DE69839401T2

DE69839401T2 - Dcr3 polypeptid, ein tnfr homolog

Info

Publication number: DE69839401T2
Application number: DE69839401T
Authority: DE
Inventors: Avi J. San Mateo Ashkenazi; David Belmont Botstein; Kelly H. San Mateo DODGE; Austin L. Belmont Gurney; Kyung Jin Los Altos KIM; David A. San Francisco LAWRENCE; Robert El Cerrito PITTI; Margaret A. San Francisco ROY; Daniel B. Orinda TUMAS; William I. Hillsborough Wood; Audrey San Francisco Goddard
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-09-18
Filing date: 1998-09-18
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2018-09-19
Also published as: JP2009159970A; PT1015587E; IL134578A0; ES2306480T3; US6764679B2; CY1108175T1; US20040014176A1; IL193919A0; CA2303225A1; EP1015587B1; US20040175791A1; DK1015587T3; EP1015587A1; CA2303225C; JP5153679B2; AU2003252913A1; JP2001516581A; US20020065210A1; AU9497098A; JP4303883B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Identifikation und Isolierung eines Polypeptids, hierin „DcR3" genannt, Anti-DcR3-Antikörper und ihre Verwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verschiedene Moleküle, wie z. B. der Tumornekrose-Faktor α („TNF-α"), der Tumornekrose-Faktor β („TNF-β” oder „Lymphotoxin"), CD30-Ligand, CD27-Ligand, CD40-Ligand, OX-40-Ligand, 4-1BB-Ligand, Fas-Ligand (auch als Apo-1-Ligand oder CD95-Ligand bezeichnet) und Apo-2-Ligand (auch als TRAIL bezeichnet), wurden als Mitglieder der Tumornekrose-Faktor-(„„TNF"-)Familie der Zytokine identifiziert [siehe z. B. Gruss und Dower, Blood 85, 3378–3404 (1995); Wiley et al., Immunity 3, 673–682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem. 271, 12687–12690 (1996)]. Unter diesen Molekülen wurde von TNF-α, TNF-β, CD30-Ligand, 4-1BB-Ligand, Fas-Ligand und Apo-2-Ligand (TRAIL) berichtet, dass sie in apoptotischen Zelltod involviert sind. Sowohl von TNF-α als auch von TNF-β wurde berichtet, dass sie apoptotischen Tod in anfälligen Tumorzellen induzieren [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol. 17, 689 (1987)]. Zheng et al. berichteten, dass TNF-α in die Post-Stimulations-Apoptose CD8-positiver T-Zellen involviert ist [Zheng et al., Nature 377, 348–351 (1995)]. Andere Forscher berichteten, dass der CD30-Ligand in die Deletion selbstreaktiver T-Zellen im Thymus involviert sein könnte [Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laborstory Symposium an Programmed Cell Death, Abstr. Nr. 10 (1995)].
Der Fas-Ligand scheint hauptsächlich drei Typen von Apoptose zu regulieren: (a) den aktivierungsinduzierten Zelltod (AICD) reifer T-Lymphozyten; (b) die Eliminierung von Entzündungszellen von immunprivilegierten Stellen; und (c) das Abtöten beschädigter Zellen durch zytotoxische Lymphozyten [Nagata, Cell 88, 355 (1997)]. Es wurde berichtet, dass der T-Zellen-AICD zur Ausschaltung der Immunantwort des Wirts beiträgt, sobald eine Infektion eliminiert wurde. Eine wiederholte Stimulation des T-Zellen-Rezeptors (TCR) durch Antigen induzierte die Expression von Fas-Ligand und Fas auf der Oberfläche von T-Helferzellen; anschließend bindet der Fas-Ligand Fas und kann in den aktivierten Lymphozyten Apoptose auslösen, was zu ihrer Eliminierung führt. Immunprivilegierte Stellen umfassen Gewebe, wie z. B. Auge, Gehirn oder Hoden, in denen entzündliche Immunantworten die Funktion stören können. Zellen an immunprivilegierten Stellen scheinen den Fas-Liganden konstitutiv zu exprimieren und infiltrierende Leukozyten, die Fas exprimieren, durch Fas-abhängige Apoptose zu eliminieren. Gewisse Krebsarten, unter anderem Melanome [Hahne et al., Science 274, 1363 (1996)] und hepatozelluläre Karzinome [Strand et al., Nature Med. 2, 1361–1366 (1996)], verwenden einen ähnlichen Fas-Ligand-abhängigen Mechanismus, um die Immunüberwachung zu umgehen. Von natürlichen Killer-(NK-)Zellen und zytotoxischen T-Lymphozyten wurde berichtet, dass sie Zellen, die durch virale oder bakterielle Infektion oder durch onkogene Transformation geschädigt wurden, durch zumindest zwei Wege eliminieren. Ein Weg umfasst die Freisetzung von Perforin und Granzymen, und ein Alternativweg umfasst die Expression von Fas-Ligand und die Induktion von Apoptose durch die Bindung von Fas an Target-Zellen [Nagata, s. o.; Moretta, Cell 90, 13 (1997)].
Mutationen im Maus-Fas/Apo-1-Rezeptor oder in Ligand-Genen (genannt Ipr bzw. gld) wurden mit manchen Autoimmunerkrankungen assoziiert, was darauf hindeutet, dass der Fas-Ligand eine Rolle in der Regulierung der klonalen Deletion selbstreaktiver Lymphozyten in der Peripherie spielen kann [Krammer et al., Curr. Op. Immunol. 6, 279–289 (1994); Nagata et al., Science 267, 1449–1456 (1995)]. Von Fas-Ligand wird auch berichtet, dass er Post-Stimulations-Apoptose in CD4-positiven T-Lymphozyten und in B-Lymphozyten induziert, und er kann in die Elimination aktivierter Lymphozyten involviert sein, wenn ihre Funktion nicht mehr gebraucht wird [Krammer et al., s. o.; Nagata et al., s. o.]. Von monoklonalen Agonisten-Maus-Antikörpern, die spezifisch an den Fas-Rezeptor binden, wurde berichtet, dass sie eine zellabtötende Aktivität aufweisen, die mit jener von TNF-α vergleichbar ist oder dieser ähnelt [Yonehara et al., J. Exp. Med. 169, 1747–1756 (1989)].
Von der Induktion verschiedener zellulärer Antworten, die durch solche TNF-Familien-Zytokine vermittelt werden, wird angenommen, dass sie durch ihre Bindung an spezifische Zellrezeptoren initiiert wird. Zwei verschiedene TNF-Rezeptoren mit etwa 55 kDa (TNFR1) und 75 kDa (TNFR2) wurden identifiziert [Hohman et al., J. Biol. Chem. 264, 14927–14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 3127–3131 (1990); EP 417.563 , veröffentlicht am 20. März 1991], und menschliche und Maus-cDNAs, die beiden Rezeptor-Typen entsprechen, wurden isoliert und charakterisiert [Loetscher et al., Cell 61, 351 (1990); Schall et al., Cell 61, 361 (1990); Smith et al., Science 248, 1019–1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 2830–2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol. 11, 3020–3026 (1991)]. Extensive Polymorphismen wurden mit beiden TNF-Rezeptor-Genen assoziiert [siehe z. B. Takao et al., Immunogenetics 37, 199–203 (1993)]. Beide TNFRs haben die typische Struktur von Zelloberflächenrezeptoren gemeinsam, umfassend extrazelluläre, Transmembran- und intrazelluläre Regionen. Die extrazellulären Abschnitte beider Rezeptoren sind auch natürlich als lösliche TNF-Bindungsproteine zu finden [Y. Nophar et al., EMBO J. 9, 3269 (1990); und T. Kohno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331 (1990)]. Vor noch kürzerer Zeit wurde von Hale et al. [J. Cell. Biochem. Ergänzungsband 15F, 113 (P424) (1991)] über die Klonierung rekombinanter löslicher TNF-Rezeptoren berichtet.
Der extrazelluläre Abschnitt von Typ-1- und Typ-2-TNFRs (TNFR1 und TNFR2) enthält ein repetitives Aminosäuresequenzmuster aus vier cysteinreichen Domänen (CRDs), genannt 1 bis 4, beginnend am NH₂-Terminus. Jede CRD ist etwa 40 Aminosäuren lang und enthält 4 bis 6 Cysteinreste an Positionen, die gut konserviert sind [Schall et al., s. o.; Loetscher et al., s. o.; Smith et al.; Nophar et al., s. o.; Kohno et al., s. o.]. Bei TNFR1 sind die ungefähren Grenzen der vier CRDs Folgende: CRD1-Aminosäuren 14 bis etwa 53; CRD2-Aminosäuren von etwa 54 bis etwa 97; CRD3-Aminosäuren von etwa 98 bis etwa 138; CRD4-Aminosäuren von etwa 139 bis etwa 167. Bei TNFR2 umfasst CRD1 die Aminosäuren 17 bis etwa 54; CRD2- die Aminosäuren von etwa 55 bis etwa 97; CRD3- die Aminosäuren von etwa 98 bis etwa 140; und CRD4- die Aminosäuren von etwa 141 bis etwa 179 [Banner et al., Cell 73, 431–435 (1993)]. Die potentielle Rolle der CRDs in der Liganden-Bindung wird auch von Banner et al., s. o., beschrieben.
Ein ähnlich repetitives Muster an CRDs existiert in mehreren anderen Zelloberflächenproteinen, unter anderem im p75-Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor (NGFR) [Johnson et al., Cell 47, 545 (1986); Radeke et al., Nature 325, 593 (1987)], im B-Zellen-Antigen CD40 [Stamenkovic et al., EMBO J. 8, 1403 (1989)], im T-Zellen-Antigen OX40 [Mallet et al., EMBO J. 9, 1063 (1990)] und im Fas-Antigen [Yonehara et al., s. o., und Itoh et al., Cell 66, 233–243 (1991)]. CRDs sind auch in den löslichen TNFR-(sTNFR-)artigen T2-Proteinen der Shope- und Myxoma-Pockenviren zu finden [Upton et al., Virology 160, 20–29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 335 (1991); Upton et al., Virology 184, 370, 370 (1991)]. Eine optimale Anordnung dieser Sequenzen zeigt, dass die Positionen der Cysteinreste gut konserviert sind. Diese Rezeptoren werden manchmal kollektiv als Mitglieder der TNF/NGF-Rezeptor-Überfamilie bezeichnet. Vor kurzem durchgeführte Studien über p75NGFR zeigten, dass die Deletion von CRD1 [A. A. Welcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 159–163 (1991)] oder eine 5-Aminosäure-Insertion in dieser Domäne [H. Yan und M. V. Chao, J. Biol. Chem. 266, 12099–12104 (1991)] eine geringe oder gar keine Wirkung auf die NGF-Bindung aufwies [H. Yan und M. V. Chao et al., s. o.]. p75-NGFR enthält einen prolinreichen Abschnitt von etwa 60 Aminosäuren zwischen seiner CRD4- und der Transmembranregion, die nicht in die NGF-Bindung involviert ist [C. Peetre et al., Eur. J. Hematol. 41, 414–419 (1988); P. Seckinger et al., J. Biol. Chem. 264, 11966–11973 (1989); H. Yan und M. V. Chao, s. o.]. Eine ähnliche prolinreiche Region ist in TNFR2 zu finden, jedoch nicht in TNFR1.
Itoh et al. offenbaren die Tatsache, dass der Fas-Rezeptor einen apoptotischen Zelltod ähnlich jenem, der vom 55-kDa-TNFR1 signalisiert wird, signalisieren kann [Itoh et al., s. o.]. Die Expression des Fas-Antigens wurde auch zusammen mit jener vom TNFR1 als herabreguliert beschrieben, wenn Zellen entweder mit TNF-α oder mit monoklonalem Anti-Fas-Maus-Antikörper behandelt werden [Krammer et al., s. o.; Nagata et al., s. o.]. Dementsprechend haben manche Forscher die Hypothese aufgestellt, dass Zelllinien, die sowohl Fas- als auch TNFR1-Rezeptoren co-expri mieren, das Abtöten der Zellen durch häufig anzutreffende Signalwege vermitteln könnten [Id.].
Die bis heute identifizierten TNF-Familien-Liganden, abgesehen von der Ausnahme von Lymphotoxin a, sind Typ-II-Transmembranproteine, deren C-Terminus extrazellulär ist. Im Gegensatz dazu sind die meisten Rezeptoren in der TNF-Rezeptor(TNFR-)Familie, die bis heute identifiziert wurden, Typ-I-Transmembran-Proteine. Sowohl in den TNF-Liganden- als auch in den -Rezeptor-Familien wurde die zwischen Familienmitgliedern identifizierte Homologie jedoch hauptsächlich in der extrazellulären Domäne („ECD") angetroffen. Mehrere der TNF-Familien-Zytokine, unter anderem TNF-α, Fas-Ligand und CD40-Ligand, werden proteolytisch auf der Zelloberfläche gespalten; das resultierende Protein bildet in jedem Fall typischerweise ein homotrimeres Molekül, das als lösliches Zytokin fungiert. TNF-Rezeptor-Familien-Proteine werden normalerweise auch proteolytisch gespalten, um lösliche Rezeptor-ECDs freizusetzen, die als Inhibitoren der zugehörigen Zytokine fungieren können.
Vor kurzem wurden andere Mitglieder der TNFR-Familie identifiziert. Solche neu identifizierten Mitglieder der TNFR-Familie umfassen CAR1, HVEM und Osteoprotegerin (OPG) [Brojatsch et al., Cell 87, 845–855 (1996); Montgomery et al., Cell 87, 427–436 (1996); Marsters et al., J. Biol. Chem. 272, 14029–14032 (1997); Simonet et al., Cell 89, 309–319 (1997)]. Im Gegensatz zu anderen bekannten TNFR-artigen Molekülen berichten Simonet et al., s. o., dass OPG keine hydrophobe transmembranumdurchdringende Sequenz enthält.
In Marsters et al., Curr. Biol. 6, 750 (1996), beschreiben die Forscher ein menschliches Nativsequenz-Polypeptid voller Länge, genannt Apo-3, das Ähnlichkeit mit der TNFR-Familie in seinen extrazellulären cysteinreichen Wiederholungen aufweist und TNFR1 und CD95 dahingehend ähnelt, dass es eine zytoplasmatische Todesdomänen-Sequenz enthält [siehe auch Marsters et al., Curr. Biol. 6, 1669 (1996)]. Apo-3 wurde von anderen Forschern auch als DR3, wsl-1 und TRAMP bezeichnet [Chin naiyan et al., Science 274, 990 (1996); Kitson et al., Nature 384, 372 (1996); Bodmer et al., Immunity 6, 79 (1997)].
Pan et al. haben ein anderes Mitglied der TNF-Rezeptor-Familie offenbart, das als „DR4" bezeichnet wird [Pan et al., Science 276, 111–113 (1997)]. Von DR4 wurde berichtet, dass es eine zytoplasmatische Todesdomäne enthält, die in der Lage ist, den Zellsuizidmechanismus zu starten. Pan et al. offenbaren, dass von DR4 angenommen wird, dass es ein Rezeptor für den als Apo-2-Ligand oder TRAIL bekannten Liganden ist.
In Sheridan et al., Science 277, 818–821 (1997), und Pan et al., Science 277, 815–818 (1997), wird ein weiteres Molekül beschrieben, von dem angenommen wird, dass es ein Rezeptor für den Apo-2-Liganden (TRAIL) ist. Dieses Molekül wird als DR5 bezeichnet (alternativ dazu wurde es auch als Apo-2 bezeichnet). Wie von DR4 wird auch von DR5 berichtet, dass es eine zytoplasmatische Todesdomäne aufweist und in der Lage ist, Apoptose zu signalisieren.
In Sheridan et al., s. o., wird ein DcR1 (oder alternativ dazu Apo-2DcR) genannter Rezeptor als potentieller Köderrezeptor für Apo-2-Ligand (TRAIL) offenbart. Sheridan et al. berichten, dass DcR1 die Apo-2-Liganden-Funktion in vitro inhibieren kann. Siehe auch Pan et al., s. o., bezüglich der Offenbarung des Köderrezeptors, der als TRID bezeichnet wird.
Für eine Beschreibung der TNF-Zytokin-Familie und ihrer Rezeptoren siehe Gruss und Dower, s. o.
Membrangebundene Proteine und Rezeptoren können eine wichtige Rolle in der Bildung, der Differenzierung und dem Erhalt multizellulärer Organismen spielen. Das Schicksal vieler einzelner Zellen, z. B. die Proliferation, die Migration, die Differenzierung oder die Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise durch Informationen gesteuert, die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umgebung erhalten werden. Diese Information wird oftmals von sekretierten Polypeptiden über tragen (z. B. von mitogenen Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxischen Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptiden und Hormonen), die wiederum von verschiedenen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen erhalten und interpretiert werden. Solche membrangebundenen Proteine und Zellrezeptoren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Zytokin-Rezeptoren, Rezeptorkinasen, Rezeptorphosphatasen, Rezeptoren, die in Zell-Zell-Wechselwirkungen involviert sind, sowie zelluläre Adhäsinmoleküle, wie z. B. Selectine und Integrine. Die Übertragung von Signalen, die Zellwachstum und -differenzierung regulieren, wird z. B. teilweise durch Phosphorylierung verschiedener zellulärer Proteine reguliert. Proteintyrosinkinasen, Enzyme, die diesen Prozess katalysieren, können auch als Wachstumsfaktorrezeptoren fungieren. Beispiele umfassen den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor und den Nerven-Wachstumsfaktor-Rezeptor.
Membrangebundene Proteine und Rezeptormoleküle besitzen verschiedene gewerbliche Anwendungsgebiete, unter anderem als pharmazeutische und Diagnose-Mittel. Rezeptor-Immunoadhäsine können z. B. als therapeutische Mittel zum Blockieren der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung verwendet werden. Die membrangebundenen Proteine können auch zum Screening potentieller Peptid- oder Kleinmolekül-Inhibitoren der relevanten Rezeptor/Liganden-Wechselwirkung verwendet werden.
Es werden sowohl von industrieller als auch von akademischer Seite Anstrengungen unternommen, um neue native Rezeptor-Proteine zu identifizieren. Viele Anstrengungen basieren auf dem Screening rekombinanter Säugetier-DNA-Bibliotheken, um die kodierenden Sequenzen neuer Rezeptor-Proteine zu identifizieren.
WO 9830694 offenbart einen TNFR-artigen Rezeptor, der identisch mit dem hierin offenbarten DcR3 ist. Darin werden dessen strukturelle Ähnlichkeiten mit TNFR und anderen TNF-Rezeptor-Familienmitgliedern gezeigt, es wird jedoch nichts bezüglich plausibler Aktivität oder biologischer Rolle offenbart.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben einen cDNA-Klon namens DNA30942 (ATCC-Hinterlegungsnr. 209254) identifiziert. Er kodiert für ein Polypeptid, das in der vorliegenden Anmeldung als „DcR3" bezeichnet wird. Die Anmelder haben herausgefunden, dass DcR3 mit Fas-Ligand wechselwirkt und dass das DcR3-Gen in gewissen Krebsarten amplifiziert wird. Die Anmelder haben ebenfalls Antikörper erhalten, die gegen DcR3 gerichtet sind und die dessen Wechselwirkung mit Fas-Ligand inhibieren, weiters haben sie ebenso gezeigt, dass das DcR3-Polypeptid als Köder benutzt werden kann, um die Wirkung von Fas-Ligand zu modulieren.
