DE3153606C2

DE3153606C2 -

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Publication number: DE3153606C2
Application number: DE3153606A
Authority: DE
Inventors: Dennis G. San Mateo Calif. Us Kleid; Daniel G. San Francisco Calif. Us Yansura; Herbert L. Burlingame Calif. Us Heyneker; Giuseppe F. Augarten Rheinfelder Ch Miozarri
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1980-03-24
Filing date: 1981-03-23
Publication date: 1991-04-25
Anticipated expiration: 2001-03-24
Also published as: EP0036776B1; EP0086548A2; EP0036776A2; MX7689E; NZ207660A; ES509936A0; YU45534B; IL71885A; KR830005351A; EP0086548B1; ES8304206A1; ES8305042A1; ES8207220A1; IE51892B1; NO161572B; FR2555199A1; CS238612B2; IE51893B1; YU75681A; FR2480781B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zum Schneiden doppelsträngiger DNA. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Mit dem Aufkommen der DNA-Rekombinations-Technologie ist die kontrollierte bakterielle Produktion einer enormen Vielfalt nützlicher Polypeptide möglich geworden. Man hat bereits Bakterien in der Hand, die durch diese Technologie verändert wurden, um die Produktion derartiger Polypeptid- Produkte zu ermöglichen, wie z. B. Somatostatin (K. Itakura, et al., Science 198, 1056 (1977)), die jeweils einzelnen A- und B-Ketten des menschlichen Insulins (D. V. Goeddel, et al., Proc Nat'l Acad Sci, USA 76, 106 (1979)) und menschliches Wachstumshormon (D. V. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)). Kürzlich wurde die DNA-Rekombinations-Technik dazu verwendet, um die bakterielle Herstellung von Thymosin α1 zu ermöglichen, einer immunverstärkenden Substanz, die in der Thymusdrüse gebildet wird (US-Patentanmeldung von Roberto Crea und Ronald Wetzel vom 28. Februar 1980, übertragen auf die Anmelderin der vorliegenden Anmeldung). Die Möglichkeiten dieser Technologie sind derartig durchschlagend, daß so gut wie jedes nützliche Polypeptid bakteriell hergestellt werden kann und die kontrollierte Herstellung von Hormonen, Enzymen, Antikörpern und Impfstoffen gegen eine große Vielfalt von Krankheiten in Reichweite gebracht wird. Die zitierten Veröffentlichungen, die im Detail die obengenannten repräsentativen Beispiele beschreiben, sowie weitere, im folgenden genannte Veröffentlichungen, welche den Hintergrund der Erfindung bilden, sind durch Verweis in die Offenbarung mit einbezogen.

Das Arbeitspferd der DNA-Rekombinations-Technik ist das Plasmid, ein nichtchromosomaler Ring doppelsträngiger DNA, der in Bakterien gefunden wird und oft in vielfacher Kopie pro Bakterienzelle vorliegt. Die DNA des Plasmids enthält eine Information, die benötigt wird, um das Plasmid in Tochterzellen zu reproduzieren (d. h. ein "Replikon") und normalerweise ein oder mehr Selektions-Charakteristika, wie z. B. Resistenz gegen Antibiotika, die es erlauben, diejenigen Clone der Wirtszelle, die das interessierende Plasmid enthalten, zu erkennen und bevorzugt in selektivem Medium wachsen zu lassen. Der Nutzen der bakteriellen Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie durch die eine oder andere Restriktionsendonuklease oder "Restriktionsenzym" spezifisch geschnitten werden können, von denen jedes eine andere Stelle auf der Plasmid-DNA erkennt. Danach können heterologe Gene oder Genfragmente in das Plasmid eingefügt werden, wobei entweder die Enden der Schnittstellen oder unmittelbar an die Schnittstellen angefügte Enden miteinander verbunden werden. Im folgenden wird der Terminus "heterolog" für ein Gen verwendet, das normalerweise nicht in E. coli gefunden wird oder eine Polypeptidsequenz, die normalerweise nicht durch E. coli hergestellt wird. Der Terminus "homolog" wird für ein Gen oder Polypeptid verwendet, das in Wildtyp E. coli hergestellt wird. Die DNA-Rekombination wird außerhalb der Bakterie durchgeführt. Das resultierende "rekombinante" Plasmid kann durch ein Verfahren, das als Transformation bekannt ist, in Bakterien eingeführt werden, und man erhält große Mengen des rekombinanten Plasmids, das das heterologe Gen enthält, indem man die Transformanten wachsen läßt. Wenn das Gen im Hinblick auf Bereiche des Plasmids, die die Transkription und Translation der codierten DNA-Information regeln, richtig eingefügt ist, kann der resultierende Expressionsvektor dazu verwendet werden, tatsächlich die Polypeptidsequenz zu produzieren, für die das inserierte Gen codiert, ein Prozeß, der Expression genannt wird.

