DD154022A5 - Verfahren zur herstellung von menschlichem pre-wachstumshormon - Google Patents

Abstract

Eine DNS mit einer Basensequenz, die menschliches Wachstumshormon codiert, wurde kloniert und neue Rekombinant-DNS-Transfervektoren die die klonierte DNS enthielten, wurden aufgebaut. Man erhielt neue Mikroorganismen, die durch die genannten Rekombinant-Transfervektoren transformiert wurden. Ein gewisser Anteil der transformierten Mikroorganismen ist in der Lage, die klonierte DNS auszudruecken durch Synthetisieren eines Proteins, das menschliches Pre-Wachstumshormon umfasst.

Description

Verfahren zur Herstellung von menschlichem Pre-Wachstumshormon

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein isoliertes und gereinigtes (nachfolgend als "kloniert" bezeichnet) menschliches Gen zur Kodierung von Wachstumshormonen, einschließlich eines Teiles seiner Pre-Sequenz, ein Verfahren zur Isolierung und [Reinigung des Gens und ein Verfahren zur Übertragung des Gens auf und Replizieren des Gens in einen Mikroorganismus. Das klonierte Gen wird weiterentwickelt durch einen Wirts-Mikroorganismusj wenn es mit einem procaroytischen Gen vereinigt wird, das in einem Wirt ff weiterentwickelbar ist. Das Gen ist bei der Herstellung von menschlichem Wachstumshormon für therapeutische Zwecke einsetzbar.

Bekannte technischeJLösungeη

Wachstumshormon wird prinzipiell durch den Hypophysenvorderlappen produziert. Das Hormon wird normalerweise über die gesamte Lebenszeit produziert, die höchsten Mengen jedoch während der Kindheit. Obgleich der Herstellungsmechanismus noch nicht im Detail verstanden wird, ist das Wachstumshormon dafür bekannt, Glukose und den FettStoffwechsel zu beeinflussen und die Proteinsynthese zu beschleunigen.

Es sind eine Vielzahl von klinischen Störungen bekannt, die mit dem Wachstumshormonmangel einhergehen. Schwerwiegende Fälle von Zwergwuchs sind überall mit menschlichem Wachstumshormon behandelt worden, das aus Leichen isoliert wurde. Da die meisten Wachstumshormone von Nicht-Primaten beim Menschen nichi; wirksam sind, gibt es keine alternative Quelle. Die Materialmenge ist sehr gering, und die Isolierung

57 593 12

und Reinigung ist umfangreich und kostspielig. Pro Jahr und Patient werden die Kosten auf ca. 5 000,00 U$ geschätzt. Die Behandlung des Wachstumshormonmangels wurde daher auf die schv/erwiegenauen Pälle beschränkt· Pur mehr als 1000 neue Patienten im Jahr ist eine Behandlung erforderlich. Wenn eine ausreichende Menge an Hormon zu annehmbaren Kosten erhältlich wäre, könnten zusätzlich schätzungsweise 10 000 Patienten mit weniger schweren Wachstumsmangelerscheinungen oder mit irgendwelchen anderen Wachstumsproblemen behandelt werden.

Zusätzlich ist durch Experimente belegt, daß menschliches Wachstumshormon für die Behandlung von Magen-Darm-Blutungen, für Knochenbruch- und -Wundheilprozesse sowie Knochenstoffwechselkrankheiten nützlich ist.

Bas Wachstumshormon ist ein Protein. Die durch konventionelle Verfahren bestimmte Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Die chemische Synthese dieser Sequenz von 191 Aminosäuren ist durch die bekannten Techniken nicht durchführbar. In der Hypophyse wird das auslösende biosynthetische Produkt als Pre-Wachstumshormon bezeichnet und enthält zusätzlich zu der in Tabelle 1 aufgeführten Sequenz eine Sequenz mit 26 Aminosäuren, die als Signalpeptid bezeichnet wird und am Aminoterminalende angesetzt ist. Die Signalpeptidsequenz ist:

-26 -20 -15

KHg-Met-Ala-Thr-Gly-Ser-Arg-Thr-Ser-Leu-Leu-Ieu-Aia-Phe-Gly-

-10 -5 -1

Leu-Leu-Cys-Ieu-Pro-Trp-Leu-Gln-Glu-Ala-Val-Pro.

Das Signalpeptid mit 26 Aminosäuren hat die Aufgabe, durch Verleihen der.Fähigkeit in die Zellenmembran einzudringen und sie zu durchdringen, die Abscheidung des Proteins aus

57 593 12

der Zelle, in der es synthetisiert wurde, zu ermöglichen (siehe Blobel, G. et al. J. Cell. Biol. 62, 835 (1975).)

Verschiedene Stufen von Signalpeptiden sind dafür bekannt, daß sie eucaryotische Proteine durch die Membranbarrieren hindurch transportieren· In einem zellfreien System wurde ein spezifisches Spaltenzym beobachtetj das die Peptidbindung zwischen dem Signalpeptid und dem aktiven Protein in Verbindung mit dem Passieren der Zellmembran hydrolysiert (siehe Blobel, G. et al«, Proc. Nat. Acad. Ca« USA 75, 361 (1978).

Fortschritte der Biochemie und bei der BNS-Rekombinationstechnologie in jüngster Zeit haben es ermöglicht, die Synthese spezifischer Proteine unter kontrollierten Bedingungen durchsufuhren, unabhängig von einem höheren Organismus, aus dem sie sonst normalerweise isoliert wurden. Derartige biochemische synthetische Verfahren benutzen Enzyme und ßubzellulare Komponenten des proteinsynthetisierenden Mechanismus lebender Zellen, entweder in vitro, in zellfreien Systemen oder in vivo, in Mikroorganismen. In jedem Pail ist das Schlüsselelement das Vorhandensein einer Desoxyribonukleinsäure (DNS) mit spezifischer Sequenz, die die notwendigen Informationen zur Spezifizierung der gewünschten Aminosäuresequenz enthält. Eine solche spezifische DNS wird hier als Gen bezeichnet.Das codierte Verhältnis, womit eine Desoxynucleotidsequenz zur Spezifizierung der Aminosäuresequenz eines Proteins eingesetzt wird₅ ist weiter unten beschrieben und wirkt nach den grundsätzlichen Prinzipien, die das gesamte bekannte Reich der lebenden Organismen erfassen.

Ein kloiiiertes Gen kann eingesetzt werden, um die Aminosäuresequenz von Proteinen zu spezifizieren, die in irjyitro Systemen synthetisiert worden sind» DNS-gerichtete protein

57 593 12

synthetisierende Systeme sind aus dem Stand der Technik bereits .bekannt, siehe z.B. Zubay, G., Ann. Rev. Genetics 2, 267 (1973). Zusätzlich kann eine Einzelstrang-DNS dazu geführt werden, daß sie als Messenger-RNS in vitro wirkt, was zu einer originalgetreuen Übertragung der DNS-Sequenz führt (Salas, J. et al., J. Biol. Chem. _243, 1012 (1968). Andere Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, können mit den oben genannten Verfahren kombiniert werden, um die Ausbeuten zu erhöhen.

Weiterentwicklungen bei der DNS-Rekombinationstechnologie haben es ermöglicht, spezifische Gene oder Teile davon aus höheren Organismen zu isolieren, z.B. vom Menschen und anderen Säugetieren, und die Gene oder Genfragmente auf einen Mikroorganismus zu übertragen, wie z.B. Bakterien oder Hefe. Das transferierte Gen wird repliziert und vermehrt wie sich der transformierte Mikroorganismus repliziert. Als ein Ergebnis kann der transformierte Mikroorganismus die Fähigkeit erhalten, ein beliebiges Protein, Gen oder Fragment zu verschlüsseln, ob es ein Enzym, ein Hormon, ein Antigen, ein Antikörper oder ein Teil davon ist. Der Mikroorganismus vererbt diese Fähigkeit an seine Nachkommenschaft, so daß die Übertragung tatsächlich zu einem neuen Stamm mit der beschriebenen Fähigkeit führt, siehe beispielsweise Ullrich, A. et al., Science 196, 1313 (1977) und Seeburg, P.H.,. et al., Nature j>70, 486 (1977). Eine Grundvoraussetzung, die die Anwendung dieser Technologie für die Praxis erlaubt, ist die, daß die DNS aller lebenden Organismen, von Mikroben bis" zum Menschen, chemisch ähnlich ist und aus den gleichen vier Nucleotiden besteht. Die wesentlichen Unterschiede bestehen in den Sequenzen dieser Nucleotide in dem polymeren DNS-Molekül. Die Nucleotidsequenzen werden dazu eingesetzt, die Aminosäuresequenzen des dem Organismus angehörenden Proteins zu spezifizieren. Obgleich die meisten Proteine verschiedener

Γ-Oi 57 593 12

Organismen voneinander abweichen, ist das Codierungsverhältnis zwischen Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz für alle Organismen grundsätzlich gleich. Beispielsweise findet man die gleiche Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz von HGH in menschlichen Hypophysezellen codiert, bei der Übertragung auf einen Mikroorganismus als Codierung für die gleiche Aminosäuresequenz. Hierin benutzte Abkürzungen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Codierungsbeziehungen zwischen der Nucleotidsequenz in der DNS und der Aminosäuresequenz im Protein sind insgesamt als der in Tabelle 3 aufgeführte genetische Code bekannt.

Pur die vorliegenden Zwecke ist die Tatsache ein wesentliches Merkmal des Codes, daß jede Aminosäure durch eine Trinucleotidsequenz spezifiziert wird, bekannt auch als ein Nucleotid-Triplet. Die Phosphodiesterbindungen, die die benachbarten Triplets miteinander verbinden, sind chemisch von allen anderen internucleotiden Bindungen in der ONS nicht unterscheidbar. Daher kann die Nucleotidsequenz nicht als Code für eine einzige Aminosäuresequenz gelesen werden ohne zusätzliche Informationen zur Bestimmung des Ableserahmens (reading frame). Letzteres ist der Begriff, der verwendet wird, um die Gruppierung von Triplets zu bezeichnen, die bei der Decodierung der genetischen Botschaft durch die Zelle eingesetzt werden.

