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WO2023210244A1 - Ｎａｍｐｔ活性を有する蛋白質およびｎｍｎの製造方法 - Google Patents

Ｎａｍｐｔ活性を有する蛋白質およびｎｍｎの製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2023210244A1
WO2023210244A1 PCT/JP2023/012607 JP2023012607W WO2023210244A1 WO 2023210244 A1 WO2023210244 A1 WO 2023210244A1 JP 2023012607 W JP2023012607 W JP 2023012607W WO 2023210244 A1 WO2023210244 A1 WO 2023210244A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
seq
nmn
protein
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/012607
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
一将 堀
哲朗 氏原
祐輔 安宅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Bio Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority to EP23795991.1A priority Critical patent/EP4516908A1/en
Priority to CN202380034876.5A priority patent/CN118984876A/zh
Priority to US18/858,913 priority patent/US20250270607A1/en
Priority to JP2024517916A priority patent/JP7770553B2/ja
Publication of WO2023210244A1 publication Critical patent/WO2023210244A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/02012—Nicotinamide phosphoribosyltransferase (2.4.2.12), i.e. visfatin

Definitions

  • the present invention relates to a protein having nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) activity, and a method for producing nicotinamide mononucleotide (NMN) using the protein.
  • NAMPT nicotinamide phosphoribosyltransferase
  • Nicotinamide mononucleotide is a precursor of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), which is used as an electron carrier in mammals, and is known to have many functions such as mitochondrial activation and sirtuin gene activation, and is used as a supplement.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NMN NMN-Non-Patent Document 1
  • Non-Patent Document 3 a chemical synthesis method
  • Non-Patent Document 2 an extraction method from yeast
  • Patent Document 3 a chemical synthesis method
  • Patent Document 3 an enzymatic decomposition method of NAD
  • Patent Document 3 an extraction method from yeast
  • NMN is produced by condensing nicotinamide (NAM) and phosphoribosylpyrophosphate (PRPP) produced by enzymatic or biological methods within bacterial cells.
  • NAM nicotinamide
  • PRPP phosphoribosylpyrophosphate
  • NAMPT Nicotinamide phosphoribosyltransferase
  • NAMPT is known to be involved in NMN synthesis in the human body (Non-Patent Document 7), and is considered to be a key enzyme for NMN synthesis.
  • NAMPT examples include NAMPT derived from Haemophilus ducreyi disclosed in Non-Patent Document 4.
  • Non-Patent Document 5 describes Shewanella oneidensis, Sphingopyxis sp. C-1, Chitinophaga pinensis, Homo sapiens, Sus scrofa, Mus musculus, Boleophthalmus pectinirostris, Rhinopithecus Roxellana, Pteropus alecto and Xanthomonas translucens are disclosed, among which Napmts derived from Sphingopyxis sp. It has been disclosed that high NMN productivity is shown when Napmt derived from C-1 or Chitinophaga pinensis is used.
  • An object of the present invention is to provide a protein with improved nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) activity, and a method for producing nicotinamide mononucleotide using the protein.
  • NAMPT nicotinamide phosphoribosyltransferase
  • the present inventors conducted intensive research to provide a novel protein with NAMPT activity, and found that NAMPT derived from Bisgaardia hudsonensis and Chitinophaga rupis was found to be derived from the previously known Hemophilus. It was discovered that the NMN production activity was higher than that of NAMPT derived from Haemophilus ducreyi and Shewanella oneidensis, leading to the completion of the present invention.
  • the present invention relates to the following 1 to 8.
  • the protein according to any one of [1] to [3] below, which has nicotinamide phosphoribosyltransferase activity.
  • [1] Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5
  • [2] In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5, 1 to 20 amino acids have been deleted, substituted, inserted, or added
  • Mutant protein consisting of an amino acid sequence [3]
  • Homologous protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5 2.
  • the DNA described in 2 above which is the DNA described in any one of the following [4] to [6].
  • a method for producing NMN which comprises producing nicotinamide mononucleotide (NMN) using the transformant according to any one of 5 to 7 above.
  • a method for producing NMN which comprises producing nicotinamide mononucleotide (NMN) using the protein described in 1 above.
  • the present invention it is possible to provide a protein with improved nicotinamide phosphoribosyltransferase activity, and also to provide an efficient method for producing nicotinamide mononucleotides using the protein.
  • Protein of the present invention is a protein according to any one of [1] to [3] below, which has nicotinamide phosphoribosyltransferase activity.
  • [1] Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5
  • [2] In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5, 1 to 20 amino acids have been deleted, substituted, inserted, or added
  • Homologous protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is a protein having nicotinamide phosphoribosyltransferase activity derived from Bisgaardia hudsonensis, and consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the protein is a protein having nicotinamide phosphoribosyltransferase activity derived from Chitinophaga rupis.
  • Nicotinamide phosphoribosyltransferase converts nicotinamide (NAM) into phosphoribosylpyrophosphate (5-phospho- ⁇ -D-ribose, 1-diphosphate, (hereinafter referred to as PRPP) and ⁇ - Nicotinamide mononucleotide (compound name: [(2R,3S,4R,5R)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yI] methylhydrogen phosphate; ⁇ - It is an enzyme that produces NMN).
  • NAMPT Nicotinamide phosphoribosyltransferase
  • Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) activity refers to the activity of synthesizing ⁇ -NMN from NAM and PRPP, or the activity of synthesizing ⁇ -NMN using NAM, PRPP, ATP, and water molecules as substrates.
  • Mutated protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in the original protein, or artificially inserting or adding amino acid residues into the protein.
  • deletion, substitution, insertion, or addition of amino acids means that 1 to 20 amino acids are deleted at any position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5, For example, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 amino acid may be deleted. It may be deleted, replaced, inserted, or added.
  • the amino acids to be substituted, inserted, or added may be natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L- - Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • Group A Leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D Lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenylalanine
  • Homologous proteins are proteins that exist in organisms that exist in nature, and refer to a group of proteins that have the same evolutionary origin. Homologous proteins are similar in structure and function to each other.
  • the amino acid sequence of the homologous protein in [3] is 90% or more, preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, or 95% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5. , more preferably 96% or more, 97% or more, or 98% or more, still more preferably 99% or more.
  • BLAST and Gapped When using the BLAST program, use the default parameters for each program. Specific techniques for these analysis methods are publicly known.
  • the mutant protein of [2] above or the homologous protein of [3] above has NAPRT activity.
  • a recombinant DNA having DNA encoding a protein whose activity is to be confirmed is prepared by the method described below.
  • the recombinant DNA is a microorganism that does not have NAMRT activity or ⁇ -NMN production activity, such as DNA encoding nicotinamidase (pncA gene) or DNA encoding nicotinamide mononucleotide amidase (pncC gene).
  • DNA encoding acid phosphatase (aphA gene), DNA encoding 5'-nucleotidase/UDP-hydrolase (ushA gene), and DNA encoding nicotinamide riboside phosphorylase (deoD gene) were deleted.
  • a microorganism obtained by transforming Escherichia coli strain W3110 is cultured, and nicotinamide is added to the medium to produce ⁇ -NMN. Finally, ⁇ -NMN in the culture supernatant is detected using HPLC as described below. The presence of NAMPT activity can be confirmed by detecting ⁇ -NMN.