Die Expression wird in einer Gegend initiiert, die als Promoter bekannt ist, der von der RNA-Polymerase erkannt wird und an den diese bindet. In einigen Fällen, wie z. B. beim trp-Operon, das im nachfolgenden noch ausführlich diskutiert werden wird, werden Promoterregionen von "Operator"- Regionen überlappt, wodurch ein kombinierter Promoter- Operator gebildet wird. Operatoren sind DNA-Sequenzen, die von sogenannten Repressorproteinen erkannt werden, die dazu dienen, die Häufig der Initiation der Transkription an einem speziellen Promoter zu regulieren. Die Polymerase arbeitet sich an der DNA entlang, wobei sie die in dem codierenden Strang enthaltene Information vom 5′- zum 3′-Ende in Messenger-RNA (mRNA) transkribiert, die ihrerseits wieder in ein Polypeptid translatiert wird, das die Aminosäuresequenz aufweist, für die die DNA codiert. Jede Aminosäure wird durch ein einziges Nukleotidtriplet oder "Codon" codiert, das innerhalb eines "Strukturgens" liegt, wie man es für die vorliegenden Zwecke nennen mag, d. h. in dem Teil, der für die Aminosäuresequenz des exprimierten Produkts codiert. Nach dem Binden an den Promoter transkribiert die RNA-Polymerase vorerst Nukleotide, die für eine Ribosomen- Bindestelle codieren, sodann ein Initiations- oder "Start"- Signal (normalerweise ATG, das in der resultierenden mRNA zu AUG wird) und schließlich die Nukleotidcodons innerhalb des Strukturgens selbst. Sogenannte Stop-Codons werden am Ende des Strukturgens transkribiert, wonach die Polymerase eine zusätzliche Sequenz von mRNA bilden kann, die, aufgrund der Anwesenheit des Stopsignals, von den Ribosomen nicht mehr translatiert wird. Ribosomen binden an die auf der mRNA zur Verfügung gestellten Bindestelle, bei Bakterien normalerweise wenn die mRNA gebildet wird, und stellen selbst das codierte Polypeptid her, wobei sie am Translations- Startsignal beginnen und an dem oben erwähnten Stopsignal enden. Das gewünschte Produkt wird hergestellt, wenn die Sequenzen, die für die Ribosomen-Bindestelle codieren, im Hinblick auf das AUG-Initiatorcodon richtig liegen und wenn alle übrigen Codons dem Initiatorcodon in Phase folgen. Das resultierende Produkt kann erhalten werden, indem man die Wirtszelle lysiert und das Produkt durch geeignete Reinigungsschritte von anderen bakteriellen Proteinen trennt.

Die durch die Anwendung der DNA-Rekombinations-Technik exprimierten Polypeptide können vollkommen heterolog sein, wie im Falle der direkten Expression des menschlichen Wachstumshormons, können aber auch andererseits ein heterologes Polypeptid enthalten, das zumindest mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Peptids verbunden ist, wie im Fall der Herstellung von Zwischenprodukten für Somatostatin und die Bestandteile des menschlichen Insulins. Im letzteren Fall enthält beispielsweise das angefügte homologe Polypeptid einen Teil der Aminosäuresequenz für β-Galactosidase. In diesen Fällen ist das angestrebte bioaktive Produkt durch das angefügte homologe Polypeptid so lange bioinaktiv, bis dieses durch extrazelluläre Maßnahmen abgeschnitten wird. Die ebengenannten "Fusionsproteine" können so hergestellt werden, daß ein hochspezifisches Schneiden des Vorläuferproteins von dem angestrebten Produkt ermöglicht ist, beispielsweise durch die Einwirkung von Bromcyan auf Methionin oder aber durch enzymatisches Schneiden; siehe auch GB-PS Nr. 20 07 676 A.

Wenn die DNA-Rekombinations-Technologie ihr Versprechen voll halten soll, müssen Systeme erdacht werden, die die Expression der Geninsertionen optimieren, so daß das angestrebte Polypeptid-Produkt in großen Mengen erhalten werden kann. Die β-Lactamase- und Lactose-Promoter-Operator- Systeme, die in der Vergangenheit üblicherweise verwendet wurden, haben, obwohl sie gut zu verwenden sind, vom Standpunkt der Menge her die Kapazität der Technologie nicht voll ausgenutzt. Es besteht ein Bedürfnis für einen bakteriellen Expressionsvektor, der fähig ist, das gewünschte Polypeptid-Produkt in größerer Menge kontrolliert zu exprimieren.

