DE69734936T2

DE69734936T2 - Wirtszellen und methoden für die produktion von proteinen

Info

Publication number: DE69734936T2
Application number: DE69734936T
Authority: DE
Inventors: Jan Lehmbeck
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-09-19
Filing date: 1997-09-19
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2017-09-20
Also published as: ATE313620T1; DK0956338T3; WO1998012300A1; EP0956338B1; JP4091119B2; DE69734936D1; CN1230986A; JP2001500381A; CN1262639C; ES2256895T3; US6352841B1; EP0956338A1; AU4200897A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pilzwirtszellen und Verfahren zur Herstellung von Proteinen. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Zelle von Aspergillus oryzae, die für die Expression heterologer Proteine verwendbar ist, wobei die Wirtszelle genetisch modifiziert wurde, um wesentlich verminderte Mengen einer Metalloprotease und alkalischen Protease zu exprimieren. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen von Interesse mit hohen Ausbeuten durch Verwenden des Pilzes der Erfindung, wobei das Verfahren das Züchten der Zelle in einem geeigneten Wachstumsmedium gefolgt von der Gewinnung des gewünschten Proteins umfasst. Die Erfindung umfasst ebenso Verfahren zur Herstellung derartiger Pilze und DNA-Konstruktionen, die für diese Verfahren geeignet sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Verwendung rekombinanter Wirtszellen zur Expression heterologer Proteine vereinfachte in den letzten Jahren bedeutend die Herstellung großer Mengen kommerziell nützlicher Proteine, welche ansonsten nur durch Reinigung von ihren natürlichen Quellen erhältlich sind. Zurzeit gibt es eine verschiedenartige Auswahl von Expressionssystemen, aus der zur Herstellung eines beliebigen gegebenen Proteins einschließlich eubakterieller und eukaryotischer Wirte ausgewählt werden kann. Die Auswahl eines geeigneten Expressionssystems hängt häufig nicht nur von der Fähigkeit der Wirtszelle ab, geeignete Ausbeuten des Proteins in einem aktiven Zustand herzustellen, sondern kann auch weitgehend vom beabsichtigten Endverwendungszweck des Proteins bestimmt sein.
Ein häufig anzutreffendes Problem ist die große Menge proteolytischer Enzyme, die von einer gegebenen Wirtszelle hergestellt werden oder im Kulturmedium vorliegen. Es wurde nahe gelegt, dass man Wirtsorganismen mit entzogener Fähigkeit, bestimmte proteolytische Verbindungen herzustellen, bereitstellen könnte. Zum Beispiel beschreibt die internationale Patentanmeldung WO 90/00192 (Genencor) Fadenpilzwirte, die unfähig sind, enzymatisch aktive Aspartat-Proteinasen zu sezernieren, und EP 574 347 (Ciba Geigy AG) Aspergillus-Wirte, die in einer Serin-Protease des Subtilisin-Typs einen Defekt aufweisen.
Metalloproteasen wurden von etlichen eukaryotischen Quellen isoliert. Ebenso wurde von Aspergillus-Stämmen isolierten, neutralen Metalloproteasen, d.h. Metalloproteasen, die bei einem neutralen pH-Wert eine optimale Aktivität aufweisen, berichtet. Von den physikalisch-chemischen Eigenschaften zweier neutraler Metalloproteasen von Aspergillus sojae, NpI und NpII, wurde in einer Reihe von Studien berichtet (Sekine, H., 1972, Agric. Biol. Chem. 36: 198–206, 207–216; Sekine, H., 1972, Agric. Biol. Chem. 36: 2143–2150). Es zeigte sich, dass die enzymatischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften von NpI, jedoch nicht von NpII, denen des Thermolysins von Bacillus thermoproteolyticus gleichen. Kürzlich wurde die cDNA-Sequenz einer neutralen Metalloprotease, NpII, von Aspergillus oryzae offenbart (Tatsumi, H. et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 228: 97–103). Jedoch wurde die cDNA-Sequenz einer neutralen Metalloprotease der NpI-Gruppe von Aspergillus oryzae nie offenbart.
Die alkalische Protease ist eine Serin-Protease mit einem alkalischen pH-Optimum (Nakagawa, Y., 1970, Methods Enzymol. 19: 581–591). Sie ist ein Homologon des Subtilisins und die vorherrschende extrazelluläre alkalische Endopeptidase von Aspergillus oryzae. Das Gen wurde isoliert und charakterisiert (Murakami et al., 1991, Agric. Biol. Chem. 55: 2807–2811). Zwei andere Spezies von Aspergillus, A. flavus und A. sojae, stellen identische oder nah verwandte Enzyme her.
Von einer möglichen Rolle von Metalloproteasen und alkalischen Proteasen bei der Verminderung der Stabilität der von Aspergillus erhaltenen Proteinprodukte wurde nicht berichtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, dass die proteolytische Aktivität der neutralen Metalloprotease I und der alkalischen Protease entweder einzeln oder in Kombination die Stabilität eines durch eine Zelle hergestellten Proteinprodukts von Interesse wesentlich vermindern kann, was zu einer verminderten Ausbeute des Proteins führt.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Zelle von Aspergillus orzyae bereit, in die eine ein heterologes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz eingeführt wurde, wobei die Zelle durch rekombinante DNA-Technologie in einer Weise modifiziert wurde, durch welche

a) eine endogene Metalloprotease,
i) die durch die in SEQ. ID. NR. 2 gezeigte DNA-Sequenz oder eine zu mindestens 70% mit SEQ. ID. NR. 2 identischen DNA-Sequenz kodiert ist, und
b) eine endogene alkalische Proteaseaktivität, die durch die in SEQ. ID. NR. 3 gezeigte DNA-Sequenz oder eine zu mindestens 70% mit SEQ. ID. NR. 3 identischen DNA-Sequenz kodiert ist,

