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WO2022168991A1 - フコース含有糖質の輸送活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法 - Google Patents

フコース含有糖質の輸送活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法 Download PDF

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WO2022168991A1
WO2022168991A1 PCT/JP2022/004972 JP2022004972W WO2022168991A1 WO 2022168991 A1 WO2022168991 A1 WO 2022168991A1 JP 2022004972 W JP2022004972 W JP 2022004972W WO 2022168991 A1 WO2022168991 A1 WO 2022168991A1
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WO
WIPO (PCT)
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fucose
dna
protein
seq
amino acid
Prior art date
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PCT/JP2022/004972
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English (en)
French (fr)
Inventor
智惇 杉田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Bio Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Bio Co Ltd
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Priority to EP22749862.3A priority patent/EP4289955A4/en
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Priority to JP2022579651A priority patent/JPWO2022168991A1/ja
Publication of WO2022168991A1 publication Critical patent/WO2022168991A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
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    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01214—Glycoprotein 3-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.214)

Definitions

  • the present invention relates to a transporter involved in the excretion of fucose-containing carbohydrates and a method for producing fucose-containing carbohydrates such as 3-fucosyllactose.
  • HMO human milk oligosaccharides
  • Non-Patent Document 2 Among carbohydrates known as HMOs, fucose-containing carbohydrates such as 2′-fucosyllactose and 3-fucosyllactose account for about 60% of the total HMOs in terms of substance amount (Non-Patent Document 2). Particular attention is paid to functionality.
  • Non-Patent Document 3 describes a fermentation method using microorganisms that express fucosyltransferase derived from microorganisms such as Helicobacter pylori and Bacteroides fragilis, and using lactose and GDP-fucose as substrates. discloses a method for producing 2'-fucosyllactose and 3-fucosyllactose.
  • Patent Document 1 shows that the SetA protein, known as a transporter involved in sugar excretion in E. coli, is also involved in the transport of fucose-containing sugars such as 2'-fucosyllactose, and overexpresses the protein.
  • a method for improving the productivity of fucose-containing carbohydrates is disclosed.
  • the SetA protein is a transport protein belonging to the SET family among major facilitator superfamily (MFS) transporters (Non-Patent Document 4). unknown to
  • CDT2 protein derived from Neurospora crassa belonging to the SP family is involved in the transport of 2'-fucosyllactose as a transporter responsible for transporting oligosaccharides like the SetA protein (non-patent Reference 5).
  • the purpose of the present invention is to provide a method for efficiently producing fucose-containing carbohydrates using proteins involved in the transport of fucose-containing carbohydrates and microorganisms having the ability to produce proteins.
  • the present inventors have found that 3-fucosyllactose can be produced more efficiently than conventional methods by using a microorganism that has the ability to produce a protein having a transport activity for fucose-containing carbohydrates containing a specific amino acid sequence. I found that it can be done, and completed the present invention.
  • [1] A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • [2] A mutant protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and having transport activity for fucose-containing carbohydrates.
  • [3] A homologous protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having transport activity for fucose-containing carbohydrates.
  • 2. The protein according to 1 above, wherein the fucose-containing carbohydrate is an oligosaccharide. 3.
  • a method for producing a fucose-containing carbohydrate comprising culturing the transformant according to any one of 5 to 7 above in a medium to produce the fucose-containing carbohydrate in the culture.
  • the fucose-containing carbohydrate is an oligosaccharide.
  • the oligosaccharide is 3-fucosyllactose.
  • the protein of the present invention has excellent fucose-containing carbohydrate transport activity due to its specific amino acid sequence.
  • fucose-containing carbohydrates such as 3-fucosyllactose can be produced more efficiently than conventional methods.
  • the protein of the present invention is a protein according to any one of [1] to [3] below.
  • [1] A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • [2] A mutant protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and having transport activity for fucose-containing carbohydrates.
  • [3] A homologous protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having transport activity for fucose-containing carbohydrates.
  • amino acid deletion means deletion or disappearance of an amino acid residue in a sequence
  • amino acid substitution means that an amino acid residue in a sequence is replaced with another amino acid residue
  • amino acid insertion means that a new amino acid is inserted into the sequence
  • amino acid addition means that a new amino acid residue is added to the sequence to insert it. do.
  • substitution, substitution, insertion or addition of 1 to 20 amino acids include embodiments in which 1 to 20 amino acids are replaced with other chemically similar amino acids.
  • replacement of a hydrophobic amino acid with another hydrophobic amino acid, replacement of a polar amino acid with another polar amino acid having the same charge, and the like can be mentioned.
  • Such chemically similar amino acids are known in the art for each amino acid.
  • nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, glycine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • Polar (neutral) amino acids include serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine, and the like.
  • positively charged basic amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • aspartic acid, glutamic acid, etc. are mentioned as an acidic amino acid with a negative charge.
  • Amino acid sequences having 1 to 20 amino acid deletions, substitutions, insertions, additions, etc. in the amino acid sequence of the protein of interest include amino acids that have a certain degree of sequence identity with the amino acid sequence of the protein of interest. sequence. For example, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 90% or more of the amino acid sequence of the target protein, in the following order Amino acid sequences having 95% or more identity are preferred.
  • Deletion, substitution, insertion or addition of 1 to 20 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 confirms, for example, deletion, substitution, insertion or addition. It can be confirmed by aligning the amino acid sequence of the protein of interest with the amino acid sequence of the original protein.
  • Alignment of amino acid sequences can be created using, for example, the known alignment program ClustalW [Nucelic Acids Research 22, 4673, (1994)].
  • ClustalW for example, http://www. ebi.ac. Available from uk/clustalw/ (European Bioinformatics Institute). Default values, for example, can be used for parameters when creating an alignment using ClustalW.
  • amino acid residues to be substituted, inserted or added may be natural or non-natural.
  • natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, and L-arginine.
  • L-methionine L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenylalanine
  • the transport activity of fucose-containing carbohydrates refers to the activity of transporting intracellular fucose-containing carbohydrates out of the cell.
  • an oligosaccharide containing fucose as a constituent monosaccharide is preferable, and an oligosaccharide having a chain length of 3 to 6 and having a lactose terminal is more preferable.
  • 3-fucosyllactose 2′-fucosyllactose, lacto-N-fucopentaose I, lacto-N-fucopentaose II, lacto-N-fucopentaose III, lacto-N-fucopentaose V, lactodifucotetra ose, lacto-N-difcohexaose I, and lacto-N-difcohexaose II, among which 3-fucosyllactose.
  • Mutant protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in the original protein, or artificially inserting or adding amino acid residues into the protein.
  • Deletion, substitution, insertion or addition of amino acids in the mutant protein may mean deletion, substitution, insertion or addition of 1 to 20 amino acids at any position in the same sequence.
  • Amino acids to be substituted, inserted or added may be natural or non-natural.
  • naturally occurring amino acids include the aforementioned naturally occurring amino acids.
  • mutually substitutable amino acids are as described above.
  • Amino acids included in the same group can be substituted for each other.
  • Homologous proteins refer to a group of proteins derived from proteins of the same evolutionary origin, which are proteins possessed by organisms that exist in nature. Homologous proteins are similar in structure and function to each other.
  • a recombinant DNA having a DNA encoding a mutant protein or a homologous protein whose activity is to be confirmed is prepared by the method described below.
  • a transformant having a higher activity of the protein than the parent strain is prepared, and fucose produced and accumulated in the culture medium of the parent strain or the transformant It can be confirmed by comparing the amount of sugar contained.
  • the term "parent strain” refers to the original strain to be subjected to genetic modification, transformation, and the like.
  • DNA of the present invention is DNA encoding the protein described in [1] to [3] above. Specific examples of the DNA of the present invention include the following DNAs [A1] to [A3]. [A1] A base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3. [A2] Encodes a homologous protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and has fucose-containing carbohydrate transport activity DNA.
  • hybridize means a step in which DNA hybridizes to a DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, the DNA having the specific nucleotide sequence or the nucleotide sequence of the DNA hybridizing to a part of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. It may be the same DNA.
  • DNAs used as probes include, for example, DNAs of at least 100 bases or more, preferably 200 bases or more, and more preferably 500 bases or more.
  • DNAs used as primers include, for example, DNAs of at least 10 bases or more, preferably 15 bases or more.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can also be obtained by following the instructions attached to the commercially available hybridization kit.