  • DNA of the present invention is DNA encoding the protein of the present invention, that is, the protein of the above [1], the mutant protein of [2], or the homologous protein of [3].
  • DNA of the present invention include DNAs described in any one of [4] to [6] below.
  • DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 [5] DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 2 is used to express in Escherichia coli the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the gene encoding nicotinamide phosphoribosyltransferase derived from Visguardia fuzonensis represented by SEQ ID NO: 3.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 4 is a gene encoding the Chitinophaga lapis-derived nicotinamide phosphoribosyltransferase represented by SEQ ID NO: 5.
  • Examples of DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 1, and from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • An example of DNA encoding a protein is a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • Examples of the DNA encoding the mutant protein in 1 [2] above or the homologous protein in [3] include the DNA in [4] or [5] above.
  • hybridizing is a process in which the DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, the DNA having the specific base sequence or the base sequence of the DNA that hybridizes to a part of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or has a length that can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. It may be the same DNA.
  • DNA used as a probe examples include DNA with at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, and examples of DNA used as a primer include at least 10 bases, preferably 15 bases or more.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can also be obtained by following the instructions attached to a commercially available hybridization kit.
  • Commercially available hybridization kits include, for example, a random primed DNA labeling kit (manufactured by Roche Diagnostics), in which probes are prepared by a random prime method and hybridization is performed under stringent conditions.
  • the above stringent conditions mean, for example, that a DNA-immobilized filter and probe DNA are mixed in 50% formamide, 5x SSC (750mM sodium chloride, 75mM sodium citrate), 50mM sodium phosphate (pH 7.6 ), overnight incubation at 42°C in a solution containing 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g/L denatured salmon sperm DNA, followed by e.g. 0.2x SSC solution at about 65°C.
  • 5x SSC 750mM sodium chloride, 75mM sodium citrate
  • 50mM sodium phosphate pH 7.6
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing blocking reagents used to suppress background in hybridization experiments. Addition of the blocking reagent described above may be accompanied by alteration of hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • DNA that can hybridize under the above-mentioned stringent conditions includes, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 when calculated based on the above-mentioned parameters using programs such as BLAST and FASTA. Identity of 90% or more, preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more or 95% or more, more preferably 96% or more, 97% or more or 98% or more, even more preferably 99% or more Examples include DNA consisting of a base sequence having the following.
  • the DNA of the present invention can be obtained using a probe that can be designed based on the base sequence of DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5. It can be designed by Southern hybridization to a chromosomal DNA library of the genus Bisguardia fuzonensis or Chitinophaga lapis, or based on DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5. It can be obtained by PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using primer DNA and the above chromosomal DNA library as a template.
  • the DNA of the present invention also includes, for example, DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5 (for example, DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4), For example, Molecular Cloning 4th edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)) and Current Protocols are added to the base sequence of the part encoding continuous or discontinuous 1 to 20 amino acid residues located above Obtained by introducing a mutation using the site-directed mutagenesis method described in In Molecular Biology (JOHN WILEY & SONS, INC.) etc. and substituting it with a base sequence encoding another amino acid residue. I can do it.
  • the DNA of the present invention can also be obtained using PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • DNA can be obtained, for example, by subjecting DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 to error-prone PCR, etc., as a template.
  • the amino acid sequence consists of an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted, or added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5 of 1 [2] above.
  • DNA encoding a mutant protein can be obtained.
  • the DNA of the present invention can also be obtained by following the instructions attached to a commercially available partial-specific mutagenesis kit.
  • a commercially available part-specific mutagenesis kit for example, PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit (Takara Bio Inc.), which can introduce a mutation (deletion, substitution, insertion, or addition) into the desired mutation position, is available. (manufactured by).
  • a pair of mutation-introducing primers with 15 bases overlapping on the 5' side is designed. do. At this time, the overlapped portion contains the desired mutation.
  • PCR is performed using the mutation introduction primer and a plasmid having the nucleotide sequence into which the desired mutation is to be introduced as a template.
  • the DNA encoding a homologous protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5, described in 1 [3] above, can be obtained, for example, by the following method. can. Specifically, for example, 90% or more, preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, or 95% of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 in various gene sequence databases. Search for a nucleotide sequence having an identity of 96% or more, 97% or more, or 98% or more, still more preferably 99% or more, and design based on the nucleotide sequence or amino acid sequence obtained by the search.
  • the homologous protein can be obtained by a method similar to the method for obtaining DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5 above, using probe DNA or primer DNA that can DNA encoding a protein can be obtained.
  • base sequences and amino acid sequences can be determined by the same method as in 1 above. Furthermore, it can be confirmed by the same method as in 1 above that the mutant protein or homologous protein encoded by the DNA of the present invention has NAPRT activity.
  • the DNA of the present invention obtained by the above method can be used as it is or after being cut with an appropriate restriction enzyme, etc., and inserted into a vector by a conventional method.
  • a commonly used base Sequence analysis methods such as dideoxy method [Proc. Nat. Acad. Sci. , USA, 74, 5463 (1977)]
  • a base sequence analyzer such as Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer or Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (both manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • Vectors that can be used to determine the base sequence of the DNA of the present invention include pBluescript II KS (+), pPCR-Script Amp SK (+) (both manufactured by Agilent Technologies), and pT7Blue (manufactured by Merck Millipore). ), pCRII (manufactured by Thermo Fisher Scientific), pCR-TRAP (manufactured by Gene Hunter), and pDIRECT [Nucleic Acids Res. , 18, 6069 (1990)].
  • the above-mentioned host cell may be any cell as long as the above-mentioned vector can be introduced and propagated.
  • any method for introducing DNA into host cells can be used.
  • a method using calcium ions [Proc. .. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-248394
  • electroporation method Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)].
  • full-length DNA can be obtained by Southern hybridization or the like on a chromosomal DNA library using the partial-length DNA as a probe.
  • the desired DNA can also be prepared by chemically synthesizing it using an NTS M series DNA synthesizer manufactured by Nihon Techno Service Co., Ltd., etc., based on the determined DNA base sequence.
  • the recombinant DNA of the present invention contains the DNA of the present invention.
  • the recombinant DNA of the present invention is a DNA that can autonomously replicate in a host cell, and the DNA of the present invention is integrated into an expression vector containing a promoter at a position where the DNA of the present invention described in 2 above can be transcribed. It is the DNA of
  • DNA that can be integrated into the chromosome of a host cell and that contains the DNA of the present invention is also the recombinant DNA of the present invention.
  • the recombinant DNA is a recombinant DNA that can be integrated into the chromosome, it may or may not contain a promoter.
  • the recombinant DNA of the present invention is a recombinant DNA composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention described in 2 above, and a transcription termination sequence. It is preferable. Furthermore, a gene that controls a promoter may be included.
  • the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the start codon is preferably adjusted to an appropriate distance, for example, 6 to 18 bases.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is an appropriate nucleic acid molecule for introducing, propagating, and expressing the target DNA into a host, and includes not only plasmids but also artificial chromosomes, vectors using transposons, and cosmids. It's okay.
  • expression vectors include pColdI, pSTV28, pSTV29, pUC118 (all manufactured by Takara Bio), pET21a, pCDF-1b.
