DE69023474T2

DE69023474T2 - Expressionssysteme in Pilzen.

Info

Publication number: DE69023474T2
Application number: DE69023474T
Authority: DE
Inventors: Frank Dr Buxton; Graaff Leendert Hendrik De; Den Broeck Henriette Catha Van; Jacob Prof Visser
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1990-01-29
Filing date: 1990-12-20
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2010-12-21
Also published as: PT96310A; CA2032035A1; KR910014507A; AU645768B2; NO905393D0; MX23984A; DE69023474D1; NO309283B1; FI103206B; HUT56886A; IE904481A1; EP0439997A1; GR3018044T3; PT96310B; JP3329472B2; FI906123A; HU210989B; ES2079468T3; HU908325D0; IE68457B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik und stellt neue DNA-Moleküle, die einen fungalen Promotor umfassen, bereit. Die neuen DNA-Moleküle sind zur Konstruktion von Hybridvektoren, welche in Fadenpilzen Gene exprimieren, geeignet.

Hintergrund der Erfindung

Obwohl in der Gentechnik bereits zahlreiche Polypeptidexpressionssysteme für procaryotische und eucaryotische Wirte bekannt sind, besteht fortlaufender Bedarf für neue Systeme, die Vorteile gegenüber bekannten Systemen aufweisen.
Sehr breite Verwendung als Wirte finden procaryotische Escherichia coli und die eucaryotische Hefe, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, wofür eine Vielzahl verschiedener Expressionsvektoren, hauptsächlich Plasmide, entwickelt wurden. Der Nachteil von Escherichia coli als Wirte besteht darin, daß sie die Polypeptide nicht glycosylieren können. Hefen glycosylieren zwar, ähnlich E. coli scheiden sie jedoch häufig keine Polypeptide in das Nährmedium aus, sondern sie scheiden sie lediglich in den periplasmatischen Raum aus. Höhere eucaryotische Wirte, wie Krebszellen von Säugern, sind in der Lage, sowohl zu glycosylieren, als auch in das Nährmedium auszuscheiden, jedoch ist ihre Züchtung sehr langsam und aufwendig und es besteht die Gefahr, daß onkogene Nucleinsäuren, zusammen mit dem gewünschten Peptid isoliert werden könnten.
Bei der Suche nach anderen Wirten wurden Fadenpilze, wie Neurospora crassa, Aspergillus nidulans und Aspergillus niger, untersucht. Deren Anwendung blieb in der Gentechnik zurück, hauptsächlich aufgrund eines fehlenden geeigneten Transformationssystems. Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae enthalten Fadenpilze natürlicherweise keine Plasmide, die zur Einführung von Fremdgenen verwendet werden könnten. Es ist jedoch möglich, Fadenpilze mit Fremdplasmiden, die einen selektierbaren Marker enthalten, zu transformieren. Fast alle soweit für Fadenpilze beschriebenen Vektoren replizieren nicht autonom, wie die meisten Hefen dies ausführen, sondern sind in dem fungalen Chromosom integriert. Obwohl dies nur für eine geringe Häufigkeit zutrifft, gestaltet integrative Transformation vorteilhafterweise die Transformanten auch unter nichtselektiven Bedingungen mitotisch sehr stabil. Stabile Integration von mehr als 100 Kopien wurde mitgeteilt.
Der erste für Fadenpilze beschriebene Vektor enthielt das qa-2-Gen von Neurospora crassa als selektierbaren Marker [Case, M.E., Schweizer, M., Kushner, S.R. und Giles, N.H. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263; Case, M.E. (1982) in: Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander, A., DeMoss, D., Kaplan, S., Konisky, J., Savage, D. und Wolfe, R.S., Herausg.), Seiten 87-100, Plenum].
In Aspergillus nidulans, das einen Sexualzyklus aufweist und daher für klassische genetische Manipulationen zugänglich ist, wurden sowohl negative als auch positive Selektionssysteme auf der Grundlage auxotropher Marker oder dominanter Selektionsmarker gefunden. (Ballance et al., BBRC 112, 284, 1983; Tilburn et al., Gene 26, 205, 1983; Yelton et al., PNAS 81, 1470, 1984; Yelton und Timberlake, J. Cell. Biochem. Suppl. 9C, 173, 1985; Johnstone et al. EMBO J. 4, 1307, 1983; Tilburn et al., Gene 26, 205, 1983; Wernars et al., Curr. Genet. 9, 361, 1985; Kelly, J.M. et al., EMBO J. 4, 475, 1985).
Verglichen mit N. crassa oder A. nidulans ist A. niger der weitaus wichtigste Organismus, da er bei der industriellen Herstellung von Enzymen in breitem Maße verwendet wird, beispielsweise zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie. A. niger scheidet eine Vielzahl hydrolytischer Enzyme aus, beispielsweise Glucoamylase, α-Amylase, Pectinase, Cellulase, β-Glucanase, β-Galactosidase, Naringinase, Pentosanase, saure Protease und Ligninase, wobei der Glucoamylase - und Pectinasekomplex die wichtigsten sind.
Klassische Mutations- und Selektionsverf ahren bei A. niger haben ausgedehnte Stammverbesserungen für die Sekretion hydrolytischer Enzyme geschaffen. A. niger weist keinen bekannten Sexualzyklus auf. Mutationen können lediglich über meiotische Rekombination in selektierten Diploiden, gefolgt von Haploidbildung, kombiniert werden.
Das heterologe amds-Gen (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475, 1985) und argB-Gen (Buxton et al., Gene 37, 207, 1985; EP 184 438; WO 86/06097), beide erhalten von A. nidulans, oder das homologe pyrA-Gen (van Hartinsvelt et al., Mol. Gen. Genet. 206, 71-75, 1987; Goosen et al., Curr. Genet. 11, 499- 503, 1987) wurden als selektierbare Marker für die A. niger- Transformation verwendet.
A. niger ist der wichtigste Organismus für die industrielle Herstellung von pectinabbauenden Enzymen, beispielsweise Polygalacturonasen, Pectinlyasen oder Pectinesterasen.
Die Anwendungen von Pectinlyase, Pectinesterase, Polygalacturonase und Enzymgemischen davon bei der Obst- und Gemüseverarbeitung (Tabelle 1) wurden von der ursprünglichen Verwendung von Pectinenzymen zur Behandlung von Weichfrüchten, zur Gewährleistung hoher Fruchtausbeuten und Pigmenten nach dem Auspressen und zur Klärung von rohgepreßten Säften entwickelt. Technische Enzymzubereitungen enthalten bei der Verwendung für diese Verfahren Pectinesterasen, Polygalacturonasen und Pectinlyasen in verschiedenen Mengen neben anderen Enzymen, wie Arabinanasen, Galactanasen, Xylanasen, Cellulasen, β-1,4-Glucanasen, Glycosidasen und Proteasen.
Tabelle 1 (von Voragen, A.G.J., Food enzymes: prospects and limitation. In: J.P. Roozen et al., Herausg., Food Science: Basic Research for Technological Progress. PUDOC Wageningen, Niederlande, 1989): Verwendung von Polygalacturonasen und Gemischen davon in der Obst- und Gemüseindustrie. Enzyme Verwendung Polygalacturonase Pectinesterase+Polygalacturonase und/oder Pectinlyase Pectinesterase/Polygalacturonase/Pectinlyase+ (Hemi-) Cellulasen Mazeration, Zitrussaftstabilisierung/Viskositätsverminderung Saftklärung, Saft/Ölextraktion, Zitrusschalenöl, Zitrusfaserwäsche Verflüssigung, klare/trübe Säfte Erhöhung der natürlichen Produktextraktion Aufwertung von Biomasse/Futter
Durch die Verwendung von pectischen und cellulolytischen Enzymen können die Zellwände und Fruchtfasern zum Zustand fast völliger Verflüssigung abgebaut werden. Die Anwesenheit von Endo- als auch Exo-β-1,4-glucanasen (Cellulasen) sowie pectischen Enzymen ist essentiell (vergleiche Renard C.M.C.G. et al., Apple Protopectin: preliminary study of enzymatic extraction. In: Roozen J.P. et al., Herausg., Food Science: Basic Research for Technological Progress. PUDOC, Wageningen, Niederlande, 1989).
Polygalacturonase und Enzymgemische davon sind auch zur Verflüssigung und Verzuckerung von Biomasse geeignet, beispielsweise zur Herstellung von fermentierbaren Polysacchariden aus Pflanzenzellen (Beldman, G. et al., Enzyme Micros. Technol. 6, 503-507, 1984) oder für die Modifizierung von Pectinen (zur Übersicht siehe Voragen A.G.J. Food enzymes: prospects and limitations. In Roozen J.P. et al., dem genannten Werk).
In A. niger werden die Proteine des pectischen Komplexes nicht konstitutiv exprimiert. Unter induzierenden Bedingungen, d.h. in Gegenwart von Pectin oder Abbauprodukten davon, exprimiert A. niger die vorstehend genannten Enzyme, vorausgesetzt, daß andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose oder Saccharose, eingeschränkt sind.
Aufgrund der industriellen Bedeutung von A. niger und dessen Enzymen gibt es fortlaufenden Bedarf für neue A. niger-Expressionssysteme zur Stammverbesserung und/oder Herstellung von homologen oder heterologen Genprodukten. Von starkem Interesse ist beispielsweise die Herstellung von einzelnen pectinabbauenden Enzymen oder von definierten Gemischen davon.
Die vorliegende Erfindung stellt neue DNA-Moleküle bereit, umfassend einen vorteilhaften Promotor, abgeleitet vom A. niger-Pyruvatkinasegen (pki), das zur Konstruktion neuer Vektoren für die Expression homologer oder heterologer struktureller Gene bei Fadenpilzen, insbesondere in A. niger, verwendet werden kann.
Das die A. niger-Pyruvatkinase (systematischer Name ATP-Pyruvatphosphotransferase, EC 2.7.1.40) codierende Gen wird stark exprimiert, was ausweist, daß die Transkription unter der Kontrolle eines starken Promotors liegt.
Ein 5kb BglII/HindIII-Restriktionsfragment des Genoms von A. niger N 400, welches mit einem Fragment aus dem Codierungsbereich des Hefepyruvatkinasegens hybridisiert, wurde geklont. Der erhaltene Klon wurde pGW1100 genannt. Cotransformationsversuche mit dem Plasmid pGW613, umfassend ein pyrA-Gen als Selektionsmarker und mit pGW1100 führten zu steigenden Mengen an Pyruvatkinase bei 8 von 11 untersuchten Transformanten. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlußfolgert, daß pGW1100 für A. niger-Pyruvatkinase codiert und daß es das vollständige funktionsfähige Gen umfaßt (L.H. deGraaff, The structure and expression of the pyruvate kinase gene of Aspergillus nidulans and Aspergillus niger. Dissertation, Landwirtschaftliche Universität Wageningen, 1989).
Ausgehend von diesem Stand der Technik wurden neue DNA-Moleküle, die den pki-Promotor umfassen, in der vorliegenden Erfindung entwickelt und wurden zur Konstruktion neuer Expressionsvektoren zur Überproduktion eines homologen Genprodukts, beispielsweise Pectinlyase, oder für die Expression eines heterologen Strukturgens in A. niger, beispielsweise einem Interferongen, verwendet.

Aufgabe der Erfindung

Aufgaben der Erfindung sind neue DNA-Moleküle, die den A. niger-pki-Promotor umfassen, Hybridvektoren, geeignet zur Expression von Strukturgenen, unter der Kontrolle dieses Promotors, Wirte, transformiert mit den neuen Hybridvektoren, und Verfahren zur Herstellung der neuen DNA-Moleküle, Hybridvektoren und transformierten Wirten und zur Herstellung von rekombinanten Polypeptiden mit Hilfe der transformierten Wirte.