  • Commercially available hybridization kits include, for example, a random primed DNA labeling kit (manufactured by Roche Diagnostics) in which probes are prepared by the random prime method and hybridized under stringent conditions.
  • the above stringent conditions are, for example, DNA-immobilized filters and probe DNAs mixed with 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6). ), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g/L of denatured salmon sperm DNA after overnight incubation at 42° C., followed by, for example, 0.2 ⁇ SSC solution at about 65° C. conditions in which the filter is washed.
  • 5 ⁇ SSC 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate
  • 50 mM sodium phosphate pH 7.6
  • 5 ⁇ Denhardt's solution 10% dextran sulfate
  • 20 ⁇ g/L of denatured salmon sperm DNA after overnight incubation at 42° C.
  • 0.2 ⁇ SSC solution at about 65° C. conditions in which the filter is washed.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing blocking reagents used to suppress background in hybridization experiments. Addition of blocking reagents as described above may be accompanied by alteration of the hybridization conditions in order to match the conditions.
  • Examples of the DNA that can hybridize under stringent conditions include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 when calculated based on the parameters described above using programs such as BLAST and FASTA described above.
  • a DNA consisting of a base sequence having at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity is included.
  • the DNA of the present invention can be obtained by, for example, molecular cloning 4th ed. It can be obtained by introducing a mutation by a site-directed mutagenesis method described in Protocols in Molecular Biology (JOHN WILEY & SONS, INC.), etc., and replacing it with a base sequence encoding another amino acid residue. . Alternatively, the DNA of the present invention can also be obtained by using PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be obtained, for example, by using a probe that can be designed based on the base sequence of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a specific example of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2 is the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 can be obtained, for example, by using a probe that can be designed based on the base sequence of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, using a microorganism, preferably Escherichia. Escherichia coli W3110 using a primer DNA that can be designed by Southern hybridization to a chromosomal DNA library of the genus, more preferably Escherichia coli W3110 strain, or based on a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 It can be obtained by PCR using the chromosomal DNA of the strain as a template.
  • a specific example of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:4 is the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO:3.
  • a mutein comprising an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and fucose according to [2] above, and fucose
  • a DNA encoding a mutant protein having transport activity for contained carbohydrates can be obtained, for example, by subjecting a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 to error-prone PCR or the like as a template.
  • a partial specific mutagenesis method by PCR using a set of PCR primers each having at their 5' end a nucleotide sequence designed to introduce the desired mutation (deletion, substitution, insertion or addition) ( Gene, 77, 51, 1989), a mutein comprising an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 of [2].
  • a DNA encoding a mutant protein having a fucose-containing carbohydrate transport activity can be obtained.
  • the DNA can also be obtained by following the instructions attached to the commercially available partial-specific mutagenesis kit.
  • a commercially available partial-specific mutagenesis kit for example, PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) that can introduce mutation (deletion, substitution, insertion or addition) at the position where the desired mutation is to be introduced is available. mentioned.
  • a pair of mutagenesis primers having a 15-base overlap on the 5' side is designed. do. At this time, the overlapping portion contains the desired mutation.
  • PCR is performed using a plasmid having a nucleotide sequence to be mutated as a template.
  • a DNA encoding a homologous protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having transport activity for fucose-containing carbohydrates can be obtained by, for example, the following: can be obtained by the method of Specifically, for example, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 99% of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 in various gene sequence databases.
  • a base sequence having an identity of 10% or more is searched, and using a probe DNA or primer DNA that can be designed based on the base sequence or amino acid sequence obtained by the search, and a microorganism having the DNA, the above SEQ ID NO: 2
  • the DNA encoding the homologous protein can be obtained by the same method as the method for obtaining the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by 4.
  • base sequences and amino acid sequences can be determined by the same method as 1 above.
  • the DNA of the present invention obtained by the above method may be used as it is, or may be cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, incorporated into a vector by a conventional method, and the resulting recombinant DNA introduced into a host cell.
  • Sequence analysis methods such as the dideoxy method (Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74, 5463, 1977), or Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer and Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (both from Thermo Fisher Scientific
  • the base sequence of the DNA can be determined by analysis using a base sequence analyzer such as (manufactured by Co., Ltd.).
  • Vectors that can be used for determining the nucleotide sequence of the DNA of the present invention include, for example, pBluescriptII KS (+), pPCR-Script Amp SK (+) (all manufactured by Agilent Technologies), pT7Blue (Merck Millipore company), pCRII (manufactured by Thermo Fisher Scientific), pCR-TRAP (manufactured by Gene Hunter), and pDIRECT (Nucleic Acids Res., 18, 6069, 1990).
  • the above host cells may be any cells as long as the vector can be introduced and proliferated.
  • any method for introducing DNA into host cells can be used.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110, 1972
  • protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • electroporation method Nucleic Acids Res., 16, 6127, 1988
  • full-length DNA can be obtained by Southern hybridization method etc. for the chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe.
  • the target DNA can be prepared by chemical synthesis using the NTS M series DNA synthesizer manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd., etc.
  • the recombinant DNA of the present invention is a DNA capable of autonomous replication in a host cell, wherein the DNA of the present invention is incorporated into an expression vector containing a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed in 2 above. It is the DNA that exists.
  • a DNA that can be integrated into the chromosome in a host cell and that has the DNA of the present invention is also the recombinant DNA of the present invention. If the recombinant DNA is a recombinant DNA capable of chromosomal integration, it may not contain a promoter.
  • the recombinant DNA of the present invention is a recombinant DNA composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention described in 2 above, and a transcription termination sequence. is preferred. Furthermore, a gene controlling a promoter may be included.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • expression vectors include pColdI, pSTV28, pUC118 (all manufactured by Takara Bio), pET21a, pCDF-1b, and pRSF.
  • pKYP200 Agric.Biol.Chem., 48,669,1984)
  • pLSA1 Agric.Biol.Chem., 53, 277, 1989
  • pGEL1 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)
  • pTrS30 prepared from Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)]
  • pTrS32 Escherichia coli JM109/pTrS32 ( FERM BP-5408)]
  • pTK31 [APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2007, Vol. 73, No.
  • any promoter that functions in the cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia can be used when the above expression vector is used.
  • Examples include trp promoter, gapA promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, Examples thereof include promoters derived from Escherichia coli, phages, etc., such as PSE promoter.
  • artificially designed and modified promoters such as a promoter in which two trp promoters are arranged in series, a tac promoter, a trc promoter, a lacT5 promoter, a lacT7 promoter, and a letI promoter are also included.
  • expression vectors include, for example, pCG1 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500), pCG2 (Japanese Patent Laid-Open No. 58- 35197), pCG4 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799), pCG11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (both Japanese Patent Laid-Open No. 58-105999 publication), pCE51, pCE52, and pCE53 (all of which are Molecular and General Genetics, 196, 175, 1984).
  • any promoter that functions in coryneform bacterium cells can be used as the promoter when the above expression vector is used.
  • P54-6 promoter Appl. Microbiol. , 2000.
  • expression vectors include, for example, YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • Any promoter can be used when the expression vector is used, as long as it functions in cells of yeast strains. Examples include PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, Promoters such as heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, and CUP1 promoter are included.
  • the recombinant DNA of the present invention can be produced, for example, by treating the DNA fragment prepared by the method 2 above with a restriction enzyme and inserting it downstream of the promoter of the appropriate expression vector.
  • the expression level of the protein encoded by the DNA can be improved.
  • Information on codon usage in host cells is available through public databases.
  • the transformant of the present invention is a transformant obtained by transforming a host cell with the recombinant DNA containing the DNA of the present invention described in 2 above.
  • the term "host cell” refers to the original cell to be transformed by gene transfer.
  • transformants of the present invention include microorganisms in which the activity of the protein of any one of [1] to [3] above and the productivity of fucose-containing carbohydrates are enhanced.
  • Examples of the microorganism in which the activity of the protein according to any one of [1] to [3] above is enhanced include a recombinant having the DNA according to any one of [A1] to [A3] above.
  • Examples thereof include microorganisms obtained by transforming a parent strain with somatic DNA and having enhanced productivity of fucose-containing carbohydrates compared to the parent strain.
