JPS58110600A - ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトβ型インターフェロン（以下メーＩＦＮと
略記する）をコードするＤＮＡを含む組みかえ体プラス
ミドおよびこれを用いるβ−４ＦＮの製造法Ｋｌｌする
。

生物の遺伝情報の発現は、ＤＮＡを鋳重としたＲＮＡの
合成、すなわち転写過程と、ＲＮＡを鋳型としたポリペ
プチド合成、すなわち翻訳過程を含む一連の生化学反応
である。遺伝子組みかえに関する研究技術が発達し、そ
の産業への応用が可能となった現在、外来の遺伝子をプ
ラスンドベクター上にいかにして組みこみ、どのようＫ
して微生物中で外来遺伝子上にコードされたポリペプチ
ドを効率よく合成させるか社重要な開発課題である。

微生物、特に大腸菌において外来遺伝子を効率よく発現
させるため、これまでに種々の工夫がなされている。ま
ず転写の効率を高めるために、プロモーター（ＲＮＡポ
リメラーゼによる転写開始部位）としてｊａａ系、ｔｒ
ｐ系などが使用され、また翻訳過程の効率を高めるため
に、シャイン・グルガノ配列（以下ＳＤ配列と略記する
）と翻訳開始部位との距離（通常３〜１５塩基）を種々
かえた組みかえ体がつくられている〔ケイイチ・イタク
ラ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第１９８巻１．第１
０５６〜第１０６３頁（１９７７）、シーバーブ（八Ｈ
，８ｅ＠ｂｕｒｇ）ら：ネイチャー（）Ｊａｔｕｒす２
７６巻７９５−７９８頁（１９７ｇ）、マーシャル（Ｊ
、Ａ、　Ｍａｒｔｉｍｌ）ら：サイｘ　７　ス（Ｂｏｉ
・ｎａ・）２０５巻、６０２−６０７頁（１９７９）　
）。

上記の例のうち多くのものは、タンパク質は２種類以上
のタンパク質からなる融合タンパク質として生産される
ので実用上−問題がある。

すでに直接インタクトなタンパク質をつくらせることも
可能になっているが〔ターデル（Ｄａｖｉζｙ、　Ｇｏ
ｍａｅｌ）ら：ネイチャー（Ｈａｔｕｒｅ）　２８１巻
、５４４−５４８頁（１９７９）、ターデルら：ネイチ
ャー（Ｈａｔｕｒｅ）　　２８７巻４１１−４１＠真（
１９１１Ｇ）、ターデルら二二ュクレイツク・アンド・
リナーチ（Ｈｕａｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＨｅｓｅａｒｃｈ
）　８巻４＊Ｓ７−４０７４頁（１９８０）］　、この
場合は外来遺伝子をプロモーターの下流に翻訳開始の遺
伝暗号であるＡＴＧを付与して組みこむためＫＩｆ！＃
殊な金成りＮＡを中継ぎ役として使うために不便である
。本発明者らは、これら既知のプラスミドベクターがｔ
つ難点を解消しえるベクターを開発し、これらを用いて
β−ＩＦＨの大腸菌における効率よい発現を確認するこ
とに′より、本発明を完成すゐに至った。

以下本発明の詳細な説明する。

本発ＥＪＩＫよれは大腸舊形質導入ファージ（λＯＩ　
８５７　ｔｒＰｌｅＤ　１０）　Ｋ由来する大腸菌トリ
グトファンプロモーター（以下ｔｒｐ　７’口毫−ター
と略記する）とトリプトファンリーダーペプチドの８Ｄ
配列の下流に制限酵素（１’１ｍ　１部位とＢｉｎｄ１
部位を有するグラスミドベクターを造成し、上記２種Ｏ
制ｉ＋ｕｇｐ素部位を用いて、合成りＮＡなどの中継ぎ
役を用いることなく、容易にβ−ＩＦＮ遺伝子（構造遺
伝子のはじめｌ’ｃＡＴＧを有する。）を組みζみ、し
かもＳＤ配列とβ−ＴＦＮ遺伝子の翻訳開始点との距離
を種々変化させた組みかえ体を造成し、これらの組みか
え体を用いて形質転換させた大腸菌を培養することＫよ
シ、極めて効率のよいβ、ＩＦＮの製造がで龜る。

