DE69233245T2

DE69233245T2 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Info

Publication number: DE69233245T2
Application number: DE69233245T
Authority: DE
Inventors: Masayuki Tatebayashi-shi Yabuta; Yuji Ashikaga-shi Suzuki; Kazuhiro Ohra-gun Ohsuye; Takehiro Ashikaga-shi Oshima; Seiko Isesaki-shi Onai; Koji Takatsuki-shi Magota; Shoji Ashiya-shi Tanaka
Original assignee: Daiichi Suntory Pharma Co Ltd
Current assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Priority date: 1991-08-19
Filing date: 1992-08-19
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2012-08-20
Also published as: EP0528686A2; HUT62335A; ES2206443T3; AU2107892A; AU656791B2; EP0528686B8; ATE253639T1; CA2076320C; EP0528686B1; HU216335B; CA2076320A1; EP0528686A3; DE69233245D1

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON PEPTIDEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden oder deren Vorstufen (die im vorliegenden Text gewöhnlich als "Zielpeptid" bezeichnet werden) als Fusionsproteine.
Bisher wurden zahlreiche Versuche unternommen, um physiologisch aktive Peptide oder Proteine unter Anwendung von DNA-Rekombinationsverfahren in Mikroorganismen, wie Escherichia coli, zu produzieren. Wenn kurze Peptide mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht durch direkte Expressionssysteme unter Verwendung von Mikroorganismen, wie Escherichia coli, erzeugt werden, werden die Enden der kurzen Peptide in diesem Fall im Mikroorganismus schnell aufgespalten.
Um diesen Abbau zu hemmen, wird ein Verfahren angewendet, bei dem nach der Herstellung der Zielpeptide in Form von Fusionsproteinen mit anderen Proteinen oder Polypeptiden (die hier als Schutzpeptide bezeichnet werden) eine chemische oder enzymatische Behandlung vorgenommen wird, um die Zielpeptide spezifisch aus den Fusionsproteinen freizusetzen, worauf eine Abtrennung und Reinigung folgt.
Ein bekanntes Verfahren zum Freisetzen eines Zielpeptids aus einem Fusionsprotein umfaßt in den Fällen, bei denen die Moleküle des Zielpeptids keinen Methioninrest enthalten, die Erzeugung eines Fusionsproteins, in dem ein Methioninrest in die C-terminale Aminosäureposition eines Linker-Peptids zwischen dem Schutzpeptid und dem Zielpeptid eingeführt wird, gefolgt von der Abspaltung des Methioninrestes durch Behandlung mit Bromcyan (CNBr), wodurch das Zielpep tid freigesetzt wird (Science, 198, 1059 (1977), Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 106 (1978)).
Wenn das Molekül des Zielpeptids keinen Arginin- oder Lysinrest enthält, umfaßt das Verfahren, das nach der Erzeugung eines Fusionsproteins, in das ein Argininrest oder Lysinrest an der C-terminalen Aminosäureposition eines Linker-Peptids zwischen einem Schutzpeptid und dem Zielpeptid eingeführt worden ist, für die Freisetzung des Zielpeptids angewendet wird, die Behandlung mit Trypsin, das spezifisch am C-Terminus des Arginin- oder Lysinrestes spaltet (Nature, 285, 456 (1980)) oder die Behandlung mit Lysyl-Endopeptidase (Achromobacter Protease I), die spezifisch am C-Terminus eines Lysinrestes spaltet.
Ein Proteinfragment, das vom Wirtsmikroorganismus stammt, das bei der Produktion verwendet worden ist, wird gewöhnlich als Schutzpeptid verwendet, um das Fusionsprotein zu erzeugen. Es wird ein Polypeptid mit einer geeigneten Größe (Länge) vom N-Terminus (Aminoterminusregion) eines Proteins verwendet, das in den Zellen des Wirtsmikroorganismus in großen Mengen ausgeprägt wird, und es ist bekannt, daß die Länge dieses Polypeptids einen beträchtlichen EinfluB auf die Produktivität des Fusionsproteins hat.
Obwohl zu erwarten wäre, daß die Produktivität verbessert wird, wenn die Größe der Schutzpeptidregion verringert (die Länge verringert) wird, wodurch der relative Anteil des Zielproteins in bezug auf das Fusionsprotein zunimmt, verbessert eine Reduzierung der Schutzpeptidregion tatsächlich nicht immer die Produktivität des Zielpeptids. Wenn zum Beispiel Insulin in Escherichia coli als Fusionsprotein erzeugt wird, ist auch bekannt, daß die Insulinproduktivität mit einer weiteren Verringerung der Größe abnimmt, obwohl die Produktivität von Insulin zunimmt, wenn β-Galactosidase als Schutzpeptid verwen det wurde und die Größe des β-Galactosidase-Abschnittes verringert wurde (Gene, 29, 251, 1984).
Wenn ein Zielpeptid als Teil eines Fusionsproteins erzeugt wird, gibt es keine gültige Theorie, wie groß das Schutzpeptid sein sollte, obwohl die Größe des Schutzpeptids eng mit der Stabilität des Fusionsproteins im Inneren des Mikroorganismus in Zusammenhang steht. Im allgemeinen bilden stabile Fusionsproteine unlösliche Einschlußkörper in Wirtszellen. Mit anderen Worten ist es von Vorteil, Einschlußkörper in Wirtszellen zu erzeugen, um eine große Menge eines Fusionsproteins zu produzieren.
Wenn jedoch in Abhängigkeit vom bestimmten Fall die Anzahl der Einschlußkörper, die pro Zelle ausgeprägt werden, zunimmt, führen die Einschlußkörper zu einer Beschädigung der Zellen, was zu einer Hemmung des Zellwachstums führt, die die Produktivität der Einschlußkörper pro Volumen der Kultur verringern kann. Obwohl der Mechanismus der Bildung von Einschlußkörpern in Mikroorganismen im Dokument von Catherine (Biotechnology, 7, 1141 (1989)) ausführlich beschrieben ist, sind an der Bildung von Einschlußkörpern zahlreiche Faktoren beteiligt, und gegenwärtig gibt es keine gültige Theorie. Außerdem gibt es noch keine eingeführten Verfahren zur industriellem Produktion durch Ausprägen eines Fusionsproteins als stabile Einschlußkörper in Mirkoorganismen.
Es gibt zahlreiche Berichte über Verfahren, bei denen Human-Calcitonin als Fusionsprotein in Escherichia coli erzeugt wird. Bennett et al. berichten zum Beispiel von einem Verfahren zur Herstellung einer Vorstufe von Human-Calcitonin (hCT-Gly) durch Ausprägen eines Fusionsproteins von Chloramphenicol-Acetyltransferase und einer Vorstufe von Human-Calcitonin (hCT-Gly) (JP-A-60/501391).
Dieses Verfahren hat jedoch mit nur 1,1 bis 2,0 mg der Vorstufe von Human-Calcitonin, die aus 44 mg Fusionsprotein erhalten werden, einen geringen Wirkungsgrad.
Unsere EP-A-281418 (entspricht JP-A-1/010999) beschreibt ein wirksames Verfahren, um Zielpeptide in E.coli zu erzeugen, wobei ein Fusionsprotein aus E.coli-β-Galactosidase und dem Zielpeptid (insbesondere eine Vorstufe von Human-Calcitonin hCT-Gly-Lys-Lys-Arg) verwendet wird. Dieses Fusionsprotein A-L-B enthält das Zielpeptid B, einen Linker-Aminosäurerest L, vorzugsweise Lysin, Arginin, Glutaminsäure oder Methionin, und ein schützendes "Partner"-Polypeptid A, das die β-Galactosidase-Sequenz ist. Das Fusionsprotein wird als Einschlußkörper ausgeprägt, die nach dem Aufbrechen der gezüchteten Zellen als unlösliche Fraktion erhalten werden, löslich gemacht werden und dann mit Endoprotease oder einem anderen geeigneten chemischen Mittel behandelt werden, um das Zielpeptid aus dem Fusionsprotein freizusetzen.
In einem anderen unserer Dokumente, das die Produktion von Human-Calcitonin betrifft, wurde nach dem Löslichmachen des Fusionsproteins (wie vorstehend beschrieben) mit Harnstoff die Vorstufe von Human-Calcitonin (hCT-Gly-Lys-Lys-Arg) aus dem Fusionsprotein mit V8-Protease freigesetzt, hCT-Gly wurde erhalten, indem Lys-Lys-Arg vom C-terminalen Abschnitt der Vorstufe von Human-Calcitonin entfernt wurde, wobei Carboxypeptidase B verwendet wurde, und das reife, C-terminal amidierte Human-Calcitonin wurde unter Verwendung eines C-terminalen Amidierungsenzyms von Xenopus laevis mit hoher Wirksamkeit erhalten (JP-A-2/190193).
Es besteht jedoch noch Bedarf nach einem wirksamen Verfahren zur Herstellung eines Peptids.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf, ein neues Verfahren bereitzustellen, um Peptide, wie physiologisch aktive Peptide oder Vorstufen davon, vorzugsweise in großen Mengen, bereitzustellen.
