Abwesenheit eines PCR DNS Fragments
+ bedeutet die Anwesenheit eines PCR DNS Fragments nach Agarosegelelektrophorese
Aus den in Tabelle 3 gezeigten Ergebnissen kann geschlossen werden, daß die PCR-positiven Transfromanden nur 1,5-2 mal mehr Arabinofuranosidase produzieren als die PCR-negativen Transformanden, d. h. diejenigen, die nur den selektiven pyrA Marker aus dem Plasmid pGW635 erhielten.

Beispiel 10

Arabinofuranosidaseexpression in Aspergillus, transformiert mit Expressionsvektoren, die das abfB Gen enthielten, verbunden mit dem Promotor und Signalsequenzen des Amyloglucosidase (glaA) Gens aus A. niger

Beispiel 10.1: Zusammenbau des Expressionsvektors

All Konstrukte wurden unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren hergestellt, wie sie z. B. in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. beschrieben sind.
Um eine Überexpression von Arabinofuranosidase in Aspergillus niger zu erhalten, wurde eine zusätzliche Expressionskassette hergestellt, in welcher das abfB Gen des Amyloglucosidase (AG) Promotors aus A. niger zusammen mit der 18 Aminosäurensignalsequenz des glaA Gens gesteuert wird.

Beispiel 10.2: Zusammenbau von pAB6-1, pAB-6-3, pAB6-4, pAB6-31 und pAGEK1

Das Amyloglucosidase (AG) Gen (glaA) aus A. niger wurde aus Plasmidbibliotheken isoliert, die 3-4 kb EcoRI Fragmente oder 13-15 kb HindIII Fragmente in dem E. coli-Vektor pUC19 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene, 33, 103; erhältlich z. B. von Pharmacia LKB Biotechnology, Schweden) enthielten, unter Verwendung der folgenden AG-spezifischen Oligos:
AG-1: 5'-GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC-3'
(Formel 6)
AG-2: 5'-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3'
(Formel 7)
die beide auf der für die Nukleotidsequenz von A. niger publizierten Sequenz basieren (Boel et al. (1984) EMBO J., 3, 1097-1102; Boel et al. (1984) Mol. Cell. Biol., 4, 2306). Die Oligonucleotidproben wurden abgeleitet aus den Sequenzen, die das Intron 2 umgeben: Oligo AG-1 ist in 3'-Richtung des Introns angeordnet und weist eine Polarität auf, die der der AG mRNS identisch ist, und Oligo AG-2 wird stromaufwärts des Introns 2 gefunden und wird antiparallel zu der AG mRNS gewählt.
Durch dieses Screening wurde das Plasmid pAB6-1 erhalten, welches das glaA Gen auf einem 14,5 kb HindIII Fragment enthält (siehe Fig. 7).
Aus dem Plasmid pAB6-1 wurden mehrere Subklone in pUC19 hergestellt: pAB6-3, welcher ein 1,8 kb EcoRI Fragment unmittelbar stromaufwärts des glaA Gens enthält und möglicherweise regulatorische Sequenzen beinhaltet; pAB6-4, welcher ein 4,6 kb HindIII- BgIII Fragment enthält, das den Promotor des glaA Gens sowie einen Teil des 5'-Endes dieses Gens umfaßt.
Als nächstes wurde das Plasmid pAB6-3 teilweise mit EcoRI verdaut und mit T4 Polymerase behandelt. In dieses Plasmid wurde das HindIII plus EcoRI Fragment das Plasmids pAB6-4 ligiert, wiederum nach Behandlung mit T4 Polymerase. Das erhaltene Konstrukt wurde als pAB6-31 bezeichnet; dieses Konstrukt enthält ein 3,6 kb Stromaufwärtsfragment des glaA Gens mit einer zerstörten EcoRI Stelle in der Mitte und einer einzelnen EcoRI Stelle nahe des glaA Gens.
Aus dem Plasmid pAB6-31 wurde ein 3, 4 kb KpnI/EcoRI Fragment, das die gleichen Stromaufwärtssequenzen des glaA Gens beinhaltete, in den Vektor pTZ18R (Pharmacia, Schweden) subkloniert. Das sich ergebende Konstrukt wurde mit pAGEK1 bezeichnet.