大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するグラスミドベクター
はいくつか知られているが〔ノーマン・ヘンリー・ケア
リーら二特開昭−５６−３６５００、ハルウＸ、　ル（
Ｒ６Ａ、ａａ１１ｅｗ＊１りらニジ−％Ｇｅｎｅ）９巻
　２７−４７頁（１９８０）、エムテジ（ＩＣｍｔｌＬ
ｇ＠１　）ら：ネイチャー（Ｎａｔｕｒリ　２８３巻　
１７１−１７４頁（１９８Ｇ）、エドマｙ　（Ｊ、　Ｃ
，］Ｃ４ｍａｎ　）ら：ネイチャー（Ｎａｔｕｒす２９
１巻！＄０３−５０６頁（１９８１）１本発明Ｋかかわ
るグラスミドベクタ、−は、プロモーターとＳＤ配列の
直後（０〜２０塩基まで）にたとえばＣｊ＆１部位、Ｈ
１ｎ４１部位、ＥＣｏＦ％１部位、ＢａｍＨ１部位、ｐ
ｌｉｔ１部位々どから選はれる２種以上の制限酵素部位
を有し、しかもこれら制限酵素部位を用いて外来遺伝子
の翻訳開始点までの距離を調節するととにより翻訳の効
率を嵩めゐことができる点に特徴がある。

以下にプラスミドベクターの製造法につき詳細をのべる
。

ｔｒｐ７’ａモーター傾城のＤＮＡ配列は既知であり〔
ペンネット（Ｇ、　Ｎ、Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら：　Ｊ、Ｍ
ＯＪＢｉＯｊ、ｌ　　１１３−１３７　（１９７８）、
リー（Ｆ。

Ｌｅｅ　）ら：Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂ１０ｊ、　１２１１
９３−２１７（１９７８））第１１１に示した。

目的とするｔｒｐグロモーターを含有するプラスミドベ
クターは第１図のプロモーターおよびＳＤ配列を含むＤ
ＮＡ断片（例えば第１図の１〜１３９塩基まで）をｐＢ
Ｒ３２２、ｐＢＲ３２ｓ、ｐＧＡ２２、ｐＡＣＹＣ’１
８４、ｐＡＣＹＣ１７７などのベクターにクローン化す
ることによって完成する。

ｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡの供給源として、トリ
ット７アンオペロンを運ぶ形質導入ファージ（以下、λ
ｐｔｒｐと略記する）を用いる。

このλｐｔｒｐ　ＤＮＡから第１図に示したンロモータ
ーとＳＤ配列を含むＤＮＡ断片のみを制限酵素を用いて
直接切シ出すことはむずがしいので、第２図に示した３
段階の過程を経てｔｒｐプロモーターを有するグラスミ
ドベク夛−を造成する。

以下（ＩＬ）〜（９にそのプラスミドベクターの造成法
を述べる。

（亀）　λ＃ｒｐＤＮＡの精＄１ λｐｔｒｐを大腸菌菌株Ｋｌ原化させた菌株を培養し７
アージの誘発を行なう、７アージ溶菌液を常法によシ精
製しλｐｔｒｐ　ＤＮＡを得る。

（ｂ）　　ｔｒｐプロモーターの１ラスミド入のクロー
ニング上記のごとくして得たλｐｔｒＰＤＮＡ　ｔ−下
記のごとく処理してｔｒｐオペロンのクローニングを行
なう。

−Ｊが工しト紅Ｑや１オさすｐタ見二子イグー組換えグ
ラスミド　　　　　　　　　　　　コンピテントなｔｒ
ｐオヘロンの一部を含むＤＮＡ断片がクローン化された
１ラスミドを持つ形質転換株 このようにして得られる形質転換株より１ラスミドＤＮ
Ａを常法によプ分離し、下記方法によりベクターにクロ
ーン化する。

ｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片がクローン化され
九プラスミドを持つ形質転換株 （ｃ）　　ｔｒｐプロキーターのボータプル化上記形質
転換株からｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片がクロ
ーン化されたプラスばドを分離し第６図に示したようＫ
ＨｐａＩＩ％）（ｉｎｄｌなどの制限酵素を用いて処理
し、該プラスミドの縮少を行なう。

（ｄ）２個以上のｔｒｐプロモーターの連結上記縮少プ
ラスミドを第７図に示したように処理し呻プロモーター
を２個以上有するプラスミドを造成する。

以上のごとくして得られるｔｒｐプロモーターを含むプ
ラスミドベクターの例としてはλｔｒｐ　’ＩＡ　Ｄか
ら得られる４、６ＫｂＩｊりＤＮＡ断片をプラスさドＰ
ＢＲ３２５に組みこんだｐＫＹＰ−１と称するプラスミ
ド、ｐＫＹｐ　１から得られる２、６ＫｂのＤＮＡ断片
をグラスきドｐＥＲ８２２に組みこんだｐＫＹＰ　　５
と称するプラスミド、ｐＫＹＰ−５から得られる約３７
０　ｂｐのＤＮＡ断片をプラスさドｐＢ’Ｒ３２２に組
みζんだｐＫＹＰ　−１０と称するプラスミド、ｐＫＹ
Ｐ　−４０にさらに１個のｔｒｐプロモーター（合計２
個）を挿入し九ｐＫＹＰ−１１と称するプラスミドおよ
びｐＫＹＰ　−１１にさらｆＣ１個のｔｒｐグロモータ
ー（合計３個）を挿入したｐＫＹＰ−１２と称するプラ
スミドなどがあげられる。