Als Folge der Untersuchung einer Möglichkeit zur Lösung der vorstehend genannten Aufgaben durch die hier genannten Erfinder wurde zum ersten Mal experimentell bestätigt, daß zur Verbesserung der Produktivität eines Fusionsproteins in Zellen von Escherichia coli die Auswahl des isoelektrischen Punktes des Fusionsproteins im Bereich von pI = 4,9 bis 6,9 die Stabilität und Produktivität des Fusionsproteins verbessert werden kann. Außerdem wurden völlig neue Erkenntnisse erhalten, wobei die vorstehend genannten Aufgaben gelöst werden, indem die Anzahl der Aminosäuren mit einer Ladung innerhalb des Linker-Peptids (basische oder saure Aminosäurereste) geregelt wird, um den isoelektrischen Punkt des Fusionsproteins in einem Bereich von pI = 4,9 bis pI = 6,9 einzustellen.
Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung sind in den Ansprüchen 1 und 10 aufgeführt.
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Zielpeptids, das aus Calcitonin, einer Calcitonin-Vorstufe, einem Natriuretikum-Peptid (NP), einem Zellwachstumsfaktor und einem Parathormon ausgewählt ist, welches umfaßt:

(a) Züchten von Wirtszellen, die mit einem Vektor transformiert sind, der ein Gen ausprägen kann, das ein Fusionsprotein codiert, das mit der Formel A-L-B angegeben werden kann, worin B das Zielpeptid ist; A ein Schutzpeptid ist, das ein N-terminales Fragment mit 90 bis 210 Aminosäuren von β-Galactosidase von E.coli ist; und L ein Linker-Peptid zwischen dem C-Terminus des Schutzpeptids und dem N-Terminus des Zielpeptids ist; wobei das Linker-Peptid L so ausgewählt ist, daß sich das Zielprotein abtrennt, wenn das Fusionsprotein mit einer bestimmten chemischen Substanz, wie einem Enzym, behandelt wird;
(b) Homogenisieren der gezüchteten Wirtszellen, wodurch eine unlösliche Fraktion erhalten wird, die Einschlußkörper umfaßt;
(c) Lösen des Fusionsproteins in den Einschlußkörpern durch Behandeln der unlöslichen Fraktion mit einem löslichmachenden Mittel; und
(d) Spalten der Peptidbindung zwischen dem C-terminalen Aminosäurerest des Linkers und dem N-Terminus des Zielpeptids, wodurch das Zielpeptid freigesetzt wird.

Wir schlagen die Auswahl des Linker-Peptids L vor, so daß das Fusionsprotein einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 4,9 bis 6,9 erhält. Wir haben festgestellt, daß das die Produktivität verbessern kann.
Nach einem ersten Gesichtspunkt (Anspruch 1) ist das Linker-Peptid L die gesamte oder ein Teil der Aminosäuresequenz, die mit der Sequenzidentifizierungsnummer 1 angegeben ist und 3 bis 8 Argininreste enthält.
Ein zweiter Gesichtspunkt (Anspruch 10) gibt exakt an, daß das Linker-Peptid L, das so ausgewählt ist, daß im Fusionsprotein der bestimmte isoelektrische Punkt erreicht wird, kein einzelner Lysin-, Arginin-, Glutaminsäure- oder Methioninrest ist, wie es in unserer EP-A-281418 nahegelegt worden ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: zeigt die Nucleotidsequenz eines Teils eines Tetracyclin-Resistenzgens der Nucleotid-Positionen 403–495 im Plasmid pBR322, die entsprechende Aminosäuresequenz und die jedes Linker-Peptid codierenden Abschnitte. Diese Nucleotidsequenz ist in der Sequenzidentifizierungsnummer 1 gezeigt.
2: zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pG97S4DhCT(G)R10 und pG97S4DhCT(G)R6.
3: zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pG97S4DhCT(G)R8.
4: zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pG97S4DhCT(G)R1-R5.
5: zeigt die Nucleotidsequenzen von R1 bis R5, die eine die Linker-Abschnitte codierende DNA sind. Diese Sequenzen sind ebenfalls in den Sequenzidentifizierungsnummern 2 bis 9 gezeigt.
6: zeigt die Aminosäuresequenz jedes Linker-Peptids.
7: ist eine Aufnahme der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, die die Expressionsstadien der Fusionsproteine aus jedem Expressionsplasmid zeigt.
8: zeigt die Ergebnisse der Hochleistungs-Flüssigchromatographie von Human-Calcitonin, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten worden ist.
9: zeigt die Aminosäuresequenz von CNP-22, die dieses codierende Nucleotidsequenz und die PCR-Primer für die Insertion von Restriktionsenzym-Stellen an beiden Enden.
10: zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pG97S4DhCNP-22.
11: zeigt ein Linker-Peptid zur Regelung des isoelektrischen Punktes eines Fusionsproteins und eine dieses codierende Oligonucleotidsequenz.
12: zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pG97S4DhCNP-22R3-2 und pG97S4DhCNP-22R5-2.
13: zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pG97S4DhCNP-22R5-3.
14: ist eine Aufnahme der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, die das Ergebnis zeigt, das die Mengen der ausgeprägten Fusionsproteine vergleicht, bei denen die isoelektrischen Punkte eingestellt worden sind.
15: zeigt die Elutionskurve eines Fusionsproteins vor der Freisetzung von hCNP-22 bei der Hochleistungs-Flüssigchromatographie.
16: zeigt die Elutionskurve eines Fusionsproteins nach der Freisetzung von hCNP-22 bei der Hochleistungs-Flüssigchromatographie.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich bei der Erzeugung von Fusionsproteinen physiologisch aktiver Zielpeptide und insbesondere bei deren Erzeugung durch Einschlußkörper anwenden. Zusätzlich zu Human-Calcitonin, das in der vorliegenden Beschreibung ausführlich erläutert wird, schließen Beispiele solcher Peptide Nicht-Human-Calcitonine und Vorstufen davon, Natriuretikum-Peptide (NP), wie ein Natriuretikum-Peptid des Vorhofs, ein Natriuretikum-Peptid vom Gehirn oder ein Natriuretikum-Peptid vom C-Typ, Zellwachstumsfaktoren und ein Parathormon (PTH) ein.
Besonders bevorzugte Schutzpeptide sind Peptide, die aus der 1. bis 97. Aminosäure des N-Terminus von β-Galactosidasse von Escherichia coli bestehen. Es ist noch stärker bevorzugt, Peptide zu verwenden, bei denen der Cysteinrest im Peptid, das aus diesen 97 Aminosäureresten besteht, durch einen Serinrest ersetzt ist. Außerdem ist es besonders bevorzugt, ein Peptid zu verwenden, bei dem der Cysteinrest in einem Peptid, das aus den vorstehend genannten 97 Aminosäureresten besteht, durch einen Serinrest ersetzt ist, und außerdem vier Glutaminsäurereste durch Aspartinsäurereste ersetzt sind.
Die vorliegende Erfindung ist durch die Erzeugung des Zielpeptids in Form eines Fusionsproteins mit einem isoelektrischen Punkt zwischen 4,9 und 6,9 gekennzeichnet. In diesem Fall kann der isoelektrische Punkt des Fusionsproteins wie folgt aus der Aminosäuresequenz bestimmt werden. Ein geeignetes Verfahren zum Berechnen des isoelektrischen Punkts entspricht dem Verfahren, das in Trends in Analytical Chemistry, Bd. 5, Nr. 4, S. 82–83 (1986) beschrieben ist. Es kann zum Beispiel das Programm zum Einschätzen des isoelektrischen Punkts DNASIS (Hitachi) angewendet werden, das auf der Basis dieses Verfahrens vorbereitet worden ist.
Um den isoelektrischen Punkt des Fusionsproteins innerhalb des oben genannten Bereichs zu regeln, müssen die Aminosäurereste des Schutzpeptids und/oder oder des Linker-Peptids geregelt werden, da die Aminosäurereste des Zielpeptids nicht geändert werden können. Ein natürliches Peptid oder ein Teil eines solchen Peptids, das den vorstehend genannten isoelektrischen Punkt ergibt, kann für das Schutzpeptid und/oder das Linker-Peptid ausgewählt werden, um mit dem Zielpeptid ein Fusionspeptid zu bilden. Ein anderes Verfahren beinhaltet die Regelung des isoelektrischen Punkts des Fusionsproteins durch Substitution, Eliminierung oder Addition von Aminosäureresten natürlicher Peptide oder von Abschnitten dieser Peptide.
Die Addition oder Eliminierung von sauren Aminosäuren, wie Aspartinsäure- und Glutaminsäureresten, die Addition oder Eliminierung von basischen Aminosäuren, wie Arginin- und Lysenresten, die Substitution einer anderen Aminosäure durch derartige Aminosäuren oder Kombinationen solcher Aminosäuremanipulationen können für diese Regulierung angewendet werden.
Wie vorstehend erwähnt, erfolgt die Regulierung des isoelektrischen Punkts des Fusionsproteins mit dem Linker-Peptid.
