DE10101962B4

DE10101962B4 - DNA-Sequenz mit regulatorischen Bereichen zur Expression von Proteinen

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Publication number: DE10101962B4
Application number: DE10101962A
Authority: DE
Inventors: Leopold Prof. Dr. Döhner; Dietmar Dr. Becher; Salah Dr. Salim; Rimantas Siekstele; Kestutis Sasnauskas
Original assignee: TAD Pharma GmbH
Current assignee: TAD Pharma GmbH
Priority date: 2001-01-17
Filing date: 2001-01-17
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2021-01-18
Also published as: WO2002070713A3; EP1354052A2; CA2436815A1; WO2002070713A2; US20040161841A1; JP2004519239A; DE10101962A1

Abstract

DNA enthaltend die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NO:1 oder eine Sequenz, die mindestens die Nucleotide 352 bis 1112 von SEQ ID NO:1 enthält, und als Promotor aktiv ist, den offenen Leserrahmen für das Enzym Triosephosphatisomerase und eine Sequenz, die mindestens die Nucleotide 1860 bis 2163 von SEQ ID NO:1 enthält und als Terminator aktiv ist, aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die das Triosephosphatisomerasegen einschließlich seiner regulatorischen Sequenzen umfaßt, eine DNA-Sequenz, die als Promotor aktiv ist, diese Sequenz enthaltende Expressions- und Sekretions-Systeme, mit dieser DNA transformierte Wirtszellen, die Verwendung der Sequenzen für in Hefezellen aktive Expression- und Sekretionssysteme sowie Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden und RNA mit Hilfe solcher Systeme.

Zur gentechnischen Herstellung von Proteinen stehen verschiedene Systeme zur Verfügung, z. B. rekombinante Mikroorganismen, die Expressionsplasmide tragen, bei denen unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen die Expression von Fremdgenen gesteuert wird. Häufig werden Bakteriensysteme verwendet, da sie leicht zu vermehren sind. Sie haben aber den Nachteil, dass sie pyrogene Substanzen erzeugen, die bei der Gewinnung von Medikamenten oder Impfstoffen vor der Verwendung entfernt werden müssen. Außerdem können in Bakterien keine glykosylierten Polypeptide hergestellt werden. Es wurden daher auch eine Reihe anderer Systeme für die Expression von Polypeptiden oder Proteinen in eukaryontischen Zellen entwickelt. Außer Zellkulturen werden hierfür Hefen inbetracht gezogen, insbesondere die weitverbreitete Hefe Saccharomyces cerevisiae, deren Genom inzwischen bekannt ist und für die einige Vektoren und Expressionssysteme erhältlich sind.

Eine weitere Hefe-Gattung, die aufgrund günstiger Eigenschaften für biotechnologische Verfahren inbetracht gezogen wird, ist Kluyveromyces. Die Arten K.lactis und K.marxianus werden als GRAS (Generally Recognized As Save) eingestuft und können daher mit derselben Sicherheit wie Saccharomyces verwendet werden. Darüberhinaus kann K.marxianus eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen und Energiequellen für das Wachstum nutzen und ist nicht sehr temperaturempfindlich. Kluyveromyces marxianus kann bei Temperaturen bis zu 45°C wachsen und bietet daher in dieser Hinsicht gegenüber den temperaturempfindlicheren Saccharomyces-Stämmen Vorteile bei der Züchtung. Die Zellen von schnell wachsenden K.marxianus- Stämmen können sich bei optimalen Bedingungen alle 35 Minuten teilen. Allerdings konnten diese guten Eigenschaften bisher nicht optimal ausgenutzt werden, da für diese Hefeart kaum Expressionssysteme zur Verfügung stehen, mit denen Proteine in guter Effektivität hergestellt werden können, und es an klonierten und zuverlässigen, getesteten, expressionsstarken Promotoren mangelt.

Bei der Herstellung von Proteinen und Polypeptiden auf gentechnischem Weg ist es darüberhinaus wünschenswert, dass die entstehenden Produkte nicht in der Zelle verbleiben, sondern in das umgebende Medium ausgeschieden werden, da sie sich dann leichter gewinnen lassen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, Promotoren mit verbesserter Effektivität bereitzustellen, die die Expression von Proteinen und Peptiden in Hefezellen steuern können. Eine weitere Aufgabe war es, Vektoren zur Verfügung zu stellen, mit denen Polypeptide und Proteine exprimiert und die exprimierten Produkte aus der Zelle ausgeschleust werden können.

Diese Aufgaben werden mit den erfindungsgemäß bereitgestellten DNA-Sequenzen, Expressionskassetten und -vektoren, Plasmiden und Verfahren, die in den Ansprüchen definiert sind, gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist daher die Bereitstellung einer neuen DNA-Sequenz, neuer regulatorischer Elemente, eines Verfahrens zum Ausschleusen von Proteinen aus der Zelle sowie die Bereitstellung geeigneter Expressionskassetten, Plasmide und Mikroorganismen.

Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 zur Verfügung gestellt:
Die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 ist eine Nucleinsäuresequenz, die die regulatorischen Regionen und den offenen Leserahmen für das Enzym Triosephosphatisome rase codiert. Im Bereich der Nucleotide 1 bis 1112 finden sich als Promotor aktive regulatorische Regionen dieses Gens.

Das Enzym Triosephosphatisomerase (im Folgenden auch als TPI bezeichnet) ist ein glycolytisches Enzym, das an dem Abbau von Glucose und Fructose, der zur Energiegewinnung in Zellen stattfindet, beteiligt und daher weit verbreitet ist. Die Triosephosphatisomerase dient dazu, das bei der Spaltung von Fructose-1,6-biphosphat neben dem Glycerinaldehyd-3-phosphat entstehende Dihydroxyacetonphosphat ebenfalls zu Glycerinaldehyd-3-phosphat zu isomerisieren, das dann schließlich über mehrere Stufen unter Energiegewinnung in Pyruvat umgewandelt wird. Das Enzym ist auch am Metabolismus komplexer Lipide beteiligt. Es ist ein Homodimer, dessen Untereinheiten aus etwa 250 Aminosäuren bestehen.