  • pRSF-1b (all manufactured by Merck Millipore), pMAL-c5x (all manufactured by New England Biolabs), pGEX-4T-1, pTrc99A (all manufactured by GE Healthcare Biosciences), pTrcHis, pSE280 (all manufactured by GE Healthcare Biosciences) Thermo Fisher Scientific), pGEMEX-1 (Promega), pQE-30, pQE-60, pQE80L (all manufactured by Qiagen), pET-3, pBluescriptII SK (+), pBluescriptII KS (- ) (all manufactured by Agilent Technologies), pKYP10 (Japanese Unexamined Patent Publication No.
  • any promoter may be used as long as it functions in cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as trp promoter, gapA promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, Promoters derived from Escherichia coli, phages, etc., such as the PSE promoter, can be used.
  • artificially designed and modified promoters such as a promoter in which two trp promoters are arranged in series, a tac promoter, a trc promoter, a lacT5 promoter, a lacT7 promoter, and a letI promoter can also be used.
  • examples of expression vectors include pCG1 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-134500), pCG2 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-35197). , pCG4 (JP 57-183799), pCG11 (JP 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all JP 58-105999), pCE51, pCE52, pCE53 [all Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)].
  • any promoter may be used as long as it functions in the cells of coryneform bacteria, but for example, the P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol. , 53, p674-679 (2000)] can be used.
  • examples of expression vectors include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, etc. .
  • any promoter may be used as long as it functions in the cells of the yeast strain, such as the PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, Examples include promoters such as heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, and CUP1 promoter.
  • the recombinant DNA of the present invention can be produced by, for example, treating the DNA fragment prepared by method 2 above with restriction enzymes and inserting the resulting fragment downstream of the promoter of the appropriate expression vector described above.
  • the expression level of the protein encoded by the DNA can also be improved.
  • Information on codon usage in host cells is available through public databases.
  • the transformant of the present invention is a transformant obtained by transforming a host cell with the recombinant DNA described in 3 above, which contains the DNA of the present invention described in 2 above.
  • the transformant of the present invention is preferably a transformant with enhanced nicotinamide mononucleotide (NMN) productivity compared to the host cell.
  • NNN nicotinamide mononucleotide
  • the host cell into which the recombinant DNA of the present invention is introduced may be any of prokaryotes, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., but preferably prokaryotes or yeast strains, more preferably , prokaryotes belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, or Pseudomonas, or the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon. , Escherichia coli, and particularly preferably Escherichia coli.
  • preferred host cells include Escherichia coli BL21 codon plus, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue (all manufactured by Agilent Technologies), Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (manufactured by Merck Millipore), Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli HST08Premium, Escherichia coli HST02, Escherichia coli HST04 dam-/ dcm-, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli CJ236, Escherichia coli BMH71-18 mutS, Esc herichia coli MV1184, Escherichia coli TH2 (both Takara Bio), Escherichia coli W, Escherichia coli JM101, Escherichia coli W3110, Escherichia
  • Prokaryotes such as D-0110, or Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Sch Yeast strains such as Wanniomyces alluvius, Pichia pastoris, or Candida utilis can be mentioned.
  • the host cell is preferably a bred strain whose nicotinamide or ⁇ -nicotinamide mononucleotide degrading activity is artificially weakened, or a strain whose productivity of nicotinamide, which is a substrate for the target ⁇ -nicotinamide mononucleotide, is artificially weakened.
  • a breeding stock that has been given or strengthened, or a breeding stock that has been given both can be used.
  • a method for artificially weakening the nicotinamide or ⁇ -nicotinamide mononucleotide decomposition activity of cells used as host cells, particularly microorganisms includes weakening at least one enzyme having nicotinamide or ⁇ -nicotinamide mononucleotide decomposition activity.
  • a method of blocking may be mentioned.
  • Methods for artificially imparting or enhancing the ability to produce nicotinamide (productivity) to cells used as host cells, particularly microorganisms include (a) controlling the mechanism that controls the biosynthetic pathway that produces the desired nicotinamide; (b) a method for enhancing the expression of at least one enzyme involved in the biosynthetic pathway that produces the desired nicotinamide; (c) the biosynthetic pathway that produces the desired nicotinamide. (d) weakening or blocking at least one metabolic pathway that branches from the biosynthetic pathway that produces the target nicotinamide to a metabolite other than the target substance;
  • the above-mentioned known methods can be used alone or in combination.
  • Non-Patent Document 5 for the purpose of further improving the productivity of NMN using Escherichia coli as a host cell, strengthening of NiaP, which is a nicotinamide uptake system, and enhancement of NMN excretion system. PnuC enhancement, PRPP synthase PrsA enhancement, etc. may also be performed.
  • Methods for introducing the recombinant DNA described in 3 above as a plasmid capable of autonomous replication in host cells include, for example, the above-mentioned method using calcium ions, the protoplast method, the electroporation method, and the spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 81, 4889 (1984)], lithium acetate method [J. Bacteriol. , 153, 163 (1983)].
  • Examples of methods for integrating recombinant DNA into the chromosome of host cells include homologous recombination.
  • Examples of the homologous recombination method include a method using a plasmid for homologous recombination that can be produced by ligating with plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate within the host cell into which the drug is to be introduced.
  • Examples of methods using homologous recombination frequently used in Escherichia coli include, for example, a method of introducing recombinant DNA using a lambda phage homologous recombination system [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].
  • the fact that the transformant obtained by the above method has the DNA of the present invention described in 2 above means, for example, that the transformant is cultured in a medium and the target NMN accumulated in the culture is The production amount can be confirmed by comparing it with that of the parent strain (host cell).
  • an extract containing the protein of the present invention is prepared from the culture, two different nicotinamides are present in the aqueous medium, and the amount of NMN accumulated in the aqueous medium is determined by It can also be confirmed by comparing it with that of the parent stock.
  • transformants of the present invention include the transformants described later in Examples.
  • Method for producing nicotinamide mononucleotide of the present invention As a method for producing nicotinamide mononucleotide (NMN) of the present invention, a microorganism having the ability to produce the protein of the present invention described in 1 above is cultured in a medium, and the culture is Examples include a method for producing NMN by a fermentation method, which is characterized by producing NMN.
  • the production method may include, for example, producing NMN in a culture, allowing it to accumulate, and collecting NMN from the culture.
  • the transformant of the present invention As the microorganism used in the method for producing NMN by fermentation method, it is preferable to use the transformant of the present invention described in 4 above, and also a transformant having the ability to produce nicotinamide, which is a substrate for NMN, and/or It is preferable that the transformant is a transformant whose degrading activity of nicotinamide or NMN is artificially weakened.
  • the method for culturing the transformant described in 4 above can be carried out according to the usual method used for culturing microorganisms.
  • the medium for culturing the transformant may be any medium that contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the transformant, and is capable of efficiently culturing the transformant.
  • Either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • Any substance that can be assimilated by the transformant may be used, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, sugars such as starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid or propionic acid, or glycerol. , alcohols such as ethanol, propanol, etc. can be used.
  • nitrogen sources include ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate or ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and corn steep liquor. , casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented microbial cells and digested products thereof, etc. can be used.
  • potassium phosphate dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc.
  • potassium phosphate dipotassium phosphate
  • magnesium phosphate magnesium phosphate
  • sodium chloride ferrous sulfate
  • manganese sulfate copper sulfate
  • calcium carbonate etc.