上記のごとくして得られるｔｒｐプロモーターを含むグ
ラスミドベクターにβ−ＩＦＮをコードするＤＮＡを組
むことにより　ｔｒｐプロモ−ターの下ｆｉＫβ−ＩＦ
Ｈの遺伝子を組みこんだ組換えプラスミドを得る。

β−ＩＦＮ遺伝子は本発明者らによりクローン化され、
その全塩基配列も決定されている［　Ｔ、タニグチら：
ジーン１０巻　１１−１５頁（１９８０））。

名らに本発明者ら拡このβ−ＩＦＮ遺伝子を大腸掴ｔｕ
ｆＢプロモーターの下流に結合させた組みかえ体ｐＴｕ
ＩＦＮβ−５を作成し、大腸菌内で８００−２６００単
位／−のβ−ＩＦＮを生産させるととに成功した（特−
願昭５６−１４３７３）。

本発明においてはβ−ＩＦＮの遺伝子の起源としてこの
ｐＴｕＩＦＮβ−５を用いたが、他の方法で得られるβ
−ＩＦＨの遺伝子も用いることができる。

本発明の具体的組みかえプラスミドの例としては、ｐＫ
ＹＰ−１２にβ−ＩＦＨの遺伝子を組みこんだｐＬＸ−
３と称する組みかえプラスミドおよびｐＬ、に−３の誘
導体であるｐＬＶ　　１　、ｐＬＶＸ−１およびｐＭＺ
−２と称する組みかえプラスミドがあぜられる。これら
組みかえプラスミドならびにその製造については実施例
２以下で詳細に述べる。

実施例１．　　ｔｒｐプロモーターを有するグラスミド
ベクターの造成　： ←）　トリプトファン形質導入ファージＤ　Ｎ　Ａの精
製 λｐ　ｔ　ｒｐファージであるλｃ１８５７ｔｒｐｌＤ
１０〔以下、λｔ’ｒｐＨ）と略す　Ｑ、　ｐ’、　Ｍ
ｉ＆ｌＩ厘ａｒｉら：Ｊ、Ｂａａｔ＊ｒ１ｏ丸　１３３
巻、１４５７貞（１Ｇ７８））を大腸１ｉＪＡ１９４株
ＣＦＺ　””＋　ｒｋｌ　’ｌｋ　＠社ｒ１ｐ１５゜］
Ｊｕ５．　Ｊ、　Ｃａｒｂｏｎら　ＲＩｅｏｍｂｉｎｌ
ｎｔ　ｆｉｌｌ・ｏｕｌ・−Ｐ、　３５５　（１９７７
）　Ｒａｖｅｎｐｒ＠ｓｓ　）に溶原化させることによ
って得られる菌株、　ＪＡ１９４（λ梵ＩＤ）を４２℃
で３０分培養することによってλｔｒｐｌＩ）ファージ
を誘発し、ファージ溶菌液を調ａｔムこのファージ液よ
り塩化セシウム平衡＊＊勾配遠心法〔山川ら「核酸の化
学Ｉ」東京化学同人社夙５４−６１．１９７４３によっ
てλファージを精製する。

次いでとのλファージよシ、山川らの方法〔核酸の化学
１、東京化学同人社、ｐ６２−６５．１９７４３に従い
フェノール凱理とクロロホルム魁理をして精製す一為。

（ｂ）　　ｔｒｐプロモーターのプラスミドへのクロー
ニング 上記の如く精製されるλｔｒｐ　ｌ　ＤファージのＤＮ
Ａを制限酵素ＥｃｏＨ１とＨｌｎｄｌで消化したときの
制限酵素地図は第３図の如くである。

これをもとにｈ　ｔｔｐ　ｌ　ＤファージＤＮＡからｔ
ｒｐオペロンのクローン化は以下のごとく行う、すなわ
ち、８〜のλｔｒｐＥＤ　Ｄ　Ｎ　Ａを２０ｍＭ　　）
リス−ＨＣｊ（］＞Ｈ７，５）、７５ｍＭ　Ｎ＆ＣＩ、
１０１０すＣＪｘ、５ｍＭジチオスレイトール中で１６
単位のＫＯＯＲＩ　（宝酒造社製、以下同じ）と１６単
位の）ｉｉｎｄｌ（宝酒造社製、以下同じ）を加えて３
７℃、２時間消化する。一方プラスミド、ＢＲ３２５Ｄ
　ＮＡ　１μＶも同様に２単位のｆｆ１００”ｑＩと２
単位の１（ｉｎｌｌｌで消化する（最終容量３０〜）。