  • Microorganisms obtained by transforming the parent strain with the recombinant DNA and having enhanced productivity of fucose-containing carbohydrates compared to the parent strain include, for example, the following microorganisms i) to iii). i) The recombinant DNA having the DNA according to any one of [A1] to [A3] above is introduced into the parent strain as an autonomously replicable plasmid, or integrated into the chromosome of the parent strain. A microorganism in which the amount of transcription of said DNA or the amount of production of a protein encoded by said DNA is increased.
  • a microorganism having enhanced productivity of fucose-containing carbohydrates by producing a protein having an enhanced specific activity of a protein having transport activity for fucose-containing carbohydrates as the mutant protein of [2] above.
  • iii) A microorganism having enhanced productivity of fucose-containing saccharides by producing a protein having an enhanced specific activity of a protein having transport activity for fucose-containing saccharides as the homologous protein of [3] above.
  • a transformant strain obtained by transforming a parent strain with DNA encoding a mutant protein. It is cultured in a medium, and the specific activity is measured from the amount of fucose-containing saccharide produced accumulated in the culture and the amount of the protein. This can be confirmed by comparing with the specific activity of the protein without
  • transformants of the present invention include the FucT/pSTV_YdeA strain and the FucT/pMW118_MdfA strain described later in Examples.
  • Host cells into which the recombinant DNA of the present invention is introduced may be any of prokaryotes, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., preferably prokaryotes or yeast strains, more preferably Escherichia genus.
  • Escherichia coli for example, Escherichia coli BL21 codon plus, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue (all manufactured by Agilent Technologies), Escherichia coli BL21(DE3)pLysS( ⁇ ) ⁇ Escherichia coli DH5 ⁇ Escherichia coli HST08Premium ⁇ Escherichia coli HST02 ⁇ Escherichia coli HST04 dam - /dcm - ⁇ Escherichia coli JM109 ⁇ Escherichia coli HB101 ⁇
  • yeast strains such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris or Cuandis.
  • host cells include microorganisms capable of producing fucose-containing carbohydrates, preferably microorganisms that have higher activity of proteins involved in the biosynthesis of fucose-containing carbohydrates than the parent strain.
  • Proteins involved in the biosynthesis of fucose-containing carbohydrates include GDP-fucose, which is a reaction substrate of fucosyltransferase, and receptor carbohydrates and fucosyltransferase, which are reaction substrates of fucosyltransferase.
  • Host cells include, for example, the following 1) to 3).
  • a microorganism used as a host cell, in which the ability to produce GDP-fucose, which is a reaction substrate for fucosyltransferase, is artificially imparted or enhanced 2)
  • a microorganism used as a host cell, a reaction substrate for fucosyltransferase Microorganisms artificially endowed or enhanced with the ability to supply certain receptor carbohydrates 3) Microorganisms used as host cells with artificially endowed or enhanced fucosyltransferase activity Each host cell will be described below. .
  • a microorganism used as a host cell that is artificially endowed or enhanced with the ability to produce GDP-fucose, which is a reaction substrate for fucosyltransferase.
  • methods for enhancement include known methods such as methods by various genetic manipulations (Metabolic Engineering (2017) 41: 23-38).
  • the ability to produce GDP-fucose includes the ability to produce GDP-fucose from sugar.
  • Methods for artificially imparting or enhancing the ability to produce GDP-fucose from sugar to a microorganism used as a host cell include, for example, the following methods (1a) to (1d). These methods may be used alone or in combination.
  • the mechanism controlling the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar include known mechanisms such as a control mechanism by a transcriptional regulatory factor (e.g., RcsA, etc.) involved in the regulation of the biosynthetic pathway. be done.
  • a transcriptional regulatory factor e.g., RcsA, etc.
  • enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar include mannose-6-phosphate isomerase, phosphomannommutase, mannose-1-phosphate guanylyltransferase, GDP-mannose- Known enzymes such as 4,6-dehydratase and GDP-L-fucose synthase can be mentioned.
  • metabolic pathway branching from the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar to metabolites other than the target substance include known metabolic pathways such as the metabolic pathway from GDP-fucose to colanic acid. be done.
  • methods for artificially imparting or enhancing include the following (2a) to (2g). These methods may be used alone or in combination.
  • Receptor carbohydrates include, for example, N-acetylglucosamine, N-acetyllactosamine, galactose, fucose, sialic acid, glucose or lactose, combinations thereof, and carbohydrate chains containing these as partial structures. Among these, lactose is preferred.
  • enzymes involved in biosynthetic pathways that produce acceptor carbohydrates from sugars include known enzymes such as enzymes that have lactose synthase activity that produces lactose using glucose and UDP-galactose as substrates.
  • enzymes that have lactose synthase activity that produces lactose using glucose and UDP-galactose as substrates include known enzymes such as ⁇ -galactosidase, which catalyzes the hydrolysis of lactose to produce glucose and galactose.
  • enzymes involved in intracellular uptake of receptor carbohydrates include known enzymes such as lactose permease, which is involved in intracellular uptake of lactose.
  • Specific examples of the method of imparting or enhancing the ability to supply receptor carbohydrates include methods of reducing or inactivating ⁇ -galactosidase activity by genetic manipulation (Metabolic Engineering, 2017, 41: 23-38). , known methods.
  • Microorganisms to which fucosyltransferase activity is artificially imparted or enhanced in microorganisms used as host cells examples include: (3a) and (3b). These methods may be used alone or in combination. (3a) a method of enhancing the expression of at least one fucosyltransferase (3b) a method of increasing the copy number of at least one gene encoding a fucosyltransferase
  • Fucosyltransferases include, for example, ⁇ 1,2-fucosyltransferase, ⁇ 1,3-fucosyltransferase, ⁇ 1,4-fucosyltransferase, and ⁇ 1,6-fucosyltransferase. Fucosyltransferase is preferred.
  • ⁇ 1,3-fucosyltransferases include the following proteins I) to III).
  • Methods for introducing the recombinant DNA of 3 above as an autonomously replicable plasmid in host cells include, for example, the above-described method using calcium ions, the protoplast method, the electroporation method, and the spheroplast method (Proc. Natl.Acad.Sci., USA, 81, 4889, 1984) and the lithium acetate method (J. Bacteriol., 153, 163, 1983).
  • Methods for integrating recombinant DNA into the chromosome of host cells include, for example, homologous recombination.
  • the homologous recombination method includes, for example, a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligating with a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the host cell to be introduced.
  • a method using homologous recombination frequently used in Escherichia coli for example, a method of introducing recombinant DNA using the homologous recombination system of lambda phage (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 , 6641-6645, 2000).
  • a selection method utilizing the sucrose sensitivity of Escherichia coli due to the Bacillus subtilis levansucrase integrated on the chromosome together with the recombinant DNA, and a method of incorporating a wild-type rpsL gene into Escherichia coli having a streptomycin-resistant mutant rpsL gene.
  • a selection method utilizing the sensitivity of E. coli to streptomycin [Mol. Microbiol. , 55, 137 (2005), Biosci. Biotechnol. Biochem. , 71, 2905 (2007)], etc., to obtain E. coli in which the target region on the chromosomal DNA of the host cell has been replaced with recombinant DNA.
  • the transformant obtained by the above method has the DNA of the present invention described in 2 above is, for example, the ability of the transformant to produce GDP-fucose or an acceptor sugar from sugar.
  • a transformant obtained by transforming a host cell having can be confirmed by
  • the method for producing fucose-containing saccharides of the present invention comprises culturing the transformant of 4 above in a medium to produce fucose-containing saccharides in the culture.
  • a method for producing fucose-containing saccharides by fermentation is mentioned.
  • the transformant of the present invention used in the method for producing fucose-containing carbohydrates by fermentation is preferably a transformant capable of producing GDP-fucose from sugar.
  • a transformant having the ability to produce an acceptor saccharide may also be used as the transformant of the present invention used in the method for producing a fucose-containing saccharide by fermentation.
  • the method for culturing the transformant in 4 above can be carried out according to the usual method used for culturing microorganisms.
  • any medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the transformant and capable of efficiently culturing the transformant can be used.
  • both natural and synthetic media may be used.
  • Any carbon source can be used as long as it can be assimilated by the transformant.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch or starch hydrolysates, and organic sources such as acetic acid or propionic acid.
  • organic sources such as acetic acid or propionic acid.
  • acids include acids, alcohols such as glycerol, ethanol, propanol, and the like.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor. , casein hydrolysates, soybean meal, soybean meal hydrolysates, various fermented bacteria and their digests, and the like.