Eine Reihe von DNS-Rekombinationstechniken wecL-en zwei Klassen von Verbindungen an, Transfervektoren und Restriktionsenzyme, was diskutiert wird. Ein Transfervektor ist ein DNS-Molekülj das unter anderem die genetische Information enthält, die seine eigene Replikation sichert, wenn es auf ein Wirts-Mikroorganismusstamra übertragen wird. Beispiele von Transfervektoren, die üblicherweise in der bakteriellen Genetik eingesetzt werden, sind Plasmide und die

57 593 12 - 6 -

DNS bestimmter Bakteriophagen . Obgleich Plasmide als Transfervektoren für die hier vorliegende Erfindung verwendet wurden, können selbstverständlich auch andere Arten von Transfervektoren eingesetzt werden.

Plasmid ist der benutzte Begriff für eine selbständig replizierende DKS-Einheit, die in einer mikrobiellen Zelle gefunden werden kann, anders als das Genom der Wirtszelle selbst« Ein Plasmid ist nicht genetisch mit dem Chromosom der Wirtszelle verbundene Plasmid DNS existieren als Doppelstrang-Ringstrukturen im allgemeinen in der Größenordnung einiger Millionen Daltons Molekulargewicht, obgleich

einige größer als 10 Daltons an Molekulargev/icht sind. Sie repräsentieren üblicherweise nur einen kleinen Prozentsatz der Gesamt-DNS der Zelle. Die Transfervektor-DNS ist üblicherweise von der Wirtssellen-DNS infolge der erheblichen Größendifferenz zwischen beiden abtrennbar« Die Transfervektoren tragen die genetische Information, die sie in die lage versetzen, sich innerhalb der Wirtszelle zu replizieren, in den meisten Fällen unabhängig von der Rate der Wirtszellteilung. Einige Plasrnide haben die Eigenschaft, daß ihre Replikationsrate 4^urcn den Forscher mit Hilfe von Variationen in den Wachstumsbedingungen gesteuert werden kann. Plasmid-DNS existiert als ein geschlossener Ring. Der Ring kann allerdings durch entsprechende Techniken geöffnet werden, ein Fragment einer heterologen DlTS. eingesetzt, und der Ring wieder geschlossen werden₅ um so ein vergrößertes Molekül zu bilden, das das eingefügte DNS-Segment mit enthält« Bakteriophagen-DNS kann ein Segment einer heterologen DHS aufnehmen, das anstelle einzelner nicht-essentieller Phagen-Gene eingesetzt wurde. Der Transfervektor dient jedenfalls als Träger oder als Vektor für ein eingesetztes Fragment einer heterologen DJiS·'

Der Transfer wird über ein Verfahren realisiert, das als Transformation bekannt ist. Während der Transformation

57 593

nehmen die mit der Plasmid-DNS vermischten Bakterienzellen die gesamten Plasmidmoleküle in die Zellen auf. Obgleich der Verfahrensablauf unklar bleibt_s ist es mit Hilfe empirisch gefundener Behandlungsmethoden möglich, den Anteil von Bakterienzellen zu maximieren, die in der Lage sind, Plasmid-DNS aufzunehmen und folglich transformiert werden.

Wenn einmal eine Zelle ein Plasmid aufgenommen hat, wird letzteres in der Zelle repliziert^ und das replizierte Plasmid wird bei der Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben. In den Nucleotidsequenzen der Plasmid-DNS enthaltene genetische Informationen können prinzipiell in den Wirtszellen ihren ^Ausdruck" finden. Es ist charakteristisch, daß eine transformierte Wirtszelle durch ihre erworbenen Merkmale bestimmt wird, die durch das Plasmid getragen werden, wie z.B. Widerstandsfähigkeit gegen bestimmte Antibiotika. Verschiedene Plasmide sind durch unterschiedliche Fähigkeiten oder die Kombination von Fähigkeiten bestimmbar^ in der sie enthalten sind. Irgendein gegebenes Plasmid kann quantitativ hergestellt v/erden durch Wachstum einer reinen Zellkultur, die das Plasmid enthält und anschließendes Isolieren der Plasmid-DNS.

Restriktionsendonucleasen sind hydrolytische Enzyme₃ die in der Lage sind, katalytisch die DNS-Moleküle lagespezifisch zu zerschneiden. Der Angriffsort der Restriktionsendonuclease ist durch die Exist enz einer spezifischen Nucleotidsequenz bestimmt. Sine solche Sequenz wird als Erkennungssequenz oder -stelle (recognition site) für die Restriktionsendonuclease bezeichnet. Es wurden Restriktionsendonucleasen aus einer Vielzahl von Quellen isoliert und durch Begriffβ charakterisiert, die aus der Nucleotidsequenz ihrer Erkennungsstelle resultieren. Einige Restriktionsendonucleasen hydrolysieren Phosphodieeterbindungen an beiden Strängen an des gleichen Punkt unter Bildung von glatten Enden (blünt ends),

+) die sie der Wirtszelle übertragen

57 593 12

Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, abgetrennt durch einige Nucleotide voneinander, unter Bildung von freien einzelsträngigen Regionen an jedem Ende des zerschnittenen Moleküls. Solche einzelsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und können benutzt werden, die hydrolysierte DNS wieder einzubinden. Da einige DNS, die zur Spaltung durch ein. derartiges Enzym neigen, die gleiche Erkennungssequenz enthalten müssen, werden die gleichen kohäsiven Enden hergestellt, so daß es möglich ist, heterologe DNS-Sequenzen, die mit Restriktionsendonuclease behandelt worden sind, mit anderen, ähnlich behandelten Sequenzen zu verbinden, siehe Roberts, R.J., Grit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976)..

Restriktionsstellen sind relativ selten, jedoch hat sich die generelle Einsetzbarkeit von Restriktionsendonuclease wesentlich durch die Synthese von doppelsträngigen Oligonucleotiden erweitert, die die Restriktionsstellensequenz tragen. Daher kann praktisch irgendein Segment der DNS an irgendein anderes Segment einfach durch Befestigung des entsprechenden Restriktionsoligonucleotids an den Enden des Moleküls angekoppelt werden. Anschließend wird das Produkt einer hydrolytischen Einwirkung der entsprechenden Restriktionsendonuclease unterworfen, wobei die erforderlichen kohäsiven Enden entstehen., siehe Heyneker, H.L., et al., Nature J!6_3, 748 (1976) und Scheller, R.H. et al., Science 196, 177 (1977). Ein wesentliches Merkmal der Verteilung der Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen ist die Tatsache, daß sie zufällig im Hinblick auf den Ableserahmen verteilt sind. Dementsprechend kann die Spaltung durch die Restriktionsendonuclease zwischen benachbarten Codons eintreten, oder sie kann innerhalb eines Codons erfolgen. Allgemeinere Methoden für die DNS-Spaltung oder für die Endsequenzmodifikation sind verfügbar. Eine Vielzahl von unspezifischen Endonucleasen kann eingesetzt werden, um die DNS zufällig zu spalten, wie das weiter unten ausgeführt wird.

221

57 593 12 - 9 -

Die Bndsequenzen können durch das Hervorbringen von Oligonucleotidbegrenzungen mit dA an einem Ende und dT am anderen oder mit dG und dC modifiziert v/erden, wodurch Restriktionsstellen ohne die Notwendigkeit für spezifische Verbindungssequenzen ausgebildet werden, wenn die Enden verbunden werden.

Der Begriff "Ausdruck" (expression) wird in Erkenntnis der Tatsache verwendet, daß ein Organismus selten, wenn überhaupt, alle seine genetisch vorhandenen Fähigkeiten zu irgendeiner gegebenen Zeit einsetzt. Gerade in relativ einfachen Organismen, wie Bakterien, werden viele Proteine nicht synthetisiert, die die Zelle in der Lage ist zu synthetisieren, obgleich sie unter entsprechenden Umweltbedingungen synthetisiert werden können. Wenn das Prcteinprodukt, das durch ein gegebenes Gen codiert ist, durch den Organismus synthetisiert worden ist,.hat das Gen seinen "Ausdruck" gefunden. Wenn das Proteinprodukt nicht hergestellt ¥/ird, hat das Gen seinen "Ausdruck" nicht gefunden. Normalerweise wird der "Ausdruck" der Gene in E, coli reguliert, wie das weiter unten allgemein beschrieben wird, in derartiger V/eise, daß Proteine; deren Funktion in einer gegebenen Umgebung nicht nützlich ist, auch nicht synthetisiert werden, und die Stoffwechselenergie konserviert .wird.

Die Mittel, mit denen der Gen"ausdruck" in E.coli gesteuert wird, beherrscht man als Resultat extensiver Studien .während der letzten zwanzig Jahre, siehe allgemein Hayes, W., The Genetics of Bacteria and their Viruses, 2. Aufl., John Wiley & Sons, Inc., ilew York (1968) und Watson, J.D., The Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., Benjamin, Menlo Park, Kalifornien (1976). Diese Studien haben ge-. zeigt, daß verschiedene Gene, üblicherweise solche, die zum Codieren von Proteinen dement sprechende Tätigkeiten in der Zelle ausführen, in kontinuierlichen Sequenzen vereinigt gefunden werden. Die Vereinigung wird als Operon bezeichnet. Alls Gene in dem Operon werden in der gleichen

57 593 12

Richtung kopiert, beginnend mit den Codons, die die W-terminale Aminosäure des ersten Proteins in der Sequenz codiert und bis zum C-terminalen Ende des letzten Proteins in dem Operon. Am Anfang des Operons, unmittelbar am W-terminalen Aminosäurecodon, gibt es einen Bereich der DNS, der als Steuerbereich bezeichnet wird und eine Vielzahl von Steuerelementen enthält, einschließlich des Operators, des Promotors und Sequenzen für die ribosomalen Verbindungsstellen. Die Aufgabe dieser Stellen ist es, den · "Ausdruck" solcher Gene unter ihrer Steuerung zu gestatten, die für die Erfordernisse des Organismus verantwortlich sind. Zum Beispiel werden solche Gene, die Enzyme codieren, die ausschließlich für die Verwertung von Lactose erforderlich sind, normalerweise nicht in beträchtlichem Maße "ausgedrückt", bevor nicht Lactose oder eines seiner Analoge tatsächlich in dem Medium vorhanden ist. Die Funktionen des Steuerungsbereiches müssen für den "Ausdruck" vorhanden sein, um die Initiierung des Kopierens (transcription) und des Übertragens (translation) zu veranlassen. Der "Ausdruck" des ersten Gens in der Sequenz wird in Gang gesetzt durch das Initiieren des Kopierens und des Übertragens an der Position, die die N-terminale Aminosäure des ersten Proteins des Operons codiert. Der "Ausdruck" jedes Gens abwärts von diesem Punkt wird im weiteren Verlaufe ebenfalls initiiert, zumindest bis ein Endsignal oder ein anderes Operon mit seinem eigenen Steuerungsbereich erreicht ist₅ der so verschlüsselt ist, daß er auf andere Umweltfaktoren reagiert. Von diesem allgemeinen Schema gibt es im Detail eine Vielzahl von Varia tionen, wobei der wesentliche Fakt der ist, daß ein Gen, das in einem Procaryoten wie S_a coil "ausgedrückt" wird, im Hinblick auf einen Steuerungsbereich mit Kopierinitiationfunktionen und Übertragungsinitiatorfunktionen genau angeordnet sein muß.