Die Aminosäure- und Nucleotidsequenz des Enzyms Triosephosphatisomerase (EC 5.3.1.1) aus der Hefeart Kluyveromyces marxianus var. marxianus wurde von den Erfindern aufgeklärt und letztere ist in SEQ ID Nr. 1 angegeben. Sequenzen des En zyms TPI in anderen Organismen sind bekannt; die Sequenz für TPI in S.cerevisiae wurde aufgeklärt und mit der Nummer YDR050CCDS bezeichnet. Bei einem Sequenzvergleich wurde gefunden, dass die Übereinstimmung der TPI codierenden DNA-Sequenzen in verschiedenen Mikroorganismen im Hinblick auf den offenen Leserahmen hoch ist, im Hinblick auf die regulatorischen Sequenzen jedoch gering.

Bei der Untersuchung der Expression dieses Enzyms in dem speziellen Organismus K. marxianus wurde gefunden, dass der die Expression von TPI steuernde Promotor ein sehr starker Promotor ist und sowohl in funktioneller Verbindung mit Fremdproteinen als auch in Zellen von anderen Hefearten und -stämmen effizient ist.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher die Bereitstellung eines neuen Promotors, der die Nucleotide 1 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1 oder Teile davon, die als Promotor aktiv sind, aufweist. Der erfindungsgemäße Promotor kann in an sich bekannter Weise in funktioneller Verbindung mit Fremdgenen eingesetzt werden.

Eine DNA-Sequenz mit den Nucleotiden 1 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1 wird im folgenden auch als Promotor-Sequenz bezeichnet.

Erfindungsgemäß wird ein Promoter zur Verfügung gestellt, der in Hefen aktiv ist und ein Expressionssystem liefert, das sehr variabel ist. Es ist unter anderem für Kluyveromyces und andere Hefearten geeignet und kann z.B. für Hefearten wie Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces lactis eingesetzt werden. Versuche, die im experimentellen Teil beschrieben werden, haben gezeigt, dass unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors eine hocheffektive Expression von Fremdprotein erfolgt.

Der neue erfindungsgemäß bereitgestellte konstitutive Promotor ist für die Expression von rekombinanten Proteinen in Hefezellen geeignet. Unter Promotor wird hier eine DNA-Sequenz verstanden, von der aus die Transkription eines Genes gesteuert wird. Die Bezeichnung "als Promotor aktiver Teil" bedeutet eine Teilsequenz des Promotors, die in Verbindung mit einem offenen Leserahmen zur Expression des von dem Leserahmen codierten Polypeptids führt.

Es wurde festgestellt, dass der Promotor, der in K.marxianus die Expression von TPI reguliert, im Folgenden auch als KmTPI-Promotor bezeichnet, sieben mögliche Transkriptionsstartstellen aufweist. Diese sind in der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 als Transkriptionsstart #1 bis #7 bezeichnet. Es wurde auch gefunden, dass zur Expression verschiedene Mikroorganismen verschiedene Sequenzmotive als Transkriptionsstartpunkt nutzen. Die Leistung des Promotors hängt unter anderem davon ab, welche der Transkriptionsstartpunkte bei der Expression verfügbar sind und daher läßt sich die Stärke des Promotors durch Auswahl der Sequenzteilstücke jeweils maßgenau für den Mikroorganismus, in dem die Expression erfolgen soll, einstellen.

Zum Beispiel wirkt der KmTPI-Promotor in Kluyveromyces marxianus so stark, dass schon ein Teilbereich der Promotor-DNA mit nur einer Transkriptionsstartstelle zur Expression eines Polypeptides führt. In anderen Kluyveromyces-Arten, wie z.B. K. lactis, ist es vorteilhaft, wenn mindestens drei, bevorzugter mindestens fünf Transkriptionsstartpunkte in der Sequenz enthalten sind. Daher wird für die Expression in Kluyveromyces-Arten, wie K. lactis bevorzugt als Promotor eine Sequenz verwendet, die mindestens fünf Transkriptionsstartstellen umfasst, z.B. eine Sequenz mindestens mit den Nukleotiden 352 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1.

Der erfindungsgemäß bereitgestellte KmTPI-Promotor ist auch in Saccharomyces funktionell. Um eine zufriedenstellende Expression zu erreichen, wird allerdings empfohlen, in Organismen dieser Gattung den KmTPI-Maximalpromotor mit den Nucleotiden 1 bis 1112 von SEQ ID Nr. 1 zu verwenden.

Die beschriebenen Nucleinsäuresequenzen mit Promotor-Aktivität schließen solche Sequenzen ein, die durch Modifikation, Substitution, Deletion oder Insertion oder Kombinationen hiervon entstanden sind. Hierzu kann auch die Promotor-Sequenz mit weiteren regulatorischen Upstream-Sequenzen mit Enhancer-, Aktivator- und/oder Repressorfunktionen versehen sein. Als Sequenz mit Promotor-Aktivität werden solche Sequenzen angesehen, die einen Teil der beanspruchten Sequenz oder ein Derivat davon umfassen, das noch als Promotor für die Expression von Proteinen wirkt.

Erfindungsgemäß werden weiterhin auch solche Sequenzen inbetracht gezogen, die mit der beanspruchten Nucleotidsequenz bzw. den beanspruchten Teilen davon, z.B. der Promotorsequenz, eine Homologie von mindestens 70%, bevorzugter mindestens 90% und insbesondere mindestens 95% aufweisen, solange die jeweiligen Sequenzen auch eine vergleichbare biologische Funktion haben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die Homologie dabei in üblicher Weise unter Verwendung der üblichen Algorithmen bestimmt. Teil der Erfindung sind auch solche Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen hybridisieren.

Erfindungsgemäß werden darüberhinaus auch solche Nucleinsäuren inbetracht gezogen, die zu TPI homologe Polypeptide codieren, insbesondere solche mit mindestens 80% Homologie. Der Ausdruck "homologes Polypeptid" umfasst in der vorliegenden Beschreibung ein Polypeptid, das im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz und im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität aufweist, wie das beanspruchte Polypeptid. Ein Homolog kann sich von dem Ausgangspolypeptid dadurch unterscheiden, dass es mehr, weniger oder andere Aminosäuren aufweist, wobei die Funktion aber erhalten bleibt. Der Fachmann kennt Verfahren, um entsprechend modifizierte Polypeptide zu erzeugen.