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Acceptor carbohydrates such as lactose may be added as precursors of fucose-containing carbohydrates, and GTP, mannose, etc. as precursors of GDP-fucose may be added to the medium.
  • GDP-fucose is added to the medium during culture.
  • GDP-fucose may be supplied to the transformant of the present invention by co-cultivating a microorganism capable of producing GDP-fucose from sugar with the transformant of the present invention.
  • a microorganism capable of producing GTP may be cultured at the same time.
  • microorganisms capable of producing GTP include known microorganisms such as microorganisms in which expression of enzymes involved in the biosynthetic pathway of GTP is enhanced by various genetic manipulations (Biotechnol Bioeng, Sep. 3: 2019, 2412-2417). are mentioned.
  • the transformant to be used does not have the ability to produce receptor carbohydrates such as lactose
  • the receptor carbohydrates such as lactose are added to the medium during culture. Add to.
  • the transformant to be used does not have the ability to produce receptor carbohydrates such as lactose
  • receptor carbohydrates such as lactose can be added during the culture.
  • the medium by simultaneously culturing a microorganism capable of producing an acceptor carbohydrate such as lactose from sugar with the transformant of the present invention, the transformant of the present invention accepts lactose and the like.
  • Body carbohydrates may be supplied.
  • Cultivation is usually preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is usually 15 to 40° C., and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH of the culture solution during cultivation is usually maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • Example 1 Construction of microorganisms used for production of 3-fucosyllactose (1) Obtaining DNA fragments used as markers for gene deficiency As such, PCR was performed using the DNA listed in "Template” in Table 1 as a template to obtain each amplified DNA fragment.
  • the genomic DNA of 168 strains of Bacillus subtilis was prepared by a standard method.
  • the cat of the amplified DNA fragment includes about 200 bp upstream to about 50 bp downstream of the cat gene on pHSG396.
  • the amplified DNA fragment sacB contains about 300 bp upstream to about 100 bp downstream of the sacB gene on the genomic DNA of Bacillus subtilis strain 168.
  • PCR is performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 8 and 11 as a primer set, and DNA containing the cat gene and the sacB gene (hereinafter referred to as cat -sacB) fragment was obtained.
  • PCR was performed using the DNA consisting of the base sequences shown in Table 2 as a primer set to amplify each DNA fragment.
  • lacZ upstream 1 and lacZ upstream 2 regions include regions approximately 1000 bp upstream of the start codon from the start codon of the lacZ gene.
  • lacY downstream 1 and lacY downstream 2 include about 50 bp to about 1000 bp downstream of the stop codon of the lacY gene.
  • lacZY::cat-sacB DNA fragment consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequences of the regions surrounding the lacZ and lacY genes was obtained.
  • lacZ upstream 2 and lacY downstream 2 were directly linked (hereinafter referred to as ⁇ lacZY) to obtain a DNA fragment.
  • lacZY::cat-sacB fragment was transformed into plasmid pKD46 [Datsenko, K. et al. A. , Warner, B.; L. , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, Vol. 97, 6640-6645 (2000)] was introduced into the W3110 strain by electroporation, and a transformant exhibiting chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity (lacZ and lacY genes are lacZY::cat -sacB) was obtained.
  • the ⁇ lacZY fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a chloramphenicol-sensitive and sucrose-resistant transformant (a transformant in which lacZY::cat-sacB was replaced with ⁇ lacZY). . From these, a transformant exhibiting ampicillin sensitivity (a transformant lacking pKD46) was obtained. The transformant was named W3110 ⁇ lacZY.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the W3110 strain as a template and DNA consisting of the base sequences shown in "primer set" in Table 3 as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • wcaJ upstream 1 and wcaJ upstream 2 include regions from the start codon of the wcaJ gene to about 1000 bp upstream of the start codon.
  • wcaM downstream 1 and wcaM downstream 2 include the region from the stop codon of the wcaM gene to about 1000 bp downstream of the stop codon.
  • a mixture of wcaJ upstream 1, wcaM downstream 1 and cat-sacB fragment in an equimolar ratio was used as a template, and PCR was performed using DNAs consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 19 and 21 as a primer set.
  • a DNA fragment (hereinafter referred to as wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB) consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequence of the -wzxC-wcaKLM operon peripheral region was obtained.
  • PCR was performed using a mixture of wcaJ upstream 2 and wcaM downstream 2 at an equimolar ratio as a template, and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 19 and 21 as a primer set to obtain wcaJ-wzxC-wcaKLM.
  • a DNA (hereinafter referred to as ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM) fragment consisting of a sequence in which the wcaJ upstream and the wcaM downstream are directly linked was obtained.
  • a transformant (wcaJ-wzxC- A transformant in which wcaKLM was replaced with wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB) was obtained.
  • the ⁇ wcaJM fragment was introduced into the transformant by electroporation, and a transformant exhibiting chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB was replaced with ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM A transformed transformant) was obtained. Furthermore, a transformant exhibiting ampicillin sensitivity (a transformant lacking pKD46) was obtained. The transformant was named T166.
  • Genomic DNA of Escherichia coli W3110 strain and Bacteroides reticulotermitis JCM10512 strain was prepared by a conventional method.
  • the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 is a codon-optimized DNA for expressing the partial sequence of the gene encoding ⁇ 1,3-fucosyltransferase derived from Bacteroides fragilis ATCC 25285 strain in E. coli.
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 25 and 26, SEQ ID NOs: 28 and 29, SEQ ID NOs: 30 and 31, and SEQ ID NOs: 27 and 32 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • PCR was performed using, as a template, a mixture of three fragments, cBrFucT upstream, cBrFucT midstream, and cBrFucT downstream, at an equimolar ratio, and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 26 and 27 was used as a primer set.
  • 3 fragments hereinafter referred to as cBrFucT fragment
  • rcsA, cBrFucT, and lacY fragments were used as a template, and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 34 and 35 was used as a primer set to perform PCR, and the three fragments were ligated together. (hereinafter referred to as rcsA-cBrFucT-lacY) fragment was obtained.
  • nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 36 and 37 were PCR performed using the plasmid pPE167 (Appl. Obtained. At this time, the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 34 and 37 and SEQ ID NOs: 35 and 36 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • An ⁇ 1,3-fucosyltransferase expression plasmid was obtained by ligating the rcsA-cBrFucT-lacY fragment obtained above and the vector fragment using the In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • E. coli harboring the plasmid was constructed by the following method.
  • PCR was performed using oligonucleotides consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 38 and 39 as a primer set to obtain a pSTV29 vector fragment.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Escherichia coli ATCC9637 strain as a template and oligonucleotides consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 40 and 41 as a primer set to amplify a DNA fragment containing the uspA promoter.
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 38 and 41 and SEQ ID NOs: 39 and 40 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • the obtained DNA fragment containing the uspA promoter was ligated to the pSTV29 vector fragment using the In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio) to obtain the expression vector pSTV.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 strain as a template and oligonucleotides consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOS: 43 and 44 as a primer set to obtain YdeA protein (having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A DNA fragment encoding the protein) was amplified.
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 41 and 43 and SEQ ID NOs: 42 and 44 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • the expression vector pSTV_YdeA was obtained by ligating the DNA fragment encoding YdeA obtained above to the pSTV vector fragment using the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio).
  • an Escherichia coli-derived drug an Escherichia coli-derived transporter gene (mdfA) belonging to the H+ antiporter-1 family was placed under the lac promoter, and an E. coli strain containing the gene expression plasmid was constructed by the following method.
  • mdfA Escherichia coli-derived transporter gene belonging to the H+ antiporter-1 family was placed under the lac promoter, and an E. coli strain containing the gene expression plasmid was constructed by the following method.
  • PCR was performed using oligonucleotides consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 45 and 46 as a primer set to obtain a pMW118 vector fragment.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 strain as a template and oligonucleotides consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 47 and 48 as a primer set to obtain the MdfA protein (having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 A DNA fragment encoding the protein) was amplified.
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 45 and 48 and SEQ ID NOs: 46 and 47 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • the obtained DNA fragment encoding MdfA was ligated to the pMW118 vector fragment using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio) to obtain the expression vector pMW118_MdfA.
  • the FucT strain constructed in Example 1 (3) was transformed to obtain FucT/pSTV strain, FucT/pMW118 strain, FucT/ The pSTV_YdeA and FucT/pMW118_MdfA strains were obtained.
