DD267511A5

DD267511A5 - Neues Expressionssystem

Info

Publication number: DD267511A5
Application number: DD31263288A
Authority: DD
Inventors: Jutta Heim; Christof Gysler; Jacob Visser; Hermanus C M Kester
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1987-02-04
Filing date: 1988-02-03
Publication date: 1989-05-03
Also published as: YU21688A; HU214005B; DE3854947T3; FI105484B; DD283838A5; GB8702475D0; ZA88757B; EP0683228A2; DE3854947T2; NO179078B; AU625773B2; FI880439A0; NZ223392A; PT86684B; NO179078C; ATE133706T1; EP0278355B1; JPS63273480A; PH26106A; IE72506B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Molekuels, welches DNA-Sequenz enthaelt, die fuer das Pektinlyase (PL)-Expressionssystem oder ein Derivat desselben kodieren, wobei ein mit einem DNA-Molekuel transformierter Wirt gezuechtet wird und das gewuenschte rekombinante DNA-Molekuel oder ein Derivat desselben isoliert wird. Das DNA-Molekuel kann auch durch in-Vitro-Synthese hergestellt werden. Durch die Entwicklung der neuen erfindungsgemaess hergestellten Polypeptid-Expressionssysteme wird das Gebiet der Gentechnologie erweitert.

Description

Hierzu 14 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnologie und schafft neue DNA-Moleküle, umfassend DNA-Sequenzen, die die Pektinlyase I (PLI) von Aspergillus niger und/oder den Promotor, die Signalsequenz oder den Terminator davon kodieren. Die neuen DNA-Moleküle sind für die Überproduktion von PLI in Aspergillus und/oder die Konstruktion von Hybridvektoren, welche Fremdgene in Fadenpilzen zum Ausdruck kommen lassen, nützlich.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Obzwar auf gentechnologischem Gebiet zahlreiche Polypeptid-Expressionssystemefürprokaryotische und eukaryotische Wirte bereits bekannt sind, besteht ein fortlaufender Bedarf für neue Systeme, welche gegenüber den bekannten Systemen Vorteile haben konnten.

In großem Maße werden der prokaryotische Wirt Escherichia coli und der eukaryotische Hefe-Wirt, z. B. Saccharomyces cerevisiae, für die eine große Anzahl von verschiedenen Expressionshybridvektoren, meistens Plasmide, entwickelt wurden, angewandt. Die Nachteile der E.coli-Wirte bestehen darin, daß sie das gebildete Polypeptid nicht glykosylieren können und daß aufgrund des Fehlens von Ausscheidung das fremde Peptid innerhalb der Wirtszelle akkumuliert werden könnte und weiteres Wachstum verhindern könnte. Die Hefe-Wirte glykosylieren, jedoch scheiden sie nicht, wie E.coli, die Polypeptide in das Nährmedium aus, außer sehr kleinen. Hefen scheiden nur in den periplasmischen Raum aus. Höhere eukaryotische Wirte sind Säugetierkrebszellen, welche in der Lage sind, zu glykosylieren und in das Nährmedium auszuscheiden, jedoch ist die Kultivierung hiervon sehr langsam und kostspielig, und es besteht die Gefahr, daß onkogene Nucleinsäuren zusammen mit dem gewünschten Peptid, wovon das letztere nicht befreit werden kann, isoliert werden.

Aufgrund des Bedarfs für andere Wirte wurden auch Fadenpilze, wie Neurospora crassa, Aspergillus nidulans und Asperg illus niger, untersucht. Solche Pilze werden bereits in hohem Maße für industrielle Zwecke verwendet, jedoch wu rde ihre Anwendu ng in der Gentechnologie vernachlässigt, hauptsächlich wegen des Fehlens eines geefgneten Transformationssystems. Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae enthalten Fadenpilze keine Plasmide, welche zur Einführung von Fremdgenen und phänotypischer Selektion verwendet werden könnten. Es ist jedoch möglich, Fadenpilze mit Fremdplasmiden, die ein selektierbares Markergen enthalten, zu transformieren. Alle bisher für Fadenpilze beschriebenen Vektoren sind nicht selbstreplizierend wie diejenigen der Hefen, werden aber in das Pilzchromosom integriert. Dies tritt nur mit sehr niedriger Frequenz auf. Andererseits macht die integrative Transformation die Transformanten vorteilhafterweise m itotisch sehr stabil, selbst unter non-selektiven Bedingungen. Es wurde von einer stabilen Integration von mehr als einhundert Kopien berichtet. Der erste beschriebene Vektor für Fadenpilze enthielt das qa-2-Gen von Neurospora crassa als selektiven Marker. Dieses Gen kodiert die Enzym-katabolische Dehydrokinase und kann zur funktionellen Vervollständigung von Aromutanten von N.crassa verwendet werden [M. E. Case, M.Schweizer, S.R.Kushner und N.H.Giles [1979] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76,5259-5263). Aromutanten sind nicht in der Lage, auf Minimalmedium ohne Zusatz einer aromatischen Aminosäure zu wachsen. Transformation von N.crassa durch den qa-2-Vektortrat durch Integration einer Einzelkopie des Plasmids in das Chromosom auf. 30% der stabilen Aro⁺-Integranten hielten das integrierte qa-2-Gen, das noch an die bakterielle Plasmid-Sequenzen gebunden war, zurück (M. E. Case [1982] in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals [A. Holländer, D. DeMoss, S. Kaplan, J.Konisky, D.Savage und R.S.Wolfe, Editoren], Seiten 87-100, Plenum). Diese Beobachtung machte die Kotransformation von nicht-selektiven DNA-Sequenzen zusammen mit selektiven zu einer durchführbaren Aufgabe.

In Aspergillus nidulans, der einen Sexuaizyklus hat und daher klassischen genetischen Manipulationen unterworfen werden kann, wurden sowohl negative als auch positive Selektionssysteme identifiziert. Sowohl unter Verwendung von heterologer DNA von N.crassa als auch homologer DNA wurde eine funktionell Vervollständigung von A. nidulans-pyrG-Mutanten durch Transformation mit Plasmiden, die das pyrG-Gen enthielten, erhalten (Ballance et al. BBRC 112,284,1983; Tilburn et al. Gene 26, 205,1983). In anderen Systemen wurden Mutationen am trpC- oder argB-Locus funktionell durch Transformation mit den geeigneten Plasmiden vervollständigt (Yelton et al. PNAS 81,1470,1984; Yelton und Timberlake J. Cell. Biochem. Suppl. 9C173, 1985; Johnstone et al. EMBO J. 4,1307,1983).

Ein dominantes, positives Selektionssystem wurde auch entwickelt, indem das amdS-Gen verwendet wurde, das aus A. nidulans isoliert wurde, welches den damit transformierten A. niger in die Lage versetzt, auf Acetamid als einziger Stickstoffquelle zu wachsen (Tilburn et al., Gene26,205,1983; Wernars et al., Curr. Genet. 9,361,1985; J. M.Kelly et al., EMBO J. 4,475,1985). Verglichen mit N. crassa oder A. nidulans ist A. niger bei weitem der wichtigere Organismus. Er wird in weitem Umfang bei der industriellen Produktion von Enzymen, z.B. zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie, verwendet. A. niger unterscheidet sich von A. nidulans durch seine sekretorische Kapazität in der Weise, daß er eine Vielzahl von hydrolytischen Enzymen ausscheidet, z.B. Glucoamylase, a-Amylase, Pectinase, Cellulase, ß-Glucanase, ß-Galactosidase, Naringinase, Pentosanase, Säureprotease und Lignase, wobei der Glucoamylase- und Pectinase-Komplex die bei weitem wichtigsten sind. A. niger hat keinen bekannten Sexualzyklus. Mutationen können daher nicht über meiotische Rekombinationen eingeführt werden. Mittels klassischer Mutations- und Selektionsverfahren wurden jedoch ausgedehnte Stammverbesserungen in der Sekretion von hydrolytischen Enzymen erreicht.

Von den Genen der A.niger-Enzyme wurden nur diejenigen der Glucoamylase (Boel et al. EMBO J. 3,1581,1984) und Alkohol- und Aldehyd-Dehydrogenase (WO 86/06097) zusammen mit ihrem Promoter und Signalsequenzen charakterisiert und bei Transformationsexperimenten mit A. nidulans bzw. A. niger verwendet.

Als Selektionsmarker für A. niger wurden die heteroiogen amds-Gene (Kelly und Hynes, EMBO 3,4,475,1985) und das argB-Gen (Buxton et al., Gene 37,207,1985; EP 184438; WO 86/06097), welche beide aus A. nidulans erhalten wurden, verwendet. A. niger ist der wichtigste Organismus für die industrielle Produktion von Pektin abbauenden Enzymen. Pektine sind Polygalacturonide mit hohem Molekulargewicht (20000 bis 40000 D), die aus a-1,4-glykosidisch gebundener-D-Galacturonsäure-Polymeren bestehen und in der Natur als Bestandteile von Zellen höherer Pflanzen auftreten, wo sie an Celluloeemolekülen gebunden sind, die hauptsächlich in der primären Zellwand und den Mittellamellen gefunden werden. Unter den reichsten Quellen für Pektin sind Zitronen- und Orangenrinde, welche etwa 30% dieses Polysaccharide enthalten. Pektische Enzyme bauen das Kohlenhydrat-Polymersubstrat ab entweder durch Hydrolyse der a-1,4-glykosidischen Bindung (Polygalacturonase) oder durch Transeiemination des CHl.S-ungesättigt-Galacturonischen Restes aus dem Pektinmolekül (verschiedene Pektinlyasen). Der systematische Name der Pektinlyase ist Pektintranseliminase (EC 4.2.2.10).

In A. niger werden die Proteine des praktischen Komplexes konstitutiv nicht exprimiert. Unter induzierenden Bedingungen und Verwendung von Pektin oder Bruchstücken davon drückt A. niger die oben erwähnten Enzyme einschließlich PLI aus, wenn andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose oder Saccharose, begrenzt sind. Bei Oberflächenkulturen neigen die pektischen Enzyme dazu, mit der äußeren Zellwand verbunden zu bleiben. Steigende Pektin· und Ca²⁺-Konzentration im Medium führt zu vollständiger Ausscheidung.

Pektinasen, wie PLI, werden von der Nahrungsmittelindustrie hauptsächlich für die Fruchtsaftklärung verwendet. Aus Aspergillus niger wurden zwei verschiedene Pektinlyasen, PLI und PLII, gereinigt und teilweise durch F. E. A. Van Houdenhoven (1) charakterisiert. PLI enthält vier Reste von Mannose, während PLII zwei Reste von jeweils Mannose und Glukose hat. Die Enzyme haben verschiedene Molekulargewichte (PLI: 37,5kD, PLII: 36 kD). Vor der vorliegenden Erfindung wurden keine Gesamt- oder Teilaminosäure-Sequenzen veröffentlicht.

Die vorliegende Erfindung basiert auf einer teilweisen Strukturbestimmung von Pektinlyase I (PLI), welche die Synthese von DNA-Teilstücken erlaubte, die für relevante Teile des Proteins kodieren. Mit Hilfe der DNA-Teilstücke war es möglich, aus einer Genbank von A. niger DNA zu screenen und zu isolieren, welche für PLI, gegebenenfalls zusammen mit Prä- und Post-Sequenzen davon, kodiert.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, das Gebiet der Gentechnologie durch Entwicklung neuer Polypeptid-Expressionssysteme zu erweitern, die gegenüber den bekannten Systemen Vorteile haben.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten DNA-Molekülen, die für ein Pektinlyase-Expressionssystem und Derivate davon kodieren, wie das Strukturgen von PLI und entsprechenden regulatorischen Sequenzen, z.B. Promotor·, Start· und Stopsequenzen, und Hybridvektoren, umfassend die entsprechenden DNAs einschließlich Hybridvektoren mit DNA, die für homologe oder heterologe Polypeptide kodieren, Wirte, insbesondere Fadenpilze, z. B. Aspergillus-Wirte, transformiert durch diese Vektoren, Methoden zur Herstellung dieser rekombinanten DNA-Moleküle und ihrer Wirte und die Verwendung der rekombinanten DNA-Moleküle zur Herstellung von neuen Expressionssystemen zu entwickeln. Eine weitere Aufgabe ist die Herstellung von Polypeptiden mittels dieser DNAs und ihrer Wirte.

Das Pektinylase-Expressionssystem umfaßt DNA-Sequenzen, die für den Promotor, die Startsequenz, das Strukturgen und den Terminator eines Pektinlyasegens kodieren.

Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Konstruktion von Hybridexpressionsvektoren, umfassend DNA-Sequenzen, die für den Promoter von PLI kodieren, gegebenenfalls für die Startsequenz dieses Proteins und gegebenenfalls für einen geeigneten Terminator des gleichen Gens zu finden. Diese Hybridexpressionsvektoren werden zum Einschluß der Gene, die für besondere Proteine und für die Transformation von Fadenpilzen, wie Aspergillus, Penicillium und Cephalosporium, kodieren, verwendet. Die Kotransformation von A. niger mit zwei verschiedenen Plasmiden kann durchgeführt werden, wobei eines der Plasmide aus der Gruppe von Expressionsvektoren der Erfindung ausgewählt wird und das andere ein besonders konstruiertes Selektionsplasmid, das in Verbindung mit einem mutierten Stamm eines Fadenpilzes arbeitet, ist. Die vorliegende Erfindung hat auch die Aufgabe die Überproduktion von PLI in Aspergillus-Species zu schaffen. Erfindungsgemäß wird zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches DNA-Sequenzen enthält, die für das Pektinlyase (PL)-Expressionssystem oder ein Derivat desselben kodieren, ein mit einem DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz enthält, die für das Pektinlyase-Expressionssystem oder ein Derivat desselben kodiert ein transformierter Wirt gezüchtet und das gewünschte rekombinante DNA-Molekül oder das Derivat desselben isoliert. Das rekombinante DNA-Molekül kann erfindungsgemäß auch durch in-Vitro-Synthese hergestellt werden.

Weitere erfindungswesentliche Details werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung eines kombinanten DNA-Moleküls, umfassend die DNA-Sequenz der Formel I (Fig.4) oder ein Derivat davon.

Der Ausdruck „Derivat", sofern im Zusammenhang mit der DNA-Sequenz der Formel I verwendet, soll größere Derivate mit flankierenden Sequenzen, Fragmente dieser DNA-Sequenz, Mutanten, insbesondere natürlich auftretende Mutanten, und DNA-Sequenzen, welche degeneriert sind, umfassen.

Größere Derivate der DNA-Moleküle der Formel I sind solche, die aus dem A. niger-Genom ausgeschnitten werden können und die DNA-Sequenz der Formel I umfassen, wie sie in einer Genbank von A. niger gefunden werden kann, erhalten durch Fragmentieren der Nucleinsäuren, Behandlung der Fragmente mit einem geeigneten Restriktionsenzym, z. B. Sau3A, Ligieren an ein geeignetes Plasmid, z. B. pUN121, Klonen, z. B. in E. coli, und Wiederausschneiden mit dem gleichen Restriktionsenzym. Ein solches Derivat ist z.B. der Einschub des Plasmids pCG3B11, dargestellt in Fig. 1.

Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I sind solche, die sich zwischen zwei Restriktionsstellen ausdehnen, ausgewählt aus denjenigen von Pst I, EcoRI, Hindlll, Sau3AI, Kpnl, CIaI, Ncol, Accl, SaIII, Pvul, Sail, Spei, BgII, EcoRV, BgIII, Aval, Xhol, Nhel, BssHI, Xmnl, BamHI, BssHII und dergl., wie dies in den beigefügten Figuren gezeigt ist.

Bevorzugte Fragmente sind solche, welche die Promotor-Sequenz, die Start-Sequenz, das Strukturgen von PU und/oder die Stop-Sequenz enthalten.

Die Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I können Linker enthalten, welche für eine erfolgreiche Verbindung zu anderen DNA-Molekülen sorgen.

Die PLI-Promotor-Sequenz ist in der DNA-Region zwischen den Nucleotid-Positionen — 1 bis —688 enthalten, wobei die Sequenz zwischen den Nucleotiden etwa -100 bis -146 wesentlich ist. Für die Promotor-Sequenz ist der TATAA-Abschnitt bei den Nucleotiden -120 bis -146 als RNA-Polymerase-Erkennungszone wichtig. An diese Fragmente können geeignete Bindeglieder angeknüpft werden.