57 593 12

, D & » -11-

Es wurde gezeigt, daß Gene, die normalerweise nicht Teile eines gegebenen Operons sind, in das Operon eingesetzt und von ihm gesteuert werden können. Die klassische Darstellung erfolgte durch Jacob, F., et al. J. Mol. Biol. JJ3, 704 (1965). In diesem Experiment wurden enzymcodierende Gene, die in eine Purinbiosynthese einbezogene Enzyme codieren, auf einen Bereich übertragen, der durch das Lactoseoperon gesteuert wurde. Es wurde dann beobachtet, daß der "Ausdruck" des Purinbiosynthese-Enzyms in Abwesenheit von Lactose oder eines Lactoseanalogen unterdrück wurde und auf Umwelteinflüsse, die normalerweise seinen "Ausdruck" hervorrufen, nicht wieder erfolgte.

Zusätzlich zu dem Operatorbereich, der die Initiierung der Kopierung des Gens in Abwärtsrichtung reguliert, existieren bekanntermaßen Codons, die als Stop-Signal wirken und das C-terminale Ende eine gegebenen Proteins anzeigen (Siehe Tabelle 2), Derartige Codons sind als Terminalsignale und ebenfalls als "Unsinn"-(nonsense)codons bekannt, da sie eine Aminosäure nicht normal codieren. Die Herausnahme eines Terminalsignals zwischen strukturellen Genen eines Operons führt zu einem fusionierten Gen, was zur Synthese eines chimeren Proteins führen kann, das aus zwei Aminosäuresequenzen besteht, die durch benachbarte Gene codiert und durch^ine Peptidbindung verbunden sind. Derartige chimere Gene werden synthetisiert, wenn Gene fusioniert werden, was durch Benzer, S. und Champe,S* P., Proc. Nat.Acad.,Sci.USA 48 , 114 (1962) demonstriert wurde.

Ein gegebenes Gen wurde isoliert, gereinigt und in einen Transfervektor eingesetzt. Das ganze Verfahren, das als Klonieren des Gens bezeichnet wird, führt zu einer wesentlichen Quantität, Das klonierte Gen wird in einen geeigneten Mikroorganismus übertragen, worin sich das Gen so repliziert, wie sich der Mikroorganismus fortpflanzt, und aus dem das Gen durch übliche Mittel zurückisoliert werden kann. Dadurch

57 593 12 OCM 59t - 12 -

entsteht eine sich kontinuierlich erneuernde Quelle von Genen für v/eitere Manipulationen, Modifikationen und Übertragungen auf andere Vektoren oder Orte innerhalb des gleichen Vektors.

Einen "Ausdruck" erhält man durch Übertragen des klonierten Gens bei genauer Orientierung und mit Hilfe eines "Ableserahmens" in einen Steuerungsbereich derart, daß das Ablesen durch das procaroytische Gen zu einer Synthese eines chimeren Proteins führt, das die Aminosäuresequenz enthält, die durch das klonierte Gen codiert ist. Eine Vielzahl von Protein-Schneidetechniken kann zur Zerschneidung des chimeren Proteins an einem gewünschten Punkt eingesetzt werden, so daß die gewünschte Aminosäuresequenz freigesetzt wird, die dann auf übliche Weise gereinigt wird. Techniken für den Aufbau eines "Ausdrucks^TI-Tranfervektors mit dem klonierten Gen in genauer Nebeneinanderstellung mit einem Steuerungsbereich sind beschrieben worden von Polisky, B., et al., Proc.Nat. Acad.Sci. USA _73, 3900 (1976); Itakura, K._s et al., Science 1£§L> 1056 (1977); Villa-Komaroff, L., et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, J75, 3727 (1978); Mercereau-Puijalon, 0., et al., Nature 275, 505 (1978); Chang, A. CY., et al., Nature .275, 617 (1978) und in der US-Patentanmeldung Nr. 933 035 von Rutter, et al., wobei die hier mit eingeschlossene genannte Anmeldung durch Hinweise gekennzeichnet ist.

Insgesamt erfordert ein Verfahren zur Herstellung eines Säugetierproteins, wie menschliches Pre-Wachstumshormon, mit Hilfe der DNS-Rekombinanttechnik das Klonieren eines Säugetier-Gens. Einmal kloniert, kann das Gen. in bestimmten Mengen produziert werden, unter Einsatz chemischer oder enzymätischer Mittel modifiziert und auf ein "Ausdrucks"-Plasmid übertragen werden. Das klonierte Gen ist ebenso für die Isolierung damit in Beziehung stehender Gene geeignet, oder, wenn ein Fragment kloniert worden ist, für die Isolierung des gesamten Gens unter Einsatz des klonierten

57 593 12

Gens als Hybridisierungs"fühler". Weiterhin ist das klonierte Gen bei der Prüfung der Identität oder der Homologie von unabhängigen Isolaten des gleichen oder mit diesem in Verbindung stehender Gene durch Hybridisierung nützlich, Wegen der Natur des genetischen Codes wird das klonierte Gen, wenn es in den genauen "Ableserahmen" übertragen ist, die Produktion nur auf die Aminosäuresequenz ausrichten, für die es codiert ist und auf keine andere.

Das klonierte Gen für menschliches Pre-Wachstumshormon ist für eine Vielzahl von Verfahren nutalich« Die Transponierung auf einen "Ausdrucks"-Transfervektor erlaubt die Synthese von Pre-Wachstumshormonen durch einen Wirts-Mikroorganismus, übertragen niit dem Vektor, der das klonierte Gen trägt. Das Wachstum des transformierten Wirts führt zu einer Synthese des Pre—Wachstumshormons als Teil eines chimeren Proteins« Wenn der procaroytische Teil des chimeren Proteins der Signalteil eines ausgeschiedenen oder anderweitig abgesonderten Wirtsproteins ist, kann die -Ausscheidung oder Absonderung erfolgen, wodurch die Stabilität wesentlich vergrößert und die leinigung des Pre-Wachstumshormonchimeren erleichtert wird. Zusätzlich wird, wenn der procaroytische Teil kurz ist, die Absonderung von dem procaroytischen Wirt durch die Pra-Sequenz selbst erleichtert, wenn die Pre-Sequenz in dem procaroytischen Wirt so wirkt, wie sie es in der eucaroytischen Zelle tut. Das klonierte Gen ist weiterhin bei Hybridisierungstechniken für die Isolirung genetischen Materials mit partieller Sequenzhomologie nützlich. Die Waohstumshormon-Gene anderer Säugetierspecies sind in dieser Weise isolierbar, da, abgesehen von ihrem Mangel an physiologischer Kreuzaktivität, für die effektive Hybridisierung eine ausreichende Sequenz ähnlich vorkommt. Die Wachstumshormone verschiedener tierischer Species sind für landwirtschaftliche und Veterinäre Zwecke einsetzbar. Das Wachstumshormongen eines individuellen menschlichen Patienten

57 593 12 - 14 -

ist durch die Hybridisierungstechnik isolierbar zwecks Analyse und Behandlung einer spezifischen Wachstumsstörung.

Das klonierte Pre-Wachstumshormon-Gen kann in einer Vielzahl von Verfahren für die Herstellung von Pre-Wachstumshormon verwendet werden. Pre-Wachstumshormone selbst sind nützlich, da sie durch bekannte enzymatische und chemische Verfahren in Wachstumshormone selbst umgewandelt werden können. Beispielsweise kann die Pre-Sequenz durch ein gangbares enzymatisches Verfahren entfernt v/erden, wie das von Blobel, G. weiter oben spezifisch für die Entfernung von Signalpeptiden beschrieben wurde.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die bekannten Verfahren zur Pre-Wachstumshormongewinnung weiterzuentwickeln.

Wesen der Erfindung .

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine cDSTS mit einer Basis-Sequenz, die ein menschliches Pre-Wachstumshormon codiert, zu klonieren. Die Struktur der klonierten .cDNS wurde durch Uucleotid-Sequenzanalyse nachgewiesen.

Die Originalquelle des genetischen Materials ist menschli-y ches Tumorgewebe aus der Hypophyse, das operativ gewonnen wurde. Vorzugsweise wird das genetische Material aus den Zellen eines menschlichen Individuums isoliert und eine spezielle erfindungsgemäße Technik angewandt, das Gen aus dem menschlichen Tumor zu kloniei'en.

Aus den Zellen wurde Messenger-ENS isoliert und partiell durch Chromatografie und Sedimentation gereinigt. Aktive Fraktionen wurden identifiziert durch ihre Fähigkeit, die Synthese eines Proteins von ca. 200 Aminosäuren in einem zellfreien Synthesesystem zu leiten, was durch Gel-Elektrophorese bewiesen wer-. den konnte. .

57 593 12

ο

Iu der isolierten Messenger-ENS (cDNS) wurde DNS unter Verwendung einer Umkehr-Transkriptase in zwei Reaktionszyklen synthetisiert, um zu einer doppelsträngigen cDNS zu gelangen, wie das im Detail weiter unten beschrieben wird. Das heterogene Reaktionsprodukt, bestehend aus Umkehr-Transkriptase und Doppelstrang-DNS wurde nach Länge durch Gel-Elektrophorese fraktioniert. Pur die weiteren Untersuchungen wurde der Bereich der DNS-Wanderung -ausgewählt, der bei etwa 800 Basenpaaren in der länge lag. Der Hauptteil der cDNS mit 800 Basenpaaren wurde für das Codieren des Wachstumshormons eingesetzt, indem er mit den Eestriktionsendonucleasen PvuII und BgIII getrennt behandelt wurde. Es ist bekannt, daß PvuII Wachstumshormon cDNS zerschneidet, wobei man ein ca. 495-Basenpaarfragment erhält. Von BgIII ist bekannt, daß es eine Schnittstelle innerhalb dieses Fragments hat. Nach der Zerschneidung und Fraktionierung der erwarteten Teile erhält man die Charakteristik der Wachstumshormon-cDNS.