次いで、６５℃、５分間加熱処理して反応を停止し、そ
れぞれの消化したＤＮＡ溶液１５ｇずつを混合し、終湊
度５００／ｇＭＯＡＴＰと、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ５
単位（Ｈ＠ｗ　Ｉｌｉｎｇｌａｎｌ　Ｂｉｏ１ａｂ社製
）を加え４℃１８時間結合反応を行なう。

このようＫして見られるプラスミドの混合物を用い大腸
菌Ｃ８００８Ｆ株〔キヤメロンら：プロシーデイングス
・オブ・ザ・ナシ吐ル・アカデミ−・オブ・サイエンス
７２巻、３４１＠頁（１９７５都）〕を公知の方法（Ｓ
、　Ｎ、″：１−エンら：プロシーデインダス・オブ・
ず・ナシ冒ナル・アカデミ−・オプ・サイエンス６９巻
　２１１０頁（１９７２年）〕Ｋ従って形質転換し、ア
ンピシリン耐性（Ａ♂）、テトラサイクリン耐性（Ｔ♂
）およびクロラム７エ＝コール感受性（ＣＩ：）を有す
る形質転換株を得る。このようＫして得られる大腸菌の
形質転換株よシブラスミドＤＮＡ４分離し、制−限酵素
］ＣｃｏＲ１ｓ　Ｈ１ｎｃｌ１％Ｈｐａｌで切断した結
榮、第４図囚に示す構造をもつことを確認し、ｐＫＹＰ
　−１と命名した。

すでに第１図に示し九ようにトリプトファンプロモータ
ーの下流にある８Ｄ配列（ＡＡＧＧ）の４塩基下ｆＩＬ
Ｋ制限酵素Ｔａ　ｑ　ｌで切断される部位がある。この
事実を利用し、上記のプラスミ）”　、ＫＹＰ　−１！
すＴｈｑｌとＮｅｏＲｌで消化しトリプトファンプロモ
ーターとＳＤ配列を含４ｂ（キロペース二以下同じ）の
ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法によシ精製する
。このＺ６ＫｂのＤＮＡ断片を第５図に示した方法によ
り既知ベクターであるｐ　Ｂ　Ｒ３２２にクローン化す
る。すなわち、８μＶのｐＢＲ３２２に２単位ノＴａｑ
ｌ（全酒造社製）を加え、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈ
Ｃｊ（１）Ｈ＆　４　）、６ｍＭＭｙＣ１ｚ、１００ｍ
ＭＮａＣ１，６ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む
全量１００μ！の反応液中４５ｔ′１４６０分、反応さ
せる。ＴＩＬ（ｌ　Ｉによる部分消化後、低融点アガロ
ース・ゲル電気泳動法［Ｌ、ウイスランダー（ＩＪｒｅ
　ｙｉｅｓｌａｎｄｓｒ）　：アナリテイカル・バイオ
ケミストリー　９８巻３０５頁（１９７９年）〕によ＃
）４．３６　Ｋ　ｔ）のＤＮＡ断片を精製し、さらにこ
のＤＮＡ（約１．５声ｆ）を３単位のＰｏｏＲＩを加え
て、３７℃、３時間反応させて完全に消化した後、上と
同様に低融点アガロース・ゲル電気泳動により、約４３
３Ｋｍ）のＤＮＡ断片（約１．０μｔ）を得る。

次に１２ｐｆのｐＫＹＰ−Ｉ　ＤＮＡを上と同様に３単
位のＴＩＬ（ＩＩを加えて部分消化し、低融点アガロー
ス・ゲル電気泳動法で＆５ＫｂのＤＮＡ断片（約２μｆ
）を精製し、さらにこのＤ　＊　Ａ　ｔ−ＺｅｏＲｌで
完全消化することによシ、Ｚ６Ｋｔ）のＤＮＡ断片約α
５μｔを精製する。

このようにして得たｐＢＲ３２２の４３３ＫｔｌＤＮＡ
（α４＃）とｐＫＹＰ−１の２．６　Ｋｌ）　ＤＮＡ断
片（α２５μ２）を２０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣｊ　（
ＰＨ７，６）、１０　ｍＭ　ＭｙＣｌ、、１０ｍＭジチ
オスレイトールを含む全量２０μｍの反応液中で、０．
５　ｍＭのＡＴＰとＴ０ｎ、ＮＡソリガーゼ単位を加え
、４℃で１８時間、結合反応を行々う、このようにして
得られる組みかえプラスミドＤＮＡを用い、大腸菌Ｃ６
Ｇ０１９Ｆ８株を形質転換し、得られるＡｐ’　ｓ　Ｔ
ｃ”の形質転換株がもつプラスミドを分離精製する。こ
のプラスミドＤＮＡを６種の制限酵素、ＫｃｏＨ）、　
ａｌｎａ１％ｃ１ｍｌ　（ペーリンガー・１ンノ〜イム
社製）、ＨＰ亀Ｉ（宝酒造社Ｉｌ）、Ｈｌｎａｌ　（全
酒造社製）　、　ＢＩＬｍＨｉ　（宝酒造社＄ｔ）Ｋよ
って消化して、プラスミドの構造解析を行なった結果、
第４図ＣＢ）Ｋ示し九構造１もつことを確認し、これを
、ＫＹＰ　−５と命名し九。