Der Promotor von PLI von A. niger ist induzierbar, d. h. die Expression des daran geknüpften Strukturgens, z. B. des Strukturgens, das für PLI oder irgendein anderes Fremdgen kodiert, wird durch Zugabe von Pektin oder Pektinabbauprodukten zum Medium induziert.

Die Start-Sequenz dehnt sich zwischen den Nucleotiden 1 bis 57 aus. Die Start-Sequenz ist eine bevorzugte Sequenz und diese umfassende DNA-Moleküle, z.B. solche, welche diese Sequenz und gegebenenfalls geeignete Bindeglieder enthalten, sind bevorzugte DNA-Moleküle.

Das Strukturgen von PLI beginnt bei Nucleotid 58 und dehnt sich bis Nucleotid 1366 aus. Wie aus Formel I ersichtlich, enthält das Strukturgen mehrere Introns. Auch das Strukturgen kann geeignete Linker enthalten.

Der Terminator beginnt mit dem Stopcodon TAA bei Nucleotid 1367 und kann sich bis zu Nucleotid 1570 oder bis zu 2029 ausdehnen, besonders bis zu einem der Restriktionspunkte innerhalb dieser Sequenz. Das Terminatorfragment kann geeignete Linker enthalten.

Geeignete Linker für obige Fragmente haben eine DNA-Sequenz, welche in die Restriktionsstelle der DNA, an welche das Fragment gebunden werden soll, hineinpaßt oder welche eine Restriktionsstelle enthalten.

Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I sind auqh solche, welche aus kleineren Fragmenten zusammengesetzt sind, z. B.

solchen, die aus dem Promotor und der Start' oder Struktursequenz oder der Start- und der Struktursequenz, dem Strukturgen ohne die Introns, und dergl. bestehen.

Mutanten der DNA-Sequenz der Formel I sind beispielsweise natürlich vorkommende Mutanten, wie die Mutante, deren Nucleotid T₈₀ durch A₈₀ ersetzt ist, wobei das Codon GTG, das für Valin kodiert, in GAG, das für Glutaminsäure kodiert, geändert wird. Die letztere Aminosäure ist in dem PLI vorhanden, das aus einem Gemisch von pektinolytischen Enzymen (Ultrazym"", Novo Industries, Kopenhagen), erhalten aus einem A. niger-Stamm, isoliert wurde. Die Erfindung umfaßt auch natürliche oder synthetische Mutanten der Start-Sequenz mit einem ähnlichen oder identischen Hydrophobizitätsprofil, z. B. worin die Codons für die polaren Aminosäuren Lysin (K⁸⁺), Tyrosin (Y⁸") und Arginin (R⁸⁺) durch Codons für andere Aminosäuren mit ähnlichen Ladungen ausgetauscht wurden und die hydrophoben Aminosäuren Alanin (A), Leucin (L) und Threonin (T) durch Codons für andere hydrophobe Aminosäuren ausgetauscht sind. Beispielsweise kann das Codon für das positiv geladene Lysin durch ein Codon für Arginin und umgekehrt ersetzt werden, das Codon für das negativ geladene Tyrosin durch ein Codon für Glutamat oder Aspartat und/oder das Codon für das nicht-polare, hydrophobe Alanin durch irgendeines der Codons für Threonin, Prolin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin und dergl. ersetzt sein. Andere Mutationen sind »stille Mutationen", worin eine oder einige andere Nucleotide, z. B. bis zu etwa 30, durch eine oder mehrere andere Nucleotide ersetzt sind, wobei die neuen Codons die gleiche(n) Aminosäure(n) kodieren.

DNA-Sequenzen der Formel I, welche degeneriert sind, sind, wie die stillen Mutationen, solche, welche innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes derart degeneriert sind, daß eine unbegrenzte Anzahl von Nucleotiden durch andere Nucleotide ersetzt ist, ohne daß die Aminosäuresequenz, für die sie kodieren, geändert ist. Solche degenerierte DNA-Sequenzen können wegen ihrer verschiedenen Restriktionsstellen nützlich sein.

Rekombinante DNA-Moleküle, umfassend eine DNA-Sequenz der Formel I oder ein Derivat davon, sind besonders rekombinante Vektoren, alternativ auch Hybridvektoren genannt, die solche DNA-Sequenzen als Einschübe enthalten. Sie sind zum Klonen in Wirten, wie Bakterien, Pilzen oder tierischen Zellen, verwendbar. Solche Hybridvektoren stammen von irgendeinem Vektor, der in der Gentechnologie verwendbar ist, wie von Phagen, Kosmiden, Plasmiden oder chromosomaler DNA, wie Defivaten von Phage λ, z.B. NM 989, M13mp8 Phagen-DNA (15), linearisiert durch BamHI-Abbau, bakteriellen Plasmiden, z.B. pBR 322, pUN121, pUC18, oder Hefeplasmiden, z. B. Hefe 2μ Plasmid, oder auch chromosomaler DNA, stammend z. B. von Aspergillus,

z. B. A. niger, beispielsweise solchen, die von EP 184438 zugänglich gemacht werden.

Ein Hybridv'ektor gemäß der Erfindung enthält zusätzlich zu der DNA-Sequenz der Formel I oder eines Derivats davon einen Replikationspunkt und gegebenenfalls, in Abhängigkeit von dem Typ des DNA-Derivats, einen Expressionskontrollsequenz, wie eine Beschleuniger-Sequenz, eine stromaufgelegene Aktivierungsstelle, einen Promotor und Start-Sequenzen und/oder Strukturgene, die verschieden sind von den entsprechenden Sequenzen, die von dem vorhandenen A. niger abgeleitet sind.

Solche Enhancer-Sequenzen können abgeleitet werden von der extrachromosomalen, ribosomalen DNA von Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278) oder sind die stromaufgelegenen Aktivierungsstellen vom Säurephosphates PHO5-Gen (EP-Anmeldung Nr. 86111820.6) oder dem PHO5, trp. PHO5-GAPDH-Hybrid (EP-Anm. Nr. 86111 820.6) oder ähnlichen Promotorn. Solche Expressions-Kontrollsequenzen können an das PLI-Strukturgen gebunden sein.

Strukturgene, die mit dem vorhandenen Promotor, Start- und/oder Stopsequenzen verbunden sind, sind außer solchen, die PLI mit oder ohne Introns kodieren, auch homologe andere Pektinlyase-Gene und heterologe Strukturgene, die für eine große Vielzahl von Polypeptiden kodieren, einschließlich glykosylierter Polypeptide, insbesondere von höheren eukaryotischen, insbesondere Säugetier-, wie tierischen und besonders menschlichen Ursprungs, wie Enzyme, welche verwendet werden können, beispielsweise zur Erzeugung von Nahrungsmitteln und zur Durchführung enzymatischer Reaktionen in der Chemie, oder nicht-enzymatischer Polypeptide, welche zur Behandlung von menschlichen oder tierischen Krankheiten¹ oder zur Vorbeugung davon nützlich und wertvoll sind, beispielsweise Hormone, Polypeptide mit immunsteuernden, anti-viralen und Anti-Tumor-Eigenschaften, Antikörper, virale Antigene, Vakzinen bzw. Impfstoffe, Blutgerinnungsfaktoren, Nahrungsmittel und dergi.

Beispiele für solche heterologen Strukturgene sind beispielsweise solche, die kodieren für: Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermale oder insulinähnliche Wachstumsfaktoren, Mastzellen-, Nerven- oder Transformierungswachstumsfaktor, Wachstumshormone, wie Human- oder Rinder-Wachstumshormone, Interleukin, wie lnterleukin-1 oder -2, Humanmakrophagen-Migrationsinhibitorfaktor (MIF), Interferone, wie Human-a-lnterferon, z. B. Interferon-aA, aB, aD oder aF, ß-lnterferon, γ-lnterferon oder ein Hybrid-Interferon, z. B. ein aA-aD- oder ein aB-aD-Hybridferon, Hepatitisvirus-Antigene, wie Hepatitis B-Virus-Oberflächen- oder -Core-Antigen oder Hepatitis A-Virus-Antigen, Plasminogen-Aktivatoren, wie Gewebeplasminogen-Aktivator oder Urokinase, Tumor-Nekrose-Faktor, Somatostatin, Renin, ß-Endorphin, Immunoglobuline,

wie die leichten und/oder schweren Ketten von Immunoglobulin D, E oder G, Immunoglobulin-bindende Faktoren, wie

Immunoglobulin E-Bindungsfaktor, Calcitonin, Humancalcitoftinverwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX oder VIIIc, Eglin, wie Eglin C, Oesulfatohirudin, wie Desulfatohirudin-Variant HV1, HV2 oder PA, oder Human-Superoxid-Dismutase. Bevorzugte Gene sind solche, die kodieren für: menschliches α-Interferon oder Hybridinterferon, menschlichen Plasminogen- Aktivator (t-PA), Hepatitis B-Virus-Oberflächen-Antigen (HBVsAg), Insulinähnlichen Wachstumsfaktor I, Eglin C und Desulfatohirudin, z. B. Variant HVI .,In den Hybridvektoren gemäß vorliegender Erfindung kann der vorliegende Promotor

und/oder die Start- bzw. Signal-Sequenz operabel mit der Polypeptid kodierenden Region verbunden sein, um einewirkungsvolle Expression des Polypeptide zu sichern.

Die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können selektive Marker in Abhängigkeit von dem Wirt, der transformiert,

selektiert und geklont werden soll, enthalten. Irgendein Markergen kann verwendet werden, welches die Selektion der

Transformanten aufgrund der phänotypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind besonders solche,

welche antibiotische Resistenz aufweisen, z. B. gegen Tetracyclin oder Ampicillin, oder, im Falle von auxotrophen Hefemutanten,

Gene, welche die Wirtsläsionen ergänzen. Entsprechende Gene verleihen beispielsweise Resistenz gegenüber dem

antitbiotischen Cycloheximid oder schaffen Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, z. B. dem ura3-, Ieu2-, his3- odertrpi-Gen. Es ist auch möglich, als Marker strukturelle Gene zu verwenden, welche mit einem autonom replizierenden Segmentassoziiert sind, vorausgesetzt, daß der zu transformierende Wirt für das durch den Marker exprimierte Produkt auxotroph ist.

Von besonderer Wichtigkeit sind Markergene, welche A. niger-Wirtsläsionen ergänzen, wie das argB-Gen, das für die Ornithincarbamoyl-Transferase kodiert, z. B. abgeleitet von A. niger oder A. nidulans (EP 184438) oder A. nidulans-DNA- Fragmente, die dem N.crassa pyr4-Gen (26) homolog sind. Bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Hybridvektoren, worin das Strukturgen, insbesondere das

fremde Strukturgen, mit dem Promotor und den Startsequenzen gemäß vorliegender Erfindung wirksam verbunden ist. Solchebevorzugten Hybridvektoren sind z.B. pCG3B11, M13 mp8-PL (Sall-EcoRI) BssHII/BE5, pUBE5, pLHK3, pLHL5 und pLHLT7.

Weitere brauchbare Hybridvektoren sind pPL35-5 (vergl. Beispiele und Figuren). Die DNA der Formel I und deren Derivate einschließlich Fragmente können zum Screenen von DNA-Genbanken oder mRNA für

ähnliche DNAs oder mRNAs verwendet werden.

Die Züchtung der Wirte zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls wird in einem üblichen Nährmedium durchgeführt,

welches mit chemischen Verbindungen ergänzt oder von solchen befreit ist, welche eine negative oder positive Auswahl der

Transformanten, d.h. solchen Wirten, die das gewünschte DNA-Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker enthalten, von

den Nicht-Transformanten, d.h. solchen Wirten, denen das gewünschte DNA-Molekül fehlt, ermöglichen.

Irgendwelche transformierbaren Wirte, die auf diesem Gebiet verwendbar sind, z. B. Bakterien, wie E. coli. Pilze, wie Saccharomycescerevisiae, oder insbesondere Fadenpilze, wie Aspergillus, z.B. A. nidulans, A.oryzae, A.carbonarius, A. awamori und insbesondere A. niger, können eingesetzt werden. Ein bevorzugter Wirt ist A. niger An8, eine neue Mutante, der

das pyrA-Gen fehlt, wie im folgenden beschrieben. Die Transformation der Wirte wird nach üblichen Methoden durchgeführt.

Die DNA-Sequenz, welche für das PL-Expressionssystem kodiert, wird aus Fadenpilzen erhalten, die ein solches System

enthalten, insbesondere aus einer Genbank davon oder auch über die mRNA.

Im folgenden ist die Herstellung des PLI-Expressionssystems detaillierter beschrieben. Eine Genbank kann hergestellt werden, z. B. durch partiellen Abbau von genomischer DNA eines A. niger-Stamms, z. B. N756, mit Sau3AI und Klonen von hochmolekularen DNA-Fragmenten in das E. coli-Plasmid pUN121. Irgendein anderer A. niger-Stamm,

der PLI produziert, kann als Quelle für die Genbank dienen und gleichermaßen können andere geeignete Vektoren als Rezipientenfür die Fragmente verwendet werden.

Um die Genbank für DNA-Sequenzen, die für PLI kodieren, erfolgreich zu screenen, war eine Sequenzbestimmung dieses Enzyms oder von Teilen davon notwendig. PU wurde aus einer handelsüblich erhältlichen Mischung von pektinolytischen Enzymen von A. niger (Ultrazym"", Novo Industries) gereinigt und sequenziert. Der N-Terminus von reifem PLI ergab die Sequenz V₁-G-V-X₄-G-T₆-P-E-G-F-A,

und ein Fragment von PLI, das durch Spalten der PLI mit Bromcyan erhalten wurde, ergab die N-terminale Sequenz V₁₂₉-S-G-V-S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-X₁₄₃-D-I-N-X₁₄₇-E,

worin die Aminosäuren X damals nicht identifiziert worden waren.

Basierend auf jenen Aminosäure-Sequenzen wurde eine Anzahl von DNA-Teilstücken, d. h. Mischungen von DNA-Sequenzen, die für Teile der Aminosäure-Sequenzen kodieren und die entsprechenden degenerierten DNA-Sequenzen, chemisch synthetisiert und zum Screenen verwendet. Solche DNA-Teilstücke sind beispielsweise die Mischungen der Formeln

3'TGR₁ GGR₁ CTR₂ CCR₃ AAR₃ CG5' (2014) (la) oder 3'TGR₁ GGR₁ CTR₂ CCR₂AAR₃ CG5' (2015) (Ib),

worin R₁ für A, C, G oder T steht, R₂ für C oder T steht und R₃ für A oder G steht, oder DNA-Gemisch 2060 der Formel 5' AAR₁ ATR₂ ATR₂ ATR₂ CAR₃ A 3' (2060) (I c)

worin R₁ für A oder T steht, R₂ für A, T oder C steht und R₃ für A oder G steht.

Da die Gesamt-DNA-Sequenz des PLI-Gens im Verlauf der vorstehenden Arbeit aufgeklärt wurde, kann irgendein Teil davon mit

wenigsttens etwa 14bp zum Screenen verwendet werden, was auch das Screenen für mRNA, welche für das PL-System kodiert,einschließt.

Für Screeningzwecke werden die DNA-Teilstücke nach bekannten Methoden unter Verwendung von γ³²-Ρ-ΑΤΡ- und T4-Kinase 5' radioaktiv markiert. Wirt-Mikroorganismen, die die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung als Insert tragen, werden durch Hybridisierung mit dem markierten DNA-Teilstück auf Filterreplikas der Genbank identifiziert.

Zum Anfertigen einer Unterbank können Klone der Genbank, welche ein radioaktives Ansprechen auf das radioaktiv markierte DNA-Teilstück zeigen, das für den N-terminalen Teil der PLI kodiert, isoliert, kultiviert und mit dem zweiten DNA-Teilstück hybridisiert werden, das für die N-terminalen Aminosäuren des CNBr-Fragments kodiert, wie oben beschrieben. Klone, welche eine Hybridisationsreaktion auf eines oder beide DNA-Teilstücke zeigen, werden isoliert und vermehrt. Beispielsweise ergab das Screenen mit DNA-Teilstücken 2014 und 2015 33 bzw. 39 positive Klone. Die 72 Klone wurden vermehrt und die erhaltenen Subgenbanken erneut mit DNA-Teilstücken 2060 gescreent, wodurch drei positive Klone identifiziert werden konnten. Ein Klon wurde selektiert und als E. coli BJ 5183/gCG3B11 bezeichnet. Er enthält Plasm id pCG3B11, wovon eine Teilrestriktionskarte in Fig. 1 gezeigt ist. Das Sau3AI-Fragment von pCG3B11 umfaßt das Spel-Nhel-Fragment, das in Fig. 4 und Formel I gezeigt wird.