Die nicht zerschnittene, heterogene, doppelsträngige£DNS von annähernd 800 Basenpaaren I>änge wurde behandelt, um spezifische Verbinder-Qligonucleotid Sequenzen an jedem Ende zu erzeugen, um den Einsatz an einer Stelle gleicher Eestriktionsspezifität eines?Transfervektor zu erleichtern.

Zum Klonieren wurde ein Transfervektor ausgewählt, der eine gute Selektivität und stabile Replikationseigenschaften aufwies. Die behandelte 800-Basenpaar-cDNS wurde unter Verwendung allgemein üblicher Techniken in einen Transfervektor an einer vorbestimmten Stelle der Vektor-DNS eingesetzt, um einen Rekombinant-Transfervektor zu bilden.Wirt-Mikroorganismuszellen wurden mit dem Rekombinantvektor transformiert. Entsprechend den Kriterien für den Einsatz an der vorherbestimmten Stelle wurden Transformierungsmittel ausgewählt.

+) komplementäre

57 593 12

S .ψ i * ' - 16 -

Einzelne Kolonien, jede von einer einzeln transformierten Mikroorganismuszelle herrührend, wurden aufgenommen und' in individuellen Kulturen wachsen gelassen, um die Heplikation der Rekombinant-Transfervektor-DNS-Klone zu ermöglichen. Dann wurde die Transfervektor-DIIS isoliert und über Platten-Gel-Elektrophoresereihen laufen gelassen, um Transfer-Vektoren korrekter Größe herauszusuchen und Defekte sowie Fehlstellen zu eliminieren. Die Kolonien, die die Rekombinant-Transfervektor-DNS von entsprechender Größe lieferten, ließ man in größeren Einzelkulturen wachsen, um die Transfervektor-DNS zu isolieren und die MS der Restriktions-Enzymanalyse auszusetzen. Die in den Transfervektor eingesetzte DUS kann für jedes Klon identifiziert werden durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym, das für die Zerschneidung an der Einsatzstelle verwendet wird, sowie durch die Enzyme PvuII und BgjJI, mit denen die Wachstumshormon-cDKS ein Fragment von charakteristischer Größe ergibt. Ein .Klon, das alle Erfordernisse zufriedenstellend erfüllt, wurde für die genaue Identifizierung der NucLeotidsequenz des klonierten Pre-Y/achstumshormonsgens ausgewählt und für die Übertragung auf ein entsprechendes "Ausdrucks"-Plasmid.

Wachstumshormon wird bei normalen Individuen ausschließlich im Hypophysenvorderlappen synthetisiert. Im Prinzip konnte das Gen für das Wachstum shormon aus Gewebe isoliert werden. Allerdings gibt es im menschlichen Wachs-'tumshorinongen Zwischensequenzen, die in der normalen eucaroytischen Umgebung kopiert und dann aus dem Prozeß ausgeschleust werden, um die "reife" mRNS ohne Zwischensequenzen zu ergeben. Eine Desoxynucleotidsequenz, die in eine procaroytische Zelle, wie ein Bakterium, übetragbar ist, kann solche Zwischensequenzen nicht enthalten, da man von procaroytischen Zellen erwartet, daß sie solche Sequenzen

57 593 12 - 17 -

übertragen und so zu einem Anwachsen an unerwünschtem Proteinprodukt führen. Als praktisches Erfordernis muß daher die De soxynucleot idseq uenz von der Messenger-MS abgeleitet werden, die aus aktiv das Wachstumshormon synthetisierenden Zellen isoliert wird.

Die Hauptzüge für das Klonieren einer cDNS, die ein gegebenes Protein codiert, ausgehend von der eurocaroytischen Me s senge r-RliS, wurde von Ullrich, A., weiter oben, und Seeburg, P.H., et al., ebenfalls weiter oben schon zitiert, beschrieben. Kurz zusammengefaßt besteht das Verfahren aus folgenden Schritten: 1) Isolieren der polyadenylierten RHS. im wesentlichen nicht abgebaut, aus differenzierten Zellen oder Gewebe, die das gewünschte Protein produzieren, 2) Synthese eines DNS-Stranges, komplementär in Basen-Sequenzen zur isolierten ElTS unter Verwendung von Umkehr-Transkriptase und Erhalten eines RIiS-DNS-Hybrids, 3) selektiver Abbau des RNS-Teiles des Hybrids unter Zurückbleiben einer einzelsträngigen eDNS, 4) Synthese der zu der einzeisträngigen cDHS komplementären DiIS zwecks Ausbildung einer doppelsträngigen cDNS, 5) Fraktionieren der doppelsträngigen cDIS, um Moleküle in der gewünschten Größenordnung anzureichern, 6) Herstellung eines ausgevjählten Transfervektors für die Einpflanzung der cDHS, 7) kovalentes Verbinden der cDNS mit dem Transfervektor unter Verwendung von DNS-Ligase, um zu einem Rekombinant-Transfervektor zu gelangen und 8) Replikation des gewünschten Rekombinant-Transfervektors durch Transformation, Selektion und Wachstum eines geeigneten Wirts-Mikroorganismus-Staromes.

Hypophysenzellen können entweder aus menschlichen Hypophysenlappen erhalten werden durch transphenoidale ^!^ypo jähysektomie oder aus einer in Kultur aufgezogenen menschlichen Hypophysen-Tumorselle. Die aus einer der beiden Quellen

57 593 12 - 18 -

isolierte RNS.wird partiell gereinigt, um die Endausbeute zu -erhöhen und als Schablone für die Kopierung in die eDNS eingesetzt. Die Partiaireinigung kann eine Sedimentation in einem Saccharosegradienten sein, um die entweder zu kleine oder zu große DNS zu entfernen. Zusätzlich kann eine Reinigung durch Ghroinatografie über öligodT-Zellulose erfolgen, um die polyadenylierte RNS zu isolieren, die die Hauptform der Messenger-RNS in eurocaroytischen Zellen darstellt.

Partiell gereinigte Messenger-RNS kann als Schablone für den Aufbau von cDNS unter Verwendung des Enzyms Umkehr-Transkriptase verwendet werden. Die Bildung von doppelsträngiger cDNS unter Verwendung von Umkehr—Transkriptase in Verbindung mit Sl Nuklease und bekannter Trenntechnik wurde bereits vorher beschrieben, (siehe Ullrich, A. et al« Sciene Jj9o, 1313 (1977) und Seeburg, P.H. et al., Nature 270, 486 (1977).) Das resultierende cDNS-Produkt ist in der Länge heterodispers» Wenn die Nucleotidsequenz der zu klonierenden cDNS bekannt oder innerhalb vernünftiger wahrscheinlicher Grenzen vorhersehbar ist, und wenn die Restriktionsstellen ziemlich dicht an Anfang und Ende des zu klonierenden Gens angeordnet werden können, sind geeignete Restriktionsensyme einsetzbar, um das gewünschte cDNS-Produkt in homogener Länge und getrennt von Verunreinigungen unterschiedlicher Sequenzen wiederzugeben. Es ist klar, daß eine derartige Nucleotidsequenzinformation für Gene wie menschliches Pre-Wachstumshormi^nicht brauchbar ist, die vorher nicht isoliert und gereinigt worden sind, ausgenommen sind gewisse Ausnahme- und Zufallsumstände. Daher müssen alle späteren Schritte generell mit dem heterogenen cDNS-Produkt durchgeführt werden.

Hinreichende Informationen hinsichtlich des Teils der Nucleotidsequenz der menschlichen Wachstumshornf-oDNS sind

57,593 12

aus bekannten Daten der US-Patentanmeldung Ser.Nr. 897 710 von Goodraann et al. zu entnehmen, um die Identifikation der Unterfragmente der Pre-Wachstumshormon-Gens zu ermöglichen, wie das weiter oben beschrieben wurde. Wegen der bekannten Anzahl von Aminosäuren in menschlichem Wachstumshormon, wurde die ungefähre Länge der erwünschten cMS auf 800 Basenpaare geschätzt. Bei doppelsträngiger cDNS , deren Gel-Elektrophorese-Beweglichkeit etwa 800 Basenpaaren entspricht, wurde gefunden, daß sie nach der Spaltung mit den Eestriktionsenzymen PvuII und Bgjtll vorwiegend Wachstumshormon'-" codierende Sequenzen enthält. Die Übertragung von cDUS auf einen DNS-Transfervektor kann an irgendeiner zufälligen Stelle auf den Vektor erfolgen, bewirkt durch einen einzelnen Endonuclease-Stoß, verbunden mit der Anknüpfung der cDNS durch DNS-ligasekatalysiertes Verbinden der glasten Enden. (Sgaramelle, V. et al, Proc. Hat.Acad.Sci. USA j57, 1468 (1970); Die Selektion wird da durch wesentlich vereinfacht, und die Ausbeuten werden erhöht durch Verwendung einer spezifischen Einsatζsteile, deren Anordnung im Transfervektor bekannt ist sowie durch die Behandlung der cDHS zur Erhöhung der Binsatzspezifität, In einer bevorzugten Ausführungsförm wird ein Plasmid-Transfervektor mit einer einzelnen Eestrikt.ionsstelle verwendet, die mit einem Markierungs-Gen versehen ist. Die ringförmige Plasmid-DNS wird mit der entsprechenden Eestriktions-Endonuclease zerschnitten. Das Verbinden der Enden der cDNS mit den Enden der offenen Plasmid-DNS führt zur Bildung eines Bekombinant-Plasraids mit derjan der Ee strikt ionssteile eingesetzten eDNS, das Markierungs-Gen wirkungsvoll unterbrechend und dadurch zum Verlust der Funktion des Markierungs-Gens. Beispielsweise enthält das Plasmid pBE322 eine einzige Mndlll-Eestriktionssteile, die in dem Beschleuniger des Gens für die Tetracyclinresistenz angeordnet ist.