Beispiel 10.3: Zusammenbau von pAGabfB1

Die Fusion des AG-Promotors und der 18 Aminosäurenleadersequenz des glaA Gens mit dem abfB Strukturgen, das für das reife Protein kodiert, wurde mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR), wie schematisch in Fig. 8 dargestellt, durchgeführt.
Als Primer für die PCR-Amplifikationen wurden vier synthetische Oligonucleotide mit den folgenden Sequenzen entworfen:
Primer 2796: 5'-CTCTGCAGGAATTCAAGCTAG-3'
Eine AG-spezifische Sequenz um die EcoRI Stelle herum etwa 250 bp stromaufwärts des ATG Startcodons. (Formel 8) (Formel 9) (Formel 10)
Primer 2630 : 5'-GCTTAGCCCGGGGGTGCTTGGGTCAGG-3'
Eine abfB-spezifische Sequenz, welche nahe an der SmaI Stelle an Position 483 angeordnet ist (Formel 11).
Die PCR wurde, mit kleineren Abänderungen, wie bei Pomp & Medrano (1991) Biotechniques, 10, 58, beschrieben durchgeführt (siehe Beispiel 8).
Um die AG Sequenzen mit den kodierenden abfB Sequenzen zu fusionieren wurden zwei verschiedene PCR Reaktionen durchgeführt:
- Die erste Reaktion (PCR (1) in Fig. 8) verwendete pAB6-1 als Matrize und die Oligos 2796 und 2628 als Primer, um ein 230 bp DNS Fragment zu amplifizieren, welches das 3'-Fragment des AG Promotors und die 18 Aminosäuren AG- Leadersequenz flankiert an der 3'-Grenze durch die Nucleotide des abfB Gens enthielt;
- Die zweite Reaktion (PCR (2) in Fig. 8) verwendete pGBabfB1 als Matrize und die Oligos 2629 und 2630 als Primer, um ein 300 bp DNS Fragment zu amplifizieren, welches den 5'-Anteil des reifen Arabinofuranosidase (abfB) Gens enthält, flankiert an der 5'-Grenze durch 18 Nucleotide des Amyloglucosidase (AG) Signalpeptids.
Die beiden mittels PCR hergestellten DNS Fragmente wurden durch Gelelektrophorese und den SephaglasTM Band Prep Kit (Pharmacia, Schweden) gereinigt.
Diese beiden gereinigten DNS Fragmente wurden, unter Verwendung der Oligos 2796 und 2630 als Primer, als Matrize in der dritten Reaktion (PCR (3) in Fig. 8) verwendet, um die AG-Arabinofuranosidase B Fusion zu erzeugen. Das 530 bp DNS Fragment wurde mittels SmaI verdaut, durch Agarosegelelektrophorese und den SephaglasTM Band Prep Kit gereinigt und in den mit SmaI geschnittenen pTZ18R Vektor ligiert.
Die ligierte DNS wurde in elektrokompetente Top10 Zellen von E. coli wie vom Lieferanten beschrieben transformiert (Invitrogen Corporation; San Diego, CA, U. S. A.). Die Auswahl wurde auf Luria Nährlösung (LB) Platten getroffen, die Xgal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D- galactosid), IPTG (Isopropylthiogalactosid) und Ampicillin enthielten. Plasmid-DNS aus weißen Transformanden wurde wie von Andreoli, P. (1985) Mol. Gen. Genet., 199, 372, beschrieben gewonnen und mittels der Restrikzionsenzyme EcoRI und SmaI untersucht. Diese Transformanden, die das 530 bp Fusions-DNS-Fragment enthielten, wurden sequenziert und mit pAGabfB1 bezeichnet.
Eine schematische Ansicht des Aufbaus des Plasmids pAGabfB1 ist in Fig. 8 dargestellt.