Die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Promotors erfolgt in an sich bekannter Weise, indem entweder die natürlich vorkommende Sequenz isoliert wird, was bevorzugt ist, oder die Sequenz gentechnisch hergestellt oder chemisch synthetisiert wird. Verfahren zur Gewinnung oder Synthese sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Erläuterung. Wesentlich ist nur, dass der Promotor der Triosephosphatisomerase aus K. marxianus, mit den Nucleotiden bis einschließlich 1112 von SEQ ID Nr. 1, oder ein aktiver Teil davon verwendet wird.

Um die Verwendung des erfindungsgemäßen Promotors zu erleichtern, wird weiterhin ein Expressionssystem bzw. eine Expressionskassette zur Verfügung gestellt, die die Promotor-Sequenz, wie oben definiert, oder einen als Promotor aktiven Teil davon, einen Terminator und gegebenenfalls weitere regulatorische Sequenzen, wie Enhancer, und einen Insertionsklonierungsort aufweist. In den Insertionsklonierungsort kann das gewünschte zu exprimierende Gen oder die DNA für ein zu exprimierendes Fremdprotein eingesetzt werden, die unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors transkribiert werden kann.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt in ihrer einfachsten Form eine Promotorsequenz oder einen als Promotor aktiven Teil davon, einen Insertionsklonierungsort, in den das Polynucleotid für das zu exprimierende Protein einkloniert werden kann, und eine als Terminator wirksame Nucleotidsequenz. Als Insertionsklonierungsort geeignete Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Erläuterung. Als Terminator kann z.B. die bei der Expression von TPI als Terminator wirkende Sequenz verwendet werden. Letzere umfasst die Nucleotide 1860 bis 2163 von SEQ ID Nr. 1 oder als Terminator aktive Teile davon. Gute Ergebnisse wurden auch erzielt bei Verwendung der Terminatorregion des Endopolygalacturonasegens aus Kluyveromyces marxianus.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann vielfältig verwendet werden. Der Insertionsklonierungsort ist eine Schnittstelle, an der die Sequenz aufgeschnitten werden kann und das Polynucleotid für das gewünschte Protein oder Peptid einligiert werden kann. In dieser einfachsten Form wird bei der Expression das Protein intrazellulär produziert und nicht aus der Zelle ausgeschleust. Es kann dann nach Aufschluß der Zelle in an sich bekannter Weise gewonnen werden. Diese Ausführungsform eignet sich sowohl für kleine Peptide und Proteine, die außerhalb der Zelle instabil sind als auch für Proteine, die generell intrazellulär lokalisiert sind.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können zur Expression von DNA-Sequenzen in Zellen, insbesondere Hefezellen, verwendet werden. Besonders geeignet sind die erfindungsgemäßen Expressionskassetten zur Expression in Hefezellen der Gattungen Saccharomyces und Kluyveromyces, z.B. S. cerevisieae, K. lactis, K. marxianus und andere.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette eignet sich sowohl zum Einbau in sich autonom replizierende Plasmide als auch zum Einbau in Hefechromosomen über integrative Vektoren.

Es ist jedoch bevorzugt, eine Expressionskassette, in die das gewünschte Polynucleotid zur Expression eines Peptids oder Proteins einligiert wurde, in einem E.coli-Plasmid zu amplifizieren und dann die E.coli-Plasmide zu gewinnen, die Expressionskassette mit geeigneten Restriktionsendonucleasen, für die Schnittstellen an den Rändern der Expressionskassette vorgesehen sind, auszuschneiden und die Expressionskassette in einen Hefevektor einzuligieren. Die Vektoren enthalten üblicherweise Selektionsmarker, um erfolgreich transformierte Zellen in an sich bekannter Weise selektieren zu können.

Die Plasmide können gegebenenfalls in E. coli vermehrt und dann in Kluyveromyces- marxianus oder einen anderen Kluyveromyces-Stamm oder auch einen anderen Hefestamm eingesetzt werden. Als Transformationssystem können beispielsweise bekannte Plasmide auf Basis des Kluyveromyces drosophilarum-Plasmides pKD1 verwendet werden. Abkömmlinge dieses Plasmids eignen sich zur Verwendung in Kluyveromyces marxianus und führen bei Verwendung des erfindungsgemäßen Expressionssystems zu einer effektiven Expression von Fremdproteinen im entsprechenden Wirt.

In einer anderen Ausführungsform kann aus den erfindungsgemäßen, wie oben vorbereiteten Plasmiden die Expressionskassette einschließlich des zu exprimierenden Polynucleotids herausgeschnitten und als lineare oder zirkularisierte DNA als Integrationskassette direkt mit Hefezellen in Kontakt gebracht werden, um von diesen aufgenommen zu werden. Ein stabiler Einbau in die Wirtszelle kann dann über homologe Rekombination erfolgen, sofern ein Teil der Nucleinsäuren für die Wirtszelle homolog ist. Aufgrund einer Homologie von Teilen der Expressionskassette, z.B. des TPI-Gens oder der regulatorischen Sequenzen davon, mit dem Genom der Hefe wird dann in einem Teil der behandelten Zellen die DNA in die entsprechenden Chromosomen durch Austausch mit den entsprechenden Sequenzen aufgenommen.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette wird stabil in Chromosomen eingebaut und führt, wenn die Zellen unter optimalen Bedingungen gezüchtet werden, zu einer guten Ausbeute des gewünschten Proteins. Abhängig von der Art des zu exprimierenden Proteins oder Peptids kann die Kopienzahl des Systems eingestellt werden. Falls eine höhere Kopienzahl erwünscht ist, werden in an sich bekannter Weise an die Enden der Expressionskassette Sequenzen eines in größerer Kopienzahl in dem Chromosomensatz vorliegenden Gens, z.B. für rDNA, anligiert, um eine höhere Anzahl an Austauschereignissen zu bewirken.

In an sich bekannter Weise kann zusätzlich noch ein Markergen in die Sequenz miteingebaut werden, damit die erfolgreich transformierten Zellen selektiert werden kön nen. Verfahren und hierzu geeignete Marker sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Erläuterung.