  • Example 2 Production of 3-fucosyllactose by fermentation using a microorganism that strongly expresses a transporter , cultured on an LB plate at 30 ° C. for 24 hours, added 100 mg / L kanamycin and 25 mg / L chloramphenicol (pSTV29-derived plasmid expression strain) or 100 mg / L ampicillin (pMW118-derived plasmid expression strain) The strain was inoculated into a large test tube containing 4 mL of LB medium containing the strain, and cultured with shaking at 30°C for 18 hours.
  • the resulting culture was transferred to a production medium containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol (pSTV29-derived plasmid expression strain) or 100 mg/L ampicillin (pMW118-derived plasmid expression strain)
  • pSTV29-derived plasmid expression strain 100 mg/L ampicillin
  • ampicillin pMW118-derived plasmid expression strain
  • glucose 30 g /L lactose monohydrate 10 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 2 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 16 g/L, potassium dihydrogen phosphate 14 g/L, ammonium sulfate 2 g/L, citric acid 1 g/L , casamino acids 5 g/L, thiamine hydrochloride 10 mg/L, ferrous sulfate heptahydrate 50 mg/L, manganese sulfate pentahydrate 10 mg/L (glucose, lacto
  • SEQ ID NO: 1 E. Nucleotide sequence of ydeA derived from E. coli W3110 SEQ ID NO: 2: E. coli W3110 E. coli W3110-derived YdeA amino acid sequence SEQ ID NO: 3: E. coli W3110. Nucleotide sequence of mdfA derived from E. coli W3110 SEQ ID NO: 4: E. coli W3110 E.

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Abstract

本発明は、フコース含有糖質の輸送に関与する蛋白質、及び蛋白質を生産する能力を有する微生物により効率的にフコース含有糖質を製造する方法の提供を目的とする。本発明は、［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する変異蛋白質、［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する相同蛋白質のいずれか１の蛋白質に関する。

Description

フコース含有糖質の輸送活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法
　本発明は、フコース含有糖質の排出に関わるトランスポーター、及び３－フコシルラクトース等のフコース含有糖質の製造法に関する。
　ヒト母乳中に含まれるヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）はプレバイオティクスとしての腸内環境の改善作用や免疫の賦活化、乳幼児の認知機能発達などの健康機能を有することが報告されており、その生理活性から、幼児用調製粉乳への添加剤や成人向け健康機能素材としての活用が期待されている（非特許文献１）。
　ＨＭＯとして知られる糖質のうち２’－フコシルラクトースや３－フコシルラクトースなどのフコース含有糖質は、物質量比でＨＭＯ全体の約６０％を占めており（非特許文献２）、ＨＭＯの中でも特に機能性が注目されている。
　フコース含有糖質の製造法としては、フコース転移酵素を利用した微生物発酵法が広く活用されている。非特許文献３には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ（ヘリコバクター・ピロリ）やＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ（バクテロイデス・フラジリス）などの微生物に由来するフコース転移酵素を発現させた微生物を用い、ラクトースとＧＤＰ－フコースを基質として、発酵法により２’－フコシルラクトースや３－フコシルラクトースを生産する方法が開示されている。
　特許文献１には、大腸菌において糖の排出に関わるトランスポーターとして知られるＳｅｔＡ蛋白質が、２’－フコシルラクトース等のフコース含有糖質の輸送にも関与することが示され、当該蛋白質を過剰発現させることによりフコース含有糖質の生産性を向上させる方法が開示されている。
　ＳｅｔＡ蛋白質は、Ｍａｊｏｒ　Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ　Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＭＦＳ）輸送体のうち、ＳＥＴファミリーに属する輸送蛋白質である（非特許文献４）が、同じＳＥＴファミリーに属する蛋白質でフコース含有糖質の輸送に関与する蛋白質は他に知られていない。
　ＳｅｔＡ蛋白質と同様にオリゴ糖の輸送を担う輸送体として、ＳＰファミリーに属するＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ（ネウロスポラ・クラッサ）由来のＣＤＴ２蛋白質が、２’－フコシルラクトースの輸送に関わることが開示されている（非特許文献５）。
日本国特許第５５８０４０８号公報
Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２０１９）２３９０２４０：１－８ Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１９）５６：１３０－１３７ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８ Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４：２２９７７－２２９８４ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１９）５２：２３２－２４２
　しかしながら、ＳｅｔＡ蛋白質やＣＤＴ２蛋白質の他に、フコース含有糖質の排出に関わる蛋白質は報告されておらず、効率的なフコース含有糖質の製造法を実現する手段として、フコース含有糖質の輸送に関与する蛋白質のさらなる探索が求められている。
　したがって、本発明は、フコース含有糖質の輸送に関与する蛋白質、及び蛋白質を生産する能力を有する微生物により効率的にフコース含有糖質を製造する方法の提供を目的とする。
　本発明者は、特定のアミノ酸配列を含むフコース含有糖質の輸送活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることにより、従来の方法と比して、効率的に３－フコシルラクトースを製造できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
１．下記［１］～［３］のいずれか１の蛋白質。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する相同蛋白質。
２．前記フコース含有糖質がオリゴ糖である、前記１に記載の蛋白質。
３．配列番号１又は３で表される塩基配列又はその相同配列からなり、かつ前記１または２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
４．前記３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
５．前記４に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
６．前記１に記載の［１］～［３］のいずれか１の蛋白質の活性及び前記フコース含有糖質の生産性が増強された微生物である、前記５に記載の形質転換体。
７．前記微生物が前記フコース含有糖質の生産能を有する大腸菌である、前記６に記載の形質転換体。
８．前記５～７のいずれか１に記載の形質転換体を培地に培養して培養物中に前記フコース含有糖質を生成させることを含む、フコース含有糖質の製造法。
９．前記フコース含有糖質がオリゴ糖である、前記８に記載の製造法。
１０．前記オリゴ糖が３－フコシルラクトースである、前記９に記載の製造法。
　本発明の蛋白質は、特定のアミノ酸配列からなることにより、優れたフコース含有糖質の輸送活性を有する。本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることにより、従来と比して、効率的に３－フコシルラクトース等のフコース含有糖質を製造できる。
１．本発明の蛋白質
　本発明の蛋白質は、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質である。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する相同蛋白質。
　「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の挿入」とは配列中に新たなアミノ酸が挿入されていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
　「１～２０個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加」の具体的な態様としては、１～２０個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などが挙げられる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。
　具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加などを有するアミノ酸配列としては、対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。例えば、対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列と好ましくは６０％以上、より好ましくは以下順に６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていることは、例えば、欠失、置換、挿入又は付加されていることを確認しようとする蛋白質のアミノ酸配列と、元となる蛋白質のアミノ酸配列とをアライメントすることにより確認できる。
　アミノ酸配列のアライメントは、例えば、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２２，４６７３，（１９９４）］を用いて作成できる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ.ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より利用できる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いることができる。
　配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸を置換、挿入又は付加する場合、置換、挿入又は付加するアミノ酸残基は、天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　フコース含有糖質の輸送活性とは、細胞内のフコース含有糖質を細胞外へ輸送する活性をいう。
　フコース含有糖質としては、例えば、構成単糖としてフコースを含有するオリゴ糖が好ましく、鎖長３～６であり且つラクトース末端を有するオリゴ糖がより好ましい。より具体的には例えば、３－フコシルラクトース、２’－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ、ラクトジフコテトラオース、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ、及びラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩが挙げられ、これらの中でも３－フコシルラクトースが挙げられる。
　変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。
　置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸の例としては、前記の天然型アミノ酸が挙げられる。相互に置換可能なアミノ酸の例は前述の通りである。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
　相同蛋白質とは、自然界に存在する生物が有する蛋白質であって、進化上の起源が同一の蛋白質に由来する一群の蛋白質をいう。相同蛋白質は、互いに構造及び機能が類似している。　
　アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３，１９９３）やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３，１９９０）を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは、例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐ　ｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　上記の変異蛋白質又は相同蛋白質が、フコース含有糖質の輸送活性を有することは、例えば以下の方法により確認できる。まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとする変異蛋白質又は相同蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、親株を形質転換することにより該親株より該蛋白質の活性が高い形質転換体を作製し、該親株又は該形質転換体の培養液中に生成、蓄積したフコース含有糖質の量を比較することによって確認できる。本明細書において、「親株」とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元株をいう。
２．本発明のＤＮＡ
　本発明のＤＮＡは、上記［１］～［３］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡである。本発明のＤＮＡとして、具体的には以下の［Ａ１］～［Ａ３］のＤＮＡが挙げられる。
［Ａ１］配列番号１又は３で表される塩基配列。
［Ａ２］配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、フコース含有糖質の輸送活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ。
［Ａ３］配列番号１又は３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、フコース含有糖質の輸送活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ。
　上記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。従って、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。
　プローブとして用いるＤＮＡとしては、例えば、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡが挙げられる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、例えば、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡが挙げられる。