DNA-Moleküle, die den A. niger-Pyruvatkinasepromotor umfassen

Die vorliegende Erfindung betrifft einen A. niger-Pyruvatkinase-(pki)-promotor, der ein DNA-Molekül umfaßt, das die Nucleotidsequenz mit der Sequenzidentifizierungsnummer (SEQ ID NR.) 1 aufweist oder ein Derivat oder ein Fragment davon mit Promotoraktivität.
Die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 1 umfaßt das gesamte funktionsfähige Pyruvatkinasegen pki von A. niger, einschließlich des Promotors. Der pki-Promotor erstreckt sich von der Nucleotidposition 1 bis zu dem ersten Nucleotid des für Pyruvatkinase codierenden Bereiches in Position 1042. Der pki-Promotor bindet an die RNA-Polymerase sowie an regulatorische Proteine und kann die Expression eines strukturellen Gens, das in funktionsfähigem Zustand damit verbunden ist, steuern. Der A. niger-pki-Promotor ist ein starker Promotor. Die Erfindung betrifft folglich ein DNA-Molekül einer Nucleotidsequenz, die sich von etwa Position 1 bis etwa 1042 erstreckt oder einem Fragment oder Derivat dieses Promotors, der eine Promotoraktivität beibehält, welche reguliert werden kann oder nicht.
Der vollständige pki-Promotor von A. niger kann reguliert werden, da er regulatorische Elemente umfaßt, die das Ausmaß der Transkription von der zur Züchtung von den Promotor umfassenden A. niger-Zellen verwendeten Kohlenstoffquelle abhängig machen. Die Verwendung einer gluconeogenen Kohlenstoffquelle, wie Acetat, führt zu einem geringen Transkriptionsausmaß, wohingegen die Verwendung einer glycolytischen Kohlenstoffquelle, beispielsweise Glucose, zu einer Transkription hohen Ausmaßes führt.
In dem von der Nucleotidsequenz mit SEQ ID NR. 1 umfaßten Promotor ist eine potentielle TATA-Box zwischen den Nucleotidstellen 927 und 934 eine potentielle CAAT-Box zwischen den Stellen 830 und 836 und ausgedehnte CT-reiche Regionen (CT-Blöcke) zwischen Positionen 848 und 1041 angeordnet. Letzteres findet man in Promotor/Regulationsbereichen von vielen stark exprimierten Genen, die von Hefen und Pilzen herrühren.
Ein Fragment der Erfindung ist beispielsweise ein Fragment, ausgewählt aus der Gruppe von Fragmenten mit Promotoraktivität, das mit einem der Nucleotide in Position 1 bis etwa Position 950 beginnt und mit einem Nucleotid etwa in Position 1041 in der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 1 endet. Bevorzugt ist ein Fragment, beginnend mit einem Nucleotid in der ungefähren Position 300 und endend bei einem Nucleotid etwa in der Position 1041 in der Nucleotidsequenz. Die erfindungsgemäßen Fragmente können beispielsweise bei einer Restriktionsenzymschnittstelle, angeordnet innerhalb der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 1, beginnen, beispielsweise der BamHI-Stelle (in etwa Position 300) oder den folgenden Stellen (ungefähre Positionen in Klammern): SphI (441), SmaI (859), XmaI (859).
Ein am meisten bevorzugtes Fragment ist das Fragment, das an der BamHI-Stelle etwa in Position 300 beginnt und sich bis zu Position 1041 erstreckt. Dieses Fragment ist Teil des BamHI/PvuII-Fragments, das sich von der BamHI-Stelle in etwa Position 300 bis zur PuvII-Stelle in etwa Position 1352 erstreckt und das nachstehend in den Beispielen zur Inserierung einer Restriktionsenzymschnittstelle verwendet wird.
Ein erfindungsgemäßes Derivat ist beispielsweise eine Mutante, ein rekombinantes Derivat oder ein rekombinantes Derivat einer Mutante des pki-Promotors, umfaßt in dem DNA-Molekül, das die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 1 aufweist oder ein Fragment davon. Ein erfindungsgemäßes Derivat umfaßt eine Sequenz mit pki-Promotoraktivität, die reguliert werden kann oder nicht.
Eine erfindungsgemäße Mutante kann eine natürlich vorkommende oder vorzugsweise eine künstliche Mutante sein. Mutanten des pki-Promotors der Erfindung sind insbesondere jene mit neuen Restriktionsenzymspaltstellen, beispielsweise für die Restriktionsenzyme NsiI, BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, SalI, NcoI und dergleichen. Bevorzugt ist eine Mutante, umfassend eine neue Restriktionsenzymspaltstelle in oder etwa bei Position 1041 der Sequenz mit SEQ ID NR. 1, die zur Insertion eines Strukturgens 3' des Promotors verwendet werden kann, das dann in funktionsfähigem Zustand damit verbunden ist. Eine derartige Mutante ist beispielsweise dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 2, die Sequenz, die sich zwischen der Stelle 1034 und 1054 in der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 1 erstreckt, substituiert und dadurch, daß eine NsiI-Stelle unmittelbar benachbart zur Stelle 1041 von SEQ ID NR. 1 angeordnet wird.
Eine erfindungsgemäße Mutante ist auch eine Mutante eines Fragments, dessen Bedeutung vorstehend dafür angegeben ist. Eine bevorzugte Mutante von einen Fragment umfaßt stromabwärts des pki-Promotors eine neue Restriktionsenzymschnittstelle zur funktionsfähigen Bindung eines Strukturgens an den Promotor. Eine derartige bevorzugte Mutante von einem Fragment ist beispielsweise umfaßt in dem 1053 Bp BamHI/PvuII-Fragment oder dem 742 Bp BamHI/NsiI-Fragment, das in der M13mp18-PK-(BamHI-NsiI-PvuII)-RF-DNA umfaßt ist. Das 1053 Bp BamHI/PvuII-Fragment von M13mp18-PK (BamHI-NsiI- PvuII) weist eine Nucleotidsequenz auf, die sich von der BamHI-Stelle in etwa Position 300 zu der PvuII-Stelle etwa in Position 1352 einer Sequenz mit der SEQ ID NR. 1 erstreckt, welche mutiert ist, indem die Sequenz mit SEQ ID NR. 2, die Nucleotide der Stelle 1034 bis 1054 substituiert. Das 742 Bp BamHI/NsiI-Fragment erstreckt sich von der BamHI-Stelle bis zur NsiI-Stelle in dem substituierten Bereich. In beiden Mutanten ist die NsiI-Stelle unmittelbar benachbart zur Stelle 1041 von SEQ ID NR. 1 angeordnet.
Ein erfindungsgemäßes Derivat ist auch ein rekombinantes DNA-Molekül. Ein derartiges rekombinantes DNA-Molekül ist beispielsweise dadurch gekennzeichnet, daß es einen an das 3'- und/oder 5'-Ende eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls mit pki-Promotoraktivität gebundenen Oligonucleotidlinker enthält, welcher eine erfolgreiche Bindung zu anderen DNA-Molekülen bereitstellt, beispielsweise Vektorsequenzen. Der Linker kann eine oder mehrere Restriktionsenzymschnittstellen oder teilweise einsträngige Enden (klebrige Enden) und/oder glatte Enden umfassen.
Ein erfindungsgemäßes Derivat ist auch ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend ein DNA-Molekül der Erfindung mit pki-Promotoraktivität und ein homologes oder heterologes Strukturgen mit oder ohne Introns, ausgenommen das homologe pki-Strukturgen, das in funktionsfähigem Zustand gebunden ist mit dem pki-Promotor und gegebenenfalls einen Oligonucleotidlinker. Ein erfindungsgemäßes Derivat kann außerdem eine Expressionsleitsequenz zusätzlich zu dem pki-Promotor umfassen, der ebenfalls in funktionsfähigem Zustand mit dem Strukturgen verbunden ist. Eine derartige Expressionsleitsequenz, beispielsweise ein Verstärker, ein transkriptionaler Terminator oder eine Signalsequenz, beispielsweise eine Signalsequenz eines A. niger-Pectinlyasegens, z.B. für PLA, B, C oder D, oder Polygalacturonasegens, z.B. für PGI, PGC oder PGII.
Homologe Strukturgene sind von A. niger abgeleitete Gene. Sie codieren beispielsweise für Enzyme, die vorzugsweise in der Industrie, beispielsweise in der Nahrungsmittel- und der Futterindustrie, einsetzbar sind. Derartige Enzyme sind beispielsweise pectinolytische Enzyme, wie Pectinesterase, endo- und exo-wirkende Polygalacturonase (PG), Pectinlyase (PL), Rhamnogalacturonase oder Arabinasen, Galactanasen, Xylanasen, Cellulasen, β-1,4-Glucanasen, Glycosidasen und dergleichen.
Die Nucleotidsequenz des Strukturgens für A. niger- PLD wird in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer EP-A2-0 278 355 offenbart. Die Strukturgene für weitere A. niger-PL, insbesondere PLA, B, C, E und F, werden in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer EP-A2-0 353 188 offenbart. Die Strukturgene für A. niger-PG, insbesondere PGII, werden in der Britischen Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 8919884.0 offenbart.
E. coli-HB101- oder JM109-Zellen, transformiert mit Plasmiden pGW 820, 830, 850 und 1800, die A. niger-Strukturgene umfassen, sind gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig, hinterlegt. Nucleotidsequenzen von Teilen des Strukturgens PGII, die für das N- bzw. C-terminale Ende codieren, sind in dem Sequenzlisting dargestellt. Für weitere Informationen siehe Tabelle 2. Tabelle 2 Strukturgen für Transformierte E. coli Hinterlegungsnummer 3(N-terminal) 4(C-terminal)
Homologe Gene, die innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung liegen, schließen ebenfalls Derivate der vorstehend genannten PL- und PG-Gene, einschließlich Fragmente, Mutanten und DNA-Sequenzen, die gemäß dem genetischen Code erzeugt werden, indem eine unbeschränkte Anzahl an Nucleotiden durch andere Nucleotide ohne Anderung der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids ersetzt wird, ein.
Heterologe Strukturgene stammen von Viren, procaryotischen Zellen oder eucaryotischen Zellen und können abgeleitet sein von genomischer DNA oder von cDNA, hergestellt über den mRNA-Weg, oder können chemisch synthetisiert werden, und codieren für eine Vielzahl geeigneter Polypeptide, einschließlich glycosylierter Polypeptide, insbesondere höheren eucaryotischen Ursprungs, beispielsweise von Säugern, wie tierischen oder insbesondere menschlichen Ursprungs, wie Enzyme, welche beispielsweise zur Herstellung von Nährstoffen und zur Durchführung enzymatischer Reaktionen in der Chemie verwendet werden können oder Polypeptide, die für die Behandlung von menschlichen oder tierischen Erkrankungen oder zu deren Verhinderung geeignet und von Wert sind, beispielsweise Hormone, Polypeptide mit immunomodulatorischen, antiviralen und Antitumoreigenschaften, Antikörper, virale Antigene, Impfstoffe, Gerinnungsfaktoren, Nahrungsmittel und dergleichen.
Beispiele derartiger Strukturgene sind beispielsweise jene, die für Hormone codieren, wie Secretin, Thymosin, Relaxin, Calcitonin, luteinisierendes Hormon, Parathyroidhornon, Andrenocorticotropin, Melanocyten-stimulierendes Hormon, β- Lipotropin, Urogastron oder Insulin, Wachstumsfaktoren, wie Hautwachstumsfaktor, insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF), beispielsweise IGF-I und IGF-II, Mastzellenwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, Glia-abgeleiteter Nervenwachstumsfaktor oder Transformationsfaktor (TGF), wie TGFα oder TGFβ, beispielsweise TGFβ1, β2 oder β3, Wachstumshormon, wie menschliches oder Rinderwachstumshormon, Interleukin, wie Interleukin-1 oder -2, Humanmakrophagenmigrationsinhibitorfaktor (MIF), Interferone, wie Human-α-Interferon, beispielsweise Interferon-αA, αB, αD oder αF, β-Interferon, γ-Interferon oder ein Hybridinterferon, beispielsweise αA-αD- oder ein αB- αD-Hybridinterferon, insbesondere das Hybridinterferon BDBB, Proteinaseinhibitoren, wie α&sub1;-Antitrypsin, SLPI und dergleichen, Hepatitisvirusantigene, wie Hepatitis-B-Virusoberflächen- oder -kernantigen oder Hepatitis A-Virusantigen oder Hepatitis-Nicht-A-Nicht-B-Antigen, Plasminogenaktivatoren, wie Gewebsplasminogenaktivator oder Urokinase, Tumornekrosefaktor, Somatostatin, Renin, β-Endorphin, Immunoglobuline, wie leichtkettiges oder schwerkettiges Immunoglobulin D, E oder G, oder Human-Maus-Immunoglobuline, Immunoglobulinbindungsfaktoren, wie Immunoglobulin-E-Bindungsfaktor, beispielsweise sCD23, Calcitonin, Humancalcitonin-verwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX oder VIIIc, Erythropoietin, Eglin, wie Eglin C, Hirudin, Desulfatohirudin, wie Desulfatohirudin-Variante HV1, HV2 oder PA, Humansuperoxiddismutase, virale Thymidinkinase, β-Lactamase, Glucoseisomerase. Bevorzugte Gene sind jene, die für Human-α-interferon oder Hybridinterferon codieren, insbesondere Hybridinterferon BDBB, Humangewebsplasninogenaktivator (t-PA), Hepatitis-B-Virusoberflächenantigen (HBVsAg), insulinähnlicher Wachstumsfaktor I und II, Eglin C und Desulfatohirudin, beispielsweise Variante HV1. In einem erfindungsgemäßen DNA- Molekül ist der vorliegende Promotor in funktionsfähigem Zustand an den Polypeptid codierenden Bereich gebunden, so daß eine wirksame Expression des Polypeptids gewährleistet ist.
Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle, einschließlich Fragmente und Derivate davon, können zum Absuchen von DNA- Genbanken für weitere DNA oder mRNA verwendet werden.
Die Erfindung betrifft außerdem Hybridvektoren, die als Insert ein die pki-Promotoraktivität umfassendes DNA-Molekül der Erfindung umfassen. Diese DNA-Moleküle der Erfindung schließen Promotoren, Fragmente oder Derivate davon, beispielsweise Mutanten, oder die Fusion eines Strukturgens, das vorstehend genannt wurde, mit dem Promotor oder einem Fragment davon ein. Die erfindungsgemäßen Hybridvektoren sind zur Klonierung in Wirten geeignet, wie Bakterien, Pilzen oder tierischen Zellen. Solche Hybridvektoren werden abgeleitet von beliebigen Vektoren, die auf dem Fachgebiet der Gentechnik geeignet sind, wie von Phagen, Cosmiden, Plasmiden oder chromosomaler DNA, wie Derivaten vom Phagen λ, beispielsweise NM 989, oder Phagen M13, beispielsweise M13mp18- oder M13mp19-Phagen-DNA, bakterielle Plasmide, beispielsweise pBR322, pUN121, pUC18 oder Hefeplasmide, beispielsweise Hefe-2u-Plasmid oder auch chromosomaler DNA, abgeleitet von Aspergillus, beispielsweise A. niger, z.B. jene, bereitgestellt durch die EP-A-184 438, oder Defektphagen oder Defektplasmide in Gegenwart eines Helferphagen oder eines Helferplasmids, welche die Replikation des Defektphagens oder des Defektplasmids erlauben, beispielsweise M13(+)KS-Vektor in Gegenwart von beispielsweise M13K07-Helferphagen.
Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor umfaßt zusätzlich zu den DNA-Molekülen der Erfindung eine Replikationsstelle und falls erforderlich, ein Markergen und/oder eine zusätzliche Expressionsleitsequenz, die von dem pki-Promotor verschieden ist, beispielsweise einen Verstärker, einen transkriptionalen Terminator, einen ribosomalen Bindungsbereich, eine translationale Start- oder Stoppstelle oder eine Signalsequenz, beispielsweise eine Signalsequenz des Strukturgens für A. niger-Pectinlyase A, B, C oder D, oder Polygalacturonase, beispielsweise PGI oder II.
pGW1100 ist kein erfindungsgemäßer Hybridvektor.
Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor kann jedoch Fragmente von pGW1100 mit pki-Promotoraktivität umfassen. Ein Beispiel eines derartigen Hybridvektors ist M13mp18-PK (BamHI-PvuII), umfassend das 1053 Bp BamHI/PvuII-Restriktionsfragment, das sich von der BamHI-Stelle bei etwa Nucleotidstelle 300 bis zur PvuII-Stelle in etwa Nucleotidstelle 1352 der Sequenz SEQ ID NR. 1 erstreckt.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Hybridvektor ist ein derartiger, der eine Mutation in dem A. niger-pki-Promotor umfaßt. Diese Mutation kann eine neue Restriktionsenzymschnittstelle erzeugen, insbesondere eine derartige, die für die Insertion eines Strukturgens, das dann an den pki-Promotor in funktionsfähigem Zustand gebunden ist, geeignet ist. Ein Beispiel eines derartigen Vektors ist insbesondere M13mp18-PK (BamHI-NsiI-PvuII), umfassend ein erfindungsgemäßes mutiertes DNA-Molekül mit einer neuen NsiI-Stelle an der Translationsstartstelle des A. niger-Pyruvatkinasestrukturgens.
Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor kann auch ein homologes Strukturgen außer dem A. niger-Pyruvatkinasestrukturgen oder ein heterologes Strukturgen umfassen, das in funktionsfähigem Zustand an den pki-Promotor gebunden ist. Ein derartiger Hybridvektor ist beispielsweise pPK-PLB, der das 742 Bp BamHI/NsiI-Fragment von M13mp18-PK (BamHI-NsiI-PvuII) und 2,6 kB BamHI/NsiI-Fragment von pGW830 umfaßt. Dieser Hybridvektor umfaßt das PLB codierende Strukturgen, einschließlich dessen Signalsequenz.
Bevorzugte Hybridvektoren sind pPKI-IFN-2, pPKIssIFN- 2, pPK-PLB, M13mp18-PK (BamHI-PvuII), M13mp18-PK (BamHI-NsiI- PvuII).