Das Plasmid pCG3B11 kann zum Aufbau anderer DNA-Moleküle gemäß der Erfindung durch Anwendung üblicher gentechnologischer Methoden verwendet werden.

Beispielsweise führt die Restriktion von pCG3B11 mit EcoRI und Klonen der beiden Fragmente in Plasmid pUNI 21 zum Plasmid pPL 29-5 (Fig. 2), enthaltend den Promotor, die Start-Sequenz und den Teil des Struktur-PLI-Gens bis zur zentralen EcoRI-Restriktionsstelle in Stellung 649/650, und zu Plasmid pPL35-5 (Fig. 3), enthaltend einen Teil des PLI-Strukturgens, beginnend bei Position 650, und den Terminator. pPL 29-5 enthält weiterhin die flankierenden N-terminalen Sequenzen und pPL35-5 die flankierenden C-terminalen Sequenzen von pCG3B11.

Fragmente der Inserts der Plasmide pPL29-5 und pPL35-5 können für das Sequenzieren durch Restriktion mit geeigneten Enzymen, wie Aha III, Pst I, Ava I, Hind III, EcoR I, Kpn I, CIa I, Nco I. Acc I, Sal I, Pvu I, SaI II, Nhe I, BgI I, EcoR I und EcoR V, erhalten werden. Die Fragmente können subkloniert, z. B. in verschiedene МІЗ-Phagen, vorzugsweise MI3mp8 und MI3mpl8, und sequenziert werden, z. B. unter Verwendung des МІЗ-Kloning- und Sequencing Kit (M 13 Sequencing Kit N.4502, Amersham) unter den Bedingungen, die vom Hersteller (16) angegeben sind. Die ganze Sequenz des 2.7 kb Spel-Nhel-Fragments, enthaltend die vollständige Sequenz vom PLI-Gen, ist in Fig.4 dargestellt. Sie umfaßt 688 Nucleotide der Promotorregion, 1369 Nucleotide des strukturellen Teils des PLI-Gens und 661 Nucleotide der Terminatorregion. Der Sequenz von pPL29-5, entsprechend der Aminosäure-Sequenz des N-Terminus von PU, wie durch Aminosäure-Sequenzanalyse bestimmt (Beispiel 1), gehen 57 Nucleotide voraus, die für das Signalpeptid der Formel

M₁-K-Y-A-A-A-L-T-A^A-A-L-A-A-R-A-A-As₇

kodieren.

Die Aminosäure-Sequenz des N-Terminus des C-terminalen CNBr-Fragments von PU (Beispiel 3) wird nicht kontinuierlich kodiert durch das geklonte DNA-Fragment von pPL35-5 (Nucleotid 1257-1379). Eine Computeruntersuchung auf Sequenzübereinstimmungen von Exon/Intron-Spleißverbindungen sowie auf Intron-interne Sequenzen (E. Boel et al. [18] und S.

M. Mount [19]) führt dazu, die Anwesenheit von vier Introns mit Längen von 65 bp, bzw. 62 bp bzw. 63 bp bzw. 57 bp (Fig.4) zu postulieren.

Ein Phage, der aus Phagen M13mp8 und dem 0,8 kb Sall-EcoRI-Fragment von Plasmid pPL29-5 erhalten wurde, enthaltend 130 Nucleotide des Promoters und des N-terminalen Teils des PLI-Gens, wird mit M13mp8(Sall-EcoRI) bezeichnet und in weiteren Schritten zur Herstellung anderer DNA-Moleküle gemäß der Erfindung verwendet.

Solche anderen DNA-Moleküle gemäß der Erfindung, die Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I enthalten, können, wie in den Fig. 5 bis 9 beschrieben, aufgebaut werden, wobei gewünschtenfalls neue Restriktionsstellen eingeführt werden können,

z. B. eine BssHII-Restriktionsstelle innerhalb der Start-Sequenz des PLI-Gens. Solche DNA-Moleküle sind die Plasmide oder Phagen pUBE5, MBmp8PL(Sall-EcoRI)BssHII/BE5 (Fig.5), pLHK3 (Fig.7), pLHL5, Mi3mp18-PL(Spel-EcoRI) BssHII/AC5 pLHLT7 (Fig. 9), wovon die letzteren drei Plasmide das Strukturgen enthalten, das für Desulfatohirudin kodiert.

Mutanten, die neue Restriktionsstellen enthalten, können beispielsweise in vitro durch gezielte Mutagenese gemäß üblichen

Methoden hergestellt werden (vergl. Review-Artikel von M. J. Zoller und M. Smith, Methods Enzymol. 100,468 [1983], D. Botstein und D. Shortle, Science 229,1193 [1985] oder K. Norris et al., Nucl. Acids Res. 11,5103 [1983]).

Beispielsweise wird eine Mutante der vorliegenden DNA-Sequenzen vom M13mp8PL(Sal-EcoRI)-Phagen abgeleitet, der den Promotor und das Ausscheidungssignalen von PLI enthält. Die Einführung einer neuen BssHII-Restriktionsstelle in die Start- bzw. Signal-Sequenzregion des MI3mp8PL(Sal-EcoRI)-Gens wird unter Verwendung eines chemisch synthetisierten Primär-Oligonucleotids durchgeführt, welches komplementär zu der DNA-Sequenz in Positionen 36-54 ist, die nahe dem C-terminalen Teil der PLI-Signal-Sequenz gelegen ist, mit Ausnahme, daß bei Position 45 eine C/G-Transversion (mutagener Primer) eingeführt wird.

Der mutierte Phage, der die neue BssHII-Stelle trägt, wird als M13mp8PL (sal-EcoRI) BssHII bezeichnet und kann zum Aufbau der Expressionsvektoren für homologe oder heterologe Gene verwendet werden.

In einem entsprechenden Beispiel wird das Desulfatohirudin-Gen von pML310 (EP 168342) in den Phagen M13mpl8-PL(Spel-EcoRI)BssHII/AC5 (Fig.6 bis 9) rekloniert. Ein Hgal/BssHII-Linker wird aufgebaut, um die Hgal-Restriktionsstelle des Desulfatohirudin-Gens von pML301L mit der BssHII-Stelle von MISmpie-PLiSpel-EcoROBssHII/ACS kompatibel zu machen. Die Linker-DNA wird an die gespaltene Phagen-DNA gebunden. Die Phagen-DNA, die das Linkerfragment trägt, wird mit Hindlll aufgetrennt, was zwei Fragmente ergibt. Das 0,7 kb-Fragment, welches die Signal- bzw. Startstruktur von PLI und das Verbindungsfragment enthält, wird isoliert. Ein geeignetes Replikationsplasmid, das eine BamHI-Restriktionsstelle trägt, wie pBR322, wird mit BamHI gespalten. Das zu klonierende Gen wird mit geeigneten Restriktionsenzymen aus der genomischen DNA, Plasmid- oder Phagen-DNA herausgelöst und, falls notwendig, mit den erforderlichen kompatiblen Restriktionsstellen versehen.

Eine andere Methode, um die Restriktionspunkte kompatibel zu machen, ist die in vitro-Mutagenese, wie sie beispielsweise beim Aufbau von pML301L (Fig. 6) durchgeführt wird. Ein Verbindungsstück, enthaltend eine Hgal-Restriktionsstelle, wird hergestellt und an das 5'-terminale Ende des Desulfatohirudin-Gens geknüpft.

Für höhere Expressionsraten kann irgendeine eukaryotische Terminator-Sequenz mit dem Ende des Strukturgens verknüpft werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Terminatorregion des PLI-Gens verwendet. Beispielsweise kann ein Expressionsvektor, der den Terminatorpunkt von PLI enthält, durch Modifikation des oben beschriebenen Verfahrens in der folgenden Weise erhalten werden. Der Promotor und die Ausschneidungs-Start-Sequenzen werden aus dem Plasmid Miampie-PLISpel-EcoRO-BssHII/ACS erhalten. Die Terminatorregion wird aus pPL35-5 erhalten. MISrnpie-PUSpel-EcoRD-BssHII/ACS wird mit BssHII gespalten, und ein BssHII-Hgal-Linker wird angefügt. In einer Modifikation wird Plasmid pPL35-5 mit Pstl gespalten, was zwei Fragmente ergibt, an die wiederum ein geeigneter Linker, der mit dem 3'-Ende des geklonten Gens kompatibel ist, angekoppelt wird. Die »sticky ends" der Pstl-Restriktionsstellen werden durch das Enzym T4-Polymerase aufgefüllt und es wird ein BamHI-Linker zugefügt, der beispielsweise von Biolabs, New England, bezogen werden kann. Das pPL35-5-Plasmid wird mit Nhel gespalten und das sich ergebende O,7kb-Fragment, das die Terminatorregion von PU enthält, wird isoliert. Zur Verbreiterung bzw. Vermehrung kann irgendein Plasmid, das verträgliche Restriktionsstellen besitzt, verwendet werden, z. B. pUCi8. Im Falle von pUC18 wird das Plasmid mit Hindlll und Xbal gespalten. Vier DNA-Fragmente, das M13mp18-PL(Spel-EcoRI)BssHII/AC5-Fгagment, das den BssHII-Hga-l-Linker trägt, das O,7kb-Fragment von pPL35-5, das den BamHI-Linker trägt, Hindlll/Xbal-gespaltenes pUC18 und das Hgal-BamHI-Fragment des Desulfatohirudin-Gens, werden ligiert, um pLHL7 zu bilden (Fig.9).

Bakterien werden durch eine übliche Methode transformiert und die Transformanten werden aufgrund ihrer Resistenz, z. B.. gegenüber Tetracyclin, identifiziert.

Insbesondere werden die beschriebenen Expressionsvektoren in geeigneten E.coli-Wirtsstämmen, wie HB101, vermehrt, transformiert (10) und nach auf diesem Gebiet üblichen Methoden selektiert. Die vermehrte Plasmid-DNA wird aus den Bakterien durch übliche Methoden, insbesondere wie von Birnboim & DoIy beschrieben (17), isoliert. In ähnlicher Weise können andere Plasmide mit anderen homologen oder heterologen Genen aufgebaut werden. Die in vitro-Synthese ist besonders anwendbar zur Herstellung von kleineren Fragmenten des PL-Expressionssystems, z. B. der DNA-Sequenzen, welche für den Promotor oder besonders die Start-Sequenz von PLI oder Mutanten davon kodieren. DNA-Moleküle, gemäß der Erfindung hergestellt, die den PLI-Promotor und gegebenenfalls die PLI-Start-Sequenz, das PLI-Strukturgen, irgendein anderes heterologes Strukturgen und/oder den PLI-Terminator enthalten, können auch verwendet werden, um Fadenpilze, wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium, z. B. A.niedulans, A.oryzae, A.carbonarius und insbesondere A.niger, zu transformieren.

Um die Selektion der transformierten von den nicht-transformierten Pilzen zu ermöglichen, tragen die DNA-Moleküle der Erfindung einen Selektionsmarker oder, alternativ, werden die Pilze mit einem zweiten Vektor, dereinen solchen Marker enthält, kotransformiert. Wie in anderen Systemen ist ein solcher Selektionsmarker ein exprimierbares Strukturgen, dessen exprimiertes Polypeptid (ein Enzym) Resistenz gegen Verbindungen verleiht, die für den Transformanten toxisch sind, oder welches das Enzymsystem eines Mutanten, dem ein solches wesentliches Polypeptid fehlt, ergänzt. Solche Markergene sind beispielsweise die bekannten qa-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS- oder argB-Gene.

Innerhalb des Bereichs der Erfindung wurde ein neues Markergen mit dem Namen pyrA aus der Genbank rung von A.niger isoliert, das mit dem pyrG von A.nidulans und pyr4 von N.crassa verwandt ist und eine ähnliche Funktion hat, nämlich die Erzeugung des Enzyms Orotidin-ö'-phosphat-decarboxylase. Dieses Enzym katalysiert die Decarboxylierung von Orotidin-5'-phosphat zu Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch von Fluororotsäure zum toxischen Fluoro-uridin. Ein E.coli-Klon, enthaltend das pyrA-Gen, wurde durch Hybridisierung mit dem 1,1 kb Hindlll-Fragment von pDJB2 (26), enthaltend einen Teil des pyr4-Gens, identifiziert, jedoch kann DNA von irgendeinem anderen руг-Gen, das Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase kodiert, verwendet werden. Auseinem positiven Klon mit der Bezeichnung E.coli B75183/pCG59D7 wurde das Plasmid pCG59D7, welches das parA-Gen enthält, isoliert und zur Kotransformation einer A.niger pyrA"-Mutante verwendet. Einer solchen pyrA"-Mutante fehlt das Orotidin-ö'-phosphat-decarboxylase-Gen, und sie ist daher nicht in der Lage, das entsprechende Enzym zu produzieren. Eine solche Mutante wurde durch Behandlung von Konidiosporen von A.niger N756 unter mutagener UV-Bestrahlung hergestellt und Kolonien, welche in Anwesenheit von Fluor-Orotsäure und Uridin überleben, werden ausgewählt. Kolonien, welche in Anwesenheit von Fluororotsäure und in Abwesenheit von Uridin überleben, werden entfernt. Die verbleibenden, Uridin benötigenden Mutanten gehören je nach ihrer Fähigkeit, transformiert zu werden, zu zwei ergänzenden Gruppen pyrA und pyrB, die durch die Mutanten An8 bzw. An10 repräsentiert werden. Sie werden in Form ihrer Protoplasten unter transformierenden Bedingungen mit dem pyrA enthaltenden Plasmid pCG59D7 behandelt. Es wurde gefunden, daß nur die An8-Kolonien transformiert wurden und das pyrA-Gen enthielten, wie dies durch die hybridisierende Fähigkeit von deren abgebauter DNA mit DNA von pUN121 gezeigt wurde.

Die Erfindung betrifft auch das Selektionsmarker-Plasmid pCG59D7, einen Wirt, der dieses enthält und die pyrA-Mutante A.niger An8 und Verfahren zu deren Herstellung.

Die Erfindung betrifft weiterhin Wirte, die mit den Hybridvektoren der Erfindung transformiert sind, und Methoden zu ihrer Herstellung. Solche Transformanten sind beispielsweise Bakterien, wie E.coli, oder Fadenpilze, wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium, und insbesondere A.nidulans, A.oryzae, A.carbonarius oder vorzugsweise A.niger, z. B. A.niger An8. Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Herstellung solcher Transformanten, umfassend die Behandlung eines Wirts unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül, insbesondere einem Hybridvektor gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit einem Selektionsmarkergen und Selektieren der Transformanten. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der rekombinanten DNAs oder eines Derivats davon zur Herstellung von Hybridvektoren, welche nützliche Polypeptide, z.B. PLI, Desulfatohirudin und dergl., exprimieren.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Methode zur Herstellung von Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hybridvektor der Erfindung in einem geeigneten Wirt exprimiert und das Polypeptid durch übliche Methoden isoliert wird. Diese Methode umfaßt die Überproduktion von PLI in Aspergillus-Arten durch Züchtung eines Aspergillus-Wirts, der mit einem Expressionshybrid-Vektor für die Expression und Sekretion von PLI transformiert wurde, und Sammeln von PLI aus dem Nährmedium.

Die Erfindung soll anhand von Figuren in Beispielen näher erläutert werden.