Beispiel 10.4: Zusammenbau von pAGabfB2 und pAGabfB3

Eine schematische Ansicht dieser beiden Plasmidkonstruktionen ist in Fig. 9 gezeigt.
Der E. coli Vektor pBluescript II SK (+), erhältlich von Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA, U.S.A.), wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt.
Das 530 bp EcoRI-SmaI Fragment aus dem Plasmid pAGabfB1 und das 1,8 kb SmaI-XhoI Fragment aus pGBabfB 1 (enthaltend das reife abfB Gen) wurden isoliert (siehe Beispiel 7). Diese beiden Fragmente wurden in den mittels EcoRI-XhoI geschnittenen pBluescript II SK(+) Vektor ligiert und in E. coli DH5α kompetente Zellen transformiert, die gemäß eines modifizierten Hanahanverfahrens ((1983) J. Mol. Biol., 166, 557) hergestellt worden waren. Die Selektion erfolgte auf LB Platten, die Xgal, IPTG und Ampicillin enthielten. Plasmid- DNS von weißen Transformanden wurde hergestellt und mittels der Restriktionsenzyme EcoRI und XhoI untersucht. Das Plasmid, welches das gewünschte 2, 3 kb EcoRI-XhoI Fragment enthielt, wurde mit pAGabfB2 bezeichnet.
Für den Zusammenbau von pAGabfB3 wurde der übrig gebliebene, stromaufwärts gelegene. 3,4 kb Bereich des AG-Promotors durch Verdau des Plasmids pAGEKI mit KpnI und EcoRI erhalten und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt.
Das 2,3 kb EcoRI-XhoI Fragment, welches das fusionierte AG-Arabinasegen enthielt, wurde aus dem Plasmid pAGabfB2 gereinigt.
Diese beiden Fragmente wurden in den pBluescript II SK(+) Vektor (welcher mit KpnI-XhoI geschnitten war) ligiert und verwendet, um kompetente E. coli DH5α Zellen wie oben beschrieben zu transformieren.
Nach Plasmid-DNS-Isolierungen und Restriktionsenzymanalysen wurde die gewünschte Expressionskassette pAGabfB3 erhalten (siehe Fig. 9).

Beispiel 10.5: Zusammenbau von pAGabfB4

Um einen homologen Selektionsmarker für die Transformation des Aspergillus niger Stamms N593 (Goosen et al. (1987), oben) einzuführen, wurde das das pyrA Gen (Goosen et al. (1989), siehe oben) enthaltende 3,8 kb XbaI Fragment des Plasmids pGW635 in die einzige XbaI Stelle der pAGabfB3 Expressionskassette eingesetzt. Das entstandene Expressions/Selektions-Plasmid wurde, als pAGabfB4 bezeichnet und ist in Fig. 10 gezeigt.

Beispiel 10.6: Zusammenbau von pAGabfB5

Ein 3,8 kb HindIII-XbaI Fragment des Plasmids pFYT3 (von Gorcom, R. F. et al., (1991) Europäische Patentanmeldung 0 420 358 A1), enthaltend das amdS Selektionsgen aus Aspergillus nidulans (Corrick et al. (1987) Gene, 53, 63), wurde isoliert und in das mit HindIII-XbaI geschnittene pAGabfB3 Plasmid eingesetzt. Das entstandene Expressions/Selektions-Plasmid wurde als pAGabfB5 bezeichnet und ist in Fig. 11 gezeigt.

Beispiel 10.7: Einführung der Expressionskassetten pAGabfB3 und pAGabfB4 in Aspergillus niger N593

Das Plasmid pAGabfB3 wurde durch Co-Transformation des Stammes N593 unter Verwendung des pyrA Gens als Selektivmarker auf das Plasmid pGW635 (Goosen et al. (1989), siehe oben) und der Expressionskassette pAGabfB3 als co-transformierende DNS in A. niger eingeführt.
Die Transformation des Stammes N593 mit der Expressionskassette pAGabfB4 wurde wie von Kusters-von Someren et al. (1991) Curr. Genet., 20, 293, beschrieben durchgeführt.
Die sich ergebenden PYR&spplus; Transformanden wurden isoliert, gereinigt und in Schüttelflaschen unter Verwendung des in Beispiel 11 beschriebenen Verfahrens auf Arabinofuranosidaseproduktion getestet.
Als Kontrolle wurden Tansformanden getestet, die nur den Vektor pGW635 enthielten.