Verfahren zur Herstellung der DNA-Moleküle, die den A. niger-pki-Promotor umfassen, von Hybridvektoren, die ein derartiges DNA-Molekül umfassen, und Wirten, die mit den Hybridvektoren transformiert werden

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls der Erfindung, beispielsweise ein Verfahren, umfassend die Herstellung eines derartigen DNA-Moleküls durch eine in vitro-Synthese oder Züchtung eines Wirtes, der eine derartige DNA-Sequenz umfaßt.
Die Züchtung von Wirten wird in einem üblichen Nährmedium ausgeführt, das mit chemischen Verbindungen angereichert oder vermindert wird, was eine negative oder positive Selektion der Transformanten erlaubt, d.h. derartige Wirte, welche das gewünschte DNA-Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker enthalten, von den Nichttransformanten, d.h. derartigen Wirten, denen das gewünschte DNA-Molekül fehlt.
Ein auf dem Fachgebiet geeigneter beliebiger transformierbarer Wirt kann verwendet werden, beispielsweise Bakterien, wie E. coli, Pilze, wie Saccharomyces cerevisiae, oder insbesondere Fadenpilze, wie Aspergillus, beispielsweise A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori, A. japonicus und insbesondere A. niger. Die Transformation der Wirte wird durch übliche Verfahren ausgeführt.
Ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül kann aus Aspergillus niger erhalten werden, der das Pyruvatkinasegen (pki) enthält, insbesondere aus einer Genbank davon oder auch über eine mRNA, die zur Herstellung eines cDNA-Moleküls verwendet wird.
Im folgenden wird die Herstellung eines DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung im einzelnen beschrieben.
Eine Genbank kann beispielsweise durch Teilaufschluß von Genom-DNA eines A. niger-Stamms, beispielsweise NW756 oder N400, mit beispielsweise Sau3AI oder MboI, und Klonieren der DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht in einem geeigneten Wirtsvektor, beispielsweise einem E. coli-Plasmid pUN121 oder einem Lambda-Vektor, beispielsweise EMBL4, hergestellt werden.
Um die Genbank für DNA-Sequenzen, die pki umfassen, erfolgreich abzusuchen, ist eine hybridisierende DNA-Sonde erforderlich. Diese kann eine synthetische DNA-Sonde oder ein anderes Pyruvatkinasegen oder ein Teil davon, der A. nigerpki hybridisiert, beispielsweise das Hefepyruvatkinasestrukturgen, umfaßt in dem Plasmid pPYK1 (Burke et al., 1983), sein.
Zum Absuchen werden die DNA-Sonden durch an sich bekannte Verfahren radioaktiv markiert, beispielsweise am 5'- Ende unter Verwendung von γ³²P-ATP- und T4-Kinase. Wirtsmikroorganismen, die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung als Insert tragen, werden durch Hybridisierung mit einer markierten DNA-Sonde auf Filterreplikas der Genbank identifiziert. Die mit der Sonde hybridisierenden DNA-Moleküle werden isoliert und falls erwünscht, unter Verwendung von üblichen Verfahren subkloniert. Das Plasmid pGW1100 ist ein derartiger Subklon eines genomen Klons aus einer A. niger-N400-Genbank. Es umfaßt ein 5,0 kBp BglII/HindIII-Fragment des A. niger-Genoms, das das gesamte funktionsfähige Gen für die A. niger- Pyruvatkinase umfaßt.
Die identifizierten pki- oder Genfragmente werden dann sequenziert. Die gesamte Sequenz des funktionsfähigen pki von A. niger, umfaßt in pGW1100, wird in einen Sequenzlisting unter SEQ ID NR. 1 wiedergegeben.
Das Plasmid pGW1100 wird zur Herstellung von DNA-Molekülen der Erfindung verwendet. Derartige DNA-Moleküle werden in üblicher Weise durch Anwenden üblicher Restriktionsenzyme, Linker, Mutations-, Ligierungs-, Verstärkungs- und Isolationsverfahren hergestellt.
Fragmente eines DNA-Moleküls mit der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 1 werden beispielsweise durch ein Verfahren hergestellt, umfassend die Behandlung des DNA-Moleküls mit Nucleasen, beispielsweise Exonucleasen, wie Ba131 oder ExoIII oder Endonucleasen, wie Restriktionsenzyme.
Derivate eines DNA-Moleküls mit einer Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 1 oder einem Fragment davon werden beispielsweise durch Mutagenese gemäß üblichen Verfahren [siehe Übersichtsartikel von M.J. Zoller und M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein und D. Shortle, Science 229, 1193 (1985) oder K. Norris et al., Nucl. Acids Res. 11, 5105 (1983)], beispielsweise wie in Beispiel 2.1.2. nachstehend beschrieben, hergestellt.
Eine Mutante, die eine neue Restriktionsstelle enthält, kann beispielsweise durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung eines mutagenen Oligonucleotids gemäß üblichen Verfahren hergestellt werden. Ein Beispiel für ein derartiges mutagenes Oligonucleotid zum Einführen einer Mutation in die Sequenz mit SEQ ID NR. 1 ist das unter SEQ ID NR. 2 wiedergegebene DNA-Molekül.
Ein rekombinantes Derivat eines DNA-Moleküls mit der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 1 oder ein Fragment oder eine Mutante davon kann beispielsweise durch rekombinante DNA-Technologie, zum Beispiel durch ein Verfahren, umfassend Schneiden eines derartigen DNA-Moleküls, Fragments oder Mutante davon mit einem Restriktionsenzym und/oder dessen Ligieren mit einem weiteren DNA-Molekül, beispielsweise mit einem Oligonucleotidlinker oder DNA-Molekül, das ein Strukturgen, eine Signalsequenz und/oder einen Terminatorbereich enthält, hergestellt werden.
Alle DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können auch durch eine in vitro-Synthese gemäß üblichem Verfahren hergestellt werden. Die in vitro-Synthese ist besonders zur Herstellung von kleineren DNA-Molekülen der Erfindung anwendbar.
Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor wird gemäß üblichen Verfahren der Gentechnik hergestellt, z.B. durch ein Verfahren, umfassend Ligieren eines auf dem Gebiet der Gentechnik geeigneten Vektors, der linearisiert ist, beispielsweise durch Schneiden mit einem Restriktionsenzym mit einem DNA-Molekül der Erfindung, Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit dem Ligierungsgemisch und Identifizieren und/oder Selektieren der Transformanten.
Wirtszellen werden durch ein übliches Verfahren transformiert und die Transformanten werden beispielsweise durch ihre Resistenz z.B. gegen Tetracyclin oder durch Komplementation von auxotrophen Markern, beispielsweise pyrA, selektiert.
Insbesondere werden die beschriebenen Expressionsvektoren in geeigneten E. coli-Wirtsstämmen verstärkt wie HB101, JM109, MH1, DH5α und dergleichen, durch übliche Verfahren transformiert und selektiert. Die verstärkte Plasmid- DNA wird aus den Bakterien durch übliche Verfahren isoliert, insbesondere wie bei Birnboim & Doly (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523, 1979) beschrieben.
Ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül oder ein erfindungsgemäßer Hybridvektor, insbesondere ein derartiger, der ein homologes oder heterologes Strukturgen umfaßt, kann ebenfalls zur Transformation von Fadenpilzen, wie Aspergillus, Trichoderma, Penicillium oder Cephalosporium, beispielsweise A. nidulans, A. japonicus, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori und insbesondere A. niger, verwendet werden.
Um eine Selektion der transformierten von den nichttransformierten Pilzen zu gestatten, können die erfindungsgemäßen Hybridvektoren einen Selektionsmarker tragen oder alternativ können die Pilze mit einem zweiten Vektor, der einen derartigen Selektionsmarker enthält, cotransformiert werden. Wie in anderen Systemen ist ein derartiger Selektionsmarker ein exprimierbares Strukturgen, dessen exprimiertes Polypeptid Beständigkeit gegen Verbindungen bereitstellt, die für den Rezipienten toxisch sind oder die das Enzymsystem einer Mutante, denen ein derartiges essentielles Polypeptid fehlt, ergänzt. Derartige Markergene sind beispielsweise die bekannten qa-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS- oder argB-Gene.
Wie in EP-A-278 355 beschrieben, wurde ein Markergen, genannt pyrA, aus der Genbank von A. niger isoliert, welche verwandt ist oder eine ähnliche Funktion hat wie pyrG von A. nidulans und pyr4 von N. crassa, nämlich die Herstellung des Enzyms Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase. Dieses Enzym katalysiert die Decarboxylierung von Orotidin-5'-phosphat zu Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch von Fluororotsäure zu dem toxischen Fluoruridin. Von E. coli Bg5183/pCG59D7, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 3968, wurde das Plasmid pCG59D7, das das pyra-Gen umfaßt, isoliert und zur Cotransformation einer A. niger-pyrA&supmin;-Mutante verwendet. Eine derartige pyrA&supmin;- Mutante ist im Orotidin-5'-phosphatdecarboxylasegen beschädigt und ist daher nicht in der Lage, das entsprechende Enzym zu erzeugen. Derartige Mutanten sind beispielsweise A. niger N593 oder A. niger An8, letztere hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 3917. Die Mutanten werden durch Behandlung von Conidiumsporen von A. niger unter mutierender UV-Bestrahlung erzeugt und die in Gegenwart von Fluororotsäure und Uridin überlebende Kolonien werden ausgewählt. In Gegenwart von Fluororotsäure und in Abwesenheit von Uridin überlebende Kolonien werden verworfen.
Die Erfindung betrifft außerdem Wirte, transformiert mit einem Hybridvektor der Erfindung. Derartige Transformanten sind beispielsweise Bakterien, wie E.coli oder Fadenpilze, wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium und insbesondere A. nidulans, A. japonicus, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori oder vorzugsweise A. niger, beispielsweise A. niger An8 oder N593.
Besonders bevorzugt ist E. coli JM101 oder DH5α, transformiert mit pPKI-IFN-2, pPKIssIFN-2 oder pPK-PLB, Aspergillus niger N593 oder An8, transformiert mit pPK-PLB, pPKI-IFN-2 oder pPKIssIFN-2 und gegebenenfalls mit dem Selektionsmarkerplasmid pGW613 oder pCG59D7.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung derartiger Transformanten, umfassend die Behandlung eines Wirts unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül oder einem Hybridvektor der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit einem Selektionsmarkergen und falls erforderlich, Selektion der Transformanten.

Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden dadurch gekennzeichnet, daß ein Strukturgen, das für ein Polypeptid codiert, beispielsweise jene, deren Bedeutung vorstehend angegeben wurde, vorzugsweise jene, die für ein Human-α-interferon oder ein Hybridinterferon codieren, insbesondere Hybridinterferon BDBB, Humangewebsplasminogenactivator (t-PA), Hepatitis B-Virusoberflächenantigen (HBVsAg), insulinähnlicher Wachstumsfaktor I und II, Eglin C und Desulfatohirudin, beispielsweise Variante HV1, in funktionsfähigem Zustand an den pki-Promotor gebunden ist und in einem geeigneten Wirt exprimiert wird. Falls erforderlich, wird das Polypeptid in üblicher Weise isoliert. In Abhängigkeit von der Konstruktion des Vektors werden die Produkte entweder in der Wirtszelle erzeugt oder wenn eine Signalsequenz vorliegt, werden sie in der Zelle erzeugt und ausgeschieden. Ein geeigneter Wirt ist vorzugsweise eine Aspergillusspezies, beispielsweise A. niger, insbesondere A. niger An8 oder N593. Ein geeigneter Wirt ist ebenfalls ein weiterer Fadenpilz, beispielsweise Neurospora crassa oder eine Hefe, zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae oder Kluyveromyces lactis.
Es ist möglich, ein einzelnes Genprodukt zu erzeugen, wobei verschiedene Verfahren angewendet werden können. Beispielsweise ist ein Verfahren zur Erzeugung einer einzelnen Polygalacturonase PG oder Pectinlyase PL, vorzugsweise PLB, dadurch gekennzeichnet, daß ein geeigneter Wirt, der nicht in der Lage ist, PG oder PL zu exprimieren oder der PG oder PL in geringen Mengen exprimiert, mit einem Hybridvektor transformiert wird, der ein Strukturgen umfaßt, welches für ein PG oder PL, beispielsweise PLB, codiert, und das Gen expriniert. Unter Verwendung des pki-Promotors als Kontrollbereich ist es nun auch möglich, ein einzelnes Genprodukt herzustellen, beispielsweise PLB in einem geeigneten transformierten Wirt, der das entsprechende oder ein verwandtes endogenes Genprodukt(e) , beispielsweise PLA, B, C, D, E oder F nur unter induzierenden Bedingungen erzeugt, beispielsweise wenn Pectin oder Pectinabbauprodukte in dem Medium vorliegen, durch Züchten des transformierten Wirtes unter Bedingungen, die keine Expression des endogenen Strukturgens beziehungsweise der endogenen Strukturgene, sondern nur die Expression des Strukturgens, welches sich unter der Steuerung des pki-Promotors befindet, erlaubt. Eine derartige Bedingung liegt vor, wenn beispielsweise ein Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle verwendet wird. Wenn ein Wirt verwendet wird, der nicht in der Lage ist, PG oder PL zu exprimieren oder wenn Bedingungen angewendet werden, die die Erzeugung von endogenem PL nicht zulassen, kann das einzelne PG oder PL in reiner Form erhalten werden, was bedeutet, entweder mit PG oder PL nicht verunreinigt.
Das einzelne Genprodukt, das in einem geeigneten Wirt, transformiert mit einem DNA-Molekül oder einem Hybrid- Vektor der Erfindung, der für ein derartiges Genprodukt codiert, erzeugt wird und physiologisch verträgliche Salze davon sind ebenfalls Gegenstände der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt sind Enzyme von A. niger, insbesondere jene, die in der Nahrungsmittel- und Futterindustrie verwendbar sind, beispielsweise PG oder PL, insbesondere PLB. Die Erfindung betrifft die Polypeptide, wenn immer durch ein erfindungsgemäßes Verfahren hergestellt.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von enzymatischen Zusammensetzungen, die ein oder mehrere Polypeptide umfassen, hergestellt durch ein erfindungsgemäßes Verfahren, beispielsweise ein einzelnes PL und/oder ein Derivat davon mit PL-Aktivität und/oder ein einzelnes PG und/oder ein Derivat davon mit PG-Aktivität und/oder physiologisch verträgliche Salze davon, gegebenenfalls in vorbestimmter Kombination mit einem oder mehreren geeigneten Enzymen mit einer anderen als PL- beziehungsweise PG-Aktivität.
Geeignete Enzyme mit einer anderen als PL-Aktivität bauen ab und modifizieren celluläre Polymere. Derartige Enzyme sind beispielsweise Pectinesterasen, endo- und exowirkende Polygalacturonasen, Cellulasen, gemischte Endoglucanasen, Hemicellulasen, Xylanasen, Arabinasen, Galactanasen, α- und β-Glycosidasen und dergleichen.
Geeignete Enzyme, die eine andere als PG-Aktivität aufweisen, bauen ab und modifizieren zelluläre Polymere. Derartige Enzyme sind Pectinesterasen, Pectinlyasen, Cellulasen, gemischte Endoglucanasen, Hemicellulasen, Xylanasen, Arabinasen, Galactanasen, α- und β-Glycosidasen und dergleichen.
Einzelne PG oder PL oder Derivate davon mit PG- oder PL-Aktivität, hergestellt gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren oder enzymatische Zusammensetzungen davon, sind beispielsweise zur Klärung von Gemüse- oder Obstsaft, zur Erhöhung der Saftausbeute bei der Gemüse- oder Obstsaftproduktion und der Preßausbeute von ölenthaltenden Saaten oder Früchten, zur Stabilisierung von Gemüse und Obstsaft, zur Reduktion der Viskosität von Gemüse- oder Obstsaft, zur Verflüssigung von Biomasse, zur Mazeration, zur Erhöhung der natürlichen Produktextraktion, wie natürlichen Pigmenten, Aromen und Geschmacksstoffen, zur Aufwertung von Biomasse, Nahrungsmittel oder Futter und dergleichen geeignet.
Die Erfindung betrifft in äußerst bevorzugter Weise den A. niger-pki-Promotor oder ein Fragment oder Derivat davon mit Promotoraktivität, einen Hybridvektor, einen transformierten Wirt, ein Verfahren zur Herstellung des A. niger- pki-Promotors oder eines Fragments oder Derivats davon mit Promotoraktivität, ein Verfahren zur Herstellung eines Hybridvektors, ein Verfahren zur Herstellung eines transformierten Wirts und ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wie nachstehend in den Beispielen beschrieben.
Die nachstehenden Beispiele sind lediglich zur Erläuterung angegeben, sind jedoch in keiner Weise vorgesehen, sie zu beschränken.

Die Abkürzungen haben die nachstehenden Bedeutungen:

Amp Ampicillin
ATP Adenosintriphosphat
BSA Rinderserumalbumin
Bp Basenpaare
CIP alkalische Kalbsdarmphosphatase
dATP 2'-Desoxyadenosintriphosphat
dCTP 2'-Desoxycytidintriphosphat
d.e. Veresterungsgrad
dGTB 2'-Desoxyqguanosintriphosphat
DNA Desoxyribonucleinsäure
dNTP 2'-Desoxynucleotidtriphosphat
DTT 1,4-Dithiothreitol
dTTP 2'-Desoxythymidintriphosphat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäurenatriumsalz
EGTA Bis-(aminoethyl)-glycolether-N,N,N',N'-tetraessigsäure
IFN Interferon
kDa Kilodalton
kBp Kilobasenpaare
Km Michaelis-Menten-Konstante
LMP geringer Schmelzpunkt
O.D. optische Dichte
PCR Polymerasekettenreaktion
PEG Polyethylenglycol
pki Pyruvatkinasegen von A. niger
PLB Pectinlyase B
RNA Ribonucleinsäure
U/min Umdrehungen pro Minute
SDS Natriumdodecylsulfat
SSC Natriumnatriumcitrat (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat)
Tc Tetracyclin
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U Einheiten

Medien

LC-Medium 1% Trypticase-Pepton (BBL), 0,5 % Hefeextrakt (BBL), 0,8 % NaCl, 1 ml Tris-HCl, pH 7,5 pro Liter
2XYT-Medium pro Liter 16 g Trypticase- Pepton (BBL), 109 Hefeextrakt, 5 g NaCl Minimal-Medium für A. niger 1 Liter enthält 1,5 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,59 KCl, 0,5 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 4,0 g NH&sub4;Cl, 10,0 g Glucose, Spuren von FESO&sub4;, MNSO&sub4;, ZnCl&sub2;, eingestellt auf pH 6,5 mit NaOH
Vollständiges Medium für A. niger Minimalmedium plus 0,2 % Trypticasepepton (BBL), 0,1 % Casaminosäuren (Difco), 0,1 % Hefeextrakt (BBL), 0,05 % Ribonucleinsäurenatriumsalz aus Hefe (ICN, Cleveland, USA) , 2 ml Vitaminlösung pro Liter. A. niger Vitaminlösung pro 100 ml 10 mg Thiamin, 100 mg Riboflavin, 10 mg Panthotensäure, 2 mg Biotin, 10 mg p-Aminobenzoesäure, 100 mg Nikotinamid, 50 mg Pyridoxin-HCl
Für Platten werden alle Medien durch Zugabe von 1,5 % Agar (BBL), verfestigt für Topagar(ose) 0,7 % Agar (BBL) oder Agarose (Seakem) verwendet.

Folgende Stämme werden verwendet:

E. coli JM 101 (Messing, 1979)
E. coli RZ 1032 (Pharmacia)
E. coli DH5a (Bethesda Research Laboratories)
E. coli DH5αF' (Bethesda Research Laboratories)
E. coli BW313 (Kunkel, 1985)
A. niger An8 (DSM 3917, EP-A-0 278 355)
A. niger N593

Die nachstehenden Vektoren werden verwendet: pBR322

Beschrieben in Sutcliffe, J.G. (1979), Peden, K.W.C. (1983) oder Bolivar et al. (1977)

pGW613

Dieses Plasmid wurde von Goosen et al. (1987) beschrieben.