Tryptophan ist eine Aminosäure, die von Bakterien als Bestandteil eines homologen Polypeptids verwendet wird und in einem Biosyntheseweg hergestellt wird, der folgende Schritte enthält: Chorisminsäure → Anthranilsäure → Phosphoribosylanthranilsäure → CDRP (Enol-1-(o-Carboxyphenylamino)- 1-desoxy-D-Ribulose-5-Phosphat) → Indol- 3-Glycerinphosphat und letztlich Tryptophan selbst. Die enzymatischen Reaktionen dieses Syntheseweges werden durch Produkte des Tryptophan- oder "trp"-Operons katalysiert, einem polycistronischen DNA-Segment, das unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems transkribiert wird. Die resultierende polycistronische mRNA codiert die sogenannte trp-Führer- (im folgenden "Leader"- genannte) Sequenz und dann, der Reihe nach, die Polypeptide, genannt trpE, trpD, trpC, trpB und trpA. Diese Polypeptide katalysieren und kontrollieren auf verschiedene Weise einzelne Schritte des Syntheseweges ausgehend von der Chorisminsäure bis zum Tryptophan.

Im Wildtyp E. coli ist das Tryptophan-Operon unter der Kontrolle mindestens dreier, deutlich zu unterscheidender Arten. Im ersten Fall, einer Promoter-Operator-Repression, handelt das Tryptophan als Corepressor und bindet an seinen Aporepressor, um einen aktiven Repressorkomplex zu bilden, der seinerseits an den Operator bindet, wodurch das Tryptophan seinen eigenen Syntheseweg vollkommen verschließt. Zweitens bindet Tryptophan in einem Prozeß von Rückkopplungshemmung an einen Komplex der trpE- und trpD-Polypeptide und verhindert dadurch deren Beteiligung an dem Syntheseweg. Letztlich wird eine Kontrolle ausgeübt durch einen Prozeß, der als "Attenuierung" bekannt ist. Dieser Vorgang läuft unter der Kontrolle einer "Attenuator-Region" des Gens ab, einer Region, die innerhalb der trp-Leader- Sequenz liegt. Die Attenuierung ist ein Vorgang, der phänotypisch als eine Art Verdünnung des Tryptophans in der Zelle in Erscheinung tritt (siehe dazu allgemein G. F. Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457 (1978); The Operon 263-302, Cold Spring Harbor Laboratory (1978), Miller und Reznikoff, eds.; F. Lee et al., Proc Nat'l Acad Sci, USA 74, 4365 (1977) und K. Bertrand et al., J. Mol. Biol. 103, 319 (1976)). Das Ausmaß der Attenuierung scheint durch die intrazelluläre Konzentration des Tryptophans geregelt zu werden, und in Wildtyp E. coli beendet der Attenuator die Expression in ungefähr neun von zehn Fällen, möglicherweise durch die Bildung einer Sekundärstruktur, eines "Terminationsrings" in der mRNA, welcher die RNA-Polymerase dazu veranlaßt, sich verfrüht von der DNA zu lösen.

Andere Autoren haben das trp-Operon dazu verwendet, um bis zu einem gewissen Grad heterologe Polypeptide zu exprimieren. Mit diesen Arbeiten hat man sich versuchsweise mit Problemen der Repression und Attenuierung befaßt, wobei Indolacrylsäure zugegeben wird, ein Induktor und Analogon, das mit Tryptophan um das trp-Repressor-Molekül konkurriert, wobei durch kompetitive Hemmung auf Derepression abgezielt wurde. Gleichzeitig verringert der Induktor durch Hemmung der enzymatischen Umwandlung von Indol zu Tryptophan die Attenuierung und bewirkt dadurch, daß der Zelle Tryptophan entzogen wird. Als Ergebnis davon lesen mehr Polymerasen erfolgreich über den Attenuator hinweg. Vom Standpunkt der vollständig durchgehenden Translation und der angestrebten großen Mengen erscheint dieser Versuch jedoch problematisch, da die Tryptophan-enthaltenden Proteinsequenzen während der Synthese infolge des Mangels von nutzbarem Tryptophan vorzeitig beendet werden. Tatsächlich ist bei diesem Versuch eine wirkungsvolle Unterstützung der Attenuierung vollständig von einer strengen Tryptophan-Aushungerung abhängig.

In der Stammanmeldung der vorliegenden Anmeldung (P 31 11 405.9) werden neue, von Plasmiden abgeleitete Expressionsvektoren für das Herstellen von heterologen Polypeptid-Produkten in Bakterien bereitgestellt. Diese Vektoren haben eine Sequenz von doppelsträngiger DNA, die in Phase von einem ersten 5′- zu einem zweiten 3′-Ende des codierenden Strangs folgende Bestandteile enthält: einen trp-Promoter-Operator, Nukleotide, die für die trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle codieren und Nukleotide, die für die Translationsinitiatoren zur Expression eines Strukturgens codieren, welches für die Aminosäuresequenz eines heterologen Polypeptids codiert. Diese beschriebene DNA-Sequenz enthält weder eine trp- Attenuator-Region noch Nukleotide, die für die trpE-Ribosomen- Bindestelle codieren. Statt dessen wird die trp-Leader- Ribosomen-Bindestelle wirkungsvoll dazu verwendet, die Expression von Information zu bewirken, die durch inserierte Gene codiert wird.