Ein Peptid oder ein Teil davon, der von der 403. bis 495. Nucleotidsequenz des Tetracyclin-Resistenzgens codiert werden kann, das von pBR322 stammt, kann für diesen Typ eines Peptids verwendet werden. Wie in 1 und in der Sequenzidentifizierungsnummer 1 angegeben ist, kann diese Genregion aus 33 Aminosäureresten 10 Argininreste codieren, und durch die Verwendung verschiedener Abschnitte in dieser Region können verschiedene Linker-Peptide erhalten werden, die eine unterschiedliche Anzahl von Argininresten enthalten. In diesem Fall ist es bevorzugt, einen Abschnitt zu verwenden, der 1 oder mehr, vorzugsweise 3 oder mehr und besonders bevorzugt 3 bis 8 Argininreste enthält.
Um das Zielpeptid aus einem Fusionsprotein freizusetzen, ist es erforderlich, daß ein Aminosäurerest, der enzymatisch oder chemisch abgespalten werden kann, am C-Terminus des Linker-Peptids vorliegt. Beispiele solcher verwendbaren Aminosäurereste schließen einen Argininrest oder einen Lysinrest (von Trypsin abgespalten), einen Lysinrest (von Lysyl-Endopeptidase abgespalten), einen Glutaminrest (von V8-Protease abgespalten) und einen Methioninrest (von Bromcyan abgespalten) ein.
Es folgt eine Erläuterung der Erzeugung eines Plasmids, das ein Fusionsprotein ausprägt, wobei ein Beispiel genommen wird, bei dem das Zielpeptid eine Vorstufe von Human-Calcitonin ist.
Das Plasmid pG97S4DhCT(G) wird als Ausgangsplasmid für die Konstruktion von Expressionsplasmiden für die Expression einer Vorstufe von Human-Calcitonin verwendet, die die Aminosäuresequenz von Human-Calcitonin und einen an dessen C-Terminus angefügten Glycinrest in Form von Fusionsproteinen, die verschiedene Linker enthalten, umfaßt.
In diesem Plasmid ist (a) das Strukturgen (ß-gal97S4D), das ein Schutzpeptid codiert, das aus 97 Aminosäuren des N-Terminus von β-Galactosidase von Escherichia coli besteht, wobei ein darin enthaltener Cysteinrest durch einen Serinrest ersetzt ist und vier Glutaminsäurereste durch Aspartinsäurereste ersetzt sind, und (b) ein Strukturgen einer Vorstufe von Human-Calcitonin durch die EcoRI- und XhoI-Erkennungsstellen verbunden, wie es in 2 gezeigt ist. Das dieses Fusionsprotein codierende Strukturgen wird vom lac-Promotor kontrolliert. Außerdem enthält dieses Plasmid ein Gen für einen Selektionsmarker.
Dieses Plasmid wird vom Plasmid pG97SHPCTLE(G) abgeleitet, das in JP-A-2/190193 beschrieben ist.
Escherichia coli W3110, das das vorstehend genannte Plasmid pG97S4DhCT(G) enthält, wurde am B. August 1991 gemäß der Vorschriften des Budapester Vertrags beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology als Escherichia coli SBM323 hinterlegt und hat die Nummer FERM BP-3503 erhalten.
Ein Fusionsprotein, das vom Plasmid pG97S4DhCT(G) codiert wird, umfaßt ein Schutzpeptid, das aus 97 Aminosäuren des Endes des N- Terminus von β-Galactosidase besteht, bei dem der darin enthaltene Cysteinrest durch einen Serinrest ersetzt ist und 4 Glutaminsäurereste durch Aspartinsäurereste ersetzt sind, und die vorstehend genannte Vorstufe von Human-Calcitonin. Dessen Ausprägung erfolgt äußerst langsam, und sein isoelektrischer Punkt beträgt 4,43. Um verschiedene Fusionsproteine innerhalb eines weiten Bereichs von isoelektrischen Punkten auszuprägen, werden somit zwischen dem vorstehend genannten β-Galactosidase-Gen und dem Gen der Human-Calcitonin-Vorstufe DNA-Sequenzen eingeschoben, die Linker-Peptide mit verschiedenen basischen Aminosäureresten codieren, wobei die EcoRI-XhoI-Stelle verwendet wird.
Es ist bequem, als Linker-Peptid ein Peptid zu verwenden, das 33 Aminosäuren umfaßt und von einem Gen codiert werden kann, das vom Tetracyclin-Resistenzgen der Nucleotidpositionen 86–1273 in Plasmid pBR322 oder von einem Teil dieses Peptids abgeteilt ist. In dieser Peptidregion sind 10 Argininreste verteilt, und durch die Verwendung geeigneter Abschnitte für das Linker-Peptid können Fusionsproteine mit verschiedenen isoelektrischen Punkten erhalten werden.
Die Linker-Peptide, die aus dieser Region erhalten wurden, sind in 1 zusammen mit den Nucleotidsequenzen gezeigt, die diese Linker-Peptide codieren. Die Gene, die diese Peptide codieren, werden durch Aufschluß des Plasmids pBR322 mit einem geeigneten Restriktionsenzym oder durch chemische Synthese nach einem gewöhnlich angewendeten Verfahren erhalten. Diese Linker-Peptide R₁, R₃, R₄, R₅, R₆, R₈ und R₁₀ enthalten 1, 3, 4, 5, 6, 8 bzw. 10 Argininreste. Die Expressionsplasmide, in denen ein Gen, das eines dieser Linker-Peptide klont, an der EcoRI-XhoI-Stelle im vorstehend genannten Plasmid pG97S4DhCT(G) eingesetzt worden ist, werden als
pG97S4DhCT(G)R1, pG97S4DhCT(G)R3, pG97S4DhCT(G)R4,
pG97S4DhCT(G)R5, pG97S4DhCT(G)R6, pG97S4DhCT(G)R8 und
pG97S4DhCT(G)R10 bezeichnet.
Außerdem wurden Stämme von Escherichia coli W3110 durch Transformation mit dem vorstehend genannten Ausgangsplasmid erhalten, und diese Plasmide werden als W3110/pG97S4DhCT(G),
W3110/pG97S4DhCT(G)R1, W3110/pG97S4DhCT(G)R3,
W3110/pG97S4DhCT(G)R4, W3110/pG97S4DhCT(G)R5,
W3110/pG97S4DhCT(G)R6, W3110/pG97S4DhCT(G)R8 und
W3110/pG97S4DhCT(G)R10 bezeichnet.
Folgende Ergebnisse werden erhalten, wenn die isoelektrischen Punkte der Fusionsproteine berechnet werden, die von diesen Mikroorganismen erzeugt wurden:
W3110/pG97S4DhCT(G) (die Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 0), isoelektrischer Punkt = 4,43;
W3110/pG97S4DhCT(G)R1 (die Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 1), isoelektrischer Punkt = 4,70;
W3110/pG97S4DhCT(G)R3 (die Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 3), isoelektrischer Punkt = 4,90;
W3110/pG97S4DhCT(G)R4 (die Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 4), isoelektrischer Punkt = 5,80;
W3110/pG97S4DhCT(G)RS (die Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 5), isoelektrischer Punkt = 5,91;
W3110/pG97S4DhCT(G)R6 (die Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 6), isoelektrischer Punkt = 6,01;
W3110/pG97S4DhCT(G)R8 (die Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 8), isoelektrischer Punkt = 6,83; und
W3110/pG97S4DhCT(G)R10 (die Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 10), isoelektrischer Punkt = 7,85.
Es wurden Transformanten von Escherichia coli, die das vorstehend genannte Fusionsprotein mit einem isoelektrischen Punkt von 4,43 bis 7,85 erzeugen, gezüchtet und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf die Menge des Fusionsproteins analysiert, das pro Anzahl der Zellen erzeugt worden ist. Der Stamm W3110/pG97S4DhCT(G) mit einem isoelektrischen Punkt von 4,43 und der Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R1 mit einem isoelektrischen Punkt von 4,70 erzeugten nur eine kleine Menge des Fusionsproteins. Es wurde auch bestätigt, daß die anderen Stämme eine große Menge des Fusionsproteins als Einschlußkörper in Bakterienzellen erzeugten. Durch diese Ergebnisse wurde somit deutlich, daß sowohl die Produktivität des Fusionsproteins als auch die Menge der erzeugten Einschlußkörper gering sind, wenn der isoelektrische Punkt des Fusionsproteins in der Nähe von 4,5 bis 4,7 liegt.
Obwohl die Produktivität des Fusionsproteins pro Anzahl der Zellen im Falle des Stamms W3110/pG97S4DhCT(G)R10 mit einem isoelektrischen Punkt von 7,85 ungefähr dem der anderen Bakterienstämme äquivalent war, wurde zudem bestätigt, daß die abschließende Bakterienkonzentration während der Kultur nur die Hälfte der der anderen Stämme betrug. Obwohl die Kapazität für die Erzeugung des Fusionsproteins pro Anzahl der Zellen zunahm, wird angenommen, daß bei dem schwach alkalischen isoelektrischen Punkt des Fusionsproteins (pI = 7,85) aufgrund der schnellen Bildung der Einschlußkörper oder aufgrund dessen, daß der isoelektrische Punkt des Fusionsproteins schwach alkalisch war, eine Hemmung des Zellwachstums auftrat, die dazu führte, daß es nicht zu einer Zunahme der abschließenden Bakterienkonzentration kam.