M13mp-Phase

Die M13mp18- und M13mp19-Vektoren (Norrander et al., 1983) sind Derivate der einsträngigen DNA des Bakteriophagen M13 und sind ausgelegt, die DNA-Sequenzierung durch Klonierenlassen von DNA-Fragmenten mit einer Universalpolylinkerstelle und Klonieren desselben Restriktionsfragments in beiden möglichen Orientierungen zu erleichtern. Sequenzen, die in diese Vektoren kloniert werden, können leicht als Template (Schablonen) für Sequenzierungsumsetzungen oder für die Herstellung von einsträngigen Sonden unter Verwendung von versträngten Oligodesoxyribonucleotidprimer und den Klenow-Fragment von E. coli DNA Polymerase I eingesetzt werden. Die Vektor-DNA trägt den E. coli-lac-operon-Promotor und die genetische Information der ersten 145 Aminosäuren von β-Galactosidase. Die Polylinkersequenzen, die die Vielzahl an Restriktionsstellen enthalten, werden in die lacZ-Sequenz inseriert. Der Polylinker hält das lacZ-Leseraster zurück und der Vektor gibt eine allelische Komplementation eines lacZα-Wirtstammes, das zu blauen Plaques auf den IPTG- und X-gal-enthaltenden Platten führt. Rekombinante Phagen, die Inserts enthalten, welche das Leseraster zerstören oder anderweitig bei der Expression des lacZα-Peptids stören, treten als farblose Plaques hervor.

pCG 59D7

Dieses Plasmid ist in EP 88 101 397.3 beschrieben und kann aus Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968) erhalten werden. Das Plasmid umfaßt das pyrA-Gen und wird zur Cotransformation von A. niger-pyrA&supmin;-Mutanten verwendet.

M13 K07

Der Helfer M13-Phage, beispielsweise für M13(+)KS. Beschrieben in Mead et al. (1986) und Dotto und Zinder (1984).

pPYK1

Umfaßt das S. cerevisiae-Pyruvatkinasegen, beschrieben in Burke et al., 1983.

pGW1800

Umfaßt das PGII-Gen von A. niger. Ein E. coli-JM109- Stamm, umfassend pGW1800, ist als DSM 5505 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt.

pGW 830

Umfaßt das pelB Gen von A. niger. Ein E. coli-H8101- Stamm, umfassend pGW830, ist als DSM 4389 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt. pTZ18R Erhältlich von Pharmacia.

pGW1100

Umfaßt das A. niger-pki-Gen. Beschrieben in L.H. de Graaff, 1989 und hinterlegt als E. coli DH5αF'/pGW1100 unter der Nummer 5747 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen.

pJDB207 - IFNAM119

Beschrieben in EP-A-0 205 404.

Beispiel 1: Isolierung und Charakterisierung des A. niger-Pyruvatkinasegens

Beispiel 1.1: Isolierung eines DNA-Fragments, umfassend das Hefepyruvatkinasegen

Das Plasmid pPYK1, umfassend das 1,8 kB EcoRI-Fragment von dem Saccharomyces cerevisiae-Pyruvatkinasegen (Burke et al., 1983) wird mit EcoRI aufgeschlossen unter Verwendung der vom Hersteller (BRL) angegebenen Bedingungen. Die erhaltenen Fragmente werden durch Elektrophorese in einem niederschmelzenden (LMP) Agarosegel, 0,6 %, getrennt. Das das 1,8 kB EcoRI-Fragment enthaltende LMP-Agarosestück wird aus dem Gel geschnitten und die DNA durch das nachstehende Verfahren extrahiert: TE-Puffer (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) wird zu dem Agarosestück zu einem Endvolumen von 500 ul gegeben, gefolgt von 250 ul Phenol. Die Agarose wird durch Inkubation bei 65ºC für 10 Minuten geschmolzen und mit der Lösung vermischt. Nach Zugabe von 250 ul CIA (Chloroform/Isoamylalkohol 24:1) werden die wässerigen und organischen Phasen durch Zentrifugation getrennt (Eppendorf-Zentrifuge) für 10 Minuten bei 14000 x g. Die organische Phase wird verworfen und die wässerige Phase wird erneut durch Inkubieren mit ½ Volumen Phenol für 10 Minuten bei 65ºC extrahiert, anschließend Zugabe eines weiteren ½ Volumens CIA und Trennung der Phasen. Die organische Phase wird erneut verworfen und die wässerige Phase wird nacheinander bei Raumtemperatur mit einem gleichen Volumen Phenol/CIA (1:1) und einem gleichen Volumen CIA extrahiert. Schließlich wird die DNA aus der wässerigen Phase durch Zugabe von 0,1 Volumen 3M Na-Acetat, pH 5,6 und 2 Volumen Ethanol gefällt. Die DNA wird durch Zentrifugieren (Eppendorf-Zentrifuge) für 30 Minuten bei 14000 x g bei Raumtemperatur sedimentiert. Nach der Entfernung des Überstands wird das DNA-Pellet unter Verwendung einer Savant Spedvac Vakuumzentrifuge getrocknet. Die DNA wird schließlich in 10 ul TE gelöst und die Konzentration wird durch Agaroseelektrophorese unter Verwendung von einer bekannten Menge einer mitlaufenden Lambda-DNA als Standard bestimmt.

Beispiel 1.2: ³²P-markierte DNA-Fragmente

100 ng eines 1,8 kB EcoRI-Fragments, isoliert aus dem Plasmid pPYK1 wie beschrieben in Beispiel 1.1, wird durch Nick-Translation markiert, im wesentlichen beschrieben von Maniatis et al., 1982, S. 109 bis 112. Fünf ul α-³²P-dATP (10 uCi/ul, 3000 Ci/mMol), 1 ul (5U/ul) DNA-Polymerase I, 100 pg DNase I, 100 ng 1,8 kB EcoRI-Fragment von pPYK1 und steriles Wasser werden zu 40 ul Reaktionspuffer (bestehend aus 25 uM dGTP, 25 uM dCTP, 25 uM dTTP, 5 mM MgCl&sub2;, 50 mM Tris/HCl pH 7,5) auf ein Endvolumen von 50 ul gegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 2 Stunden bei 16ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 5 ul 500 mM EDTA, pH 8,0, gestoppt. Zur Entfernung des nichteingebauten α-³²P-dATP aus dem Gemisch wird das Volumen auf 100 ul mit TE erhöht und das α-³²P-dATP wird durch Fraktionierung auf einer Sephadex G50 (Pharmacia) Säule entfernt. Die das radioaktiv markierte 1,8 kB EcoRI- Fragment enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und zusammengegeben. Die markierte DNA wird durch Inkubation für 3 Minuten bei 100ºC denaturiert und einsträngig durch rasches Abkühlen auf Eis gehalten, bevor sie zu der Hybridisierungslösung, beschrieben in Beispiel 1.4, gegeben wurde.

Beispiel 1.3.: Isolierung von DNA hohen Molekulargewichts aus A. niger

Die A. niger-DNA wird durch ein leicht modifiziertes Verfahren, verwendet zur Isolierung von Pflanzen-RNA (Slater, 1985), isoliert. Mycelium, das über Nacht in einem flüssigen Mininalmedium gewachsen ist, wird gehärtet, mit kalter Salzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC gelagert. Nucleinsäuren werden durch Aufsprengen von 0,5 g gefrorenem Mycelium unter Verwendung eines Mikrodismembrators (Braun) isoliert. Das erhaltene myceliale Pulver wird mit einem frisch hergestellten Extraktionspuffer extrahiert. Der Extraktionspuffer wird wie nachstehend hergestellt: 1 ml Triisopropylnaphthalinsulfonsäure (TNS) (20 mg/ml) wird sorgfältig mit 1 ml p-Aminosalicylsäure (PAS) (120 mg/ml) vermischt und 0,5 ml 5 x RNB-Puffer werden zugegeben (5 x RNB enthält 121,10 g Tris, 73,04 g NaCl und 95,10 g EGTA in 1 l, pH 8,5). Nach der Zugabe von 1,5 ml Phenol wird der Extraktionspuffer für 10 Minuten bei 55ºC äquilibriert. Der warme Puffer wird dann zu dem Mycelialpulver gegeben und die Suspension wird sorgfältig für 1 Minute vermischt. Nach Zugabe von 1 ml Chloroform wird die Suspension erneut für 1 Minute vermischt. Nach Zentrifugieren bei 10&sup4; x g für 10 Minuten wird die wässerige Phase mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und wird dann zweimal mit Chloroform extrahiert. Die DNA wird aus der wässerigen Phase unter Verwendung des nachstehenden Verfahrens isoliert: Die DNA wird sofort aus der wässerigen Phase mit 2 Volumen Ethanol bei Raumtemperatur gefällt, anschließend durch Zentrifugation bei 10&sup4; x g für 10 Minuten gesammelt und zweimal durch Wiederauflösen der DNA in destilliertem sterilem Wasser und erneutem Fällen mit Ethanol gewaschen. Schließlich wird die DNA wieder in TE-Puffer gelöst. RNA wird dann durch Zugabe von RNase A (20 ug/ml) entfernt.

Beispiel 1.4.: Bestimmung der heterologen Hybridisierungsbedingungen

DNA hohen Molekulargewichts, isoliert aus A. niger, wie beschrieben in Beispiel 1.3, wird mit EcoRI und BamHI aufgeschlossen. Die nachstehenden Fragmente werden durch Agarosegelelektrophorese getrennt und auf Nitrocellulose überführt, wie beschrieben bei Maniatis et al., (1982) S. 383- 389. Heterologe Hybridisierungsbedingungen werden bestimmt und Hybridisierungsexperimente werden ausgeführt, wie von de Graaff et al. (1988) bereits beschrieben. Die Hybridisierungsbedingungen zum Absuchen der Genbank und zur Hybridisierung von Southernblots mit dem 1,8 kB EcoRI-Fragment des Hefegens als Sonde sind: Vorhybridisierung in 6 x SSC, 0,1 % SDS, 0,05 % Natriumpyrophosphat und 20 ug/ml denaturierter Heringssperma-DNA bei 56ºC für 3-5 Stunden, Hybridisierung in 6 x SSC, 0,1 % SDS, 0,05 % Natriumpyrophosphat und 20 ug/ml denaturierter Heringssperma-DNA bei 56ºC für 15-18 Stunden, gefolgt von zweimal Waschen in 5 x SSC, 0,1 % SDS bei 56ºC und zweimal Waschen mit 2 x SSC bei 56ºC. Die Filter werden Autoradiographie über Nacht bei -70ºC unter Verwendung von Konica Röntgenfilmen und Kodak X-Omatic-Kassetten mit regulären Verstärkerschirmen unterzogen.

Beispiel 1.5.: Absuchen der Genbank mit dem radioaktiven 1,8 kB EcoRI-Fragment

Das A. niger-pki-Gen wird durch heterologe Hybridisierung unter Verwendung des 1,8 kB EcoRI-Fragments von pPYK1 als Sonde isoliert. Die Genbank von A. niger N400, die gemäß dem in EP-A-0 278 355 beschriebenen Verfahren hergestellt wird, wird mit dem 1,8 kB EcoRI-Fragment von pPYK1 durch ein Hybridisierungsverfahren gemäß dem Verfahren, beschrieben in Beispiel 1.4., abgesucht. Die Suchergebnisse führen zur Isolierung von positiven Klonen. Aus den Klonen, die die stärksten Hybridisierungssignale liefern, wird Plasmid-DNA durch Mini-Prep-Isolierung (Maniatis. et al., 1982, S. 368-369) isoliert. Southern- und Restriktionsanalyse wird verwendet, um zu prüfen, ob ein Klon das komplette A. niger-pki-Gen enthält. Das 5 kBp BglII/HindIII-Fragment dieses Klons und das 4,0 kBp BamHI/HindIII-Vektorfragment von E. coli-Vektor pBR322 werden gemäß dem LMP-Agarose-Verfahren, beschrieben in Beispiel 1.1., isoliert. Das 5 kBp BglII/HindIII-Fragment wird mit dem 4,0 kBp BamHI/HindIII-Vektorfragment von pBR322 ligiert, was zu dem Plasmid pGW1100 führt, durch das nachstehende Verfahren: 100 ng pBR322-Fragment werden mit 250 ng des 5 kBp BglII/HindIII-Fragments und 4 ul 5 x Ligierungspuffer (Zusammensetzung: 250 mM Tris/HCl pH 7,6; 50 mM MgCl&sub2;; 50 mM DTT; 5 mM ATP; 5 mM Spermidin; 50 ug/ml BSA) vermischt und 1 ul (1,2 U/ul) DNA-Ligase (BRL) wird zu dem Gemisch zu einen Endvolumen von 20 ul gegeben. Nach Inkubation für 16 Stunden bei 14ºC wird das Gemisch auf 100 ul mit sterilen Wasser verdünnt. 10 ul des verdünnten Gemisches werden zur Transformation von kompetenten E. coli-JM101-Zellen verwendet, die gemäß dem CM1-,CM2-Verfahren, beschrieben in dem Handbuch von Pharmacia für das M13-Klonierungs/Sequenzierungssystem, hergestellt wurden. pGW1100 wird in großem Maßstab isoliert (Maniatis, 1982, S. 86), mit CsCl-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TE-Puffer gelöst. Das Plasmid pGW1100 wird außerdem durch Restriktionsanalyse analysiert und die Orientierung des pki-Gens wird durch Hybridisierung unter Bedingungen, beschrieben in Beispiel 1.4., unter Verwendung von Fragmenten, die das 5'- und 3'-Ende des S. cerevisiae-Pyruvatkinasegens, 1,0 kBp EcoRI/BglII bzw. 0,88 kBp EcoRI/BglII-Fragment als Sonden enthalten, bestimmt.