  • the transformant used does not have the ability to produce nicotinamide as a substrate, the nicotinamide is added to the medium during culture.
  • nicotinamide may be added to the medium during culture instead of nicotinamide. Nicotinamide may be supplied to the transformant of the present invention by co-cultivating a microorganism capable of producing nicotinamide with the transformant of the present invention.
  • Cultivation is usually preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration agitation culture.
  • the culture temperature is usually 15 to 40°C, and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH of the culture solution during cultivation is usually maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as necessary during culturing.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • NMN can be produced by producing NMN in the culture.
  • NMN can be produced, for example, by producing and accumulating NMN in a culture and collecting NMN from the culture.
  • the obtained NMN can be analyzed by a conventional method using high performance liquid chromatography (HPLC) or the like. Collection of NMN from the above-mentioned culture or a processed product of the culture can be carried out by a conventional method using activated carbon, ion exchange resin, or the like.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the method for producing NMN of the present invention may also be a method for producing NMN using the protein of the present invention.
  • NMN can be produced by reacting the protein of the present invention with its substrate, nicotinamide.
  • Example 1 Creation of microorganisms expressing various NAMPTs (1) Obtaining DNA encoding NAMPT Using the DNA listed in “Template” in Table 1 as a template, the "primer set” listed in Table 1 was used. , PCR was performed to amplify the target DNA fragment.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) is codon-optimized DNA for expression in E. coli, and was prepared by artificial synthesis. Chromosomal DNA of Chitinophaga rupis was prepared by a conventional method.
  • CrnadV (SEQ ID NO: 4) is a gene encoding nadV (SEQ ID NO: 5) (hereinafter referred to as "CrnadV”) derived from Chitinophaga lapis.
  • GenBank accession number of the genomic DNA of Visguardia fuzonensis strain M327/99/2 is CP016605.1
  • GenBank accession number of the genomic DNA of Chitinophaga lapis strain DSM 21039 is NZ_FOBB01000001.1.
  • PCR was performed using a DNA fragment consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 17 and 18 as a primer set. , a vector fragment of approximately 4.0 kb was obtained.
  • PCR was performed using the expression vector pTrc99A as a template and DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 19 and 18 as a primer set, to obtain a trc promoter fragment of approximately 250 bp.
  • PCR was performed using chromosomal DNA of Escherichia coli strain BL21 prepared by a conventional method as a template, PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 20 and 21 as a primer set, and a prsA fragment of approximately 950 bp was obtained.
  • Forward primer 5'-gcgcgaattgatctggtttgacagcttatcatcg-3' (SEQ ID NO: 19)
  • Reverse primer 5'-ggtctgtttcctgtgtgaaat-3' (SEQ ID NO: 18)
  • Forward primer 5'-tttcacacaggaaacagaccatgaagctttttgctggtaacg-3' (SEQ ID NO: 20)
  • Reverse primer 5'-tttcacacaggaaacagaccatgaagctttttgctggtaacg-3' (SEQ ID NO: 21)
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 19 and 21 as a primer set, and a DNA fragment of approximately 1200 bp (hereinafter referred to as the Ptrc-prsA fragment) was obtained. ) was obtained.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 22 and 23 as a primer set, and each vector fragment (hereinafter referred to as pBhnadV fragment) of approximately 5.5 kb was carried out.
  • pBhnadV fragment each vector fragment (hereinafter referred to as pBhnadV fragment) of approximately 5.5 kb was carried out.
  • pCrnadV fragment) was obtained.
  • Forward primer 5'-gtttgacagcttatcatcgac-3' (SEQ ID NO: 22)
  • Reverse primer 5'-cagatcaattcgcgctaactc-3' (SEQ ID NO: 23)
  • Chromosomal DNA of Shewanella oneidensis was prepared by a conventional method.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 6 encodes nicotinamide phosphoribosyltransferase nadV (hereinafter referred to as "SonadV") derived from Shewanella oneidensis, represented by SEQ ID NO: 7.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 9 is the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8) is codon-optimized DNA for expression in E. coli, and was prepared by artificial synthesis. Note that the base sequences represented by SEQ ID NOs: 24, 26, and 18, and SEQ ID NOs: 25, 27, and 17 include complementary sequences at their 5' ends.
  • GenBank accession number of the genomic DNA of Shewanella oneidensis strain MR-1 is CP053946.1
  • GenBank accession number of the genomic DNA of Haemophilus doucrei FDAARGOS 297 strain is CP022037.2.
  • NAMPTs were expressed by ligating each of the resulting amplified DNA fragments containing SonadV or HdnadV with the vector fragment prepared in Example 1 (1) using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio).
  • the plasmids pSonadV and pHdnadV were constructed.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 22 and 23 as a primer set, and each vector fragment of approximately 5.5 kb (hereinafter referred to as pSonadV fragment) was used as a template. pHdnadV fragment) was obtained.
  • E. coli having co-expression plasmids Escherichia coli strain W3110 was transformed using the co-expression plasmids obtained above to construct E. coli having various plasmids, and each strain was transformed into W3110/pPrsA-SonadV. and W3110/pPrsA-HdnadV.
  • Example 2 Production of NMN The productivity of NMN was evaluated for the W3110/pPrsA-BhnadV strain and the W3110/pPrsA-CrnadV strain constructed in Example 1. As positive controls, W3110/pPrsA-SonadV and W3110/pPrsA-HdnadV constructed in Comparative Example 1 were used.
  • the cells were inoculated and cultured with shaking at 30°C for 20 hours.
  • the obtained culture solution was inoculated at 1% into a large test tube containing 5 mL of LB medium containing 100 mg/L of ampicillin, and cultured with shaking at 30° C. for 16 hours. Two hours after the start of culture, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM.
  • reaction medium potassium dihydrogen phosphate 3 g/L, disodium hydrogen phosphate 6.8 g/L, sodium chloride 0.5 g/L, ammonium chloride 1 g/L, glucose 20 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 0.
  • the entire amount of wet bacterial cells was suspended in a large test tube containing 5 mL of 25 g/L, calcium chloride 14.7 mg/L, and NAM 2.6 g/L, and the reaction was carried out by shaking at 30° C. for 2 hours. After the reaction, the reaction solution was centrifuged, and the supernatant was subjected to NMN analysis. The test was performed three times independently. The results are shown in Table 3.
  • BhnadV and CrnadV have higher NMN production activity than SonadV and HdnadV, which are known NAMPTs.
  • BhnadV improved NMN productivity by more than 10 times than the known NAMPT, indicating that NMN can be efficiently produced by using the same enzyme.