Dementsprechend stellt die Erfindung in einer ersten Ausführungsform einen isolierten Anti-DcR3-Antikörper bereit, der (a) an ein DCR3-Polypeptid bindet, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz des nativen DcR3-Polypeptids aufweist, das die Aminosäurereste 1-300 aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) umfasst; und (b) die Bindung von Fas-Ligand an das DcR3-Protein aus (a) inhibiert. Gegebenenfalls handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper. Zusammensetzungen, Fabrikate und Verwendungen zur Herstellung von Medikamenten, die diese Antikörper umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt.
In einer zweiten Ausführungsform stellt die Erfindung Hybridom-Zelllinien bereit, die solche Antikörper produzieren.
In einer dritten Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines DcR3-Polypeptids, wie oben stehend in der ersten Ausführungsform definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Inhibierung der Fas-Liganden-Aktivität bereit.
In einer vierten Ausführungsform stellt die Erfindung ein In-vitro-Verfahren zur Detektion oder Diagnose von Krebs in einem Säugetier bereit, umfassend eine Analyse von Säugetierzellen zur Amplifikation eines DcR3-Gens.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz eines Nativsequenz-DcR3.
2 zeigt die Nucleotidsequenz einer Nativsequenz-DcR3-cDNA.
3 zeigt eine EST-Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 3).
4 zeigt verschiedene ESTs (Seq.-ID Nr. 3–10), die in der Anordnung der Konsensussequenz verwendet werden.
5 zeigt eine Anordnung von DcR3 und menschlichem TNFR2 (hTNFR2). Vier cysteinreiche Domänen (CRD) werden als CRD1, CRD2, CRD3 und CRD4 gezeigt.
6 zeigt eine Anordnung von DcR3 und menschlichem OPG. Vier cysteinreiche Domänen werden als CRD1, CRD2, CRD3 und CRD4 identifiziert.
7 zeigt die Expression von DcR3-mRNA in menschlichen Geweben und menschlichen Krebszellenlinien, wie mittels Northern-Blot-Hybridisierungsanalyse bestimmt.
8A zeigt Resultate einer FACS-Analyse, um die spezifische Bindung von DcR3 an Fas-Ligand zu bestimmen.
8B zeigt Resultate eines Co-Immunpräzipitationstests, um die spezifische Bindung von DcR3 an löslichen Fas-Liganden zu bestimmen.
Die 9A–C zeigen die Resultate von In-vitro-Tests, um die Inhibierung der Fas-Liganden-Aktivität durch DcR3 zu bestimmen.
10 zeigt die Resultate von Tests zur Bestimmung der Amplifikation des DcR3-Gens in verschiedenen Lungen- und Kolon-Tumoren sowie in verschiedenen Kolon-Tumorzellinien.
Die 11A–11C zeigen die Resultate von Tests zur Bestimmung der Wirkung von DcR3 auf die Induktion von Lymphozyten-Proliferation in gemischten Lymphozyten-Reaktions-(MLR-)Tests oder Co-Stimulations-Tests.
Die 12 und 13 zeigen die Antigenspezifität von gewissen DcR3-Antikörpern, die als 4C4.1.4; 5C4.14.7; 11C5.2.8; 8D3.1.5; und 4B7.1.1 bezeichnet werden.
Die 12 und 14 zeigen die Resultate eines ELISA zur Bestimmung der Blockierungsaktivität gewisser DcR3-Antikörper, die als 4C4.1.4; 5C4.14.7; 11C5.2.8; 8D3.1.5; und 4B7.1.1 bezeichnet werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Definitionen
Die Ausdrücke „DcR3-Polypeptid" und „DcR3" umfassen bei Verwendung hierin Nativsequenz-DcR3 und DcR3-Varianten (die weiters hierin definiert werden). Das DcR3 kann aus einer Reihe an Quellen isoliert werden, wie z. B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder es kann durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Ein „Nativsequenz-DcR3" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie ein DcR3, das aus der Natur stammt. Solch ein Nativsequenz-DcR3 kann aus der Natur isoliert werden oder es kann durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden. Der Ausdruck „Nativsequenz-DcR3" umfasst spezifisch natürlich auftretende trunkierte oder sekretierte Formen des DcR3 (z. B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich auftretende Variantenformen (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende Allelvarianten des DcR3. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Nativsequenz-DcR3 ein reifes Nativsequenz-DcR3 oder ein Nativsequenz-DcR3 voller Länge, umfassend die Aminosäuren 1 bis 300 aus 1 (Seqq.-ID Nr. 1). Alternativ dazu umfasst das DcR3 die Aminosäuren 1 bis 215 aus 1 (Seq.-ID Nr. 1).
„DcR3-Variante" beschreibt ein DcR3, wie unten stehend definiert, mit zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität mit dem DcR3 mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die in 1 (Seq.-ID Nr. 1) für ein menschliches Nativsequenz-DcR3 voller Länge dargestellt ist, oder den hierin identifizierten Domänensequenzen. Solche DcR3-Varianten umfassen z. B. DcR3-Polypeptide, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der Sequenz aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) oder der hierin identifizierten Domänensequenzen hinzugefügt oder deletiert sind. Normalerweise weist eine DcR3-Variante zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentitat, noch bevorzugter zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität und weiters noch bevorzugter zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität, mit der Aminosäuresequenz aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) auf.
„Prozentsatz (%) der Aminosäuresequenzidentität" hinsichtlich der hierin identifizierten DcR3-Sequenzen ist als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in der DcR3-Sequenz identisch sind, nachdem die Sequenzen angeordnet wurden und, falls notwendig, Lücken eingeführt wurden, um den maximalen Prozentsatz der Sequenzidentität zu erzielen, wobei etwaige konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität angesehen werden. Die Anordnung für Zwecke der Bestimmung des Prozentsatzes der Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erzielt werden, die nach dem Stand der Technik möglich sind, z. B. unter Verwendung einer öffentlich erhältlichen Computer-Software, wie z. B. der BLAST-, ALIGN- oder Megalign-(DNASTAR-)Software. Der Fachmann kann geeignete Parameter zur Messung der Anordnung bestimmen, unter anderem etwaige Algorithmen, die benötigt werden, um eine maximale Anordnung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erzielen.
„Prozentsatz (%) der Nucleinsäuresequenzidentität" hinsichtlich der hierin identifizierten DcR3-Sequenzen ist als der Prozentsatz an Nucleotiden in einer Kandidatense quenz definiert, die mit den Nucleotiden in der DcR3-Sequenz identisch sind, nachdem die Sequenzen angeordnet wurden und, falls notwendig, Lücken eingeführt wurden, um den maximalen Prozentsatz der Sequenzidentität zu erzielen. Die Anordnung für Zwecke der Bestimmung des Prozentsatzes der Nucleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erzielt werden, die nach dem Stand der Technik möglich sind, z. B. unter Verwendung einer öffentlich erhältlichen Computer-Software, wie z. B. der BLAST-, ALIGN- oder Megalign-(DNASTAR-)Software. Der Fachmann kann geeignete Parameter zur Messung der Anordnung bestimmen, unter anderem etwaige Algorithmen, die benötigt werden, um eine maximale Anordnung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erzielen.
Der Ausdruck „epitopmarkiert" bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein chimäres Polypeptid, das DcR3 umfasst, oder auf eine Domänensequenz davon, fusioniert an ein „Markierungspolypeptid". Das Markierungspolypeptid besitzt genügend Reste, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, trotzdem ist es kurz genug, so dass es die Aktivität des DcR3 nicht stört. Das Markierungspolypeptid ist vorzugsweise auch relativ einzigartig, so dass der Antikörper keine wesentliche Kreuzreaktion mit anderen Epitopen eingeht. Geeignete Markierungspolypeptide besitzen allgemein zumindest sechs Aminosäurereste und normalerweise zwischen etwa 8 und etwa 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 20 Reste).
„Isoliert" beschreibt bei Verwendung zur Beschreibung der verschiedenen hierin offenbarten Polypeptide Polypeptide, die identifiziert und aus einer Komponente ihrer natürlichen Umgebung getrennt und/oder gewonnen wurden. Kontaminierende Komponenten ihrer natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen des Polypeptids stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid gereinigt, und zwar (1) durch die Verwendung eines Spinning-Cup-Sequenzierungsgeräts bis zu einem Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste des N-Terminus oder der internen Aminosäuresequenz zu erhalten, oder (2) mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau- oder vorzugsweise Silberfärbung bis zur Homogenität. Isoliertes Polypeptid umfasst Polypeptid in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen DcR3-Umgebung nicht vorhanden ist. Normalerweise wird isoliertes Polypeptid jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Ein „isoliertes" DcR3-Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem kontaminierenden Nucleinsäuremolekül getrennt ist, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle der DcR3-Nucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes DcR3-Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form vor als in der Form oder dem Umfeld, in der/dem es in der Natur zu finden ist. Isolierte DcR3-Nucleinsäuremoleküle werden deswegen vom DcR3-Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen vorliegt, unterschieden. Ein isoliertes DcR3-Nucleinsäuremolekül umfasst jedoch DcR3-Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die normalerweise DcR3 dort exprimieren, wo sich z. B. das Nucleinsäuremolekül an einer chromosomalen Position befindet, die sich von jener natürlicher Zellen unterscheidet.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die sich für Prokaryoten eignen, umfassen z. B. einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, sowie eine Ribosomenbindungsstelle. Eukaryotische Zellen verwenden bekanntermaßen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer.
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in einem funktionellen Verhältnis mit einer anderen Nucleinsäuresequenz platziert wird. DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader ist z. B. operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn diese als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn dieser die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation vereinfacht wird. Allgemein bedeutet „operabel gebunden", dass die zu bindenden DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Falle eines sekretorischen Leaders, zusammenhängend und in der Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an passenden Restriktionsstellen erzielt. Falls solche Stellen nicht existieren, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -Linker in Einklang mit der herkömmlichen Praxis verwendet.
Der Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und deckt spezifisch einzelne monoklonale Anti-DcR3-Antikörper (unter anderem Agonisten-, Antagonisten- und neutralisierende oder blockierende Antikörper) und Anti-DcR3-Antikörper-Zusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität ab. Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der von einer Population im Wesentlichen homogener Antikörper erhalten wurde, d. h. die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, sind bis auf mögliche natürlich auftretende Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch.
„Aktiv" oder „Aktivität" für die hierin beschriebenen Zwecke bezieht sich auf (eine) Form(en) von DcR3, welche die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten von nativem oder natürlich auftretendem DcR3 beibehält/beibehalten.
Die Ausdrücke „Apoptose" und „apoptotische Aktivität" werden in einem umfassenden Sinn verwendet und beziehen sich auf die geordnete oder kontrollierte Form von Zelltod in Säugetieren, die typischerweise von einer oder mehreren charakteristischen Zellveränderungen begleitet wird, unter anderem von der Kondensierung von Zytoplasma, dem Verlust von Plasmamembran-Mikrovilli, der Segmentierung des Nucleus, dem Abbau chromosomaler DNA oder dem Verlust von Mitochondrienfunktion. Diese Aktivität kann z. B. durch Zelllebensfähigkeitstests, FACS-Analyse oder DNA-Elektrophorese bestimmt und gemessen werden, alles Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind.
Die Ausdrücke „Krebs" und „kanzerös" beziehen sich auf oder beschreiben den physiologischen Zustand bei Säugetieren, der typischerweise durch unreguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele von Krebsarten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Karzinome, Lymphome, Blastome, Sarkome und Leukämie. Noch spezifischere Beispiele solcher Krebsarten umfassen das Plattenepithelkarzinom, das kleinzellige Bronchialkarzinom, das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom, Blastome, Gastrointestinalkarzinome, Nierenkarzinome, Pankreas-Karzinome, Glioblastome, Neuroblastome, Zervix-Karzinome, Eierstock-Karzinome, Leber-Karzinome, Magen-Karzinome, Blasen-Karzinome, Hepatome, Brustkarzinome, Kolon-Karzinome, Kolorektalkarzinome, Endometrium-Karzinome, Speicheldrüsen-Karzinome, Nieren-Karzinome, Prostata-Karzinome, Vulva-Karzinome, Schilddrüsen-Karzinome, hepatische Karzinome sowie verschiedene Arten von Kopf- und Hals-Karzinomen.
Die Ausdrücke „behandeln", „Behandlung" und „Therapie" beziehen sich bei Verwendung hierin auf eine heilende Therapie, eine prophylaktische Therapie und eine präventive Therapie.
Der Ausdruck „Säugetier" bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein beliebiges Säugetier, das als Säugetier klassifiziert ist, unter anderem auf Menschen, Kühe, Pferde, Hunde und Katzen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Säugetier um einen Menschen.
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
Hierin werden isolierte Nucleotidsequenzen offenbart, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als DcR3 bezeichnet werden. Die Anmelder haben insbesondere cDNA identifiziert und isoliert, die für ein DcR3-Polypeptid kodiert, wie ausführlicher in den unten stehenden Beispielen offenbart wird. Unter Verwendung von BLAST- und FastA-Sequenzanordnungs-Computerprogrammen haben die Anmelder herausgefunden, dass ein Nativsequenz-DcR3 voller Länge (dargestellt in 1 und Seq.-ID Nr. 1) etwa 28% Aminosäuresequenzidentität mit menschlichem TNFR2 aufweist. Dementsprechend wird momentan angenommen, dass DcR3, das in der vorliegenden Erfindung offenbart wird, wahrscheinlich ein neu identifiziertes Mitglied der TNFR-Familie ist und Aktivitäten oder Eigenschaften besitzen könnte, die für die TNFR-Proteinfamilie typisch sind. Wie OPG, ein weiteres TNFR-Familienmitglied [Simonet et al., s. o.], scheint dem DcR3-Molekül nach aktuellem Wissensstand eine Transmembranregion zu fehlen, und es kann ein sekretiertes Polypeptid sein.
Es wird momentan angenommen, dass DcR3 ein löslicher Köderrezeptor sein könnte, der zur Fas-Liganden-Bindung und/oder zur Inhibierung der Fas-Liganden-Aktivität in der Lage ist, umfassend die Inhibierung der Apoptoseinduktion durch Fas-Liganden. Wie in den unten stehenden Beispielen gezeigt wird, ergaben Genamplifikations-Experimente, dass das DcR3-Gen in einer beträchtlichen Anzahl an primären Lungen- und Kolon-Krebsarten amplifiziert wird, was darauf hindeutet, dass gewisse Krebsarten dem immunzytotoxischen Angriff durch Expression eines Köderrezeptors, wie z. B. DcR3, der Fas-Ligand-induzierte Apoptose blockiert, entkommen können. Die Beispiele zeigen auch, dass DcR3 zu immuninhibierender Aktivität in der Lage ist, was z. B. auf dessen Verwendung in der Behandlung T-Zellen-vermittelter Erkrankungen hinweist. Antikörper gegen DcR3 können verwendet werden, um DcR3-produzierende Krebsarten für immunzytotoxische Angriffe empfindlich zu machen und um die Proliferation tumorreaktiver Lymphozyten zu verstärken.
B. Modifikationen von DcR3
Das hierin offenbarte DcR3-Polypeptid kann kovalent modifiziert werden. Eine Art der kovalenten Modifikation umfasst das Umsetzen von Aminosäureresten des DcR3, auf die abgezielt wird, mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des DcR3 zu reagieren. Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist z. B. zur Vernetzung von DcR3 an eine wasserunlösliche Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-DcR3-Antikörpern und umgekehrt von Nutzen. Häufig verwendete Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl-)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, unter anderem Disuccinimidylester, wie z. B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide, wie z. B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan, sowie Mittel, wie etwa Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen die Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginyl-Resten zum entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartyl-Rest, die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonyl-Resten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., 79–86, San Francisco (1983)], die Acetylierung des N-terminalen Amins und die Amidierung etwaiger C-terminaler Carboxylgruppen.
Eine andere Art der kovalenten Modifikation des DcR3-Polypeptids, die im Schutzumfang dieser Erfindung inkludiert ist, umfasst das Verändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Das „Verändern des nativen Glykosylierungsmusters" soll für die hierin beschriebenen Zwecke das Deletieren einer oder mehrerer Kohlenhydratgruppierungen beschreiben, die in Nativsequenz-DcR3 zu finden ist/sind, und/oder die Addition einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die nicht im Nativsequenz-DcR3 vorhanden ist/sind.
Die Addition von Glykosylierungsstellen zum DcR3-Polypeptid kann durch Verändern der Aminosäuresequenz erzielt werden. Die Veränderung kann z. B. durch die Addition von oder die Substitution durch einem/einen oder mehreren/mehrere Serin- oder Threonin-Reste(n) zum Nativsequenz-DcR3 erfolgen (für O-gebundene Glykosylierungsstellen). Die DcR3-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Veränderungen auf der DNA-Ebene verändert werden, insbesondere durch Mutieren der DNA, die für das DcR3-Polypeptid kodiert, an vorausgewählten Basen, so dass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatieren.
Ein anderer Weg zur Erhöhung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen auf dem DcR3-Polypeptid ist durch chemische oder enzymatische Kopplung von Glycosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden nach dem Stand der Technik z. B. in WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
Die Entfernung von Kohlenhydratgruppierungen, die auf dem DcR3-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitution von Codons erzielt werden, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für die Glykosylierung dienen. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind nach dem Stand der Technik bekannt und werden z. B. von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen auf Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Reihe von Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben.
Eine andere Art einer kovalenten Modifikation von DcR3 umfasst die Bindung des DcR3-Polypeptids an eines einer Reihe nicht-proteinartiger Polymere, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, und zwar auf die im US-Patent Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 beschriebene Art und Weise.
Das DcR3 der vorliegenden Erfindung kann auch auf eine Art und Weise modifiziert werden, um ein chimäres Molekül zu bilden, das DcR3 umfasst, das an eine andere heterologe Polypeptid- oder Aminosäuresequenz fusioniert ist. In einer Ausführungsform umfasst solch ein chimäres Molekül eine Fusion des DcR3 mit einem Markierungspolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Markierungsantikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung ist allgemein am Amino- oder Carboxyl-Terminus des DcR3 platziert. Die Gegenwart solcher epitopmarkierter Formen des DcR3 kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungspolypeptid detektiert werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung. ermöglicht mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Markierungsantikörpers oder einer anderen Art an Affinitätsmatrix, die an die Epitopmarkierung bindet, auch eine leichte Reinigung des DcR3. In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Fusion des DcR3 mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Das chimäre Molekül kann insbesondere eine ECD von DcR3 umfassen, welche die Aminosäuren 1 bis 215 aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) umfasst, die an ein IgG-Molekül fusioniert sind. Für eine zweiwertige Form des chimären Moleküls könnte solch eine Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen.