（ｏ）　　ｔｒｐプロモーターのポータプル化上記のプ
ラスミドベクターｐＫＹＰ−５は８Ｄ配列の下＊（１〜
２０塩基以内）にＣｊａ１部位とＨ１ｎｓ１１部位を有
するのでＤＮＡ導入ベクターとして充分使用可能である
。しかし、ｐＫＹＰ−５ＤＮＡ中に８Ｄ配列の直後の０
１１ＬＩ部位以外にもう１ケ所Ｃ１＆　１部位があるこ
と、および、ＫＹＰ−５ＤＮＡからｕｃｏＨｌとＨｌｎ
ｌｌで切り出したｔ１プロモーターを含む断片が１６５
Ｋｌ）とや＼大きいのでより使いやすいようにするため
第６図のようにしてさらに小さいトリプトファンプロモ
ーターを含むＤＮＡ断片を有するプラスミドを造成する
。すなわちｐＫＹＰ−５ＤＮＡｔＨｐａｌとＨ１ｎｄｌ
テ消化して約３４０　ｂｐ　（ペースペアー）のＤＮＡ
断片を精製し、これをＣａｌ　ｌとＨ１ｎ４１で消化し
九ｐＢＲ３２２に第６図のように挿入し、ｐＫＹＰ−１
０を得る。ｐＫＹＰ　　１０の構造は制限酵素ｘａｏＲ
１゜Ｃ１ｌ　ｌ、Ｈｌｎｌｌ、　ａｐａｌ　ｆ消化した
俵、アカクースゲルミ気泳動で確認する。

に）　２個以上のｔｒｐプロモーターの連結次にさらに
強いプロモーター活性を有するプラスミドベクターの造
成を０指して、ｔｒｐプロモーターを２個連結すること
を試みる。

す表わち、第７図囚に示したように前項（６）でのべた
ｔｒｐプｑモーターを含む約３４０　ｂＭ）ＤＮＡ断片
をＣ１ｍ　ｌと）ｉｉｎ（１１テ消化した。ＫＹＰ−１
０に挿入し、ｐＫＹＰ−１１を得る。同様の方法でｔｒ
ｐプロモーター３個を同一方向に連結したｐＫＹＰ−１
２（第７図（９）〕も造成し、ｚｃｏＲｌ、（’ｌａｌ
、　Ｈ１ｎ４ｇ、Ｈｐａ　ｌで消化し構造を線間する。

上記ｐＫＹＰ−５，１Ｇ、　１１．１２はいずれもｔｒ
ｐプロモーターを含むＤＮＡ断片をプラスンドｐＢＲ３
２２にクローン化した場合であるが、他のプラスミド例
えはｐＢＲ３２５に同様にクローン化し類似のＤＮＡ導
入ベクターを造成できることはいうまでもない。また、
ｐＫＹＰ−５，１０，１１，１２よシアンピシリン遺伝
子またはテトラサイクリン遺伝子を欠落させた誘導体や
、他の薬剤耐性遺伝子（例えはカナマイシン耐性遺伝子
、り四ラムフェニコール耐性遺伝子など）を導入し、類
似の誘導体を造成することもできる。