Auf der Basis der vorstehenden Ergebnisse wurde von den hier genannten Erfindern zum ersten Mal bestätigt, daß es wichtig ist, daß der isoelektrische Punkt des Fusionsproteins im sauren pI-Bereich zwischen 4,9 und 6,9 liegt, um in Zellen von Escherichia coli ein Fusionsprotein in Form Einschlußkörpern sowohl beständig als auch in großer Menge zu erzeugen.
Danach nahmen wir eine Abtrennung und Reinigung der Vorstufe von Human-Calcitonin (hCT-Gly) aus den Einschlußkörpern des Fusionsproteins von der Vorstufe von Human-Calcitonin, die in Escherichia coli erzeugt worden war, in der vorstehend beschriebenen Weise vor. Außerdem wurde bestätigt, daß Human-Calcitonin mit einem amidierten C-Terminus mit dem Amidierungsenzym wirksam erzeugt werden kann, das von Xenopus laevis stammt.
Es folgt ein weiteres Beispiel der vorliegenden Erfindung zur Konstruktion eines Plasmids, das ein Fusionsprotein ausprägt, wobei als ein Beispiel der Fall genommen wird, bei dem das Zielpeptid ein Natriuretikum-Peptid-22 vom C-Typ ist (als CNP-22 abgekürzt) (Sequenzidentifizierungsnummer 10). Das Plasmid pG97S4DhCNP-22 wurde für die Konstruktion von Expressionsplasmiden als Ausgangsplasmid verwendet, um Human-CNP-22 (das 22 Aminosäuren umfaßt) als Fusionsproteine auszuprägen, die verschiedene Linker enthalten.
In diesem Plasmid sind (a) das Strukturgen (ßgal97S4D), das ein Schutzpeptid codiert, das aus 97 Aminosäuren des N-Terminus von β-Galactosidase von Escherichia coli codiert, wobei der darin enthaltene Cysteinrest durch einen Serinrest ersetzt ist und vier Glutaminsäurereste durch Aspartinsäurereste ersetzt sind, und (b) das Strukturgen von Human-CNP-22 über die EcoRI- und XhoI-Erkennungsstellen verbunden, wie es in 10 gezeigt ist. Das dieses Fusionsprotein codierende Strukturgen wird vom lac-Promotor kontrolliert. Außerdem enthält dieses Plamid einen Marker für die Tetracyclinresistenz.
Bei der Konstruktion des Expressionsplasmids pG97S4DhCNP-22 sind das Strukturgen Human-CNP-22 und das Plasmid pUCCNP1, die für die Herstellung dieses Gens verwendet werden, in JP-A-4/139199 offenbart.
Außerdem ist das Plasmid pG97S4DhCT(GRRR), das als Plasmid verwendet wird, das ein Schutzpeptid codiert, im wesentlichen mit dem vorstehend genannten Plasmid pG97S4DhCT(G) identisch.
Der isoelektrische Punkt des Fusionsproteins, das vom Plasmid pG97S4DhCNP-22 codiert wird, beträgt 4,56. Angesichts dessen, daß der isoelektrische Punkt des Fusionsproteins für die vorstehend angegebene starke Ausprägung des Fusionsproteins vorzugsweise im Bereich von pI = 4,9 bis 6,0 liegt, kann keine Produktion einer großen Menge eines Fusionsproteins erwartet werden. Deshalb erfolgte eine Untersuchung, bei der die Linker-Peptid-Gene, die verschiedene basische Aminosäuren codieren, in die EcoRI-XhoI-Region zwischen dem vorstehend genannten β-Galactosidase-Gen und dem Human-CNP-Gen eingeschoben ist, um verschiedene Fusionsproteine mit isoelektrischen Punkten von 4,9 bis 6,9 zu gestalten und eine große Menge dieser Fusionsproteine in Escherichia coli auszuprägen.
Diese Linker-Peptide können unter Anwendung eines Verfahrens hergestellt werden, bei dem Gene, die basische Aminosäuren codieren, künstlich gestaltet und dann chemisch synthetisiert werden.
11 zeigt die Gestaltung von Linker-Peptid-Genen, die basische Aminosäuren codieren, und die chemisch synthetisierten Gensequenzen. Diese Linker-Peptide R3-2 (Sequenzidentifizierungsnummern 13 und 14), R5-2 (Sequenzidentifizierungsnummern 15 und 16) und R5-3 (Sequenzidentifizierungsnummern 17 und 18) enthalten 3, 5 bzw. 5 Argininreste. Die Expressionsplasmide, bei denen diese Linker-Peptide codierenden Gene in die EcoRI-XhoI-Region im vorstehend genannten pG97S4DhCNP-22 eingeschoben sind, werden als pG97S4DhCNP-22R3-2, pG97S4DhCNP-22R5-2 bzw. pG97S4DhCNP-22R5-3 bezeichnet.
Außerdem wurden die Stämme Escherichia coli W3110 durch Transformation mit den vorstehend genannten Ausgangsplasmiden erhalten, und diese Plasmide werden als W3110/pG97S4DhCN-22, W3110/pG97S4DhCNP-22R3-2, W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 bzw. W3110/pG97S4DhCNP-22R-3 bezeichnet.
Wenn die isoelektrischen Punkte der von diesem Mikroorganismen erzeugten Fusionsproteine berechnet werden, werden folgende Ergebnisse erhalten:
W3110/pG97S4DhCNP-22 (Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 0), isoelektrischer Punkt = 4,56,
W3110/pG97S4DhCNP-22R3-2 (Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 3), isoelektrischer Punkt = 4,95,
W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 (Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 5), isoelektrischer Punkt = 6,22, und
W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3 (Anzahl der Argininreste in der Linker-Region = 5), isoelektrischer Punkt = 5,59.
Wenn die das vorstehend genannte Fusionsprotein mit einem isoelektrischen Punkt von pI = 4,56 bis 6,22 erzeugenden Stämme Escherichia coli gezüchtet wurden und die Menge des Fusionsproteins, die pro Anzahl der Zellen erzeugt wurde, durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert wurde, wurde im Falle jener Stämme, die einen isoelektrischen Punkt des Fusionsproteins von pI = 4,95 bis 6,22 zeigten, bestätigt, daß die ausgeprägte Menge des Fusionsproteins im Vergleich zum Stamm W3110/pG97S4DhCNP-22 groß war, obwohl die Fusionsproteinmenge, die vom Stamm W3110/pG97S4DhCNP-22 erzeugt wurde (isoelektrischer Punkt des Fusionsproteins = 4,56) nicht diese große Menge war.
Insbesondere wurde klar, daß vom Stamm W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 eine große Menge eines Fusionsproteins ausgeprägt wurde, das einen isoelektrischen Punkt von 5,59 bot, und der Stamm W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3 im Vergleich mit dem Stamm W3110/pG97S4DhCNP-22 einen isoelektrischen Punkt von 6,22 bot (siehe 14). Somit zeigt der Fall von Human-CNP-22 auch, daß die Behandlung mit einem isoelektrischen Punkt des Fusionsproteins im Bereich von pI = 4,9 bis 6,9 zu einer besseren Produktivität für das Fusionsprotein führt.
Außerdem wurde bestätigt, daß Human-CNP-22 aus Einschlußkörpern eines Fusionsproteins, die auf diese Weise in Escherichia coli erzeugt wuren, mit V8-Protease wirksam freigesetzt wird, was zu einer effizienten Produktion von Human-CNP-22 führt, womit die Nützlichkeit der erfindungsgemäßen Verfahren deutlich wird.
Beispiele
Die folgenden Beispiele bieten eine ausführliche Erläuterung der Ausführungsformen.
Beispiel 1: Konstruktion des Expressionsvektors
Ein Expressionsplasmid, das ein Fusionsprotein mit 1 bis 10 Argininresten in der Linker-Peptid-Region ausprägt, wurde in der nachstehend beschriebenen Art und Weise konstruiert.
(A) Konstruktion von pG97S4DhCT(G)R10
Das nachstehend beschriebene Verfahren wurde durchgeführt, um ein Gen, das die Aminosäuren der Region R10 codiert, die in 1 gezeigt ist, in das Linker-Peptid einzufügen, das die Region zwischen dem Gen β-gal 97S4D (Peptid, das aus 97 Aminosäuren des N-Terminus von β-Galactosidase besteht, wobei ein Cysteinrest durch einen Serinrest ersetzt ist und 4 Glutaminsäurereste durch Aspartinsäurereste ersetzt sind) und dem Gen hCT(G) (Vorstufe von Human-Calcitonin mit 1 Glycinrest am C-Terminus) einzufügen. Ein Konstruktionsverfahren für pG97S4DhCT(G)R10 ist in 2 gezeigt.
Zuerst wurde pBR322 mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen, um die Region R10 im Tetracyclin-Resistenzgen von pBR322 zu isolieren. 150 μg pBR322 wurden 60 Minuten bei 37°C mit jeweils 200 Einheiten BamHI und Eco47III in 300 μl High-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH = 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreitol, als DTT abgekürzt) aufgeschlossen.
Nach der Reaktion wurden dem Reaktionsgemisch 30 μl einer Farbstofflösung (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylolcyanol, 40% Saccharose) zugesetzt, und es wurde die Gelelektrophorese mit 1,5 Agarose (TAE-Pufferlösung, 40 mM Tris-Essigsäure, pH = 8,0, 2 mM EDTA, 120 V, 2 h) durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in 0,5 μg/ml einer Ethidiumbromidlösung getaucht, das 119 bp BamHI-Eco47III-Fragment wurde aus dem Gel geschnitten.