Das erfindungsgemäße Expressionssystem ist geeignet zur Expression verschiedener heterologer und homologer Proteine. Vorteilhaft ist die Expression homologer Proteine dann, wenn die Expression eines in dem verwendeten Organismus vorhandenen Proteins verstärkt werden soll, da der erfindungsgemäße Promotor die Menge an produziertem Protein stark verbessern kann. Bevorzugt wird das System verwendet zur Expression von Hormonen, z.B. Wachstumshormonen und Wachstumsfaktoren, immunmodulierenden Faktoren, z.B. Interferonen und Interleukinen, Enzymen, z.B. Endopolygalacturonase, Reportergenen, z.B. EGFP, oder Antigenen, z.B. Oberflächenantigenen von Viren, unter anderem S-Antigene von Hepatitis-B-Virus oder Virusprotein 1 aus Polyoma-Virus. Letztere Proteine können besonders vorteilhaft als Impfstoffe eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette ist unter anderem für Hefen der Stämme Kluyveromyces und Saccharomyces geeignet und wird bevorzugt in Hefestämmen der Art Kluyveromyces marxianus var. marxianus verwendet.

TPI ist ein intrazellulär wirkendes Enzym und katalysiert Stoffwechselvorgänge, die normalerweise innerhalb der Zelle ablaufen. TPI wird daher üblicherweise nicht in dem die Zelle umgebenden Medium erwartet und auch nicht gefunden. Wie nicht anders bei einem Enzym mit intrazellulärer Wirkung zu erwarten, wurde daher auch keine Signalsequenz gefunden.

Überraschenderweise wurde nun bei einem speziellen Mikroorganismus, nämlich Kluyveromyces marxianus, TPI im Zellüberstand nachgewiesen. Daraufhin wurde im offenen Leserahmen, der TPI codiert, nach Signalsequenzen gesucht, es konnten aber keine typischen Sequenzen gefunden werden. Die Ausschleusung dieses Enzyms, das im folgenden auch als KmTPI bezeichnet wird, scheint daher auf anderen, Golgi unabhängigen Mechanismen zu beruhen. Die Eigenschaft des Enzyms KmTPI, die Zelle zu verlassen, macht sich die vorliegende Erfindung zunutze.

Natürlicherweise werden Peptide und Proteine dann aus der Zelle ausgeschleust, wenn sie über eine Signalsequenz verfügen. Diese Signalsequenz erzeugt bei der Translation einen Abschnitt, der für den Membranenkontakt und den Durchtritt des auszuschleusenden Proteins sorgt. Dieser Mechanismus liegt bei KmTPI aber offensichtlich nicht vor, sondern die spezielle Triosephosphatisomerase aus K. marxianus weist Eigenschaften auf, die ein Durchdringen der Zellmembranen ermöglichen. Darüberhinaus wurde festgestellt, dass auch ein durch Fusion angehängtes Peptid oder Protein zusammen mit der Triosephosphatisomerase aus der Zelle ausgebracht wird.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass einerseits KmTPI nicht nur in K. marxianus nach der Expression aus der Zelle ausgeschleust wird, sondern dass es nach Transformation von anderen Hefestämmen mit autonom replizierenden Plasmiden, die das KmTPI-Gen exprimieren können, zu einer Überexpression und Ausschüttung von TPI in das Kulturmedium kommt, und dass es andererseits möglich ist, durch Bildung von Fusionsproteinen mit TPI, Fremdproteine nach der Transkription und Translation als Fusionsproteine in das umgebende Zellmedium auszuschleusen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Ausschleusen eines Fremdproteins in Form eines Fusionsproduktes mit Triosephosphatisomerase, bei dem man eine Sequenz, die mindestens regulatorische Sequenzen und eine Fusions-DNA, die für Triosephosphatisomerase und das gewünschte Peptid oder Protein codiert, zur Expression bringt, das gebildete Fusionsprotein isoliert und das Fremdprotein abtrennt.

Auf diese Weise ist es möglich, ein Fusionsprodukt im Zellüberstand zu erhalten. Das Fusionsprodukt kann sowohl ein Hybridmolekül sein, d.h. aus einem homologen und einem heterologen Anteil bestehen, als auch ein Fusionsprotein sein, das aus zwei, oder gegebenenfalls mehr, heterologen Teilen besteht. Bei dem Fusionsprotein kann der TPI-Teil an dem Fremdprotein sowohl N-terminal als auch C-terminal vorhanden sein. Für die Ausschleusung aus der Zelle ist der TPI-Teil am N-terminalen Ende des Fremdproteins bevorzugt. Das Fusionsprodukt kann anschließend in an sich bekannter Weise getrennt werden.

Um die Trennung des Fusionsproduktes zu erleichtern, wird bevorzugt zwischen die beiden die Proteine codierenden DNA-Sequenzen noch eine DNA-Sequenz, die einen Abstandshalter codiert, in an sich bekannter Weise eingefügt. Der Abstandshalter zwischen beiden Molekülteilen sollte groß genug sein, um ein leichtes Auftrennen zu ermöglichen und stellt in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Schnittstelle für Enzyme bereit.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass durch Ankopplung an Triosephosphatisomerase sogar hydrophobe Peptide oder Proteine aus Zellen ausgeschleust werden, die bei Verwendung üblicher Signalsequenzen nicht oder nur in geringem Maße im Überstand zu finden sind. Dies wurde gezeigt für das Oberflächenantigen von Hepatitis B, (Hbs), das mit den üblichen Verfahren nicht aus der Zelle ausgebracht werden kann.

Das Ausschleusen von Proteinen über die Fusion mit TPI ist daher besonders geeignet für solche Proteine, die aufgrund ihrer Hydrophobizität oder fehlender Signalpeptide normalerweise nicht aus der Zelle ausgeschleust werden.

Im experimentellen Teil werden Expressionsversuche gezeigt, die bei Verwendung dieser erfindungsgemäßen Kombinationen zu hohen Ausbeuten führen.