Beispiel 1.6.: Sequenzbestimmung des A. niger Pyruvatkinasegens

Die Sequenz des A. niger-pki-Gens, einschließlich des Promotorbereiches des Strukturgens und des Terminationsbereiches, wird durch Subklonierungsfragmente von pGW1100 in M13mp18/mp19 bestimmt. Für die Nucleotidsequenzanalyse geeignete Restriktionsfragmente werden, wie in Beispiel 1.1. beschrieben, isoliert und werden mit linearisierten Bakteriophagen-M13-mp18/19-RF-DNA-Vektoren (Messing, 1983; Norrander et al., 1983) wie in Beispiel 1.5. beschrieben, ligiert. Die Nucleotidsequenzen werden unter Verwendung des Didesoxynucleotidkettenterminationsverfahrens bestimmt (Sanger et al., 1977) wie beschrieben in M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction manual from BRL, S. 50-73. Die ermittelte Sequenz wird in dem Sequenzlisting unter SEQ ID NR. 1 angegeben.

Beispiel 2: Konstruktion von Expressionsvektoren

Beispiel 2.1.: Einführung einer neuen Restriktionsstelle als Translationsstartcodon des Pyruvatkinasegens

Beispiel 2.1.1.: Herstellung von Uracil enthaltender M13mp18-PK (BamHI-PvuII) Templat-DNA

Bakteriophage M13mp18-PK(BamHI-PvuII), erhalten in Beispiel 1.6., wird durch Beimpfen einer 5 ml Kultur von E. coli JM101 in 2xYT Nährmedium bei O.D.1cm/600nm = 0,1 mit einem einzelnen Plaque vermehrt.
Nach Züchten über Nacht bei 37ºC werden die Bakterien durch Zentrifugieren (10000 x g, 10 min.) entfernt und der Überstand wird als Phagenstamm bei der Herstellung des Uracil enthaltenden einsträngigen DNA-Templats verwendet.
Das Uracil enthaltende Templat wird gemäß Kunkel et al. (1985) und Ner et al., (1988) wie nachstehend hergestellt: 10 ml 2xYT-Medium, enthaltend 5 mM Uridin, werden mit E. coli RZ1032 geimpft und die Kultur wird bei 37ºC bis zu einer O.D.1 cm/550 nm von 0,3 gezüchtet. Von dieser Kultur werden 2,5 ml in 10 ml 2xYT-Medium, enthaltend 5 mM Uridin, verdünnt. Diese Kultur wird durch Zugabe von 12 ul des M13np18- PK (BamHI-PvuII) enthaltenden Überstands, hergestellt wie vorstehend beschrieben, infiziert. Die infizierte Kultur wird für 5 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Nach diesen Züchtungszeitraum werden die Bakterien aus der Kultur, wie vorstehend beschrieben, entfernt und der Phagen enthaltende Überstand wird verwendet, um den zweiten Zyklus der Phagenzüchtung von E. coli RZ1032, wie vorstehend beschrieben, auszuführen. Bei einem dritten Zyklus des Wachstums werden 40 ml 2xYT-Medium, enthaltend 5 mM Uridin, mit 10 ml Kultur von E. coli RZ1032 und 50 ul Phagen enthaltenden Überstand, erhalten vom zweiten Züchtungszyklus, zugegeben. Die Bakterien werden für 5 Stunden bei 37ºC gezüchtet und die Bakterien werden aus dem Überstand durch Zentrifugieren, wie vorstehend beschrieben, entfernt. Der Überstand wird ein zweites Mal zentrifugiert, bevor die Phagen durch Zugabe von 8 ml 20 % Polyethylenglycol-6000/3 M NaCl gefällt werden. Die Phagen werden durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 10000 x g gesammelt. Das erhaltene Phagenpellet wird in 2,5 ml TE-Puffer resuspendiert. Der Anteil an Uracil enthaltenden Phagen wird durch Plattieren unterschiedlicher Lösungen dieser Phagenlösung auf E. coli JMI01 (non-permissive) sowie E. coli RZ1032 (permissive) bestimmt. Ein Verhältnis von nicht Uracil zu Uracil enthaltenden Phagen von 1 zu 106 wird gefunden. Einsträngige M13mp18-PK (BamHI-PvuII)-DNA wird aus der Phagenlösung durch Phenol-Chloroform-Extraktion, Fällen mit Ethanol wie beschrieben in Beispiel 1.1. und Resuspendieren in 125 ul TE- Puffer, isoliert.

Beispiel 2.1.2.: Einführung einer NsiI-Stelle an der Translationsstartstelle des A. niger-pki-Gens durch in vitro- Mutagenese

Eine NsiI-Stelle wird an einer Translationsstartstelle des Pyruvatkinasegens durch in vitro-Mutagenese (Ti-Zi Su und M. Raafat El-Gewely, 1988) auf Uracil enthaltende einsträngige M13mp18-PK (BamHI-PvuII)-DNA, beschrieben in Beispiel 2.1.1., unter Verwendung des mutagenen Oligonucleotids 5926, das die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR. 2 aufweist, erzeugt.
Das Oligonucleotid 5926 besteht aus 29 Nucleotiden, wobei dessen Sequenz, mit der Sequenz um die Translationsstartstelle des pki-Gens, ausgenommen Positionen 12 bis 14 des Oligonucleotids, identisch ist. Die Sequenz der Nucleotide in den Positionen 12 bis 14, die in dem ursprünglichen pki-translationalen Startbereich GCC heißt, ist in dem Oligonucleotid CAT. Das Oligonucleotid weist daher eine NsI-Stelle an den Stellen 9 bis 14 auf.
Für eine in vitro-Mutation des pki-Gens werden 50 pMol Oligonucleotid 5926 an dem 5'-Ende phosphorylisiert (Maniatis, 1982) mit 100 pmol ATP. Diese Reaktion wird für 30 Minuten bei 37ºC mit 10 U T4 Polynucleotidkinase (BRL) in 50 ul Kinasepuffer, wie vom Hersteller empfohlen, ausgeführt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2 ul einer 500 mM EDTA-Lösung beendet. Das Gemisch wird mit Phenol und Chloroform, wie in Beispiel 1.1 beschrieben, extrahiert.
0,2 pMol Uracil enthaltende einsträngige M13mp18-PK (BamHI-PvuII)-DNA, hergestellt gemäß Beispiel 2.1.1., werden mit 0,5 pMol phosphorylisiertes Oligonucleotid 5926 in 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 25 mM NaCl zu einem Endvolumen von 10 ul vermischt. Das Gemisch wird für 5 Minuten bei 65ºC inkubiert, langsam auf Raumtemperatur während 60 Minuten gekühlt und für 15 Minuten auf Eis gegeben. Die 2 ul 500 uM dNTP, 1,5 ul 10 mM ATP, 1 ml T&sub7; DNA-Polymerase (12 U/ul) (Pharmacia) und 1 ul T4 DNA-Ligase (1,2 U/ul) (BRL) werden zu dem Gemisch gegeben und dieses Polymerisationsgemisch wird für 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird durch Erwärmen auf 65ºC für 5 Minuten gestoppt. Das Polymerisationsgemisch wird dann auf ein Endvolumen von 100 ul verdünnt und aliquote Mengen des verdünnten Gemisches werden, um kompetente E. coli JM101 (non-permissive) und E. coli RZ1032 (permissive) zu transfizieren, welche gemäß Beispiel 1.5. hergestellt werden. Die transfizierten Zellen werden, wie in Beispiel 1.5. beschrieben, plattiert.

Beispiel 2.1.3.: Sequenzanalyse des mutierten M13mp18-PK (BamHI-PvuII)

Zwölf Plaques werden von den Platten mit transformiertem E. coli JM101 genommen, die Phagen mit E. coli JM101 als Wirt vermehrt und von jedem Phagen wird die einsträngige DNA, wie in Beispiel 2.1.1. beschrieben, isoliert. Die isolierte einsträngige DNA dieser Phagen wird durch "G-track"- Analyse, wie in dem Handbuch "M13 cloning and sequencing" von BRL beschrieben, analysiert. Drei der Phagen mit dem vorbestimmten G-Muster der gewünschten Mutation werden durch Sequenzanalyse, wie beschrieben in Beispiel 1.6., analysiert. Die Phagen umfassen das vorbestimmte 1053 Bp BamHI-PvuII- Fragment mit der NsiI-Stelle an der Translationsstartstelle des pki-Gens. Die mutierten Phagen werden M13mp18-PK (BamHI- NsiI-PvuII) genannt.

Beispiel 2.2: Konstruktion von pPK-PLB

Das 742 Bp BamHI/NsiI-Fragment, das den pki-Promotorbereich enthält, wird aus der M13mp18-PK-(BamHI-NsiI-PvuII)- RF-DNA isoliert, während ein 2,6 kB BamHI/NsiI-Fragment, das das Strukturgen für Pectinlyase B enthält (pel B), aus Plasmid pGW830 gemäß den in Beispiel 1.1. beschriebenen Verfahren isoliert wird. Beide Fragmente werden in einem dephosphorylisierten pBR322-Vektor, aufgeschlossen mit BamHI (Fig. 4), wie nachstehend ligiert: 100 ng BamHI aufgeschlossene pBR322 DNA werden mit 250 ng 2,6 kB pelB BamHI/NsiI-Fragment und mit 250 ng des 742 Bp pki BamHI/NsiI-Fragments vermischt. Das Gemisch wird, wie in Beispiel 1.5. beschrieben, ligiert. Aliquote Mengen des verdünnten Ligierungsgemisches werden zur Transformation kompetenter E. coli JM101-Zellen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1.5., verwendet. Das Transformationsgemisch wird auf LC-Platten, die 50 ug/ml Anpicillin enthalten, plattiert und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Transformanten werden von der Platte entfernt und für 5 Stunden bei 37ºC in flüssigen LC-Medium, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, gezüchtet. Plasmid-DNA wird aus Transformanten durch Miniprep-Isolation (Maniatis et al., 1982, S. 368-369) isoliert. Eine Transformante, enthaltend ein Plasmid, das die erwarteten Fragmente nach Aufschluß mit BamHI, SphI, SmaI und mit den Kombinationen von BamHI und NsiI aufzeigt, wird zusätzlich durch Sequenzanalyse unter Verwendung eines pel B spezifischen Olinucleotids als Primer analysiert. Die Sequenz entspricht der vorausgesagten Sequenz des fusionierten Gens pkipel B. Das Plasmid wird pPK-PLB genannt und wird vermehrt und gereinigt wie in Beispiel 1.5.

Beispiel 3:

Beispiel 3.1: Einführung von pPK-PLB in A. niger

Das Plasmid pPK-PLB, enthalten in Beispiel 2.2., wird in A. niger durch Cotransformation von A. niger N593 mit Plasmiden pGW613 und pPK-PLB eingeführt. pGW613 umfaßt das selektive Marker-Gen pyr A.
Protoplasten von A. niger N593 werden aus Mycelium von gezüchtetem A. niger N593 auf Minimalmedium, ergänzt mit 0,5 % Hefeextrakt, 0,2 % Casaminosäuren, 50 mM Glucose und 10 mM Uridin, für 20 Stunden bei 30ºC hergestellt. Die Zubereitung von Protoplasten von A. niger N593 und das Transformationsverfahren wird, wie von Goosen et al., 1987 beschrieben, ausgeführt. Die erhaltenen PYR&spplus;-Transformanten werden auf dem ergänzten Minimalmedium gezüchtet und werden zur Expression des pel B-Gens analysiert.