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Abstract

本発明の蛋白質は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する、下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質である。 ［１］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質 ［２］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質 ［３］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質

Description

ＮＡＭＰＴ活性を有する蛋白質およびＮＭＮの製造方法
　本発明は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）活性を有する蛋白質、および該タンパク質を用いたニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法に関する。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は哺乳類において、電子伝達体として使われるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の前駆体であり、ミトコンドリアの活性化やサーチュイン遺伝子の活性化など多くの機能が知られ、サプリメントとして期待されている（非特許文献１、非特許文献２）。
　ＮＭＮの製造方法としては、化学合成法（特許文献１）、ＮＡＤの酵素的分解法（非特許文献３）、酵母からの抽出法（特許文献２）などが知られている。しかしながら、これらの製法は生産性が低いことや製造コストが高いことが課題であり、より安価で効率的な製造方法が求められていた。
　より効率的な製造方法として、ニコチンアミド（ＮＡＭ）と、酵素的または生物学的な方法で生成したホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）とを、菌体内で縮合させることによりＮＭＮを製造する方法が知られている（非特許文献４、５、６および特許文献３）。このニコチンアミドとＰＲＰＰの縮合反応には、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）が用いられている。ＮＡＭＰＴは、ヒトの生体内においてもＮＭＮ合成に関与することが知られており（非特許文献７）、ＮＭＮ合成の鍵酵素であると考えられている。
　ＮＡＭＰＴとしては、例えば、非特許文献４に開示されたＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ由来のＮＡＭＰＴが挙げられる。また非特許文献５には、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ　ｓｐ．　Ｃ－１、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ　ｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ、Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｂｏｌｅｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ　ｐｅｃｔｉｎｉｒｏｓｔｒｉｓ、Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ　ｒｏｘｅｌｌａｎａ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ　ａｌｅｃｔｏおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓに由来するＮａｐｍｔが開示されており、これらの中でも、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ　ｓｐ．　Ｃ－１またはＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ　ｐｉｎｅｎｓｉｓ由来のＮａｐｍｔを用いた場合に、高いＮＭＮ生産性を示すことが開示されている。
国際公開第２０１６／１６０５２４号 国際公開第２０１７／０２２７６８号 国際公開第２０１９／０６５８７６号
Kim Baumann, "Counteracting toxic protein aggregation", Nature Reviews Molecular Cell Biology 17 (2016) 679-690 Rui-Xiong Huang et al., "Nicotinamide mononucleotide attenuates glucocorticoid-induced osteogenic inhibition by regulating the SIRT1/PGC-1α signaling pathway", Molecular Medicine Reports 22 (2020) 145-154 E. Harth et al., "Control of photosynthetic oxygen evolution by the internal Ph of the chloroplast thylakoid Inhibition of photosynthetic oxygen evolution by uncouplers at high Ph and restoration of electron flow by an artificial electron donor for photosystem II", FEBS Letters 42 (1974) 161-164 G. C. Marinescu, "β-nicotinamide mononucleotide (NMN)production in Escherichia coli", Scientific Reports 8(2018) 12278 Shinichiro Shoji et al., "Metabolic design for selective production of nicotinamide mononucleotide from glucose and nicotinamide", Metabolic Engineering 65 (2021)167-177 Kazane Sugiyama et al., "Nicotinamide mononucleotide production by fructophilic lactic acid bacteria", Scientific Reports 11 (2021) 7662 Antje Garten et al. "Nampt: linking NAD biology, metabolism and cancer", Trends in Endocrinology & Metabolism 20 (2009) 130-138
　上記のように、大腸菌などの微生物に異種生物由来のＮＡＭＰＴを発現させることでニコチンアミドからＮＭＮを生産する方法は多く知られているものの、その生産性は十分とはいえない。より効率的にＮＭＮを生産するためには、活性が高く、かつ高効率にＮＭＮを生産できるＮＡＭＰＴの探索が求められる。
　本発明の目的は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）活性が向上した蛋白質、および該蛋白質を用いたニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供することである。
　本発明者らは、新規のＮＡＭＰＴ活性を有する蛋白質を提供すべく鋭意研究したところ、ビスガーディア・フゾネンシス（Ｂｉｓｇａａｒｄｉａ　ｈｕｄｓｏｎｅｎｓｉｓ）およびキチノファーガ・ラピス（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ　ｒｕｐｉｓ）由来のＮＡＭＰＴが、従来知られているヘモフィラス・ドゥークレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ）およびシュワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）由来のＮＡＭＰＴよりもＮＭＮ生産活性が高いことを見出し、本発明の完成に至った。
　本発明は、以下の１～８に関する。
１．ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する、下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質。
［１］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質
［３］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質
２．上記１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
３．下記［４］～［６］のいずれか１に記載のＤＮＡである、上記２に記載のＤＮＡ。
［４］配列番号２または４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［５］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
［６］配列番号２または４で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
４．上記２または３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
５．上記４に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
６．宿主細胞に比べて、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の生産性が増強された形質転換体である、上記５に記載の形質転換体。
７．上記宿主細胞が大腸菌である、上記５に記載の形質転換体。
８．上記５～７のいずれか１に記載の形質転換体を用いてニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を生産する、ＮＭＮの製造方法。
９．上記１に記載の蛋白質を用いてニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を生産する、ＮＭＮの製造方法。
　本発明によれば、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が向上した蛋白質を提供し、また該蛋白質を用いた、効率的なニコチンアミドモノヌクレオチの製造方法を提供することができる。
１．本発明の蛋白質
　本発明の蛋白質は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する、下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質である。
［１］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質
［３］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質
　ここで、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、ビスガーディア・フゾネンシス（Ｂｉｓｇａａｒｄｉａ　ｈｕｄｓｏｎｅｎｓｉｓ）由来のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質であり、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、キチノファーガ・ラピス（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ　ｒｕｐｉｓ）由来のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質である。
　ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、以下ＮＡＭＰＴという）は、ニコチンアミド（ＮＡＭ）を、ホスホリボシルピロリン酸（５－ｐｈｏｓｐｈｏ－α－Ｄ－ｒｉｂｏｓｅ　１－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、以下ＰＲＰＰという）と縮合させ、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド（化合物名：［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（３－ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－１－ｉｕｍ－１－ｙｌ）－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｏｘｏｌａｎ－２－ｙＩ］ｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；β－ＮＭＮ）を生成する酵素である。
　ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）活性とは、ＮＡＭおよびＰＲＰＰからβ－ＮＭＮを合成する活性、または、ＮＡＭ、ＰＲＰＰ、ＡＴＰ及び水分子を基質としてβ－ＮＭＮを合成する活性をいう。
　変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。［２］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、配列番号３または５で表されるアミノ酸配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよく、例えば、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、又は１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。