Beispiel 10.8: Einführung der Expressionskassette pAGabfB5 in den Aspergillus niger Stamm CBS 513.88

Das Plasmid pAGabfB5 wurde unter Verwendung der von Tilburn et al. (1983) Gene, 26, 205, und Kelly & Hynes (1985) EMBO J., 4, 475, beschriebenen Transformationsverfahren mit den folgenden Abänderungen in den Aspergillus niger Stamm CBS 513.88 (hinterlegt am 10. Oktober 1988) eingeführt:
- Das Mycel wurde für 16 Stunden bei 30ºC auf einer Umlaufschüttelmaschine bei 300 upm auf Aspergillus Minimalmedium angezogen (Cove (1966) Biochem. Biophys. Acta, 113, 51), ergänzt durch 10 mM Arginin und 10 mM Prolin;
- für die Bildung der Protoplasten wurde nur Novozym 234 (NOVO Industri), und keine Helicase, verwendet;
- nach 90 Minuten Protoplastenbildung wurde 1 Volumen an STC Puffer (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl&sub2;) zu der Protoplastensuspension zugegeben und es wurde bei 2500 g bei 4ºC 10 Minuten lang in einem Rotor mit Schwinggefäßen zentrifugiert. Die Protoplasten wurden zweimal gewaschen und in STC Puffer mit einer Konzentration von 108 Zellen/ml resuspendiert;
- Plasmid-DNS wurde in einem Volumen von 10 ul in TE Puffer (1.0 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA) zu 100 ul der Protoplastensuspension hinzu gegeben;
- nach der Inkubation der DNS-Protoplastensuspension bei 0ºC für 15 Minuten wurden 200 ul einer PEG-Lösung tropfenweise zugegeben (25% PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl&sub2;) und die Inkubation bei Raumtemperatur 10 Minuten lang fortgesetzt. Danach wurde 1 ml einer PEG-Lösung (60% PEG 4000 in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl&sub2;) langsam zugegeben, bei wiederholtem Mischen der Reagenzgläser. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten wurden die Suspensionen mit STC Puffer verdünnt, durch Inversion gemischt und bei 2000 · g und 4ºC 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Protoplasten wurden sanft in 200 ul STC- Puffer resuspendiert und auf Aspergillus selektivem Minimalmedium mit 10 mM Acetamid als einziger Stickstoffquelle und 1 M Saccharose, verfestigt mit 0,75% bakteriologischem Agar Nr. 1 (Oxoid), ausplattiert. Das Wachstum wurde bei 30ºC für 6-10 Tage durchgeführt.
Die sich ergebenden Transformanden wurden mittels Abdruck auf selektive Acetamid- Minimalmedium 1,2% Agaroseplatten plattiert und bei 30ºC für 4-7 Tage inkubiert.
Nach 4-7 Tagen erscheinen gegen einen sehr schwachen Hintergrund schnell wachsende und gut sporulierende Transformanden.
Die AMDS&spplus; Transfromanden wurden durch Spreiten von einzelnen Kolonien auf selektiven Minimalmedium 1, 2% Agaroseplatten gereinigt und in Schüttelflaschen unter Verwendung des in Beispiel 11 beschriebenen Verfahrens auf Arabinofuranosidaseproduktion getestet.

Beispiel 11

Expression des Arabinofuranosidase B Gens unter der Kontrolle des AG Promotors und der 18 Aminosäuren AG Leadersequenz in Aspergillus niger