In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteinprodukts in einer Zelle von Aspergillus oryzae der Erfindung bereit, wobei das Verfahren das Einführen einer das Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz in die Zelle, das Züchten der Zelle in einem geeigneten Wachstumsmedium und das Gewinnen des heterologen Proteinprodukts umfasst.
Durch das Verfahren der Erfindung wird die proteolytische Aktivität, die aus einer neutralen Metalloprotease I und einer alkalischen Protease resultiert, wesentlich vermindert und dabei die Stabilität und Ausbeute des durch das Verfahren erhaltenen Proteins verbessert. Darüber hinaus kann es sich bei dem durch das Verfahren der Erfindung erhaltenen Protein um ein Vorläuferprotein, wie z.B. ein Zymogen, ein Hybridprotein, ein als Prosequenz oder Präprosequenz erhaltenes Protein oder einen beliebigen anderen Typ der unreifen Form handeln.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch Bezugnahme auf die Zeichnungen in der Anlage veranschaulicht, wobei:
1 die Konstruktion des Plasmids pJaL335 darstellt, das das pyrG-Gen trägt;
2 die Konstruktion des Plasmids pSO5 darstellt, das die 5'- und 3'-Sequenzen des pyrG-Gens trägt;
3 die Konstruktion des Plasmids pJaL212 darstellt, wobei die pyrG kodierende Sequenz zwischen den 5'- und 3'-Sequenzen des alp-Gens eingefügt wurde;
4 die Konstruktion des Plasmids pJaL399 darstellt, wobei die NpI kodierende Sequenz zerstört ist;
5 die N-terminale Aminosäuresequenz der Lipase B von Candida antarctica und die Sequenzen zweier, von dieser Sequenz abgeleiteten Oligonukleotid-Primer zeigt;
6 die Konstruktion des Plasmids pMT1305 darstellt, das das Gen der Lipase B von C. antarctica trägt;
7 die Konstruktion des Plasmids pMT1329 darstellt, das eine Teilsequenz vom 5'-Ende des Gens der Lipase B von C. antarctica trägt;
8 die Konstruktion des Plasmids pMT1332 darstellt, das das Gen der Lipase B von C. antarctica trägt; und
9 die Konstruktion des Expressionsplasmids pMT1335 darstellt, das das Gen der Lipase B von C. antarctica trägt.
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung stellt eine Wirtszelle bereit, die zur Expression heterologer Proteine verwendbar ist, wobei die Zelle genetisch modifiziert wurde, um wesentlich verminderte Mengen einer Metalloprotease- und alkalischen Proteaseaktivität im Vergleich zu einer parentalen Zelle zu exprimieren. Die Wirtszelle ist von der parentalen Zelle abgeleitet, die eine Wildtypzelle sein kann.
Vorzugsweise ist die Wirtszelle der Erfindung ein Fadenpilz, der ein gewünschtes Protein herstellen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fadenpilz ein Stamm von Aspergillus oryzae.
Metalloproteasen
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung handelt es sich bei einer Metalloprotease um ein proteolytisches Enzym, das ein katalytisches Zinkmetallzentrum enthält, das an der Hydrolyse des Peptidgerüsts des Substrats beteiligt ist. Das aktive Zinkzentrum unterscheidet diese Proteasen von den Calpainen, deren Aktivitäten von der Anwesenheit von Calcium abhängen. Die Bestätigung einer Protease als eine Metalloprotease besteht in dem umkehrbaren Verlust der proteolytischen Aktivität nach Entfernung des Zinkzentrums mit 1 mM 1,10-Phenanthrolin und seine Wiederherstellung nach Titration mit Zn²⁺ (0,1–100 mM).
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der im Zusammenhang mit dieser Erfindung vorgesehenen Metalloprotease um eine neutrale Metalloprotease, die eine Metalloprotease ist, welche eine optimale proteolytische Aktivität im neutralen pH-Bereich, d.h. im pH-Bereich von etwa 6–8, vorzugsweise im pH-Bereich von etwa 6,5–7,5, insbesondere bei einem pH-Wert von etwa 7 besitzt. Insbesondere handelt es sich bei der im Zusammenhang mit dieser Erfindung vorgesehenen Metalloprotease um eine neutrale Aspergillus-Metalloprotease der Gruppe NpI oder NpII (Tatsumi et al., 1991, vorstehend).
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Metalloprotease um eine neutrale Metalloprotease I (NpI) von Aspergillus oryzae, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die von der als SEQ. ID. NR. 2 dargestellten Nukleotidsequenz oder einer dazu homologen Sequenz abgeleitet ist.
Alkalische Proteasen
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung handelt es sich bei einer alkalischen Protease um eine Serin-Protease mit einer Aktivität, deren Höchstwert im neutralen oder alkalischen pH-Bereich liegt. Die Analysen der Aminosäuresequenz alkalischer Proteasen deuten auf eine Homologie zu der Subtilase-Untergruppe der Subtilisin-ähnlichen Serin-Proteasen hin. Wie es von Siezen et al. (1991, Protein Eng. 4: 719–737) zusammengefasst wurde, wurden über 50 Subtilasen bei einer breiten Vielfalt an Organismen identifiziert, die von verschiedenen Spezies von Bakterien einschließlich Gram-positiver und Gram-negativer Spezies, über Pilze und Hefe, bis hin zu höheren Eukaryoten, einschließlich Würmern, Insekten, Pflanzen und Säugern reicht. Die Aminosäuresequenz wurde in über 40 dieser Subtilasen bestimmt, und es zeigte sich, dass sich der reife Bereich des Enzyms über eine Länge von 268 bis 1775 Aminosäuren und ein Präprobereich von 27 bis 280 Aminosäuren in der N-terminalen Umgebung erstreckt. Bei Pilzen und Hefe ist die Variation mit entsprechenden Bereichen von 279 bis 281 und 105 bis 121 bei Pilzen und 297 bis 677 und 126 bis 280 in Hefe offensichtlich kleiner. Ein cDNA-Fragment des gesamten kodierenden Bereichs der alkalischen Protease von Aspergillus oryzae wurde in Saccharomyces cerevisiae kloniert und exprimiert (Tatsumi, H. et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219: 33–38). Es zeigte sich, dass die Primärstruktur mit anderen sequenzierten Subtilisinen eine Homologie von 29% bis 44% teilt, und die drei Reste in der aktiven Stelle, Asp32, His64 und Ser221 in Subtilisin BPN' wurden konserviert.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der alkalischen Protease um eine alkalische Protease von Aspergillus oryzae (alp), die vorzugsweise durch eine cDNA-Sequenz kodiert ist, die die als SEQ. ID. NR. 3 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine dazu homologe Sequenz umfasst.
Sequenz-Homologie
Wie hierin verwendet ist die DNA-Sequenz-Homologie festgelegt als der Identitätsgrad zwischen den zwei Sequenzen, der eine Abstammung der ersten Sequenz von der zweiten anzeigt. Die Homologie kann in geeigneter Weise mit Hilfe von den auf dem Fachgebiet bekannten Computerprogrammen bestimmt werden, wie z.B. GAP, welches in dem GCG-Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI, USA; Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., 1970, J. Mol. Biol. 48: 443–453) bereitgestellt ist. Durch Verwenden der folgenden GAP-Einstellungen für den DNA-Sequenzvergleich, eine Bildungsstrafe von 5,0 und eine Verlängerungsstrafe von 0,3, zeigt der kodierende Bereich der analogen DNA-Sequenz einen Identitätsgrad vorzugsweise von mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95% und am stärksten bevorzugt mindestens 97% mit dem kodierenden Bereich einer angegebenen DNA-Sequenz.
Die Aminosäuresequenz-Homologie ist wie hierin verwendet in gleicher Weise festgelegt als der Identitätsgrad zwischen zwei Sequenzen, der eine Abstammung der ersten Sequenz von der zweiten anzeigt. Die Homologie kann in geeigneter Weise mit Hilfe von den auf dem Fachgebiet bekannten Computerprogrammen bestimmt werden, wie z.B. GAP mit Verweis auf Vorstehendem (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., 1970, vorstehend). Durch Verwenden von GAP mit den folgenden Einstellungen für den Aminosäuresequenz-Vergleich, eine Bildungsstrafe von 3,0 und eine Verlängerungsstrafe von 0,1, zeigt das durch eine analoge DNA-Sequenz kodierte Polypeptid einen Identitätsgrad vorzugsweise von mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95% und besonders bevorzugt mindestens 97% mit einer DNA-Sequenz, die den das Strukturprotein kodierenden Bereich umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Varianten von Metalloproteasen und alkalischen Proteasen, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die sich durch nicht mehr als drei Aminosäuren, vorzugsweise durch nicht mehr als zwei Aminosäuren und stärker bevorzugt durch nicht mehr als eine Aminosäure von dem reifen Polypeptid der Aminosäuresequenz, die von SEQ. ID. NR. 1, SEQ. ID. NR. 2 und SEQ. ID. NR. 3 abgeleitet ist, unterscheidet.
Die Hybridisierung ist wie hierin verwendet als Angabe dafür vorgesehen, dass eine analoge DNA-Sequenz an eine Oligonukleotidsonde, die einem Polypeptid entspricht, welches durch eine angegebene DNA-Sequenz kodiert ist, die den das Strukturprotein kodierenden Bereich umfasst, unter bestimmten spezifizierten, nachstehend im Detail beschriebenen Bedingungen bindet.