Verschiedene Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin-(poly-his-gly-)Markierungen; das Grippe-HA-Markierungspolypeptid und dessen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dagegen [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)]; sowie die Herpes-simplex-Virus-Glykoprotein-D-(-gD-)Markierung und dessen Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547–553 (1990)]. Andere Markierungspolypeptide umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)]; das KT3-Epitop-Peptid [Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)]; ein α-Tubulin-Epitop-Peptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)]; sowie die T7-Gen-10-Protein-Peptid-Markierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)].
C. Herstellung von DcR3
Die unten stehende Beschreibung lehrt die Produktion von DcR3 durch Züchten von Zellen, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert wurden, der DcR3-Nucleinsäure enthält. Es wird natürlich in Betracht gezogen, dass Alternativverfahren, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind, zur Herstellung von DcR3 verwendet werden können. Die DcR3-Sequenz oder Abschnitte davon können z. B. durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasen-Verfahren hergestellt werden [siehe z. B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963)]. Die In-vitro-Protein-Synthese kann unter Verwendung händischer Verfahren oder durch Automatisierung erfolgen. Die automatisierte Synthese kann z. B. unter Verwendung eines Applied-Biosystems-Peptid-Synthesegeräts (Foster City, CA) unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers erfolgen. Verschiedene Abschnitte des DcR3 können getrennt chemisch synthetisiert werden und unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das DcR3 voller Länge zu produzieren.
1. Isolierung von DNA, die für DcR3 kodiert
DNA, die für DcR3 kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, es würde die DcR3-mRNA besitzen und diese in detektierbarem Ausmaß exprimieren. Dementsprechend kann menschliche DcR3-DNA passenderweise aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wird, wie in den Beispielen beschrieben. Das für DcR3 kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder durch Oligonucleotidsynthese erhalten werden.
Bibliotheken können mit Sonden gescreent werden (z. B. Antikörper für das DcR3 oder Oligonucleotide mit zumindest etwa 20–80 Basen), die entworfen wurden, um das Gen von Interesse oder das Protein, das von diesem kodiert wird, zu identifizieren. Das Screening der cDNA- oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1989), beschrieben. Ein Alternativverfahren zur Isolierung des Gens, das für DcR3 kodiert, ist die Verwendung der PCR-Methodik [Sambrook et al., s. o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1995)].
Die unten stehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screening einer cDNA-Bibliothek. Die Oligonucleotidsequenzen, die als Sonden ausgewählt wurden, sollten ausreichend lang und ausreichend unzweideutig sein, so dass falsch-positive Resultate minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise markiert, so dass es nach der Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek detektiert werden kann. Verfahren der Markierung sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und umfassen die Verwendung von Radiomarierungen wie z. B. ³²P-markiertes ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, unter anderem moderate Stringenz und hohe Stringenz, werden in Sambrook et al., s. o., bereitgestellt.
Sequenzen, die in solchen Bibliotheksscreeningverfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten hinterlegten und in öffentlichen Datenbanken, wie z. B. GenBank, oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegten Sequenzen verglichen und angeordnet werden. Die Sequenzidentität (entweder auf der Aminosäure- oder der Nucleotidebene) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die Sequenz voller Länge kann durch Sequenzanordnung unter Verwendung von Computersoftware-Programmen, wie z. B. ALIGN, DNAstar und INHERIT, bestimmt werden, die verschiedene Algorithmen zur Messung der Homologie verwenden.
Eine Nucleinsäure mit einer für ein Protein kodierenden Sequenz kann durch Screening ausgewählter cDNA- oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin erstmals offenbarten abgeleiteten Aminosäuresequenz und, falls notwendig, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren, wie in Sambrook et al., s. o., beschrieben, um Vorläufer zu detektieren, und Verarbeiten der mRNA-Zwischenprodukte, die noch nicht in cDNA umkehrtranskribiert wurden, erhalten werden.
DcR3-Varianten können durch Einführung geeigneter Nucleotidveränderungen in DcR3-DNA oder durch Synthese des gewünschten DcR3-Polypeptids erhalten werden. Der Fachmann weiß es zu schätzen, dass Aminosäureveränderungen posttranslationale Prozesse des DcR3 verändern können, z. B. das Verändern der Anzahl oder der Position an Glykosylierungsstellen oder das Verändern der Membranverankerungscharakteristika.
Variationen im Nativsequenz-DcR3 voller Länge oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen DcR3 können z. B. unter Verwendung beliebiger der z. B. im US.-Patent Nr. 5.364.934 dargelegten Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen durchgeführt werden. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Codons sein, die für das DcR3 kodieren, die im Vergleich zum Nativsequenz-DcR3 zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz des DcR3 führt. Gegebenenfalls erfolgt die Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure mit einer beliebigen anderen Aminosäure in einer oder mehreren der Domänen des DcR3-Moleküls. Die Variationen können unter Verwendung von Verfahren erfolgen, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, z. B. oligonucleotidvermittelte (ortsspezifische) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese. Ortsspezifische Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1982)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können auf der klonierten DNA durchgeführt werden, um die DcR3-Varianten-DNA zu erzeugen.
Eine Scanning-Aminosäureanalyse kann auch durchgeführt werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren, die in die Wechselwirkung mit einem bestimmten Liganden oder Rezeptor involviert sind. Unter den bevorzugten Scanning-Aminosäuren sind relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist die bevorzugte Scanning-Aminosäure dieser Gruppe, da es die Seitenkette nach dem β-Kohlenstoff eliminiert und mit geringerer Wahrscheinlichkeit die Hauptketten-Konformation der Variante verändert. Alanin wird auch bevorzugt, da es die häufigste Aminosäure ist. Weiters ist es häufig sowohl in verborgenen als auch in exponierten Positionen zu finden [Creighton, The Proteins, W. H. Freeman & Co., N. Y.; Chothia, J. Mol. Biol. 105, 1 (1976)]. Falls die Alanin-Substitution keine angemessenen Mengen der Variante ergibt, so kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
Einmal ausgewählt, werden DcR3-Varianten produziert, sie können z. B. mit Fas-Ligand kontaktiert werden, und die Wechselwirkung kann, falls vorhanden, bestimmt werden. Die Wechselwirkung zwischen der DcR3-Variante und Fas-Ligand kann durch einen In-vitro-Test gemessen werden, wie z. B. in den unten stehenden Beispielen beschrieben. Während eine beliebige Anzahl analytischer Messungen verwendet werden kann, um Aktivitäten und Eigenschaften zwischen einer Nativsequenz-DcR3- und einer DcR3-Variante zu vergleichen, ist eine passende für die Bindung die Dissoziationskonstante Kd des Komplexes, der zwischen der DcR3-Variante und dem Fas-Liganden gebildet wird, im Vergleich zur Kd für das Nativsequenz DcR3.
Gegebenenfalls würden repräsentative Stellen in der für eine Mutagenese (wie z. B. die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren) geeigneten DcR3-Sequenz Stellen innerhalb einer oder mehrerer der cysteinreichen Domänen enthalten. Solche Variationen können unter Verwendung der oben stehend beschriebenen Verfahren erreicht werden.
2. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit Expressions- oder Klonierungsvektoren transfiziert oder transformiert, die hierin für die DcR3-Produktion beschrieben werden, und in herkömmlichem Nährstoffmedium gezüchtet, das je nach Eignung zur Induktion von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder zur Amplifikation der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Medium, Temperatur, pH-Wert und dergleichen, können vom Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Allgemein sind Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und Sambrook et al., s. o., zu finden.
Verfahren zur Transfektion sind dem Fachmann bekannt, z. B. CaPO₄ und Elektroporation. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für diese Zellen geeignet sind, durchgeführt. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie in Sambrook et al., s. o., beschrieben, oder die Elektroporation wird allgemein für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation gewisser Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und WO 89/05859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und Van der Eb, Virology 52, 456–1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystem-Transformationen wurden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, z. B. durch Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin, können ebenfalls verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den hierin enthaltenen Vektoren umfassen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Eubakterien, z. B. gramnegative oder grampositive Organismen, z. B. Enterobacteriaceae, wie etwa E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, z. B. der E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635).
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z. B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für DcR3-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein häufig verwendeter niederer eukaryotischer Wirtsmikroorganismus.
Geeignete Wirtszellen zur Expression von glykosyliertem DcR3 stammen von multizellulären Organismen. Beispiele von Zellen von wirbellosen Organismen umfassen Insektenzellen, wie z. B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, sowie Pflanzenzellen.
Beispiele nützlicher Säugetier-Wirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock-(CHO-) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen die Affen-Nieren-CV1-Linie, die durch SV40 transformiert wurde (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche Embryo-Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, für das Wachstum in Suspensionskultur subkloniert, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977); Chinahamster-Eierstock-Zellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4216 (1980)); Maus-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungen-Zellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); sowie den Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Die Selektion der geeigneten Wirtszelle wird als nach dem Stand der Technik bekannt angesehen.
3. Selektion und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), die für DcR3 kodiert, kann zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Es sind verschiedene Vektoren öffentlich erhältlich. Der Vektor kann z. B. in der Form eines Plasmids, eines Cosmids, eines viralen Partikels oder eines Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann durch eine Reihe an Verfahren in den Vektor insertiert werden. Allgemein wird DNA unter Verwendung von Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, in (eine) geeignete Restriktionsendonuclease-Stelle(n) insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine oder mehrere einer Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Die Konstruktion geeigneter Vektoren, enthaltend eine oder mehrere dieser Komponenten, verwendet Standard-Ligationsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
Das DcR3 kann rekombinant nicht nur direkt produziert werden, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der DcR3-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz sein, die z. B. aus der aus der alkalischen Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Für die Hefe-Sekretion kann die Signalsequenz z. B. der Hefe-Invertase-Leader sein, der α-Faktor-Leader (unter anderem Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder der Saure-Phosphatase-Leader, der C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das Signal, das in WO 90/13646 , veröffentlicht am 15. November 1990, beschrieben ist. Bei der Säugetierzellen-Expression können Säugetier-Signalsequenzen verwendet werden, um die Sekretion des Proteins zu steuern, z. B. Signalsequenzen von sekretierten Polypeptiden derselben oder verwandter Spezies, sowie virale sekretorische Leader.
Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für eine Reihe an Bakterien, Hefearten und Viren wohlbekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind zum Klonieren von Vektoren in Säugetierzellen von Nutzen.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, auch selektierbarer Marker genannt. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetrazyklin, verleihen, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die nicht aus komplexen Medien erhältlich sind, z. B. das Gen, das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodiert.
Ein Beispiel geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen sind jene, welche die Identifikation von Zellen ermöglichen, die für die Aufnahme der DcR3-Nuclein säure kompetent sind, z. B. DHFR oder Thymidin-Kinase. Eine geeignete Wirtszelle bei Verwendung von Wildtyp-DHFR ist die CHO-Zelllinie mit Defizienz bezüglich der DHFR-Aktivität, hergestellt und vermehrt wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefe-Plasmid YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Hefe-Mutantenstamm bereit, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, z. B. ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten normalerweise einen Promotor, der operabel an die DcR3-Nucliensäuresequenz gebunden ist, um die mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die von einer Reihe potentieller Wirtszellen erkannt werden, sind wohlbekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotor-Systeme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ] und Hybrid-Promotoren, wie z. B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S. D.-)Sequenz, die operabel an die für DcR3 kodierende DNA gebunden ist.
Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefe-Wirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeuran et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)], z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefe-Promotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil, dass die Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert ist, sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase sowie Enzyme, die für Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefe-Expression sind im EP 73.657 genauer beschrieben.
Die DcR3-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird z. B. durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren, wie z. B. dem Polyoma-Virus, dem Geflügelpocken-Virus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), dem Adenovirus (z. B. Adenovirus 2), dem Rinder-Papilloma-Virus, dem Vogel-Sarkom-Virus, dem Zytomegalievirus, einem Retrovirus, dem Hepatitis-B-Virus und dem Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren, z. B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, sowie aus Hitzeschockpromotoren erhalten werden, vorausgesetzt diese Promotoren sind mit den Wirtszellensystemen kompatibel.
Die Transkription einer DNA, die für das DcR3 kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht werden. Enhancer sind cisagierende DNA-Elemente, normalerweise von etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription zu erhöhen. Viele Enhancersequenzen sind zur Zeit aus Säugetier-Genen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fötoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen, Zell-Virus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100–270), den frühen Zytomegalievirus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zu der für DcR3 kodierenden Sequenz gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, menschliche oder kernhaltige Zellen von anderen multizellulären Organismen) verwendet werden, enthalten ebenfalls Sequenzen, die für die Been dung der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Solche Sequenzen sind häufig aus den 5'- und gegebenenfalls 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für DcR3 kodierenden mRNA transkribiert sind.
Wiederum andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für eine Adaptierung an die Synthese von DcR3 in rekombinanter Wirbeltier-Zellkultur geeignet sind, sind in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantel et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 und EP 117.058 beschrieben.
4. Detektion der Gen-Amplifikation/-Expression
Die Gen-Amplifikation und/oder -Expression kann direkt in einer Probe gemessen werden, z. B. durch konventionelles Southern-Blotting und Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren [Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder durch In-situ-Hybridisierung, und zwar unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe erkennen können, unter anderem DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper können wiederum markiert sein, und der Test kann dort durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so dass nach der Duplex-Bildung auf der Oberfläche die Gegenwart von an den Duplex gebundenem Antikörper detektiert werden kann.
Alternativ dazu kann die Gen-Expression durch immunologische Verfahren gemessen werden, wie z. B. durch immunohistochemische Färbung von Zellen oder Gewebeschnitten und Test von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, um die Gen-Produkt-Expression direkt zu quantifizieren. Antikörper, die zur immunohistochemischen Färbung und/oder für den Test von Probeflüssigkeiten von Nutzen sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in einem beliebigen Säugetier her gestellt werden. Passenderweise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-DcR3-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, das auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen basiert, oder gegen eine exogene Sequenz, die an DcR3-DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörper-Epitop kodiert, hergestellt werden.
5. Polypeptid-Reinigung
Formen von DcR3 können aus dem Kulturmedium oder aus Wirtszell-Lysaten gewonnen werden. Falls membrangebunden, kann es aus der Membran unter Verwendung einer geeigneten Detergenslösung (z. B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung freigesetzt werden. Zellen, die in der Expression von DcR3 verwendet werden, können durch verschiedene physikalische oder chemische Verfahren zerstört werden, z. B. durch Gefrier-Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanischen Aufschluss oder durch zelllysierende Mittel.
Es kann gewünscht werden, DcR3 aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind ein Beispiel geeigneter Reinigungsverfahren: Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Silica oder auf einem Kationenaustausch-Harz, wie z. B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfat-Präzipitation; Gelfiltration, z. B. unter Verwendung von Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen, um Verunreinigungen, wie z. B. IgG, zu entfernen; sowie metallchelatisierende Säulen, um epitopmarkierte Formen des DcR3 zu binden. Verschiedene Verfahren der Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind nach dem Stand der Technik bekannt und werden z. B. in Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/die ausgewählte(n) Reinigungsschritt(e) hängt/hängen z. B. von der Art des verwendeten Produktionsverfahrens und vom spezifischen DcR3, das produziert wird, ab.
D. Verwendungen für DcR3
Nucleotidsequenzen (oder ihr Komplement), die für DcR3 kodieren, besitzen verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie, unter anderem Verwendungen als Hybridisierungssonden, bei der Chromosomen- und Gen-Kartierung und in der Erzeugung von Anti-Sense-RNA und -DNA. DcR3-Nucleinsäure ist auch zur Herstellung von DcR3-Polypeptiden durch die hierin beschriebenen Rekombinationsverfahren von Nutzen.
Das Nativsequenz-DcR3-Gen voller Länge (2; Seq.-ID Nr. 2) oder Abschnitte davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek verwendet werden, um das DcR3-Gen voller Länge zu isolieren oder um noch andere Gene zu isolieren (z. B. jene, die für natürlich auftretende Varianten von DcR3 kodieren oder für DcR3 von anderen Spezies), die eine gewünschte Sequenzidentität mit der in 2 (Seq.-ID Nr. 2) offenbarten DcR3-Sequenz aufweisen. Gegebenenfalls liegt die Länge der Sonden bei etwa 20 bis etwa 50 Basen. Die Hybridisierungssonden können von der Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 2 oder aus genomischen Sequenzen stammen, umfassend Promotoren, Enhancer-Elementen und Introns von Nativsequenz-DcR3. Beispielsweise umfasst ein Screeningverfahren das Isolieren der kodierenden Region des DcR3-Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine ausgewählte Sonde mit etwa 40 Basen zu synthetisieren. Hybridisierungssonden können durch eine Reihe an Markierungen markiert werden, unter anderem durch Radionucleotide, wie z. B. ³²P oder ³⁵S, oder durch enzymatische Markierungen, wie z. B. alkalische Phosphatase, durch Avidin/Biotin-Bindungssysteme an die Sonde gebunden. Markierte Sonden mit einer Sequenz, die komplementär zu jener des DcR3-Gens der vorliegenden Erfindung ist, können verwendet werden, um Bibliotheken menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu screenen, um zu bestimmen, an welche Mitglieder solcher Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungsverfahren werden in den unten stehenden Beispielen ausführlicher beschrieben.
Die in der vorliegenden Anwendung offenbarten und beanspruchten ESTs können unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren auf ähnliche Art und Weise als Sonden verwendet werden.
Die Sonden können auch in PCR-Verfahren verwendet werden, um einen Pool an Sequenzen zur Identifikation eng verwandter DcR3-Sequenzen zu erzeugen.
Nucleotidsequenzen, die für ein DcR3 kodieren, können auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden zur Kartierung des Gens, das für dieses DcR3 kodiert, sowie für die genetische Analyse von Individuen mit genetischen Erkrankungen zu konstruieren. Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen können unter Verwendung bekannter Verfahren, wie z. B. In-situ-Hybridisierung, Bindungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungsscreening mit Bibliotheken, an ein Chromosom und spezifische Regionen eines Chromosoms kartiert werden. Beispiel 12 beschreibt weiters ein ausgewähltes chromosomales Kartierungsverfahren und identifiziert, dass das DcR3-Gen an das menschliche Chromosom 20 kartiert wurde.