　置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型を問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　相同蛋白質とは、自然界に存在する生物が有する蛋白質であって、進化上の起源が同一の蛋白質に由来する一群の蛋白質をいう。相同蛋白質は、互いに構造及び機能が類似している。［３］の相同蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号３または５で表されるアミノ酸配列に対し、９０％以上、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上、より好ましくは９６％以上、９７％以上または９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有することが望ましい。
　アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは、例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐ　ｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　上記の［２］の変異蛋白質又は［３］の相同蛋白質が、ＮＡＰＲＴ活性を有していることは、例えば以下の方法により確認することできる。まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとする蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、ＮＡＭＲＴ活性又はβ－ＮＭＮ生成活性を有さない微生物、例えば、ニコチンアミダーゼをコードするＤＮＡ（ｐｎｃＡ遺伝子）、ニコチンアミドモノヌクレオチドアミダーゼをコードするＤＮＡ（ｐｎｃＣ遺伝子）、酸性ホスファターゼをコードするＤＮＡ（ａｐｈＡ遺伝子）、５’－ヌクレオチダーゼ／ＵＤＰ－加水分解酵素をコードするＤＮＡ（ｕｓｈＡ遺伝子）、および、ニコチンアミドリボシドホスホリラーゼをコードするＤＮＡ（ｄｅｏＤ遺伝子）を欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、該培地にニコチンアミドを添加し、β－ＮＭＮを生成させる。最後に、後述のＨＰＬＣを用いて培養上清中のβ－ＮＭＮを検出する。ＮＡＭＰＴ活性を有していることは、β－ＮＭＮの検出によって確認することができる。
２．本発明のＤＮＡ
　本発明のＤＮＡは、本発明の蛋白質、すなわち、上記［１］の蛋白質、［２］の変異蛋白質又は［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡである。
　本発明のＤＮＡとして、具体的には、下記［４］～［６］のいずれか１に記載のＤＮＡを挙げることができる。
［４］配列番号２または４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［５］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
［６］配列番号２または４で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
　ここで、配列番号２で表されるＤＮＡは、配列番号３で表されるビスガーディア・フゾネンシス由来のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、配列番号４で表されるＤＮＡは、配列番号５で表されるキチノファーガ・ラピス由来ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。
　配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの一例は、配列番号２又は配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの一例は、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。上記１［２］の変異蛋白質または［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡは、たとえば、上記［４］または［５］のＤＮＡが挙げられる。
　［５］のＤＮＡについて、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。従って、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。
　プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。
　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４））、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（１９９７））の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を挙げることができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて４２℃で一晩インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
　上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算した時に、配列番号２または４で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上、より好ましくは９６％以上、９７％以上または９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
　本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号３または５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計することができるプローブを用い、微生物、好ましくはビスガーディア属またはキチノファーガ属、より好ましくはビスガーディア・フゾネンシスまたはキチノファーガ・ラピスの染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号３または５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、上記染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。
　本発明のＤＮＡはまた、例えば、配列番号３または５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば配列番号２または４で表される塩基配列からなるＤＮＡ）を用いて、該ＤＮＡ上に位置する、連続または不連続の１～２０のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に、例えば、モレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＪＯＨＮ　ＷＩＬＥＹ　＆　ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、他のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより取得することができる。あるいは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等を用いることでも、本発明のＤＮＡを得ることができる。
　例えば、上記１［２］記載の、配列番号３または５で表されるアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号２または４で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
　または、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによる部分特異的変異導入法［Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によっても、上記１［２］の配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
　また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、本発明のＤＮＡを取得することができる。市販の部分特異的変異導入キットとしては、例えば、目的の変異を導入したい位置に変異（欠失、置換、挿入又は付加）を導入することができるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を挙げることができる。
　すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を含むプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドを得ることができる。
　上記１［３］に記載の、配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、以下の方法により取得することができる。具体的には、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号２または４で表わされる塩基配列と９０％以上、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上、より好ましくは９６％以上、９７％以上または９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記の配列番号３又は５で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって、該相同蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
　塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、上記１と同様の方法で決定することができる。また、本発明のＤＮＡによってコードされる変異蛋白質又は相同蛋白質が、ＮＡＰＲＴ活性を有していることは、上記１と同様の方法で確認することできる。
　上記の方法で取得した本発明のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］、又はアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
　本発明のＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができるベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］等を挙げることができる。
　上記の宿主細胞としては、上記ベクターを導入し増殖可能なものであれば何でもよいが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２等を挙げることができる。
　本発明のＤＮＡを組み込んで得られる組換え体ＤＮＡの宿主細胞への導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等を挙げることができる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
　さらに、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ　ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。
３．本発明の組換え体ＤＮＡ
　本発明の組換え体ＤＮＡは、本発明のＤＮＡを含有する。本発明の組換え体ＤＮＡは、宿主細胞において自律複製可能なＤＮＡであって、上記２の本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに本発明のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
　宿主細胞において染色体への組み込みが可能なＤＮＡであって、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡもまた、本発明の組換え体ＤＮＡである。
　組換え体ＤＮＡが、染色体への組み込みが可能な組換え体ＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していても含有していなくてもよい。
　細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記２の本発明のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。さらに、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　ここで、リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンの間は、適当な距離、例えば６～１８塩基に調節することが好ましい。
　また、本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　発現ベクターとしては、目的ＤＮＡを宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドを用いてもよい。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ－６０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＴｒＳ３０　［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２　［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（特開昭６３－２３３７９８号公報）等を挙げることができる。