Das ausgeschnittene Gel wurde dann in einen Dialyseschlauch gegeben, der den TAE-Puffer enthielt, und der Elektrophorese unterzogen (120 V, 30 min), um das 119 bp DNA-Fragment aus dem Gel zu eluieren. Dann wurde die Lösung im Dialyseschlauch aufgefangen, danach folgten eine Phenolbehandlung, eine Chloroformbehandlung und die Fällung mit Ethanol nach gewöhnlich angewendeten Verfahren, und der Niederschlag in Ethanol wurde in 40 μl TE-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH = 8,0, 1 mM EDTA) gelöst. 2,5 μl 10-fach konzentrierter Med-Puffer (100 mM Tris/HCl, pH = 7,5, 500 mM NaCl, 100 mM MgCl2 und 10 mM DTT) und 10 Einheiten HaeIII wurden zu 20 μl dieser das DNA-Fragment BamHI-Eco47III (119 bp) enthaltenden Lösung gegeben und 2 Stunden bei 37°C aufgeschlossen. Nach der Zugabe einer Farbstofflösung wurde die Gelelektrophorese mit 15% Polyacrylamid (TBE-Puffer, 89 mM Tris-Borsäure-Puffer, pH = 8,0, 2 mM EDTA, 120 V, 90 min) vorgenommen.
Dann wurde das Gel in einer Ethidiumbromidlösung gefärbt, und danach wurde das Band des DNA-Fragmentes HaeIII-Eco47III (89 bp) aus dem Gel geschnitten. Dieses ausgeschnittene Gel wurde zu feinen Stücken geschnitten und 12 Stunden bei 37°C in 200 μl DNA-Elutionspuffer (0,5 m Ammoniumacetat, 1 mM EDTA, pH = 8,0) stehengelassen. Dann erfolgten die Phenolbehandlung, die Chloroformbehandlung und die Fällung mit Ethanol nach gewöhnlich angewendeten Verfahren und der Niederschlag in Ethanol wurde in 5 μl TE-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH = 8,0, 1 mM EDTA) gelöst.
Danach wurden 5 μg des Plasmids pG97S4DhCT(G) 2 Stunden bei 37°C in 50 μl TA-Puffer (33 mM Tris/Essigsäure, pH = 7,9, 10 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM DTT, 66 mM Kaliumacetat, 0,01% Rinderserumalbumin) mit 30 Einheiten EcoRI aufgeschlossen. Außerdem wurde 1 μl von 25 mM dNTP, das aus dATP, dGTP, dCTP und dTTP und 4 Einheiten T₄-DNA-Polymerase bestand, für 5 Minuten bei 37°C zu dieser Reaktionslösung gegeben, um die kohäsiven Enden zu füllen. Nach der Reaktion wurden eine Phenolbehandlung, Chloroformbehandlung und Fällung in Ethanol nach üblicherweise angewendeten Verfahren vorgenommen, und der Niederschlag in Ethanol wurde in 10 μl TE-Puffer gelöst.
5 μl des mit EcoRI aufgeschlossenen und mit stumpfen Enden versehenen pG97S4DhCT(G) und 5 μl des DNA-Fragmentes HaeIII-Eco47III (89 bp) wurden gemischt, und die Verknüpfungsreaktion erfolgte für 12 Stunden bei 16°C mit einem DNA-Verknüpfungs-Kit (Takara Shuzo). Das Verknüpfungsgemisch diente dazu, Escherichia coli W3110 nach gewöhnlich angewendeten Verfahren zu transformieren, und es wurden tetracyclinresistente Transformanten erhalten. Die Plasmidstruktur wurde durch die Restriktionsenzymanalyse mit BspHI und BglII bestätigt, und eine der Transformanten, die die gewünschte Struktur trug, wurde als Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R10 bezeichnet.
(B) Konstruktion von pG97S4DhCT(G)R6
Das nachstehend beschriebene Verfahren erfolgte, um ein Gen, das die Aminosäuren der Region R6 codiert, die in 1 gezeigt ist, in die Linker-Peptid codierende zwischen dem Gen β-gal 97S4D einzufügen. Die Konstruktion von pG97S4DhCT(G)R6 ist in 2 gezeigt.
pBR322 wurde mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen, um die Region R6 im Tetracyclin-Resistenzgen von pBR322 zu isolieren. 150 μg pBR322 wurden 60 Minuten bei 37°C mit jeweils 200 Einheiten BamHI und Eco47III in 300 μl High-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH = 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 1 mM DTT) aufgeschlossen. Nach der Reaktion wurden dem Reaktionsgemisch 30 μl einer Farbstofflösung (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylolcyanol, 40% Saccharose) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für die Gelelektrophorese mit 1,5% Agarose (TAE-Pufferlösung, 40 mM Tris-Essigsäure, pH = 8,0, 2 mM EDTA, 120 V, 2 h) verwendet.
Nach der Gelelektrophorese wurde das Gel in 0,5 μg/ml einer Ethidiumbromidlösung gefärbt und das Band des DNA-Fragmentes BamHI-Eco47III (119 bp} wurde aus dem Gel geschnitten. Das ausgeschnittene Gel wurde dann in einen Dialyseschlauch gegeben, der den TAE-Puffer enthielt, und der Elektrophorese unterzogen (120 V, 30 min), um das 119 bp DNA-Fragment aus dem Gel zu eluieren. Dann wurde die Lösung im Dialyseschlauch aufgefangen, danach folgten eine Phenolbehandlung, eine Chloroformbehandlung und die Fällung mit Ethanol nach gewöhnlich angewendeten Verfahren, und der Niederschlag in Ethanol wurde in 40 μl TE-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH = 8,0, 1 mM EDTA) gelöst.
2,5 μl 10-fach konzentrierter 7A-Puffer (330 mM Tris/HCl, pH = 7,9, 100 mM Magnesiumacetat, 5 mM DTT, 660 mM Kaliumacetat und 0,1 % Rinderserumalbumin) und 10 Einheiten BanI wurden zu 20 μl dieser BamHI-Eco47III (119 bp) enthaltenden Lösung gegeben und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Außerdem wurden für 5 Minuten bei 37°C 1 μl 25 mM dNTP und 4 Einheiten T4-DNA-Polymerase zugesetzt, um die kohäsiven Enden zu füllen. Nachdem diesem Reaktionsgemisch 2,5 μl Farbstofflösung zugesetzt worden waren, erfolgte die Gelelektrophorese mit 15% Polyacrylamid (TBE-Puffer, 89 mM Tris-Borsäure-Puffer, pH = 8,0, 2 mM EDTA, 120 V, 90 min).
Nach der Elektrophorese wurde das Gel in einer Ethidiumbromidlösung gefärbt, und das Band des DNA-Fragmentes HaeIII-Eco47III (56 bp) wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Dieses ausgeschnittene Gel wurde in feine Stücke geschnitten und 12 Stunden bei 37°C in 200 μl DNA-Elutionspuffer (0,5 m Ammoniumacetat, 1 mM EDTA, pH = 8,0) stehengelassen. Dann wurden die Phenolbehandlung, die Chloroformbehandlung und die Fällung in Ethanol nach gewöhnlich angewendeten Verfahren vorgenommen, und der Niederschlag in Ethanol wurde in 5 μl TE-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH = 8,0, 1 mM EDTA) gelöst.
5 μg des Plasmids pG97S4DhCT(G) wurden 2 Stunden bei 37°C mit 30 Einheiten EcoRI in 50 μl TA-Puffer aufgeschlossen. Außerdem wurden dieser Reaktionslösung für 5 Minuten bei 37°C 1 μl 25 mM dNTP und 4 Einheiten T₄-DNA-Polymerase zugesetzt, um die kohäsiven Enden zu füllen. Nach der Reaktion wurden die Phenolbehandlung, die Chloroformbehandlung und die Fällung in Ethanol nach gewöhnlich angewendeten Verfahren vorgenommen, und der Niederschlag in Ethanol wurde in 10 μl TE-Puffer gelöst.
5 μl des mit EcoRI aufgeschlossenen und mit stumpfen Enden versehenen pG97S4DhCT(G) und 5 μl des DNA-Fragmentes BanI-Eco47III (56 bp) wurden gemischt, und die Verknüpfungsreaktion erfolgte für 12 Stunden bei 16°C mit einem DNA-Verknüpfungs-Kit (Takara Shuzo). Das Verknüpfungsgemisch diente dazu, Escherichia coli W3110 nach gewöhnlich angewendeten Verfahren zu transformieren, und es wurden tetracyclinresistente Transformanten erhalten. Die Plasmidstruktur wurde durch die Restriktionsenzymanalyse mit BspHI und BglII bestätigt, und eine der Transformanten, die die gewünschte Struktur trug, wurde als Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R6 bezeichnet.
(C) Konstruktion von pG97S4DhCT(G)R8
Das nachstehend beschriebene Verfahren erfolgte, um ein Gen, das die Aminosäuren der Region R8 codiert, die in 1 gezeigt ist, in eine Linker-Peptid codierende Region zwischen dem Gen β-gal 97S4D und dem Gen hCT(G) einzufügen. Die Konstruktion von pG97S4DhCT(G)R8 ist in 2 gezeigt.