Fig. 1: zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pCG3B11, enthaltend ein Sau3AI-Fragment des A.niger-Stammes N756; Fig. 2: zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pPI29-5, enthaltend das N-terminale EcoRI-Fragment der DNA der Formel I; Fig. 3: zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pPI35-5, enthaltend das C-terminale EcoRI-Fragment der DNA der Formel I; Fig.4: zeigt die DNA der Formel (I) mit Angaben einiger Restriktionsstellen und die Start- und Struktur-Aminosäure-Sequenzen

von PLI; Fig. 5: zeigt den Aufbau von pUBES aus MISmpe-PLtSall-EcoRD-BssHII/BES und pUN121. pUBE5 enthält einen Teil des PLI-

Promotors, die Start-Sequenz mit dem BssHII-Restriktionspunkt und einen Teil des PLI-Strukturgens; Fig. 6: zeigt den Aufbau von pML31 OL, enthaltend das Desulfatohirudin-Gen; Fig. 7: zeigt den Aufbau von ρ LH КЗ, enthaltend einen Teil des PLI-Promotors, die Start-Sequenz mit der BssHII-Restriktionsstelle,

den Linker BssHII-Hgal und das Desulfatohirudin-Gen; Fig.8: zeigt den Aufbau von pLHL5, enthaltend den PLI-Promotor, die Start-Sequenz mit der BssHII-Restriktionsstelle und das

Desulfatohirudin-Gen; und Fig.9: zeigt den Aufbau von pLHLT7, enthaltend den PLI-Promotox, die Start-Sequenz mit der BssHII-Restriktionsstelle, das

Desulfatohirudin-Gen und den PLI-Terminator. Die in den Anmeldeunterlagen angeführten Literaturstellen sind am Ende der Unterlagen in einem Literaturverzeichnis

zusammengefaßt.

In den Beispielen, die zur Erläuterung der Erfindung dienen, sie jedoch in keiner Weise beschränken sollen, haben die Abkürzungen folgende Bedeutungen:

bp	Basenpaare
BSA	Rinderserumalbumin
cpm	Impulse pro Minute (radioaktiver Zerfall)
dATP	2'-Desoxyadenosin-triphosphat
dCTP	2'-Desoxycytidin-triphosphat
dGTP	2'-Desoxyguanosin-triphosphat
dTTP	2'-Desoxythymidin-triphosphat
dNTP	Mischung von dATP, dCTP, dGTP und dTTP
CIAP	alkalische Phosphatase aus Kalbsdärmen
DNA	Desoxy ribonucleinsäure
DTT	1,4-Dithiothreit
EDTA	Ethylendiamin-tetraessigsäure-dinatriumsalz
h	Stunden
IPTG	Isopropyl-ß-D-thio-galactopyranosid
kb	Kilobasen
min	Minuten
PL	Pektinlyase 1
PTH	Phenylthiohydantoin
RF-DNA	Doppelstrang replikative Form von DNA
RNA	Ribonucleinsäure
rpm	Umdrehungen pro Minute
SDS	Natriumdodecylsulfat
SS	einzelstrangig
RT	Raumtemperatur
Tris	Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
tRNA	Transfer-RNA
U	Einheiten
M9	Mikrogramm
vol	Volumen
X-GAL	5-Brom-4-chlor-3-indonyl-ß-galactosid.

Puffer, Medien, Reagentien

ss-Denhardt: 0,02% Ficoll (Sigma), 0,02% Polyvinylpyrrolidon (Sigma), 0,02% BSA (Sigma), 100цд/тІ denaturierte

Lachsspermen-DNA (Sigma) EcoRI-Puffer: 0,01 M Tris-HCI pH7,5 0,1 M NaCI 0,01 M MgCI₂ 1 mM 2-Mercaptoethanol Hgal-Puffer: 5OmM NaCI, 1OmM MgCI₂,1 mM DTT, 100цд/тІ BSA, 6mM Tris-HCI pH7,4 IPTG: 10OmM Isopropyl-ß-D-thio-galactopyranosid (23,8mg/ml in H₂O) — unmittelbar vor Verwendung herzustellen LB-Medium: 1 % Bacto-trypton (Difco), 0,5% Bacto-Hefeextrakt (Difco), 17OmM NaCI, eingestellt auf pH7,5 mit NaOH Verbindungspuffer: 2OmM Tris-HCI, 1OmM MgCI₂,1OmM Dithioerythrit, 0,6mM ATP, pH7,6 TBE-Puffer: 11 enthält 10,8g Tris, 5,5g Borsäure, 4ml 0,5M EDTA (pH 8,0) TE-Puffer: 1OmM Tris-HCI (pH7,5), 1 mM EDTA niedriger TE-Puffer: 1OmM Tris-HCI (pH7,5), 0,1 mM EDTA Topagar: pro Liter 10g Bacto-trypton, 8g NaCI, 8g Agar

2xTY-Medium: pro Liter 16g Bacto-trypton, 10g Hefeextrakt, 5g NaCI

X-GAL: 2%(5-Brom-4-chlor-3-indonyl-ß-galactosid)in Dimethylformamid — unmittelbar vor Verwendung herzustellen

SOC-Medium: 2%Bacto-trypton (Gibco),0,5%Hefeextrakt (Gibco), 1OmM NaCI,2,5mM KCI, 1OmM MgCI₂,5mM MgSO₄,2OmM Glukose

Kinase-Puffer: 5OmM Tris-HCI, 1OmM MgCI₂,5mM DDT (pH7,5)

X-gal-Platten: 0,002% X-GaI, 0,07mM IPTG

NET: 0,15M NaCI, 0,015MTris.HCI (pH7,5), 1 mM EDTA

Minimalmedium für E.coli: 0,6% Na₂HPO₄,0,1 % NH₄CI, 0,05% NaCI, 1 mM MgSO₄,0,01 mM CaCI₂,1 mM Thiamin-HCI, 0,2% Glukose

Minimalmedium für A.niger: 1 Liter enthält 6g NaNO₃,0,52g KCI, 0,52 g MgSO₄ χ 7H₂0,1,52 g KH₂PO₄, Spuren an Zn, Fe, 10g Glukose, eingestellt auf pH 6,5 mit NaOH

Komplettmedium für A.niger: Mycophil-Agar (BBL)

PCT: 25% Polyethylenglykbl 6000 (Merck, Darmstadt) in 1OmM Tris.HCI (pH7,5), 5OmM CaCI₂ Sporulationsmedium: 10g/l Phytonpepton, 10g/l Glukose, 10g/l Agar

SSC: 0.15M NaCI, 0,015M Natriumeitrat.

Für die Platten werden alle Medien durch Zugabe von 1,5% Bacto-Agar (Difco) verfestigt.

Die folgenden Stamme werden verwendet

E.coli Stamm HB101: F", hsdS20 (r~_Bm-B), recA13, ara14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20(str^R), xyl-5, mtl-1, supE44, λ" (Maniatis et

E.coli Stamm BJ5183: F", endA, sbcB", recBC, galK, met", str^R, thi~\ bioT, hsdRir*, nV), λ (Hanahan [10]) E.coli Stamm JM101: supE, thi, A(lac-proAB), (F', traD36, proAB, lac19ZAM15) (Yanish-Perron et al [25]) Aspergillus niger Stamm N756: Der A.niger Stamm N756 wurde ausgewählt wegen der hohen Produktion von pektinolytischen Komplexenzymen.

Die folgenden Vektoren werden verwendet M13mp-Phage

Die M13mp8,9,18,19-Vektoren (28) sind Derivate des Einzelstrang-DNA-Bakteriographen M13 und werden benutzt, um die DNA-Sequenzierung zu erleichtern, indem das Klonen der DNA-Fragmente an einer anpassungsfähigen Polylinkerstelle und das Klonen des gleichen Restriktionsfragments in beiden möglichen Richtungen ermöglicht wird. Sequenzen, die in diese Vektoren geklont sind, können leicht als Vorlage für sequenzierende Reaktionen oder die Produktion von Einzelstrang-Teilstücken unter Verwendung eines Standard-Oligodesoxyribonucleotid-Primers und des Klenow-Fragments von E.coli DNA-Polymerase I verwendet werden. Die Vektor-DNA trägt den E.coli lac-Operon-Promotor und die genetische Information der ersten 145 Aminosäuren der ß-Galactosidase. Die Polyverbindungssequenzen, die mehrere Restriktionsstellen enthalten, werden in die lacZ-Sequenz eingeschoben. Die Polylinkersequenz behält den lacZ-Ableserahmen und der Vektor ergibt eine allele Komplementation eines LacZa-Wirtsstamms und gibt blaue Plaques auf Platten, die IPTG und X-gal enthalten. Rekombinante Phagen, welche Inserts enthalten, die den Ableserahmen zerstören oder anderweitig mit der Expression des lacZa-Peptids interferieren, werden als farblose Plaques gefunden.

pUC18-Plasmid

Das pUC18-Plasmid (28) kann zum Klonen der DNA-Sequenzen in der lacZa-Region verwendet werden und liefert den Nachweis für Transformanten, welche rekombinante Plasmide auf Basis ihres Lac-Phänotyps enthalten. Die Bakterien, welche die Plasm ide aufgenommen haben, ohne daß sie eingefügt wurden, ergeben blaue Kolonien auf Indikatorplatten (Platten mit X-gal), während solche, welche rekombinante Plasmide aufgenommen haben, weiße Kolonien ergeben. Ptasmid pUC18 enthält bestimmte Klonierungsstellen in der lacZa-Region, komplementär zu denen des M13mp18-Phagen. Das Plasmid trägt ein Gen für amp",

pML310-Plasmid

pML310 ist in der europäischen Patentanmeldung 0168342 beschrieben, pML310 wird durch amp", den trp-Promoter und ein Gen, das für Desulfatohirudin kodiert, einen Thrombin-Inhibitor, der in der Natur in Blutegeln vorkommt, charakterisiert.

pUN121-Plasmid

Plasmid pUN121 (Nilsson et al. [9]) kann als klonierender Vektor verwendet werden, der eine positive Selektion von Transformanten erlaubt, die Plasmide mit DNA-Einschüben aufnehmen. Das Plasmid enthält das cl-Gen des Bakteriophagen lambda und dastet-Gen. Bakterien, die pUN121 aufgenommen haben, sindfürTetracyclin empfindlich, da dastet-Gen von dem rechten Promotor des Bakteriophagen lambda transkribiert wird, und dieser Promotor kann durch den cl-kodierten Repressor unterdrückt werden. Der Einschub der DNA-Fragmente in eine der Restriktionsstellen des cl-Gens inaktiviert das Repressorgen und liefert Tetracyclin-resistente Transformanten. Außerdem hat das Plasmid pUN121 ein funktionelles amp-Gen, so daß eine Vermehrung der Plasmid-DNA unter selektiven Bedingungen durchgeführt werden kann.

pBR322-Plasmid

Das Plasmid pBR322 trägt Gene für die Resistenz gegenüber den Antibiotika Ampicillin lamp") und Tetracyclin (tet^R). Das Plasmid trägt mehrere günstige Klonierungsstellen, wovon einige entweder in dem amp- oder tet-Gen lokalisiert sind, so daß der Einschub von geklönter DNA zu antibiotisch empfindlichen Bakterien führt.

pDJB2-Plasmid

Dieses Plasmid wurde von Bailance und Turner beschrieben (26).

Beispiel 1 Isolierung und Charakterisierung von Pektinlyase I Beispiel 1.1

Aminosäure-Sequenzbestimmung des N-terminalen Abschnitts der Pektinlyase I Pektinlyase I wird gereinigt von Ultrazym"" (ein Gemisch von pektinolytischen Enzymen, erhalten von A.niger, Novo Industries, Kopenhagen) in Analogie zu der von F. E. A. van Houdenhoven (1) beschriebenen Methode. 2 mg Pektinlyase I werden gegen mehrere Liter destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Das Protein wird in 1,5mИ 00mM NaHCO₃, pH 10,0 gelöst und 3 h bei Raumtemperatur gehalten. Diese Behandlung verursacht die Erhöhung der Anzahl der Stufen, die zuverlässig durch die automatische Edman-Abbaumethode (2) sequenziert werden können. Nach der alkalischen Behandlung wird das Protein gegen 11 destilliertes Wasser, 1 % Ameisensäure und anschließend destilliertes Wasser dialysiert. Der automatische Edman-Abbau wird in einem Beckman-spinning-cupsequenator, Modell 890C, durchgeführt. Das intakte, reduzierte und carboxymethylierte Protein wird unter Verwendung eines Quadrol Einzelspaltungsprogramms (Modifikation des Beckman-Programms 072172 C) abgebaut Der Abbau des Peptide wird unter Verwendung eines Dimethylbenzylamin-Einzel-Spaltungsprogramms (Beckman-Programm 082773) oder nach dem Programm von Hunkapiller und Hood durchgeführt. Um das Auswaschen des Peptide zu verhindern, werden 2,5 mg Dorsch-Parvalbumin als Träger verwendet (3). Pheny Ithiohydantoin-Derivate der Aminosäuren werden durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie gemäß der Methode von Frank und Strubert (4) identifiziert. Die folgende, N-terminale Aminosäure-Sequenz wird für die Pektinlyase I bestimmt:

V-G-V-Xt-G-T-P-E-G-F-A Aminosäure X₄ ist sehr wahrscheinlich Serin, jedoch wurde seine Anwesenheit nicht zweifelsfrei festgestellt.

Beispiel 1.2 Herstellung von Cyanbromid-Fragmenten von Pektinlyase I

Die Reduktion und S-Carboxymethylierung von Pektinlyase I wird nach C rest field et al. (5) durchgeführt. 3g Harnstoff (ultrarein) werden in 5ml destilliertem Wasser gelöst und mit 0,5g eines Mischbett-Ionenaustauschers (Biorad Ag 50 1-X8) während 1 h gerührt. Nach Entfernen der lonenaustauscher-Kügelchen werden 10mg EDTA und 200mg Tris zu 4ml der Harnstofflösung gegeben und das pH wird mit HCI auf 8,5 eingestellt. Die Lösung wird auf ein Endvolumen von 5 ml in einem Fläschchen mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Dann werden 5 bis 20mg Pektinlyase I, die gemäß F.E. A. van Houdenhoven (1) gereinigt wird, zugesetzt, und das Fläschchen wird unter einem Stickstoffmantel gehalten.

Schließlich werden 33μΙ ß-Mercaptoethanol zugesetzt und die Reduktion 4h bei Raumtemperatur unter einem Stickstoffmantel fortgesetzt. 0,33ml einer frisch hergestellten Lösung (0,268g Jodessigsäure in 1 ml 1 N NaOH) werden unter Stickstoff zu dem Reaktionsgemisch gegeben und das Gemisch 15min im Dunkeln bei Raumtemperatur gehalten.

Die Reaktion wird durch Zugabe von ß-Mercaptoethanol gestoppt. Anschließend wird das carboxymethylierte Protein auf eine Sephadex G-25-Gelfiltrationssäule (100ml Bettvolumen) aufgebracht, welche mit einer Aluminiumfolie umwickelt ist, und mit 0,5% Ameisensäure eluiert. Die Proteinfraktionen werden vereinigt und lyophilisiert.

Die carboxymethylierte Pektinlyase I (2-10mg) wird in 70%iger Ameisensäure gelöst, und festes Bromcyan wird in dem etwa lOOfachen molaren Überschuß zu Methionin gegeben, wovon 1 Rest pro Pektinlyase f auftritt. Das Reaktionsgemisch wird kontinuierlich während 24h bei Raumtemperatur in einem geschlossenen Reaktionsgefäß gerührt. Proben von 5μΙ werden in regelmäßigen Zeitabständen abgezogen und auf 15% SDS-PAGE analysiert, um das Ausmaß der Proteinspaltung zu kontrollieren. Nach 24h wird Wasser zugesetzt und das Präparat teilweise durch Spülung mit Stickstoff eingedampft. Dieser Schritt wird zur Entfernung der Ameisensäure wiederholt.

Durch die SDS-PAGE-Analyse werden neben etwas restlicher Pektinlyase I zwei Bromcyan-Peptide, CBI und CBII, mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 16,5kD und 3OkD identifiziert. Die Reinigung dieser Fragmente wird durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung einer Sephacryl-S200-Säule (Länge 190 cm, Durchmesser 1 cm), die in 2OmM Natriumphosphat-Puffer, pH6,0, äquilibriert ist, 10OmM NaCI, 4M Harnstoff und 1 % (Vol/Vol) ß-Mercaptoethanol durchgeführt. Das CB Il-Fragment erscheint in zwei Peaks, wobei ein Peak sogar vor dem restlichen, intakten Protein eluiert wird, welches daher ein Aggregat darstellen muß, und ein anderer Peak zwischen dem intakten Protein und dem kleinen CBI-Fragment.