１ 実施例２　β−ＩＦＮをコードするＤＮＡのプラスミド
ベクターｐＫＹＰ−１２への組みこみ：ｐＴｕＩＦＮβ
−５（人’Ｉ’Ｃ’Ｃ’３１８Ｈｌから常法により分離
する）をＨｌｎｌ　ＩＩで消化後ＤＮＡポリメラーゼＩ
　（Ｎｅｗ　Ｒｎｇｌａｎａ　Ｂ１０１ａ’ｂｓ社製）
で処理した後結合反応を行ない第８図に示したｐＴｕＩ
ＦＮβＨ−５を得る。ｐＴｕＩＦＮβＨ−５よりβ−Ｉ
ＦＮ遺伝子を切夛出し、ｔｒｐプロモーターを有するプ
ラスミドｐｘｙｐ−１２にクローン化する。すなわち、
ｐＫＹＰ−１２ＤＮＡ２μｆＫ１１１＠酵素Ｃｊａｌを
４単位加え、１６　ｍＭＴｒｉｅ−ＨＣｊ（ｐＨ７，５
）、６　ｒｎＭＭｆｃｌ、　、　５　ｍＭジチオｘｖイ
トール（以下Ｃｊａバッファーとよぶ）中（全量３０μ
りで、３７℃、２時間反応させた後、ＮａＣＪを最＃！
濃度１００鮨になるように加えてさもＫｓ７℃で２時間
反応を続ける・次いで６ｓ℃で５分間加熱して酵素を失
活させ、低融点アガｑ−ス・ゲル電気泳動法約５　Ｋ’
ｂのｚｒｐプリモーターを含むＤＮＡ断片を精製し、１
．２μｆを得る０次１ｃｐＴｕＩＦＮβＨ−５ＤＮＡｌ
５ｓｆ　　を上と同様に制限酵素ＣｊａｌとＢａｍＨｌ
で消化し、低融点アガロース・ゲル電気泳動法で精製し
、β−ＩＦＮ遺伝子を含むＤＮＡ断片（１，１Ｋ１：＋
）　　約１１１ｆを得る０以上のようにして得られる２
個のＤＮＡ断片（第Ｓ図の５　Ｋｂと１．１に１））を
２０　ｍＭＴｒｉｍ−ＨＣＪ（ｐＨ７，５）　６　ｒｎ
Ｍ　ＭｆＣＩ！、　５　ｍＭジチオスレイトール、ＳＯ
ＯμＭＡＴＰ　　にとかし、Ｔ４ＤＮ人リガーゼ４単位
を加え、４℃で１８時間結合反♂を行う、得られたくみ
かえ体プラスミドの混合物を用いて、常法過少、大腸菌
ＨＢ１０１を形質転換し、Ａｐｌ′ｌのプロニーを得る
。

このコロニーの培養液よりプラスミドを分離し、第８図
に示したｐＬＥ−３を得る。ｐＬＥ−３の構造はＣＪａ
ｌ　＋　ＲｃｏＲＩ　＋　Ｈ１ｎ＋１１１　＋　Ｂａｍ
ＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動によシ確賢する
。プラスミドｐＬ！−３のＳＤ配列（ＡＡＧＧ）から開
始コドン（人Ｔ（））ｆｉでの塩基配列は「ＡλＧＧＧ
ＴＡＴＣＧＡＴＧＪであることをマキ＝！−−−−− サム・ギルバートの方法（Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｍら：Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、　８ｃｉ第７４巻、５６０
頁（１９７７））で確認する。

ｐＬＥ−３を含む大腸菌菌株はアメリカン・タイプ金カ
ルチャー・コレクション（人ＴＣＣ）　　に１ｃｓａｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｉ　Ｌ　Ｋ　−３人ＴＣＣ
３９０１０として寄託されている。

実施例＆ 実施例鵞によシ得られるｐＬＥ−３ＤＮＡ２μｔをＣｊ
ａ−バッファー（３０μｌ）にとかし、制限酵素Ｃｊａ
１４単位を加え、３７℃、２時間反応２０　ｓＭになる
ように加え、さらに６単位の大腸菌り七Ａポリメラーゼ
Ｉ（１μりを加えて１５℃で１時間反応させる。次に５
　ｍＭジチオスレイトール、５０６μＭ　ＡＴＰと’ｒ
ＪＤＮ人リガーゼす０単位を加え、４℃で１８時間結舎
反応を行なう、これを用いて常法通り、大腸菌ＨＢ１０
１を形質転換し、Ａｐｌのコロニーを得る。

重曹の培養液よシブラス建ドを分離し、第９図（ａ）に
示したｐＬＶ−１を得る。ｐＬＶ−１の構造はＥｃｏＲ
Ｉ＋　Ｃ７ａｌ　ｓ　Ｈｌｎｄ、　ｍｅ　ＢａｍＨＩで
消化した後、アガロースゲル電気泳動によシ確認する。

ｐＸｓＶ−１においてＳＤ配列から開始コドン（ＡＴＧ
）までの塩基配列はｒＡＡＧＧＧＴ人Ｔ＜ｌ”Ｇｃ’Ｇ
Ａ’１！」であることをマキサム・ギルバートの方法で
確認する。