Sporen der gereinigten Transformanden wurden von Zellen gesammelt, die für 3-5 Tage bei 34ºC auf Kartoffel-Dextrose Agar (Difco) Platten gezüchtet worden waren.
Etwa 1 · 10&sup8; Sporen wurden in 100 ml Vorkulturmedium eingeimpft, enthaltend (pro Liter): 1 g KH&sub2;PO&sub3;; 30 g Saccharose (Maltose); 5 g Hefeextrakt; 10 g Caseinhydrolysat; 0,5 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O und 3 g Tween 80. Der pH-Wert wurde auf 5,5 eingestellt.
Nach Wachstum über Nacht bei 34ºC in einer Umlaufschüttelmaschine (250 upm) wurde 1 ml der Wachstumskultur in 100 ml einer Hauptkultur überimpft, enthaltend (pro Liter): 1 g KH2PO&sub3;; 70 g Maltodextrin (Maldex MDO3, Amylum); 12,5 g Hefeextrakt; 25 g Caseinhydrolysat; 2 g K2504; 0,5 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O; 0,03 g ZnCl&sub2;; 0,02 g CaCl&sub2;; 0,05 g MnSO&sub4;·4H&sub2;O und 0,3 g FeSO&sub4;. Der pH-Wert wurde auf 5,6 eingestellt.
Das Mycel wurde für mindestens weitere 140 Stunden bei 34ºC und 250 upm gezüchtet. In ausgewählten Zeitabständen wurden Proben entnommen. Das Mycel wurde durch Filtration entfernt und das Kulturflitrat durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und den Arabinofuranosidasetest, wie in Beispiel 1 beschrieben, untersucht.
Die N593 Transformanden, welche die pAGabfB3 oder die pAGabfB4 Expressionskassette enthalten, zeigen eine gesteigerte Produktion des ABF B Enzyms verglichen mit den N593 Transformanden, die nur den pyrA Selektionsmarker enthalten.
Die CBS 513.88 Transformanden, welche die pAGabfB5 Expressionskassette enthalten, zeigen eine gesteigerte Expression des ABF B Enzyms, verglichen mit den CBS 513.88 Transformanden, welche die p18FYT3 Expressionskassette enthielten.

Beispiel 12:

Aminosäuresequenzbestimmung der α-L-Arabinofuranosidase B (ABF B)

Etwa 1-2 nmol aus einem Kulturfiltrat von A. niger N400 erhaltene α-L-Arabinofuranosidase B (ABF B) und gereinigt wie von von der Veen et al. ((1991), siehe oben) beschrieben wurden für die Gasphasensequenzierung verwendet (SON Facility, Leiden, NL). Die folgende Sequenz wurde bestimmt:
Xaa-Pro-Xaa-Asp-Ile-Tyr-Glu-Ala-Gly-Asp-Thr-Pro
(Formel 12)
Zusätzlich wurden 2-4 nmol des Proteins mittels CNBr unter Verwendung folgender Methoden gespalten: Das Protein wurde 18 Stunden lang gegen Bidest. dialysiert und danach gefriergetrocknet. Das Pulver wurde in 70%-iger Ameisensäure in einer Konzentration von 1 mg/ml resuspendiert. Zu dieser Lösung wurde ein 200-facher Überschuß an CNBr, bezogen auf die erwartete Anzahl an Methioninresten, gegeben und die Proteinlösung wurde bei Dunkelheit und Raumtemperatur 24 Stunden lang inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde gefriergetrocknet, zweimal mit Bidest. gewaschen und in Probenpuffer (50 mM Tris pH 6,8; 100 mM Dithiothreitol; 2% SDS; 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerin) resuspendiert. Diese Lösung wurde für 3 Minuten bei 100ºC erwärmt, wonach die Peptide auf einem 15%- igen SDS-Polyacrylamidgel getrennt wurden, gefolgt von einem Blotten auf eine Immobilion- P Membran (Millipore) gemäß der von Matsudaira, P. ((1987) J. Biol. Chem., 262, 10035) beschriebenen Methode. Membranfragmente, die 2-3 nmol des bestimmten Peptids enthielten, wurden mit Bidest. gewaschen und der Sequenzanalyse unterzogen, gemäß der von Amons, R. ((1987) FEBS Lett., 212, 68) beschrieben Methode. Die folgenden Aminosäuresequenzen wurden bestimmt:
Glu-Asn-Asn-Leu-Phe-Ser-(Gly)-Ala-Asp-Glu-(Gly)-Tyr-Asn-Ser-(Thr)-Asp-Pro-Thr (Fomel 13)
Ser-Lys-Glu-Gly-Ala-Ile-Ile-Leu-Gly-Ile-Gly-Gly-Asp-Asn-Ser-Asn-Gly-Ala-GIn-Gly (Formel 14)
Thr-Ser-Gly-Tyr-Pro-Ser-Asp-Asp-Val-Glu-Asn-(Ser)-Val-Xaa-Gln-Ile-Val-Ala (Formel 15)
Die Aminosäuresequenzen der Formeln 12-15 wurden ebenfalls in der abgeleiteten Aminosäuresequenz gefunden, wie sie in Fig. 6 gezeigt ist. Dies bestätigt, daß das ABF B Enzym in unterschiedlichen Aspergillus niger Stämmen konserviert ist.