Geeignete Bedingungen zur Bestimmung der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz umfassen das Vordurchtränken des Filters, das die zu hybridisierende/n DNA-Fragmente oder RNA enthält, in 5 × SSC (Kochsalz-Citrat-Standardpuffer; vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, NY, USA) für eine Dauer von 10 Min. und Vorhybridisieren des Filters in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardts Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter, mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA (Sambrook et al., 1989, vorstehend), gefolgt von der Hybridisierung in derselben Lösung, die eine mit Zufalls-Primer erzeugte (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. 1983, Anal. Biochem. 132: 6–13), ³²P-dCTP-markierte (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) Sonde enthält, für eine Dauer von 12 Stunden bei ca. 45°C. Der Filter wird dann zweimal 30 Minuten in 2 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 55°C (geringe Stringenz), stärker bevorzugt mindestens 60°C (mittlere Stringenz), stärker bevorzugt mindestens 65°C (mittlere/hohe Stringenz), stärker bevorzugt mindestens 70°C (hohe Stringenz), noch stärker bevorzugt mindestens 75°C (sehr hohe Stringenz) gewaschen. Die Moleküle, an die die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden durch Belichtung eines Röntgenfilms nachgewiesen.
Genetische Modifikationen der Wirtszelle
Um wesentlich verminderte Mengen an Metalloprotease- und alkalischer Proteaseaktivität zu exprimieren, wird die Zelle von Aspergillus oryzae der Erfindung genetisch modifiziert, was durch Verwenden der dem Fachmann bekannten rekombinanten DNA-Technologie nach Standard erzielt werden kann. Die für die Herstellung der Metalloprotease- und alkalischen Proteaseaktivität jeweils verantwortlichen Gensequenzen können inaktiviert oder teilweise oder gänzlich eliminiert werden. Somit exprimiert eine Zelle von Aspergillus oryzae der Erfindung verminderte oder nicht nachweisbare Mengen der Metalloprotease und alkalischen Protease oder exprimiert eine funktionell inaktive Metalloprotease und alkalische Protease.
In einer bestimmten Ausführungsform wird die Inaktivierung durch Modifikation der jeweiligen strukturellen oder regulatorischen Bereiche erhalten, die innerhalb der Gene der Metalloprotease und alkalischen Protease von Interesse kodiert sind. Bekannte und verwendbare Verfahren schließen spezifische oder Zufallsmutagenese, PCR-generierte Mutagenese, ortsspezifische DNA-Deletion, -Insertion und/oder -Substitution, Gen-Zerstörung oder Gen-Ersatz, Antisense-Verfahren oder eine Kombination davon ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Mutagenese kann durch Verwenden eines geeigneten physikalischen oder chemischen Mutagenisierungsmittels durchgeführt werden. Beispiele eines für den vorliegenden Zweck geeigneten physikalischen oder chemischen Mutagenisierungsmittels schließen die Bestrahlung mit Ultraviolett (UV), Hydroxylamin, N-Methyl^–-N-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, salpetrige Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotidanaloga ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Wenn derartige Mittel verwendet werden, wird die Mutagenese typischerweise durch Inkubieren der zu mutagenisierenden Zelle in Anwesenheit des mutagenisierenden Mittels der Wahl unter geeigneten Bedingungen und Selektieren der Zellen, die eine wesentlich verminderte Herstellung von NpI und alp zeigen, durchgeführt.
Die Modifikation kann auch durch Einführung, Austausch oder Entfernung eines oder mehrerer Nukleotide in der Struktursequenz oder eines regulatorischen Elements, das für die Transkription oder Translation der Struktursequenz erforderlich ist, bewerkstelligt werden. Zum Beispiel können Nukleotide eingesetzt oder entfernt werden, um zur Einführung eines Stopp-Codons, zur Entfernung des Start-Codons oder zu einer Änderung des offenen Leserahmens der Struktursequenz zu führen. Die Modifikation oder Inaktivierung der Struktursequenz oder eines regulatorischen Elements davon kann durch ortsspezifische Mutagenese oder PCR-generierte Mutagenese gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bewerkstelligt werden. Obwohl grundsätzlich die Modifikation in vivo, d.h. direkt in der Zelle, die die Gene der Metalloprotease und alkalischen Protease exprimiert, durchgeführt werden kann, wird es derzeit vorgezogen, dass die Modifikation in vitro wie nachstehend erläutert durchgeführt wird.
Ein günstiger Weg, die Herstellung der Metalloprotease und alkalischen Protease in einer Wirtszelle der Wahl zu inaktivieren oder zu vermindern, basiert auf Verfahren der Gen-Unterbrechung. Bei diesem Verfahren wird eine DNA-Sequenz, die dem endogenen Gen oder Gen-Fragment von Interesse entspricht, in vitro mutagenisiert. Die DNA-Sequenz kodiert somit ein defektes Gen, das dann in die Wirtszelle transformiert wird. Durch homologe Rekombination ersetzt das defekte Gen das endogene Gen oder Gen-Fragment. Es kann erwünscht sein, dass das defekte Gen oder Gen-Fragment auch einen Marker kodiert, der dazu verwendet werden kann, die Transformanten zu selektieren, bei denen die jeweiligen Metalloprotease und/oder alkalische Protease kodierenden Gene modifiziert oder zerstört wurden.
Verfahren zum Entfernen oder Zerstören eines Zielgens sind speziell von Miller et al. (1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1714–1721), WO 90/00192, May, G. (1992, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi. J. R. Kinhorn und G. Turner, Hrsg., Blackie Academic and Professional, S. 1–25) und Turner, G. (1994, Vectors for Genetic Manipulation. S. D. Martinelli und J. R. Kinghorn, Hrsg., Elsevier, S. 641–665) beschrieben.
Alternativ kann die Modifikation oder Inaktivierung der DNA-Sequenz durch etablierte Antisense-Verfahren durchgeführt werden, indem eine Nukleotidsequenz, die zu einer Metalloprotease kodierenden Sequenz komplementär ist, z.B. die als SEQ. ID. NR. 1 und SEQ. ID. NR. 2 dargestellten Nukleotidsequenzen, oder eine alkalische Protease kodierende Sequenz, z.B. die in SEQ. ID. NR. 4 gezeigte Nukleotidsequenz, verwendet werden. Die Antisense-Technologie und ihre Anwendung ist im Detail im U.S.-Patent Nr. 5,190,931 (Universität New York) beschrieben.
Aufgrund der genetischen Modifikation exprimiert die Zelle von Aspergillus oryzae der Erfindung daher wesentlich verminderte Mengen an Metalloprotease- und alkalischer Proteaseaktivität. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge an diesen proteolytischen Aktivitäten, die von der Zelle von Aspergillus oryzae exprimiert wird, einzeln betrachtet um mehr als etwa 50%, vorzugsweise um mehr als etwa 85%, stärker bevorzugt um mehr als etwa 90% und am stärksten bevorzugt um mehr als etwa 95% vermindert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können diese proteolytischen Aktivitäten in der Zelle von Aspergillus oryzae der Erfindung in beliebiger Kombination vermindert werden. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist das durch die Zelle von Aspergillus oryzae exprimierte Produkt im Wesentlichen frei von proteolytischer Aktivität durch Metalloprotease und alkalischer Protease.
Verfahren zur Herstellung von Proteinen
Durch das Verfahren der Erfindung werden die proteolytischen Aktivitäten der Metalloprotease und alkalischen Protease wesentlich vermindert und dabei die Stabilität und Ausbeute der empfindlichen Proteinprodukte, die von der Zelle von Aspergillus oryzae der Erfindung synthetisiert werden, verbessert bzw. erhöht. Insbesondere wird durch das Verfahren der Erfindung die Zelle von Aspergillus oryzae innerhalb der Struktur- und/oder regulatorischen Bereiche, die innerhalb der Gene der Metalloprotease und alkalischen Protease kodiert sind, genetisch modifiziert.
Deshalb stellt eine andere Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen in einer Zelle von Aspergillus oryzae der Erfindung, einschließlich heterologer Polypeptide bereit, wobei das Verfahren das Einführen einer das Proteinprodukt von Interesse kodierenden Nukleinsäuresequenz in die Zelle, das Züchten der Zelle in einem geeigneten Wachstumsmedium, gefolgt von der Gewinnung des Proteinprodukts umfasst.
Daher muss die Zelle von Aspergillus oryzae der Erfindung strukturelle und regulatorische genetische Bereiche enthalten, die für die Expression des gewünschten Produkts notwendig sind. Die Natur derartiger struktureller und regulatorischer Bereiche hängt sehr von dem fraglichen Produkt und der fraglichen Zelle von Aspergillus oryzae ab. Das genetische Design der Zelle von Aspergillus oryzae der Erfindung kann durch den Fachmann durch Verwenden der rekombinanten DNA-Technologie nach Standard zur Transformation oder Transfektion einer Wirtszelle bewerkstelligt werden (siehe unter anderem z.B. Sambrook et al.).
Vorzugsweise wird die Zelle von Aspergillus oryzae durch die auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren zur Einführung eines geeigneten Klonierungsvehikels, d.h. ein Plasmid oder ein Vektor, der ein das gewünschte Proteinprodukt kodierendes DNA-Fragment umfasst, modifiziert. Das Klonierungsvehikel kann entweder als autonom replizierendes Plasmid in die Wirtszelle eingeführt oder ins Chromosom integriert werden. Vorzugsweise umfasst das Klonierungsvehikel ein oder mehrere strukturelle Bereiche, die funktionell mit einem oder mehreren geeigneten regulatorischen Bereichen verknüpft sind.