+) ringförmigen

57 593 12 - 20 -

B.._qoli -Zellen, die durch pBR322 transformiert wurden, sind in der Lage,in der Gegenwart von 20/ig/ml Tetracyclin im Wachstumsrnedium zu wachsen und sich zu teilen. Im Gegensatz dazu werden nicht-transfarmierte Zellen unter gleichen Bedingungen abgetötet. Die durch Rekombinant pBR322 transformierten Zellen, die einen Einsatz an der HinclIII- Steiß enthalten, sind nicht in der Lage, in der Gegenwart von 20/ug/ml Tetracyclin zu wachsen und sich zu teilen. Das Plasmid pBR322 trägt auch ein Gen, das die Ampicillinresistenz verleiht. Die Verbindung dieser beiden genetischen Kennzeichen ermöglicht die Selektion von transformierten Zellen aus nicht-transformierten durch Wachstum der ersteren in Gegenwart von Ampicillin und Selektion der derart transformierten durch Nicht-Rekombinant-pBR322 aus Rekombi— nant-pBR322 durch Wachstum nur der ersteren in Gegenwart von Tetracyclin. ·

Die Einsatsspezifität und die Ausbeute an HindXII-SchnittpBR322 wird noch erhöht, wenn Hiiidlll-Verbindungsoligonucleotide an den Enden der heterogenen cDNS angesetzt werden, siehe Scheller, R_eH., et al., weiter oben zitiert. Weiterhin werden Nebenreaktionen bei der Bildung des Rekombinant-Transfervektors, wie Ringschluß ohne Einsatz der cDUS oder Dimerisierung, wesentlich durch Vorbehandlung der Enden der Restriktionsschnitt-Transfervektor-DIiS vermindert, und zwar durch Entfernung der 5'-Terminal-Phosphatgruppen. Das wird von Shine in der gleichfalls anhängigen US-Patentanmeldung Ser.Nr. 898 887 beschrieben. In Kombination eingesetzt, ermöglichen die beschriebenen Techniken eine absolute und relative Ausbeuteerhöhung an gewünschten Rekombinant-Transfervektoren.

Bei früheren Klonierungsstudien wurde die cDNS aus Messenger-RiJS synthetisiert, die aus .vereinigten Zellextrakten verschiedener Individuen herrührte. Die vorliegende Erfindung ermöglicht esj ein klcniertes Gen von einem einzigen Individuum

57 593 12

22:1 521.

- 21 -

zu erhalten. Die Technik verbindet Verringerungen der Größe und des Reaktionsvoluniens miteinander., bemüht sich darum, das Endprodukt nicht zu zerstören und die Träger-DNS zu eliminieren. Letzterer Vorteil verbessert überraschenderweise die Gesamtausbeute und den Wirkungsgrad der verschiedenen, in diesem Verfahren benutzten enzymkatalysierten Raktionen. Die Messenger-RNS wird aus einzelnen Hypophysentumoren nach den entsprechend beschriebenen Verfahren isoliert (Seeburg, et al., weiter oben zitiert), Die Säulenchromatografie-Schritte können in schmalen Glasröhrchen mit herabgezogener Spitze, zum Beispiel in Pasteur-Pipetten durchgeführt werden. Die Reinigung zur Proteinentfernung kann nach irgendeiner der geeigneten Phasentrenntechniken durchgeführt werden, wie die Phenolextraktion, vorzugsweise durch Extraktion mit chloroformgesättigtem Phenol. Die Konzentrierung der Nucleinsäuren durch Fällung mit Alkohol bei niederen Temperaturen, vorzugsweise durch Äthanolfällung bei - 70⁰G, kann vollständig erfolgen. Sovrohl die Extraktion als auch die Fällung können in einem einzigen Röhrchen ausgeführt werden, vorzugsweise in einem konischen Plastik-Zentrifugenröhrchen von ein bis zwei ml Gesamtvolumen.

Auch Enzymreaktionen.wie die Behandlung mit Ümkehr-Transkriptase können in dem gleichen kleinen Reaktionsrohrchen durchgeführt werden. Synthesegrad- und-umfang an einzelstrangiger und doppelsträngiger cDUS werden im allgemeinen durch Einbeziehung eines radioaktiv markierten Atoms in die entstandene cDNA bestimmt. Ein geeignetes Isotop ist /~ P/ an der alpha-Position eines der Vorläufer des Nucleosidtriphosphats, zum Beispiel αώ- P-dCTP. Die radioaktive Markierung gestattet außerdem eine entsprechende Beobachtung des cDHS-Produktes während des Durchgangs durch die Säulen und auf dem Elektrophorese-Gel. Wo es erforderlich ist,

57 593 12 - 22 -

eine ganze Reihe von Säulenchromatografie-Fraktionen au beobachten, beispielsweise nach der Chroraatrograf ie bei der Entfernung nichtreagierter Ausgangsprodukte von der Reaktion mit Umkehr4Dranskriptase, ist am zweckmäßigsten eine Radioassay durchzuführen, wobei das Reaktionsprodukt nicht zerstört wird. In dem vorliegenden Verfahren werden die Fraktionen, die in den kleinen Plastik-Röhrchen, wie oben beschrieben, gesammelt werden, dicht verschlossen. Die Röhrchen werden dann in SointiHationsainpullen ohne Scintillationsflüssigkeit gesteckt. Die sich ergebende Cerenkov-Strahlung kann mit dem entsprechenden Instrumentarium gemessen werden.

Arbeitsweisen mit kleinen DÜTS-Mengen werden üblicherweise mit Träger-DNS durchgeführt, die dem Gemisch zugegeben werden« Grundlage für die Verwendung von Träger-DNS ist die Verbesserung der Rückgewinnung von gewünschter DNS, die durch unspezifische Adsorption an den Behälterwänden zurückgehalten wird oder wo durch Mangel bei der DNS-Fällung und dergleichen Verluste auftreten. Angemessene DNS-Ausbeuten werden in Abwesenheit von der hinzugesetzten Träger-DNS erhalten, die selbst bei Nanogramm-Mengen an DUS erhältlich sind. Das Weglassen von Träger-DNS bringt zwei entscheidende Vorteile im vorliegenden Verfahren. Erstens ist keine un.spezifische DNS vorhanden, die zu unspezifischen Reaktionsprodukten bei den enzymkatalysierten Reaktionen führen könnte. Zweitens ist keine verunreinigende DNS vorhanden, die zu unspezifischen Rekombinant-Transfervektoren führen könnte.

Unter kombinierter Verwendung der beschriebenen Techniken ist es möglich, die Desoxynucleotidsequenz zu klonieren, die menschliches Pre-Wachstumshormon aus der Hypophyse eines einzelnen menschlichen Patienten codiert.

Ausf Ührungsbeifpiel

In den folgenden Beispielen werden die Isolierungs- und

57 593 12 23 -

Reinigungsverfahren detailliert beschrieben. Die Identität sprüfung des klonierten Gens erfolgt durch lucleotid-Sequenzanslyse.

Beispiel 1

Verfahren sum Klonieren eines Gens, das menschliches Pre-Wachstumshormon aus dem Gewebe eines einzelnen Individuums codiert.

Die Hypophysen von sechs menschlichen Patienten mit Hypophysentumoren wurden durch transphenoidale Hypophysektomie entfernt, eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Im folgenden Verfahren wurde jede Hypophyse getrennt behandelt, alle sechs wurden jedoch gleichzeitig aufgearbeitet. Die Drüsen wurden aufgetaut und in 4 M Guanidinthiocyanat, das auf pH 5,0 abgepuffertes 1 M Mercaptoäthanol enthält, bei 4° C homogenisiert. Jedes Homogenisat wurde mit 1,2 ml 5,7 M CsC£, enthaltend 10 mTÄ ADTE, überschichtet und 18 Stunden bei 37 000 U/min in einem SW 50,1 Rotor einer Beckmann Ultrazentrifuge bei 15° C zentrifugiert. Dabei setzte sich die BUS am Boden des Röhrchens ab. Die weitere Reinigung der Messenger-RNS unter Verwendung einer Oligo-dT-Cellulosesäule wurde im wesentlichen durchgeführt, wie es bei Ullrich, A., et al. und Seeburg, P.H., et al., beide weiter oben zitiert, beschrieben wurde. Die biologische Aktivität der partiell gereinigten Messenger-RKS wurde mittels ihrer Fähigkeit gemessen, den Einschluß

35 von / Sy-Methionin in das Wachstumshormon zu lenken, in einem zellfreien Proteinsynthesesystem aus Weizenkeimen. Die experimentellen Bedingungen für den Test wurden im wesentlichen von Martial, J.H., et al., Proc.Nat.Acad. Sei. USA 74, 1816 (1977) beschrieben.

Pig. 1 zeigt die Ergebnisse eines solchen Tests. Die radioaktiven Proteinprodukte wurden durch Gel-Elektrophorese

57 593 12

auf 12,5 $ Polyacrylamid-Gel, das 0,1 % Natriumdodecylsutfat enthielt, 4 Stunden bei 20 mA fraktioniert. Die radioaktiven Proteinbanden wurden durch Autoradiografie bestimmt. Band (a) zeigt £~ (^/-markierte Markierungsproteine des Bakteriophagen T4, die als Größenmarkierer eingesetzt wurden. Die Banden 1-6 zeigen die Übertragungsprodufete der oligo-dT~zellulosegereinigten Messenger-RNS der einzelnen Tumore. Es kann daraus entnommen werden, daß bei den Tumoren 1-5 das Pre—Y/aehstumshormon den Hauptbestandteil des zellfreien synthetischen Produktes darstellt«

Die EWS-Chargen, die am meisten mit dem Wachstumshormon zellfrei übertragener Aktivität angereichert waren (Beispiel in den Banden 2, 4 und 5)_} wurden gesammelt und als Schablone für die Synthese der doppelsträngigen cDNS eingesetzt. Alle Reaktionsschritte wurden in 1,5 ml fassenden Plastik-Zentrifugenrö'hrchen durchgeführt. Die erste Urakehrtranskriptase-katalytis/ert Reaktion, die zu einem EtTS-DlTS-Hybrid führt, v/urde in einem Eeaktionsgemisch durchgeführt, das 68/ul der RKS-Charge mit etwa 13/ug RITS darin enthielt, sowie Yogel-Myeloblastosisvirus-Umkehrtranskriptase, 4 al des unverdünnten Präparats, wie es vom Office of Program Eecources and Logistic, Viral Cancer Program, Viral Oncology, Division of Cancer Cause and Prevention, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland geliefert wird und 32 jal eines Reaktidnsgemisches, das 10 u.1 "Umkehr-Transkriptasepuffer" (0,5 M Tris-HCE pH 8,3; 1 mM ÄDTE; 70 mH MgCl₂; 200.mM KC£), 1 yul 2-Mercaptoäthanol 11, 5 Ml oligo-dT 1 yug/ml, jeweils 5 /il. dATP, dGTP und TTP (20 mil Vorratslösung), 1 μΐ dCTP 20 mM Vorratslösung enthielt und ungefähr 2 χ 10 cpm (Zählstöße pro Minute)οώ -/~³²P_7-dCTP, direkt aufgelöst in dem Reaktionsgemis.ch.