Beispiel 13.

Charakterisierung des abfB Gens

Der Sequenz, die das abfB Strukturgen (Fig. 5, Formel 4) enthält, wie es in dem 2,8 kb SacI Fragment (siehe Beispiel 7) gefunden wird, geht ein 166 Nucleotide langer Stromaufwärtsbereich voraus. Eine mutmaßliche TATA Box erstreckt sich von Position 54 bis Position 60.
Der strukturelle Teil des abfB Gens erstreckt sich von Position 167 bis Position 1666 und enthält keine Introns.
Das abfB Gen kodiert für ein 499 Aminosäuren langes Protein, das ein abgeleitetes Molekulargewicht von 52523 Da (Fig. 6, Formel 5) aufweist, wie es nach der Sequenz des abfB Gens bestimmt und durch die abfB cDNS Sequenz bestätigt wurde. Der N-terminalen Aminosäuresequenz, wie in Beispiel 12.2 (Formel 14) bestimmt, geht eine 18 Aminosäuren lange hydrophobe Sequenz voraus. Die anhand der CNBr Peptide (Formeln 15, 16 und 17) bestimmten Aminosäuresequenzen finden sich in der Sequenz von Aminosäureposition 203 bis Position 219, 267 bis 286 und 294 bis 312. Das reife ABF B Protein ist 481 Aminosäuren lang, weist ein abgeleitetes Molekulargewicht von 50663 Da und einen theoretischen IEP von 3,8 auf. Der abgeleitete Molekulargewichtswert für das ABF B Enzym weicht von denen oben in der Literatur angegebenen ab (siehe Rombouts et al., oben, und von der Veen et al., oben). Dies ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß die Bestimmungen gemäß der Literatur mit dem glycosylierten Protein gemacht wurden, wohingegen das im vorliegenden Beispiel gefundene, abgeleitete Molekulargewicht streng auf dem nicht glycosylierten Protein beruht.

Beispiel 14

Enzymatische Aktivität des ABF B auf Arabinosid-haltige, aus Trauben gewonnene glycosidische Extrakte

Es wurde durch Extraktion eines Mosts von Trauben der Sorte Muscat de Frontignan gemäß der von Gunata et al. ((1989) siehe oben) beschriebenen Methode ein glycosidischer Extraxt gewonnen.
Das Versuchsprotokol für die enzymatische Hydrolyse des glycosidischen Extrakts unter Verwendung des ABF B Enzyms war wie von Gunata et al. ((1989) siehe oben) beschrieben.
Zu 200 ul des glycosidischen Extrakts wurden 50 ul (0,15 nkat, bestimmt nach der von Gunata et al. ((1989) siehe oben) beschriebenen Methode) einer Lösung von α-Arabinosidase (ABF B) hinzu gegeben und 16 Stunden lang bei 40ºC und einem pH-Wert von 4,4 inkubiert. Die Lösung wurde dann mit 5 · 250 ul Pentan extrahiert. Die Hydrolyse wurde mittels Dünnschicht- und Gaschromatographie überwacht.
Danach wurden 50 ul (0,15 nkat, bestimmt nach der von Gunata (1989) beschriebenen Methode, siehe oben) einer β-Glucosidaselösung zu der Lösung hinzu gegeben. Die so erhaltene Lösung wurde für 16 Stunden bei 40ºC und einem pH-Wert von 4,4 reinkubiert und mit 5 · 250 ul Pentan extrahiert. Die Hydrolyse wurde mittels Dünnschicht- und Gaschromatographie überwacht.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß das ABF B Enzym in der Lage war, 70% des Arabinosylglucosids aus dem glycosidischen Extrakt zu hydrolysieren.