Bei den strukturellen Bereichen handelt es sich um Bereiche von Nukleotidsequenzen, die das gewünschte Proteinprodukt kodieren. Die regulatorischen Bereiche schließen Promotor-Bereiche, die Kontrollsequenzen für die Transkription und Translation umfassen, Stopp-Signale umfassende Terminator-Bereiche und Polyadenylierungsbereiche ein. Bei dem Promoter, d.h. einer Nukleotidsequenz, die Transkriptionsaktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, kann es sich um einen Promoter handeln, der von einem Gen abgeleitet ist, das ein extrazelluläres oder intrazelluläres Protein, vorzugsweise ein Enzym, wie z.B. eine Amylase, eine Glucoamylase, eine Protease, eine Lipase, eine Cellulase, eine Xylanase, eine Oxidoreduktase, eine Pektinase, eine Cutinase oder ein glykolytisches Enzym kodiert. Beispiele geeigneter Promotoren für die Transkription in einer Pilzwirtszelle sind Promoteren, die von dem Gen abgeleitet sind, das die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, die neutrale α-Amylase von Aspergillus niger, die säurestabile α-Amylase von Aspergillus niger, die Glucoamylase (GluA) von Aspergillus niger oder Aspergillus awamsii, die Acetamidase von Aspergillus nidulans, die alkalische Protease von Aspergillus oryzae, die Triosephosphat-Isomerase von Aspergillus oryzae, die Aspartat-Protease von Rhizopus meihei und die Lipase von Rhizopus meihei kodiert. Bei den bevorzugten Promotoren handelt es sich um die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae und das GluA von Aspergillus awamsii.
Das Klonierungsvehikel kann auch einen selektierbaren Marker wie z.B. ein Genprodukt, das einen Defekt in der Wirtszelle von Aspergillus oryzae komplementiert oder das eine Antibiotikum-Resistenz verleiht, einschließen. Beispiele von Antibiotika, die als Selektionsmarker für Aspergillus verwendbar sind, schließen Hygromycin, Phleomycin und Basta ein. Andere Beispiele von Selektionsmarkern für Aspergillus schließen amdS, das ein an der Acetamid-Verwertung beteiligtes Enzym kodiert, pyrG, das ein an der Uridin-Biosynthese beteiligtes Enzym kodiert, argB, das ein an der Arginin-Biosynthese beteiligtes Enzym kodiert, niaD, das ein an dem Nitrat-Aufnahmeweg beteiligtes Enzym kodiert, und sC, das ein an dem Sulfat-Aufnahmeweg beteiligtes Enzym kodiert, ein. Bevorzugt für die Verwendung in einer Aspergillus-Wirtszelle sind die amdS- und pyrG-Marker von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae. Des Weiteren kann die Selektion durch Kotransformation bewerkstelligt werden, wobei die Transformation mit einem Gemisch von zwei Vektoren durchgeführt wird und die Selektion nur einen Vektor fördert.
Die verwendeten Verfahren, um das DNA-Konstrukt der Erfindung, den Promoter, Terminator bzw. andere Elemente zu ligieren und sie in ein geeignetes Klonierungsvehikel einzusetzen, das die für die Replikation notwendige Information enthält, sind einem Fachmann bekannt (siehe unter anderem z.B. Sambrook et al., 1989).
Bei der/dem verwendeten Kulturbrühe oder -medium kann es sich um ein beliebiges herkömmliches Medium handeln, das für das Züchten der Wirtszelle der Erfindung geeignet und gemäß den Grundzügen des Stands der Technik formuliert ist. Das Medium enthält vorzugsweise Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie andere anorganische Salze. Geeignete Medien, z.B. Minimal- oder Komplexmedien sind im Handel erhältlich oder können gemäß den veröffentlichen Rezepturen wie in The Catalogue of Strains, der von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, 1970 veröffentlicht wurde, hergestellt werden.
Der geeignete pH-Wert für die Fermentation wird häufig von derartigen Faktoren wie der Natur der zu verwendenden Wirtszelle, der Zusammensetzung des Wachs tumsmediums, der Stabilität des Polypeptids von Interesse und dergleichen abhängen. Obwohl die Zelle von Aspergillus oryzae der Erfindung unter Verwendung eines beliebigen Fermentationsverfahrens bei einem beliebigen pH-Wert gezüchtet werden kann, ist es folglich vorteilhaft, dass der pH-Wert des Fermentationsverfahrens derart ist, dass die Aktivitäten saurer und/oder neutraler Proteasen der Zelle von Aspergillus oryzae im Wesentlichen eliminiert oder mindestens wesentlich vermindert sind. Daher kann die Entfernung der Aspartat-Proteaseaktivität, wie sie in WO 90/00192 beschrieben ist, auch durch Erhöhen des pH-Werts der Fermentation bewerkstelligt werden und bietet keinerlei zusätzliche vorteilhafte Auswirkung auf die Ausbeute des gewünschten Proteins von den im alkalischen pH-Bereich gezüchteten Wirtszellen.
Wenn der pH-Wert des Fermentationsverfahrens innerhalb des Bereichs von 5 bis 11 wie z.B. von 6 bis 10,5, 7 bis 10 oder 8 bis 9,5 liegt, ist Aktivität der sauren Proteasen wie z.B. Aspartat- und Serin-Proteasen und der neutralen Proteasen in den pH-Bereichen über 7 vermindert oder blockiert. Beispiele von unter alkalischen Fermentationsbedingungen hergestellten Enzymen schließen Endoglucanasen, Phytasen und Proteindisulfid-Isomerasen ein.
Jedoch wird der alkalische pH-Bereich die alkalische Proteaseaktivität in einer nicht modifizierten Wirtszelle fördern, die wiederum möglicherweise zum Abbau des Polypeptidprodukts von Interesse führen kann. Folglich ist in derartigen Fällen die Inaktivierung des Gens, das die alkalische Protease kodiert, besonders vorteilhaft.
Die Inaktivierung des Gens der alkalischen Protease der Erfindung ist ebenso besonders vorteilhaft für bestimmte Wirtszellen, da die Mengen an Aktivitäten von sauren, neutralen und alkalischen Proteasen von Spezies zu Spezies variieren. Zum Beispiel ist die Menge an alkalischer Proteaseaktivität bei Aspergillus oryzae höher als bei Aspergillus niger.
Nach der Züchtung wird das gewünschte Protein durch herkömmliche Verfahren der Proteinisolierung und -reinigung aus der Kulturbrühe gewonnen. Gut etablierte Reinigungsverfahren schließen das Abtrennen der Zellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration, die Fällung proteinhaltiger Bestandteile des Mediums mit Hilfe eines Salzes wie z.B. Ammoniumsulfat und chromatographische Verfahren wie z.B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen ein.
Produkte
Bei dem gewünschten Endprodukt, d.h. dem durch die Wirtszelle der Erfindung exprimierten heterologen Protein, kann es sich um ein beliebiges eubakterielles oder eukaryotisches Protein oder Peptid handeln.
Wie hierin definiert, handelt es sich bei einem „heterologen Protein" um ein Protein- oder Polypeptid-Genprodukt, das für die Wirtszelle nicht natürlich ist, oder um ein natürliches Protein, in dem Modifikationen vorgenommen wurden, um die natürliche Sequenz zu verändern, oder um ein natürliches Protein, dessen Expression als Ergebnis einer Manipulation der natürlichen regulatorischen Sequenz, die für die Expression des natürlichen Proteins erforderlich ist, wie z.B. eines Promoters, einer Ribosomenbindungsstelle usw. oder einer anderen Manipulation der Wirtszelle durch Verfahren mit rekombinanter DNA quantitativ verändert ist.
In einer spezifischeren Ausführungsform handelt es sich bei dem Produkt um ein therapeutisch aktives Peptid oder Protein, wie z.B. ein Hormon, insbesondere Insulin, Wachstumshormon, Glucagon oder Somatostatin; ein Interleukin, insbesondere Interferon; einen hämatopoetischen Wachstumsfaktor, insbesondere PDGF (von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor), EPO (Erythropoietin) oder TPO (Thrombopoietin); eine Protease, insbesondere Faktor VII, Faktor VIII, Urokinase, Chymosin oder einen Gewebeplasminogenaktivator; oder Serumalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Produkt um ein Enzym pilzlichen oder bakteriellen Ursprungs.
Bei dem Enzym handelt es sich vorzugsweise um ein Glykosidase-Enzym, z.B. eine Amylase, insbesondere eine α-Amylase (EC 3.2.1.1) oder eine β-Amylase (EC 3.2.1.2); eine Glucan-1,4-α-Glucosidase (EC 3.2.1.3), eine Cellulase, insbesondere eine Endo-1,4-β-Glucanase (EC 3.2.1.4) oder eine Endo-1,3(4)-β-Glucanase (EC 3.2.1.6); eine Xylanase, insbesondere eine Endo-1,4-β-Xylanase (EC 3.2.1.8) oder eine Xylan-endo-1,3-β-Xylosidase (EC 3.2.1.32); eine Polygalacturonase (EC 3.2.1.15); eine Glucosidase, insbesondere eine α-Glucosidase (EC 3.2.1.20) oder eine β-Glucosidase (EC 3.2.1.21); eine Galactosidase, insbesondere eine α-Galactosidase (EC 3.2.1.22) oder eine β-Galactosidase (EC 3.2.1.23); eine Endoglucanase, insbesondere eine Endo-1,3-β-Glucanase (EC 3.2.1.39), eine Endo-1,3-α-Glucanase (EC 3.2.1.59), eine Endo-1,2-β-Glucanase (EC 3.2.1.71) oder eine Endo-1,6-β-Glucanase (EC 3.2.1.75); und eine Cellulose-1,4-β-Cellobiosidase (EC 3.2.1.91).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um ein lipolytisches Enzym, insbesondere eine Lipase, eine Esterase, eine Phospholipase oder eine Lysophospholipase.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um eine Phytase, insbesondere um eine 3-Phytase (EC 3.1.3.8) oder eine 6-Phytase (EC 3.1.3.26).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um ein proteolytisches Enzym.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um eine Laccase, eine Pektinase oder eine Cutinase oder eine Oxidoreduktase, wie z.B. eine Peroxidase.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Produkt um ein Hybridpolypeptid, vorzugsweise Prochymosin und Protrypsin-ähnliche Proteasen.
Aufgrund der Abwesenheit der Metalloprotease- und alkalischer Proteaseaktivitäten kann es sich bei dem von der Wirtszelle exprimierten heterologen Protein ebenso um ein Vorläuferprotein wie z.B. ein Zymogen, ein Hybridprotein, ein als eine Prosequenz oder Präprosequenz erhaltenes Protein oder eine beliebige andere unreife Form handeln.
BEISPIELE
Die Erfindung ist ferner unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht, die in keiner Weise dahin gehend ausgelegt werden sollten, dass der wie in den anhängenden Patentansprüchen definierte Umfang der Erfindung beschränkt wird.
Materialien und Verfahren
Stämme
Aspergillus oryzae IFO 4177: erhältlich vom Institute for Fermentation, Osaka; 17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawaku, Osaka, Japan.