　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２０１２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ，１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ，１９９７）の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行える。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得できる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）が挙げられる。
　上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて４２℃で一晩インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件が挙げられる。
　上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算した時に、配列番号１又は３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
　本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、例えば、モレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２０１２）及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＪＯＨＮ　ＷＩＬＥＹ＆ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、他のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより取得できる。あるいは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等を用いることでも、本発明のＤＮＡが得られる。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物、好ましくはエシェリヒア属、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ）　Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得できる。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、具体的には、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
　配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物、好ましくはエシェリヒア属、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得できる。配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、具体的には、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
　前記［２］に記載の、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む変異蛋白質であり、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得できる。
　又は、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによる部分特異的変異導入法（Ｇｅｎｅ，７７，５１，１９８９）によっても、前記［２］の配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含む変異蛋白質であり、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得できる。
　また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、該ＤＮＡを取得できる。市販の部分特異的変異導入キットとしては、例えば、目的の変異を導入したい位置に変異（欠失、置換、挿入又は付加）を導入できるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）が挙げられる。
　すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を有するプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドが得られる。
　前記配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相同蛋白質であり、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、以下の方法により取得できる。具体的には、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１又は３で表わされる塩基配列と好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計できるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、前記の配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって、該相同蛋白質をコードするＤＮＡを取得できる。
　塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、前記１と同様の方法で決定できる。上記の方法で取得した本発明のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３，１９７７）、又はアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定できる。
　本発明のＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができるベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，６０６９，１９９０）等が挙げられる。
　上記の宿主細胞としては、前記ベクターを導入し増殖可能なものであれば何でもよいが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２等が挙げられる。
　本発明のＤＮＡを組み込んで得られる、組み換えＤＮＡの宿主細胞への導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０，１９７２）、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６，６１２７，１９８８）等が挙げられる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得できる。
　更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ　ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。
３．本発明の組換え体ＤＮＡ
　本発明の組換え体ＤＮＡは、宿主細胞において自律複製可能なＤＮＡであって、前記２の本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに本発明のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
　宿主細胞において染色体への組込が可能なＤＮＡであって、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡもまた、本発明の組換え体ＤＮＡである。組換え体ＤＮＡが、染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
　細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、前記２の本発明のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。さらに、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　ここで、リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンの間は、適当な距離、例えば６～１８塩基に調節することが好ましい。また、本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８(いずれもタカラバイオ社製)、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ(いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ－６０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９，１９８４）、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７，１９８９）、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）、ｐＴｒＳ３０［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９/ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９/ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）、ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８/１２３４３号）、ｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５）、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）等が挙げられる。
　上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターが挙げられる。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてコリネ型細菌を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３（いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５，１９８４）等が挙げられる。
　上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４－６７９，２０００）が挙げられる。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞として酵母菌株を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などが挙げられる。
　前記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
　本発明の組換え体ＤＮＡは、例えば、前記２の方法により調製したＤＮＡ断片を制限酵素処理する等して、前記の適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによって作製できる。
　ここで、本発明のＤＮＡを構成する塩基配列を宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上できる。宿主細胞におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
４．本発明の形質転換体
　本発明の形質転換体は、前記２に記載の本発明のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。本明細書において、「宿主細胞」とは、遺伝子導入による形質転換の対象となる元の細胞をいう。
　本発明の形質転換体としては、具体的には例えば、上記［１］～［３］のいずれか１の蛋白質の活性及びフコース含有糖質の生産性が増強された微生物が挙げられる。上記の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性が増強された微生物としては、例えば上記［Ａ１］～［Ａ３］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもフコース含有糖質の生産性が増強された微生物が挙げられる。
　親株を前記組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、該親株よりもフコース含有糖質の生産性が増強された微生物としては、例えば、以下のi）～iii）の微生物が挙げられる。
i）上記［Ａ１］～［Ａ３］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されることにより、又は親株の染色体中に組み込まれることにより、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大した微生物。
ii）上記［２］の変異蛋白質としてフコース含有糖質の輸送活性を有する蛋白質の比活性が増強された蛋白質を生産することにより、フコース含有糖質の生産性が増強された微生物。
iii）上記［３］の相同蛋白質としてフコース含有糖質の輸送活性を有する蛋白質の比活性が増強された蛋白質を生産することにより、フコース含有糖質の生産性が増強された微生物。
　上記［Ａ１］～［Ａ３］のいずれか１つに記載のＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことを確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより又は該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認できる。
　フコース含有糖質の輸送活性を有する蛋白質の比活性が増強されたことを確認する方法としては、例えば、変異蛋白質をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる形質転換株該形質転換体を培地に培養し、培養物中に蓄積したフコース含有糖質生成量と該蛋白質量から比活性を測定し、同様に測定した、フコース含有糖質の輸送活性を有し、且つ変異が導入されていない蛋白質の比活性と比較することにより確認できる。
　このような本発明の形質転換体の例としては、実施例において後述するＦｕｃＴ／ｐＳＴＶ＿ＹｄｅＡ株及びＦｕｃＴ／ｐＭＷ１１８＿ＭｄｆＡ株が挙げられる。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞は、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれであってもよいが、好ましくは原核生物又は酵母菌株、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株であり、最も好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ９６３７、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ［例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８］、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ［例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ［Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ［Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０］、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ［Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４］若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ－０１１０）等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株が挙げられる。
　宿主細胞としては、フコース含有糖質の生産能を有する微生物が挙げられ、フコース含有糖質の生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物が好ましい。フコース含有糖質の生合成に関わる蛋白質としては、フコース転移酵素の反応基質であるＧＤＰ－フコース、フコース転移酵素の反応基質である受容体糖質およびフコース転移酵素が挙げられる。