Beispiel 3.2: Analyse von PK-PLB-Transformanten von A. niger N593

A. niger-Transformanten, erhalten in Beispiel 3.1, werden zur Bildung des pel B Genprodukts, dem PLB-Protein gezüchtet. Sie werden selektiert und für 18 Stunden auf Medium, enthaltend 10 g 72 % verestertes Pectin, 7,5 g NH&sub4;NO&sub3;, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO&sub4;, 1,5 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g Casaminosäuren, 0,5 g Hefeextrakt und 0,5 ml Stammlösung von Spurenelementen, H&sub2;O auf 1 l, pH 6,0, gezüchtet. Die Stammlösung von Spurenelementen besteht pro Liter aus 10 g EDTA, 4,4 g ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 1,01 g MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 0,32 g CoCl&sub2; 6H&sub2;O, 0,315 g CuSO&sub4; 5H&sub2;O, 0,22 g (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; 4H&sub2;O, 1,47 g CaCl&sub2; 2H&sub2;O und 1,0 g FeSO&sub4; 7H&sub2;O. Nach dem Züchten wird das Mycelium durch Filtrieren entfernt und das Kulturfiltrat wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter Verwendung eines Gel enthaltenden 10 % Acrylamids analysiert. Das PLB-Protein wird durch Westernblotbestimmung (wie in dem Manual für die 2117 Multiphor II semi-dry blot-Vorrichtung von LKB beschrieben) unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern aus Ratten gegen PLII (van Houdenhoven, 1975) und Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Bio Rad) gemäß den Anweisungen der Hersteller, bestimmt. Von den analysierten Transformanten erzeugen in etwa 70 % das PLB-Protein. Eine Transformante wird für weitere Arbeiten ausgewählt. Nachstehend wird die Transfornante als A. niger/PK-PLB bezeichnet.

Beispiel 3.3: Northern-Analyse von pPK-PLB-Transformanten von A. niger

Die A. niger-Transformante A. niger/PK-PLB, ausgewählt gemäß Beispiel 3.2, wird für die Bildung von pelB-spezifischer mRNA analysiert. Die Transformante wird für 16 Stunden bei 30ºC auf einem Medium, wie beschrieben in Beispiel 3.2, mit der Abweichung für die Kohlenstoffquelle, die 2 % (Gewicht/Volumen) D-Glucose ist, gezüchtet. Nach der Ernte wird das Mycelium rasch durch Pressen zwischen zwei Papierbögen getrocknet und sofort in flüssigen Stickstoff zum Vermahlen getaucht. 1 g pulverisiertes Mycel wird dann in 3 ml Puffer suspendiert (4,0 M Guanidiniumthiocyanat, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM EDTA pH 7,5, 1 % β-Mercaptoethanol, 2 % Natriumlaurylsarcosinat) und für 1 Minute Vortexbehandlung unterzogen. Nach Zentrifugieren (10 Minuten, 10000xg bei Raumtemperatur) wird der Überstand entfernt. Zu jedem 2,5 ml- Überstand werden 1 g CsCl gegeben. Die Proben werden anschließend auf einer Zwischenlage von 5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA (pH 7,5) in einem SW 50-Ultrazentrifugenröhrchen von Beckman beschichtet. Zentrifugation wird für 16 Stunden bei 30000 U/min bei 20ºC unter Verwendung eines SW50-Rotors von Beckman ausgeführt. RNA-Pellets werden in sterilem destilliertem Wasser gelöst. Die Menge an RNA der Proben wird auf etwa gleiche Konzentrationen nach Agarosegelelektrophorese eingestellt. Mengen von etwa 25 ug RNA werden unter Verwendung von Glyoxaldenaturierung [Maniatis et al. (1982) Molekularkloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Seite 200)] laufen lassen. Die RNA wird auf Gene-bind (Pharmacia) unter Verwendung eines 10-SSC als Transferpuffer geblottet und für 1 Stunde bei 80ºC getempert. Die Hybridisierung wird bei 16 Stunden in dem von Church und Gilbert beschriebenen Puffer ausgeführt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984)] (1% BSA, 1 mM EDTA, 0,5 M NaPi pH 7,2, 7% SDS) bei 60ºC unter Verwendung des radioaktiv markierten 2,8 kBp XhoI-Fragments als Sonde, auf dem das pelB-Gen angeordnet ist. Die Blots werden zweimal für 30 Minuten mit 2 SSC, 0,1 % SDS gewaschen und dann zweimal für 30 Minuten mit 0,2 SSC, 0,1 % SDS bei 60ºC gewaschen. Exposition der Blots wird über Nacht bei -70ºC unter Verwendung eines Konica Röntgenfilms und Verstärkerschirmen ausgeführt. Die Analyse zeigte ein starkes pelB spezifisches mRNA-Signal in der Transformante und kein Signal im Kontrollstamm A. niger N400, der ähnlich aufwuchs.

Beispiel 3.4: Herstellung. Reinigung und Charakterisierung von Pectinlyase B (PLB) von dem A. niger/PK-PLB

Beispiel 3.4.1.: Züchtungsbedingungen zur Herstellung von Pectinlyase B und Isolierung des Enzyms

Sporen von A. niger/PK-PLB werden zur Beimpfung von 600 ml Züchtungsmedium zu einer Dichte von 7 x 10&sup6; Sporen/ml verwendet. Das Medium hat die nachstehende Zusammensetzung: 20 g Glucose, 7,5 g NH&sub4;NO&sub3;, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 15 g KH&sub2;PO&sub4;, 5 g Hefeextrakt&sub1; 0,5 g Ribonucleinsäuren, 0,5 ml einer Stammlösung von Spurenelementen, H&sub2;O auf 1 l, pH 6,0. Die Stammlösung der Spurenelemente besteht pro Liter aus 10 g EDTA, 4,4 g ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 1,01 g MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 0,32 g CoCl&sub2; 6H&sub2;O, 0,315 g CuSO&sub4; 5H&sub2;O, 0,22 g (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; 4H&sub2;O, 1,47 g CaCl&sub2; 2H&sub2;O und 1,0 g FeSO&sub4; 7H&sub2;O. Die Kultur wird für 3 Stunden bei 30ºC in einem New Brunswick-Orbitalschüttler gezüchtet und dann in einen 10 l-Kolben, der 4 l desselben Mediums enthält, überführt. Die Kultur wird über einen Strömstein am Boden des Kolbens belüftet, um die komprimierte Luft zu verteilen und die Kultur zu bewegen. Die Züchtung wird für 16 h bei 30ºC fortgeführt. Nach diesem Zeitraum der Züchtung ist der pH-Wert des Mediums 5,8. Das Mycelium wird durch Filtrieren entfernt und PLB wird aus dem Kulturfiltrat durch nachstehendes Verfahren isoliert:
Das Enzym wird fast quantitativ durch Ammoniumsulfatfällung gewonnen (95 % Sättigung) bei 0ºC, gefolgt von Zentrifugation (15 min, 8500 x g). Das gefällte Enzym wird in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,0 gelöst, gegen denselben Puffer dialysiert und bei -20ºC gelagert. Die Pectinlyaseaktivität wird bei 25ºC bestimmt unter Verwendung einer Endkonzentration von 0,3 % (Gew./Vol.) Pectin (Veresterungsgrad 94,6 %) in 50 mM Tris/HCl-Puffer, 1 mM CaCl&sub2;, pH 8,5 unter Verwendung des von van Houdenhoven beschriebenen spektrophotometrischen Verfahrens, 1975, Seite 11.
Die Analyse des Kulturfiltrats mit SDS-Polyacrylamidelektrophorese und Westernblotting zeigt eine predoninante Proteinbande entsprechend PLB und fast reines Enzym in der gefällten dialysierten Fraktion. Die spezifische Pectinlyaseaktivität in dem Kulturfiltrat beträgt 48 U/mg Protein und in der gefällten dialysierten Fraktion sind 216 U/mg Protein und die Proteinkonzentration beträgt 380 mg bzw. 82,6 mg, bestimmt gemäß dem Pierce BCA-Assay.

Beispiel 3.4.2: Eigenschaften des PLB-Proteins

Die scheinbare Molekularmasse des PLB, wie isoliert in Beispiel 3.1.3., beträgt 39,5 kDa, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter Verwendung von 10 % Gelen. Das gereinigte Enzym ist in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,0 stabil, wird jedoch langsam bei höheren pH-Werten inaktiviert, beispielsweise in 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,5. Diese Inaktivierung ist reversibel und die Aktivität kann größtenteils durch Dialysieren der Enzymlösung gegen Phosphatpuffer pH 6,0 wiedergewonnen werden. Das in Beispiel 3.1.3. hergestellte PLB ist eine typische Endopectinlyase, wie aus den oligoneren Abbauprodukten geschlossen werden kann, die von hochveresterten Pectinen stammen (d.e. 94,6 %). Das Enzym bevorzugt hochverestertes Pectin, wie in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Aktivität von PLB auf Apfelpectin mit unterschiedlichen Veresterungsgradena. Veresterungsgrad von Pectinsubstrat (%) relative enzymatische Aktivität von PLB (%) a Assaybedingungen: 0,3 % (Gew./Vol.) Pectin in 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,5, enthaltend 0,5 M NaCl bei 25ºC.
Die Michaelis-Menten-Parameter für PLB wurden unter Verwendung von Enzym bestimmt, das in Natriumphosphatpuffer pH 6 gelagert wird. Die Aktivität wurde bei 25ºC in 50 mM/Tris/HCl-Puffer pH 8,5 in Gegenwart von 0,5 M NaCl unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen hochveresterten Pectins (d.e. 94,6 %) ermittelt. Ein Km-Wert von 9 mM (auf Monomerbasis) und eine Wechselzahl von 51500 werden gefunden.

Beispiel 4: Expression von Hymanhybridinterferon-BDBB unter der Steuerung des pki-Promotors

Beispiel 4.1.: Konstruktion der Vorstufe von Plasmid pGII-IFN AM119-Vorstufe

Plasmid pGW1800, isoliert aus E. coli JM109/pGW1800 (DSM 5505), wird mit EcoRI aufgeschlossen und mit T4-Polymerase wie nachstehend behandelt. Religierung dieser DNA und Transformation von E. coli DH5αF' erlaubt die Isolierung eines Plasmids pGW1800-E, das dasselbe ist wie pGW1800, mit der Ausnahme, daß die EcoRI-Schnittstelle deletiert ist.
Plasmid pGW1800-E wird mit BGlII aufgeschlossen und mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BRL) in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und 50 mM NaCl für 1 h bei 65ºC behandelt. Die alkalische Phosphatase wird durch Aufschluß mit Proteinase K (Boehringer Mannheim) und Phenolextraktion inaktiviert. Die DNA wird anschließend mit Ethanol gefällt, getrocknet und in Wasser aufgelöst. Die klebrigen Enden werden mit T4-DNA-Polymerase wie nachstehend aufgefüllt.
Plasmid pJDB207-IFN AM119 (EP-A-205 404) wird mit HindIII und ClaI aufgeschlossen. Die klebrigen Enden dieser linearen Fragmente werden mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt (Boehringer Mannheim) in Gegenwart von 0,1 mM jeweils dCTP, dGTP, dATP und dTTP plus 67 mM Tris-HCl pH 7,5# 6,7 mM MgCl&sub2;, 16,7 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; und 5 mM DTT für 30 min bei 37ºC. Die Reaktion wird durch Erwärmen auf 65ºC für 5 min gestoppt. Die Fragmente werden in einem 0,8 %-igen Agarosegel mit geringer Geltemperatur (BioRad) getrennt und das 1 kBp-Fragment, das den IFN AM119 codierenden Bereich enthält, wird ausgeschnitten und die DNA auf einer Elutip D (Schleicher & Schüll)- Säule gereinigt und mit Ethanol gefällt (Schmitt & Cohen, 1983).
100 ug des IFN AM119-Fragments und des pGW1800-E-Vektors, hergestellt wie vorstehend, werden miteinander in 5 ul 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP und 1 Einheit T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) für 2 h bei Raumtemperatur ligiert. Das Gemisch wird in kompetente E. coli DH5αF'-Zellen transformiert. Ampicillin resistente Transformanten werden durch Restriktionsausschluß von deren Plasmid- DNA abgesucht, um jene zu identifizieren, die die Vorstufe des Plasmids pGII-IFN AM119 tragen.