Beispiel 1.3 Aminosäuresequenz-Bestimmung des N-terminalen Abschnitts von CBII der Pektinlyase I

200pg des gereinigten, nicht-aggregierten CBII-Fragments von Beispiel 1.2 werden für den automatischen Edman-Abbau (2) unter Verwendung eines Beckman-spinningcup-sequenators eingesetzt. Die Umwandlung in die PTH-Aminosäuren wird nach Eindampfen der Fraktionen und Zugabe von 200μΙ 2 N HCI in Methanol zum Rückstand während 15min bei 65°C durchgeführt. Die Lösung wird dann erneut eingedampft und der Rückstand in 50plTHF/CH₃CN (1/1) aufgenommen. Die PTH-Aminosäuren werden durch HPLC unter Verwendung einer Zorbax CN^R-Säule (DuPont) nach R. Knecht et al. (6) identifiziert. Die N-terminale Aminosäure-Sequenz von CBII ist die folgende:

V-S-G-V-S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-X₁₆-D-I-N-X₁₈-E Xi₅ und Xi9 sind Aminosäurereste, die nicht identifiziert wurden.

Beispiel Erstellung einer Genbank von Aspergillus niger Beispiel 2.1 Isolierung von hochmolekularer DNA aus Aspergillus niger

Die Isolierung von hochmolekularer A. niger-DNA wird nach Yelton et al. (7) durchgeführt. Konidiosporen eines A. niger Stamms N756 werden in 200ml Minimalmedium, enthaltend 0,1% Arginin, beimpft und in 500ml Kolben mit einem seitlichen Einstich bei 28⁰C auf einer rotierenden Schüttelmaschine während 2 bis 3 Tagen geschüttelt. Das Myzel wird durch Filtrieren geerntet, mit kaltem, sterilem Wasser gewaschen, gefroren und in flüssigem Stickstoff pulverisiert. Die Zellen werden rasch in 20 ml 50 mM EDTA, pH 8,5,0,2% SDS und 20 μΙ Diethylpyrocarbonat suspendiert und durch kräftiges Schütteln während 1 min bei Raumtemperatur lysiert. Das Lysat wird 15min auf 68°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und 15min bei 12000g bei RT zentrifugiert. 16ml des Überstands werden in ein neues Rohr überführt und nach Zugabe von 1 ml 8M Kaliumacetat, pH4,2,1 h auf Eis belassen. Der Niederschlag wird bei 25000g während 15min bei 4°C zentrifugiert. 12ml dieses Überstands werden gewonnen, und die Nucleinsäuren werden mit 12 ml Isopropanol ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren während 1,5 min bei 12000g pelletiert und die Kügelchen werden erneut in 2 ml TE suspendiert, enthaltend 10цд/тІ RNAseA (Boehringer, Mannheim). Die DNA-Fragmente werden mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Ethanol.wie von Maniatis et al. (8) auf den Seiten 458-459 und 461-462 beschrieben,gefällt

Beispiel 2.2

Klonen von hochmolekularen DNA-Fragmenten aus Aspergillus niger in pUN 121 Die hochmolekulare DNA von Beispiel 2.1 (ЮОцд) wird durch Zentrifugieren gefällt und das Kügelchen wird erneut in 750 μΙ Puffer, bestehend aus Tris-HCI 6mMol/l, NaCI 50mMol/l, MgCI₂ бтМоІ/І, рН7,5, suspendiert. Partielle Verdauungen werden während 60min bei 37⁰C mit Sau3 Al durchgeführt, wobei die Konzentrationen im Bereich von 0,25-0,01 U/pg liegen. Die Reaktionen werden durch Zugabe von EDTA zu den Endkonzentrationen von 2OmM beendet.

Die teilweise abgebauten DNA-Fragmente werden auf einem 0,45% Agarosegel getrennt. Lambda DNA, die mit Hind III abgebaut ist, wird als Marker verwendet, um die Größe der teilweise abgebauten DNA-Fragmente zu bestimmen. Die Gelregion, welche die gewünschten Fragmente im Bereich von 15kb bis 20 kb enthält, wird ausgeschnitten und in das Probengefäß eines ISCO elektrophoretischen Konzentrator (ISCC GmbH) überführt, mit 0,1 TBE bedeckt und 80min bei 1 Watt elektroeluiert. Die DNA-Fragmente werden mit Chlorform/Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.

4цд der teilweise verdauten DNA-Fragmente werden erneut in Wasser suspendiert und 15h bei 15°Can 1 цд pUN121 Plasmid DNA (Nilsson et aL [9]), linearisiert mit BcI I, in einem Gesamtvolumen von 106μΙ ügationspuffer mit 6U T4 DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) ligiert. 10 μΙ aliquote dieses Gemisches werden zu 210 μΙ kompetenten E. coli BJ 5183-Zellen gegeben, welche zur Transformation, wie von Hanahan (10) beschrieben, hergestellt worden waren. Die Zellen werden 30 min auf Eis gehalten und 90 see auf 42 °C erwärmt, 2 min auf Eis zu rückgestellt, 800plSOC-Medium werden zugesetzt und die Zellen werden 1 h bei 37"C inkubiert. Die Zellen werden auf 10cm-Agarplatten ausgestrichen, die LB-Medium, ergänzt mit 8 mg/l Tetracyclin (Sigma), enthalten. Die Platten werden 16hrs bei 37⁰C inkubiert. Etwa 6000 transformierte Kolonien werden erhalten, die durch ihre Tetracyclin-Resistenz charakterisiert sind. Die Effizienz beträgt etwa 12000 bis 20000 Tetracyclin-resistenter Kolonien pro цд pU N121 DNA.

Die Plasmid-Analyse von 11 willkürlich ausgewählten, rekombinanten Klonen zeigt einen mittleren DNA-lnsert von 10 kb. Um das Genom von A. niger (4,5 χ 10⁷bp) in der Genbank fast 4fach darzustellen, werden 15360 Tetracyclin-resistente Kolonien aufgenommen und über Nacht in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten in LB-Medium, ergänzt mit 8mg/l Tetracyclin, gezüchtet. Nach der Inkubation wird Glycerin auf 50% Vol/Vol zugesetzt, und die Mikrotiterplatten werden bei -70⁰C gelagert.

Beispiel 3 Screening der genomischen Karte von A. niger auf PLI verwandte Nucleinsäuren Beispiel 3.1 Herstellung von Rlterreplikas der Genbank

Zur Isolierung des Pektinlyasel-Gens aus der DNA-Bank, die gemäß Beispiel 2.2 erhalten wurde, werden Filterreplikas von den 15360 ausgewählten, transformierten E. coli BJ 5183-Zellen nach der von Gergen et al. (11) beschriebenen Methode gemacht. Die Zellen werden aus den Mikrotiterplatten auf Agarplatten, die mit 8 mg/l Tetracyclin ergänzt wurden, mittels der Stempeltechnik überführt und über Nacht bei 37⁰C gezüchtet. Wie üblich geschnittene Whatman 541 Filterpapiere (114 χ 175mm/192 Klone) werden auf die tColonien gegeben. Nach 2h bei 37°C werden die Riter auf LB-Platten, welche 250mg/ml Chloramphenicol (Sigma, St. Louis, USA) enthalten, überführt und über Nacht bei 37⁰C bebrütet. Die Filter werden zweimal in 0,5M NaOH, zweimal in 0,5M Tris-HCI, pH7,4, und zweimal in SSC gewaschen und luftgetrocknet. Die Filterreplikas können für mehrere Hybridisierungsversuche verwendet werden, wobei vorher jedesmal die oben erwähnten Waschstufen durchgeführt werden.

Beispiel 3.2

Synthese von Oligonucleotid-Mischungen

Die Oligonucleotidezum Screenen der DNA-Bank A. niger, erhalten gemäß Beispiel 2.2, werden gemäß der Aminosäure-Sequenz, bestimmt in den Beispielen 1.1 und 1.3, synthetisiert unter Verwendung der Phosphoramidit-Methode (M.H.Caruthers [12]) mit einem angewandten Biosystem (Modell 380B)-Oligonucleotid-Synthesizer.

Synthese eines Oligonucleotids, das für den N-terminalen Abschnitt der Pektinlyase I von Aspergillus niger kodiert Das Oligonucieotid, das für den N-terminalen Abschnitt des Pektinlyase I-Proteins kodiert, wird in bezug auf seine Aminosäure-Zusammensetzung, wie in Beispiel 1.1 bestimmt, synthetisiert. Aufgrund der genetischen Degeneration sind 256 Oligonucleotide erforderlich, um alle Möglichkeiten zu erfassen.

Zwei getrennte Mischungen von Oligonucleotiden werden chemisch synthetisiert, da es aus technischen Gründen erforderlich ist, die Anzahl der Nucleotide in dem Genisch zu vermindern. Beide enthalten 128 verschiedene Oligonucleotide, wobei jedes

ein komplementärer Strang derjenigen Stränge ist, die für die Aminosäure-Sequenz Tr-P-E-G-F-A₁₁ kodieren. Im folgenden werden sie als Mischungen 2014 und 2015 bezeichnet und bestehen aus Oligonucleotiden wie folgt:

Mischung 2014 3'TGR₁ GGR₁ CTR₂CCR₃AAr₃CGS'

Mischung 2015 3'TGR, GGR₁ CTR₂ CCR₂ AAR₃ CG 5'

worin R₁ für A, C, G oder T steht, R₂ für C oder T steht und R₃ für A oder G steht.

Beispiel 3.2.2

Synthese eines Ollgonucleotids, das den N-tnrminalen Abschnitt des C-terminalen Fragments des CNBr-zersetzten Pektinlyasel-Proteins kodiert

Das Oligonucleotid, das für den N-terminalen Abschnitt des C-terminalen Fragments des CNBr-zersetzten Pektinlyasel-Proteins kodiert, wird in bezug auf seine Aminosäure-Zusammensetzung synthetisiert, wie in Beispiel 1.3 angegeben. Ein Gemisch von 108 Oligonucleotiderrwird synthetisiert, das aus komplementären Strängen zu denjenigen Strängen besteht, die für die Aminosäure- Sequenz N₁₃₄-I-I-I-Q₁₃S kodieren, und das aus Oligonucleotiden wie folgt zusammengesetzt ist; Gemisch 2060 5'AAR₁ATR₂ATRjATR₂CAR₃AS' worin R₁ = C oder T, R₂ = A, T oder C und R₃ *= A oder G.

Beispiel 3.2.3

³²P-Markierung der Oligonucleotid-Mischungen

67 pMol der jeweiligen Oligonucleotid-Mischungen 2014,2015 und 2060 der Beispiele 3.2.1 und 3.2.2 werden 5'-markiert unter Verwendung von 5OpMoI [V³²P]ATP (Amersham, Buckinghamshire, England 5000Ci/mMol). Die Bebrütung wird bei 37⁰C mit 150 Einheiten T4 Polynucleotidkinase (New ЕЛ9^|ап(1 Nuclear) in 500μΙ Kinasepuffer durchgeführt. Die Bindungsreaktion des radioaktiv markierten ATP an die Oligonucleotide wird ermittelt, indem man aliquote Anteile der Reaktionsmischungen an 20% Polyacrylamidgel laufen läßt und anschließend autoradiographiert.

Beispiel 3.3

Screeing der Genbank mit radioaktiv markierten Oligonucleotid-Gemischen 2014 und 2015 Das Screening der Genbank wurde durch die Hybridisierung mit den radioaktiv markierten Oligonucleotid-Mischungen 2014 und 2015 des Beispiels 3.2.1 durchgeführt. Partien von^-20 Filterreplikas der Genbank (Beispiel 3.1) werden in 6x NET befeuchtet und in 200ml 6x NET, 1 χ ss- Denhardt, 0,1 % SDS bei 49,3^eC während 4h vorhybridisiert. Dann werden 67 pMol der radioaktiv markierten Oligonucleotid-Mischung 2014 zugesetzt und die Hybridisierungen über Nacht bei 49,3⁰C durchgeführt. Das gleiche Verfahren wird unter Verwendung der radioaktiv markierten Oligonucleotid-Mischung 2015 durchgeführt. Die Filter werden zweimal während 5 min in 2 x SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur, zweimal 1 h lang in 2x SSC, 0,1 % SDS bei 49,3°C und einmal während 2 h in 0,2x SSC, 0,5% SDS bei 49,3⁰C gewaschen. Die Filter werden luftgetrocknet und 3 Tage unter Verwendung von KODAK X-omat S0282-Filmen autoradiographiert.

Mit der Oligonucleotid-Mischung 2014 werden 33 Klone und mit der Oligonucleotid-Mischung 2015 werden 39 Klone gefunden, welche eine ziemlich starke Hybridisationsantwort geben. Um eine Subbank zu erstellen, werden die 72 Klone in einer neuen Mikrotiter-Platte gezüchtet und auf Whatman 541 Filter gemäß Beispiel 3.1 übertragen. Zwei Filterreplikas der Subbank werden mit beiden Teilstücken individuell hybridisiert, gewaschen und autoradiographiert. Mit der Oligonucleotid-Mischung 2014 hybridisieren nur die Klone, welche durch Hybridisierung mit der Oligonucleotid-Mischung 2014 erhalten wurden. In gleicher Weise hybridisieren mit der Oligonucleotid-Mischung 2015 nur die Klone, weiche durch Hybridisierung mit der Oligonucleotid-Mischung 2015 erhalten wurden.

Beispiel 3.4 Screening der Subbank mit der Oligonucleotid-Mischung 2060

Die Filterreplikas der Subbank (72 Klone), die in Beispiel 3.3 erhalten wurde, werden in 6x NET befeuchtet und 4 h in 15 ml 6x NET, 1 x ss-Denhardt, 0,1 % SDS bei 32"C vorhybridisiert. 8pMol der Ologonucleotid-Mischung 2060, die wie in Beispiel 3.2.3 beschrieben radioaktiv markiert ist, werden zugesetzt, und die Hybridisierung wird über Nacht bei 32°C durchgeführt. Die Filter werden zweimal während 5 min jeweils in 2x SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur, zweimal für 1 h jeweils in 2 χ SSC, 0,1 % SDS bei 32°C und einmal für 2 h in 0,2x SSC, 0,5% SDS bei 32^eC gewaschen. Die Filter werden luftgetrocknet und während 3 Tagen unter Verwendung von KODAK X-omat S0282-Filmen autoradiographiert. 3 positive Klone werden gefunden, welche alle zu der Gruppe gehören, die mit dem 2014-Abschnitt, wie in Beispiel 9 beschrieben, hybridisieren; ein Klon wird als E.coli BJ 5183/ pCG3B11 (kurz 3B11) bezeichnet.

Beispiel 4 Isolierung des Plasmids pCG3B 11 und Restriktionsanalyse desselben

Vom Klon 3B11, der gemäß Beispiel 3.4 erhalten wurde, werden große Plasmidpräparate (14) hergestellt.

Das entsprechende Plasmid, mit pCG 3 B11 bezeichnet, wird durch vollständige Restriktionsverdauung mit Hind III, EcoRJ und Pstl (alle Boehringer, Mannheim) analysiert und der elektrophoretischen Trennung über 1%Agarosegel (Fig. 1) unterworfen.

Beispiel 5

Subklonen der EcoRI-Fragmente von pCG3Bi1, enthaltend die N-terminalen und C-terminalen Fraktionen des Pektinlyase I-Gens

Beispiel 5.1

Isolierung der Sau3 Al-Fragmente von pGC3011 und Einbindung in die M13DNA 1 pg des Plasmids pCG3B11 (Beispiel 4) wird bis zur Vollständigkeit mit 18 Einheiten Restriktions-Endonuklease Sau 3Al (Boehringer, Mannheim) in 20μΙ ЮтМоІ/ІTris-HCI, 75mMol/l NaCI, ЮтМоІ/І MgCI₂, pH7,2, während 1 h bei 37°C abgebaut.

Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 2OmM beendet. Die DNA-Fragmente werden mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 20 μΙΤΕ-Puffer wiedergelöst. 100 ng der Sau3AI-verdauten DNA werden an 20ng M13mp8-Phagen-DNA (15), die durch BamH !-Verdauung (Boehringer, Mannheim) linearisiert ist, ligiert. Die

Bindung wird 4h bei 15°C mit 1 Einheit T4 DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) in einem Gesamtvolumen von 10 μΐ Ligationspuffer durchgeführt. Empfindliche E.coli JM101 -Zellen werden in SOmM CaCI₂ in Übereinstimmung mit dem Amersham handbook (16), S. 25, hergestellt. 0,3ml aliquote Anteile der empfindlichen JM101-Zellen werden in 15 ml sterile Kulturgefäße auf Eis übertragen. 5μΙ der gebundenen Phagen-DNA werden jedem Gefäß zugesetzt. Die Mischungen werden 40min auf Eis gehalten. Die Zellen werden 3 min bei 42 ⁰C einem Hitzeschock unterworfen und die Gefäße in das Eisbad zurückgegeben. Für jedes Gefäß werden die folgenden Mischungen hergestellt: 40μΙ IPTG 10OmM, 40цІХ-даІ 2% in Dimethylformamid und 200μΙ E.coli JM101-Zellen aus einer frischen, in exponentieller Wachstumsphase befindlichen Kultur. 270 uJ dieses Gemisches werden jedem Gefäß, das die hitzegeschockten E. coli JM101 -Zellen enthält, zugesetzt. 3 ml verflüssigter Topagar (bei 42⁰C gehalten) werden jedem Gefäß zugesetzt, und der Inhalt der Gefäße wird auf Agarplatten gegossen. Die Platten werden umgekehrt bei 37⁰C über Nacht bebrütet.