Mit einem, einen trp-Promoter-Operator enthaltenden Plasmid, das keinen Attenuator aufweist, werden Zellen transformiert und in Gegenwart von zugegebenem Tryptophan kultiviert. Mit der Verwendung von Tryptophan- reichem Medium steht ausreichend Tryptophan zur Verfügung, um im wesentlichen vollständig den trp-Promoter- Operator durch trp/Repressorinteraktionen zu reprimieren, so daß das Zellwachstum, ungehemmt durch vorzeitige Expression großer Mengen von heterologen Polypeptiden, fortschreiten kann, wobei dieses Polypeptid durch eine Insertion codiert wird, die ansonsten unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems steht. Sobald einerseits die Kultur der Rekombinanten zu einer Dichte angewachsen ist, die für eine industrielle Herstellung des Polypeptids geeignet ist und andererseits das von außen zugeführte Tryptophan entfernt wurde, läßt man die Zellen lediglich mit dem Tryptophan wachsen, das sie selbst produzieren. Das Ergebnis ist eine schwache Tryptophanlimitierung, wodurch folglich der Syntheseweg dereprimiert wird und eine überaus wirksame Expression der heterologen Insertion auftritt, unbehindert durch Attenuierung, da die Attenuator- Region aus dem System entfernt wurde. Auf diese Weise wird den Zellen niemals ernstlich Tryptophan entzogen, und alle Proteine, ob sie Tryptophan enthalten oder nicht, können in einem ausreichenden Umfang produziert werden.

Die vorliegende Erfindung stellt nun ein Verfahren zur Verfügung, um doppelsträngige DNA an jeder beliebigen, gewünschten Stelle zu schneiden, auch wenn eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym fehlt, eine Technik, die unter anderem für das Herstellen eines trp-Operons brauchbar ist, welches Attenuator-Deletionen aufweist, die sich von denjenigen unterscheiden, die man früher durch Selektion von Mutanten erhalten hat.

Die folgende Beschreibung sowie Zeichnungen erläutern die Erfindung. Es zeigen dabei die

Fig. 1a, 1b und 2 ein Schema für die Herstellung eines Plasmides unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei das Plasmid fähig ist, heterologe Gene (wie in dem dargestellten Fall für Somatostatin), fusioniert mit einem Teil des trpD-Polypeptides zu exprimieren, wobei die Fusion später abgespalten werden kann;

Fig. 3 das Ergebnis einer Polyacrylamid-Gel-Trennung von Zellprotein, das homolog(trpE)-heterologe Fusionsproteine zum Herstellen von Somatostatin bzw. Thymosinα1, menschlichem Proinsulin und der A- und B-Ketten des menschlichen Insulins enthält.

In den Figuren werden aus Gründen der Klarheit der Darstellung in den meisten Fällen nur der codierende Strang des doppelsträngigen Plasmids und lineare DNA-Stränge gezeichnet. Gene, die für die Resistenz gegen ein Antibiotikum codieren, werden als ap^R (Ampicillin-Resistenz) und tc^R (Tetracyclin-Resistenz) bezeichnet. Die Bezeichnung tc^S bedeutet ein Gen für Tetracyclin-Resistenz, das nicht unter der Kontrolle eines Promoter-Operator-Systems steht, so daß Plasmide, die dieses Gen enthalten, dennoch Tetracyclin- sensitiv sind. Die Bezeichnung ap^S bezeichnet eine Ampicillin-Sensitivität, die durch die Deletion eines Teils des Gens entstanden ist, das für Ampicillin-Sensitivität codiert. Promotoren und Operatoren des Plasmids werden mit p und o bezeichnet. Die Buchstaben A, T, G bzw. C bezeichnen die Nukleotide, die die Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin enthalten. Weitere Legenden der Figuren werden aus dem Text ersichtlich.

Die verwendeten Restriktionsendonukleasen sind im folgenden bezeichnet und mit ihrer zugehörigen Erkennungssequenz sowie dem Schneidemuster (angezeigt durch Pfeile) beschrieben.

Wo die Schnittpunkte auf den entsprechenden Strängen voneinander entfernt sind, werden die geschnittenen Enden "sticky", d. h. überstehend, und insofern in der Lage sein, sich wieder neu zu verbinden, bzw. diese "sticky-ends" können mit einer anderen, komplementären "sticky-end"-DNA durch Watson-Crick-Basenpaarung (A mit T und G mit C) korrekt miteinander verzapft werden. Einige Restriktionsenzyme, beispielsweise die oben beschriebenen HpaI und PvuII, hinterlassen nach dem Schnitt stumpfe Enden. Die oben gezeigten Nukleotidsequenzen sind gemäß einer diesbezüglichen Übereinkunft in der folgenden Weise dargestellt: Der obere Strang ist der Protein-codierende Strang, und man bewegt sich fortschreitend von links nach rechts vom 5′- zum 3′-Ende dieses Strangs, d. h. in Richtung der Transkription von einem proximalen zu einem distalen Punkt.