Wie hierin offenbart, kann das DcR3-Gen in kanzerösen Zellen und Geweben amplifiziert werden. Unten stehendes Beispiel 13 beschreibt z. B., dass herausgefunden wurde, dass das DcR3-Gen in verschiedenen Lungen- und Kolon-Krebsarten amplifiziert wurde. Dementsprechend können die Moleküle der vorliegenden Erfindung als Diagnosemittel verwendet werden, um die Gegenwart von Krebs oder das Risiko des Auftretens von Krebs durch Analyse von Gewebe auf die Amplifikation des DcR3-Gens zu analysieren. Die Detektion der DcR3-Gen-Amplifikation in Patientengewebe kann auch von erfahrenen Praktikern bei der Auswahl bevorzugter Behandlungsverfahren für den Patienten verwendet werden, z. B. der Identifizierung eines Anti-DcR3-Antikörper-Behandlungsverfahrens für den Patienten. Solche Diagnoseverfahren oder Tests können unter Verwendung verschiedener Verfahren, unter anderem PCR- oder FISH-Verfahren, durchgeführt werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Gewebe können auch unter Verwendung der in Beispiel 13 zur Bestimmung der DcR3-Gen-Amplifikation beschriebenen Verfahren analysiert werden.
Kodieren die für DcR3 kodierenden Sequenzen für ein Protein, das an ein anderes Protein bindet (z. B. in einem Fall, in dem das DcR3 ein Rezeptor ist), kann das DcR3 in Tests verwendet werden, um die anderen Proteine oder Moleküle zu identifizieren, die in die Bindungswechselwirkung involviert sind. Durch solche Verfahren können Inhibitoren der Rezeptor/Liganden-Bindungswechselwirkung identifiziert werden. Proteine, die in solche Bindungswechselwirkungen involviert sind, können auch verwendet werden, um auf Peptid- oder Kleinmolekül-Inhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu screenen. Das Rezeptor-DcR3 kann auch verwendet werden, um (einen) entsprechende(n) Ligand(en) zu isolieren. Screening-Tests können entwickelt werden, um Leitverbindungen zu finden, welche die biologische Aktivität eines nativen DcR3 oder eines Liganden oder Rezeptors für DcR3 imitieren. Solche Screening-Tests umfassen Tests, die für ein Screening chemischer Bibliotheken mit hohem Durchsatz zugänglich sind, wodurch sie zur Identifikation von Kleinmolekül-Arzneimittelkandidaten besonders geeignet sind. Kleinmoleküle, die in Betracht gezogen werden, umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen. Die Tests können in einer Reihe verschiedener Formate durchgeführt werden, umfassend Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screeningtests, Immuntests und zellbasierte Tests, die nach dem Stand der Technik ausführlich beschrieben sind.
Nucleinsäuren, die für DcR3 oder seine modifizierten Formen kodieren, können auch verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder „Knock-out"-Tiere zu erzeugen, die wiederum in der Entwicklung und dem Screening therapeutisch nützlicher Reagenzien von Nutzen sind. Ein transgenes Tier (z. B. eine Maus oder Ratte) ist ein Tier mit Zellen, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers in einem pränatalen, z. B. embryonalen, Stadium eingeführt wurde. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann cDNA, die für DcR3 kodiert, verwendet werden, um genomische DNA in Einklang mit etablierten Verfahren zu klonieren, die für DcR3 kodiert, und die genomischen Sequenzen können verwendet werden, um transgene Tiere zu erzeugen, die Zellen enthalten, die DNA exprimieren, die für DcR3 kodieren. Verfahren zur Erzeugung transge ner Tiere, insbesondere Tiere, wie z. B. Mäuse oder Ratten, werden nun nach dem Stand der Technik als konventionell betrachtet und werden z. B. im US-Patent Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise wären bestimmte Zellen ein Target für die DcR3-Transgen-Inkorporation mit gewebespezifischen Enhancern. Transgene Tiere, die eine Kopie eines Transgens umfassen, das für DcR3 kodiert, das in die Keimbahn des Tieres in einem embryonalen Stadium eingeführt wurde, können verwendet werden, um die Wirkung einer erhöhten Expression von DNA zu untersuchen, die für DcR3 kodiert. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie z. B. Schutz vor pathologischen Zuständen verleihen, die mit dessen Überexpression assoziiert sind. In Einklang mit dieser Facette der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und ein reduziertes Auftreten des pathologischen Zustands im Vergleich zu unbehandelten Tieren, die das Transgen in sich tragen, wäre ein Indikator für eine potentielle therapeutische Intervention bezüglich des pathologischen Zustands.
Alternativ dazu können nicht-menschliche Homologe von DcR3 verwendet werden, um ein DcR3-„Knock-out”-Tier zu erzeugen, das ein defektes oder verändertes Gen, das für DcR3 kodiert, als Resultat einer homologen Rekombination zwischen dem endogenen Gen, das für DcR3 kodiert, und veränderter genomischer DNA, die für DcR3 kodiert, eingeführt in eine embryonale Zelle des Tieres aufweist. cDNA, die für DcR3 kodiert, kann z. B. verwendet werden, um genomische DNA, die für DcR3 kodiert, in Einklang mit etablierten Verfahren zu klonieren. Ein Abschnitt der genomischen DNA, die für DcR3 kodiert, kann deletiert werden oder mit einem anderen Gen ersetzt werden, wie z. B. mit einem Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der verwendet werden kann, um die Integration zu beobachten. Typischerweise sind mehrere Kilobasen unveränderter flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch an den 3'-Enden) im Vektor inkludiert [siehe z. B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren]. Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie eingeführt (z. B. durch Elektroporation), und Zellen, in denen es zu einer homologen Rekombination der eingeführten DNA mit der endogenen DNA gekommen ist, werden ausgewählt [siehe z. B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)]. Die ausgewählten Zellen werden anschließend in eine Blastozyste eines Tie res injiziert (z. B. eine Maus oder eine Ratte), um Aggregationschimären zu bilden [siehe z. B. Bradley, in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, 113–152, E. J. Robertson (Hrsg.), IRL, Oxford (1987)]. Ein chimärer Embryo kann anschließend in ein geeignetes scheinträchtiges weibliches Ammentier implantiert werden und ausgetragen werden, um ein „Knock-out"-Tier zu erzeugen. Nachkommen, welche die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen tragen, können mittels Standardverfahren identifiziert werden und verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knock-out-Tiere können z. B. durch ihre Fähigkeit, sich gegen gewisse pathologische Zustände verteidigen zu können, sowie bezüglich ihrer Entwicklung pathologischer Zustände aufgrund der Abwesenheit des DcR3-Polypeptids beschrieben werden.
DcR3, wie in der vorliegenden Beschreibung offenbart, kann therapeutisch verwendet werden, um Apoptose durch den Fas-Liganden oder durch einen anderen Liganden, an den DcR3 in Säugetierzellen bindet, zu regulieren sowie um andere Funktionen des Fas-Liganden zu modulieren. Diese Therapie kann z. B. unter Verwendung von In-vivo- oder Ex-vivo-Gentherapie-Verfahren erzielt werden. Nucleinsäure, die für DcR3 kodiert, kann in der Gentherapie verwendet werden. In Gentherapie-Anwendungen werden Gene in Zellen eingeführt, um eine In-vivo-Synthese eines therapeutisch wirksamen genetischen Produkts zu erzielen, z. B. den Ersatz eines defekten Gens. „Gentherapie" umfasst sowohl herkömmliche Gentherapie, bei der eine lang anhaltende Wirkung durch eine einzelne Behandlung erhielt wird, als auch die Verabreichung gentherapeutischer Mittel, welche die einmalige oder wiederholte Verabreichung einer therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNAs und -DNAs können als therapeutische Mittel zum Blockieren der In-vivo-Expression gewisser Gene verwendet werden. Es wurde bereits gezeigt, dass kurze Antisense-Oligonucleotide in Zellen importiert werden können, wo sie trotz ihrer niedrigen intrazellulären Konzentrationen, die durch ihre beschränkte Aufnahme durch die Zellmembran hervorgerufen werden, als Inhibitoren fungieren [Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 4143–4146 (1986)]. Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um ihre Aufnahme zu modifizieren, z. B. durch Substituieren ihrer negativ geladenen Phosphodiester-Gruppen durch ungeladene Gruppen.
Es gibt eine Reihe von Verfahren, die zur Einführung von Nucleinsäuren in lebende Zellen erhältlich sind. Die Verfahren variieren in Abhängigkeit davon, ob die Nucleinsäure in vitro in gezüchtete Zellen oder in vivo in die Zellen des beabsichtigten Wirts transferiert wird. Verfahren, die für den In-vitro-Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen geeignet sind, umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren etc. Die momentan bevorzugten In-vivo-Gentransfer-Verfahren umfassen die Transfektion mit viralen (typischerweise retroviralen) Vektoren und Virushüllprotein-Liposomen-vermittelte Transfektion [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205–210 (1993)]. In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäure-Quelle mit einem Mittel zu versorgen, das auf die Targetzellen abzielt, z. B. ein Antikörper, der für ein Zelloberflächen-Membranprotein oder die Target-Zelle spezifisch ist, ein Ligand für einen Rezeptor auf der Target-Zelle etc. Werden Liposomen verwendet, so können Proteine, die an ein Zelloberflächen-Membranprotein binden, das mit Endocytose assoziiert ist, zum Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme verwendet werden, z. B. Capsid-Proteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die im Kreislauf einer Internalisierung unterzogen werden, Proteine, die auf die intrazelluläre Positionierung abzielen und die intrazelluläre Halbwertszeit verbessern. Das Verfahren einer rezeptorvermittelten Endozytose wird z. B. von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987), und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 4310–3414 (1990), beschrieben. Für eine Übersicht über die Genmarkierungs- und Gentherapie-Arbeitsvorschriften siehe Anderson et al., Science 256, 808–813 (1992).
Es wird in Betracht gezogen, dass DcR3-Polypeptide und modifizierte Formen von DcR3 (sowie die unten stehend beschriebenen DcR3-Antikörper) therapeutisch als Agonisten- oder Antagonisten-Moleküle verwendet werden können. DcR3-Moleküle z. B., die als Antagonisten fungieren können, können zur Inhibierung oder Blockierung von Fas-Ligand oder Fas-Ligand-induzierter Aktivität oder, alternativ dazu, der Aktivität eines anderen Liganden, an den DcR3 bindet, verwendet werden. Beispiele solcher Formen von DcR3 umfassen die oben stehend beschriebenen chimären Moleküle, die eine Fusiuon des DcR3 mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Dies umfasst chimäre Moleküle, die eine extrazelluläre Domänensequenz von DcR3 und ein Immunglobulin enthalten. Diese DcR3-Moleküle können, wie hierin beschrieben, Fas-Ligand-induzierte Aktivität beschreiben, wie z. B. Fas-Ligand-induzierte Apoptose oder Fas-Ligand-induzierte Lymphozytenaktivität, sowie die Proliferation von Lymphozyten als Reaktion auf eine antigene Stimulierung unterdrücken. Basierend auf den in den Beispielen beschriebenen Daten des gemischten Lymphozyten-Reaktionstests wird angenommen, dass die induzierte Immunantwort nicht ausschließlich vom Fas-Ligand vermittelt wird.
Diese Inhibierung oder Antagonistenaktivität besitzt daher Anwendungen bei Erkrankungen, die immunvermittelt sind und zumindest als eine Komponente ihrer Induktion und ihres Mechanismus die Aktivierung von T-Lymphozyten umfassen, die schließlich eine Reihe intra- und interzellulärer Vorkommnisse aufbauen, was bei diesen Erkrankungen für das Säugetier schädlich ist. Solche immunvermittelten Erkrankungen, von denen angenommen wird, dass sie die T-Lymphozyten-Aktivierung umfassen oder darauf beruhen, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Asthma und andere allergische Erkrankungen, umfassend z. B. allergische Rhinitis und atopische Erkrankungen, Gelenkrheumatismus und juvenile chronische Arthritis, Psoriasis, entzündliche Darmerkrankungen, unter anderem die Crohn-Erkrankung und Colitis ulcerosa, glutenempfindliche Enteropathie sowie die Whipple-Krankheit, Multiple Sklerose und andere immunvermittelte ZNS-Entmarkungskrankheiten sowie transplantatbezogene Erkrankungen, unter anderem Transplantatabstoßung und die Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung.
Von diesen Erkrankungen wird angenommen, dass sie immunvermittelt sind, und zwar entweder direkt, wie z. B. durch die nachweislich verbessernde Wirkung einer immunsuppressiven Therapie bei Säugetieren, oder indirekt, z. B. durch die Demonstration von T- oder B-Lymphozyten oder Auto-Antikörpern innerhalb von Läsionen von Patienten mit der Erkrankung, oder durch Schlussfolgerung von Daten, die durch die experimentelle Verwendung von Tiermodellen menschlicher Erkrankungen erhalten wurden [siehe allgemein Santer's Immunological Diseases, 5. Auflage, Band I und II, Little, Brown and Company (1995)].
Träger und ihre Formulierungen werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, Mack Publishing Co., Oslo et al. (Hrsg.) (1980), beschrieben. Typischerweise wird eine geeignete Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes in der Formulierung verwendet, um die Formulierung isotonisch zu machen. Beispiele des Trägers umfassen Puffer, wie z. B. Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung. Der pH der Lösung liegt vorzugsweise bei etwa 5 bis etwa 8 und noch bevorzugter bei etwa 7,4 bis etwa 7,8. Weitere Träger umfassen Retardpräparate, wie z. B. semipermeable Matrizen fester hydrophober Polymere, wobei die Matrizen die Form geformter Artikel aufweisen, z. B. Filme, Liposomen oder Mikropartikel. Es ist dem Fachmann klar, dass gewisse Träger stärker bevorzugt werden, z. B. in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg und der Konzentration des DcR3-Moleküls, das verabreicht wird.
Die Verabreichung an ein Säugetier kann durch Injektion erzielt werden (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) oder durch andere Verfahren, wie z. B. Infusion, welche die Anlieferung in den Blutkreislauf in einer wirksamen Form sicherstellen.
Wirksame Dosierungen und Verabreichungspläne können empirisch bestimmt werden, und das Erstellen solcher Bestimmungen ist nach dem Stand der Technik möglich.
E. Anti-DcR3-Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt Anti-DcR3-Antikörper bereit. Beispiele für Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper.
1. Polyklonale Antikörper
Die DcR3-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier gezüchtet werden, z. B. durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, falls gewünscht, eines Adjuvans. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder das Adjuvans in das Säugetier durch mehrfache subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert. Das immunisierende Mittel kann das DcR3-Polypeptid oder ein Fusionspeptid davon umfassen. Es kann von Nutzen sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, von dem bekannt ist, dass es in dem zu immunisierenden Säugetier immunogen ist. Beispiele solcher immunogener Proteine umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinder-Thyreoglobulin und Sojabohnen-Trypsin-lnhibitor. Beispiele für Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen vollständiges Freund-Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid-A, synthetisches Trehalose-Dicorynomycolat). Die immunisierungs-Arbeitsvorschriften können von einem Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
2. Monoklonale Antikörper
Die DcR3-Antikörper können alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridom-Verfahren hergestellt werden, z. B. jene, die von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben werden. in einem Hybridom-Verfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten zu erzeugen, die Antikörper produzieren oder dazu in der Lage sind, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel umfasst typischerweise das DcR3-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Allgemein werden entweder Peripherblutlymphozyten („PBLs") verwendet, falls Zellen menschlichen Ursprungs gewünscht werden, oder es werden Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, falls nicht-menschliche Säugetierquellen gewünscht werden. Die Lymphozyten werden anschließend mit einer immortalisierten Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, z. B. Polyethy lenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59–103 (1986)]. Immortalisierte Zelllinien sind normalerweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelom-Zellen von Nagetieren, Rindern und Menschen. Normalerweise werden Ratten- oder Maus-Myelom-Zelllinien verwendet.
Die Hybridom-Zellen können in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, welche das Wachstum oder Überleben der unfusionierten, immortalisierten Zellen inhibieren. Falls den Ausgangszellen z. B. das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium"), Substanzen, die das Wachstum HGPRT-defizienter Zellen verhindern.
Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren, eine stabile hochgradige Antikörper-Expression durch die ausgewählten antikörperproduzierenden Zellen unterstützen und auf ein Medium, wie z. B. HAT-Medium, empfindlich reagieren. Stärker bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind murine Myelom-Linien, die z. B. vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelom-Zelllinien wurden auch für die Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper beschrieben [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51–63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)].
Das Kulturmedium, in dem die Hybridom-Zellen gezüchtet werden, kann anschließend auf die Gegenwart monoklonaler Antikörper getestet werden, die gegen DcR3 gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität monoklonaler Antikörper, die von den Hybridom-Zellen produziert werden, durch Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z. B. einen Radioimmuntest (RIA) oder einen enzymgekoppelten Immunadsorptionsbestimmungstest (ELISA), bestimmt. Solche Verfahren und Tests sind nach dem Stand der Technik bekannt. Die Bindungsaffini tät des monoklonalen Antikörpers kann z. B. durch die Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die gewünschten Hybridom-Zellen identifiziert sind, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und durch Standardverfahren gezüchtet werden [Goding, s. o.]. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen z. B. Dulbeccos Modifiziertes Eagle-Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridom-Zellen in vivo als Ascites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper können durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z. B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, aus dem Kulturmedium oder der Ascites-Flüssigkeit isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wie z. B. jene, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben werden. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren leicht isoliert und sequenziert werden (z. B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten muriner Antikörper kodieren). Die Hybridom-Zellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle solcher DNA. Einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die anschließend in Wirtszellen, wie z. B. Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder Myelom-Zellen, die andernfalls kein Immunglobulin-Protein produzieren, transfiziert werden, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten. Die DNA kann auch modifiziert werden, z. B. durch Substituieren der kodierenden Sequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtketten-Domänen an Stelle der homologen murinen Sequenzen [ US-Patent Nr. 4.816.567 ; Morrison et al., s. o.] oder durch kovalente Bindung der gesamten oder eines Teils der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die kodierende Immunglobulin-Sequenz. Die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung können durch solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid ersetzt werden, oder die Variablen Domänen einer antigenkombinierenden Stelle eines Antikörpers der Erfindung können durch solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid ersetzt werden, um einen chimären zweiwertigen Antikörper zu erzeugen.