　上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてコリネ型細菌を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることができる。
　上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４－６７９（２０００）］を用いることができる。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞として酵母菌株を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などを挙げることができる。
　上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
　本発明の組換え体ＤＮＡは、例えば、上記２の方法により調製したＤＮＡ断片を制限酵素処理する等して、上記の適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによって作製することができる。
　ここで、本発明ＤＮＡの塩基配列を宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることもできる。宿主細胞におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。
４．本発明の形質転換体
　本発明の形質転換体は、上記２に記載の本発明のＤＮＡを含有する上記３に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。本発明の形質転換体は、宿主細胞に比べて、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の生産性が増強された形質転換体であることが好ましい。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞は、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれであってもよいが、好ましくは、原核生物又は酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株、特に好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を挙げられる。
　好ましい宿主細胞の具体例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ―、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ９６３７、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ－０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。
　宿主細胞としては、好ましくは、ニコチンアミド又はβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド分解活性を人工的に弱化した育種株、目的とするβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの基質となるニコチンアミドの生産性を人工的に付与又は強化した育種株、もしくはその両方を施した育種株を用いることができる。
　宿主細胞として用いる細胞、特に微生物のニコチンアミド又はβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド分解活性を人工的に弱化する方法としては、ニコチンアミド又はβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド分解活性を有する酵素の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法などを挙げることができる。
　宿主細胞として用いる細胞、特に微生物に、ニコチンアミドを生産する能力（生産性）を人工的に付与又は強化する方法としては、（ａ）目的のニコチンアミドを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｂ）目的のニコチンアミドを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｃ）目的のニコチンアミドを生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｄ）目的のニコチンアミドを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、などを挙げることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
　上記、ニコチンアミド又はβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド分解活性を弱化し、かつ基質となるニコチンアミドの生産性を付与又は強化する方法の具体例としては、各種遺伝子操作による方法（国際公開第２０１８／２１１０２８号）等、公知の方法を挙げることができる。
　具体的には、例えば非特許文献５に記載のように、大腸菌を宿主細胞としたＮＭＮの生産性のさらなる生産性の向上を目的として、ニコチンアミドの取り込み系であるＮｉａＰの強化、ＮＭＮ排出系ＰｎｕＣ強化、ＰＲＰＰ合成酵素ＰｒｓＡの強化などを行ってもよい。
　また、Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｂ．　Ｂｌａｃｋら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ　１９　（２０２０）　１５０）に開示されたように、ＮＭＮ分解系であるｐｎｃＣの破壊、ＮＭＮ合成系ＮＲＫ１の強化、ＮＡＤリプレッサーｎａｄＲの破壊を行ってもよく、これらの目的は主にＮＭＮの分解系の遮断である。
　Ｇｒｏｓｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１８７　（２００５）　４５２１－４５３０）には、サルモネラについてＮＭＮ分解系としてａｐｈＡを、基質のニコチンアミドの分解系としてｐｎｃＡを報告していること、これらは大腸菌にも存在しているこれらの酵素の破壊によって、ＮＭＮの生産性が向上することが予想される。
　さらに、Ｃｈａｋｗａｎ　Ｓｉｅｗら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８６　（２０１１）　４０３６５－４０３７５）ではＮＭＮ分解系であるｐｎｃＣに関して報告しており、Ｙａｎｇ　Ｌｉｕら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４（２０２１）　２５８１－２５９１）はＰＲＰＰ供給向上のためにプリン核酸のレギュレーターであるｐｕｒＲの破壊、ＡＭＰ分解酵素ａｍｎの破壊を言及しており、特許文献３は上述の育種の他にｕｓｈＡ、ｄｅｏＤ、ｒｉｈＡ、ｒｉｈＢ、ｒｉｈＣの破壊を行い、種々の分解を抑制していることを開示していることから、これらの酵素の破壊もＮＭＮの生産性の向上に繋がると予想される。
　上記３の組換え体ＤＮＡを宿主細胞において自律複製可能なプラスミドとして導入する方法としては、例えば、上述のカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、並びに、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等の方法を挙げることができる。
　組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法を挙げることができる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］を挙げることができる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得することができる。
　上記の方法で得られた形質転換体が、上記２に記載の本発明のＤＮＡを有していることは、例えば、該形質転換体を培地に培養し、培養物中に蓄積した目的のＮＭＮの生成量を、親株（宿主細胞）のそれと比較することにより確認することができる。または、該培養物から本発明の蛋白質を含有する抽出液を調製し、該抽出液、２種の異なるニコチンアミドを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に蓄積したＮＭＮの生成量を、親株のそれと比較することによっても確認することができる。
　このような本発明の形質転換体の例としては、実施例において後述する形質転換体を挙げることができる。
５．本発明のニコチンアミドモノヌクレオチドの製造法
　本発明のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造法としては、上記１の本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＮＭＮを生成させることを特徴とする、発酵法によるＮＭＮの製造法を挙げることができる。該製造法は、例えば、培養物中にＮＭＮを生成させたのち、蓄積せしめ、該培養物中からＮＭＮを採取することを含んでもよい。
　発酵法によるＮＭＮの製造法に用いる、微生物としては上記４の本発明の形質転換体を用いることが好ましく、また、ＮＭＮの基質となるニコチンアミドを生成する能力を有する形質転換体、及び／又は、ニコチンアミド若しくはＮＭＮの分解活性を人工的に弱化した形質転換体であることが好ましい。
　上記４の形質転換体を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素原、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
該形質転換体が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
　窒素原としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
　無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用することができる。
　発酵法によるＮＭＮの製造法において、用いる形質転換体が基質となるニコチンアミドを生成する能力を有していない場合には、培養中に、当該ニコチンアミドを培地に添加する。
　また、発酵法によるＮＭＮの製造法において、用いる形質転換体が基質となるニコチンアミドを生成する能力を有していない場合には、培養中に、ニコチンアミドを培地に添加する代わりに、ニコチンアミドを生成する能力を有する微生物を、本発明の形質転換体と共培養することにより、本発明の形質転換体にニコチンアミドを供給してもよい。
　培養は、通常、振盪培養又は深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常１５～４０℃であり、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常３．０～９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　上記の培養により、培養物中にＮＭＮを生成させることによりＮＭＮを製造することができる。具体的には、例えば培養物中にＮＭＮを生成、蓄積せしめ、該培養物中からＮＭＮを採取することにより、ＮＭＮを製造することができる。
　得られたＮＭＮは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを用いる通常の方法によって分析することができる。上記の培養物又は該培養物の処理物中からのＮＭＮの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。菌体内にＮＭＮが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から活性炭やイオン交換樹脂等によって、ＮＭＮを採取することができる。
　本発明のＮＭＮの製造方法は、また本発明の蛋白質を用いてＮＭＮを生産する方法であってよい。本発明の蛋白質と、その基質であるニコチンアミドとを反応させることによって、ＮＭＮを生産することができる。
　以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［分析例］ＮＭＮの分析、定量
　実施例において、ＮＭＮの分析および定量は、分析装置ＳＰＤ－２０ＡＶ（島津製作所社製）を用いて行った。
（分析条件）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ａｓａｈｉｐａｋ　ＭＮ２Ｐ－５０　４Ｅ　４．６Φ，２５０ｍｍ，５μｍ（昭和電工社製）
カラム温度：３０℃
移動相：５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ４．０）：アセトニトリル＝６０：４０（ｖ／ｖ）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２６０ｎｍ
［実施例１］各種ＮＡＭＰＴを発現する微生物の造成
（１）ＮＡＭＰＴをコードするＤＮＡの取得