Schließlich bezeichnet, im Hinblick auf die Übereinkunft, das Symbol "Δ" eine Deletion. Daher bezeichnet eine Benennung eines Plasmids, wie beispielsweise "ΔEcoRI-XbaI", dasjenige Plamids, aus welchem die Nukleotidsequenz zwischen den EcoRI- und XbaI-Erkennungsstellen der entsprechenden Restriktionsenzyme durch Verdauung durch diese Enzyme entfernt wurde. Der Einfachheit halber wurden verschiedene Deletionen durch Zahlen bezeichnet. Die Bezeichnung "Δ1" bedeutet daher, beginnend vom ersten Basenpaar (Bp) der EcoRI-Erkennungsstelle, die auf das Gen für Tetracyclin- Resistenz in dem Elternplasmid pBR322 folgt, eine Deletion vom Bp 1-30 (d. h. ΔEcoRI-HindIII) und daraus folgend ein Ausschalten des Tetracyclin-Promoter-Operator-Systems. Als "Δ2" wird eine Deletion der Bp 1-375 verstanden (d. h. ΔEcoRI-BamHI) und infolgedessen ein Entfernen sowohl des Tetracyclin-Promoter-Operators und der Strukturgene, die für Tetracyclin-Resistenz codieren. Die Bezeichnung "Δ3" bedeutet eine Deletion der Bp 3611-4359 (d. h. ΔPstI-EcoRI) und die Eliminierung der Ampicillin-Resistenz. "Δ4" wird verwendet, um das Entfernen der Bp ∼900-∼1500 vom trp- Operon-Fragment 5 (Fig. 1) zu bezeichnen, in dem die Strukturgene für das trpD-Polypeptid eliminiert sind.

Die trp-Leader-Sequenz ist aus den Basenpaaren (Bp) 1-162 aufgebaut, angefangen vom Startpunkt für die trp- mRNA. Ein auf 14 Aminosäuren geschätztes trp-Leader-Polypeptid wird durch die Bp 27-71 codiert, die den ATG- Nukleotiden folgen, die für das Translations-Startsignal codieren. Die trp-Attenuator-Region enthält aufeinanderfolgend GC-reiche und AT-reiche Sequenzen, die zwischen den Bp 114 und 156 liegen. Die Attenuierung wird offensichtlich durch mRNA-Nukleotide bewirkt, die durch die Bp ∼134-141 der Leader-Sequenz codiert werden. Um heterologe Polypeptide unter dem Einfluß der trp-Leader-Ribosomen- Bindestelle zu exprimieren und gleichzeitig die Attenuierung zu verhindern, müssen die folgenden Kriterien beachtet werden:

1. Die Basenpaare 134-141 oder noch mehr über das Bp 141 hinaus müssen deletiert werden;
2. das ATG-Codon des inserierten Gens muß, wie bekannt, in der richtigen Lage zu einer Ribosomen-Bindestelle ausgerichtet sein (siehe z. B. J. A. Steitz "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA" in Biological Regulation and Control (ed. R. Goldberger) Plenum Press, N. Y. (1978));
3. wo ein homolog-heterologes Fusionsprotein produziert werden soll, sollte das Translations-Startsignal einer homologen Polypeptidsequenz verfügbar bleiben, und die Codons für den homologen Teil des Fusionsproteins müssen in Phase ohne dazwischenliegende Translations-Stopsignale inseriert werden.

Wenn beispielsweise alle Basenpaare innerhalb der Leader- Sequenz distal vom Bp 70 deletiert werden, wird die Attenuator-Region entfernt, die ATG-Sequenz, die für das Translations-Startsignal codiert, verbleibt und der dazwischenliegende Translations-Stop, codiert durch TCA (Bp 69-71), wird entfernt durch Eliminieren von A und die darauffolgenden Nukleotide. Eine derartige Deletion hätte als Ergebnis die Expression eines Fusionsproteins, das mit dem Leader-Polypeptid beginnt und mit demjenigen Polypeptid endet, das durch irgendeine heterologe Insertion codiert wird. Von diesen Polypeptiden wird eine distale Region eines an die Leader-Sequenz anschließenden trp-Operon- Polypeptids eingeschlossen, die durch das Ausmaß der Deletion in der 3′-Richtung bestimmt wird. Eine in das Gen E hineinreichende Deletion würde daher zur Expression eines homologen Vorläufers führen, der die L-Sequenz und die distale Region des Gens E (jenseits des Endpunkts der Deletion) enthält, verbunden mit der Sequenz, die durch irgendeine folgende Insertion codiert wird, usw.