Beispiel 4.2.: Erzeugung von pGIIss-IFN AM119 unter Verwendung von PCR

Gemäß dem PCR-Verfahren, beschrieben von R.M. Horten et al. (1989), wird pGW1800 durch XbaI-Aufschluß linearisiert und mit Ethanol gefällt. Nach Resuspension in Wasser werden 100 ug dieser DNA Verstärkung durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Oligonucleotiden A und C (SEQ ID NR. 5 bzw. 6) in einem automatischen "Thermal Cycler" für 25 Zyklen unterzogen (jeweils bestehend aus 1 min bei 94ºC, 2 min bei 40ºC und 3 min bei 72ºC), gefolgt von 10 min bei 72ºC. 100 pm jedes Oligonucleotids und 0,5 ul Taq-Polymerase (Perkin Elmer Cetus) werden für jede Reaktion in einem Volumen von 100 ul unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Reaktionspuffers verwendet. Dies ergibt DNA 2 (SEQ ID NR. 7).
In ähnlicher Weise ergibt pJDB207-IFN AM119, linearisiert mit BamHI und behandelt durch die PCR-Technik, mit entweder Oligonucleotiden D (SEQ ID NR. 8) und F (SEQ ID NR. 9) DNA 3 (SEQ ID NR. 10).
Diese Reaktionsgemische werden mit Ethanol gefällt, in Wasser wieder gelöst und aliquote Mengen werden auf einen Gel zur Bestimmung der Konzentration der DNA-Fragmente in den Gemischen geprüft.
Unter denselben Bedingungen wie vorstehend werden DNA 2 und 3 PCR unterzogen mit Oligonucleotiden A und F unter Bereitstellung einer DNA-Sequenz, umfassend eine perfekte In- Raster-Fusion der PGII-Signalsequenz, gebunden an ein PGII- Promotorfragment, mit dem Codierungsbereich für reifes Hybridinterferon BDBB.
Das BamHI-ECORI-Fragment dieser DNA, die die vollständige In-Raster-Fusion enthält, wird in eine BamHI-EcoRI- geschnittene pGII-IFN AM119-Vorstufe ligiert unter Erzeugung von Plasmid pgiiss-IFN AM119. Der Teil von pgllss-IFN AM119, umfassend die PGII-Signalsequenz, das BDBB-Hybrid IFN AM119- Gen, den Hefe-pHO5-Terminator wird unter SEQ ID NR. 11 dargestellt.

Beispiel 4.3.: Konstruktion des Plasmids pPKI-IFN-1

Zwei ug pGW1100 werden mit Restriktionsendonuclease NsiI an einer Stelle am 3'-Ende des pki-Gens geöffnet. Diese DNA wird mit T4-Polymerase für 30 min bei 37ºC in einem 20 ul-Reaktionsgemisch behandelt, enthaltend: 2 ug DNA, 67 mM Tris/HCl pH 8,8, 6,7 mM MgCl&sub2;, 16,7 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 5 mM Dithiothreitol, 50 uM jeweils dGTP, dATP, dCTP und dTTP, 1 U T4-Polymerase. Nach Ethanolfällung werden 100 ng dieser DNA mit 10 pM unphosphorylisiertem EcoRI-Oligonucleotidlinker mit der Sequenz 5'GGAATTCC bei Raumtemperatur für 2 h in einem 5 ul Reaktionsgemisch, enthaltend: 100 ng DNA, 10 pM Linker, 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP und 1 U Ligase, ligiert. Dieses Gemisch wird in E. coli DH5αF' transformiert und für Plasmid enthaltende Zellen auf 2xYT plus 50 ug/ml Ampicillin abgesucht. Nach Herstellung von DNA aus 18 Kolonien und Absuchen derer durch Restriktionsaufschluß wird Plasmid pGW1100-E, umfassend die EcoRI-Linkersequenz und ohne NsiI-Stelle identifiziert.
Plasmid pGIIss-IFN AM119, hergestellt gemäß Beispiel 4.2., enthält den Aspergillus niger-PGII-Promotor und die Signalsequenz, fusioniert an ein IFN-Gen, das gefolgt wird von dem Saccharomyces cerevisiae PHO5-Terminator und den PGII- Terminator. Dieses Plasmid wird mit Psti am Ende des PHO5- Promotors geschnitten und glatt beendigt mit T4-Polymerase und ligiert zu einem SphI-Oligonucleotidlinker mit der Sequenz 5'GGCATGCC und in E. coli DH5α transformiert, genau wie vorstehend beschrieben, unter Herstellung von Plasmid pGIIss- IFNAM119Sph.
50 ng der nachstehenden vier gereinigten Fragmente werden miteinander wie vorstehend ligiert:
- Das 742 Basenpaar BamHI/NsiI-Fragment, enthaltend den pki-Promotorbereich, von mutierter M13mp18-PK-(BamHI- NsiI-PvuII)-RF-DNA. Die NsiI-Stelle wird durch Behandlung des mit NsiI geschnittenen Plasmids mit T4-Polymerase vor Schneiden mit BamHI entfernt.
- Das etwa 1,1 kBp große BamHI/SphI-Fragment, enthaltend das 3'-Ende des PGII-Promotors plus der PGII-Signalsequenz plus dem IFN-Gen, von PGIIss-IFNAM119SRh. Die BamHI- Stelle wurde mit T4-Polymerase vor dem Schneiden mit SphI aufgefüllt.
- Das 417 Bp SphI/EcoRI-Fragment, enthaltend den Terminatorbereich des pki-Gens, von pGW1100-E.
- Das etwa 2,8 kB-Fragment von BamHI/EcoRI geschnittenem pTZ18R (Pharmacia). Nach Transformation in E. coli DH5αF' und Absuchen wird Plasmid PKI-IFN-1 identifiziert.

Beispiel 4.4.: Mutagenese von pPKI-IFN-1 zur Herstellung von pPKI-IFN-2 und pPKIssIFN-2

Plasmid pPKI-IFN-1 wurde in einen dut&supmin;ung&supmin;-E. coli- Stamm BW313 transformiert. Dieser wurde superinfiziert mit M13K07 unter Bereitstellung eines einsträngigen Uracil substituierten Phagen von dem Plasmid. Diese Phagen-DNA wurde hergestellt und wie vorstehend beschrieben, mit zwei unterschiedlichen Oligonucleotiden IFN-1 bzw. TFN-2 mutagenisiert, deren Sequenzen in dem Sequenzlisting mit SEQ ID NR. 12 bzw. 13 ausgewiesen sind. Mutagenisieren mit Oligonucleotid IFN-1 ergibt pPKI-IFN-2 und mit IFN-2 ergibt ergibt pPKIssIFN-2. Beide Plasmide umfassen perfekte In-Raster-Fusionen. pPKI- IFN-2 weist den pki-Pramotor, fusioniert an ein Methioninstartcodon, auf und dann den Rest des IFN-Gens und pPKIssIFN- 2 weist das pki-Gen, fusioniert an die PGII-Signalfrequenz, auf, gefolgt von dem IFN-Gen. Die Nucleotidsequenzen der Bereiche pPKI-IFN-2 und pPKIssIFN-2, die sich vom pki-Promotor bis zum Terminatorbereich erstrecken, sind unter SEQ ID NR. 14 bzw. 15 ausgewiesen.

Beispiel 4.5.: Transformation des PKI-IFN-Expressionsplasmids in Aspergillus niger

Die Plasmide pPKI-IFN-2 und pPKIssIFN-2 werden in A. niger N593 unter Verwendung des A. niger-pyrA-Gens als selektierbaren Marker auf Plasmid pGW613, wie vorstehend beschrieben, cotransformiert.

Beispiel 4.6.: Analyse der Transformanten

Die Transformanten von Beispiel 4.5. werden hinsichtlich Erzeugung von IFN durch Westernanalyse, wie beschrieben in Beispiel 3.2., jedoch unter Verwendung eines Antikörpers gegen TFN (anstelle eines Anti-PLII-Antikörpers) analysiert.

Hinterlegte Mikroorganismen

E. coli DH5αF'/pGW1100 wurde als Nr. DSM 5747 am 18. Januar 1990 und A. niger N593 als Nr. DSM 5756 am 26. Januar 1990, gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D- 3300 Braunschweig hinterlegt.

Literatur

- Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W., Crosa, J.W., und S. Falkow (1977) Construction and Characterization of new cloning vehicles 11: A multipurpose cloning system. Gene 2: 95.
- BRL: M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual
- Burke, R.L., Tekamp-Olson, P. und Najarian, R. (1983): The isolation, characterization and sequence of the pyruvate kinase gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 258: 2193-2201.
- Dotto, P.D. und Zinder, N.D. (1984). Nature 311: 279
- Goosen, T., Bloemheuvel, G., Gysler, C., de Bie, D.A., van den Broek, H.W.J. und Swart, K. (1987) Transformation of Aspergillus niger using the homologous orotidine-5'- phosphate-decarboxylase gene, Curr. Genet.,11: 499-503.
- de Graaff, L.H., van den Broek, H.W.J. und Visser, J. (1988): Isolation and transformation of the Aspergillus nidulans pyruvate kinase gene. Curr. Genet., 13: 315-321.
- de Graaff, L.H. (1989). The structure and expression of the pyruvate kinase gene of Aspergillus nidulans and Aspergillus niger, Dissertation, Landwirtschaftliche Universität von Wageningen. Niederlande.
- Horton, R.M. Hunt, H.D. Ho, S.N., Pullen, J.K., und Pease, C.R. (1989). Engineering hybrid genes without the use of restriction enzynes: gene splicing by overlap extension. Gene 77: 61-68.
- Kunkel, T. (1985): Rapid und efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492.
- Maniatis T., E.F. Fritsch, J. Sambrook (1982): Molecular cloning, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
- Mead et al. (1986). Protein Engineering 1: 67.
- Messing, J. (1979). A multipurpose cloning System based on single stranded DNA bacteriophage M13. Recomb. DNA Techn. Bull 2 (2): 43.
- Messing, J. (1983): New M13 vectors for cloning. Methods in Enzymol., 101C: 20-78
- Ner, Sarbjit S., Goodin, D.B. und Smith, M. (1988): A simple and efficient procedure for generating random point mutations and for codon replacements using mixed oligodeoxynucleotides, DNA, Bd. 7, Nr. 2: 127-134.
- Norrander, J., Kempe, T. und Messing, J. (1983): Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide directed mutagenesis. Gene, 26: 101-106
- Pharmacia: Manual for the M13-cloning/sequencing system, including M13mp18/M13mp19.
- Peden, K.W.C. (1983). Revised sequence of the tetracyclinresistance gene of pBR322. Gene 22, 277-280.
- Sanger, F., Nickelen, S. und Coulson, A.R. (1977): DNA sequencing with chain terminating inhibitors; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467.
- Schnitt, J.J. und Cohen, B.N. (1983). Quantitative isolation of restriction fragments from low-melting agarose by Elutip-α affinity chromatography. Analytical Biochemistry 133: 462-464.
- Slater, R.J. (1985): The extraction of total RNA by the detergent and phenol method. In: Walker J.M. (Herausg.), Methods in Molecular Biology, Bd. 2, 1985, Nucleic acids, Humana press, Cliftar, New Yersey, Seiten 101-108
- Sutcliffe, J.G. (1979). Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symposia Quant. Biol. 43: 77-90.
- Ti-zi Su und M. Raafat El-Gewely (1988): A multisite-directed mutagenesis using T&sub7;-polymerase: application for reconstructing a mammalian gene, Gene 69: 81-89.
- van Houdenhoven, F.E.A. (1975): Dissertation, Landwirtschaftliche Universität, Wageningen, Niederlande.
- Vishniac, W. und Santer (1957). Bacteriol. Rev. 21: 195-213.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, daß ein für ein derartiges Polypeptid codierendes Strukturgen, ausgenommen das homologe pki-Strukturgen, mit dem Promotor (pki) für die A. niger-Pyruvatkinase-Transkription, der sich von einem Nukleotid in der Position von etwa 300 bis zu einem Nukleotid in der Position von etwa 1042 der in SEQ ID NR. 1 beschriebenen DNA-Sequenz erstreckt, in funktionsfähigem Zustand gebunden ist und in einem geeigneten Wirt exprimiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Wirt ein Fadenpilz oder eine Hefe ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Wirt nicht in der Lage ist, Polygalacturonase oder Pectinlyase zu exprimieren oder welcher Polygalacturonase oder Pectinlyase in geringer Menge exprimiert.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Wirt ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus A. niger, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces lactis.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Humanhybridinterferon BDBB erzeugt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine A. niger-Pectinlyase erzeugt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine A. niger-Polygalacturonase erzeugt wird.