　宿主細胞としては、例えば、以下の１）～３）が挙げられる。
１）宿主細胞として用いる微生物において、フコース転移酵素の反応基質であるＧＤＰ－フコースを生産する能力が人工的に付与又は増強された微生物
２）宿主細胞として用いる微生物において、フコース転移酵素の反応基質である受容体糖質を供給する能力が人工的に付与又は増強された微生物
３）宿主細胞として用いる微生物において、フコース転移酵素活性が人工的に付与又は増強された微生物
　以下、各宿主細胞について説明する。
１）宿主細胞として用いる微生物において、フコース転移酵素の反応基質であるＧＤＰ－フコースを生産する能力が人工的に付与又は増強された微生物
　宿主細胞として用いる微生物において、ＧＤＰ－フコースを生成する能力を付与又は増強する方法としては、具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
　ＧＤＰ－フコースを生産する能力としては、糖からＧＤＰ－フコースを生産する能力が挙げられる。宿主細胞として用いる微生物に、糖からＧＤＰ－フコースを生産する能力を人工的に付与又は増強する方法としては、例えば、以下の（１ａ）～（１ｄ）の方法が挙げられる。これらの方法は単独または組み合わせて用いてもよい。
（１ａ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（１ｂ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（１ｃ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（１ｄ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の具体例としては、例えば、当該生合成経路の制御に関わる転写調節因子（例えば、ＲｃｓＡ等）による制御機構等、公知の機構が挙げられる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰマンノース－４，６－デヒドラターゼ、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の具体例としては、例えば、ＧＤＰ－フコースからコラン酸への代謝経路等、公知の代謝経路が挙げられる。
２）宿主細胞として用いる微生物において、フコース転移酵素の反応基質である受容体糖質を供給する能力が人工的に付与又は増強された微生物
　宿主細胞として用いる微生物に、受容体糖質を供給する能力を人工的に付与又は増強する方法としては、例えば、以下の（２ａ）～（２ｇ）が挙げられる。これらの方法は単独または組み合わせて用いてもよい。
（２ａ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｂ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（２ｃ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｄ）受容体糖質を分解する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｅ）受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（２ｆ）受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｇ）受容体糖質から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
　受容体糖質としては、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルラクトサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸、グルコース若しくはラクトースまたはそれらの組合せ、さらにはそれらを部分構造として含む糖鎖が挙げられる。これらの中でもラクトースが好ましい。
　糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、グルコース及びＵＤＰ－ガラクトースを基質としてラクトースを生成するラクトースシンターゼ活性を有する酵素等、公知の酵素が挙げられる。受容体糖質を分解する機構の具体例としては、例えば、ラクトースの加水分解を触媒しグルコース及びガラクトースを生成するβ－ガラクトシダーゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素の具体例としては、例えば、ラクトースの細胞内取り込みに関与するラクトースパーミアーゼ等、公知の酵素が挙げられる。上記、受容体糖質を供給する能力を付与又は増強する方法の具体例としては、遺伝子操作によりβ－ガラクトシダーゼの活性を低下又は失活させる方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
３）宿主細胞として用いる微生物において、フコース転移酵素活性が人工的に付与又は増強された微生物
　宿主細胞として用いる微生物において、フコース転移酵素活性を人工的に付与又は増強する方法としては、例えば、以下の（３ａ）および（３ｂ）が挙げられる。これらの方法は単独または組み合わせて用いてもよい。
（３ａ）フコース転移酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（３ｂ）フコース転移酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
　フコース転移酵素としては、例えば、α１，２－フコース転移酵素、α１，３－フコース転移酵素、α１，４－フコース転移酵素、α１，６－フコース転移酵素が挙げられ、これらの中でもα１，３－フコース転移酵素が好ましい。
　α１，３－フコース転移酵素としては、具体的には例えば、以下のI)～III)の蛋白質が挙げられる。
I）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
II)配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコース転移酵素活性を有する変異蛋白質
III)配列番号６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコース転移酵素活性を有する相同蛋白質
　前記３の組換え体ＤＮＡを宿主細胞において自律複製可能なプラスミドとして導入する方法としては、例えば、上述のカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、並びに、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９，１９８４）、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３，１９８３）等の方法が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５，２０００）が挙げられる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得できる。
　上記の方法で得られた形質転換体が、前記２に記載の本発明のＤＮＡを有していることは、例えば、該形質転換体が糖からＧＤＰ－フコースや受容体糖質を生成する能力を有している宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体の場合、該形質転換体を培地に培養し、培養物中に蓄積したフコース含有糖質の生成量を、親株のそれと比較することにより確認できる。
５．本発明のフコース含有糖質の製造法
　本発明のフコース含有糖質の製造法としては、上記４の形質転換体を培地に培養して培養物中にフコース含有糖質を生成せることを含む、発酵法によるフコース含有糖質の製造法が挙げられる。
　発酵法によるフコース含有糖質の製造法に用いる、本発明の形質転換体としては、糖からＧＤＰ－フコースを生成する能力を有する形質転換体であることが好ましい。
　また、発酵によるフコース含有糖質の製造法に用いる本発明の形質転換体として、受容体糖質を生成する能力を有する形質転換体を用いてもよい。
　上記４の形質転換体を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が挙げられる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。フコース含有糖質の前駆体としてラクトース等の受容体糖質を、また、ＧＤＰ－フコースの前駆体としてＧＴＰやマンノース等を培地に添加してもよい。
　発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がＧＤＰ－フコースを生成する能力を有していない場合には、培養中に、ＧＤＰ－フコースを培地に添加する。また、発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がＧＤＰ－フコースを生成する能力を有していない場合には、培養中に、ＧＤＰ－フコースを培地に添加する代わりに、糖からＧＤＰ－フコースを生成する能力を有する微生物を、本発明の形質転換体と同時に培養することにより、本発明の形質転換体にＧＤＰ－フコースを供給してもよい。
　また、ＧＤＰ－フコースの前駆体であるＧＴＰを供給または増強するために、ＧＴＰを生産する能力を有する微生物を同時に培養してもよい。ＧＴＰを生産する能力を有する微生物としては、例えば、各種遺伝子操作によりＧＴＰの生合成経路に関与する酵素の発現が増強された微生物（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ，　Ｓｅｐ３：２０１９，２４１２－２４１７）等、公知の微生物が挙げられる。
　発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有していない場合には、培養中に、ラクトース等の受容体糖質を培地に添加する。
　また、発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有していない場合には、培養中に、ラクトース等の受容体糖質を培地に添加する代わりに、糖からラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有する微生物を、本発明の形質転換体と同時に培養することにより、本発明の形質転換体にラクトース等の受容体糖質を供給してもよい。
　培養は、通常、振盪培養又は深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常１５～４０℃であり、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常３．０～９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
［分析例］
　実施例において、３－フコシルラクトースの分析、定量は以下に示す手順で行った。培養後の微生物を含む培養液を遠心分離し、上清を回収した。該上清に含まれる３－フコシルラクトースを糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ　ＰＡ１
カラム温度：２５℃
移動相：（移動相Ａ）水
       （移動相Ｂ）５００ｍｍｏｌ／Ｌ　水酸化ナトリウム
       （移動相Ｃ）３００ｍｍｏｌ／Ｌ　酢酸ナトリウム
移動相Ａ、移動相Ｂ及び移動相Ｃ混合比:
      （０～１０分）８０：２０：０
      （１０～１５分）８０：２０：０から７０：２０：１０の勾配
      （１５～１７分）７０：２０：１０から０：２０：８０の勾配
      （１７～２５分）０：２０：８０
      （２５～３５分）８０：２０：０
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
　以下に発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］３－フコシルラクトースの製造に用いる微生物の造成
（１）遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
　表１の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス・サチルス）　１６８株のゲノムＤＮＡは定法により調製した。増幅ＤＮＡ断片のｃａｔは、ｐＨＳＧ３９６上のｃａｔ遺伝子の上流約２００ｂｐから下流約５０ｂｐを含む。増幅ＤＮＡ断片のｓａｃＢは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株のゲノムＤＮＡ上のｓａｃＢ遺伝子の上流約３００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。
　次に、増幅ＤＮＡ断片のｃａｔおよびｓａｃＢを鋳型とし、配列番号８および１１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ（以下、ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
（２）β－ガラクトシダーゼ活性、ラクトースパーミアーゼ活性及びコラン酸生成活性が喪失した大腸菌の造成
　β－ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＺ遺伝子という。）、ラクトースパーミアーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＹ遺伝子という。）、及びコラン酸生成関連蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ又はｗｃａＭ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。なお、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ（以下、ｌａｃＺＹという。）、ならびに、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ及びｗｃａＭ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）は大腸菌ゲノム上でそれぞれオペロンを形成している。
　常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｌａｃＺ上流１およびｌａｃＺ上流２は、ｌａｃＺ遺伝子の開始コドンから開始コドンの上流約１０００ｂｐの領域を含む。ｌａｃＹ下流１およびｌａｃＹ下流２は、ｌａｃＹ遺伝子の終止コドン下流約５０ｂｐから約１０００ｂｐを含む。
　ｌａｃＺ上流１、ｌａｃＹ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１３および１５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｌａｃＺ上流２およびｌａｃＹ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１３および１５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺ及びｌａｃＹを含まず、ｌａｃＺ上流とｌａｃＹ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｌａｃＺＹという。）断片を得た。
　ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，６６４０－６６４５（２０００）］を保持するＷ３１１０株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体 （ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子がｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｌａｃＺＹ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｌａｃＺＹに置換した形質転換体）を得た。それらのうちからさらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷ３１１０ΔｌａｃＺＹと命名した。
　同様に、Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表３の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ｗｃａＪ上流１およびｗｃａＪ上流２は、ｗｃａＪ遺伝子の開始コドンから開始コドンの上流約１０００ｂｐの領域を含む。ｗｃａＭ下流１およびｗｃａＭ下流２は、ｗｃａＭ遺伝子の終止コドンから終止コドンの下流約１０００ｂｐまでの領域を含む。