Wie in den unten stehend beschriebenen Beispielen angeführt, wurden monoklonale Anti-DcR3-Antikörper hergestellt. Mehrere dieser Antikörper, hierin als 4C4.1.4; 5C4.14.7; 11C5.2.8; 8D3.1.5; und 4B7.1.1 bezeichnet, wurden bei der ATCC hinterlegt, und es wurde ihnen die Hinterlegungs-Zugriffsnr. HB-12573, HB-12574, HB-12572, HB-12571 bzw. HB-12575 zugewiesen. In einer Ausführungsform besitzen die monoklonalen Antikörper der Erfindung dieselben biologischen Eigenschaften wie einer oder mehrere Antikörper, die von den Hybridom-Zelllinien sekretiert werden, die unter der Zugriffsnr. HB-12573, HB-12574, HB-12572, HB-12571 oder HB-12575 hinterlegt wurden. Der Ausdruck „biologische Eigenschaften" wird verwendet, um sich auf die In-vitro- oder die In-vivo-Aktivitäten oder Eigenschaften der monoklonalen Antikörper zu beziehen, wie z. B. die Fähigkeit, an DcR3 zu binden oder die Fas-Ligand/DcR3-Bindung im Wesentlichen zu inhibieren. Gegebenenfalls bindet der monoklonale Antikörper an dasselbe Epitop wie zumindest einer der Antikörper, die oben stehend spezifisch erwähnt wurden. Diese Epitopbindung kann durch Durchführung verschiedener Tests bestimmt werden, wie z. B. jene, die hierin und in den Beispielen beschrieben werden.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zum Herstellen einwertiger Antikörper sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Ein Verfahren umfasst z. B. die rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtketten und modifizierten Schwerketten. Die Schwerkette wird allgemein an einem beliebigen Punkt in der Fc-Region trunkiert, um eine Schwerketten-Vernetzung zu verhindern. Alternativ dazu werden die relevanten Cystein-Reste mit einem anderen Aminosäurerest substituiert oder sie werden deletiert, um eine Vernetzung zu vermeiden.
In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Der Verdau von Antikörpern, um Fragmente davon zu produzieren, insbesondere Fab- Fragmente, kann unter Verwendung von Routine-Verfahren erzielt werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind.
3. Humanisierte Antikörper
Die DcR3-Antikörper der Erfindung können weiter humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen nicht-menschlicher (z. B. muriner) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulin-Ketten oder Fragmente davon (z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine minimale Sequenz enthalten, die von nicht-menschlichem Immunglobulin abstammt. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), in denen Reste einer komplementätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste von einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie z. B. einer Maus, einer Ratte oder eines Kaninchens, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüst-Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Empfänger-Antikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüst-Sequenzen zu finden sind. Allgemein umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); sowie Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)].
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Allgemein weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus einer nicht-menschlichen Quelle in ihn einge führt wurden. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oftmals als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import"-Domäne entnommen werden. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern durchgeführt werden [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)], und zwar durch Substituieren der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen. Dementsprechend sind solche „humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin wesentlich weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz einer nicht-menschlichen Sequenz substituiert ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert sind.
Menschliche Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener, nach dem Stand der Technik bekannter Verfahren produziert werden, umfassend Phagendisplay-Bibliotheken [Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)]. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. sind auch zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper erhältlich (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan. R. Liss, 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147 (1), 86–95 (1991)).
4. Bispecific Antibodies
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das DcR3, die andere für ein beliebiges anderes Antigen und vorzugsweise für ein/einen/eine Zelloberflächenprotein oder -rezeptor oder eine -rezeptor-Untereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind nach dem Stand der Technik bekannt. Traditionellerweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Anti körper auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, wobei die zwei Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen [Milstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)]. Aufgrund der Zufallsverteilung von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potentielles Gemisch aus zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls wird normalerweise durch Affinitätschromatographieschritte erreicht. Ähnliche Verfahren werden in WO 93/08829 , veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörper-Domänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-kombinierende Stellen) können an konstante Immunglobulin-Domänen-Sequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerketten-Domäne, umfassend zumindest einen Teil der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen. Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerketten-Region (CH1) die für die Leichtketten-Bindung erforderliche Stelle, die in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist, enthält. DNAs, welche für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen und, falls gewünscht, die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Für weitere Details zur Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe z. B. Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
5. Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper liegen auch innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte Antikörper bestehen aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern. Von solchen Antikörpern wurde z. B. vorgeschlagen, dass sie Immunsystemzellen auf ungewollte Zellen abzielen lassen [ US-Patent Nr. 4.676.980 ], weiters wurden sie zur Behandlung einer HIV-Infektion vorgeschlagen [ WO 91/00360 ; WO 92/200373 ; EP 03089 ]. Es wird in Betracht gezogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie hergestellt werden können, unter anderem jener, die Vernetzungsmittel um fassen. Immuntoxine z. B. können unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele geeigneter Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie jene, die z. B. im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
F. Verwendungen für DcR3-Antikörper
Die DcR3-Antikörper der Erfindung können auf verschiedene Art und Weise genutzt werden. Die DcR3-Antikörper können beispielsweise in diagnostischen Tests für DcR3 verwendet werden, z. B. zur Detektion von dessen Expression in spezifischen Zellen, Geweben, Serum oder Tumoren. Verschiedene diagnostische Testverfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden, z. B. kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwich-Tests und Immunpräzipitationstests, die in entweder heterogenen oder homogenen Phasen durchgeführt werden [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147–158, CRC Press, Inc. (1987)]. Die in den diagnostischen Tests verwendeten Antikörper können mit einer detektierbaren Gruppierung markiert werden. Die detektierbare Gruppierung sollte in der Lage sein, entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal zu produzieren. Die detektierbare Gruppierung kann z. B. ein Radioisotop, wie z. B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z. B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z. B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettich-Peroxidase, sein. Ein beliebiges Verfahren zum Konjugieren des Antikörpers an die detektierbare Gruppierung, das nach dem Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden, unter anderem jene Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben wurden.
DcR3-Antikörper sind auch für die Affinittäsreinigung von DcR3 aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen von Nutzen. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen DcR3 auf einem geeigneten Träger, wie z. B. einem Sephadex-Harz oder Filterpapier, unter Verwendung nach dem Stand der Technik wohlbekannter Verfahren immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird anschließend mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende DcR3 enthält, und danach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen all das Material in der Probe entfernt, außer das DcR3, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist. Schlussendlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das den DcR3 aus dem Antikörper freisetzt.
Die DcR3-Antikörper der Erfindung besitzen auch therapeutischen Nutzen. DcR3-Antikörper können z. B. verwendet werden, um die Aktivität von DcR3 zu antagonisieren, die Fas-Ligand-induzierte Apoptose blockiert oder potentielle Autoimmun/Entzündungs-Wirkungen blockiert. DcR3-Antagonisten können in der Krebstherapie funktionieren, z. B. durch Hindern von DcR3 an der Inhibierung immunzytotoxischer Abtötung von Krebszellen. Dies kann z. B. durch Blockieren von Fas-Ligand-DcR3-Bindung oder durch Steigerung oder Verbesserung der DcR3-Clearance oder -Entfernung erzielt werden. Der Fachmann weiß es zu schätzen, dass es Moleküle gibt, welche die Aktivierung oder Stimulierung einer Immunantwort unterdrücken können und daher die Fähigkeit haben, ein gewisses Ausmaß an Immunsuppression hervorzurufen, und dadurch die Fähigkeit haben, Krebszellen dabei zu helfen, sich dem Überwachungssystem und der Antwort des Immunsystems des Säugetiers zu entziehen. Ein Beispiel eines natürlichen Inhibitors des Immunsystems ist CTLA4, das eine T-Lymphozytenaktivierung durch Inhibierung eines Co-Stimulierungsmechanismus von T-Lymphozyten inhibieren kann. Es wurde gezeigt, dass ein Antagonismus dieser Inhibierung in vivo die Fähigkeit des Säugetiers verstärkt, Krebs immunologisch abzustoßen. Es wurde berichtet, dass die Blockade von CTLA4 mit einem Antikörper in vivo zu einer Verstärkung der Immunantwort auf eine etablierte Krebsart führte, was zu einer anschließenden Abstoßung dieser Krebsart führte [Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 8099–8103 (1997); Leach et al., Science 271, 1734–1736 (1996)].
Es können therapeutische Zusammensetzungen und Verabreichungsarten (wie z. B. oben stehend für DcR3 beschrieben) verwendet werden. Wirksame Dosierungen und Pläne zur Verabreichung des Antagonisten können empirisch bestimmt werden, und die Erstellung solcher Bestimmungen ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Dem Fachmann ist bewusst, dass die Dosierung des Antagonisten, die verabreicht werden muss, z. B. in Abhängigkeit vom Säugetier, das den Antagonisten erhält, vom Verabreichungsweg, dem bestimmten Antagonistentyp, der verwendet wird, und anderen Arzneimitteln, die dem Säugetier verabreicht werden, variiert. Richtlinien bezüglich der Auswahl geeigneter Dosierungen für Antikörper-Antagonisten sind in der Literatur über therapeutische Verwendungen von Antikörpern zu finden, z. B. Handbook of Monoclonal Antibodies, Kapitel 22, 303–357, Ferrone et al. (Hrsg.), Noges Publications, Park Ridge, N. J. (1985); Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, 365–389, Haber et al. (Hrsg.), Raven Press, New York (1977). Eine typische tägliche Dosis des alleine verwendeten Antagonisten könnte von etwa 1 μg/kg bis zu 100 mg/kg Körpergewicht oder mehr pro Tag reichen, in Abhängigkeit von den oben stehend erwähnten Faktoren.
Bei Verfahren zur Behandlung von Krebs, welche die hierin beschriebenen DcR3-Antagonisten verwenden, wird in Betracht gezogen, dass dem Säugetier andere zusätzliche Therapien verabreicht werden können, und das umfasst, ist jedoch nicht eingeschränkt auf, Chemotherapie und Strahlentherapie, Immunadjuvanzien, Zytokine und antikörperbasierte Therapien. Beispiele umfassen Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-3, IL-6), den Leukämie-Inhibierungsfaktor, Interferone, TGF-β, Erythropoietin, Thrombopoietin, HER-2-Antikörper und Anti-CD20-Antikörper. Andere Mittel, von denen bekannt ist, dass sie Apoptose in Säugetierzellen induzieren, können auch verwendet werden, und solche Mittel umfassen TNF-α, TNF-β (Lymphotoxin-α), CD30-Ligand und 4-1BB-Ligand.
Chemotherapien, die von der Erfindung in Betracht gezogen werden, umfassen chemische Substanzen oder Arzneimittel, die nach dem Stand der Technik bekannt und im Handel erhältlich sind, wie z. B. Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Busulfan, Cytoxin, Taxol, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin und Carboplatin. Herstellungs- und Dosierungspläne für solch eine Chemotherapie können entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet werden oder wie empirisch vom Fachmann festgelegt. Die Herstellungs- und Dosierungspläne für solch eine Chemotherapie werden auch in Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992), beschrieben. Die Chemotherapie wird vorzugsweise in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie z. B. den oben beschriebenen, verabreicht. Der Antagonist kann nacheinander oder gleichzeitig mit dem einen oder mehreren anderen therapeutischen Mitteln verabreicht werden. Die Mengen an Antagonist und therapeutischem Mittel hängen z. B. davon ob, welche Art an Arzneimitteln verwendet werden, von der Art des zu behandelnden Krebs und vom Plan und den Wegen der Verabreichung, wären jedoch allgemein geringer, als wenn jedes einzeln verwendet würde.
Nach der Verabreichung des Antagonisten an das Säugetier kann der Krebs des Säugetiers und der physiologische Zustand auf verschiedene Arten beobachtet werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Die Tumormasse kann z. B. physikalisch oder durch Standard-Röntgenstrahlen-Bildgebungsverfahren beobachtet werden.
Die folgenden Beispiele dienen nur zu veranschaulichenden Zwecken und dienen nicht dazu, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, die in den Beispielen erwähnt wurden, wurden entsprechend den Anweisungen der Hersteller verwendet, falls nicht anders angegeben. Die Quelle dieser Zellen, die in den folgenden Beispielen und während der Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnr. identifiziert wurde, ist die American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.
BEISPIEL 1
Isolierung von cDNA-Klonen, die für menschliches DcR3 kodieren
Die extrazellulären Domänen-(ECD-)Sequenzen (umfassend die Sekretionssignalsequenz, falls vorhanden) von etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öf fentlichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um EST-Datenbanken zu durchsuchen. Die EST-Datenbanken umfassten öffentliche EST-Datenbanken (z. B. GenBank), eine private EST-Datenbank (LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) sowie im Eigentums von Genentech stehende ESTs. Die Suche wurde unter Verwendung des Computer-Programms BLAST oder BLAST2 durchgeführt [Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)], und zwar als Vergleich der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Rahmen-Translation der EST-Sequenzen. Jene Vergleiche, die zu einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen 90) oder mehr führen, die nicht für bekannte Proteine kodieren, wurden mit dem Programm „phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) zu Konsensus-DNA-Sequenz-Clustern zusammengefasst und angeordnet.
Unter Verwendung verschiedener ESTs wurde eine Konsensus-DNA-Sequenz angeordnet. Die ESTs umfassten eine im Eigentum von Genentech stehende EST (Seq.-ID Nr. 3; siehe 3 und 4), sechs ESTs aus den privaten Datenbanken (Seq.-ID Nr. 4; Seq.-ID Nr. 5; Seq.-ID Nr. 6; Seq.-ID Nr. 7, Seq.-ID Nr. 8; Seq.-ID Nr. 9, siehe 4) und eine EST aus der öffentlichen Datenbank (Seq.-ID Nr. 10).
Basierend auf der Konsensus-Sequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert, um durch PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, welche die Sequenz von Interesse enthielt, sowie zur Verwendung als Sonden, um einen Klon der kodierenden Sequenz voller Länge für DcR3 zu isolieren.
Ein Paar an PCR-Primern(Vorwärts- und Rückwärts-) wurden synthetisiert:
Eine Sonde wurde ebenfalls synthetisiert:
Um mehrere Bibliotheken auf eine Quelle eines Klons voller Länge zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation mit dem oben stehend identifizierten PCR-Primer-Paar identifiziert. Eine positive Bibliothek wurde anschließend verwendet, um Klone zu isolieren, die für das DcR3-Gen kodieren, und zwar unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids sowie eines der PCR-Primer.
Die RNA zur Konstruktion der cDNA-Bibliotheken wurde aus fötalem Lungen-Gewebe isoliert. Die cDNA-Bibliotheken, die zur Isolierung der cDNA-Klone verwendet wurden, wurden durch Standardverfahren unter Verwendung im Handel erhältlicher Reagenzien, wie z. B. jener von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, enthaltend eine NotI-Stelle, geprimt, mit dem stumpfen Ende an SalI-hemikinasierte Adaptoren gebunden, mit NotI gespalten, mittels Gelelektrophorese passend klassiert und in einer definierten Ausrichtung in den einzigartigen XhoI- und NotI-Stellen in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert (z. B. pRKB; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der keine Sfil-Stelle enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)).
Eine DNA-Sequenzierung der wie oben stehend beschrieben isolierten Klone ergab die DNA-Sequenz voller Länge für DcR3 (2; Seq.-ID Nr. 2) und die davon abgeleitete Proteinsequenz für DcR3 (1; Seq.-ID Nr. 1).
Die gesamte Nucleotidsequenz von DcR3 wird in 2 (Seq.-ID Nr. 2) dargestellt. Klon DNA30942 enthält einen einzelnen offenen Leseraster mit einer scheinbaren Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 101–103 [Kozak et al., s. o.] (2; Seq.-ID Nr. 2). Der prognostizierte Polypeptidvorläufer ist 300 Aminosäuren lang. Der N-Terminus der Sequenz enthält ein typisches Sekretionssignal (Aminosäuren 1-23 aus 1; Seq.-ID Nr. 1). Eine Analyse der DcR3-Aminosäuresequenz zeigte die Gegenwart von vier CRDs, wie in den 5 und 6 dargestellt. Es wird angenommen, dass DcR3 eine Transmembrandomäne fehlt. Es wird auch angenommen, dass die Aminosäuren 1 bis 215 aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) eine ECD darstellen, die vier CRDs umfasst (5). DcR3 besitzt eine potentielle N-gebundene Glykosylierungsstelle an Rest 173 der 1. Klon DNA30942 wurde bei der ATCC hinterlegt (identifiziert als DNA30942-1134), und ihm und wurde die ATCC-Hinterlegungsnr. 209254 zugewiesen.
Basierend auf einer BLAST- und FastA-Sequenzanordnungsanalyse der Sequenz voller Länge zeigt DcR3 eine gewisse Aminosäurensequenzidentität mit TNFR2 (28,7%) und OPG (31%). Siehe 5 und 6. Alle Cysteine in den vier CRDs von DcR3 und OPG sind konserviert; der C-terminale Abschnitt von DcR3 ist jedoch etwa 100 Reste kürzer.
BEISPIEL 2
Northern-Blot-Analyse
Die Expression von DcR3-mRNA in menschlichen Geweben und menschlichen Krebszelllinien wurde mittels Northern-Blot-Analyse untersucht. Menschliche RNA-Blots wurden basierend auf der DcR3-cDNA voller Länge an eine ³²P-markierte DNA-Sonde hybridisiert. Menschliches fötales RNA-Blot-MTN (Clontech), menschliches Erwachsenen-RNA-Blot-MTN-II (Clontech), menschliche Krebszelllinien-Blots (Clontech) wurden mit den DNA-Sonden inkubiert. Die Blots wurden anschließend 60 Stunden lang bei 42°C mit den Sonden in Hybridisierungspuffer (5X SSPE; 2X Denhardt-Lösung; 100 mg/ml denaturierte gescherte Lachsspermien-DNA; 50% Formamid; 2% SDS) inkubiert. Die Blots wurden mehrere Male in 2X SSC; 0,05% SDS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einem 30-Minuten-Waschschritt in 0,1X SSC; 0,1% SDS bei 50°C. Die Blots wurden nach einer Übernacht-Exposition durch Phosphorimager-Analyse (Fuji) entwickelt.
Ein vorherrschendes DcR3-Transkript von etwa 1,2 kb wurde in Lunge, Gehirn und Leber des Fötus und in Milz, Kolon und Lunge des Erwachsenen detektiert (7). Zusätzlich dazu wurde ein relativ hohes Ausmaß an DcR3-mRNA in der menschlichen Kolonkarzinom-Zelllinie SW480 detektiert (siehe 7).
BEISPIEL 3
Verwendung von DcR3 als Hybridisierungssonde
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer Nucleotidsequenz, die für DcR3 kodiert, als Hybridisierungssonde.
DNA, umfassend die kodierende Sequenz von DcR3 (wie in 2, Seq.-ID Nr. 2 dargestellt), wird als Sonde verwendet, um auf homologe DNAs (z. B. jene, die für natürlich auftretende Varianten von DcR3 kodieren) in menschlichen Gewebe-cDNA-Bibliotheken oder in menschlichen genomischen Gewebe-Bibliotheken zu screenen.
Die Hybridisierung und das Waschen von Filtern, enthaltend beide Bibliotheks-DNAs, wird unter den folgenden Bedingungen hoher Stringenz durchgeführt. Eine Hybridisierung einer radiomarkierten, von DcR3 abstammenden Sonde an die Filter wird in einer Lösung aus 50% Formamid, 5X SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2X Denhardt-Lösung und 10% Dextransulfat bei 42°C 20 Stunden lang durchgeführt. Das Waschen der Filter wird in einer wässrigen Lösung aus 0,1X SSC und 0,1% SDS bei 42°C durchgeführt.
DNAs mit einer gewünschten Sequenzidentität mit der DNA, die für Nativsequenz-DcR3 voller Länge kodiert, können anschließend unter Verwendung von Standardverfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, identifiziert werden.