Zwei Plasmide, aus denen die Attenuator- Region entfernt wurde, sind die Plasmide pGM1 und pGM3 (G. F. Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457 (1978)). Diese Plasmide tragen die Deletionen trp ΔLE 1413 und trp ΔLE 1417 und exprimieren (unter der Kontrolle des trp- Promoter-Operators) ein Polypeptid, das ungefähr die ersten sechs Aminosäuren des trp-Leaders und distale Regionen des E-Polypeptids enthält. In dem Fall des Plasmids pGM1 wird lediglich etwa das letzte Drittel des E-Polypeptids exprimiert, wohingegen pGM3 nahezu die gesamte distale Hälfte des E-Polypeptid-Codons exprimiert. Der Stamm E. coli K-12 W3110 tna 2 ^- trp ^-Δ102, der pGM1 enthält, ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Nummer 31622 hinterlegt. Das Plasmid pGM1 kann auf herkömmliche Weise aus dem genannten Stamm zur Verwendung in den unten beschriebenen Verfahren entfernt werden.

Erfindungsgemäß werden nun Deletionen durch das spezifische Schneiden von doppelsträngiger DNA an jeder gewünschten Stelle eingeführt. Diese Schneidetechnik wird im folgenden durch ein Beispiel erläutert. Erfindungsgemäß wird doppelsträngige DNA in einem den beabsichtigten Schneidepunkt umgebenden Bereich durch Reaktion mit λ-Exonuklease in einzelsträngige DNA umgewandelt. Daraufhin wird ein synthetischer oder anderer Einzelstrang-DNA-Primer an das vorher gebildete Einzelstrangstück durch Watson-Crick-Basenpaarung hybridisiert. Dabei muß sichergestellt sein, daß das 5′-Ende der Primer- Sequenz exakt gegenüber demjenigen Nukleotid auf dem ersten Strang endet, das genau vor dem beabsichtigten Schneidepunkt liegt. Als nächstes wird der Primer durch Reaktion mit DNA-Polymerase in 3′-Richtung verlängert, wodurch derjenige Teil der ursprünglich doppelsträngigen DNA, der vor dem beabsichtigten Schnittpunkt liegt, wieder hergestellt wird, der im ersten Schritt verlorengegangen war. Gleichzeitig oder danach wird derjenige Teil des ersten Stranges, der jenseits des beabsichtigten Schnittpunkts liegt, wegverdaut. Das nachfolgende Schema veranschaulicht diesen Vorgang noch einmal, wobei "v" den beabsichtigten Schnittpunkt kennzeichnet:

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Schritte (d) und (e) gleichzeitig ausgeführt, wobei eine Polymerase verwendet wird, die gleichzeitig die vorstehenden Einzelstrangenden in der 3′ → 5′-Richtung verdaut und den Primer (in Anwesenheit von dATP, dGTP, dTTP und dCTP) in der 5′ → 3′-Richtung verlängert. Besonders geeignet für diese Zwecke ist die Klenow-Polymerase I, d. h. dasjenige Fragment, das durch proteolytisches Spalten der DNA-Polymerase I erhalten wird und die 5′ → 3′-Polymerisierungsaktivität sowie die 3′ → 5′- Exonukleaseaktivität des Elternenzyms aufweist, dagegen seine 5′ → 3′-Exonukleaseaktivität verloren hat (A. Kornberg, DNA Synthesis, 98, W. H. Freeman und Co., SFO (1974)).

Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können Attenuator-Deletionen in einem ein trp-Operon enthaltenden Plasmid auf jede nur gewünschte Weise eingeführt werden. Das Plasmid wurde vorher in die lineare Form überführt, beispielsweise durch einen Schnitt an einer Restriktionserkennungsstelle stromabwärts von dem beabsichtigten Schnittpunkt, an dem das Molekül stumpfendig sein soll (siehe Bereich "v" im oben gezeigten Schema). Nach dem Deletieren der Attenuator-Region wird das Plasmid wieder in die Ringform gebracht. Dies kann beispielsweise durch Verbinden der stumpfen Enden oder auch durch andere Methoden geschehen, die dem Fachmann bekannt sind.

Die DNA-Rekombinations-Experimente, die in dem folgenden Beispiel beschrieben werden, wurden bei Genentech Inc. in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institutes of Health (NIH) bezüglich der Forschung mit rekombinanter DNA durchgeführt.

Hinsichtlich der verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sowie den Kultivierungsbedingungen einschließlich Repression und Expression sowie für alle weiteren Details der Durchführung der Experimente wird auf die korrespondierende Stammanmeldung P 31 11 405.9 verwiesen.

Beispiel

Herstellen eines Plasmids, das das Tryptophan-Operon enthält, fähig zur Expression eines spezifisch spaltbaren Fusionsproteins, das aus sechs Aminosäuren des trp-Leader-Peptids, dem letzten Drittel des trpE-Polypeptids (genannt LE′) sowie einem heterologen Strukturgen- Produkt besteht.