されている。

実施例４ 実施例２にのべ九ｐＬＥ−３から次のようにしてｐＬＶ
Ｘ−１を得る。ｐＬＥ−３ＤＮＡ３１をＣ１ａ−バッフ
ァー４０　ｔｔｌにとかし、Ｃｏａｌ　８単位を加え、
３７℃、２時間反応させた後、６５℃、Ｓ分間加熱して
ｃｊａｌを失活させる０次い”ｔ”ｄ−ＧＴＰ、ｄ−Ｃ
ＴＰを各ｋ　２０　鄭Ｍに々るように加え、さらに６単
位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを加えて、１５℃で１
時間反応させる０次にＳ　ｍＭジチオスレイトール、５
００μＭ人Ｔ　Ｐ　％Ｘｈ　ｏ　−Ｌｉｎｋｏｒ　（ｄ
（Ｃ”ＣＴＣＧＡＧＧ）コラボレイテイプ・リサーチ社
製〕０．１岸ｆおよびＴ４ＤＮ人リガーゼ２０単位を加
え、４℃で１８時間、結合反応を行なう。

得られた組みかえプラスミドの混合物を用いて、常法過
少、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換し、人ｐ１のコ冑ニー
を得る０重曹よシブラスミドを分離し、第９図（ｂ）に
示した組みかえ体プラスミドｐＬＶＸ−１を得る。

ｐＬｖＸ−ｉの構造はｇｃｏＲｌ　％Ｘｈｏ−１，Ｈｔ
ｎａｌｌ。

ＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動によ
り確Ｖする。ｐＬＶＸ−ｉｌ（おいてＥ’ｌＤ配列から
開始コドン（ＡＴＧ）までの塩基配列はｒＡＡａａ、ａ
Ｔ＊Ｔｃａｃｃｒｃｏ＊σＧＣＧに郵」であることをマ
キサム・ギルバートの方法で確認する。

ｐＬＶＸ−１を含む大腸菌菌株は人ＴＣ’ＣにＥｓｃｈ
ｓｒｉｃｈｉａ　ｃｏａｌ　ＩＩＬＶＸ−Ｉ　　ＡＴＣ
Ｃ３１０１４として寄託されている。

実施例＆ 実施例４で得た１）ＬＶＸ−１ヨシ１１１Ｌ會図（ｃ）
Ｋ　ｙ？。

し九方法で８Ｄ配列と開始コドンまでの距シの変化した
誘導体ｐＭＺ−２を得る。す表わちｐＬＶＸ−Ｉ　　５
ｌｉｔを５０　μｌ　ＯＣｊａ　−ハラ７７−にとかし
、１５０ｍＭのＮａＣｊと制限酵素Ｘｈ。

−１１０単位、を加え、３７℃で２時間反応させる０反
応終了後、６５℃、５分の処理でＸｈ。

−１を失活させ、次いでＤＮ人ポリメラーゼ！８単位を
加え３７℃、３０分反応させて、Ｘｈ。

−１で消化して生じた粘着末端を除く０次に７０℃、１
５分加熱してＤＮＡポリメラーゼを失活させた後、５ｍ
Ｍジチオスレイトール５００μＭＡＴＰ　１３０単位の
ＴＪＤＮ人リガーゼ　を用いて結合反応を行う。得られ
たＤＮ人溶液を用いて、大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換
し、Ａｐ　Ｒのコロニーを得る０本コロニーの培養液よ
り、プラスミドを分離し、第９図（ｃ）に示した組みか
え体プラスミドｐＭＺ−２を得る。ｐＭＺ−２の構造は
ＫｃｏＲｌ　、Ｈｌｎｄ　ｌ１％Ｘｈｏ−１、ＢａｍＨ
ｌで消化した後、アガロースゲル電気泳動によシ確認す
る。

ｐＭＺ−２を含む大腸菌菌株はＡＴＣ’Ｃ’にｇｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＭＺ−２ＡＴＣＣ３１１
０！３として寄託されている。

実施例６゜ 実施例２〜５で得た組みかえ体プラスミドｐＬｇ−ｓ、
ｐＬＶ−１、ｐＬＶＸ−１、ｐＭＺ−２をもつ大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ株（それぞれＩＬＥ−３、ＩＬＶ−１、ＩＬＶ
Ｘ−１、ＩＭＺ−２と命名沖イ７ターフエロンの生産性
を次の方法でテストする。

まずＩＬＥ−３、ＩＬＶ−１、ＩＬＶＸ−１、ＩＭＺ−
２をＬＧ培地〔トリプトン１０　Ｆ、酵母エキス５ｆ、
　Ｎａ（Ｊ　Ｓ　ｆ、グルコース２ｔを水１１にとかし
ＮａＯＨにてｐＨを７．０とする。〕で３３７℃１８時
間培養し、この培養液α２−を１０−のＭＣＧ培地（Ｎ
ａ１ＨＰ０４αｇ　憾、　ＫＩＩ（、ＰＯ，α３４、Ｎ
ａＣｊａＩｌ、Ｎ′Ｈ４Ｃｌ　０．１１Ｇ、グルコース
α５憾、カザミノ酸αｓ嘔、ＭｆＦ３０４１　ｍＭ、ビ
タミンＢ１４μｆ肩　ｐＨ７，２）に接種し、３０℃で
４〜１時間培！１９、トリプトファン遺伝子のインデュ
ーサーであるインドールアクリル酸（以下ＩＡ人と略す
）を１０４−加え、さらに５〜１２時間培養を続ける。