Wenn es erwünscht ist, ein Polypeptid oder Protein nach der Expression aus der Zelle auszuschleusen, wird dies daher bewirkt, indem ein Fusionsprodukt aus KmTPI und dem gewünschten Fremdprotein erzeugt wird. Dazu kann in den Insertionsklonierungsort der oben beschriebenen Expressionskassette z. B. ein ein Fusionsprotein co dierendes Polynucleotid mit N-terminaler oder C-terminaler TPI, einligiert werden. Bevorzugt wird zwischen den Sequenzen für die beiden Proteine noch eine einen Linker codierende DNA-Sequenz vorgesehen, um später die Spaltung des Fusionsproduktes zu erleichtern. Das Fremdprotein wird dann nach der Expression aufgrund der "Ausschleusungsfähigkeit" von KmTPI zusammen mit diesem als Fusionsprodukt aus der Zelle ausgetragen und kann dann nach Abtrennung aus dem Zellmedium und durch Abspaltung von KmTPI in eleganter Weise gewonnen werden.

Natürlich kann zum Ausschleusen eines exprimierten Proteins auch eine an sich bekannte Signalsequenz eingesetzt werden. Diese wird zwischen den Promotor und das zu exprimierende Fremdgen in an sich bekannter Weise einligiert. Bevorzugt wird als Signalsequenz eine solche, die für den verwendeten Organismus homolog ist, verwendet. Besonders gute Ergebnisse wurden erzielt mit einer Kombination aus dem Promotor der Triosephosphatisomerase, bzw. einem als Promotor wirksamen Teil davon, und der Signalsequenz des Endopolygalacturonase-Gens aus Kluyveromyces marxianus.

Eine weitere Verbesserung der Expression und Sekretion wird erhalten, wenn die ausschleusende Wirkung von TPI durch die Bereitstellung einer Signalsequenz verstärkt wird. Erfindungsgemäß kann daher auch die oben beschriebene Ausführungsform, in der eine DNA-Sequenz, die ein Fusionsprodukt aus KmTPI mit dem gewünschten Fremdprotein codiert, in Kombination mit einer bekannten Signalsequenz, wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, verwendet werden. Auch diese Kombination ist Teil der vorliegenden Erfindung.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird daher ein Expressions- und Sekretionssystem bereitgestellt, das in operativer Verbindung die oben definierte Promotorsequenz oder einen als Promotor aktiven Teil davon, eine als Terminator aktive Sequenz, und, zwischen diesen beiden Sequenzen eine Signalsequenz aufweist. Bevorzugt wird als Signalsequenz eine bekannte Sequenz eingesetzt. Dabei handelt es sich um die Signalsequenz des Enzyms Endopolygalacturonase (EPG) aus K. marxia nus. Bevorzugt wird daher die Signalsequenz des Enzyms EPG aus K. marxianus verwendet.

Bei beiden eben erwähnten Ausführungsformen erfolgt die Züchtung in an sich bekannter Weise, wobei entweder in einem kontinuierlichen Verfahren das Protein ständig ins Medium abgegeben wird und aus der Fermentationsbrühe kontinuierlich gewonnen werden kann oder in einem diskontinuierlichen Verfahren die Zellen gezüchtet, geerntet und dann das Protein aus der Brühe gewonnen werden kann.

Das erfindungsgemäße System ist sehr variabel. So kann z.B. nur die oben definierte erfindungsgemäße Promotor-Sequenz oder ein als Promotor aktiver Teil davon zusammen mit anderen Nucleinsäuresequenzen, die weitere regulatorische Sequenzen bereitstellen, und mit einer heterologen Nucleotidsequenz kombiniert werden. Es kann die erfindungsgemäß definierte Promotor-Sequenz oder ein als Promotor aktiver Teil davon mit einer Terminator-Sequenz, zum Beispiel der oben definierten, kombiniert werden, um ein für Kluyveromyces marxianus homologes System bereitzustellen, in das das Polynucleotid für das zu exprimierende Protein eingesetzt wird, oder aber es kann ein System aus dem erfindungsgemäßen Promotor, einer Signalsequenz und einem Terminator zusammen mit einem zu exprimierenden Gen, das ein gewünschtes Protein codiert, kombiniert werden, um ein in die Kultur abzugebendes Protein zu erzeugen. Schließlich kann die erfindungsgemäße Promotorsequenz oder ein als Promotor aktiver Teil davon mit einer Terminator-Sequenz und einer Nucleinsäure aus Km-TPI und dem gewünschten Fremdgen kombiniert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Plasmide, die erfindungsgemäße Expressionssysteme enthalten, insbesondere Plasmide, die den Promotor, das TPI-Gen und den Terminator von TPI aus K. marxianus enthalten. Beispiele sind die in den 1 bis 4 näher erläuterten Plasmide R64, R53, R48 und R11. Diese Plasmide sind rekombinante Plasmide und können in der vorliegenden Form zur Amplifikation der Expressionskassetten und zur Erzeugung der von der einligierten DNA codierten Proteine in Hefen verwendet werden.

Das Plasmid pD1, das die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 enthält, wurde in E.coli DH5α als Wirtszelle bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSMZ) mit der Hinterlegungsnr. DSM 13973 hinterlegt.

Da Kluyveromyces marxianus-Zellen mit vielen verschiedenen C-Quellen wachsen können und bezüglich weiterer Nährstoffe nicht sehr anspruchsvoll sind, darüber hinaus temperaturunempfindlich sind, wird hier ein sehr effektives System bereitgestellt. Die zuverlässige Expression der Fremdproteine wird durch die erfindungsgemäß bereitgestellte regulatorische Sequenz der Erfindung erreicht.

Erfindungsgemäß wird ein System bereitgestellt, das es zuläßt, die aufgrund ihrer außergewöhnlichen physiologischen Leistungen als Wirt vielversprechende Hefeart Kluyveromyces marxianus zu nutzen.

Das erfindungsgemäße System eignet sich zur Expression von RNA, Peptiden, Polypeptiden, Proteinen und Hybridmolekülen einschließlich glycosylierter Proteine.

Im folgenden werden einige Definitionen für Begriffe angegeben, die in der Beschreibung verwendet werden.