Fusarium oxysporum DSM 2672: hinterlegt gemäß dem Budapester Vertrag zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke des Patentverfahrens bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, DE-3300 Braunschweig, Deutschland, am 6. Juni 1983.

HowB101:	Die Konstruktion dieses Stamms ist in Beispiel 1 beschrieben.
JaL125:	Die Konstruktion dieses Stamms ist in Beispiel 1 beschrieben.
JaL151:	Die Konstruktion dieses Stamms ist in Beispiel 1 beschrieben.
JaL228:	Die Konstruktion dieses Stamms ist in Beispiel 1 beschrieben.

Gene

alp:	Dieses Gen kodiert die in SEQ. ID. NR. 3 gezeigte alkalische Protease.
NpI:	Dieses Gen kodiert die in SEQ. ID. NR. 2 gezeigte neutrale Metalloprotease I.
pyrG:	Dieses Gen kodiert die Orotidin-5'-phosphat-Decarboxylase, ein Enzym, das an der Uridin-Biosynthese beteiligt ist.
p45:	Dieses Gen kodiert die in SEQ. ID. NR. 1 gezeigte neutrale Metalloprotease I.

Plasmide

pSO2:	Die Präparation ist in Beispiel 1 beschrieben.
pSO5:	Die Präparation ist in Beispiel 1 beschrieben.
pSRe403:	Die Präparation ist in Beispiel 1 beschrieben.

pSRe403ΔSacII:	Die Präparation ist in Beispiel 1 beschrieben.
pJaL173:	Die Präparation ist in Beispiel 1 beschrieben.
pJaL212:	Die Präparation ist in Beispiel 1 beschrieben.
pJaL335:	Die Präparation ist in Beispiel 1 beschrieben.
pJaL389:	Die Präparation ist in Beispiel 1 beschrieben.
pJaL399:	Die Präparation ist in Beispiel 1 beschrieben.
pToC65:	Die Konstruktion ist in EP 531 372 B beschrieben.
pToC68:	Die Konstruktion ist in WO 91/17243 beschrieben.
pToC90:	Ein Unterklon von p3SR2 (Corrick et al., 1987, GENE 53: 63–71), der das amdS-Gen von Aspergillus nidulans als ein XbaI-Fragment von 2,7 kB trägt, auf einem pUC19-Vektor (Yannisch-Perron et al., 1985, GENE 33: 103–119), dieses Plasmid wurde wie in WO 91/17243 beschrieben präpariert.
pDM115:	Die Präparation ist in Beispiel 1 beschrieben.
pMT1303:	Die Präparation ist in Beispiel 2 beschrieben.
pMT1305:	Die Präparation ist in Beispiel 2 beschrieben.
pMT1329:	Die Präparation ist in Beispiel 2 beschrieben.

pMT1330:	Die Präparation ist in Beispiel 2 beschrieben.
pMT1332:	Die Präparation ist in Beispiel 2 beschrieben.
pMT1335:	Die Präparation ist in Beispiel 2 beschrieben.