Beispiel 5.2 Screening der rekombinanten Phagen mit dem Oligonucleotid-Teilstück 2060

E.coli JM101, transformiert mit der rekombinanten Phagen-DNA, zeigen weiße Plaques auf den X-gal enthaltenden Agarplatten von Beispiel 5.1.384 davon werden aufgenommen und individuell bei 37⁰C in 1,5ml 2x TY-Medium, beimpft mit 15μΙ exponentiell wachsenden E.coli JM 101-Zellen, wachsengelassen. Nach 6h werden die 384 Kulturen 5min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert und die Phagenüberstände bei 4°C aufbewahrt. Jeweils 100μΙ der 384 Überstände werden auf vier Gen-Screen-Membranen (New England Nuclear) unter Verwenduang einer BioDot-Vorrichtung mit 96 Schlitzen (BioRad) übertragen. Die Membranen werden 5 min in 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI und 5 min in 3 M NaCI, 1M Tris-HCI, pH 5,6, eingeweicht, an der Luft getrocknet und 2 h im Vakuum bei 80⁰C gebacken. Schließlich werden die vier Membranen vorhybridisiert, mit der Oligonucleotid-Mischung 2060, die wie in Beispiel 8 beschrieben, radioaktiv markiert ist, hybridisiert, gewaschen und gemäß Beispiel 3.4 autoradiographiert. Aus dem Bindungsversuch des Beispiels 5.1 wird ein positiver, rekombinanter Phage für die weitere Analyse, bezeichnet als mρ8-3 A, ausgewählt.

Beispiel 5.3 Sequenzanalyse des rekombinanten mp8-3 A-Phagen

Der Überstand, enthaltend den Phagen mρ8-3 A, erhalten gemäß Beispiel 5.2, wird zur Herstellung einer einzelstrangigen und replikativen Form DNA (RF-DNA), wie im Amersham handbook (16) auf S. 18-27 beschrieben, verwendet. Die einzelstrangigen Templates (Vorlagen) werden unter Verwendung der Ketten-Terminator-Methode, beschrieben im Amersham handbook auf den Seiten 30-35, sequenziert. Es stellt sich heraus, daß der Phage das 574bρ Sau 3 Al-Fragment mit der vorhergesagten Nucieotid-Sequenz des Oligonucleotid-Teilstücks 2060 in Position 584 bis 599 enthält.

Beispiel 5.4 Identifizierung der N-terminalen und C-terminalen EcoR I-Fragmente des Pektinlyasel-Gens

Die sequenzierte EcoR I-Restriktionsstelle des Phagen mp8-3A (Beispiel 5.3) wird verwendet, um zwei EcoR I-Fragmente, einen mit einem Gehalt des C-terminalen Teils des die Terminator-Region umfassenden PLI-Gens, und einen mit einem Gehalt des N-terminalen Teils des die Promoter-Region umfassenden Gens, zu identifizieren und zu subklonieren. Es werden die folgenden zwei Oligonucleotide, wie in Beispiel 3.2 beschrieben, synthetisiert.

Oligonucleotid 5052: 5TGGATGATGATGTTGGAGACa'

beginnt bei Position 597,5' zu dem zentralen EcoR I-Punkt in Position 649/650, und erstreckt sich bis Position 577 (Komplementärstrang).

Oligonucleotid 5066: 5'AGGTCCAGGACAACACCTACs'

beginnt bei Position 1020,3' zur zentralen EcoR l-stelle und erstreckt sich bis Position 1039.

Die Oligonucleotid-Mischungen 5052 und 5066 werden gemäß Beispiel 3.3 radioaktiv markiert.

1 μς der Plasmid-pCG 3 B11 (Beispiel 11 )-DNA wird mit EcoR I (Boehringer, Mannheim) vollständig abgebaut, und die Fragmente werden auf einem 1 % Agarose-Gel getrennt. Die DNA-Fragmente werden auf eine Gene Screen membrane (New England Nuclear), wie vom Lieferanten auf S.383-386 beschrieben, aufgetragen und die Membranen mit radioaktiv markierten Teilstücken der Oligonucleotide 5052 und 5066, wie von Maniatis et al. (8), S. 387-389 beschrieben, hybridisiert. Das Teilstück 5066 hybridisiert mit einem 3,5 kb EcoR I-Fragment, welches den C-terminalen Abschnitt und die Terminator-Region des PLI-Gens enthält. Das Teilstück 5052 hybridisiert mit einem 2,9 kb EcoR I-Fragment, das den N-Terminus und die Promotor-Region des Gens enthält.

Beispiel 5.5 Aufbau von pPL29-5 Und pPL35-5 durch Reklonen der EcoR I-Fragmente von pCG3 B11 in pUN 121

4,5μg der gemäß Beispiel 4 erhaltenen Plasmid pCG3Bi1-DNA werden mit 50 Einheiten EcoR I (Boehringer, Mannheim) in 50μΙ 0,01 M Tris-HCI, pH7,5,0,1 M NaCI, 0,01 M MgCI₂,1 mM Mercaptoethanol während 2h bei 37°C bebrütet. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1 % Agarose-Gel abgetrennt, die das 2,9kb-Fragment und das 3,5kb-Fragment enthaltenden Gelscheiben werden gemäß Beispiel 5 eluiert und die DNA mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt, die Niederschläge werden erneut in 40μΙ niedrigem TE-Puffer suspendiert, und 10 μΙ dieser Lösung werden an 100 ng pUn 121 (9), linearisiert durch EcoRI-Abbau, gebunden. Die Ligierung wird 4h bei 15°C mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) in 35,5μΙ 2OmMoI Tris-HCI, 1 mMol EDTA, 5mMol Dithioerythrit, 6OmMoI KCI, 50% Glycerin, pH7,6, durchgeführt. 17,5μΙ aliquoter Anteile dieser Mischung werden getrennt zu 200μΙ der empfindlichen E.coli HB 101-Zellen gegeben, welche zur Transformation durch Behandlung mit Calciumchlorid, wie von Maniatis et al. (8), S. 250, beschrieben, hergestellt worden waren. Die Mischungen werden 30min auf Eis gehalten und 2min auf 42°C erwärmt, dann mit 1 ml SOC-Medium verdünnt und 1 h bei 37°C bebrütet. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 2000g während 5 min gesammelt. Jedes Zellkügelchen wird in 600μΙ SOC-Medium resuspendiert und auf drei Agarplatten mit einem Gehalt des LB-Mediums, ergänzt mit 8mg/l Tetracyclin, ausgestrichen. Die Platten werden 16h bei 37⁰C bebrütet.

Die Plasmide von 6 rekombinanten tet^R-Klonen werden von jeder Transformation durch die Methode von Birnboim & DoIy (17) isoliert und durch Restriktionsanalyse analysiert. Ein Klon, der das 2,9kb EcoR I-Fragment von pCG 3 B11 enthält, wird für die weitere Analyse ausgewählt und als pPL29-5 (Fig.3) bezeichnet. Ein anderer Klon, enthaltend das 3,5kb EcoR I-Fragment von pCG3B11, wird ausgewählt und als pPL35-5 (Fig.3) bezeichnet.

Beispiel 6 Sequenzanalyse des Pektinlyasel-Gens

Die DNA von pPL29-5 (Beispiel 5.5) enthaltend den N-terminalen Abschnitt des PLI-Gens und die DNA von pPL35-5 (Beispiel 5.5) enthaltend den C-terminalen Abschnitts des PLI-Gens werden, wie von Hymphreys et al. (14) beschrieben, isoliert. Teile der Inserts der Plasmide pPL29-5 und pPL35-5 werden durch Restriktion mit geeigneten Enzymen erhalten. Die Fragmente werden in M13 mp8 und M13 mp 18 subkloniert und unter Verwendung des M 13-Cloning and Sequencing Kit (M 15 Sequencing Kit N.4502, Amersham) unter den vom Lieferanten (16) angegebenen Bedingungen sequenziert.

Die gesamte Sequenz des 2,7 kb Spe I-Nhel-Fragments, umfassend die vollständige Sequenz des PLI-Gens, ist in Fig. 4 dargestellt. Sie umfaßt 688 Nucleotide der Promotor-Region, 1369 Reste des Strukturteils des PLI-Gens und 660 Nucleotide der Terminator-Region.

Der Sequenz von PLI, entsprechend der Aminosäure-Sequenz des N-Terminus von PLI, wie durch Aminosäure-Sequenzanalyse (Beispiel 1) bestimmt, gehen 57 Nucleotide voraus, die für die Startsequenz

M₁-K-Y-A-A-A-L-T-A^A-A-L-A-A-R-A-A-A₆₇

kodieren.

Eine computergesteuerte Untersuchung auf übereinstimmende Sequenzen von Exon/Intron-Spleißverbindungen sowie auf Intron-interne Sequenzen (E.Boel et al. [18] und S.M.Mount [19]) führt dazu, die Anwesenheit von vier Introns mit Längen von 65bp bzw. 62 bp bzw. 63bp bzw. 57bp (Fig.4, unterstrichen) zu postulieren.

Die Sequenz des PLI-Gens wird durch Kombination der Sequenzen des EcoR I-Spel-Fragments des Plasmids pPL29-5 und des EcoR I-Nhel-Fragments von pPL35-5 (beide bestimmt durch Subklonen in M13) bestimmt.

Beispiel 7 Aufbau der Expressionsvektoren Beispiel 7.1 Einführung eines neuen Restriktionspunktes in die Start· bzw. Signal-Sequenz des PLI-Gens

Die Einführung einer neuen BssH Il-Stelle in die Start-Sequenzregion des PLI-Gens (sequenziert in Beispiel 6) durch in vitro-Mutagenese wird gemäß Zoller und Smith (20) durchgeführt. Ein Oligonucleotid, bestehend aus 19 Resten, wird nach der in Beispiel 3.2 beschriebenen Methode synthetisiert, das komplementär zu der DNA-Sequenz (Pos. 36-54), welche für den C-terminalen Abschnitt der PLI-Start-Sequenz kodiert, mit Ausnahme des Nucleotids 10 (45), was zu einer C/G-Transversion (mutagener Primer) führt, ist. Das ausgetauschte Nucleotid 45 des mutagenen Primers wird mit * bezeichnet.

Abschnitt der PLI-Start-Sequenz 5·CCTCGCTGCCCGCGCCGCT3'

36 40 50 54

mutagener 5' CCTCGCTGCGCGCGCCGCT3'

Primer 5156

Für die in vitro-Mutagenese werden 200 pMol des Oligonucleotids 5156 mit 20 nMol гATP S'-phosphoryliert. Die Reaktion wird 1 h bei 37°C mit 10 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase (Boehringer, Mannheim) in 20μΙ Kinase-Puffer durchgeführt. Die Reaktion wird durch Erwärmen auf 65⁰C während 10min beendet.

Beispiel 7.2

in vitro-Mutagenese der Template-M 13mp8-PL(Sal-EcoRI)-DNA

Das erste in vitro-Mutagenese-Experiment betrifft einzelstrangige DNA aus dem Phagen M13mp8-PL(Sall-EcoRI), erhalten in Beispiel 6, welche das 0,8kb SaIl-EcoR I-Fragment des Plasmids pPL29-5, enthaltend 117 Nucleotide des Promotors und den N-terminalen Teil des PLI-Gens, enthält. 1 pMol einzelstrangige M13mp8-PL(SaI l-EcoRI)-DNA wird mit 20pMol mutagenem Primer 5156 (Beispiel 7.1) und lOpMol Universal M 13-sequenzierendem Primer (N.4511, Amersham) in 10,5pl0,02MTris-HCI, pH7,5,0,01 M MgCI₂,0,05M NaCI, 0,001 M DDT vermischt. Die Mischung wird schnell auf 56°C erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. 1 μΙ 0,2MTHs-HCI, pH7,5,0,1 M MgCI₂,0,01 M DDT, 4μΙ 2mM dNTP, 1 μΙ 1OmM ATP werden dem Gemisch zugesetzt, 3 Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) und 2 Einheiten DNA-Polymerasel (Klenow-Fragment, Amersham) werden zugegeben und die Polymerisationsreaktion wird 15h bei 15⁰C durchgeführt. Es werden drei Verdünnungen des Polymerisationsgemisches (1:20,1:100 und 1:500) in niedrigem TE-Puffer durchgeführt. Von jeder Verdünnung werden 1 μΙ und 5μΙ zu 300 μΙ kompetenter E.coli JM101-Zellen getrennt zugesetzt, welche zur Transformation nach der in Beispiel 5.1 beschriebenen Methode hergestellt worden waren. Die Zellen werden auf X-gal-Platten gegossen und weiße Plaques bildende Kolonien werden erhalten. 100 der weißen Plaques werden aufgenommen und auf LB-Platten überführt. Die mit Phagen-DNA transformierten Bakterien werden über Nacht bei 37"C wachsengelassen und anschließend auf Whatman 541-Filter gemäß Beispiel 3.1 überführt. Die Filter werden gewaschen (Beispiel 3.1), dann in 6x NET, 1 χ ss-Denhardt, 0,1 % SDS während 30 min bei 67⁰C vorhybridisiert. Die Hybridisierung wird bei RT (Beispiel 3.4) während 30min mit 15pMol radioaktiv markiertem (Beispiel 3.3) Oligonucleotid 5156 pro Filter in 6x SSC durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Filter während

4χ 40sec in 6x SSC bei Raumtemperatur gewaschen und nach dem Lufttrocknen 1 h den Kodak-XAR-5-Filmen unter Verwendung eines Ilford-Screens ausgesetzt. Die Filter werden ein zweites Mal 5 min in 6x SSC bei 72⁰C (Tm des mutagenen Primers 5156 ist 70"C) gewaschen, getrocknet und über Nacht einem Kodak XAR-5-Film ausgesetzt.

Kolonien, welche nach der zweiten Waschstufe positive Signale zeigen, werden von der Original-LB-Platte aufgenommen, in 1 ml LB-Medium suspendiert und 20min auf 70⁰C erhitzt. Diese Bakteriophagen-Lösung wird 1:10,1:1000 und 1:100000 verdünnt und 10 μΙ jeder Verdünnung werden dazu verwendet, 300 μΙ exponentiell wachsender E. coli JM101 -Zellen durch Übertragung zu infizieren, und auf X-gal-Platten gegossen. 6 Plaques der 1 -.100000-Verdünnung werden individuell in 1,5ml 2x TY, enthaltend 15μΙ exponentiell wachsender E. coli MJ101-Zellen, aufgenommen und auf X-gal-Platten gegossen und 6 h bei 37°C wachsengelassen. Die Kulturen werden 5min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert, die Überstände bei 4°C (Phagen-Vorrat) aufbewahrt und die Zellkügelchen werden dazu verwendet, RF-Präparate nach der Methode von Birnboim & DoIy (17) herzustellen. Nach der Restriktionsanalyse mit BssH Il wird ein mutierter Phage, der einen neuen BssH Il-Locus in dem PLI SaI l-EcoR I-Fragment trägt, für weitere Versuche ausgewählt und als (M 13 mp18-PL(SaI l-EcoRlj-BssHII/BE 5) bezeichnet.

Beispiel 7.3 In vitro-Mutagenese von Template-MISrnpie-PLISpel-EcoRI)

Das zweite in vitro-Mutageneseexperiment wird mit Einzelstrang-DNA aus dem Phagen M13 mp 18-PL(Spe l-EcoR I), erhalten in Beispiel 6, durchgeführt. Dieser rekombinante Phage enthält das 1,4kb Spel-EcoRI-Fragment des Plasmids pPL29-5 und somit 688 Nucleotide des Promotors plus dem N-terminalen Abschnitt des PLI-Gens. Mutagenese dieses Templates wird genau wie in Beispiel 7.2 beschrieben durchgeführt. Ein Phage, der den neuen BssHII-Punkt in dem PLI-Spel-EcoRI-Einschub trägt, wird für vier Versuche ausgewählt und als M13 mp 18-PL(Spel-EcoR DBssH II/AC5 bezeichnet.