　ｗｃａＪ上流１、ｗｃａＭ下流１およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１９および２１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭオペロン周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｗｃａＪ上流２およびｗｃａＭ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１９および２１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭを含まず、ｗｃａＪ上流とｗｃａＭ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）断片を得た。
　ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、上記で造成したＷ３１１０ΔｌａｃＺＹ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭがｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｗｃａＪＭ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭに置換した形質転換体）を得た。さらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＴ１６６と命名した。
（３）α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する微生物の造成
　表４の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表４の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ（バクテロイデス・レティキュロターマイティス）　ＪＣＭ１０５１２株のゲノムＤＮＡは常法により調製した。配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ２５２８５株由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の部分配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡである。また、配列番号２５及び２６、配列番号２８及び２９、配列番号３０及び３１、配列番号２７及び３２で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　まず、ｃＢｒＦｕｃＴ上流、ｃＢｒＦｕｃＴ中流、及びｃＢｒＦｕｃＴ下流の３断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２６および２７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、ｃＢｒＦｕｃＴ断片という。）断片を得た。
　ｒｃｓＡ、ｃＢｒＦｕｃＴ、及びｌａｃＹ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３４及び３５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、ｒｃｓＡ－ｃＢｒＦｕｃＴ－ｌａｃＹという。）断片を得た。
　配列番号３６及び３７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）を鋳型にＰＣＲを行い、約４．４ｋｂのベクター断片を得た。このとき、配列番号３４及び３７、配列番号３５及び３６で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたｒｃｓＡ－ｃＢｒＦｕｃＴ－ｌａｃＹ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ発現プラスミドを得た。
　上記、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ発現プラスミドを用いて、上記（２）で造成したＴ１６６株を形質転換することで、α１，３－フコシルトランスフェラーゼを発現する微生物を造成し、ＦｕｃＴ株と命名した。
（４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来のトランスポーター遺伝子の発現が増強した微生物の造成
　ｕｓｐＡプロモーター下にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来のドラッグ：Ｈ＋アンチポーター－１ファミリーに属するトランスポーター遺伝子（ｙｄｅＡ）を配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
　発現ベクターｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）を鋳型として、配列番号３８及び３９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｐＳＴＶ２９ベクター断片を得た。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ９６３７株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４０及び４１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｕｓｐＡプロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号３８及び４１、配列番号３９及び４０で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　得られたｕｓｐＡプロモーターを含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｐＳＴＶ２９ベクター断片に連結することにより、発現ベクターｐＳＴＶを得た。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４３及び４４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ＹｄｅＡ蛋白質（配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号４１及び４３、配列番号４２及び４４で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたＹｄｅＡをコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｐＳＴＶベクター断片に連結することにより、発現ベクターｐＳＴＶ＿ＹｄｅＡを得た。
　続いて、ｌａｃプロモーター下にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来のドラッグ：Ｈ＋アンチポーター－１ファミリーに属するトランスポーター遺伝子（ｍｄｆＡ）を配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
　発現ベクターｐＭＷ１１８（ニッポンジーン社製）を鋳型として、配列番号４５及び４６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｐＭＷ１１８ベクター断片を得た。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４７及び４８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ＭｄｆＡ蛋白質（配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号４５及び４８、配列番号４６及び４７で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　得られたＭｄｆＡをコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｐＭＷ１１８ベクター断片に連結することにより、発現ベクターｐＭＷ１１８＿ＭｄｆＡを得た。
　発現ベクターｐＳＴＶ、ｐＭＷ１１８、並びに、上記で得られた発現プラスミドｐＳＴＶ＿ＹｄｅＡ及びｐＭＷ１１８＿ＭｄｆＡを用いて、実施例１（３）で造成したＦｕｃＴ株を形質転換し、ＦｕｃＴ／ｐＳＴＶ株、ＦｕｃＴ／ｐＭＷ１１８株、ＦｕｃＴ／ｐＳＴＶ＿ＹｄｅＡ株及びＦｕｃＴ／ｐＭＷ１１８＿ＭｄｆＡ株を得た。
［実施例２］トランスポーターを強発現する微生物を用いた発酵法による３－フコシルラクトースの製造
　実施例１で得られたＦｕｃＴ／ｐＳＴＶ株、ＦｕｃＴ／ｐＭＷ１１８、ＦｕｃＴ／ｐＳＴＶ＿ＹｄｅＡ株及びＦｕｃＴ／ｐＭＷ１１８＿ＭｄｆＡ株を、ＬＢプレート上で３０℃にて２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（ｐＳＴＶ２９由来プラスミド発現株）または１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（ｐＭＷ１１８由来プラスミド発現株）を含むＬＢ培地４ｍＬが入った大型試験管に植菌して３０℃で１８時間、振盪培養した。
　その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（ｐＳＴＶ２９由来プラスミド発現株）または１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（ｐＭＷ１１８由来プラスミド発現株）を含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、ラクトース一水和物１０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブした）（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が４ｍＬ入った大型試験管に０．２ｍＬ植菌し、３０℃で２８時間振盪培養した。ＦｕｃＴ／ｐＭＷ１１８株及びＦｕｃＴ／ｐＭＷ１１８＿ＭｄｆＡ株は、培養開始５時間後にＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加した。
　培養終了後、培養液を適宜希釈後に遠心分離し、上清に含まれる３－フコシルラクトースを糖分析装置ＩＣＳ－５０００にて分析した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、ＦｕｃＴ／ｐＳＴＶ株及びＦｕｃＴ／ｐＭＷ１１８株に比べ、ＦｕｃＴ／ｐＳＴＶ＿ＹｄｅＡ株及びＦｕｃＴ／ｐＭＷ１１８＿ＭｄｆＡ株、は、顕著に高い３－フコシルラクトース生産性を示した。
　従って、ドラッグ：Ｈ＋アンチポーター－１ファミリーに属するＹｄｅＡまたはＭｄｆＡを強発現させることで、３－フコシルラクトースの生産性が向上することが分かった。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２１年２月８日付けで出願された日本特許出願（特願２０２１－０１８４８４）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
配列番号１：Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０由来ｙｄｅＡの塩基配列
配列番号２：Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０由来ＹｄｅＡのアミノ酸配列
配列番号３：Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０由来ｍｄｆＡの塩基配列
配列番号４：Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０由来ＭｄｆＡのアミノ酸配列
配列番号５：キメラ型ＦｕｃＴの塩基配列
配列番号６：キメラ型ＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号７：コドン最適化型ＢｆＦｕｃＴの部分配列
配列番号８、９：ｃａｔ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１０、１１：ｓａｃＢ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１２、１３：ｌａｃＺ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１４、１５：ｌａｃＹ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１６：ｌａｃＺ上流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１７：ｌａｃＹ下流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１８、１９：ｗｃａＪ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２０、２１：ｗｃａＭ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２２：ｗｃａＪ上流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２３：ｗｃａＭ下流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２４、２５：ｒｃｓＡ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２６、２８：ｃＢｒＦｕｃＴ上流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２７、３１：ｃＢｒＦｕｃＴ下流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２９、３０：ｃＢｒＦｕｃＴ中流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３２、３３：ｌａｃＹ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３４、３５：ｒｃｓＡ－ｃＢｒＦｕｃＴ－ｌａｃＹ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３６、３７：ｐＰＥ１６７増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３８、３９：ｐＳＴＶ２９増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４０、４１：ＰｕｓｐＡ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４２：ｐＳＴＶ－ＰｕｓｐＡ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４３、４４：ｙｄｅＡ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４５、４６：ｐＭＷ１１８増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４７、４８：ｍｄｆＡ増幅用プライマーの塩基配列

Claims (10)

  1. 　下記［１］～［３］のいずれか１の蛋白質。
    ［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
    ［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する変異蛋白質。
    ［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつフコース含有糖質の輸送活性を有する相同蛋白質。
  2. 　前記フコース含有糖質がオリゴ糖である、請求項１に記載の蛋白質。
  3. 　配列番号１又は３で表される塩基配列又はその相同配列を含み、かつ請求項１または２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
  4. 　請求項３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
  5. 　請求項４に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  6. 　請求項１に記載の［１］～［３］のいずれか１の蛋白質の活性及び前記フコース含有糖質の生産性が増強された微生物である、請求項５に記載の形質転換体。
  7. 　前記微生物が前記フコース含有糖質の生産能を有する大腸菌である、請求項６に記載の形質転換体。
  8. 　請求項５～７のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養して培養物中に前記フコース含有糖質を生成させることを含む、フコース含有糖質の製造法。
  9. 　前記フコース含有糖質がオリゴ糖である、請求項８に記載の製造法。
  10. 　前記オリゴ糖が３－フコシルラクトースである、請求項９に記載の製造法。
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