BEISPIEL 4
Expression von DcR3 in E. coli
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von DcR3 durch rekombinante Expression in E. coli.
Die DNA-Sequenz, die für DcR3 kodiert (Seq.-ID Nr. 2), wird anfänglich unter Verwendung ausgewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsen zymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen auf dem ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Eine Reihe an Expressionsvektoren kann verwendet werden. Ein Beispiel eines geeigneten Vektors ist pBR322 (stammt von E. coli ab; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für eine Ampicillin- und Tetrazyklin-Resistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden anschließend in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein Antibiotika-Resistenz-Gen kodieren, einen trp-Promotor, einen Polyhis-Leader (unter anderem die ersten sechs STII-Codons, eine polyhis-Sequenz und eine Enterokinase-Spaltstelle), die DcR3-kodierende Region, einen λ-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen.
Das Ligationsgemisch wird anschließend verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s. o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden durch ihre Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert, und anschließend werden antibiotikaresistente Kolonien ausgewählt. Plasmid-DNA kann isoliert werden und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden.
Ausgewählte Klone können über Nacht in Flüssigkulturmedium, wie z. B. LB-Nährlösung, ergänzt mit Antibiotika, gezüchtet werden. Die Übernachtkultur kann anschließend verwendet werden, um eine Kultur größeren Ausmaßes zu beimpfen. Die Zellen werden anschließend auf eine gewünschte optische Dichte gezüchtet, während der der Expressionspromotor angeschaltet wird.
Nachdem die Zellen mehrere weitere Stunden lang gezüchtet wurden, können die Zellen durch Zentrifugierung geerntet werden. Das durch die Zentrifugierung erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener Mittel, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, solubilisiert werden, und das solubilisierte DcR3-Protein kann anschließend unter Verwendung einer metallchelatisierenden Säule unter Bedingungen, die eine feste Bindung des Proteins ermöglichen, gereinigt werden.
BEISPIEL 5
Expression von DcR3 in Säugetierzellen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von DcR3 durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.

A. Der Vektor, pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989), wird als Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls wird die DcR3-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie von Sambrook et al., s. o., beschrieben, in pRK5 mit ausgewählten Restriktionsenzymen ligiert, um die Insertion der DcR3-DNA zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird pRK5-DcR3 genannt.

In einer Ausführungsform können die ausgewählten Wirtszellen 293-Zellen umfassen. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in Medium, wie z. B. DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet.
Etwa 10 μg pRK5-DcR3-DNA wird mit etwa 1 μg DNA, kodierend für das VA-RNA-Gen, gemischt [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)] und in 500 μl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ aufgelöst. Zu diesem Gemisch werden tropfenweise 500 μl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ hinzugefügt, und es wird die Bildung eines Präzipitats für eine Zeitspanne von 10 Minuten bei 25°C ermöglicht. Das Präzipitat wird suspendiert und zu den 293-Zellen hinzugefügt und für etwa vier Stunden bei 37°C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml 20% Glycerin in PBS werden 30 Sekunden lang hinzugefügt. Die 293-Zellen werden anschließend mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird hinzugefügt, und die Zellen werden für eine Zeitspanne von etwa 5 Tagen inkubiert.
Etwa 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und mit Kulturmedium (alleine) oder mit Kulturmedium, enthaltend 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin, ersetzt. Nach einer 12-Stunden-Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, auf einem Spinfilter eingeengt und auf ein 15-%-SDS-Gel geladen. Das verarbeitete Gel kann getrocknet werden und gegenüber einem Film für eine ausgewählte Zeitspanne ausgesetzt werden, um die Gegenwart von DcR3-Polypeptid zu zeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können einer weiteren Inkubation unterzogen werden (in serumfreiem Medium), und das Medium wird in ausgewählten Biotests getestet.
In einem Alternativverfahren kann DcR3 vorübergehend unter Verwendung des Dextransulfat-Verfahrens, beschrieben von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), in 293-Zellen eingeführt werden. 293-Zellen werden bis zu maximaler Dichte in einer Spinner-Flasche gezüchtet, und 700 μg pRK5-DcR3-DNA werden hinzugefügt. Die Zellen werden zuerst aus der Spinner-Flasche mittels Zentrifugierung eingeengt und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird auf dem Zellpellet für eine Zeitspanne von vier Stunden inkubiert. Die Zellen werden mit 20% Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und erneut in die Spinner-Flasche, enthaltend Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin, gefüllt. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Die Probe, enthaltend exprimiertes DcR3, kann anschließend eingeengt werden und durch ein beliebiges ausgewähltes Verfahren gereinigt werden, wie z. B. durch Dialyse und/oder Säulenchromatographie.

B. In einer anderen Ausführungsform wurde epitopmarkiertes DcR3 in CHO-Zellen exprimiert. Das DcR3 wurde aus dem pRK5-Vektor subkloniert. Das Subklon-Insert wird anschließend einer PCR unterzogen, um im Rahmen eine Fusionierung mit einer poly-his-Markierung in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu erzielen. Das poly-his-markierte DcR3-Insert wurde anschließend in einen SV40-gesteuerten Vektor, enthaltend einen Selektionsmarker DHFR zur Selektion stabiler Klone, subkloniert.

Schließlich wurden die CHO-Zellen (wie oben stehend beschrieben) mit dem SV-gesteuerten Vektor transfiziert. Das Kulturmedium, enthaltend das exprimierte poly-his-markierte DcR3, wurde eingeengt und durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie gereinigt. Eine Analyse des gereinigten Proteins durch SDS-PAGE zeigte, dass das sekretierte DcR3-Protein ein Molekulargewicht von etwa 35 kDa aufweist.
BEISPIEL 6
Expression von DcR3 in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von DcR3 in Hefe.
Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von DcR3 aus dem ADH2/GAPDH konstruiert. DNA, kodierend für DcR3, ein ausgewähltes Signalpeptid und der Promotor werden in geeignete Restriktionsenzymstellen in dem ausgewählten Plasmid insertiert, um eine intrazelluläre Expression von DcR3 zu steuern. Zur Sekretion kann DNA, die für DcR3 kodiert, zusammen mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor kodiert, der Hefe-α-Faktor-Sekretionssignal/Leadersequenz und Linkersequenzen (falls erforderlich) zur Expression von DcR3 in das ausgewählte Plasmid kloniert werden.
Hefezellen, wie z. B. der Hefe-Stamm AB110, können anschließend mit den oben stehend beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert werden und in ausgewählten Fermentationsmedien gezüchtet werden. Die transformierten Hefe-Überstände können durch Präzipitation mit 10% Trichloressigsäure und Trennung durch SDS-PAGE, gefolgt von einer Färbung der Gele mit Coomassie-Blau-Fabstoff, analysiert werden.
Rekombinantes DcR3 kann anschließend durch Entfernung der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugierung und anschließendem Einengen des Mediums unter Verwendung ausgewählter Kartuschenfilter isoliert und gereinigt werden. Das Konzentrat, enthaltend DcR3, kann unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographie-Harze weiter gereinigt werden.
BEISPIEL 7
Expression von DcR3 in Baculovirus
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von DcR3 in Baculovirus.
Das DcR3 ist stromauf einer Epitopmarkierung, enthalten in einem Baculovirus-Expressionsvektor, fusioniert. Solche Epitopmarkierungen umfassen poly-his-Markierungen und Immunglobulinmarkierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Eine Reihe von Plasmiden kann verwendet werden, unter anderem Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden abstammen, wie z. B. pVL1393 (Novagen). Kurz gesagt wird das DcR3 oder der gewünschte Abschnitt des DcR3 (wie z. B. die Sequenz, die für eine extrazelluläre Domäne kodiert, z. B. die Aminosäuren 1 bis 215 aus 1 (Seq.-ID Nr. 1)) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die komplementär zu den 5'- und 3'-Regionen sind. Der 5'-Primer kann flankierende (ausgewählte). Restriktionsenzymstellen umfassen. Das Produkt wird anschließend mit jenen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch Co-Transfizieren des oben genannten Plasmids und der BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda(„Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) erzeugt. Nach 4–5 Tagen Inkubation bei 28°C werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet. Die virale Infektion und Proteinexpression wird durchgeführt, wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994), beschrieben.
Exprimiertes poly-his-markiertes DcR3 kann anschließend gereinigt werden, z. B. durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie, wie im Folgenden beschrieben. Extrakte werden aus rekombinanten virusinfizierten Sf9-Zellen hergestellt, wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993), beschrieben. Kurz gesagt werden Sf9-Zellen gewa schen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10% Glycerin; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zwei Mal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die Sonikate werden durch Zentrifugierung geklärt, und der Überstand wird 50fach in Ladungspuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch einen 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarose-Säule (im Handel bei Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml vorbereitet, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird auf die Säule bei 0,5 ml pro Minute geladen. Die Säule wird bis zur Grundlinien-A₂₈₀ mit Ladungspuffer gewaschen, jenem Zeitpunkt, zu dem die Fraktionensammlung beginnt. Als Nächstes wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der unspezifisch gebundenes Protein eluiert. Nachdem die A₂₈₀-Grundlinie erneut erreicht wurde, wird die Säule mit einem 0- bis 500-mM-Imidazol-Gradienten in dem sekundären Waschpuffer entwickelt. Ein-ml-Fraktionen werden gesammelt und mittels SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni² ⁺-NTA, konjugiert an alkalische Phosphatase (Qiagen), analysiert. Fraktionen, die das eluierte His₁₀-markierte DcR3 enthalten, werden gepoolt und gegen Ladungspuffer einer Dialyse unterzogen.
Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) DcR3 unter Verwendung bekannter Chromatographie-Verfahren durchgeführt werden, umfassend z. B. Protein-A- oder Protein-G-Säulen-Chromatographie.
BEISPIEL 8
Herstellung von Antikörpern, die DcR3 binden
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper, die DcR3 spezifisch binden können.
Verfahren zur Produktion der monoklonalen Antikörper sind nach dem Stand der Technik bekannt und werden z. B. in Goding, s. o., beschrieben. Immunogene, die verwendet werden können, umfassen gereinigtes DcR3, Fusionsproteine, die DcR3 enthalten, sowie Zellen, die rekombinantes DcR3 auf der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogens kann durch den Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren erfolgen.
Mäuse, wie z. B. Balb/c-Mäuse, werden mit dem DcR3-Immunogen, emulgiert in vollständigem Freund-Adjuvans und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1–100 Mikrogramm injiziiert, immunisiert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in den Ballen der Hinterpfoten des Tiers injiziert. Die immunisierten Mäuse erhalten anschließend 10 bis 12 Tage später eine Boosterdosis mit zusätzlichem Immunogen, emulgiert in dem ausgewählten Adjuvans. Danach können die Mäuse für eine Zeitspanne von mehreren Wochen auch mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können von den Mäusen periodisch durch retroorbitale Blutabnahme zum Testen in ELISA-Tests erhalten werden, um DcR3-Antikörper zu detektieren.
Nachdem ein geeigneter Antikörper-Titer detektiert wurde, können die Tiere, die auf Antikörper „positiv" getestet wurden, eine finale intravenöse Injektion von DcR3 erhalten. Drei bis vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen entnommen. Die Milzzellen werden anschließend (unter Verwendung von 35% Polyethylenglykol) an eine ausgewählte murine Myelom-Zelllinie, wie z. B. P3X63AgU.1, erhältlich bei ATCC, Nr. CRL 1597, fusioniert. Die Fusionen erzeugen Hybridom-Zellen, die anschließend in 96-Well-Gewebekulturplatten, enthaltend HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) ausplattiert werden können, um die Proliferation nicht-fusionierter Zellen, von Myelom-Hybriden und von Milzzellen-Hybriden zu inhibieren.
Die Hybridom-Zellen werden in einem ELISA-Test auf Reaktivität gegen DcR3 gescreent. Die Bestimmung „positiver" Hybridom-Zellen, weiche die gewünschten monoklonalen Antikörper gegen DcR3 sekretieren, ist nach dem Stand der Technik bekannt.
Die positiven Hybridom-Zellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Ascites zu erhalten, welche die monoklonalen Anti-DcR3-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridom-Zellen in Gewebekulturflaschen oder Rollerflaschen gezüchtet werden. Die Reinigung der monoklonalen Antikörper, die in den Ascites produziert wurden, kann unter Verwendung der Ammoniumsulfat-Präzipitation gefolgt von einer Gel-Ausschlusschromatographie erreicht werden. Alternativ dazu kann eine Affinitätschromatographie, basierend auf der Bindung der Antikörper an Protein A oder Protein G, verwendet werden.
BEISPIEL 9
In-vitro-Tests zur Bestimmung der Wechselwirkung von DcR3 mit Fas-Ligand
A. FACS-Analyse
Es wurde ein Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob DcR3 an 293-Zellen bindet, die vorübergehend mit einzelnen Liganden der TNF-Familie transfiziert sind. Menschliche 293-Zellen (ATCC CRL 1573) wurden vorübergehend mit leerem pRK5-Vektor (siehe Beispiel 5) oder pRK5, kodierend für TNF-α voller Länge [Pennica et al., Nature 312, 724–729 (1984)], mit Fas-Ligand [Suds et al., Cell 75, 1169–1178 (1993)], LIGHT [Mauri et al., Immunity 8, 21 (1998)], Apo-2-Ligand [ WO 97/25428 , veröffentlicht am 17. Juli 1997], Apo-3-Ligand (auch als TWEAK bezeichnet) [Marsters et al., Current Biology 8, 525 (1998); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem. 272, 32401 (1997)] oder OPG (auch als TRANCE, RANKL bezeichnet) [Wong et al., J. Biol. Chem. 272, 25190 (1997); Anderson et al., Nature 390, 175 (1997); Lacey et al., Cell 93, 165 (1998)] transfiziert. Anschließend wurden die Zellen 1 Stunde lang bei 37°C mit einem rekombinanten biotinylierten Fc-markierten DcR3 (exprimiert, wie in Beispiel 7 oben stehend beschrieben, und durch Protein-A-Chromatographie gereinigt [Ashkenazi et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 8, 104 (1995)]), einer Fc-markierten Ectodomäne von TNFR1 (Kontrolle) oder PBS-Puffer (Kontrolle) inkubiert. Die Zellen wurden weiters 30 Minuten lang bei 37°C mit phy coerythrin-konjugiertem Streptavidin (Gibco BRL) inkubiert und anschließend mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) analysiert.
Die Resultate zeigten, dass DcR3 spezifisch an Fas-Ligand-transfizierte Zellen band, jedoch nicht an Zellen, die mit TNF-α transfiziert wurden (siehe 8A). DcR3 zeigte auch eine signifikante Bindung an LIGHT, band jedoch nicht an Apo-2-Ligand, Apo-3-Ligand oder OPG (Daten nicht dargestellt).
B. Co-Immunpräzipitationstest
Ein Co-Immunpräzipitationstest wurde ebenfalls durchgeführt, um zu bestimmen, ob DcR3 an einen löslichen Fas-Liganden bindet.
Gereinigter, löslicher Fas-Ligand (Alexis Biochemicals) (1 Mikrogramm) wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit dem Fc-markierten DcR3 (oben stehend beschrieben), TNFR1 oder Fas-Ectodomäne (5 Mikrogramm) inkubiert und mit Protein-A-Sepharose (Repligen) immunpräzipitiert. Präzipitate wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (4–20% Gradient) unter reduzierenden Bedingungen (25 mM Dithiothreit) aufgelöst und durch Immunblot sichtbar gemacht, gefolgt von einer verstärkten Chemilumineszenz-Detektion (Amersham) mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Fas-Ligand-Antikörper (Oncogene Research Products) bei 2 Mikrogramm/ml. Der lösliche Fas-Ligand selbst wurde zum Vergleich auch direkt geladen.
Die Resultate werden in 8B gezeigt. Das Fc-markierte DcR3 band an den gereinigten löslichen Fas-Liganden, wie dies auch bei Fc-markiertem Fas der Fall war, jedoch nicht bei TNFR1. Die Resultate zeigen, dass DcR3 ein weiteres Mitglied der TNFR-Familie ist (neben Fas), das an Fas-Ligand binden kann.
BEISPIEL 10
In-vitro-Tests zur Bestimmung der Fähigkeit von DcR3, die Fas-Ligand-Aktivität zu inhibieren
A. Inhibierung der Apoptose-Induktion durch transfizierten Fas-Liganden
Die Wirkung von DcR3 auf die Apoptose-Induktion durch vorübergehende Transfektion von Fas-Ligand voller Länge in HeLa-Zellen, die Fas exprimieren, wurde untersucht.
Menschliche HeLa-S3-Zellen (ATCC CCL 22) wurden vorübergehend mit pRK5 (siehe Beispiel 5) oder mit pRK5-kodierendem Fas-Liganden voller Länge [Suds et al., s. o.] (1 Mikrogramm/10⁶ Zellen) transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden bei 37°C/5% CO₂ in der Gegenwart von PBS-Puffer, Fc-markiertem TNFR1, Fc-markiertem Fas oder Fc-markiertem DcR3 (siehe Beispiel 9) (50 Mikrogramm/ml) 18 Stunden lang inkubiert. Apoptose wurde anschließend mittels FACS zur Bestimmung der Annexin-Bindung analysiert, wie zuvor von Marsters et al., Curr. Biol. 6, 1669–1676 (1996), beschrieben.
Die Resultate sind in 9A dargestellt. Die Daten sind Mittelwerte ±SEM von Dreifachversuchen. Der Fas-Ligand induzierte Apoptose in etwa 25% der HeLa-Zellen. Das Fc-markierte Fas oder Fc-markiertes DcR3 inhibierte diese Wirkung signifikant, wohingegen das Fc-markierte TNFR1 dies nicht tat.
B. Inhibierung von T-Zellen-AICD
Es wurde ein Test durchgeführt, um die Wirkung von DcR3 auf T-Zellen-AICD zu untersuchen, was die Funktion von endogenem Fas-Liganden umfasst (siehe Nagata, s. o.).
CD3+-Lymphozyten wurden aus peripherem Blut einzelner menschlicher Spender soliert, 24 Stunden lang mit Phytohämagglutinin stimuliert (2 Mikrogramm/ml) und in Gegenwart von IL-2 (100 U/ml) 5 Tage lang gezüchtet (wie zuvor von Marsters et al., Curr. Biol., 5.0. (1996), beschrieben). Anschließend wurden die Zellen in Wells ausplattiert, die mit PBS-Puffer oder Anti-CD3-Antikörper beschichtet waren (Ortho Pharmaceuticals), und in Gegenwart von PBS-Puffer, Kontroll-IgG, Fc-markiertem Fas oder Fc-markiertem DcR3 (10 Mikrogramm/ml) bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach 18 Stunden wurde die Apoptose von CD4+-Zellen mittels FACS bestimmt, wie in Abschnitt A oben stehend beschrieben wurde.