Als "Expressionsvektor" wird ein DNA-Molekül bezeichnet, das linear oder ringförmig sein kann und ein Segment enthält, das eine Sequenz für ein interessierendes Protein oder Peptid codiert, das operativ verbunden ist mit regulatorischen Sequenzen. Diese regulatorischen Sequenzen schließen mindestens Promotor- und Terminatorsequenzen ein. Der Expressionsvektor kann zusätzlich selektierbare Marker und weitere regulatorische Elemente enthalten und muß die Übertragung und Vermehrung in Wirtszellen ermöglichen. Die Replikation der Expressionsvektoren kann autonom oder durch Integration in das Wirtsgenom erfolgen.

Der Ausdruck "DNA" oder "Polynucleotid" schließt polymere Formen von Desoxyribonucleotiden beliebiger Länge und beliebiger Modifikation in einzel- und doppelsträngiger Form ein.

"Sekretionsvektor" bezeichnet in dieser Beschreibung einen Expressionsvektor der zusätzlich zur Expression eines Polypeptids auch die Ausschleusung des Polypeptids in Form eines Fusionsproteins bzw. durch die Signalsequenz bewirkt.

Der Ausdruck "operativ verbunden" bedeutet, dass die einzelnen Segmente so angeordnet sind, dass sie dem vorgesehenen Zweck dienen, d.h. die Transkription initiieren und terminieren können und die Expression fördern können bzw. die Expression und Sekretion ermöglichen.

Die beanspruchten Sequenzen können weitere kurze Sequenzen aufweisen, die die biologische Aktivität des Moleküls nicht stören. Weiterhin umfassen die beanspruchten Sequenzen auch allelische Varianten der Sequenz, d.h. alternative Formen des Gens, die durch Mutation entstanden sind.

Der Begriff "Protein oder Peptid" bezieht sich auf eine molekulare Kette von Aminosäuren mit biologischer Aktivität. Der Ausdruck Polypeptid bezeichnet üblicherweise Aminosäuresequenzen mit bis zu 200 Aminosäuren, während längere Ketten in der Regel als Proteine bezeichnet werden. In der vorliegenden Beschreibung soll der Ausdruck Polypeptid auch Proteine umfassen bzw. umgekehrt der Ausdruck Proteine auch Polypeptide mitumfassen. Die Proteine und/oder Polypeptide können in vivo oder in vitro modifiziert werden, z.B. durch. Glycosylierung und Phosphorylierung.

Als unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors zu exprimierendes Gen wird jede DNA verstanden, deren Expression gewünscht wird. "Fremd-DNA" ist dabei jede DNA, die normalerweise nicht unter der Kontrolle des TPI-Promotors exprimiert wird. Fremd-DNA kann Gene, Teile von Genen, fusionierte Gene, cDNA oder andere DNA-Sequenzen umfassen, sowie DNA, die Polypeptide oder Proteine oder auch RNA oder anti-sense-RNA codiert. Fremd-DNA kann auch ein Reportergen sein. Die Fremd-DNA kann eine natürlich vorkommende, gentechnisch hergestellte oder chemisch synthetisierte Sequenz oder eine Kombination davon sein. Die verwendete Nucleotidsequenz und das Verfahren ihrer Herstellung sind nicht kritisch.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Hefezelle mit einem sich autonom replizierenden Plasmid transformiert, das eine erfindungsgemäße Expressionskassette und ein Polynucleotid, das ein Fremdprotein kodiert, umfaßt, die Hefezelle unter Bedingungen, die zur Expression des Fremdproteins geeignet sind, züchtet und das Protein gewinnt.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine erfindungsgemäße Expressionskassette in eine Hefezelle bringt, wo die Expressionskassette in das Genom der Wirtszelle eingebaut wird, die Zelle züchtet und anschließend das Protein gewinnt. Besonders bevorzugt wird die erfindungsgemäße Expressionskassette als Modul eingesetzt das die Konstruktion von episomalen oder integrativen Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen und ggf. Signalsequenzen enthalten, ermöglicht.

Wie in den Figuren und den Beispielen gezeigt, führt die Verwendung des erfindungsgemäßen Promotors in Kombination mit einer Sequenz für ein gewünschtes Protein und mit einem Terminator zur Expression des gewünschten Proteins, insbesondere in Hefezellen. Um zu prüfen, wie stark der erfindungsgemäß bereitgestellte Promotor ist, wurde die Expression des Gens EGFP (enhanced green fluorescent protein) unter Kontrolle des CMV-(Cytomegalie-Virus)-Promotors mit der des EGFP-Gens unter der Steuerung des TPI-Promotors verglichen. Dabei wurde gefunden, dass die Expression unter dem erfindungsgemäßen TPI-Promotor etwa das 50-fache der Expression des CMV-Promotors bewirkt, was zeigt, dass der erfindungsgemäße Promotor zu einer Verstärkung der Expression von Fremdproteinen führt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele näher erläutert.

In den Figuren zeigt

1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette (R64), in der ein funktioneller Teil des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1115 entsprechend SEQ ID Nr.1), der Leserahmen des EGFP-Gens und ein funktioneller Teil des Km-TPI-Terminators (Position 1860 bis 2127 entsprechend SEQ ID Nr.1) operativ miteinander verbunden sind.

2 die erfindungsgemäße Expressionskassette R53, in der ein funktioneller Teil des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1115 entsprechend SEQ ID Nr.1), der Leserahmen des Hepatitis-B-Virus S-Antigens und ein funktioneller Teil des Km-TPI-Terminators (Position 1860 bis 2127 entsprechend SEQ ID Nr.1) operativ miteinander verbunden sind.

3 die erfindungsgemäße Expressionskassette R48, in der ein funktioneller Teil des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1115 entsprechend SEQ ID Nr.1), der Leserahmen des Hepatitis-B-Virus S-Antigens, der Leserahmen für Triosephosphatisomerase ohne Start-Methionin (Position 1116 bis 1859 entsprechend SEQ ID Nr.1) und ein funktioneller Teil des Km-TPI-Terminators (Position 1860 bis 2127 entsprechend SEQ ID Nr.1) operativ miteinander verbunden sind.

4 die erfindungsgemäße Expressionskassette R11, in der ein funktioneller Teil des Km-TPI-Maximalpromotors (Position 21 bis 1112 entsprechend SEQ ID Nr.1), der Leserahmen für Triosephosphatisomerase (Position 1113 bis 1856 entsprechend SEQ ID Nr.1) der Leserahmen des Hepatitis-B-Virus S-Antigens, und ein funktioneller Teil des Km-TPI-Terminators (Position 1857 bis 2037 entsprechend SEQ ID Nr.1) operativ miteinander verbunden sind.