Drei Röhrchen wurden präpariert, indem 10 μg pG97S4DhCT(G)R10 in jedes Röhrchen gegeben wurden, das 50 μl High-Puffer enthielt. 20 Einheiten von BbeI und BglII, BbeI und EcoRV, und BglII und EcoRV wurden entsprechend in die drei Röhrchen gegeben. Nachdem sie 2 Stunden bei 37°C reagieren konnten, wurde die Gelelektrophorese mit 1,5% Agarose durchgeführt, und BbeI-BglII (84 bp), BbeI-EcoRV (353 bp) und BglII-EcoRV (2,7 Kb) und die Banden wurden aus dem Gel herausgeschnitten, und es wurde eine Elektrophorese vorgenommen.
Die Phenolbehandlung, die Chloroformbehandlung und die Fällung in Ethanol erfolgten dann nach gewöhnlich angewendeten Verfahren, danach wurde der Niederschlag in Ethanol in 5 μl TE-Puffer gelöst. Die drei DNA-Fragmente, die auf diese Weise erhalten worden waren, wurden gemischt und 12 Stunden bei 16°C verknüpft, wobei ein DNA-Verknüpfungs-Kit verwendet wurde. Das Verknüpfungsgemisch diente dem Transformieren von Escherichia coli W3110 nach gewöhnlich angewendeten Verfahren, und es wurden tetracyclinresistente Transformanten erhalten. Die Plasmidstruktur wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt, und eine der Transformanten wurde als Stamm E. coli W3110/pG97S4DhCT(G)R8 bezeichnet.
(D) Konstruktion von pG97S4DhCT(G)R1, pG97S4DhCT(G)R3, pG97S4DhCT(G)R4 und pG97S4DhCT(G)RS
Das nachstehend beschriebene Verfahren wurde durchgeführt, um ein Gen, das die Aminosäuren der Region R1, R3, R4 oder R5 codiert, die in 1 gezeigt ist, in die das Linker-Peptid codierende Region zwischen dem Gen ß-gal 97S4D und dem Gen hCT(G) einzuführen.
Die Konstruktion von pG97S4DhCT(G)R1, pG97S4DhCT(G)R3, pG97S4DhCT(G)R4 und pG97S4DhCT(G)RS ist in 4 gezeigt.
25 μg pG97S4DhCT(G) wurden 2 Stunden bei 37°C mit 30 Einheiten XhoI und mit EcoRI in 50 μl High-Puffer aufgeschlossen. Nach der Reaktion wurde die Gelelektrophorese mit 1% Agarose durchgeführt, und das DNA-Fragment wurde durch Elektrophorese vom Gel abgetrennt. Jeweils 100 pmol dieses DNA-Fragmentes und des chemisch synthetisierten Oligonucleotids, das in 5 gezeigt ist, wurden gemischt und verknüpft. Das Verknüpfungsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli W3110 nach einem gewöhnlich angewendeten Verfahren zu transformieren, und es wurden tetracyclinresistente Transformanten erhalten.
Nach der Analyse des Plasmids des transformierten Stamms durch Gelelektrophorese nach der Spaltung mit Restriktionsenzymen wurden die Stämme von E. Coli W3110/pG97S4DhCT(G)R1,
W3110/pG97S4DhCT(G)R3, W3110/pG97S4DhCT(G)R4 und
W3110/pG97S4DhCT(G)RS erhalten.
Wie vorstehend gezeigt, wurden 7 Arten von Plasmiden konstruiert, wobei ein Teil eines tetracyclinresistenten Gens in die EcoRI-Spaltstelle oder die EcoRI-XhoI-Spaltstelle von pG97S4DhCT(G) eingefügt wurde. Da diese eingefügten Gene 1 bis höchstens 10 Codone enthalten, die der basischen Aminosäure Arginin entsprechen, sind die Ladungen der chimären Proteine verschieden, was folglich zur Produktion von Fusionsproteinen mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten führt. Die Strukturen der erzeugten Fusionsproteine sind in 6 gezeigt.
Beispiel 2: Expression des hCT(G)-Fusionsproteins
Um den Zusammenhang zwischen isoelektrischen Punkten von Fusionsproteinen, die in Mikroorganismen produziert worden sind, und deren Produktivität zu überprüfen, wurden die Mikroorganismen gezüchtet, und die Produktivität des Fusionsproteins pro Anzahl der Zellen wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt.
Die vorbereiteten Mikroorganismen wurden 12 Stunden bei 37°C in einem Kolben in 500 ml SB-Medium (0,5% Glycerin, 2,4% Hefeextrakt, 1,2% Trypton, 100 mM Kaliumhydrogenphosphat, pH = 7,5, und Tetracyclin (10 μg/ml)) gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die Trübung der Nährbouillon mit einem Spektrophotometer (OD₆₆₀) gemessen, und die Nährbouillon wurde entfernt, so daß der Wert für [OD₆₆₀-Wert × Volumen der Kultur (ml)] 5 betrug, danach wurde 5 Minuten mit 12000 U/min zentrifugiert, um die mikrobiellen Zellen abzutrennen.
1 ml eines SDS-Proben-Puffers (63 mM Tris-HCl, pH = 6,8, 10% Glycerin, 10% SDS, 5% 2-Mercaptoethanol und 12,5 mg/l Bromphenolblau) wurden dem Zellniederschlag zugegeben, danach wurde 5 Minuten bei 95°C erwärmt, um eine Probe für die SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese zu erhalten. Die SDS-Gelelektrophorese mit 16 Polyacrylamid (TEFCO) wurde 90 Minuten mit 5 μl der vorstehend genannten Probe unter Bedingungen mit 18 mA durchgeführt. Nach der Gelelektrophorese wurde das Gel mit einer Farbstofflösung gefärbt (10 Essigsäure, 40% Methanol und 2 g/l Coomassie-Brilliantblau R-250), und es wurde die Produktivität pro Anzahl der Zellen des hCT(G)-Fusionsproteins verglichen, das von jedem Stamm erzeugt worden war. Die Ergebnisse der Elektrophorese sind in 7 gezeigt.
Wie aus 7 deutlich wird, erzeugte der Stamm W3110/pG97S4DhCT(G), der einen isoelektrischen Punkt von 4,43 bot, nur eine extrem kleine Menge des Fusionsproteins, wohingegen der Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R1, der einen isoelektrischen Punkt von 4,70 bot, nur eine kleine Menge des Fusionsproteins erzeugte. Es wurde also deutlich, daß die anderen Stämme eine große Menge des Fusionsproteins in den Zellen produzierten. Folglich zeigten diese Ergebnisse, daß die Produktivität des Fusionsproteins sowie auch die Menge seiner gebildeten Einschlußkörper gering wird, wenn der isoelektrische Punkt des Fusionsproteins in der Nähe von 4,5 bis 4,7 liegt.
Danach wurde eine Studie zur Produktivität des Fusionsproteins und der Effizienz durchgeführt, mit der hCT(G) mit V8-Protease unter den Bedingungen einer Kultur mit einem großen Volumen aus dem Fusionsprotein freigesetzt wird, indem eine Züchtung mit einem großen Volumen und die Produktion in 30 1 Züchtungstanks durchgeführt wurden, wobei die Stämme W3110/pG97S4DhCT(G)R3,
W3110/pG97S4DhCT(G)R4, W3110/pG97S4DhCT(G)R5,
W3110/pG97S4DhCT(G)R6, W3110/pG97S4DhCT(G)R8 und
W3110/pG97S4DhCT(G)R10 verwendet wurden.
Beispiel 3: Produktivität des Fusionsproteins unter Züchtungsbedingungen mit einem großen Volumen und Freisetzun von hCT(G) aus dem Fusionsprotein unter Verwendung von V8-Protease
Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um die Produktivität von Fusionsproteinen unter Züchtungsbedingungen mit einem großen Volumen und die Effizienz der Freisetzung von hCT(G) aus verschiedenen hCT(G)-Fusionsproteinen durch V8-Protease zu untersuchen.
Sechs Stämme mit einer starken Expression (W3110/ pG97S4DhCT(G)R3, W3110/pG97S4DhCT(G)R4, W3110/ pG97S4DhCT(G)R5, W3110/pG97S4DhCT(G)R6, W3110/ pG97S4DhCT(G)R8 und W3110/pG97S4DhCT(G)R10), bei denen die Bildung von Einschlußkörpern unter Verwendung des vorstehend genannten SB-Mediums in Kulturen in Kolben beobachtet worden war, wurden in 30 1 Züchtungstanks gezüchtet.