Beispiel 7.4 Der Aufbau des Plasmids pUBE5

Zur einfacheren Handhabung wird das BamH l-EcoR I-Fragment des Phagen M13 mp 8-PL(SaI l-EcoR l)BssH II/BE 5, erhalten gemäß Beispiel 7.2, einschließlich 130 bp der Promotor-Region und des N-terminalen Abschnitts des PLI-Gens einschließlich der neu eingeführten BssHIl-Stelle in der Start-Sequenzregion, in den Plasmid-Vektor pUN 121 (9), wie in Fig.5 dargestellt und im folgenden beschrieben, subktoniert.

4мд RF DNA des Phagen M13mp8-PL(Sal l-EcoRIJBssH II/BE5 werden gemäß Beispiel 5.3 isoliert und vollständig mit Restriktions-Endonuclease BamH I und EcoRI (Boehringer, Mannheim) verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel getrennt und der Gelabschnitt, enthaltend das 0,8 kb BamH l-EcoR I-Fragment, bestehend aus 117 bp des Promotors und dem N-terminalen Abschnitt des PLI-Gens, wird elektroeluiert, wie in Beispiel 2.2 beschrieben. Die DNA wird mit Phenol/ Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 10μΙ Wasser (50пд/цІ) resuspendiert.

2цд pUN 121 werden vollständig mit Bell und EcoRI (Boehringer, Mannheim) verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel getrennt und das4,0kb-Fragment wird gemäß Beispiel 2.2 elektroeluiert. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Fällen mit Ethanol wird die DNA in 18μΙ Wasser (ЮОпд/μΙ) aufgelöst.

300 ng des BamHI-EcoRI-Fragments, umfassend die BssH Il-Stelle werden an 500 ng von Bcll/EcoRI ausgeschnittene pUN 121-DNA angekoppelt. Die Kopplung wird 4h bei 15°C mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 20 μΙ von 5OmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP durchgeführt. 10μΙ des Kopplungsgemisches werden dazu verwendet, um 100μΙ kompetente E.coli-HB 101 -Zellen (8) zu transformieren. Die Zellen werden auf LB-Platten, enthaltend 8mg/l Tetracyclin (Sigma), ausgestrichen und über Nacht bei 37°C bebrütet.

Plasmid-Präparate werden aus 12tet^R-Kolonien gemäß der Methode von Birnboim &Doly (17) hergestellt und ein Plasmid mit dem gewünschten Restriktionsmuster, dargestellt in Fig. 5, wird als pUBE 5 bezeichnet und für die weitere Analyse verwendet.

Beispiel 7.5

Einführung einer Hga I-Restriktionsstelle vor dem Desulfatohirudin-Gen von pML310 und Isolierung des 0,22 kb Hga l-BamH I-

Gen-Fragments

Zur Einführung eines Hgal-Restriktionspunktes vor dem Desulfatohirudin-Gen (Fig.6) werden 8μg der Plasmid-pML310-DNA vollständig mit Restriktions-Endonuclease EcoR I verdaut. Die aufgetrennte DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Um 5' überzählige Enden zu entfernen, werden 4μg pML310/EcoRI-DNA in 100μΙ 15OmM NaCI, 1 mM ZnSO₄, 3OmM Natriumacetat, pH4,6, und 20U/ml Nuclease S₄ (Sigma) während 45min bei 37⁰C verdaut.

Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA (pMLSIO/EcoRI/Si) wird in 100μΙ 5OmM Tris-HCI (pH8,0) resuspendiert und mit 2 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdärmen (CIAP, Orthophosphorsäuremonoesterphosphorylase, EC3.1.3.1, Boehringer) 1 h bei 37⁰C bebrütet. Das Enzym wird 1,5h bei 65°C inaktiviert. Die NaCI-Konzentration wird auf 15OmM eingestellt. Die desphosphorylierte DNA (pML310/EcoRI/Si/CIAP) wird durch Adsorption an DE 52 (Whatman)-Ionenaustauschsäule in einem Puffer mit niedriger Salzkonzentration (15OmM NaCI, 1OmM Tris.HCI, pH8,0, 1 mM EDTA) gereinigt. Die Elution wird mit einer Pufferlösung hoher Salzkonzentration (1,5 M NaCI, 10 mM Tris.HCI, pH 8,0,1 mM EDTA) durchgeführt. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt und in H₂O bei einer Konzentration von 0,8 mg/mI resuspendiert. Zur Einführung einer Hga I-Stelle wird ein Oligonucleotid der Formel

S-AGCGTCGACGCT-S'

nach der Phosphotriester-Methode (21) synthetisiert. Die Sequenz der Oligonucleotids ist selbst-komplementär, enthaltend die Erkennungsstelle-GACGC-für die Restriktions-Endonuclease Hga I. Anlagerung von zwei Einzelsträngen führt zu einem doppelstrangigen DNA-Verbindungsstück.

1^g des synthetischen, einzelstrangigen Oligodesoxynucleotids werden in 10μΙ 6OmM Tris-HCI, pH7,5,1OmM MgCI₂, 5mM DTT, 30μΰι (Y-³²P] ATP (3000Ci mMol', Amersham) und 6 Einheiten T4 Polynucleotidkinase (Boehringer) während 30min bei 37°C phosphoryliert und danach einem 15minütigen „Chase" bei 37°C in Anwesenheit von 0,5mM ATP unterworfen. Das Gemisch wird weiter 10min bei 75⁰C bebrütet, um das Enzym zu inaktivieren. Die Mischung wird zwecks Anlagerung der Enden auf Raumtemperatur gekühlt.

0,6цд (17OpMoI) der ³²P-markierten Linker-DNA werden mit 2,4 цд (1,75 pMol Enden) von pMLSIO/EcoRI/Si/CIAP vermischt und in 20μΙ 60 mM Tris · HCI, pH 7,5,1OmM MgCI₂,5mM DTT, 3,5mM ATP, 800 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) 20 h bei 15⁰C ligiert. Die Ligase wird 10 min-bei 85°C inaktiviert und der Überschuß der Linkermoleküle durch Fällen der DNA in Anwesenheit von 1OmM EDTA, pH7,5,30OmM Natriumacetat, pH6,0, und 0,54VoI. Isopropanol entfernt. Nach 30min bei Raumtemperatur wird die DNA pelletiert in 45μΙ Ligierungsmischung (wie oben spezifiziert) resuspendiert und 6h bei 15°C ligiert, um zirkuläre DNA zu bilden.

Aliquote Anteile von 1 μΙ und 3μΙ der Ligierungsmischung werdenzu 100 MlCalcium-behandelten, transformationsfähigen E. coli HB101 -Zellen (hergestellt gemäß der Methode von D.Hanahan [10]) gegeben. Die Zellen werden 30min auf Eis belassen, dann 3 min bei 42°C bebrütet, 2 min auf Eis gekühlt und dann 1 h bei 37°C in 400 μΙ SOC-Medium bebrütet. Die Zellen werden in 100μΙ SOC-Medium konzentriert, jeweils auf LB-Agarplatten, enthaltend 50цд/тІ Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 37⁰C wachsengelassen.

12 transformierte amp^R-Kolonien werden isoliert und individuell in LB-Medium, enthaltend 100μς/ιηΙ Ampicillin, wachsengelassen. Plasmid-DNA wird nach der Methode von D. S. Holmes et al. (22) hergestellt. Die Anwesenheit des synthetischen Oligonucleotid-Linkers wird durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung eines Einzelstrang-DNA-Fragments als Primer, das den kodierenden Strang von Hirudin hybridisiert, bestätigt. Ein Klon, der die Verbindungs-DNA in der korrekten Position vor dem Hirudin-Gen enthält, wird als pML310L bezeichnet.

Zur Isolierung des 0,22kb Hga l-BamHI-Desulfatohirudin-Gen-Fragments werden 40μg des Plasmids pML310L vollständig mit Restriktions-EndonucleasenPvulundBamHI (Boehringer) in ΙδΟμΙΟ,ΟΙΜΤπβ · HCI, pH7,5,0,1 M NaCI, 0,01 M MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol während 2 h bei 37°C verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1% Agarosegel getrennt und das Gelstück, das das 0,84kb Pvu l-BamHI-Fragment enthält, wird gemäß Beispiel 5 elektroeluiert. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung wird die DNA in 20 μΙ Hgal-Puffer resuspendiert und vollständig mit Restriktions-Endonuclease Hga I (Biolabs) abgebaut. Die Fragmente werden auf einem 2% Agarosegel abgetrennt, und das Gelstück, das das 0,22 kb-Hga l-BamH I-Fragment enthält, wird wie vorstehend eluiert. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung wird das Fragment in 55μΙ sterilem Wasser (0,1 pMol/μΙ) resuspendiert.

Beispiel 7.6

Fusion der PLI-Start-Sequenz und des Desulfatohirudin Strukturgens

Um einen Linker zu schaffen zur Ligierung der BssHII-Stelle der die Signal-Sequenz (Beispiel 7.2) kodierenden Region des PLI-Gens mit der Hgal-Stelle des Desulfatohirudin-Gens (Beispiel 7.5), werden zwei Oligonucleotide, wie in Beispiel 3.2 beschrieben, synthetisiert.

PLI-Signal-Sequenz ι N-terminale Aminosäuren

¹ von Desulfatohirudin ι

ALA ALA LEU ALA ALA ARG ALA ALA ALAI VAL VAL

I I

5¹ 3¹ I

GCC GCC CTC GCT Gcg cgc gcc get gctlGTT GTT Oligonucleotid 5172 CGG CGG GAG CGA CGC GCg egg cga cgalcaa caA Qligonucleotid 5173

3' I 5¹

BssHII

(kleine Buchstaben: Linker)

30OpMoI jedes Oligonucleotids werden getrennt mit 40OpMoI rATP und 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (New England Nuclear) in 15μΙ 5OmM Tris-HCI (pH7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, δΟμςΛηΙ BSA behandelt. Beide mit Kinase behandelten Oligonucleotide werden in einem Verhältnis von 1:1 vermischt, auf 95⁰C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur zum Anlagern heruntergekühlt. Die doppelsträngigen Linkerfragmente werden bei -20°C aufbewahrt.

Beispiel 7.7 Aufbau von pLHK3

Zum Aufbau eines DesuIfatohirutin-Expressionsvektors (Fig. 7), der den verkürzten Promoter von PLI enthält, werden 7μg pUBE5-DNA (Beispiel 7.4) vollständig mit Restriktions-Endonuclease BssHII (Boehringer) verdaut mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA (1,9pMol) wird in 10μΙ sterilem Wasser resuspendiert. 30OpMoI des zusammengefügten Linkers 5172/5173 (Beispiel 7.6) werden an 1,9pMol BssHII geschnittenes pUBE5 mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 60μΙ 5OmM Tris-HCI (pH7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50μg/ml BSA ligiert. Die Ligierung wird 15 h bei 15⁰C durchgeführt. Die Ligase wird durch Erhitzen auf 85⁰C während 10 min inaktiviert. Der Puffer wird auf 0,01 M Tris-HCI, pH8,0,0,1 M NaCI, 0,005M MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol eingestellt. 36 Einheiten von BamH I (Boehringer) werden zugesetzt und der Abbau wird 2 h bei 37⁰C durchgeführt. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel getrennt und das 3,4kB BamH l-[Bssh IIJHga I-Linkerfragment durch Elektroelution des Gelstücks, nachfolgende Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung isoliert. Die DNA wird in 14μΙ sterilem Wasser auf eine Konzentration von 0,1 pMol/μΙ resuspendiert. 0,2pMol des 0,22kb Desulfatohirudin-Hgal-BamH I-Fragments werden an 0,1 pMol der abgebauten pUBE5-DNA ligiert. Die Ligierung wird 15h bei 15°C mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 10μΙ 5OmM Tris-HCI (pH7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50μg/ml BSA durchgeführt.

2μΙ des Ligierungsgemisches werden dazu verwendet, um 100μΙ von empfänglichen E.coli HB101-Zellen (8) zu transformieren, welche dann auf LB-Platten, enthaltend 50 mg/l Ampicillin (Sigma), ausgestrichen werden. Die DNA von 12amp^R-Kolonien wird

nach der Methode von Birnboim & DoIy (17) hergestellt und durch Restriktionsanalyse analysiert. Ein Klon wird für die Sequenzanalyse nach der Didesoxy-Kettentermmator-Methode von Sangeret al. (23) ausgewählt. Ein Klon, der das gewünschte Restriktionsmuster und die korrekte Sequenz innerhalb der PLI-Startsequenz-Desulfatohirudin-Verbindung zeigt, wird isoliert und mit pLHK3 bezeichnet.

Beispiel 7.8 Der Aufbau von pLHL5

Zum Aufbau des Desulfohirudin-Expressionsvektors, der die vollständige Promotor-Sequenz des PLI-Gens enthält, werden 10,3цд RF DNA des Phagen M13mp 18-PL(Spel-EcoR D-BssH ll/AC 5 (Beispiel 3.3) vollständig mit Restriktions-Endonuclease BssH Il (Boehringer) verdaut, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 10μΙ sterilem Wasser auf eine Konzentration von 1,9pMol resuspendiert. 30OpMoI des doppelsträngigen Linkerfragmentes 5172/5173 (siehe oben) werden an 1,9pMol der BssHII-ausgeschnittenen Phagen-DNA, wie in Beispiel 7.7 beschrieben, ligiert. Nach Inaktivierung der T4 DNA-Ligase wird der Puffer auf 0,01 M Tris-HCI, pH7,6,0,05M NaCI, 0,01 M MgCI₂,0,014M DTT eingestellt. 36 Einheiten der Restriktions-Endonuclease Hindill (Boehringer) werden zugesetzt und der Abbau wird 2h bei 37°C durchgeführt. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel abgetrennt und das 1,4 kb Hind lll-[BssHII]Hga-l-Linkerfragment wird durch Elektroelution gemäß Beispiel 2.2 isoliert. Das Fragment wird in 15μΙ sterilem Wasser resuspendiert und führt zu einer Konzentration von 0,1 ρΜοΙ/μΙ.

Зμg Plasmid pBR322 (24) werden vollständig mit Restriktions-Endonucleasen BamHI und Hindill (Boehringer, Mannheim) in 20 μΙ 0,01 M Tris.HCI, pH 7,5,0,1 M NaCI, 0,01 M MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol verdaut, und die Fragmente werden auf einem

1 % Agarosegel getrennt. Das große 4,15 kb Hind HI-BamH I-Fragment wird gemäß Beispiel 2.2 eluiert und in 8 μΙ sterilem Wasser (0,1 pMol/μΙ) resuspendiert.

0,2pMol des 0,2kb Hgal-BamHI-Fragments von Desulfohirudin und 0,2pMol des 1,4kb PLI-Promotor-Startsequenz-Hind lll[BssH ll]Hga (-Linkerfragments werden an 0,1 pMol Hind IH/BamH !-ausgeschnittenem pBR 32215 h bei 15⁰C ligiert. Die Kopplung wird mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 10μΙ 5OmM Tris-HCI (pH7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50цд/тІ BSA durchgeführt. 1 μΙ des Ligierungsgemisches wird dazu verwendet, um ΊΟΟμΙ empfindliche E.coli-HB101 -Zellen (8) zu transformieren. 12 amp^R-Kolonien werden isoliert und die DNA gemäß Beispiel 7.7 analysiert. Ein Klon wird für weitere Versuche ausgewählt und als pLHL5 (Fig.8) bezeichnet.

Beispiel 7.Э

Der Aufbau von pLHLT7

Um eine Terminator-Region für das PLI-Desulfatohirudin-Expressionssystem zu schaffen, wird das 0,7 kb Pst I-Nhe I-Fragment des Plasmids pPL35-5 mit dem 3' Desulfatohirudin-Gen, wie in Fig. 9 dargestellt, vereinigt.