　表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型として、表１に記載の「プライマーセット」を用いて、ＰＣＲを行い、目的ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　配列番号２で表されるＤＮＡは、配列番号３で表されるビスガーディア・フゾネンシス（Ｂｉｓｇａａｒｄｉａ　ｈｕｄｓｏｎｅｎｓｉｓ）由来のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼｎａｄＶ（以下、「ＢｈｎａｄＶ」）をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。キチノファーガ・ラピス（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ　ｒｕｐｉｓ）の染色体ＤＮＡは、常法により調製した。ＣｒｎａｄＶ（配列番号４）は、キチノファーガ・ラピス由来のｎａｄＶ（配列番号５）（以下、「ＣｒｎａｄＶ」）をコードする遺伝子である。なお、ビスガーディア・フゾネンシスのＭ３２７／９９／２株のゲノムＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋアセッション番号はＣＰ０１６６０５．１であり、キチノファーガ・ラピスのＤＳＭ　２１０３９株のゲノムＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋアセッション番号はＮＺ＿ＦＯＢＢ０１０００００１．１である。
　発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（E Amann, B Ochs, K J Abel1988 Gene 30;69(2):301-315）を鋳型として、配列番号１７および１８で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーセットとしてＰＣＲを行い、約４．０ｋｂのベクター断片を得た。
フォーワードプライマー：5’-tgcctggcggcagtagcg-3’（配列番号１７）
リバースプライマー：5’-ggtctgtttcctgtgtgaaat-3’（配列番号１８）
　なお、配列番号１３、１５および１８、ならびに、配列番号１４、１６および１７で表される塩基配列は、それぞれの3’末端に相補的な配列を含む。
　得られたＢｈｎａｄＶまたはＣｒｎａｄＶを含む増幅ＤＮＡ断片と、ベクター断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種ＮＡＭＰＴを発現するプラスミド、ｐＢｈｎａｄＶおよびｐＣｒｎａｄＶを造成した。
（２）共発現用プラスミドの造成
　ｔｒｃプロモーター下に、上記（１）で得られた各種ＮＡＭＰＴをコードする遺伝子、および、配列番号１２で表されるエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来リボース－リン酸ジホスホキナーゼ（ＰｒｓＡ）をコードする遺伝子を配置した、ＮＡＭＰＴ発現用プラスミドを、以下の方法で造成した。なお、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１株のゲノムＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋアセッション番号はＣＰ０５３６０２．１である。
　発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを鋳型として、配列番号１９および１８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、約２５０ｂｐのｔｒｃプロモーター断片を得た。常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２０および２１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、約９５０ｂｐのｐｒｓＡ断片を得た。
フォーワードプライマー：5’-gcgcgaattgatctggtttgacagcttatcatcg-3’（配列番号１９）
リバースプライマー：5’-ggtctgtttcctgtgtgaaat-3’（配列番号１８）
フォーワードプライマー：5’-tttcacacaggaaacagaccatgaagctttttgctggtaacg-3’（配列番号２０）
リバースプライマー：5’-tttcacacaggaaacagaccatgaagctttttgctggtaacg-3’（配列番号２１）
　上記で得られたｔｒｃプロモーター断片とｐｒｓＡ断片を鋳型に、配列番号１９および２１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、約１２００ｂｐのＤＮＡ断片（以下、Ｐｔｒｃ－ｐｒｓＡ断片という）を得た。
　上記（１）で造成したｐＢｈｎａｄＶおよびｐＣｒｎａｄＶを鋳型として、配列番号２２および２３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、それぞれ約５．５ｋｂのベクター断片（以下、ｐＢｈｎａｄＶ断片、ｐＣｒｎａｄＶ断片という）を得た。
フォーワードプライマー：5’-gtttgacagcttatcatcgac-3’（配列番号２２）
リバースプライマー：5’-cagatcaattcgcgctaactc-3’（配列番号２３）
　上記で得られたＰｔｒｃ－ｐｒｓＡ断片と、ｐＢｈｎａｄＶ断片またはｐＣｒｎａｄＶ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種ＮＡＭＰＴとＰｒｓＡを共発現するプラスミドである、ｐＰｒｓＡ－ＢｈｎａｄＶおよびｐＰｒｓＡ－ＣｒｎａｄＶを造成した。
（３）共発現用プラスミドを有する大腸菌の造成
　上記（２）で得られた各種共発現用プラスミドを用い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株を形質転換することにより、各種プラスミドを有する大腸菌を造成し、それぞれＷ３１１０／ｐＰｒｓＡ－ＢｈｎａｄＶおよびＷ３１１０／ｐＰｒｓＡ－ＣｒｎａｄＶと命名した。
［比較例１］公知ＮＡＭＰＴを発現する微生物の造成
（１）ＮＡＭＰＴ配列の取得
　表２の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型として、表２に記載の「プライマーセット」を用いて、ＰＣＲを行い、目的ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　シュワネラ・オネイデンシスの染色体ＤＮＡは常法により調製した。配列番号６で表されるＤＮＡは、配列番号７で表されるシュワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）由来のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼｎａｄＶ（以下、「ＳｏｎａｄＶ」）をコードする。配列番号９で表されるＤＮＡは、配列番号１０で表されるヘモフィラス・ドゥークレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ）由来のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼｎａｄＶ（以下、「ＨｄｎａｄＶ」）をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号８）を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。なお、配列番号２４、２６および１８、配列番号２５、２７および１７で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。なお、シュワネラ・オネイデンシスＭＲ－１株のゲノムＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋアセッション番号はＣＰ０５３９４６．１であり、ヘモフィラス・ドゥークレイＦＤＡＡＲＧＯＳ　２９７株のゲノムＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋアセッション番号はＣＰ０２２０３７．２である。
　得られたＳｏｎａｄＶまたはＨｄｎａｄＶを含む各増幅ＤＮＡ断片と、実施例１（１）で調製したベクター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種ＮＡＭＰＴを発現するプラスミド、ｐＳｏｎａｄＶおよびｐＨｄｎａｄＶを造成した。
（２）共発現用プラスミドの造成
　ｔｒｃプロモーター下に、各種ＮＡＭＰＴをコードする遺伝子、および、エシェリキア・コリ由来リボース－リン酸ジホスホキナーゼ（ＰｒｓＡ）をコードする遺伝子を配置した、該遺伝子発現用プラスミドを、以下の方法で造成した。
　上記（１）で造成したｐＳｏｎａｄＶおよびｐＨｄｎａｄＶを鋳型として、配列番号２２および２３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、それぞれ約５．５ｋｂのベクター断片（以下、ｐＳｏｎａｄＶ断片、ｐＨｄｎａｄＶ断片という）を得た。
　実施例１（２）で得られたＰｔｒｃ－ｐｒｓＡ断片と、ｐＳｏｎａｄＶ断片またはｐＨｄｎａｄＶ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種ＮＡＭＰＴとＰｒｓＡを共発現するプラスミド、ｐＰｒｓＡ－ＳｏｎａｄＶおよびｐＰｒｓＡ－ＨｄｎａｄＶを造成した。
（３）共発現用プラスミドを有する大腸菌の造成
　上記で得られた共発現用プラスミドを用い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株を形質転換することにより、各種プラスミドを有する大腸菌を造成し、それぞれＷ３１１０／ｐＰｒｓＡ－ＳｏｎａｄＶおよびＷ３１１０／ｐＰｒｓＡ－ＨｄｎａｄＶと命名した。
［実施例２］ＮＭＮの製造
　実施例１で造成したＷ３１１０／ｐＰｒｓＡ－ＢｈｎａｄＶ株およびＷ３１１０／ｐＰｒｓＡ－ＣｒｎａｄＶ株について、ＮＭＮの生産性を評価した。ポジティブコントロールとして、比較例１で造成したＷ３１１０／ｐＰｒｓＡ－ＳｏｎａｄＶおよびＷ３１１０／ｐＰｒｓＡ－ＨｄｎａｄＶを使用した。
　各菌株をそれぞれアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／Ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ］５ｍＬが入った太型試験管に植菌し、３０℃で２０時間、振盪培養した。得られた培養液を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に１％植菌し、３０℃で１６時間、振盪培養した。培養開始から２時間後には、ＩＰＴＧを終濃度が０．５ｍＭとなるよう添加した。
　培養終了後、培養液各５ｍＬを遠心分離し、上清を除いて湿菌体を取得した。反応培地（リン酸二水素カリウム３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム６．８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．２５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム１４．７ｍｇ／Ｌ、ＮＡＭ２．６ｇ／Ｌ）５ｍＬが入った太型試験管に湿菌体を全量懸濁し、３０℃で２時間振盪し、反応を行った。反応後、反応液を遠心分離し、上清をＮＭＮの分析に供した。試験は独立して三回行った。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上の結果より、既知のＮＡＭＰＴであるＳｏｎａｄＶおよびＨｄｎａｄＶに比べて、ＢｈｎａｄＶおよびＣｒｎａｄＶはＮＭＮ生産活性が高いことが分かった。特にＢｈｎａｄＶは公知ＮＡＭＰＴよりも１０倍以上ＮＭＮ生産性が向上し、同酵素を用いることで効率的にＮＭＮを生産できることが示された。

Claims (9)

  1. 　ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する、下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質。
    ［１］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
    ［２］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質
    ［３］配列番号３または５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質
  2. 　請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
  3. 　下記［４］～［６］のいずれか１に記載のＤＮＡである、請求項２に記載のＤＮＡ。
    ［４］配列番号２または４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［５］配列番号２または４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェンドな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
    ［６］配列番号２または４で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
  4. 　請求項２または３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
  5. 　請求項４に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  6. 　宿主細胞に比べて、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の生産性が増強された形質転換体である、請求項５に記載の形質転換体。
  7. 　前記宿主細胞が大腸菌である、請求項５に記載の形質転換体。
  8. 　請求項５に記載の形質転換体を用いてニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を生産する、ＮＭＮの製造方法。
  9. 　請求項１に記載の蛋白質を用いてニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を生産する、ＮＭＮの製造方法。

     
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