Beispiel 15

In-vitro Verdauung von Zuckerrübenbrei mit β-L-Galaktanase und/oder α-L-Arabinofuranosidase

In einem Modellsystem, in dem die Verhältnisse simuliert werden, wie sie im Magen und Dünndarm von Schweinen gefunden werden, wurde Zuckerrübenbrei mit α-L- Arabinofuranosidase (ABF B), β-L-Galaktanase und einem Gemisch beider Enzyme inkubiert.
Der Zuckerrübenbrei wurde zuerst drei Stunden lang bei pH = 3,0 und T = 39ºC (Bedingungen im Schweinemagen) inkubiert. Danach wurde der Brei für weitere drei Stunden bei pH = 6,5 und T = 39ºC (Bedingungen im Schweinedünndarm) inkubiert.
Nach der enzymatischen Inkubation wurde die Differenz zwischen der ursprünglichen Trockenmasse und den nach der enzymatischen Hydrolyse (die Masse wurde 24 Stunden lang bei T = 103ºC getrocknet) zurückbleibenden unlöslichen Rückständen bestimmt. Dieser Unterschied in der Trockenmasse wurde als relatives Maß für die in-vitro Verdauung des Zuckerrübenbreis angesehen. Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4

Prozentsatz der Verdaubarkeit, bezogen auf die Trockenmasse nach enzymatischer Inkubation, von Zuckerrübenbrei unter Bedingungen im Magen und Dünndarm von Schweinen

% Verdauung
Blindwert 15,9
α-L-Arabinofuranosidase (ABF B) 15,8
β-L-Galaktanase 16,0
α-L-Arabinofuranosidase (ABF B) plus β-L-Galaktanase 24,8
Ähnliche Ergebnisse wurden mit Weizenkleie erhalten.

Claims

1. Gereinigtes und isoliertes DNS-Molekül, welches für ein aus einem Pilz stammenden Enzym mit Arabinan-abbauender Aktivität kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß das DNS-Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) einem aus einem Pilzstamm erhältlichen DNS-Molekül, welches für ein Enzym mit Arabinan-abbauender Aktivität kodiert, wobei das DNS- Molekül die in Fig. 5 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist;

b) genetischen Varianten des DNS-Moleküls nach Punkt a);

c) DNS-Molekülen, die mit den DNS-Molekülen entweder gemäß des oben genannten Punkts a) oder des Punkts b) hybridisieren können;

d) einem DNS-Molekül, welches für ein Enzym kodiert, das die in Fig. 6 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

2. Gereinigtes und isoliertes DNS-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Enzym, das durch das DNS-Molekül kodiert wird, eine Arabinan abbauende Aktivität vom Exo- Typ auf (1-> 3)-α-L-Arabinosidbindungen und (1-> 2)-α-L-Arabinosidbindungen hat.

3. Gereinigtes und isoliertes DNS-Molekül nach Anspruch 2, wobei das DNS-Molekül in dem Plasmid pGBabfB1 (CBS 156.91) enthalten ist.

4. Gereinigtes und isoliertes DNS-Molekül nach Anspruch 1, wobei das DNS-Molekül aus einem Pilz, ausgewählt aus den Gattungen Aspergillus, Dichotomitus, Corticium, Phytophthora und Rhodotorula, erhältlich ist.

5. Gereinigtes und isoliertes DNS-Molekül nach Anspruch 4, wobei das DNS-Molekül erhältlich ist aus einem Pilz der Gattung Aspergillus.

6. Gereinigtes und isoliertes DNS-Molekül nach Anspruch 4, wobei das DNS-Molekül erhältlich ist aus einem Pilz der Art ausgewählt aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigensis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Dichotomitus squalens, Corticium rolfsii, Penicillium chryso egenum und Rhodotorula flava.

7. Gereinigtes und isoliertes DNS-Molekül nach Anspruch 4, wobei das DNS-Molekül erhältlich ist aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigensis oder Aspergillus niger var. awamori.