Die Resultate werden in 9B dargestellt. Die Daten sind Mittelwerte ±SEM von Resultaten von 5 Spendern. Die TCR-Verbindung mit Anti-CD3-Antikörper steigerte das Ausmaß der Apoptose in IL-2-stimulierten CD4+-T-Zellen um etwa das Zweifache. Siehe 9B. In Einklang mit vorhergehenden Berichten [Dhein et al., Nature 373, 438 (1995)] blockierte Fc-markierter Fas diese Wirkung in wesentlichem Ausmaß, wohingegen Fc-markiertes DcR3 die Induktion von Apoptose in einem ähnlichen Ausmaß blockierte.
C. Inhibierung von Jurkat-Zell-Abtötung durch NK-Zellen
Es wurde ein Test durchgeführt, um die Wirkung von DcR3 auf das Abtöten von Fasexprimierenden Target-Zellen durch Peripherblut-NK-Zellen zu untersuchen, ein Prozess, der die Fas-Liganden-Funktion involviert [Arase et al., J. Exp. Med. 181, 1235 (1995); Medvedev et al., Cytokine 9, 394 (1997)].
NK-Zellen wurden aus peripherem Blut einzelner Spender durch Anreicherung mit magnetischen Anti-CD56-Mikroperlen (Myltenyi Biotech) hergestellt und 24 Stunden lang mit ⁵¹Cr-beladenen Jurkat-T-Leukämie-Zellen in einem Effektor-Target-Verhältnis von 1:1 und 1:5 in der Gegenwart von PBS-Puffer, Kontroll-IgG oder Fc-markiertem Fas oder Fc-markiertem DcR3 (10 Mikrogramm/ml) in RPMI-1640/10-%-FBS-Medium bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Das Ausmaß des Target-Zellen-Tods wurde anschließend durch Messung der ⁵¹Cr-Freisetzung in Effektor-Target-Co-Kulturen im Verhältnis zur ⁵¹Cr-Freisetzung mittels Detergens-Lyse äquivalenter Anzahlen von Jurkat-Zellen bestimmt.
Die Resultate sind in 9C dargestellt. Die Daten sind Mittelwerte ±SEM von 2 Spendern, jeweils in Dreifachversuchen getestet. NK-Zellen lösten einen signifikanten Zelltod in Jurkat-T-Zellen aus. Der Fc-markierte Fas und DcR3 inhibierten die Targetzellen-Abtötung wesentlich, wohingegen das Kontroll-IgG dies nicht tat. Die Resultate zeigen, dass die Bindung von DcR3 die Fas-Liganden-Aktivität inhibiert.
BEISPIEL 12
Chromosomenkartierung
Die Chromosomenlokalisierung des menschlichen DcR3-Gens wurde durch Strahlungs-Hybrid-(RH-)Panel-Analyse untersucht. Die RH-Kartierung wurde mittels PCR unter Verwendung eines Mensch-Maus-Zell-Strahlungs-Hybrid-Panels (Research Genetics) und Primern, die auf der kodierenden Region der DcR3-cDNA basieren, durchgeführt [Gelb et al., Hum. Genet. 98, 141 (1996)]. Eine Analyse der PCR-Daten unter Verwendung der Stanford-Human-Genome-Center-Datenbank zeigt, dass DcR3 mit dem Marker AFM218xe7 mit einem LOD-Wert von 5,4 verbunden ist und an die distale Bande des langen Arms des menschlichen Chromosoms 20 (20q13) kartiert.
BEISPIEL 13
Gen-Amplifikationstest
Dieses Beispiel zeigt, dass das für DcR3 kodierende Gen im Genom von Lungen- und Kolon-Krebsarten amplifiziert wird. Die Amplifikation ist mit der Überexpression des Genprodukts assoziiert, was zeigt, dass das DcR3-Polypeptid ein nützliches Target für eine therapeutische Intervention bei gewissen Krebsarten ist. Solche therapeutischen Mittel können die Form von Antagonisten von DcR3-kodierenden Ge nen annehmen, z. B. murin-menschliche chimäre, humanisierte oder menschliche Antikörper gegen DcR3.
Das Ausgangsmaterial für das Screening war genomische DNA, die (unter Verwendung von Qiagen-Reagenzien) aus primärem Tumorgewebe von Lungen- und Kolon-Krebsarten und -Tumorzelllinien isoliert wurde. Die DNA wurde fluorometrisch unter Verwendung von Hoechst-Farbstoff-33258-Interkalationsfluorimetrie quantifiziert. Als Normalisierungskontrolle wurde DNA aus Peripherblut-Leukozyten von 10 normalen gesunden Individuen isoliert, die gepoolt und als Testkontrolle für die Genkopie bei gesunden Individuen („NorHu") verwendet wurde.
Der 5'-Nuclease-Test (TaqMan^TM) und die quantitative Echtzeit-PCR (Gelmini et al., Clin. Chem. 43, 752–758 (1997); ABI-Prizm-7700-Sequenzdetektionssystem^TM, Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) wurden verwendet, um die relative DcR3-Genkopien-Anzahl in jedem zu bestimmen sowie um zu bestimmen, ob die DNA, die für DcR3 kodiert, in einer der gescreenten Lungen- und Kolon-Krebsarten überrepräsentiert ist. Die primären, operativen Lungentumor-Proben wurden von der University of Iowa bereitgestellt, und die primären Kolontumor-Proben wurden von der University of Leeds bereitgestellt. Die Gruppe an Lungentumor-Geweben umfasste 8 Adenokarzinome, 7 Plattenepithelkarzinome, 1 nicht-kleinzelliges Karzinom, 1 kleinzelliges Karzinom und 1 Bronchialadenokarzinom. Die Gruppe an Kolontumor-Geweben umfasste 17 Adenokarzinome. Die Krebszellenlinien wurden von der ATCC erhalten: SW480-Kolon-Adenokarzinom (ATCC CCL 228); COLO320DM-Adenokarzinom (ATCC CCL 220); SK-CO-1-Adenokarzinom (ATCC HTB 39); SW403-Adenokarzinom (ATCC CCL 230); und HT29-Kolon-Adenokarzinom.
Die Resultate werden als relative Genkopien-Anzahlen angegeben, wie aus den ΔCt-Einheiten bestimmt wird. Eine ΔCt-Einheit entspricht 1 PCR-Zyklus oder etwa einer 2fachen Amplifikation im Verhältnis zum Normalwert; zwei Einheiten entsprechen dem 4fachen Wert; 3 Einheiten entsprechen dem 6fachen Wert etc. Eine Quantifizie rung wurde unter Verwendung von Primern und einer fluoreszierenden TaqMan^TM-Sonde erhalten, die von dem für DcR3 kodierenden Gen abstammt. Regionen von DcR3, die mit höchster Wahrscheinlichkeit einzigartige Nucleinsäuresequenzen enthalten und die mit niedrigster Wahrscheinlichkeit ausgespleißte Introns aufweisen, werden für die Primer-Ableitung bevorzugt, z. B. die untranslatierte 3'-Region. Die Sequenzen für die Primer und Sonden, die für die DcR3-Gen-Amplifikation verwendet werden, sind Folgende:
Die 5'-Nuclease-Test-Reaktion ist ein auf fluoreszierender PCR basierendes Verfahren, das die 5'-Exonuclease-Aktivität von Taq-DNA-Polymerase-Enzym verwendet, um die Amplifikation in Echtzeit zu beobachten. Zwei Oligonucleotid-Primer werden verwendet, um ein Amplicon zu erzeugen, das typisch für eine PCR-Reaktion ist. Ein drittes Oligonucleotid oder eine Sonde wird geschaffen, um eine Nucleotidsequenz zu detektieren, die sich zwischen den zwei PCR-Primern befindet. Die Sonde ist durch das Taq-DNA-Polymerase-Enzym nicht verlängerbar und ist mit einem fluoreszierenden Reporter-Farbstoff und einem fluoreszierenden Quencher-Farbstoff markiert. Eine beliebige Laser-induzierte Emission des Reporter-Farbstoffs wird durch den quenchenden Farbstoff gequencht, wenn die zwei Farbstoffe eng bei einander positioniert sind, wie dies auf der Sonde der Fall ist. Während der Amplifikationsreaktion wird die Sonde vom Taq-DNA-Polymerase-Enzym auf eine Matrizen-abhängige Art und Weise gespalten. Die resultierenden Sonden-Fragmente dissoziieren in Lösung, und das Signal vom Freisetzungs-Reporter-Farbstoff ist frei von der quenchenden Wirkung des zweiten Fluorophors. Ein Molekül des Reporter-Farbstoffs wird für jedes neue synthetisierte Molekül freigesetzt, und die Detektion des ungequenchten Reporter-Farbstoffs stellt die Basis für die quantitative Interpretation der Daten bereit.
Das 5'-Nuclease-Verfahren wird auf einer quantitativen Echtzeit-PCR-Vorrichtung laufen gelassen, wie jener des ABI-Prizm-7700^TM-Sequenzdetektionssystems. Das System besteht aus einem Thermocycler, einem Laser, einer ladungsgekoppelten Kamera (CCD-Kamera) und einem Computer. Das System amplifiziert Proben in einem 96-Well-Format auf einem Thermocycler. Während der Amplifikation wird ein laserinduziertes Fluoreszenz-Signal in Echtzeit durch Glasfaserkabel für alle 96 Wells gesammelt und an der CCD detektiert. Das System umfasst Software für das Betreiben des Instruments und das Analysieren der Daten.
5'-Nuclease-Test-Daten werden anfänglich als Ct oder als der Schwellenwert-Zyklus ausgedrückt. Dies ist als der Zyklus definiert, bei dem es zu einer Akkumulation des Reportersignals über dem Hintergrund-Niveau der Fluoreszenz kommt. Die Ct-Werte werden als quantitative Messungen der relativen Anzahl an Ausgangskopien einer bestimmten Targetsequenz in einer Nucleinsäureprobe verwendet.
Die Resultate werden in 10 dargestellt. Acht der 18 Lungentumoren und 9 der 17 Kolontumoren zeigten eine genomische Amplifikation von DcR3, die vom 2- bis zum 18fachen Wert reichte (siehe 10). Um das Resultat zu verifizieren, wurden die Kolontumor-DNAs mittels quantitativer PCR mit 3 zusätzlichen unabhängigen Gruppen von DcR3-basierten Primern und Sonden analysiert. Es wurde im Wesentlichen dieselbe Amplifikation beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Die Genamplifikationsanalyse der menschlichen Kolontumor-Zelllinien zeigte, dass 3 von 5 Zelllinien eine signifikante genomische Amplifikation von DcR3 zeigten ( 10), und zwar in Einklang mit der Amplifikation von DcR3 in den primären Tumorgeweben.
Das Ausmaß der Amplifikation der DcR3-flankierenden Regionen wurde ebenfalls analysiert. Ein menschlicher genomischer Klon, der DcR3 trägt, wurde aus einer bakteriellen künstlichen Chromosomen-(BAC-)Bibliothek (Genome Systems) isoliert. Die Amplifikation der flankierenden Regionen aus den BAC (68374rev und 68374fwd) wurde bestimmt, zusammen mit dem Ausmaß der Amplifikation der zwei nächsten erhältlichen genomischen Marker, AFM218xe7 (T160) und SHGC-36268 (T159) (das etwa 500 kb von AFM218xe7 kartiert), in der Kolontumor-Gruppe.
DcR3 zeigte die höchste Amplifikation, gefolgt von 68374rev, anschließend von 68374fwd und T160, welcher etwa dasselbe Ausmaß der Amplifikation zeigte, wohingegen T159 keine Amplifikation aufwies (10). Die Resultate zeigen, dass DcR3 sich im Epizentrum einer Chromosom-20-Region befinden kann, die bei Krebs amplifiziert wird, was in Einklang mit der Möglichkeit ist, dass DcR3 das Tumorüberleben fördern kann.
BEISPIEL 14
Gemischter Lymphozyten-Reaktions-(MLR-)Test zur Bestimmung der Inhibierungsaktivität durch DcR3
MLR-Tests wurden durchgeführt, um die CD4+-T-Lymphozyten-Funktion zu bestimmen, und zwar durch Testen der Fähigkeit von T-Lymphozyten, sich in Reaktion auf die Präsentation von Allo-Antigen zu vermehren. In dem „Einbahn"-MLR-Test wird die Spenderpopulation peripherer einkerniger Blutzellen (PBMCs) einem Immunitätstest mit einer bestrahlten Stimulatorpopulation an PBMCs unterzogen. MLR-Arbeitsvorschriften werden in Coligan et al., Current Protocols in Immunology, veröffentlicht von John Wiley & Sons, Inc. (1994), beschrieben. Die Testresultate identifizieren schließlich die Moleküle, welche die Proliferation der Responder-T-Lymphozyten in Reaktion auf die Stimulierung mit dem präsentierten Allo-Antigen entweder verstärken oder inhibieren können.
A. MLR-Test menschlicher PBMCs
PBMCs wurden aus zwei menschlichen Spendern unter Verwendung von Standard-Leukophorese-Verfahren isoliert. Ein Spender wird verwendet, um die Stimulator-PBMCs bereitzustellen, und die anderen Spenderzellen werden verwendet, um die Responder-PBMCs bereitzustellen. Die jeweiligen Zellpräparate wurden anschlie ßend in 50% fötalem Rinderserum und 50% DMSO gefroren, bis der Test durchgeführt wurde.
Anschließend wurden die Zellen über Nacht in Testmedium bei 37°C/5% CO₂ aufgetaut. Das Testmedium enthielt RPMI-Medium; 10% fötales Rinderserum; 1% Penicillin/Streptomycin; 1% Glutamin; 1% HEPES; 1% nicht-essentielle Aminosäuren und 1% Pyruvat. Nach dem Waschen wurden die Zellen in Testmedium bis auf eine Konzentration von 3 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die Spenderzellen, die als Stimulatorzellen verwendet wurden, wurden mit etwa 3000 Rad bestrahlt.
Die PBMC-Zellen wurden (in dreifacher Ausfertigung) folgendermaßen in Kulturplatten-Wells ausplattiert: 100 Mikroliter Testprobe (Fc-markiertes DcR3, beschrieben in Beispiel 9 oben stehend, verwendet in Konzentrationen von 2, 40, 1000 und 25.000 ng/ml, wie durch die O. D. bestimmt), verdünnt auf 1% oder auf 0,1%; 50 Mikroliter bestrahlte Stimulator-Zellen; 50 Mikroliter Responder-PBMC-Zellen. 100 Mikroliter an Zellkulturmedium oder 100 Mikroliter an CD4-IgG wurden als Kontrolle verwendet. Die Kulturplatten wurden anschließend 4 Tage lang bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. An Tag 5 wurde jeder Well mit tritiiertem Thymidin (1 Mikro-Curie/Well; Amersham) gepulst. Nach 6 Stunden wurden die Zellen 3-mal gewaschen und mittels Szintillationszählung bezüglich der Aufnahme der Markierung evaluiert.
Die Resultate werden in 11A dargestellt. Die Daten in 11A zeigen, dass es eine dosisabhängige inhibierende Wirkung von DcR3-IgG auf die Antwort von T-Lymphozyten in der menschlichen MLR gibt. Als das Ausmaß von DcR3-IgG von 2 ng/ml auf 25.000 ng/ml im Reaktionsmedium erhöht wurde, gab es eine signifikante Reduktion in der T-Lymphozytenproliferation, wie durch die reduzierte Aufnahme der tritiierten Thymidinmarkierung gezeigt wird, als DcR3-IgG entweder bei 40, 1000 oder 25.000 ng/ml hinzugefügt wurde. Diese Inhibierung der MLR war dosisabhängig und war signifikant im Vergleich zu einer positiven Kontrolle und zu der Wirkung eines Kontroll-IgG-Fusionsproteins (CD4-IgG), das keine Wirkung auf die MLR zeigte.
B. MLR-Test muriner PBMCs
PBMCs wurden aus der Milz von zwei verschiedenen Mäusestämmen, Balb/c und C57B6, isoliert. Die Zellen wurden aus der frisch entnommenen Milz abgelöst und in Testmedien platziert (wie oben stehend in Abschnitt A beschrieben). Die PBMCs wurden anschließend durch Überlagern der Zellen auf Lympholyt-M^TM (Organon Teknika) isoliert und bei 2000 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert. Die Schicht aus einkernigen Zellen wurde gesammelt und in Testmedium gewaschen und in Testmedium bis auf eine Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Ein Spender wurde verwendet, um die Stimulator-PBMCs bereitzustellen, und die anderen Spenderzellen wurden verwendet, um die Responder-PBMCs bereitzustellen.
Die Spenderzellen, die als Stimulatorzellen verwendet wurden, wurden mit etwa 3000 Rad bestrahlt. Die PBMC-Zellen wurden (in dreifacher Ausfertigung) folgendermaßen in Kulturplatten-Wells ausplattiert: 100 Mikroliter Testprobe (Fc-markiertes DcR3, verwendet in Konzentrationen von 25, 250, 2500 und 25.000 ng/ml, wie durch die O. D. bestimmt), verdünnt auf 1% oder auf 0,1%; 50 Mikroliter bestrahlte Stimulator-Zellen; 50 Mikroliter Responder-PBMC-Zellen. 100 Mikroliter an Zellkulturmedium oder 100 Mikroliter an CD4-IgG wurden als Kontrolle verwendet. Die Kulturplatten wurden anschließend 4 Tage lang bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. An Tag 5 wurde jeder Well mit tritiiertem Thymidin (1 Mikro-Curie/Well; Amersham) gepulst. Nach 6 Stunden wurden die Zellen 3-mal gewaschen und mittels Szintillationszählung bezüglich der Aufnahme der Markierung evaluiert.
Die Resultate werden in 11B dargestellt. Die Daten in 11B zeigen, dass es eine dosisabhängige inhibierende Wirkung von DcR3-IgG auf die Antwort von T-Lymphozyten in der murinen MLR gibt. Als das Ausmaß von DcR3-IgG von 25 ng/ml auf 25.000 ng/ml im Reaktionsmedium erhöht wurde, gab es eine signifikante Reduktion in der T-Lymphozytenproliferation, wie durch die reduzierte Aufnahme der tritiierten Thymidinmarkierung gezeigt wird. Diese Inhibierung der MLR war dosisabhängig und war signifikant im Vergleich zu einer positiven Kontrolle und zu der Wirkung eines Kontroll-IgG-Fusionsproteins (CD4-IgG), das keine Wirkung auf die MLR zeigte.
C. Co-Stimulationstest
PBLs wurden aus menschlichen Spendern unter Verwendung von Standard-Leukophorese-Verfahren isoliert. Die Zellpräparate wurden anschließend in 50% fötalem Rinderserum und 50% DMSO gefroren, bis der Test durchgeführt wurde.
Anschließend wurden die Zellen über Nacht in Testmedium bei 37°C/5% CO₂ aufgetaut. Das Testmedium enthielt RPMI-Medium; 10% fötales Rinderserum; 1% Penicillin/Streptomycin; 1% Glutamin; 10 mM HEPES und 50 Mikrogramm/ml Gentamycin. Nach dem Waschen wurden die Zellen in Testmedium resuspendiert und über Nacht bei 37°C/5% CO₂ inkubiert.