5 den Vergleich der Expression des TPI-Gens im K. marxianus Ausgangsstamm und nach Transformation mit dem Plasmid pKmarTI, das aus der Sequenz entsprechend SEQ ID Nr.1 und dem K. marxianus-Vektor pKDU8 besteht. Neben den Kulturüberständen der K. marxianus Stämme wurden Kulturüberstände nicht transformierter Stämme von K. lactis und S. cerevisiae in gleicher Menge aufgetragen.

6 den Vergleich der Sekretierbarkeit von HBs Antigen nach Expression mittels verschiedener Expressionskassetten.

7 den Vergleich der Expression von HBs-Antigen mit Hilfe verschiedener Expressionskassetten.

Beispiel 1
Aufbau allgemeiner Expressionskassetten
Um eine Expressionskassette mit dem erfindungsgemäßen Promotor bereitzustellen, wird durch PCR mittels der Primer P23 und P36 ein DNA-Fragment amplifiziert, das aus Promotor, codierendem Bereich und Terminator des KmTPI-Gens besteht und an den Enden durch künstliche Restriktionsenzymerkennungsstellen für MluI begrenzt wird. Dieses Fragment wird in den MluI Site des Plasmides pSL1180 kloniert. Im codierenden Bereich des KmTPI-Gens befindet sich eine Restriktionserkennungsstelle für das Restriktionsenzym AclI (AACGTT). Durch PCR wird an dieser Stelle eine stumme Mutation eingeführt, die den AclI Site zerstört, jedoch die durch GTT codierte Aminosäure Valin nicht verändert (AACGTT zu AACGTC). Ein Site für Ac kann nun durch PCR unmittelbar vor dem Startcodon generiert werden, da sich hier die Nucleotidsequenz AAC ATG befindet (AACgtt ATG).
Unmittelbar vor dem Stopcodon des TPI codierenden Bereiches (GTC TAA) kann ebenfalls mittels PCR ein künstlicher AclI Ort generiert werden (aacGTt TAA). Durch Verbindung des MluI/AclI Promoterfragmentes mit dem AclI/MluI Terminatorfragment entsteht eine leere Expressionskassette mit einem unikalen AclI Ort für die Insertion von fremden Leserahmen (Kassette = qpTIMex).
Die KmTPI Kassetten mit unikalem AclI Ort vor dem Startcodon bzw. vor dem Stopcodon stellen die Sekretionskassetten dar, die eine Expression von Fremdproteinen als Fusionsproteine mit TPI am N- oder C-terminalen Ende ermöglichen und zu einer Sekretion der entsprechenden Fusionsproteine führen (Kassetten = pTIMfusN und pTIMfusC).
Die Kassetten können in bekannter Weise über MluI in entsprechende integrative- oder sich autonom replizierende Vektoren eingebaut und mit diesen in Rezipientenzellen eingebracht werden.
Beispiel 2
Generierung von Expressionseinheiten
Die Generierung von Expressionseinheiten kann auf der Basis der regulatorischen Sequenzen des KmTPI auch generell durch sich überlappende PCR Reaktionen mittels Hybridprimern erfolgen, ohne dass AclI Schnittstellen in der Sequenz generiert werden müssen. Dem Fachmann sind entsprechende Techniken und PCR-Regimes bekannt. Das in Beispiel 1 beschriebene System ist deshalb nicht ausschließlich, sondern nur beispielhaft zu sehen.
Beispiel 3
Spezielle Expressionskassetten
Es wurden einige spezielle Expressionskassetten, die als R64, R53, R48 und R11 bezeichnet werden, durch PCR-Techniken generiert. Diese Kassetten sind durch Schemata und Restriktionskarten in den 1 bis 4 näher charakterisiert.
Plasmid R64 (1)
Die Kassette enthält den KmTPI-Maximal-Promoter mit den Nucleotiden 21 bis 1115 von SEQ ID Nr. 1, den EGFP Leserahmen und den KmTPI-Terminator mit den Nucleotiden 1860 bis 2127 entsprechend SEQ ID Nr. 1 (TPIpr-MetEGFP-TPItr).
Plasmid R53 (2)
Die Kassette enthält den KmTPI Maximal-Promoter mit den Nucleotiden 21 bis 1115 von SEQ ID Nr. 1 (einschließlich Met), den Leserahmen für Hepatitis B Virus S-Antigen und den KmTPI-Terminator mit den Nucleotiden 1860 bis 2127 entsprechend Sequenz SEQ ID Nr. 1 (TPIpr-HBS-TPItr)
Plasmid R48 (3)
Die Kassette enthält den KmTPI Maximal-Promoter mit den Nucleotiden 21 bis 1115 von SEQ ID Nr. 1 (einschließlich Met), den Leserahmen für Hepatitis B Virus S-Antigen an dessen C-Terminus der Leserahmen für TPI ohne Methionin fusioniert ist und den KmTPI-Terminator mit den Nucleotiden 1860 bis 2127 entsprechend Sequenz SEQ ID NR.1 (TPIpr-HBS-TPI-TPItr).
Plasmid R11 (4)
Die Kassette enthält den KmTPI Maximal-Promoter und den gesamten Leserahmen für KmTPI an dessen C-Terminus mit Methionin beginnend der Leserahmen für Hepatitis B Virus S-Antigen fusioniert ist. Dieser endet mit eigenem Stopcodon (UAG). Der hier verwendete funktionelle Teil des KmTPI-Terminators überlappt mit dem Stopcodon der HBs-Sequenz (TAAATTAAATTAGG) und beginnt mit dem Stopcodon UAA bei Position 1857 entsprechend SEQ ID Nr. 1. Er umfaßt lediglich 180 Basenpaare. Diese Kassette wurde über stumpfe Enden in den SmaI Ort entsprechender Plasmide kloniert (TPIpr-TPI-HBS-TPItr).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA enthaltend die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NO:1 oder eine Sequenz, die mindestens die Nucleotide 352 bis 1112 von SEQ ID NO:1 enthält, und als Promotor aktiv ist, den offenen Leserrahmen für das Enzym Triosephosphatisomerase und eine Sequenz, die mindestens die Nucleotide 1860 bis 2163 von SEQ ID NO:1 enthält und als Terminator aktiv ist, aufweist.
DNA mit einer Sequenz, die die Nucleotide 1 bis 1112 von SEQ ID NO:1 aufweist oder eine Sequenz, die mindestens die Nucleotide 352 bis 1112 von SEQ ID NO:1 enthält und als Promotor aktiv ist.
Promotor mit einer Sequenz nach Anspruch 2 in operativer Verbindung mit der DNA-Sequenz für ein zu exprimierendes Protein.