培養液を８００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、３
０　ｍＭ　ＮａＣｊ、　３０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ
　（ｐＨ７，５）緩衝液で洗浄する。洗浄菌体を上記緩
衝液１ｄに懸濁し、２００　＃ｔのリゾチーム、Ｏ，！
　５Ｍ　ＲＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を５
　ｓｌ加えて３０分間０℃に放置した後、凍結・融解を
３回くり返して菌体をこわす。とれを１！％ＯＯＯｒｐ
ｍ　、　３０分間遠心して上清を得、上清中のインター
フェロンの量をアームストロングの方法に従って定量す
る〔アームストロング（Ｊ、ん人ｒｍｓｔｒｏｎｇ）ら
ニアブライド・マイクロパイオルジー（Ａｐｐｌ　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、　）　　２１巻　７１３−７！１Ｇ頁
（ｘｓｙｔ）］〔但し、ウィルスとしてはＶｅ＋５ｉｃ
ｕｌａｒ　ａｔｃｍａｔｉｔｉｓＶｉｒｕｓ％動物細胞
としてはヒト羊膜細胞由来のウイッシュ・セル（Ｗｉｓ
ｈ　ａｅｌｘ）を用いた。〕結果を第１表に示す１ 第　　　１　　　表

【図面の簡単な説明】

第１図は、トリプトファンプロモーターと８Ｄ配列周辺
の塩基配列を示す。 第２図は、ｔｒｐポータプル・プロモーターの造成のフ
ロー・チャートを示す。 第３図社、λ野性株とλｔｒｐ　ＩＥＫファージＤＮＡ
の制限酵素地図を示す。 第４図（４）は、プラスミドｐＫＹＰ−１の構造を、（
Ｂ）はｐＫＹＰ−５６構造を示す。 第５図は、ｐＫＹＰ−５の造成のフロー・シートを示す
。 第６図は、ｐＫＹＰ−１０の造成の７０−−シートを示
す。 第７図に）は、ｐＫＹＰ−１１の造成のフロー・シート
を、（９）は、ｐＫＹＰ−１２の構造を示す。 第８図は、β−ＩＦＮ遺伝子を有する組みかえ体プラス
ミドｐＬＲ−３の造成に関するフロー・シートを示す。 第９図は、β−ＩＦＮ遺伝子を有する組みかえ体プｙス
ミドｐＬＶ−１、ｐＬＶＸ−１、ｐＭＺ−２のａｔに関
するフロー・シートを示す。 特許出原人　（１０２）協和醗酵工業株式金社財団法人
癌研究会 通事畏安西　浩 第　１１３２１ ＧＣＩＶ’：ＴＧＴＡＴＴＣ八ＣＣＡＴ（へ；ＣＧＴＡ
ＡＡＧＣＡＡＴＣＡＧＡＴ八ＣＣＣ八ＧＣＣＣＧＣＣ’
ｒＡＡＴへ八ＧＣへＧＧＣ１”Ｉ’Ｔ’ｌ’ｉ”へ”１
８２　図 ５ｔｚＰ３　　　　　◇ π瓦［ｊｌ 祐　３　図 第　＋　　図 第　　５　　回 Ｅ′ＬＪＩ 第　　６１躬 遁７図 ０） （Ｂ） ＰｋＹＰ　−＋２ 第　８　図 、ＬＥ−３（＆、Ｉｋｂ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１ヒトβ型インターフェロンを；−ドするＤＮ・Ａ
   断片をトリプト７アンプｐモーターの下流に組みこんだ
   組みかえ体プラスミド。 （２）　　ｐＬＪ−３、ｐＬＭ−１１，ＬＶＸ−１、ｐ
   ＭＺ　　２と称する特許請求の範囲第１項記載の組みか
   え体プラスミド。 （３１４１許請求の範囲第１項または第２項に記載した
   グラスミドを制限酵素またはエキソヌクレアーゼｌ、８
   １ヌクレアーゼおよびＢａｔ　３１から選はれるＤＮＡ
   修飾酵素で処理して得られるプラスミド誘導体。 （４）　　’！？許請求の範囲第１項から第３項に記載
   した組みか、え体プラスミドを用い形質転換した微生物
   を培地に培養し、培養物中にヒトβ型インターフェロン
   を生成蓄積せしめ、諌培養物からヒトβ型インターフェ
   ロンを採取することを特徴とするヒトβ型インターフェ
   ロンの製造法。