Um die Kulturplatten herzustellen, wurden 96-Well-Flachbodenplatten (Nunc) mit murinem Anti-Mensch-CD3-(zugekauft von Amac) oder murinem Anti-Mensch-CD28-(zugekauft von Biodesign) oder sowohl mit den Anti-CD3- als auch den Anti-CD28-Antikörpern beschichtet. Beide Antikörper wurden in Hyclone-D-PBS ohne Calcium und Magnesium verdünnt. Der Anti-CD3-Antikörper wurde in einer Konzentration von 10 ng/Well hinzugefügt, und der Anti-CD28-Antikörper wurde in einer Konzentration von 25 ng/Well in einem Gesamtvolumen von 100 Mikroliter/Well hinzugefügt. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C in PBS inkubiert.
Die beschichteten Platten wurden anschließend zwei Mal mit PBS gewaschen. Die gewaschenen PBLs wurden in Medium bis auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und zu den Platten bei 100 Mikroliter/Well hinzugefügt. Als Nächstes wurden 100 Mikroliter Testprobe (Fc-markiertes DcR3, in Konzentrationen von 25, 250, 2500 und 25.000 ng/ml verwendet, wie durch die O. D. bestimmt) oder eine Kontrolle zu jedem Well hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 200 Mikroliter in jedem Well zu ergeben. 100 Mikroliter Zellkulturmedium oder 100 Mikroliter CD4- IgG wurden als Kontrolle verwendet. Die Kulturplatten wurden anschließend 72 Stunden lang bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Anschließend wurde jeder Well mit tritiiertem Thymidin (1 Mikro-Curie/Well; Amersham) gepulst. Nach 6 Stunden wurden die Zellen 3-mal gewaschen und mittels Szintillationszählung bezüglich der Aufnahme der Markierung evaluiert.
Die Resultate werden in 11C dargestellt. Die Daten in 11C zeigen, dass es eine dosisabhängige inhibierende Wirkung von DcR3-IgG auf die Antwort von T-Lymphozyten in dem menschlichen Co-Stimulationstest gibt. Als das Ausmaß von DcR3-IgG von 25 ng/ml auf 25.000 ng/ml im Reaktionsmedium erhöht wurde, gab es eine signifikante Reduktion der T-Lymphozytenproliferation, wie durch die reduzierte Aufnahme der tritiierten Thymidinmarkierung gezeigt wird. Diese Inhibierung des menschlichen Co-Stimulationstests war dosisabhängig und war signifikant im Vergleich zu einer positiven Kontrolle und zu der Wirkung eines Kontroll-IgG-Fusionsproteins (CD4-IgG), das keine Wirkung auf den menschlichen Co-Stimulationstest zeigte.
BEISPIEL 15
Herstellung monoklonaler Antikörper für DcR3
Balb/c-Mäuse (erhalten von Charles River Laborstories) wurden durch Injektion von 0,5 μg/50 μl eines DcR3-Immunoadhäsin-Proteins (verdünnt in MPL-TDM-Adjuvans, zugekauft von Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) 11-mal im Intervall von 1 Wochentag in jeden Ballen der Hinterpfote immunisiert. Das DcR3-Immunoadhäsin-Protein wurde durch Fusion der Aminosäurereste 1-300 von DcR3 (1) an die Gelenk- und Fc-Region der menschlichen Immunglobulin-G₁-Schwerkette in pRK5 erzeugt, wie zuvor beschrieben [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10535–10539 (1991)]. Das Immunoadhäsin-Protein wurde in Insektenzellen exprimiert und durch Protein-A-Affinitätschromatographie gereinigt, wie von Ashkenazi et al., s. o., beschrieben.
Drei Tage nach der finalen Booster-Dosis wurden die Nodi lymphatici poplitei aus den Mäusen entfernt, und es wurde eine Einzelzellensuspension in DMEM-Medium (erhalten von Biowhitakker Corp.), ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin, hergestellt. Die Lymphknotenzellen wurden anschließend mit murinen Myelomzellen P3X63AgU.1 (ATCC CRL 1597) unter Verwendung von 35% Polyethylenglykol fusioniert und in 96-Well-Kulturplatten gezüchtet. Hybridome, die aus der Fusion resultierten, wurden in HAT-Medium selektiert. Zehn Tage nach der Fusion wurden die Hybridomkultur-Überstände in einem ELISA-Test gescreent, um auf die Gegenwart monoklonaler Antikörper zu testen, die an das DcR3-Immunoadhäsin-Protein oder an CD4-IgG-Protein binden.
In dem Einfang-ELISA wurden 96-Well-Mikrotiter-Platten (Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Dänemark) durch Hinzufügen von 50 μl 2-μg/ml-Ziegen-Anti-Mensch-IgG-Fc (zugekauft von Cappel Laborstories) in PBS zu jedem Well und Inkubieren bei 4°C über Nacht beschichtet. Die Platten wurden anschließend drei Mal mit Waschpuffer gewaschen (PBS, enthaltend 0,05% Tween 20). Die Wells in den Mikrotiterplatten wurden anschließend mit 200 μl 2,0% Rinderserumalbumin in PBS blockiert und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Anschließend wurden die Platten wiederum drei Mal mit Waschpuffer gewaschen.
Nach dem Waschschritt wurden 50 μl 0,4-μg/ml-DcR3-Immunoadhäsin-Protein (wie oben stehend beschrieben) in Testpuffer (PBS, enthaltend 0,5% BSA und 0,5% Tween 20) zu jedem Well hinzugefügt. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert, gefolgt von dreimaligem Waschen mit Waschpuffer.
Nach den Waschschritten wurden 100 μl der Hybridom-Überstände oder des gereinigten Antikörpers (unter Verwendung von Protein-G-Sepharose-Säulen) zu den bezeichneten Wells in Testpuffer hinzugefügt. 100 μl P3X63AgU.1-myelomzellkonditioniertes Medium wurde zu anderen bezeichneten Wells als Kontrolle hinzugefügt. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert und anschließend drei Mal mit Waschpuffer gewaschen.
Als Nächstes wurden 50 μl HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc (zugekauft von Cappel Laborstories), 1:1000 in Testpuffer verdünnt, zu jedem Well hinzugefügt, und die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Die Platten wurden drei Mal mit Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Addition von 50 μl Substrat (TMB-Mikrowell-Peroxidasesubstrat, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) zu jedem Well und der Inkubation bei Raumtemperatur für eine Zeitspanne von 10 Minuten. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 50 μl TMB-1-Komponenten-Stop-Lösung (Diethylglykol, Kirkegaard & Perry) zu jedem Well gestoppt, und die Extinktion bei 450 nm wurde in einem automatisierten Mikrotiterplatten-Lesegerät abgelesen.
Von den Hybridom-Überständen, die in dem ELISA-Test gescreent wurden, ergaben 17 Überstände ein positives Ergebnis (als etwa 4-mal über dem Hintergrund-Wert berechnet). Die ausgewählten Hybridome wurden in einem ELISA-Test (unten stehend beschrieben) auf ihre Fähigkeit, die Bindung von DcR3 an Fas-Ligand zu blockieren, getestet. Die potentiell blockierenden und nicht-blockierenden sekretierenden Hybridome wurden zwei Mal durch Grenzverdünnung kloniert.
BEISPIEL 16
ELISA-Test zur Bestimmung der Spezifität von DcR3-Antikörpern
Es wurde ein ELISA-Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob die in Beispiel 15 beschriebenen monoklonalen Antikörper in der Lage waren, andere bekannte Rezeptoren neben DcR3 zu binden. Genauer gesagt wurden die 4C4.1.4-; 11C5.2.8-; 8D3.1.5-; 5C4.14.7- bzw. 4B7.1.1-Antikörper auf die Bindung an das hierin beschriebene DcR3 und an DR4 [Pan et al., s. o.], DR5 [Sheridan et al., s. o., und Pan et al., s. o.], DcR1 [Sheridan et al., s. o.] und OPG [Simonet et al., s. o.] getestet. Der ELISA-Test wurde im Wesentlichen durchgeführt, wie in Beispiel 15 oben stehend beschrie ben. Die Antigen-Spezifität wurde unter Verwendung von 10 Mikrogramm/ml DcR3-Antikörper bestimmt.
Die Resultate werden in 12 dargestellt. Alle fünf der DcR3-Antikörper banden spezifisch an DcR3 (siehe auch 13). Keiner der fünf DcR3-Antikörper zeigte eine Kreuzreaktivität mit den anderen Rezeptoren in dem Test.
BEISPIEL 17
ELISA-Test zur Bestimmung der blockierenden Aktivität von DcR3-Antikörpern
In dem ELISA wurden 96-Well-Mikrotiter-Platten (Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Dänemark) durch Hinzufügen von 50 μl 2-μg/ml-Ziegen-Anti-Mensch-IgG-Fc (zugekauft von Cappel Laborstories) in Carbonatpuffer zu jedem Well und Inkubieren bei 4°C über Nacht beschichtet. Die Platten wurden anschließend drei Mal mit Waschpuffer gewaschen (PBS, enthaltend 0,05% Tween 20). Die Wells in den Mikrotiterplatten wurden anschließend mit 200 μl 2,0% Rinderserumalbumin in PBS blockiert und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Anschließend wurden die Platten wiederum drei Mal mit Waschpuffer gewaschen.
Nach dem Waschschritt wurden 100 μl 0,5-μg/ml-DcR3-Immunoadhäsin-Protein (wie oben stehend in Beispiel 15 beschrieben) oder Fas-IgG in Testpuffer (PBS, enthaltend 0,5% BSA und 0,5% Tween 20) zu jedem Well hinzugefügt. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert, gefolgt von dreimaligem Waschen mit Waschpuffer.
Nach den Waschschritten wurden 100 μl der gereinigten Antikörper 4C4.1.4; 11C5.2.8; 8D3.1.5; 5C4.14.7 oder 4B7.1.1 zu den bezeichneten Wells in Testpuffer hinzugefügt. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend drei Mal mit Waschpuffer gewaschen.
Als Nächstes wurden 100 μl Flag-markierter Fas-Ligand (Alexis Pharmaceuticals) (in einer Konzentration von 35 ng/ml) zu jedem Well hinzugefügt, und die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden drei Mal mit Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Addition von 100 μl HRP-Streptavidin (Zymed) in einer Verdünnung von 1:2000 zu den Wells für eine Inkubation mit einer Dauer von 1 Stunde. Die Platten wurden wiederum drei Mal mit Waschpuffer gewaschen. Als Nächstes wurden 50 μl TMB-Substrat (TMB-Mikrowell-Peroxidase-Substrat, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) zu jedem Well hinzugefügt, und es folgte eine Inkubation bei Raumtemperatur mit einer Dauer von 5 Minuten. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 50 μl TMB-1-Komponenten-Stop-Lösung (Diethylglykol, Kirkegaard & Perry) zu jedem Well gestoppt, und die Extinktion bei 450 nm wurde in einem automatisierten Mikrotiterplatten-Lesegerät abgelesen.
Die Resultate sind in 12 dargestellt. Der %-Wert der blockierenden Aktivität wurde bei 100fachem Überschuss von DcR3-Antikörper gegenüber Fas-Ligand bestimmt. Drei der Antikörper, 4B7.1.1; 11C5.2.8; und 5C4.14.7, zeigten eine signifikante blockierende Aktivität (siehe auch 14).
BEISPIEL 18
Antikörper-Isotypisierung
Der Isotyp der DcR3-Antikörper (wie oben stehend in den Beispielen 15–17 beschrieben) wurde durch Beschichten von Mikrotiterplatten mit isotypspezifischem Ziegen-Anti-Maus-Ig (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) über Nacht bei 4°C bestimmt. Die Platten wurden anschließend mit Waschpuffer gewaschen (wie in Beispiel 15 oben stehend beschrieben). Die Wells in den Mikrotiterplatten wurden anschließend mit 200 μl 2-%-Rinderserumalbumin (BSA) blockiert und bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert. Die Platten wurden erneut drei Mal mit Waschpuffer gewaschen. Als Nächstes wurden 100 μl Hybridom-Kultur-Überstand oder 5 μg/ml gereinigter Antikörper zu den genannten Wells hinzugefügt. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, und anschließend wurden 50 μl HRP-konjugiertes Ziegen- Anti-Maus-IgG (wie oben stehend in Beispiel 15 beschrieben) zu jedem Well hinzugefügt. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Das Ausmaß an HRP, das an die Platte band, wurde unter Verwendung von HRP-Substrat detektiert, wie oben stehend beschrieben.
Die Isotypisierungs-Analyse zeigte, dass die 8D3.1.5-; 11C5.2.8- und 4B7.1.1-Antikörper IgG1-Antikörper sind. Die Analyse zeigte auch, dass der 5C4.14.7-Antikörper ein IgG2b-Antikörper ist und dass der 4C4.1.4-Antikörper ein IgG2a-Antikörper ist.
Diese Resultate werden auch in 12 dargestellt.
Hinterlegung von Material

Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, USA (ATCC), hinterlegt:

Material	ATCC-Hinterlegungsnr.	Hinterlegungsdatum
DNA30942-1134	209254	16. Sept. 1997.
4C4.1.4	HB-12573	18. Sept. 1998.
5C4.14.7	HB-12574	18. Sept. 1998
11C5.2.8	HB-12572	18. Sept. 1998
8D3.1.5	HB-12571	18. Sept. 1998
4B7.1.1	HB-12575	18. Sept. 1998

Diese Hinterlegung erfolgte unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter fallenden Regelungen (Budapester Vertrag). Dies stellt den Erhalt einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für eine Zeitspanne von 30 Jahren ab dem Hinterlegungsdatum sicher. Die Hinterlegung wird von der ATCC unter den Bedingungen des Budapester Vertrags verfügbar gemacht und unterliegt einem Übereinkommen zwischen Genentech, Inc., und der ATCC, das bei der Ausstellung des einschlägigen US-Patents oder nach Offenlegung einer US- o der ausländischen Patentanmeldung für die Öffentlichkeit, welche auch immer zuerst erfolgt, permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Hinterlegungskultur für die Öffentlichkeit sicherstellt und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden sicherstellt, der vom Präsident des Patentamts der USA dazu nach 35 USC §122 sowie den dazugehörigen Bestimmungen (unter anderem 37 CFR § 1.14 mit besonderem Verweis auf 886 OG 638) berechtigt ist.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass, falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultur unter geeigneten Bedingungen absterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, die Materialien bei Benachrichtigung umgehend mit einem anderen desselben ersetzt werden. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als Lizenz zur Durchführung der Erfindung in Verstoß jener Rechte auszulegen, die unter der Genehmigung einer beliebigen Regierung in Einklang mit ihren Patentgesetzen verliehen werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierter Anti-DcR3-Antikörper, der (a) an ein DcR3-Polypeptid mit zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit Nativsequenz-DcR3-Polypeptid bindet, das die Aminosäurereste 1 bis 300 aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) umfasst, und (b) die Bindung von Fas-Ligand an das DcR3-Polypeptid aus (a) inhibiert.
Antikörper nach Anspruch 1, worin das DcR3-Polypeptid aus den Aminosäuren 1 bis 215 oder den Aminosäuren 1 bis 300 aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) besteht.
Antikörper nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der die inhibierende Wirkung des DcR3-Polypeptids nach Anspruch 1 auf die Fas-Liganden-Aktivität antagonisiert.
Antikörper nach Anspruch 3, worin die Fas-Liganden-Aktivität eine beliebige von Bindung an Fas, Induktion von Apoptose, Induktion von T-Zellen-AICD und Induktion von Zellabtötung durch NK-Zellen ist.
Antikörper nach Anspruch 4, worin die Fas-Liganden-Aktivität in der Induktion von Apoptose bei Krebszellen besteht.
Antikörper nach Anspruch 5, worin die Krebszellen Kolonkrebszellen oder Lungenkrebszellen sind.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 7, worin der Antikörper ein isolierter menschlicher Antikörper ist.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Antikörper ein Fab-Fragment umfasst.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Antikörper ein einwertiger Antikörper ist.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Antikörper in einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert wird, die aus der aus einer CHO-Zelle, einer Affen-COS-Zelle oder einer Myelom-Zelle bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Hybridom-Zelllinie, die einen Antikörper nach Anspruch 8 produziert.
Hybridom-Zelle nach Anspruch 13, die (i) die Hybridom-Zelllinie 4C4.1.4, hinterlegt unter der ATCC-Zugriffsnr. HB-12573; (ii) die Hybridom-Zelllinie 5C4.14.7, hinterlegt unter der ATCC-Zugriffsnr. HB-12574; (iii) die Hybridom-Zelllinie 11C5.2.8, hinterlegt unter der ATCC-Zugriffsnr. HB-12572; (iv) die Hybridom-Zelllinie 8D3.1.5, hinterlegt unter der ATCC-Zugriffsnr. HB-12571; oder (v) die Hybridom-Zelllinie 4B7.1.1, hinterlegt unter der ATCC-Zugriffsnr. HB-12575; ist.
Isolierter Anti-DcR3-Antikörper nach Anspruch 1, der ein monoklonaler Antikörper ist, der von einer der Hybridom-Zelllinien nach Anspruch 14 produziert ist.
Anti-DcR3-Antikörper nach Anspruch 1, der an dasselbe DcR3-Polypeptid-Epitop bindet wie das Epitop, das von einem der monoklonalen Antikörper nach Anspruch 15 gebunden wird.
Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12, 15 oder 16 sowie einen Träger.
Fabrikat, umfassend einen Behälter und eine im Behälter enthaltene Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12, 15 oder 16 umfasst.
Fabrikat nach Anspruch 18, weiters umfassend Anleitungen zur Verwendung des DcR3-Antikörpers in vivo oder ex vivo.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12, 15 oder 16 oder Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur therapeutischen Verwendung.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 12, 15 oder 16 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 17 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
Verwendung nach Anspruch 21, worin ein DcR3-Gen in den Krebszellen amplifiziert wird.
Verwendung nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, worin der Krebs Lungenkrebs oder Kolonkrebs ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 23, worin die Krebszellen auch Chemotherapie oder Strahlentherapie unterzogen werden.
Verwendung eines DcR3-Polypeptids wie in Anspruch 1 (a) definiert bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Inhibierung von Fas-Liganden-Aktivität.
Verwendung nach Anspruch 25, worin die Fas-Liganden-Aktivität von Fas-Liganden induzierte Apoptose ist.
Verwendung eines DcR3-Polypeptids wie in Anspruch 1 (a) definiert bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Inhibierung einer durch T-Zellen vermittelten Immunantwort.
In-vitro-Verfahren zum Detektieren oder Diagnostizieren von Krebs bei einem Säugetier, umfassend die Analyse von Säugetierzellen bezüglich der Amplifikation eines DcR3-Gens.