57 593 12

'Qi

Sm

- 25 -

Die Reaktion wurde unter Bedingungen ausgeführt, die im wesentlichen von Seeburg,'-P.H.- et al., weiter oben zitiert, beschrieben worden.sind. Bas Inkubationsgemisch wurde mit chloroformgesättigtem Phenol im gleichenReaktionsrohr chen extrahiert, mit Äthanol gefällt, die Röhrchen dann bei -70° C für wenigstens 15 Minuten stehen gelassen und anschließend zentrifugiert.

Das gefällte RIiS-DNS-Hybrid wurde in 0,1 N NaOH, 125 μΐ 5 mM ÄDTS gelöst ömd bei 68° C für eine halbe Stunde inkubiert, um die selektive alkalische Hydrolyse der RIiS zu ermöglichen. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine kleine Sephadex G 50-Säule in einer Pasteurpipette gegeben und mit einer Pufferlösung aus 10 mil Tris (pH 7,5) und 0,5 mM ÄDTE eluiert. Die radioaktive einzelsträngige DNS wurde in einer einzigen 2-Tropfen-i¹raktion zurückgewonnen und in einem Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Die Praaktionsröhrchen wurden verschlossen, in Scintillationsampullen gesteckt und in einem Flüssigkeits-Scintillationszähler zwecks Bestimmung der Cerenkotf-Strahlung gezählt.

Die Synthese der doppelsträngigen cDNS aus dem einzelsträngigen cDITS-Produkt der vorher beschriebenen Reaktionschritte wurde über eine Umkehr-Transkriptase katalysierte Reaktion durchgeführt. Die Reaktion wurde mit einem Gesamtvolumen von 51 -J)CiI, durchgeführt. Diese enthielten 30 μΐ an einzelsträngiger DNS-Lösung, 3,5 /ul Enzymlösung und 17,5' pl eines Reaktionsgemisches folgender Zusammensetzung: 96" μΐ Wasser, 60 pi Uinkehr-Transkriptase-Puffer, 6 μΐ 1M 2-Mercaptoäthanol, 15 Ul 20 mM dATP, 15 /il 2OmM dGTP, 1§ μΐ 2OmM TTP, 3 μΐ 2OmM dCTP, etwa 6x10⁸ Zählstöße pro Minute^ <χ - /~³²P_7-dGTP, direkt aufgelöst in dem Reaktionsgemisch. Die Reaktion ließ man 90 Minuten bei 47° C vonstatten gehen. Nach der Beendigung wurde das Protein durch Extraktion und Sephadex G-50-Chromatografie entfernt, wie weiter oben beschrieben und anschließend erfolgt die ebenfalls beschriebene Äthanolfällung..

57 593 12

Zur Bestätigung der Tatsache, daßcDiTA, die das Wachstumshormon codiert, ein zahlreich vorkommender Teil in der Charge war, wurde ein Teil der doppelsträngigen cDNS-Charge mit Restriktions-Endonuclease gespalten und durch Polyacrylamid (4,5 ^-Gel-Elektrophorese analysiert Q?ig· 2) Die Streifen (c) und (k) der Fig. 2 zeigen die Banden der radioaktivfmarkierten Bakteriophagen-fd-DNS, gespalten durch die Endonuclease Hp_a II, Streifen (c) und Hae_III, Streifen (k). Die Streifen (a) und (b) zeigen die ungespaltene doppelsträngige cDHS· Die Streifen (d) bis Q) zeigen die I)IiS, gespalten durch: Streifen (d) Pstl plus BGlII; Streifen (e) PvuII? Streifen (f) PvuII plus Bg£II; Streifen (g) Hing plus Sma I; Streifen (h) Hae_II|; Streifen (i) PvuII und Streifen (j) Haelll.

Die beobachteten Banden waren die ervrarteten der cDIJS, komplementär zu menschlicher V/achstumshormon-mEliS, basierend auf der Struktur eines vorherklonierten 550 Basenpaar-Pragmentes menschlichen Wachstumshormons, das in der US-Patentanmeldung Ser.STr. 897 710, auf die bereits Bezug genommen wurde, beschrieben wurde. Diese Daten bestätigen die Tatsache, daß die vorherrschende cDNS tatsächlich komplementär zu menschlicher Wachstumshormon-Messenger-El'iS ist.

Die resultierende doppelsträngige cDIS wurde mit SX-llaclease behandelt (wie das im wesentlichen von Ullrich, A. et al. beschrieben wurde, der bereits weiter oben zitiiert wurde), um die "haarnadel"-förmige Struktur in dem ungepaarten Krümmungsbereich zu spalten. Wie bereits bei den vorigen Schritten folgte der Enzymbehandlung die Extraktion, Chromatografie und Fällung. Die unpaarigen Enden wurden mittels einer DNS-Polymerase I katalysierten Reaktion vervollständigt. Das Reaktionsgemisch von 20yul Gesamtvolumen enthielt 60 mSfi Tris-HCL, pH 7,5; 8 mM MgCl₂; 10 mM 2-Mercaptoäthanol; 1 mM ATP; jeweils 200 «M dATP, dTTP, dGTP

57 593 12

und dCTP. Das Gemisch wurde mit einerEinheit E. coli DNS-Pqlymerase Γ bei 10° C für 10 Minuten inkubiert, um exonuclecLy tisch irgendwelche 3'-"hervorstehenden" (protruding) Enden zu entfernen und etwaige 5'-"hervorstehenden" Enden mit den komplementären Sequenzen aufzufüllen. Die Reaktion sollte zu cDNS-Molekülen mit "glatten" Enden führen.

Verbindungs-Oligonucleotide, die für die Hindlll-Restriktionsstellensequenz spezifisch sind, wurden durch Ligation der glatten Enden an die cDNS angefügt. Das erfolgte unter Verwendung von DUS-Ligase, wie es von Seeburg, P.H., et al., weiter oben zitiert, beschrieben wurde. Das Plasmid pBR322, Bolivar, Ρ_β et al., Gene 2, 95 (1977), wurde als Transfervektor aus den weiter oben beschriebenen Beweggründen gewählt. Die Einsatz- und Screening-Techniken sind von Ullrich, A., et al., weiter oben zitiert, beschrieben worden. Ampicillin-resistente Kolonien wurden aufgenommen und auf Platten mit Ampicillin und Tetracyclin übertragen. Es wurden für die weiteren Untersuchungen solche Kolonien ausgewählt, die Ampicillin-resistent jedoch Tetracyelin-empfindlich waren. Defekte Einsätze, einschließlich Fehlstellen und Verdoppelungen wurden mit Hilfe von Platten-Gel-Elektrophorese-Durchläufen der mit Hindlllbehandelten Plasmid-DNS bestimmt, die aus Kulturen isoliert wurde, die aus einer einzigen Kolonie transformierter Zellen gewachsen waren und wie oben beschrieben ausgewählt worden sind. Derartige Defekte waren mit Hilfe der Größe der HindIII-Fragmente leicht bestimmbar. Die klonierte DNS wurde als menschliches Pre-Wachstumshormon codierend bestimmt, nachdem sie durch Hindlll-Digestion vom Transfer-Vektor entfernt worden war und weiterer Behandlung mit den . Restriktionsenzymen PvuII und BgIII unterworfen wurde. Die abgetrennte cDNS und die Restriktionsfragmente wurden durch Gel-Elektrophorese fraktioniert, wobei die DNS durch

57 593 12 - 28 -

Pluoreszensfärbung mit Äthylbromid bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind aus Pig. 3 zu entnehmen, wobei die größeren DKS-Pragmente näher am oberen Teil der Pig. angeordnet sind. Streifen (a) ist ein vorher kloniertes 550-Basenpaar-Pragment menschlicher Wachstumshormon-DNS, beschrieben in US-Anmeldung Ser.Nr. 897 710. Streifen (b) ist die 800-Basenpaar-DSiS menschlichen Pre-Wachstumshormons des vorliegenden Beispiels. Die Streifen (c) und (e) sind Beispiele für das 500-Basenpaarfragment, das mit PvuII und BgIII entsprechend gespalten wurde. Die Streifen (d) und (f) sind Be&spiele für die 800-Basenpaar-Pre-Wachstumshormon-DNS, die entsprechend mit PvuII und BgJLII gespalten wurde. Die Spaltung durch PvuII führt in beiden Pällen zu Fragmenten ähnlicher Größe, wie das auch wegen der bekannten Anordnung einer PvuII-Stelle nahe am Ende des 500-Basenpaar-Pragmentes erwartet werden konnte. Die Spaltung van B&1II führt zu größeren Pragmenten mit der 800~Basenpaar~DHS als mit dem 55O-Basenpaar~Pragment, wie das ebenfalls zu erwarten war. Diese gefundenen Ergebnisse stimmen mit der Identifikation des klonierten 800-Basenpaar-Pragments überein, wie es in menschlichem Wachstumshormon-Gensequenzen enthalten ist. Die klonierte DNS, die als cHGH800 bezeichnet wurde, wählte man für die Sequenzanalyse aus.

Beispiel 2

Nucleotid-Sequenzanalyse von cHGH800

Die Nucleotidsequenz von cHGH800 wurde mit Hilfe der Methode von Maxam und Gilbert, Proc.Nat.Acad.Sci. USA _74j 560 (1977) bestimmt sowie mit der von Sanger_s P. et al., Proc.Nat.acad.Sci. USA 74 5463 (1977). Das Ergebnis ist aus Tabelle 4 zu entnehmen. Das klonierte Gen enthält die gesamte Sequenz, die menschliches Pre-Waehstumshormon

57 593 12 ^ä - 29 -

codiert, einschließlich eines 29-Basenpaar-Bereiches am 5'-Ende, wahrscheinlich nicht übertragen (untranslated), sowie einen nicht übertragenen Bereich von 108 Basenpaaren am 3'-Ende (mit Ausnahme des PoIy-A Stückes). (Die 5^fy und 3'-Enden sind gekennzeichnet durch Bezugnahmen auf den Strang der cDNS, der in der Sequenz mit der Wachstumshormon-Messenger-SNS korrespondiert). Einige Ungewißheit bleibt in der Pre-Sequenz nahe am Beginn der Wachstumshormonsequenz. Es ist außerdem festzustellen, daß die Uucleotidsequenz der Tabelle 4 eine Aminosäuresequenz für das Wachstumshormon ergibt, die leicht von der veröffentlichten Sequenz differiert. Die Aminosäuresequenz, die durch die JTucleotid-Sequenzanalyse störend beeinflußt wird, nähert sich mehr der korrekten an. Die Abweichungen treten bei charakteristischen Aminosäurepaaren auf, wie G-In oder GIu, die weniger leicht durch direktes Aminosäuresequentieren als durch liueleotidsequentieren charakterisiert werden können. Weiterhin macht die Nucleotid-Sequenzanalyse den Zugang zu vorher nicht zu erhaltenden Informationen möglich, zum Beispiel die wahrscheinliche Aminosäuresequenz der Wachstumshormon-Pre-Sequenz.