Das Medium enthielt 4 g/l Hefeextrakt, 4 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 4 g/l Dikaliumhydrogenphosphat, 2,7 g/l Natriumhydrogenphosphat, 1,2 g/l Ammoniumsulfat, 0,2 g/l Ammoniumchlorid, 2,0 g/l L-Methionin, 2,0 g/l MgSO₄·7H₂O, 40 mg/l FeSO₄·7H₂O, 40 mg/l CaCl₂·2H₂O, 10 mg/l AlCl₃·6H₂O, 4 mg/l CoCl₂·6H₂O, 2 mg/l ZnSO₄·7H₂O, 2 mg/l Na₂MoO₄·2H₂O, 1,0 mg/l CuCl₂·2H₂O, 0,5 mg/l H₃BO₃ und 10 mg/l MnSO₄·nH₂O, wobei in der ersten Phase der Züchtung Glucose (2%) als Kohlenstoffquelle verwendet wurde und nach dem Aufbrauchen der Glucose Glycerin (8%) als Kohlenstoffquelle verwendet wurde. Die Ergebnisse der schließlich erreichten Bakterienkonzentration sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, zeigte der Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R10 im Vergleich mit den anderen Stämmen ein beträchtlich schlechtes Wachstum, er erreichte eine am Ende erzielte Bakterienkonzentration, die ungefähr nur die Hälfte der der anderen Stämme betrug. Obwohl der isoelektrische Punkt des Fusionsproteins, das vom Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R10 erzeugt wurde, bei 7,85 leicht alkalisch war und es eine Zunahme der Produktivität des Fusionsproteins pro Zelle gab, was möglicherweise auf der schnellen Bildung von Einschlußkörpern oder darauf beruht, daß der isoelektrische Punkt des Fusionsproteins leicht alkalisch ist, wurde das Zellwachstum gehemmt, was zu einer geringen Zellkonzentration führte.
Auf der Basis der Ergebnisse dieser Untersuchungen wurde folglich durch die hier genannten Erfinder zum ersten Mal bestätigt, daß es für die Produktion eines Fusionsproteins als Einschlußkörper in Escherichia coli sowohl in beständigen als auch in großen Mengen wichtig ist, den isoelektrischen Punkt des Fusionsproteins im sauren Bereich zwischen 4,9 und 6,9 zu halten. Nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und dem Färben der Proteine wurde außerdem die Menge des Fusionsproteins, die pro Zellen erzeugt wurde, mit einem Gel-Scanner bestimmt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 als Menge der Einschlußkörper pro Zelle (relativer Wert) angegeben.
Wenn die Menge des Fusionsproteins pro Zellen für den Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R4 mit 100 angenommen wird, erzeugte jeder der Stämme 96 bis 116 Einschlüsse. Die Gesamtmenge der Einschlußkörper pro Kulturflüssigkeit betrug 6148 für den Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R10 und 31560 für den Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R8, was auf einen Unterschied mit einem Faktor von nahezu 2 hinweist. Obwohl der Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R8 die größte Gesamtmenge von Einschlußkörpern pro Nährbouillon zeigte, kam es bei der Produktion von hCT zu einer Spaltungsreaktion durch V8-Protease aus dem Fusionsprotein, wobei die Effizienz der Spaltungsreaktion durch V8-Protease aus dem Fusionsprotein eng mit der Ausbeute des Produktionsprozesses zusammenhängt.
Deshalb wurde eine Untersuchung der Effizienz der Spaltungsreaktion durch V8-Protease durchgeführt, wobei die erhaltenen Einschlußkörper verwendet wurden. Nach der Züchtung unter Verwendung der vorstehend genannten 30 1 Züchtungstanks wurden 1000 ml Nährbouillon entnommen, es folgte das Homogenisieren der Zellen mit einem Hochdruck-Homogenisierapparat (Manton Gaulin Laboratory Homogenizer 15M-8TA) mit 600 kg/cm². Der Niederschlag, der die Einschlußkörper enthielt, wurde durch 30minütiges Zentrifugieren mit 7000 U/min aufgefangen. Nachdem der gefällten Fraktion deionisiertes Wasser zugesetzt worden war, damit die Menge der Fraktion gleich dem Anfangsvolumen wird, wurde die Suspension erneut zentrifugiert, um den Niederschlag zu waschen.
Nachdem das Waschverfahren noch einmal wiederholt worden war, wurde der schließlich erhaltene Niederschlag mit deionisiertem Wasser suspendiert, so daß der OD660-Wert 800 betrug, und bei der Spaltungsreaktion mit V8-Protease verwendet, wie es nachstehend beschrieben ist. Nach der Entnahme von 0,6 ml der Suspension, der Zugabe von 75 μl 1 m Tris-HCl (pH = 8,0), 540 mg Harnstoff und 185 μl 100 mM DTT zu dieser Suspension und dem 10minütigen Stehenlassen bei 30°C wurde deionisiertes Wasser zugegeben, damit das Endvolumen 3,7 ml erreicht. Nachdem 10 Minuten bei 30°C vorgewärmt worden war, wurden 7 μl V8-Protease (1 mg/ml) zugesetzt, und das Ganze konnte 1 Stunde reagieren.
Die quantitative Bestimmung des abgespaltenen hCT(G) erfolgte durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer YMC-Füllkörperkolonne A-302 (0,46 cm × 15 cm, Yamamura Chemical Research). Das Eluieren wurde bei einem linearen Konzentrationsgradienten mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) und 0,1% TFA/50% Acetonitril durchgeführt. Dadurch wurde bestätigt, daß die Effizienz der Spaltung von hCT(G) aus dem Fusionsprotein in Abhängigkeit vom hCT(G)-Fusionsprotein stark schwankte.
Der Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R4 zeigte mit 97% die höchste Effizienz bei der Spaltung, wohingegen der Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)RS mit 7% die geringste Effizienz bei der Spaltung zeigte. Es gibt keinerlei Zusammenhang zwischen dieser Effizienz bei der Spaltung und der abschließenden Bakterienkonzentration. Außerdem wurde auch kein Zusammenhang mit der Anzahl der basischen Aminosäurereste des Linker-Peptids beobachtet, das in das Fusionsprotein eingeführt wurde. Andererseits wird angenommen, daß die Effizienz der Spaltung von der Aminosäuresequenz der Region der Erkennungsstelle für die Spaltung für V8-Protease beeinflußt wird. In jedem Fall wurde die Umwandlung von der Vorstufe von Human-Calcitonin in Human-Calcitonin durch ein Amidierungsenzym mit diesem Bakterienstamm vorgenommen, da der Stamm W3110/pG97S4DhCT(G)R4 die höchste gewonnene Menge von hCT(G) zeigte.
Beispiel 4: Reinigung der hCT(G)-Vorstufe und Umwandlung in Human-Calcitonin durch ein Amidierungsenzym
Nach der Züchtung des Stamms W3110/pG97S4DhCT(G)R4 in einem 20 1 Züchtungstank in der vorstehend beschriebenen Weise wurde eine Suspension von Einschlußkörpern des Fusionsproteins nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten. Nachdem 0,6 ml dieser Suspension der Einschlußkörper entnommen worden war, 750 μl 1 m Tris-HCl (pH = 8,0), 75 μl 0,5 m EDTA (pH = 8,0), 5,4 g Harnstoff und 17 mg DTT zugegeben worden waren und das Ganze 10 Minuten stehengelassen worden war, wurde deionisiertes Wasser zugesetzt, damit das Endvolumen 37 ml betrug. Danach wurden 40 μl V8-Protease (1 mg/ml) zugesetzt, um die Suspension 90 Minuten bei 37°C zu behandeln.
Danach wurde die Reaktionslösung mit deionisiertem Wasser um den Faktor 2 verdünnt, nach 30minütigem Stehenlassen wurde Essigsäure zugesetzt, um den pH-Wert auf 4,6 zu bringen. Als Folge der Verringerung des pH-Wertes auf 4,6 wurde β-gal97S4D des Schutzpeptids gefällt, wohingegen hCT(G) in der überstehenden Fraktion verblieb. Die überstehende Fraktion wurde durch 15minütiges Zentrifugieren abgetrennt, danach wurde diese überstehende Fraktion auf eine Säule mit SP-Sepharose (Tosoh) aufgebracht, die mit 10 mM Ammoniumacetat (pH = 4,6) ausgeglichen worden war, danach folgte die Säulenchromatographie. hCT(G) wurde mit 40 mM Ammoniumacetat (pH = 6,5) in Stufen eluiert. Pro Liter der Kulturflüssigkeit wurden etwa 0,4 g hCT(G) erhalten.
Human-Calcitonin konnte mit einer guten Effizienz produziert werden, wenn das in der vorstehenden Weise erhaltene hCT(G) nach dem Ver fahren, das in JP-A-2/190193 beschrieben ist, mit einem Amidierungsenzym umgesetzt wurde. Nach der Amidierungsreaktion wurde die Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit einer YMC-Füllkörperkolonne A-302 (Yamamura Chemical Research) durchgeführt, die Ergebnisse davon sind in 8 gezeigt. Bei diesen Eluierungsbedingungen eluierte Human-Calcitonin nach einer Verweilzeit von 9,7 Minuten, und aus dieser Figur wird klar, daß Human-Calcitonin mit hoher Reinheit mit einer extrem hohen Ausbeute erhalten werden kann.
Beispiel 5: Herstellung des Human-CNP-22-Gens
Ein Gen, das Human-CNP-22 codiert, bei dem ein Glutaminsäurerest, die Trennstelle der V8-Protease, an den N-Terminus angefügt ist, wurde wie nachstehend angegeben hergestellt, wobei die in vitro DNA-Amplifikation (PCR) angewendet wurde.