Promotor mit einer Sequenz nach Anspruch 2 in operativer Verbindung mit der Signalsequenz des EPG-Gens aus K.marxianus.
DNA mit einer Sequenz nach Anspruch 1 umfassend regulatorische Sequenzen und den offenen Leserahmen des Enzyms Triosephosphatisomerase aus K.marxianus.
Terminator mit einer Sequenz enthalten mindestens die Nucleotide 1860 bis 2163 von SEQ ID NO:1.
Hefe-Expressionskassette enthaltend in operativer Verbindung eine Nucleotidsequenz, die mindestens die Nucleotide 352 bis 1112 von SEQ ID NO:1 enthält, eine Insertionsklonierungsstelle und eine Sequenz enthaltend mindestens die Nucleotide 1860 bis 2163 von SEQ ID NO:1 als Terminator.
Hefeexpressions- und Sekretionskassette umfassend in operativer Verbindung einen Promotor nach Anspruch 2 oder einen als Promotor aktiven Teil davon, eine Signalsequenz, eine Insertionsklonierungsstelle und den Terminator, wie in Anspruch 7 definiert.
Plasmid pD1 enthaltend DNA gemäß SEQ ID Nr. 1 hinterlegt mit der Hinterlegungsnummer DSM13973.
Expressionsvektor enthaltend in operativer Verbindung einen Promotor gemäß Anspruch 2 ein Polynucleotid, das ein Fremdprotein kodiert, und einen Terminator.
Expressionsvektor nach Anspruch 10, der zusätzlich noch eine Signalsequenz zwischen Promotor und Polynucleotid enthält.
Expressionsvektor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Signalsequenz die Signalsequenz des EPG-Gens von K.marxianus enthaltend ist.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid ein Wachstumshormon, ein Wachstumsfaktor, ein Interferon oder ein antigenes Protein oder Peptid kodiert.
Expressionsvektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid ein Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen kodiert.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein integrativer oder episomaler Vektor ist.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein in Hefe replizierbares Plasmid ist.
Expressions- und Sekretionsvektor umfassend in operativer Verbindung einen Promotor mit einer Sequenz gemäß Anspruch 2, eine KmTPI codierende DNA 3' oder 5' benachbart zu einem Fremdgen und einen Terminator gemäß Anspruch 6.
Expressions- und Sekretionsvektor nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen KmTPI-DNA und Fremdgen noch eine DNA ist, die einen Abstandshalter codiert.
Wirtszelle transformiert mit einem Plasmid gemäß Anspruch 9 oder einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 10 bis 18.
Wirtszelle nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Zelle der Art Kluyveromyces marxianus ist.
Verwendung eines Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 10 bis 16 zur Herstellung eines rekombinanten Proteins in Hefezellen, wobei man eine Hefezelle mit einem Plasmit transformiert, das einen Expressionsvektor mit einem Polynucleotid, das ein Fremdprotein oder ein Fusionsprotein kodiert, enthält, die Hefezellen unter Bedingungen, die zur Expression des Fremd- oder Fusionproteins geeignet sind, züchtet und das Protein gewinnt.
Verwendung eines Expressions- und Sekretionsvektors nach Anspruch 17 oder 18 zur Gewinnung eines rekombinanten Proteins aus Hefezellen, wobei man eine Hefezelle mit dem Expressions- und Sekretionsvektor transformiert, die Hefezellen unter Bedingungen, die zur Expression eines Fremd- oder Fusionsproteins geeignet sind, züchtet und das bei der Expression entstehende Produkt aus dem Überstand gewinnt.
Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass man das bei der Expression entstehende Fusionsprodukt aus dem Überstand gewinnt und TPI in an sich bekannter Weise von dem Fremdprotein abtrennt.
Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Sekretionsvektor als regulatorische Abschnitte Promotor und Terminator von TPI verwendet werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass als Promotor ein Promotor nach Anspruch 2 verwendet wird und dass als Terminator ein Terminator gemäß Anspruch 6 verwendet wird.
Verwendung einer DNA nach Anspruch 1, die mindestens regulatorische Sequenzen und eine Fusions-DNA, die für Triosephosphatisomerase und das gewünschte Peptid oder Protein kodiert, aufweist zur Ausschleusung von Fremdproteinen in Form eines Fusionsproduktes nach einer Expression in Hefezellen.
Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die ausschleusende Wirkung von TPI durch Kombination mit einer Signalsequenz verstärkt wird.
Verwendung nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass DNA mit den Nucleotiden 1 bis 1112 gemäß SEQ ID Nr. 1 o der ein Teil davon als Promotor zur Expression von homologen oder heterologen Polypetiden in Hefezellen verwendet wird.
Verwendung einer KmTPI kodierenden DNA gemäß SEQ ID Nr. 1 in operativer Verbindung mit regulatorischen Bereichen und in Kombination mit einem Fremdgen zur Erzeugung eines Fusionsproduktes aus TPI und einem Polypeptid, das nach Expression aus der Zelle ausgeschleust wird.
Verwendung eines Promotors nach Anspruch 2 oder eines als Promotor aktiven Teils davon als regulatorischer Abschnitt für die Expression eines Polypeptids in Kombination mit einer Signalsequenz, um ein Polypeptid zu exprimieren und aus der Zelle auszuschleusen.
Verwendung eines Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 10 bis 18 zur Herstellung eines rekombinaten Proteins, wobei man Hefezellen mit dem Expressionsvektor transformiert, die Zellen, die den Expressionsvektor in das Genom eingebaut haben, selektiert und züchtet und anschließend das Protein gewinnt.