Testverfahren für proteolytische Enzyme
Die Metalloproteaseaktivität wird als freigesetzte Trypsinaktivität nach einer Vorinkubation für eine Dauer von 30–60 Min. bei 25°C in 0,1 M Tris, 2 mM CaCl₂, pH 7 gemessen (im niedrigeren pH-Bereich wird ein Puffer von 100 mM Borat, 10 mM DMG, 2 mM CaCl₂ verwendet). Die typische Aktivität wird in Mikrotiterplatten gemessen; Proben von 100 ml werden mit 100 ml L-BAPNA-Substrat (eine 50-fache Verdünnung der Stammkonzentration von 87 mg/ml DMSO in Puffer, Sigma Aldrich Corp., St. Louis MO, USA) gemischt, und die Absorption bei 405 nm wird durch Verwenden eines „Thermomax microplate reader" von Molecular Devices Corp. (Sunnyvale CA, USA) gemessen.
Die alkalische Proteaseaktivität wird bei 25°C unter Verwendung des synthetischen Substrats N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid (Sigma Aldrich Corp.) bei 1 mM in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 1 ml getestet. Die Freisetzung von p-Nitroanilid wird bei 410 nm verfolgt (Ramesh, M. V. et al., 1994, Infection and Immunity 62: 79–85).
Beispiel 1
Genomische Deletion des Gens der alkalischen Protease von Aspergillus oryzae (alp) und des Gens der neutralen Metalloprotease I von Aspergillus oryzae (NpI)
Die alp- und die NpI-Gene wurden jeweils durch ein einstufiges Genersatz-Verfahren (Miller, B. L., et al., 1985, Mol. and Cell. Biol. 5: 1714–1721, und May, G. in Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, S. 1–25. J. R. Kinghorn und G. Turner, Hrsg., Blackie Academic and Professional, 1992) in zwei aufeinander folgenden Runden in einem pyrG-Stamm von A. oryzae durch Verwenden des pyrG-Gens von A. oryzae als Selektionsmarker entfernt.
Klonierung des pyrG-Gens von Aspergillus oryzae
Das pyrG-Gen von A. oryzae wurde durch Kreuzhybridisierung mit dem pyrG-Gen von A. niger kloniert (van Hartingsveldt, W. et al., 1987, Mol. Gen. Genet. 206: 71–75). Eine Lambda-Phagen-Genbank der partiell mit Sau3A gespaltenen DNA von A. oryzae IFO 4177 wurde bei niedriger Stringenz mit einem DNA-Fragment von 1 kB des pyrG-Gens von A. niger untersucht. Die DNA von einem positiven Klon wurde in einen pUC118-Vektor unterkloniert. Durch Komplementation einer pyrG-Mutante von A. niger wurde gezeigt, dass das so erhaltene Plasmid, pSO2, das pyrG-Gen enthält.
Konstruktion des pyrG-Plasmids, pJaL335
Ein Fragment von 431 Bp, das sich 479 Nukleotide stromaufwärts vom 5'-Ende der kodierenden Sequenz von pyrG von A. oryzae befindet, wurde durch PCR unter Verwendung der folgenden zwei Oligonukleotid-Primer amplifiziert:
Primer A: 5'-GGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC-3'; SEQ. ID. NR. 4; und
Primer B: 5'-GGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC-3'; SEQ. ID. NR. 5.
Die unterstrichenen Bereiche geben die im 5''-Bereich des pyrG-Gens von A. oryzae vorhandenen Sequenzen an. Eine Restriktionsschnittstelle wurde am 5'-Ende von jedem Primer eingefügt, um das Klonieren zu erleichtern; Primer A enthält eine BglII-Schnittstelle und Primer B eine EcoRI-Schnittstelle benachbart zu einer HindIII-Restriktionsschnittstelle.
Das Plasmid pSO2 wurde als Matrize in der PCR-Reaktion verwendet. Die Reaktion wurde in einem Volumen von 100 μl durchgeführt und enthielt 2,5 Einheiten Taq-Polymerase, 100 ng pSO2, jeweils 250 nM dNTP und jeweils 10 pmol der zwei vorstehend beschriebenen Primer in einem Reaktionspuffer von 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 mM MgCl₂.
Die Amplifikation wurde in einem „Cetus DNA Termal 480" von Perkin-Elmer durchgeführt und bestand aus einem Zyklus von 3 Minuten bei 94°C, gefolgt von 25 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C. Die PCR-Reaktion stellte ein einzelnes DNA-Fragment mit einer Länge von 430 Bp her. Dieses Fragment wurde mit BglII und EcoRI gespalten und durch Gelelektrophorese isoliert, gereinigt und in die entsprechende Stelle im Plasmid pSO2 kloniert, was zu einem Plasmid führte, das pJaL335 genannt wurde. Somit trägt pJaL335 das pyrG-Gen, das von einer Wiederholung von 431 Bp flankiert wird. 1 fasst die Schritte bei der Konstruktion von pJaL335 zusammen.
Konstruktion eines Plasmids mit einer pyrG-Deletion, pSO5
Ein Plasmid, pSO5, mit einer pyrG-Deletion wurde aus dem Plasmid pSO2 durch Spaltung mit NheI konstruiert, um die genkodierende Sequenz von etwa 1,1 kB zu entfernen, dann religiert, wobei jeweils etwa 1 kB der 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen von pyrG bestehen bleiben. Die Konstruktion ist in 2 veranschaulicht.
Konstruktion eines pyrG^–-Stamms von Aspergillus oryzae, HowB101
A. oryzae IFO 4177 wurde mit dem HindIII-Fragment von 2,2 kB von pSO5 transformiert, das die 5'- und 3'-flankierende Sequenz des pyrG-Gens von A. oryzae trägt. Die Transformanten wurden durch Resistenz gegen 5-Fluororotsäure, ein zur Selektion von pyrG-Mutanten verwendeter Phänotyp, selektiert. Es wurde durch Southern-Analyse gezeigt, dass ein Transformant, HowB101, die erwartete Deletion am pyrG-Lokus enthält. Da HowB 101 von Uridin abhängig ist, kann er mit dem Wildtyp pyrG-Gen transformiert werden und die Transformanten durch die Fähigkeit, in der Abwesenheit von Uridin zu wachsen, selektiert werden.
Konstruktion eines Plasmids mit einer alp-Deletion, pJaL212
Eine Genbank genomischer DNA von A. oryzae IFO 4177 wurde durch partielle Spaltung mit Sau3A erhalten. Die Fragmente wurden in den mit BamHI gespaltenen pUC19 ligiert. Die Genbank wurde unter Verwendung degenerierter Oligonukleotidsonden durchgemustert, die zu bekannten Proteinsequenzfragmenten der alkalischen Protease von A. oryzae komplementär sind. Ein Plasmid, das ein Sau3A-Fragment von 3,9 kB enthält, wurde durch diese Durchmusterung erhalten und als pSRe403 bezeichnet.
pSRe403 wurde mit SacII gespalten, dann religiert, um ein Plasmid herzustellen, in dem ein Fragment des alp-Gens von etwa 1 kB Länge entfernt worden ist. Das so erhaltene Plasmid wurde als pSRe403ΔSacII bezeichnet.
pSRe403ΔSacII wurde mit HindIII partiell gespalten, die Enden wurden unter Verwendung der Klenow-Polymerase aufgefüllt, dann religiert, um die HindIII-Schnittstelle in der pUC19-Sequenz zu entfernen, was zu einem als pJaL173 bezeichneten Plasmid führte.
Ein das pyrG-Gen enthaltendes Fragment von 3,8 kB, das aus der HindIII-Spaltung von pSO2 hervorging, wurde in die HindIII-Schnittstelle in pJaL173 eingefügt, um ein Plasmid herzustellen, das das HindIII-Fragment des pyrG-Gens enthält, welches von den 5'- und 3'-Sequenzen des alp-Gens an den stromaufwärts bzw. stromabwärts gelegenen Positionen flankiert ist. 3 fasst die Konstruktion des Plasmids zusammen, das als pJaL212 bezeichnet wurde.
Konstruktion eines alp^–-Stamms von Aspergillus oryzae, JaL125
HowB101 wurde mit dem SacI/SphI-Fragment von 6,8 kB von pJaL212 unter Verwendung von Standardverfahren transformiert. Dieses Fragment besteht aus 1,5 kB des alp-Promoters, dem pyrG-Gen und 1,5 kB des 3'-Terminus des alp-Gens. Die Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit, in Abwesenheit von Uridin zu wachsen, selektiert.
Die Transformanten wurden durch Southern-Blotting analysiert, wobei ein PstI/SacII-Fragment von 599 Bp aus pJaL173, das einen Teil des alp-Gens trägt, als radioaktiv markierte Sonde diente. Die Stämme, die eine Deletion des alp-Gens tragen, wurden durch eine Verschiebung der Wildtyp-PstI-Bande von 1,0 kB zu einer Bande von 1,9 kB erkannt. Vier derartige Transformanten wurden identifiziert, einer davon wurde als JaL125 bezeichnet.
Klonierung des NpI-Gens von Aspergillus oryzae
Es wurde eine Cosmid-Genbank von A. oryzae wurde unter Verwendung des „SuperCos1 Cosmid Vector Kits" ohne Modifikation nach den vom Hersteller (Stratagene, Inc., La Jolla, CA, USA) bereitgestellten Anleitungen konstruiert.
Die genomische DNA von A. oryzae IFO 4177 wurde aus Protoplasten präpariert, die durch Standardverfahren isoliert wurden (vgl. z.B. Christensen, T. et al., 1988, Biotechnology 6: 1419–1422). Nach der Isolierung wurden die Protoplasten durch Zentrifugation bei 2500 Upm von 5 Minuten Dauer in einer Labofuge T (Heto) sedimentiert. Das Sediment wurde dann in einem Puffer von 10 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA resuspendiert und mit 100 μg/ml Proteinase K und 0,5% SDS behandelt. Dieser und alle nachfolgenden Schritte der DNA-Präparation wurden nach dem empfohlenen Verfahren des „SuperCos1 Cosmid Vector Kits" durchgeführt.
Die Größe der genomischen DNA wurde durch Elektrophorese unter Verwendung der CHEF-Gel-Apparatur von BioRad (Hercules, CA, USA) analysiert. In Kurzfassung wurde ein 1%iges Agarosegel 20 Stunden bei 200 Volt mit einem Puls von 10–50 Sekunden gefahren. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Belichtung photographiert, was eine DNA im Bereich von 50 bis über 100 kB Länge erkennen ließ. Die DNA wurde dann mit Sau3A partiell gespalten. Die Größe der so erhaltenen DNA-Fragmente lag im Bereich zwischen 20 und 50 kB gemäß vorstehender CHEF-Gelanalyse.
Der als Bande im CsCl-Gradienten erhaltene SuperCos1-Vektor wurde präpartiert, ligiert und gemäß den mit dem Kit bereitgestellten Verfahren verpackt. Nach Titration der Genbank wurde das gesamte Verpackungsgemisch einer einzelnen Ligation und Verpackung in die mit dem Vektor-Kit bereitgestellten Wirtszellen XL1-Blue MR transfiziert und auf LB-Platten ausplattiert, die 50 μg/ml Ampicillin enthielten. Es wurden annähernd 3800 Kolonien erhalten. Die Analyse der Cosmid-Präparation von 10 Kolonien zeigte, dass alle die Einfügungen der erwarteten Größe aufwiesen. Die Kolonien wurden einzeln aufgesammelt und in 96-Loch-Mikrotiterplatten angeimpft, die 100 μl LB und 100 μg/ml Ampicillin pro Loch enthielten, dann bei 37°C über Nacht inkubiert. Es wurden einhundert Mikroliter 50%iges Glycerin in jedes Loch gegeben und die gesamte Genbank wurde bei –80°C eingefroren. Insgesamt wurden 3822 Kolonien gelagert, die eine ungefähr 4,4-fache Amplifikation des Genoms von A. oryzae repräsentieren.
Herstellung einer Sonde der Metalloprotease p45 von Fusarium oxysporum
Das Gen der Metalloprotease p45 von Fusarium oxysporum wurde kloniert, wie in der am 16. November 1995 veröffentlichten Patentanmeldung WO 95/30757 (Novo Nordisk Biotech, Inc.) offenbart ist.