8. DNS-Konstrukt, welches die Fähigkeit besitzt, die gesteigerte Expression eines DNS- Moleküls zu bestimmen, das für ein Enzym kodiert, welches eine Arabinan abbauende Aktivität aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß ein DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 funktionsfähig mit regulatorischen Bereichen, welche die gesteigerte Expression des Arabinan-abbauenden Enzyms bestimmen, in einem geeigneten Wirt verbunden ist.

9. DNS-Konstrukt nach Anspruch 8, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorischen Bereiche einen Promotor aufweisen, der funktionsfähig mit einem DNS-Molekül gemäß Anspruch 1 verbunden ist, wobei der Promotor erhältlich ist aus den folgenden Genen: Endo α-L-Arabinanase (abnA)-Gen aus Pilzen; α-L- Arabinofuranosidase A (abfA)-Gen aus Pilzen; α-L-Arabinofuranosidase B (abfB)- Gen aus Pilzen; Xylanase (xlnA)-Gen aus Pilzen; Phytase Gen aus Pilzen; ATP- Synthetase-Gen aus Pilzen; Untereinheit 9 (oliC)-Gen aus Pilzen: Triosephosphatisomerase (tpi)-Gen aus Pilzen; Alkoholdehydrogenase (adhA)-Gen aus Pilzen; α-Amylase (amy)-Gen aus Pilzen; Amyloglucosidase (glaA)-Gen aus Pilzen; Acetamidase (amdS)-Gen aus Pilzen; Glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenase (gpd)-Gen aus Pilzen; Alkoholdehydrogenase-Gen aus Hefe; Lactase-Gen aus Hefe; 3-Phosphoglyceratkinase-Gen aus Hefe; Triosephosphatisomerase-Gen aus Hefe; α-Amylase-Gen aus Bakterien; Spo2-Gen aus Bakterien; und extrazellulären Protease-Genen aus Bakterien.

10. DNS-Konstrukt nach Anspruch 8, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorischen Bereiche eine Sekretions-Leader-Sequenz aufweisen, wobei der Sekretions-Leader erhältlich ist aus den folgenden Genen: Amyloglucosidase (glaA)- Gen 18 Aminosäuren AG Leader aus Pilzen; Amyloglucosidase (glaA)-Gen 24 Aminosäuren AG Leader aus Pilzen; α-Faktor-Gen aus Hefe, und α-Amylase-Gen aus Bakterien.

11. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein DNS-Konstrukt nach Anspruch 8 enthält.

12. Vektor nach Anspruch 11, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Plasmid ist.

13. Transformierter, mikrobieller Wirt, der die Fähigkeit der gesteigerten Expression eines Enzyms mit einer Arabinan-abbauenden Aktivität besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß der mikrobielle Wirt ein DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 8 enthält.

14. Transformierter; mikrobieller Wirt nach Anspruch 13, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß der mikrobielle Wirt ausgewählt ist aus den Gattenungen bestehend aus Aspergillus, Kluyveromyces, Trichoderma, Saccharomyces und Bacillus.

15. Transformierter; mikrobieller Wirt nach Anspruch 14, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß der mikrobielle Wirt ausgewählt ist aus den Arten bestehend aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus niger var. tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Kluyveromyces lactis und Saccharomyces cerevisiae.

16. Verfahren für die gesteigerte Expression eines Enzyms mit Arabinan-abbauender Aktivität, gekennzeichnet durch die Schritte:

a) Kultivieren eines mikrobiellen Wirts gemäß Anspruch 13 unter Bedingungen, welche der Expression eines Enzyms mit Arabinan-abbauender Aktivität förderlich sind; und

b) Gewinnen des Enzyms mit Arabinan-abbauender Aktivität.

17. Verfahren für die gesteigerte Expression eines Enzyms mit Arabinan-abbauender Aktivität nach Anspruch 16, wobei der mikrobielle Wirt ein DNS-Konstrukt enthält, welches seinerseits ein DNS-Molekül gemäß Anspruch 2 enthält.