10μg pPL35-5 werden vollständig mit Pst I (Boehringer) abgebaut. Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die Fragmente werden in 0,033M Tris-Acetat (pH7,9), 0,066M Kaliumacetat, 0,01 M Magnesiumacetat, 0,5mM DTT und 100ng/ml BSA resuspendiert. 10 Einheiten T4 DNA-Polymerase (Boehringer) werden zugesetzt und die Reaktion wird 180see bei 37°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gegeben, jeweils 20 nMol dATP, dCTP, dGTP, dTTP werden zugeführt, der Puffer auf die obigen Bedingungen eingestellt und die Reaktion 35 min bei 37⁰C durchgeführt. Nach Phenol/ Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung wird die DNA in 10μΙ sterilem Wasser (1,9pMol = 11,4pMol stumpfe Enden) resuspendiert. 90OpMoI mit Kinase behandelte, doppelsträngige (Beispiel 7.6) BamH I-Linkerfragmente (Biolabs) werden zugesetzt und die Kopplung 15hrs bei 15°C mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 60μΙ 5OmM Tris-HCI (pH7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50μg/ml BSA durchgeführt. Nach Inaktivierung der Ligase durch lOminütiges Erhitzen auf 85°C wird der Puffer auf 0,01 M Tris-HCI (pH 8,0), 0,1 M NaCI, 5 mM MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol eingestellt. 20 Einheiten Restriktion-Endonuclease Nhel (Biolabs) werden zugesetzt und der Abbau 2 h bei 37°C durchgeführt. Die Fragmente werden auf einem 1,2% Agarosegel abgetrennt, und das 0,7kb Nhel-[Pstl]BamH I-Fragment wird durch Elektroelution gemäß Beispiel 2.2 isoliert. Das Fragment wird in 15 μΙ sterilem Wasser resuspendiert, um eine Konzentration von 0,1 pMol/μΙ zu ergeben. Eine Ligierung wird mit 0,2pMol 0,7 kb Nhel-[Pst l]-BamH I-Terminatorfragment, 0,2 pMol 1,4kb HindIH-[BssH ll]Hga I-Promotorfragment (Beispiel 7.4), 0,2pMol 0,2 kb Hga l-BamH I-Desulfatohirudin-Fragment (Beispiel 7.5) und 0,1 pMol pUC 18-Vektor (25), linearisiert mit Hind III und Xba I, durchgeführt. Die Reaktion wird mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) während 15h bei 15°C in 10μΙ 5OmM Tris-HCI (pH7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50μg/ml BSA durchgeführt.

2 μΙ der Ligation werden zum Transformieren von E.coli HB 101-Zellen verwendet. 12amp^R-Transformanten werden gemäß Beispiel 7.6 analysiert, und das Plasmid, welches die korrekten Fusionssequenzen zeigt, wird als pLHLT7 bezeichnet.

Beispiel 8 Aufbau eines Cotransformationssystems für A.niger Beispiel 8.1 Herstellung von pCG59D7, enthaltend das ругА-Gen von Aspergillus niger

300 ng eines 1,1 kb Hind Ill-Fragments von pDJB 2 (26), das einen Abschnitt des N. crassa pyr4-Gens trägt, werden radioaktiv durch Nicktranslation nach Maniatis et al. (8) markiert. Die Filterreplikas der Genbank (Beispiel 3.1) werden in 6x NET befeuchtet und in 6x NET, 1 χ ss-Denhardt, 0,1 % SDS während 4h bei 50⁰C vorhybridisiert. Das der Nicktranslation unterworfene Hind Ill-Fragment wird zugesetzt (300ng/80 Filter), und die Hybridisierung wird 15h bei 50⁰C durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Filter 1 χ 5min in 4x SSC, 0,1 % SDS bei 50°C gewaschen. Nach dem Lufttrocknen werden die Filter 3 Tage Kodak X-Omat S 0282-Filmen ausgesetzt. Eine stark hybridisierende Kolonie, mit Escherichia coli BJ 5183/pCG 59 D 7 (kurz 59 D 7) bezeichnet, wird isoliert und ein großes Plasmidpräparat davon gemacht (14). Das Plasmid wird als pCG 59 D7 bezeichnet und zur Transformation in Beispiel 9.2 verwendet.

Beispiel 8.2 Mutation von A.niger Stamm N756 und Isolierung der für Uridin auxotrophen Mutanten

Die Selektion für Mutanten von A.niger Stamm N756, denen speziell Orotidin-ö'-phosphatdecarboxylase-Aktivität fehlt, kann durch positive Selektion gegen die toxische analoge Fluororotsäure (27) in Anwesenheit von Uridin durchgeführt werden. 3x 10⁶ Konidiosporen von A. niger Stamm N 756 werden auf 10 ml Minimalmediumplatten, ergänzt mit 1 g/l Arginin und 50 mg/1 Uridin, ausgestrichen. Die Sporen werden der Kurzwellen-UV-Bestrahlung (2600Ä) in einer Dosierung ausgesetzt, welche 0,5% überlebende Kolonien ergibt. Nach 2 Tagen Bebrütung bei 28°C, wenn das auswachsende Myzel schwach sichtbar ist, werden 10 mg Fluororotsäure zu jeder Platte zugesetzt, und die Bebrütung wird weitere 2 bis 3 Tage fortgesetzt. Fluororotsäure-resistente Kolonien treten als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Untergrundwachstum von weißlichem, sensitivem Myzel auf. Von etwa 40000 Überlebenden der mutagenen Behandlung werden 8 Mutanten isoliert. 2 davon, welche gegenüber Fluororotsäure ohne Uridin-Bedarf resistent sind, werden nicht weiter verfolgt. 6 davon zeigen eine U'ridin-Auxotrophie. Es werden Heterokaryonten hergestellt, indem ein Gemisch von Konidiosporen der zwei Fluorsäure-resistenten Mutanten jeweils auf Komplettmedium über Nacht angezüchtet wird. Myzelblöcke werden in Minimalmedium überführt. Mutanten, die einander in ihrer Mutation komplementär sind, zeigen Auswachsen von prototrophem, heterokaryotischem Myzel an den Enden, Stämme mit einer Mutation in dem gleichen AIIeI nicht. Die 6 Uridin-erfordernden Mutanten von Stamm N756 fallen, wie bei S.cerevisiae (27), in zwei Komplementgruppen. Jeweils einer—An 8 und An 10 — wird zur Transformation verwendet.

Beispiel 8.3 Herstellung von Protoplasten und Transformation der Uridin-Mutanten An 8 und An 10 von A. niger N 756

Konidiosporen der Mutanten An8 und An 10 werden getrennt auf schrägen Platten 4 bis 5 Tage bei 28°C in Komplettmedium gezüchtet. 2 x 10⁸ Konidiosporen von An 8 und An 10 werden dazu verwendet, um getrennt 200 ml Minimalmedium, ergänzt mit 1 g/l Arginin und Uridin (Beispiel 8.2), zu beimpfen. Nach 20stündigem Wachstum bei 28°C und 180rpm wird das Myzeldurch Filtrieren durch Miracloth geerntet,zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ gewaschen und in 20μΙ 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂, 0,5mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) resuspendiert. Das Gemisch wird in einem Schüttelwasserbad (30°C, 50 rpm) bebrütet, bis eine maximale Protoplasten-Freisetzung mikroskopisch festgestellt werden kann (90 bis 120 min). Die Protoplasten-Suspension wird durch einen Glaswollepfropfen in einem Trichter filtriert, um Myzelrückstände zu entfernen. Die Protoplasten werden durch vorsichtiges Zentrifugieren (10min, 2000rpm) bei Raumtemperatur pelletiert und zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ gewaschen. Die Protoplasten werden schließlich ϊη200-500μΙ 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ resuspendiert, um eine Konzentration von 1 χ 10⁸/ml zu ergeben.

Zur Transformation werden 200μΙ aliquote Anteile der Protoplasten-Suspensionen (An 8 und An 10) getrennt zusammen mit Lösungen, bestehend aus 10цд/20цІ pCG59D7 DNA, 50μΙ PCT, (1OmM Tris-HCI, pH 7,5,5OmM CaCI₂,25% PEG 6000), bebrütet. Die Inkubationsmischungen werden 20min auf Eis gehalten, weitere 2,0ml PCT werden zugesetzt und die Gemische weitere 5min bei Raumtemperatur bebrütet. 4ml 0,8M KCI, 5OmM CaCIj werden zugesetzt und 1 ml aliquote Anteile dieser Endtransformationslösungen mit verflüssigtem Minimalagarmedium (MM + 1 g/l Arginin + 10g/l Bacto-Agar [Difco]), stabilisiert mit 0,8 M KCI, vermischt. Die Gemische werden sofort auf Agarplatten des gleichen Mediums gegossen und bei 28⁰C bebrütet.

Nach 3tägigem Wachstum bei 28⁰C treten stabile Transformanten als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Untergrundwachstum von vielen hundert kleinen, wahrscheinlich abortiven Transformanten auf.

Die Transformation mit pCG59D7 ist nur erfolgreich im Mutanten An 8, nicht in Ah 10. An8 wird daher angesehen, daß ihm die Ornithin-S'-phosphatdecarboxylase-Aktivität fehlt, die durch das gesamte Genprodukt des Selektionsplasmids pCG59D7 ergänzt ist. In An8 werden etwa 20-30 Transformanten pro μν pCG59D7 erhalten.

10 Transformanten von An 8 werden aufgenommen, auf Minimalmedium subkultiviert und die DNA wird isoliert und auf Anwesenheit von pCG59D7-Sequenzen analysiert. DNA der Transformanten wird nach Pulverisierung des gefrorenen Myzels inflüssigem Stickstoff gemäß einer veröffentlichten Methode (7) isoliert, 1 μg DNA jedes Transformanten wird vollständig mit Xhol abgebaut, durch Elektrophorese über 1 % Agarosegels fraktioniert und auf Nitrocellulose-Filter gemäß Maniatis (8), S. 382-386, aufgetragen. Die Auftragungen werden mit [a-³²p]-markierter pUN121-DNA nach von Maniatis et al. (8), S. 387-389, beschriebenen Standardverfahren hybridisiert. Die erhaltenen, verschiedenen Hybridisierungsmuster zeigen die chromosomale Integration des transformierenden Plasmids pCG59D7 an verschiedenen Stellen in das Wirtsgenom an.

Beispiel 9 Expression des Desulfatohirudin-Gens unter Steuerung des PLI-Promoters in A. niger Beispiel 9.1 Cotransformation des Mutanten An 8 mit pCG59D7, pLHK3, pLHL5 oder pLHLT7

Protoplasten des Mutanten An 8 werden gemäß Beispiel 8.2 hergestellt und mit 5цд Selektionsplasmid pCG59D7 und entweder Юмд Plasmid ρ LH КЗ (Beispiel 7.7), Юцд Plasmid pLHL5 (Beispiel 7.8) oder Юцд Plasmid pLHLT7 (Beispiel 7.9) gemäß dem in Beispiel 8.2 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Die transformierten An8-Zellen werden auf Minimalmedium auf Uridin-Prototrophie, wie in Beispiel 8.2 beschrieben, ausgewählt. 50 Transformanten jedes Cotransformationsversuchs werden willkürlich genommen und auf Desulfatohirudin-Expression analysiert. Die Desulfatohirudin-Aktivität wird in einer Thrombin-Inhibierungsbestimmung nach den Herstellerinformationen für chromogenes Peptidsubstrat getestet (Boehringer, Mannheim, BRD).

Beispiel 9.2

Expression von Oesulfatohirudin unter der Steuerung des PLj-Promoters in Transformanten der Mutanten An 8 Konidiosporen von gemäß Beispiel 8.3 erhaltenen Transformanten werden individuell vorgezüchtet in 50ml eines Vorkulturmediums (Pectin Slow Set L [Unipectin, S.A. Redon, Frankreich] 3g/l, NH₄CI 2g/l, KH₂PO₄ 0,5g/l, NaCI 0,5g/l, Mg₂SO₄ x 7H₂O 0,5 g/l, Ca₂SO₄ x 2H₂O0,5g/l, pH 7,0). Die Vorkultur wird 72 hrs bei 250 rpm und 28⁰C bebrütet. 10%der Vorkultur werden dazu verwendet, um 50ml eines Hauptkulturmediums (Sojabohnenmehl 20 g/l, Pectin Slow Set 5g/l) zu

beimpfen. Die Kultur wird 72-96 h (höchste Rate der Pektinlyase-Produktion) bei 250 rpm und 28°C (bezeichnet als induzierende Bedingungen) gezüchtet. Transformanten des Mutanten An8 werden ebenfalls unter nicht-induzierenden Bedingungen in Phyton-pepton lOg/l, Glukose 10g/l anstelle des Hauptkulturmediums gezüchtet.

Bei verschiedenen Zeiten (alle 20h) werden Proben entnommen, die Zellen durch Zentrifugieren pelletiert und durch Ultraschallzerkleinerung gebrochen. Überstehendes und Zellextrakte werden beide auf Desulfatohirudin-Aktivität gemäß Beispiel 9.1 getestet. Es wird keine Desulfatohirudin-Aktivität festgestellt anschließend an die Cotransformation mit Plasmid pLHK3. pLHL5 und pLHL7, enthaltend den gesamten PLI-Promoter, sind beide in der Lage, die Expression des Desulfatohirudins in A. niger Mutant An 8 voranzutreiben. Von den 50 Transformanten, die von den Cotransformations-Experimenten (Beispiel 9.1) genommen wurden, zeigen jeweils 10 Desulfatchirudin-Aktivität im Medium.

Die Expression des Desulfatohirudins in Mutante An 8 unter Steuerung des gesamten PLI-Promotors und unter Zuhilfenahme des PLI-Startpeptids wird daher reguliert durch Induzieren von Substratpektin und führt zur Sekretion von Desulfatohirudin in das Medium.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismen wurden unter dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Grisebachstr.8,3400 Göttingen, hinterlegt:

Mikroorganismen Hinterlegungsnummer Hinterlegungstag

Escherichia coli

BJ5183/pCG3B11 DSM3916 11. Dezember 1986

AspergillusnigerAn8 DSM 3917 11. Dezember 1986

Escherichia coli

BJ5183/pCG59D7 DSM3968 2. Februar1987

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches DNA-Sequenzen enthält, die für das Pektinlyase(PL)-Expressionssystem oder ein Derivat desselben kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit einem DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz enthält, die für das Pektinlyase-Expressionssystem oder ein Derivat desselben kodiert, transformierterWirt gezüchtet wird und das gewünschte rekombinante DNA-Molekül oder das Derivat desselben isoliert wird, oder daß es durch in-Vitro-Synthese hergestellt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül hergestellt wird, das den Promoter, die Signalsequenz und das Strukturgen mit oder ohne Terminator des PLI-Expressionssystems enthält.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül hergestellt wird, das eine DNA-Sequenz der Formel I oder ein Derivat derselben enthält.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül in Form des pCG3B11 hergestellt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül hergestellt wird, das die Promotersequenz zwischen den Nucleotiden-1- bis -688 umfaßt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül hergestellt wird, das die Signalsequenz zwischen den Nucleotiden 1 und 57 enthält.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül hergestellt wird, das das PLI-Strukturgen zwischen den Nucleotiden 58 und 1366 enthält.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül hergestellt wird, das das PLI-Strukturgen ohne die introne enthält.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül hergestellt wird, das den Terminator enthält, der sich zwischen den Nucleotiden 1367 und einem der Nucleotide 1570 bis 2029 erstreckt

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül hergestellt wird, das eine DNA-Sequenz der Formel I enthält, welche degeneriert ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül in Form eines rekombinanten Hybridvektors hergestellt wird.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül in Form eines Hybridvektors hergestellt wird, der das PLI-Strukturgen oder ein homologes Pektinlyasegen oder ein heterologes Strukturgen enthält.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül in Form eines Hybridvektors hergestellt wird, welcher das Markergen pyrA enthält.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül in. Form eines Hybridvektors pLHL5 hergestellt wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNA-Molekül in Form eines Hybridvektors pLHLT7 hergestellt wird.

16. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der transformierte Wirt, durch Behandlung eines Wirts unter Transformationsbedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit einem Selektionsmarkergen und Selektion derTransformanten hergestellt wird.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, daß Escherichia coli BJ5183/PCG3811 (DSM 3916) hergestellt wird.

18. Verfahren gemäß Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, daß Aspergillusniger An8 (DSM 3917) mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 und dem Selektionsmarkerplasmid pCG59d7 transformiert wird

19. Verfahren gemäß Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, daß Aspergillusniger An8 (DSM 3917) mit pLHK3, pLHL5 oder pLHLT7 und dem Selektionsmarkerplasmid pCG59d7 transformiert wird.