Beispiel 3

Aufbau des Pla^mids ptrpED50-HGH

Ein als ptrpED5-1 bezeichnetes Plasmid, Searle Res.Lab.y High Wycombe, Bucks, England, wurde modifiziert, um den Einsatz und den "Ausdruck" der klonierten Pre-Wachstumshormon-cDNS zu ermöglichen.Das Plasmid ptrpBD5-1 wurde aus dem Hindlll-Fragment des E.coli-TryptQ-phan(trp)operons abgeleitet, übertragen vom BakteriophagenjlptrpE, beschrie-

57 593 12 - 30 -

ben von Hopkins, A.S. et al., J. Mol. Biol. 107, 549 (1976), und eingesetzt an der Hinälll-Stelle von pBR322, Bolivar, P. et al., Gene 2, 95 (1977).

Das Plasmid ptrpS 1)5-1 wurde mit HindiII gespalten und mit dem Kenow-Fragment der DTTS-Polymerase I behandelt, um die einaelsträngigen 5'-Enden zu paaren (Seeburg, P.H. et al, weiter oben zitiert). Dekanucleotid-Hindlll-Verbinder wurden an die Plasmid-DNS angefügt. Dann wurden die kohäsiven Enden durch Hinlll herausgebildet, und die Plasmid-DNS wurde durch Sephadex G-100-Chromatografie isoliert. Das ringförmige Plasmid wurde mit Hilfe von T4-DNS-Ligase regeneriert und dazu verwendet, den RR-I--Stamm von E.ooli zu transformieren. Das Klone enthaltende Plasmid ptrpBD50 wurde durch Selektion nach Ampicillinresistenz isoliert.

Klonierte menschliche Pre-Wachstuinshormon-DiiS (cHGHSOO, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben), wurde an der Hindlll-Stelle von ptrpSD50 eingesetzt. Der Rekombinant-Transfervektor wurde benutzt, um EeColi C1776 zu transformieren. Die Transformanten wurden von Ampicillin enthaltenden Platten ausgewählt. Die aus verschiedenen Klonen isolierte Plasmid-DNS wurde für die korrekte Orientierung des Einsatzes durch Spaltung mit BamHI und Pstl getestet. Die korrekte Orientierung, so daß Codons des Pre-Wachstumshormons in Phase von denen des _trp_-Operons gelesen werden können, ist aus der asymmetrischen. Anordnung der PstI-_f Stelle ersichtlich, was zu einem 700-Basenpaar-Praginent führt. Eine nicht richtige Orientierung führt zu einem 290~Basenpaar-I¹r3gment. Plasmide mit korrekter Orientierung, als ptrriED50-HGH bezeichnet, wurden dann in E.coli trp_0Bvl transformiert.

57 593 12 - 31 -

Beispiel 4

"Ausdruck" des menschlichen Wachstumshormons

In dem Plasmid ptr£ED50-HGH erfolgt der "Ausdruck" der trjaS- und trpD-Gene unter Tryptophan-Steuerung, so daß die Spiegel an Proteinprodukten, die durch diese Gene codiert werden, von einem Basisspiegel durch die Anwesenheit einer induzierenden Verbindung wie ß-^Indolylacrylsäure angehoben werden. Man erwartet, daß die Induktion von E.coli trpOEvl/ptrpED5Q-HGH zu einem Ansteigen der Produktion des trpS-Gen-Produkts und des trpD-Pre-Y/achstumshormon-Pusionsproteins führt« Das letztere umfaßt einen Teil des NHp-Terminalstückes, das trpD-Gen-Produkt, verbunden mit dem menschlichen Pre-Wachstumshormon.

Eine Kultur von B.coli trj3OEvl/pti*£SD5O-HGH wurde mit ß-Indolylacrylsäure induziert und 3 ml-Proben davon

14 impulsmarkiert mit 2 jtiCi C-markierten Aminosäuren für eine konstante Zeit bei verschiedenen Intervallen nach der Induktion« Proben von null bis vier Stunden induzierter Kulturen wurden immungefällt unter Verwendung von Pormaldehyd-behandeltem Staphylococcus aureus, um Antigen-Antikb'rper-Komplexe zu sammeln, wie es von Martial, J.A. et al., Proc. Nat.Acad.Sci. USA _7ib 1816 (1977) beschrieben v/urde. Die Proteine wurden aufgelöst und fraktioniert durch Elektrophorese in Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen. Die Ergebnisse sind aus Pig. 4 zu entnehmen.

A U

Streifen (a) enthält C-markierte Proteine aus mit Bakteriophagen T4 infizierten E.coli-Zellen., die als Größenmarkierungsmittel benutzt wurden. Die breiteren Streifen (b) bis.(g) zeigen impulsmarkierte Proteine bei null, 0,5, 1, 2, 3 und 4 Stunden nach d.er Induktion. Der breitere Streifen (h) zeigt die immungefällten Proteine von 4 Stunden

57 593 12 - 32 - '

induzierten Kulturen, mit Antiserum gegen menschliches Wachstumshormon.

Der breitere Streifen (i) zeigt die Immunfällung der vier Stunden induzierten, impulsmarkierten Proteine mit nichtiinmunem Serum. Der breitere Streifen Q) zeigt die Immunfällung von impulsmarkierten, nicht-induzierten Proteinen. Die oberen und unteren Pfeile zeigen entsprechend die Anordnungen der trpE- und der erwarteten trpD-HGH-Pusionsproteine. Die Zahlen auf der linken Seite geben

—3

die Molekulargewichte x10 der Markierungsproteine an.

Die Ergebnisse zeigen das Auftreten von t_rpJD-HGH-Protein nach Induktion und seine spezifische Fällung durch Antiserum menschlichen Wachstumshormons. Es tritt auch eine bestimmte Menge von immungefälltem trpE-Protein auf. Da die jtrjgE— und trpD-Proteine normalerweise in einem Komplex assoziiert sind, scheint es so zu sein , daß eine Assoziierung zwischen dem trpD-HGH-gusionsprotein und dem trpE-Protein eintritt, wobei der trpD-Teil des fusionsproteins davon nicht berührt wird. Jedenfalls wird der "Ausdruck" des klonierten menschlichen Pre-Wachstumshormon-Gens in S«coli klar bewiesen.

Die Erfindung wurde zwar mit bestimmten AusfUhrungsformen beschrieben. Ss sollte jedoch klar sein, daß weitere Modifikationen, Variierungen, Verwendungen oder Adaptionen der vorliegenden Erfindung einschließlich des folgenden Srfindungsanspruchs mit erfaßt werden.

Tabelle 1

1 10

NH₉-PlIe-Pr O-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met- ^ 20

Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Phe-Asp-Thr-Tyr-

30 40

Glu-Glu-Phe-Glu-Glu-Ala-Tyr-Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-

50 Ser-Phe-Leu-Gln~Asn-Pro-Gln-Thr-Ser-Leu-Cys-Phe-Ser-Glu-

60 70

Ser-Ile-Pro-Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-Gln-Gln-Lys-

80 Ser- Asn-Leu-Gln- Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-

, 90 Ser-Try-Leu-Glu-Pro-Val-Glu-Phe-Leu-Arg-Ser-Val-Phe-Ala-

100 100

Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-Gly-Ala-Ser-Asn-Ser-Asp-Val-Tyr-Asp-

120 Leu-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-

130 HO

Arg-Leu-Glu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Thr-Gly-Gln-Ile-Phe-Lys-

150 Gln-Thr-Tyr-Ser-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Ser-His-Asn-Asp-Asp-

160 Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr-Cys-Phe-Arg-Lys-

170 180

Asp-Met-Asp-Lys-Val-Glu-Thr-Phe-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-

190 191 Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-COOH.

Tabelle 2

DNS=DeSoxyribonuceinsäure RNS=Ribonucleinsäure cDNS«vervollständigte DNS

(enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz) mRNS=Mess enger Rl¹TS dATP=Desoxyadenosintriphosphat dGTP=De soxyguanos intriphosphat dCTP=Desoxycytidintriphosphat

A-Adenin T-Thymin G-Guanin C-Cytosin U-Uracil

ATP-Adenosintriphosphat TTP-Thymidintriphosphat ÄDTE-Äthylendiamintetraessigsäure

Tabelle 3

Genetischer Code	Phenylalanin (Phe)	TTK	Histidin (His)	CAK
Leucin (Leu)	XTY	Glutamin (GIn)	CAJ
Isoleucin (lie)	ATM	Asparagin (Asn)	AAK
Methionin (Met)	ATG	Lysin (Lys)	AAJ
Valin (VaI)	GTL	Asparagins äure (Asp)	GAK
Serin (Ser)	QRS	Glutaminsäure (GIu)	GAJ
Prolin (Pro)	CCL	Cystein(Cys)	TGK
Threonin (Thr)	ACL	Tryptophan (Try)	TGG
Alanin (AIa)	GCL	Arginin (Arg)	V/GZ
Tyrosin (Tyr)	TAK	Glycin (GIy)	GGL
Terminalsignal	TAJ
Terminalsignal	TGA
	Schlüssel: Jedes Dreibuchstaben-Desoxynucleotid-Triplet

korrespondiert mit einem Trinucleotid der mKMS mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Alle hier aufgeführten DNS-Sequenzen sind solche des Stranges, deren Sequenz mit der Sequenz der mRNS korrespondiert, mit Thymin anstelle von Uracil. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Desoxynucleotidsequenz bilden.