Ein Klon der vorstehenden cDNA-Genbank wurde ausgewählt und als pDM115 bezeichnet. Eine Sonde wurde aus pDM115 präpariert, das ein Fragment der cDNA von Fusarium oxysporum von 1,76 kB enthält, welches einen Teil des p45-Gens kodiert. Dieses Plasmid wurde mit SalI gespalten und die Fragmente wurden auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Bei der Bande von Interesse handelte es sich um ein Fragment von 1,5 kB, aus der die DNA eluiert wurde. Dieses Fragment wurde mit ³²P-dATP durch Zufalls-Primer-Reaktion markiert und als Sonde für die Southern-Analyse und zur Durchmusterung einer Cosmid-Genbank von A. oryzae verwendet.
Durchmusterung der Genbank von A. oryzae
Um die Cosmid-Genbank von A. oryzae mit der p45-Sonde von Fusarium oxysporum durchzumustern, wurden die einzeln eingefrorenen Kolonien in der Genbank auf 100 μg/ml Ampicillin enthaltenden LB-Platten unter Verwendung einer Mehr-Nadel-Vorrichtung in einer Anordnung von 6 Reihen mit 8 Nadeln angeimpft, die passend für eine halbe 96-Loch-Mikrotiter-Schale entworfen wurde. Sterilisierte, für die Petrischalen passend geschnittene Whatman-540-Filter wurden auf die Kolonien gelegt, die dann weitere zwei Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Die Filter wurden auf 200 μg/ml Chloramphenicol enthaltende LB-Platten übertragen und die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Filter zweimal in 0,5 M NaOH für eine Dauer von 5 Minuten, dann zweimal in 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) für eine Dauer von 5 Minuten und schließlich zweimal in 2 × SSC für eine Dauer von 5 Minuten gewaschen. Die Filter wurden mit Ethanol entwässert und luftgetrocknet.
Die Filter wurden mit dem ³²P-markierten DNA-Fragment von 1,5 kB von pDM115 hybridisiert. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden bei 65°C in einem Standardhybridisierungspuffer von 10 × Denharts Lösung, 5 × SSC, 0,02 M EDTA, 1% SDS, 0,15 mg/ml PolyA-RNA und 0,05 mg/ml Hefe-tRNA durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter in 2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C zweimal gewaschen und auf Röntgenfilme gelegt. Drei Kolonien zeigten Hybridisierung an die Sonde, 3E8, 3C1 und 2A5.
Charakterisierung der Cosmid-Klone
Die Restriktionsanalyse offenbarte, dass zwei der drei Cosmid-Klone, 3E8 und 3C1, Einfügungen enthalten, die von demselben Bereich des Genoms von A. oryzae abgeleitet sind. Drei Mikrogramm Cosmid-DNA wurde mit EcoRI gespalten und durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Die DNA wurde auf Immobilan-N-Membranfilter (Millipore) übertragen und mit der radiomarkierten pDM115-Sonde hybridisiert. Die Ergebnisse offenbarten, dass die Sonde mit einem EcoRI-Fragment von 4 kB in beiden Cosmid-Klonen hybridisierte. Das EcoRI-Fragment von 4,0 kB wurde einer weiteren Analyse unterzogen.
Konstruktion des Plasmids mit der NpI-Deletion, pJaL399
Das in EP 531 372 beschriebene Plasmid pToC65 wurde mit SacI gespalten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase gemäß den Anleitungen des Herstellers (Boehringer Mannheim) behandelt, um die 5'-Phosphatgruppen zu entfernen, dann mit Phenol extrahiert und gefällt. Das SacI-Fragment von 5,5 kB des Cosmid-Klons 3E8, das das NpI-Gen von A. oryzae enthält, wurde durch Gelelektrophorese isoliert und gereinigt. Die zwei Fragmente wurden miteinander gemischt und ligiert. Nach Transformation in E. coli wurden die Kolonien, die das korrekte Plasmid trugen, durch Restriktionsenzymspaltung von Plasmid-Minipräparationen identifiziert; das gewonnene Plasmid wurde pJaL389 genannt.
Die Anwesenheit des kodierenden Bereichs des NpI-Gens von A. oryzae wurde durch DNA-Sequenzanalyse von Teilen dieses Subklons bestätigt.
Das Plasmid pJaL389 wurde mit BalI gespalten, um ein internes Fragment von 1,1 kB des NpI-Gens zu entfernen. Das verbleibende Fragment von 7,1 kB wurde mit Klenow-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, dann durch Gelelektrophorese isoliert und gereinigt. Dieses DNA-Fragment wurde als nächstes mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, mit Phenol extrahiert und gefällt. Das Plasmid pJaL335 wurde mit HindIII gespalten, um ein das pyrG-Gen von A. oryzae umfassendes Fragment von 3,5 kB zu erhalten, dann in gleicher Weise mit Klenow-Polymerase behandelt, durch Gelelektrophorese isoliert und gereinigt. Die zwei Fragmente wurden miteinander gemischt und ligiert. Nach Transformation in E. coli wurden die Kolonien, die das korrekte Plasmid tragen, durch Restriktionsenzymspaltung von Plasmid-Minipräparationen identifiziert. Die Konstruktion dieses als pJaL399 bezeichneten Plasmids ist in 4 zusammengefasst.
Somit enthält das Plasmid pJaL399 ein Fragment des pToC65-Vektors, das das NpI-Gen trägt, wobei das interne BalI-Fragment von 1,1 kB mit einem DNA-Fragment von 3,5 kB, das das pyrG-Gen von A. oryzae kodiert, ersetzt wurde.
Isolierung eines pyrG^–-Stamms von A. oryzae, JaL151
Der alp^–-Stamm von A. oryzae, JaL125, wurde bezüglich der Resistenz gegen 5-Fluor-Orotsäure durchgemustert, um spontane pyrG-Mutanten zu identifizieren. Ein als JaL151 bezeichneter Stamm wurde als alp^– und pyrG^– identifiziert. Wie HowB101 ist JaL151 abhängig von Uridin, deshalb kann er mit dem pyrG-Gen des Wildtyps transformiert und können die Transformanten durch die Fähigkeit, in der Abwesenheit von Uridin zu wachsen, selektiert werden.
Konstruktion eines NpI^–-Stamms von Aspergillus oryzae, JaL228
JaL151 wurde mit dem SacI-Fragment von 7,9 kB von pJaL399 unter Verwendung von Standardverfahren transformiert. Die Transformanten wurden dann durch ihre Fähigkeit, in Abwesenheit von Uridin zu wachsen, selektiert. Nach erneuter Isolierung wurde die chromosomale DNA von 12 Transformanten präpariert. Die DNA von jedem der Transformanten wurde mit BalI gespalten und durch Southern-Blotting analysiert, indem das ³²P-markierte DNA-SacI-Fragment mit 5,5 kB von pJaL389, das das NpI-Gen enthält, wie vorstehend beschrieben als Sonde verwendet wurde. Die Stämme von Interesse wurden durch die Abwesenheit des hybridisierenden BalI-Fragments von 1,1 kB, was die Zerstörung des NpI-Gens anzeigt, sowie durch das Aufweisen einer veränderten Mobilität der flankierenden 5'- und 3'-Sequenzen identifiziert. Der aus einem dieser Transformanten hervorgehende Stamm wurde als JaL228 bezeichnet.
Beispiel 2
Klonierung der Lipase B von C. antarctica
Es wurde eine mit Sau3A partiell gespaltene genomische Genbank von Candida antarctica in pBR322 präpariert und die Abdruckfilter wurden mit zwei Oligonukleotidsonden durchgemustert, die gemäß der N-terminalen Aminosäuresequenz von clb, NOR929 (SEQ. ID. NR. 4) und NOR930 (SEQ. ID. NR. 5) (5) entworfen wurden. Acht Kolonien wurden identifiziert. Die Analyse der Plasmide zeigte überlappende Einfügungen. Eines der Plasmide, pMT1303, das eine Einfügung von 7,8 kB enthält, wurde weiter analysiert. Durch Entfernen des SalI-Fragments wurde ein Plasmid, pMT1305, konstruiert, das eine Einfügung von 2,1 kB enthält (6). Durch Verwenden von NOR929 als Matrize wurde pMT1305 sequenziert, um zu bestätigen, dass clb (Lipase B von C. antarctica) kodiert war. Das gesamte Gen wurde auf beiden Strängen durch Herstellen einer Serie von Deletionen in pMT1305 sequenziert, indem das „Erase-a-Base^©"-System von Promega (Promega Corp., Madison, WI, USA) verwendet wurde. Die kodierende Sequenz ist in SEQ. ID. NR. 6 bestimmt.
Konstruktion eines Plasmids mit einem Teil von CLB, pMT1329
Es wurde ein SalI-HindIII-Fragment von 788 Bp, das die N-terminale Sequenz von CLB kodiert, von pMT1305 isoliert. Von diesem Fragment wurden zwei kleinere Fragmente isoliert, ein HindIII-BanI-Fragment von 170 Bp und ein Fragment mit einem aufgefüllten BanI-Ende und einem Sau3A-Ende von 204 Bp.
Diese zwei Fragmente wurden in das mit EcoRV und HindIII gespaltene Plasmid pIC19R kloniert. Dies erzeugte eine BclI-Schnittstelle an der EcoRV- und der aufgefüllten Sau3A-Schnittstelle 9 Bp benachbart zum ATG-Condon von clb, was zu einem als pMT1329 bezeichneten Plasmid führte (7).
Konstruktion eines Plasmids mit einem Teil von CLB, pMT1332
Die Gensequenz, die den C-terminalen Bereich von CLB kodiert, wurde als ein HindIII-Xmn1-Fragment von 670 Bp von pMT1305 isoliert und in das mit HindIII und NruI gespaltene Plasmid pIC7 eingefügt, was zu pMT1330 führte. Das komplette Gen wurde aus dem HindIII-NarI-Fragment von 3,0 kB von pMT1329 und dem HindIII-ClaI-Fragment von 0,7 kB von pMT1330 zusammengesetzt, was zu pMT1332 führte (8).
Konstruktion eines CLB-Expressionsplasmids, pMT1335
Das clb-Gen wurde in Aspergillus unter Verwendung des Expressionsvektors pToC68 exprimiert. Das BclI-BglII-Fragment von 1 kB von pMT1332 wurde in den mit BamHI gespaltenen pToC68 eingefügt, um pMT1335 zu erzeugen (9). Somit führte die Konstruktion des Plasmids pMT1335 zu einem pilzlichen Expressionsplasmid für das Gen der Lipase B von C. antarctica.
Expression der Lipase B von C. antarctica in Stämmen von Aspergillus oryzae Die Stämme IFO 4177 und JaL228 von A. oryzae wurden mit pMT1335 durch Kotransformation mit pToC90 (Bedarf an der Definition von pToC90) transformiert.
Die Transformanten wurden bezüglich des Wachstums auf 10 mM Acetamid enthaltendem Minimalmedium selektiert und bezüglich der Anwesenheit von pMT1335 durch die Fähigkeit, CLB zu produzieren, durchgemustert. Jeweils ein Transformant des Wildtypstamms IFO 4177 von A. oryzae und des alp^–/NpI^–-Stamms JaL228 wurde für einen Kessel-Fermentationslauf von 93 Stunden ausgewählt. Conidiosporen wurden in 2-Liter-Keiler-Fermentern bei 30°C angeimpft, die 1,2 Liter 20%ige Maltoseflüssigkeit und 8% Harnstoff enthielten. Ein Gemisch von 20%iger Maltoseflüssigkeit und 8% Harnstoff wurde kontinuierlich zugesetzt; Phosphorsäure wurde nach Bedarf zugesetzt, um einen pH-Wert von 7 aufrechtzuerhalten.
In der nachstehenden Tabelle 1 ist die Ausbeute an CLB-Aktivität aus JaL228 im Vergleich zu IFO 4177 zusammengefasst, wobei eine Lipase-Einheit (LU) als diejenige Enzymmenge definiert ist, die notwendig ist, um 1 μmol Buttersäure pro Minute aus Tributyrin bei einem pH-Wert von 7,0 und 30°C freizusetzen. Die Tabelle zeigt, dass die in JaL228 hergestellte Menge 1,8-fach höher ist als in IFO 4177, was demonstriert, dass die Deletion der alp- und NpI-Gene die Stabilität von Proteinen, die gegen die Aktivität dieser Proteasen empfindlich sind, wesentlich verbessern kann.
Tabelle 1. Herstellung von CLB durch IFO 4177 und JaL228 nach Kessel-Fermentation von 93 Stunden.
SEQUENZLISTE