Die Strategie für das Herstellen eines Plasmids, das ein LE′-Fusionsprotein exprimiert, beinhaltet folgende Schritte:

a) Bereitstellen eines Genfragments, das aus Codons für die distale Region des LE′-Polypeptids besteht und überstehende Enden einer BglII- Erkennungsstelle am 5′-Ende und einer EcoRI- Erkennungsstelle am 3′-Ende des codierenden Strangs aufweist;
b) Eliminieren der Codons von der distalen Region des LE′-Genfragments und derjenigen für die trpD- Gene aus dem Plasmid Som7Δ2 und Inserieren des in Stufe 1 gebildeten Fragments, wodurch die LE′- Codonsequenz unmittelbar stromaufwärts von der für das heterologe Gen für Somatostatin codierenden Codonsequenz wiederhergestellt wird.

Fig. 1a zeigt die HindIII-Verdauung des Plasmids pSom7Δ2 (siehe Stammanmeldung P 31 11 405.9), gefolgt von einer λ-Exonuklease-Verdauung (einer 5′ → 3′-Exonuklease) unter Bedingungen, die so gewählt werden, daß jenseits der BglII-Restriktionserkennungsstelle innerhalb der LE′ codierenden Region verdaut wird. 20 µg des HindIII-verdauten pSom7Δ2 werden in Puffer gelöst (20 mM Glycinpuffer pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1 mM β-Mercaptoäthanol). Das erhaltene Gemisch wird mit 5 Einheiten λ-Exonuklease 60 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt. Die so erhaltene Reaktionsmischung wird dann Phenol-extrahiert, Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt.

Um letztlich einen EcoRI-Rest am distalen Ende des LE′-Genfragments herzustellen, wird mittels der bewährten Phosphotriester-Methode (R. Crea et al., Proc Nat'l Acad Sci USA 75, 5765 (1978)) ein Primer ³²pCCTGTGCATGAT synthetisiert und an ein Einzelstrangende des LE′-Genfragments hybridisiert, das durch λ-Exonuklease-Verdauung erhalten wurde. Die Hybridisierung wird im folgenden beschrieben.

20 µg des λ-Exonuklease-behandelten HindIII-Verdauungsprodukts des Plasmids pSom7Δ2 wird in 20 µl H₂O gelöst und mit 6 µl einer Lösung vereint, die etwa 80 Picomole der 5′-phosphorylierten Oligonukleotide, wie oben beschrieben, enthält. Das synthetische Fragment wird an das 3′-Ende der LE′ codierenden Sequenz hybridisiert, und der verbleibende Einzelstrangteil des LE′-Fragments wird durch das Klenow-Polymerase-I-Verfahren, wie oben beschrieben, aufgefüllt, wobei dATP, dTTP, dGTP und dCTP verwendet werden.

Die Reaktionsmischung wird auf 50°C erhitzt und langsam auf 10°C abgekühlt, wonach 4 µl Klenow-Enzym zugegeben werden. Nach 15minütiger Inkubation bei Raumtemperatur, gefolgt von 30minütiger Inkubation bei 37°C, wird die Reaktion durch Zugabe von 5 µl 0,25 molares EDTA gestoppt. Die Reaktionsmischung wird Phenol-extrahiert. Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt. Anschließend wird die DNA mit dem Restriktionsenzym BglII geschnitten. Die Fragmente werden durch PAGE getrennt. Ein aus dem Gel erhaltenes Autoradiogramm zeigt ein ³²P-markiertes Fragment der erwarteten Länge von annähernd 470 Bp, das durch Elektroeluierung rückgewonnen wird. Wie bereits hervorgehoben, hat das Fragment LE′(d) ein BglII- und ein stumpfes Ende, das mit dem Anfang des Primers übereinstimmt.

Das Plasmid pThα1, das im Abschnitt I. (C) der Stammanmeldung (P 31 11 405.9) beschrieben wurde, enthält ein Strukturgen für Thymosinα1, das an seinem 5′-Ende des codierenden Strangs in eine EcoRI-Erkennungsstelle und an seinem 3′-Ende in eine BamHI-Erkennungsstelle geclont ist. Wie in Fig. 1b gezeigt, enthält das Gen für Thymosin eine zusätzliche BglII-Erkennungsstelle.