W=C oder A wenn Z A oder G ist

W=C wenn Z C oder T ist

Z=A, G, C oder T wenn W C ist

Z=A oder G wenn W A ist

QR = TC wenn SA, G, C oder T ist

QR = AG wenn ST oder C ist

S = A, G, C oder T wenn QR TC ist

L = A, T, C oder G

M=A, C oder T

A = Adenin	C	wenn	Y A	oder G	G	wenn	X T	ist
G = Guanin	Y		C oder T	ist	C	wenn	QR	AG ist
T = Thymin X=T oder ist				oder T wenn	G
X=C wenn			C
Y = A, G, C X C ist
Y=A oder
S=T oder
J=A oder
K=T oder

QOq ΟΜ

C CQ Ω Φ

{ε* CQ Q CD

Jt, {D J> CQ

ΩΜΟ

QOJ ρ> CQ

ΩΜ C (D

Jt-M QP

QOq ->

Q μ ro

ί»Η· GM Ω CD

Ω OQ > M

Jo H-ί¹

ΩΜ Cj CD

Cj CD Q (Η

Ω M

CJ CD CO

QPO

Ω M

C CD

QP

ΩΜ Cj CD Ω P

ί>μ· απ

ΩΟς > M

C co

Ω» Q4

eic+ Ω4 ¹O

ΩΜ

Cj Φ QP

QOq QP

Ω4 ΩΟ

Q! CP VX) QMO

CW

cy Ω CC

ΩΜ

CJ Φ ΩΡ

>Ρ Ο4

ooq

J> CQ Q Φ

C4

Qi C=JOJ ΩΜ

CJt)

Ci^ Ω Φ

QOJ ΩΜ ΩΡ

>{Β Jt> CQ

ί> CQ -ι Q Φ Ο Ω4

Ω M

C Φ

QM

czj co Ω CD

CJM Cj φ

O¹O

Ω4 QO

Ωί Cn ί>4

Ω4 ΩΟ

Cj CQ Ω Φ

Ο4

>, CD > CQ ΩΡ

Q4

QP

ΩΟς

•Μ

>Μ -3 CQ

CjCQ ΩΦ Ω

J>JB > > CQ

Ω M

C Φ Ϊ

QP

ΩΜ Cj φ QP

ΩΜ Cj φ ΩΡ

ΩΡ

QhS

ί>Η· CJM Ω Φ

Cj CQ Ω Φ Ω4

Q P Ω M ΩΡ

CJ4

CJM ΩΦ

Ω«

Ω4

Q CQ

QCQ CJH-

d co

ΩΦ >4

ΩΦ ΩΜ

α φ

Ω03

Ρ CQ

oy

Ω Ω ΩΟ

ω y

Ο4Ο

Ω Φ Ω4

ΩΜ Cj φ ΩΡ

CJO

QM CCQ

ΩΦ

C CQ Ω Φ >4

Q P > CQ

Ω«

ί3>Ρ tc> CQ

Q P ΩΜ

CP

ί>0

C cd

Q H-ΩΗ

C φ

ΩΡ

ΩΡ 4

Q M

QP Ω M ΩΡ

Ω ff

>Η· C CQ

ΩΡ

Q4

COq

ΩΜ

α® ro

QP

t» M-

QtO

ΩΜ C Φ QP

QP ΩΜ ΩΡ

cy

C Φ

QP }> CQ ¹U

Ω4

CH- >Μ

Ω4

ΩΟ^ ί»Μ

Q ί> QPO

Ci C Φ ΩΜ C Φ QP

ΩΜ C Φ ΩΡ

CO I QM -* OU

ΩΜ C Φ

Ω¹O Ω4 ΩΟ

CH-Q 4 QW

ΩΜ C Φ CP

* y

QOq

it>M QP

QP ΩΜ Je» P

CP QM

Ω4 CO

CW cy-ΩΦ

O Ω4 Je» O

Ω4 ί»Η· C φ

ο« Ω4 ΩΟ

CM C φ

C CQ ΩΦ 4

>Ρ

QP

>Μ >Ρ ΩΜ C Φ CP

CW CtJ¹-* C Φ

Ω C Q

C Q

ί>

Q Ω

Ω Ω

Q Ω

Q Ω

>S I C Φ ΓΟ

Q η- σ\

QP ΩΜ

Jo H-

QOq

QM ΩΜ

C CQ Ω Φ

Ο4

ΩΡ Q4

QOq

JoH- I

OHTO Q4

CCQ Ω Φ Ω4

ΩΜ

C Φ

ΩΜ C Φ ΩΡ

ΩΜ

C Φ Q P

QP ΩΜ C P

CW

cy

C Φ

C:	1-9
	P
φ	σ1
4	φ
C+	M
4	M
P	Φ
oq

oq

tu

co ο ο

CCA	ODD	OP ίο CQ αν	ίο CQ	QTO OM
DDO	000	O ω		Q4 QTO
onn	UGG	Ω<ί CP ΩΜ	C CQ -α Ω Φ Ul ίο 4 O	ΩΜ C Φ OP
UCC	CAU	QTO ίοΜ	>· Η Ω CQ	QTO
UAA	ecu	ίο cf °-4	ίο OD ίο CQ Ω»	QP ->· ίθ CQ VjJ αν ο
UAA	GUG	αν ΩΦ	Q P ίο CQ	OTO Ol·-·
AAU	DDY	ΩΜ C Φ QP	OP ίο CQ αν	ίο CQ ΩΦ Ω4
UAA	ecu	ΩΡ am	QP ΩΜ iop	αν ΩΟ
GUU	ODD	'Cm ΩΦ	ΩΜ C Φ ίορ	ΩΡ Qh! OTO
VDO	OVO	ο< -* CP 00 QMQ	ΩΜ C Φ ΩΡ	ί> ct- Ch!
von	UGC	QTO ο£	ο ω	OTO
VVV	cue	CO Ω CQ	ίο CQ	QTO
AAA	UCC	ΩΡ Qh! QTO	CH--α Qhi O	CM Ω Φ
AAA	UGG	C W ΩΦ Chi	QTO Öl·-·	CO ΩΦ
	ODD	CP	ΩΜ C Φ _ΟΡ	Q CQ'O
	UGG	QTO ►ομ OP	ΩΜ C Φ ΩΡ	QTO^
	OVV	QTO Öl·-·	Ω4	Ω4
	UUG	ίο CQ Q Φ Ω hi	CO Ο!» .	CH- Oh!
	YDD	CO CCQ	Ω Φ	ίο CQ O Φ Ω 4
	cue	QTO -» Q M VD a^ o	oh; QTO	><=<! QCQ
	CAG	Q(B-1	Q CQ	αν Ω Φ
	C O Ω	Q	QP > CQ	OP ίο CQ αν
	YDD	ono	C Φ -J QH-O	ίο et- . ίο 4

Claims (1)

1. AP G 12 N/221 521 (57 593 12)

   Erfindungsanspruch

   1, Verfahren zur Herstellung eines DNS-Transfervektprs zur Erhaltung und zur Replikation einer das menschliche Pre-Wachstumshormon codierenden Desoxynukleotid-Sequenz, gekennzeichnei? dadurch^ daß eine Desoxynucleotid-Sequenz für menschliches Pre-Wachstumshorrnon mit einem DITS-LIoIekül umgesetzt v/ird, das man durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym erhalten hat.

   2, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktion durch DITS-Ligase katalysiert wird.

   3, Verfahren nach .Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Desoxynukleotidsequenz, die das menschliche Pre-Wachstumshormon codiert, folgenden Aufbau hat :

   ^QR-22^S-22^V/-21^GZ-21^ACL-2O^QR-19^S-19^X-18^TY-18^X-17^TY-17^X-16

   CCL _OTGG „X ^CAJ _CGAJ .GCL _OGTL _OCCL .TTK₁CCL₀ACL-ATm. -8 -7 -ο -5 -4 -3 -2 -ι ι έ 3 4

   ^W16^GZ16^GCL17^CAK18^W19^GZ19^X2O^TY2O^CAK21^CAJ22^X23^TY23^GCL24

   TY₁₂₈GAJ₁₂₉GAK₁ O

   GGL₁ ^CAJ_{1 37}ATM₁ ^TTK₁ ^AA J₁ ^₁ ^₁ ^₁ ^Q_{1 44} ^S144^AAJ145^TTK146^GAK147^ACLT48^AAK-149^QR15O^S15O^CAK151^AAK152 CAK₁₅₃ GAK₁₅₄GCL₁ ^X₁ ^TY₁ ^X.,^TY₁ 57AAJ₁53AAK₁ 53TAK_{1 6Q} ^GGL161^X162^TY162^X163^TY163^TAK164^TGK165^TTK166^W167^GZ167^AAJ168

   ₉₀₁₉₁ worin die Buchstaben folgende Bedeutung haben:

   A = Desoxyadenyl

   G = Desoxyguanyl

   C = Desoxycytosyl

   T = -Thymidyl ^:

   J ~ A'oder G .

   K = T oder C

   L=A, TC oder G

   M=A, C oder T

   X_n = T oder C, wenn Y_n = A oder G₍und C, wenn Y_n = C oder T;

   Y_n = A, G, C -oder T, wenn X_n= C, und A oder G, wenn X_n= T; W = C oder A, wenn Z_n=G oder A, und C, wenn Z_n=C oder T;

   Z=A, G, C oder T, wenn ¹^_n=C, und A oder G, wenn W_n= A; QR_n = TC, wenn S_n=A, G, C oder T, und AG, wenn S_n= T oder C; S_n = A, G, C oder T, wenn QR_n = TC, und T oder C, wenn

   QR_n= AG;

   wobei sich die tie.fgestellten Zahlen, n, auf die Position in der Aminosäuresequenz von men sch lieh ein Wachstumshormon

   57 593 -35-

   beziehen, nit der jedes Triplet in der Aminosäuresequenz korrespondiert und wobei entsprechend dem genetischen Code die Aiainosäurepositionen vom Aminoende her numeriert sind,

   4o Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die menschliches Pre-Wachstumshormon codierende Desoxynucleotid-Sequenz folgenden Aufbau hat:

   -26 -20

   ATG GCT ACA GGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC

   CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GCA GTG CCT TTC CCA

   10 .

   ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC

   20 30

   GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG

   40 TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC

   50

   CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC 'J¹GT TTC TCA GAG TCT ATT

   60 70

   CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC

   CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATG CAG TCG TGG

   90 100

   CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC

   110

   CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA

   120

   AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG

   130 140

   GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC

   150

   TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA

   160 170

   CTC AAG AAC TAC GGG CGT CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG

   57 593 12

   180

   GAC AAG GTC GAG ACA TTC CTG ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG

   190 191
   GAG GGC AGC TGT GGC TTC.

   5· Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß das DM-Molekül durch Schneiden des Transfervektors ptrpED5O mit dem Restriktionsenzym HIndlll hergestellt wird·

   6· Verfahren nach Punkt 1 bis 4» gekennzeichnet dadurch, daß das DNA-Molekül durch Schneiden des Transfervektors pBR322 mit dem Restrictionsenzym Hindill hergestellt wird«

   Jt