Claims

Zelle von Aspergillus orzyae, in welche eine ein heterologes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz eingebracht wurde, wobei die Zelle durch rekombinante DNA-Technologie in einer Weise modifiziert wurde, durch welche a) eine endogene Metallprotease, die durch eine in SEQ ID NO: 2 dargestellte DNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz, die zu mindestens 70% mit SEQ ID NO: 2 identisch ist, kodiert ist, und b) eine endogene alkalische Proteaseaktivität, die durch eine in SEQ ID NO: 3 dargestellte DNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz, die zu mindestens 70% mit SEQ ID NO: 3 identisch ist, kodiert ist, funktionell inaktiv sind oder im Vergleich mit einer parentalen Zelle mit reduzierten Graden exprimiert werden.
Zelle nach Anspruch 1, wobei die Metallprotease eine neutrale Aspergillus-Metallprotease der Gruppe NpI or NpII ist.
Zelle nach Anspruch 2, wobei die Metallprotease eine neutrale Metallprotease I von Aspergillus oryzae ist, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die von der als SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder einer DNA-Sequenz, die zu mindestens 70% damit identisch ist, abgeleitet ist.
Zelle nach Anspruch 1, wobei die alkalische Protease durch eine DNA-Sequenz kodiert ist, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die von der als SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz oder einer DNA-Sequenz, die zu mindestens 70% damit identisch ist, abgeleitet ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die durch rekombinante DNA-Technologie in der die Metallprotease kodierenden Sequenz oder eine Regulationssequenz davon und in der die alkalische Protease kodierenden Sequenz oder einer Regulationssequenz davon genetisch modifiziert wurde.
Zelle nach Anspruch 5, wobei es sich bei der Technologie um spezifische oder statistische Mutagenese-, PCR-generierte Mutagenese-, stellenspezifische DNA-Deletions-, -Insertions- und/oder -Substitutions-, Genunterbrechungs- oder Genersatztechniken, Antisense-Techniken oder eine Kombination davon handelt.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Metallproteasegehalt um mehr als etwa 50%, vorzugsweise mehr als etwa 85%, stärker bevorzugt um mehr als etwa 90% und besonders bevorzugt mehr als etwa 95% reduziert ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Gehalt der alkalischen Proteaseaktivität um mehr als etwa 50%, vorzugsweise mehr als etwa 85%, stärker bevorzugt um mehr als etwa 90% und besonders bevorzugt mehr als etwa 95% reduziert ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Reduktion der Metallprotease und der alkalischen Proteaseaktivität eine beliebige Kombination nach den Ansprüchen 7 oder 8 ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Zelle im Wesentlichen frei von jeglicher Metallprotease- und alkalischer Proteaseaktivität ist.
Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteinprodukts in der Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Einbringen einer das Proteinprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenz in die Zelle; (b) Züchten der Zelle von Schritt (a) in einem geeigneten Wachstumsmedium; und (c) Isolieren des Proteinprodukts.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Proteinprodukt ein therapeutisch wirksames Genprodukt wie Insulin, Wachstumshormon, Glucagon, Somatostatin, Interferon, EPO, TPO, PDGF, Factor VII, Factor VIII, Urokinase, Chymosin, Gewebeplasminogenaktivator oder Serumalbumin ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Proteinprodukt ein Protein pilzlichen Ursprungs ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Proteinprodukt ein Pilzenzym, insbesondere ein amylolytisches Enzym wie eine α-Amylase, eine β-Amylase, eine Glucoamylase, eine β-Galactosidase, ein cellulytisches Enzym, ein lipolytisches Enzym, ein xylanolytisches Enzym, ein proteolytisches Enzym, eine Oxidoreduktase wie eine Peroxidase oder eine Laccase, eine Pektinase oder eine Cutinase ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Proteinprodukt bakteriellen Ursprungs ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei das Proteinprodukt ein Vorläuferprotein, d.h. ein Zymogen, ein Hybridprotein, ein al Pro-Sequenz oder Prä-Pro-Sequenz oder in unreifer Form erhaltenes Protein ist.