Das Plasmid pThα1 enthält weiterhin ein Gen für Ampicillin-Resistenz. Um ein Plasmid herzustellen, das in der Lage ist, das, wie oben geschildert, hergestellte LE′(d)-Fragment aufzunehmen, wird das Plasmid pThα1 mit EcoRI verdaut, gefolgt von einer Klenow- Polymerase-I-Reaktion mit dTTP und dATP, um die EcoRI- Reste stumpfendig zu machen. Durch BglII-Verdauung des so erhaltenen Produkts wird ein lineares DNA- Fragment 33 (Fig. 1b) hergestellt, das die Gene für Ampicillin-Resistenz und, jeweils an den entgegengesetzten Enden, einen überstehenden BglII-Rest und ein stumpfes Ende enthält. Das so erhaltene Produkt kann durch Reaktion mit dem LE′(d)-Fragment, das ein überstehendes BglII-Ende und ein stumpfes Ende enthält, in der Gegenwart von T₄-Ligase rezirkularisiert werden, um das Plasmid pTrp24 (Fig. 1b) zu bilden. Während dieses Vorgangs wird eine EcoRI-Erkennungsstelle an der Position wiederhergestellt, wo die Verknüpfung der stumpfen Enden erfolgte.

Im weiteren Verlauf wird, wie in Fig. 2 gezeigt, nacheinander das Plasmid pTrp24 mit BglII und EcoRI verdaut, danach PAGE behandelt und elektroeluiert, wodurch ein Fragment entsteht, das die Codons für das LE′(d)-Polypeptid mit einem überstehenden BglII-Ende und einem überstehenden EcoRI-Ende, angrenzend an seinen 3′-Terminus des codierenden Strangs aufweist. Das LE′(d)-Fragment 38 (Fig. 2) kann in die BglII- Erkennungsstelle des Plasmids pSom7Δ2 geclont werden, um ein LE′-Polypeptid/Somatostatin-Fusionsprotein zu bilden, das unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter- Operators exprimiert wird, wie in Fig. 2 gezeigt. Ein solches Verfahren erfordert erstens eine partielle EcoRI-Verdauung des Plasmids pSom7Δ2, um die EcoRI- Erkennungsstelle distal vom Tryptophan-Promoter- Operator zu schneiden, wie in Fig. 2 gezeigt, und zweitens eine korrekte Wahl der Primer-Sequenz (Fig. 9), um den korrekten Codon-Leseraster zu erhalten und eine EcoRI-Schneidestelle wiederherzustellen.

Dazu werden 16 µg des Plasmids pSom7Δ2 in 200 µl Puffer, bestehend aus 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 0,02% NP40 Detergens, 100 mM NaCl verdünnt und mit 0,5 Einheiten EcoRI behandelt. Nach 15minütiger Behandlungszeit bei 37°C wird die Reaktionsmischung Phenol-extrahiert, Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt und anschließend mit BlgII verdaut. Das größere, so erhaltene Fragment 36 (Fig. 2) wird durch die PAGE-Behandlung isoliert, gefolgt von Elektroeluierung. Dieses Fragment enthält die Codons LE′(p) für das proximale Ende des LE′-Polypeptids, d. h., diejenigen Codons, die stromaufwärts von der BglII- Erkennungsstelle liegen. Das Fragment 36 (Fig. 2) wird als nächstes an das Fragment 38 (Fig. 2) in Anwesenheit von T₄-Ligase verknüpft, um das Plasmid pSom7Δ2Δ4 zu bilden, das, nach Transformation in den Stamm E. coli 294, wirksam unter die Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators ein Fusionsprotein produziert, das aus dem vollständig rekonstituierten LE′-Polypeptid und Somatostatin besteht. Das Fusionsprotein, von dem das Somatostatin dank der Anwesenheit eines Methionins am 5′-Ende der Somatostatinsequenz spezifisch gespalten werden kann, wird durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, wie bereits beschrieben, segregiert. Das Fusionsprotein-Produkt stellt die am deutlichsten sichtbare Bande in der Spalte 6 der Fig. 3 dar.

Claims

1. Verfahren zum Schneiden doppelsträngiger DNA, dadurch gekennzeichnet, daß zum Schneiden an jeder beliebigen Stelle

a) die doppelsträngige DNA in einem die zu schneidende Stelle umgebenden Bereich in einzelsträngige DNA umgewandelt wird;
b) an die in Schritt a) gebildete Einzelstrangregion ein komplementäres Primerstück von einzelsträngiger DNA hybridisiert wird, wobei das 5′-Ende des Primers gegenüber demjenigen Nukleotid liegt, das an die beabsichtigte Schnittstelle angrenzt;
c) derjenige Teil des zweiten, in Schritt a) eliminierten Strangs wiederhergestellt wird, der in 3′- Richtung des Primers liegt, und zwar durch eine Reaktion mit DNA-Polymerase in Anwesenheit von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosin-enthaltenden Desoxynukleotidtriphosphaten; und
d) das verbleibende DNA-Einzelstrangstück, das über die beabsichtigte Schnittstelle vorsteht, verdaut wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte c) und d) gleichzeitig durchgeführt werden, durch Reaktion mit einer DNA-Polymerase, die in 5′ → 3′-Richtung polymerisiert, die Exonukleasewirkung in 3′ → 5′-Richtung aufweist, jedoch keine Nukleasewirkung in 5′ → 3′- Richtung zeigt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase die Klenow- Polymerase I ist.