Das Plasmid pUCCNP 1 wurde für die Templat-DNA verwendet. 1,57 μg pUCCNP1 wurde 60 Minuten bei 37°C in 157 μl K-Puffer (20 mM Tris/HCl, pH = 8,5, 100 mM KCl und 1 mM Dithreitol, als DTT abgekürzt) mit 12 Einheiten EcoRI aufgeschlossen, um das Plasmid abzuspalten. Die Behandlung mit Phenol, die Behandlung mit 2-Butanol und die Fällung mit Ethanol wurden bei dieser Reaktionslösung nach gewöhnlich angewendeten Verfahren vorgenommen, und das mit EcoRI aufgeschlossene DNA-Fragment wurde in 157 μl TE-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH = 8,0, und 1 mM EDTA) gelöst.
Die Gestaltungen der Primer, die für die PCR-Reaktion verwendet wurden, sind in 9 gezeigt. Der Primer 1 (Sequenzidentifizierungsnummer 11) war so gestaltet, daß der Glutaminsäurerest, der durch V8-Protease abgespalten wird, an den N-Terminus von Human-CNP-22 angefügt ist, und EcoRI- und XhoI-Restriktionsenzym-Spaltungsstellen wurden weiter stromaufwärts vorgesehen, während der Primer 2 (Sequenzidentifizierungsnummer 12) so gestaltet war, daß die Sall-Re striktionsenzym-Spaltungsstelle unmittelbar nach dem Human-CNP-22-Gen vorgesehen ist. Diese Primer wurden mit einem DNA-Synthetisierapparat synthetisiert (Applied Biosystems, Modell 380A). Nach der Synthese wurde die Elektrophorese mit 20% Polyacrylamidgel durchgeführt, das 8 m Harnstoff enthielt, und die DNA-Fragmente mit einer Länge, die den Primern entspricht, wurden freigesetzt, wodurch jeder Primer erzeugt wurde.
Nachdem 10 ng pUCCNP 1, das mit den vorstehend genannten EcoRI abgespalten worden war, und 100 μl der Reaktionslösung (10 mM Tris/HCl, pH = 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Gelatine und jeweils 200 μM dGTP, dATP, dTTP und dCTP), die den Primer (jeweils 1 pmol) enthielt, 5 Minuten bei 95°C stehengelassen worden waren, wurden die Lösungen schnell mit Eis abgekühlt. Danach wurden 0,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Ampli-Taq, Takara Shuzo) zugesetzt, darauf folgte die Zugabe von Mineralöl, damit die PCR-Reaktion erfolgte, wobei ein Wärmereaktor (Hybaid) verwendet wurde.
Die PCR-Reaktion wurde für 30 Zyklen wiederholt, wobei ein einziger Zyklus aus aufeinander folgenden Reaktionen bestand, die aus dem thermischen Denaturieren (92°C, 1 Minute), dem Vereinigen (55°C, 2 Minuten) und der DNA-Elongation (72°C, 3 Minuten) bestand. Die DNA-Elongatinsreaktion des letzten Zyklus wurde außerdem weitere 7 Minuten durchgeführt. Nach der Reaktion und nach der Zugabe von TE-Puffer, damit das Volumen 400 μl erreicht, wurde das gesamte Volumen in eine SUPREC-02 (Takara Shuzo) gegeben und 8 Minuten mit 2000 G zentrifugiert. Das Filtrat wurde entnommen, und es wurde erneut 7E-Puffer zugesetzt, damit die Flüssigkeitsmenge 400 μl erreichte. Das Zentrifugierverfahren wurde dann in der gleichen Weise erneut durchgeführt. Die PCR-Reaktionslösung, die im Filterbecher verblieb, wurde mit TE-Puffer auf ein Volumen von 40 μl gebracht.
5 μl des 10fach konzentrierten High-Puffers (100 mM Tris/HCl, pH = 7,5, 1 m NaCl, 100 mM MgCl₂ und 10 mM DTT), 36 Einheiten EcoRI und 60 Einheiten Sall wurden zu 40 μl des PCR-Reaktionsgemischs gegeben. Nachdem das Gesamtvolumen mit Wasser auf 50 μl gebracht worden war, konnte die Reaktion 60 Minuten bei 37°C andauern. Nach der Reaktion wurden eine Behandlung mit Phenol, eine Behandlung mit 2-Butanol und die Fällung mit Ethanol durchgeführt, und der Niederschlag wurde schließlich in TE-Puffer gelöst, wodurch das Human-CNP-22-Gen mit kohäsiven EcoRI- und Sall-Enden an beiden Enden des Gens hergestellt wurde.
Beispiel 6 a): Konstruktion des Expressionsplasmids pG97S4DhCNP-22
Das in 10 gezeigte PCR-Produkt des CNP-22-Gens wurde in das Plasmid pG97S4DhCT(GRRR) eingefügt, das das Gen β-gal97S4D enthielt (ein Peptid, das aus 97 Aminosäuren des N-Terminus von β-Galactosidase besteht, bei dem ein Cysteinrest durch einen Serinrest ersetzt ist und 4 Glutaminsäurereste durch Aspartinsäurereste ersetzt sind). Dieses Konstruktionsverfahren ist nachstehend beschrieben.
10 μg pG97S4DhCT(GRRR) wurde 6 Minuten bei 37°C in 70 μl High-Puffer mit 36 Einheiten EcoRI und 60 Einheiten SalI aufgeschlossen. Nach der Reaktion wurde die Gelelektrophorese mit 1,0% Agarose nach gewöhnlich angewendeten Verfahren durchgeführt, und aus dem Gel wurde das Band des 3,2 kb EcoRI-SaII-Fragmentes ausgeschnitten. Das DNA-Fragment im Gelschnitt wurde mit einem Mikrozentrifugenröhrchen SUPREC-01 (Takara Shuzo) extrahiert, danach folgte die Reinigung durch eine Behandlung mit Phenol, eine Behandlung mit Chloroform und die Fällung mit Ethanol.
Danach wurden jeweils 5 μl dieses EcoRI-SaII-DNA-Fragmentes und des PCR-Produktes in Form des Human-CNP-22-Genfragmentes (EcoRI-Sall-DNA-Fragment) gemischt und mit einem DNA-Verknüpfungs-Kit (Takara Shuzo) verknüpft. Das Verknüpfungsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli W3110 zu transformieren, und eine der Transformanten wurde als Stamm W3110/pG97S4DhCNP-22 bezeichnet.
Beispiel 6 b): Konstruktion des Expressionsplasmids pG97S4DhCNP-22R3-2 und pG97S4DhCNP-22R5-2
Es wurde folgendes Verfahren durchgeführt, um ein Linker-Peptid-Gen, das die Aminosäuresequenz von R3-2 oder R5-2 codiert, die in 11 gezeigt ist, in die Linker-Peptid-codierende Region zwischen dem Gen β-gal197S4D und dem Human-CNP-22-Gen einzufügen. Die Konstruktion von pG97S4DhCNP-22R3-2 und pG97S4DhCNP-22R5-2 ist in 12 gezeigt.
3 μg pG97S4DhCNP-22 wurde 2 Stunden bei 37°C in 50 μl High-Puffer jeweils mit 10 Einheiten EcoRI und XhoI aufgeschlossen. Nach der Reaktion wurde die Gelelektrophorese mit 1% Agarose durchgeführt, und ein 3,2 kb DNA-Fragment wurde durch Elektroelution aus dem Gel isoliert. Bei diesem DNA-Fragment und 20 pmol des chemisch synthetisierten Oligonucleotids, das die Sequenzen von R3-2 und R5-2 codiert, wurde eine Verknüpfung mit einem Verknüpfungs-Kit (Takara Shuzo) vorgenommen. Das Verknüpfungsgemisch diente dazu, Escherichia coli W3110 zu transformieren. Nach der Isolation des Plasmids aus dem tetracyclinresistenten, transformierten Stamm wurde eine Strukturanalyse des Plasmids vorgenommen, wobei Restriktionsenzyme verwendet wurden, wodurch die zu erzielenden W3110/pG97S4DhCNP-22R3-2 und W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 erhalten wurden.
Beispiel 6 (c): Konstruktion von pG97S4DhCNP-22R5-3
Es wurde folgendes Verfahren durchgeführt, um ein Linker-Peptid-Gen, das die Aminosäuresequenz von R5-3 codiert, die in 11 gezeigt ist, in das Plasmid pG97S4DhCNP-22 einzufügen. Die Konstruktion von pG97S4DhCNP-22R5-3 ist in 13 gezeigt.
3 μg pG97S4DhCNP-22 wurden 2 Stunden bei 37°C in 50 μl High-Puffer mit 10 Einheiten EcoRI aufgeschlossen. Nach dem Aufschließen wurde 0,5 Einheit alkalische Phosphatase zugesetzt, um den 5'-Terminus 1 Stunde bei 37°C zu dephosphorylieren. Danach wurde die Phenolbehandlung vorgenommen, um die alkalische Phosphatase zu inaktivieren. Es wurde die Gelelektrophorese mit 1% Agarose durchgeführt, und das 3,2 kb DNA-Fragment wurde durch Elektrophorese vom Gel abgetrennt. Danach wurden 3 μg chemisch synthetisiertes Oligonucleotid, das die Aminosäuresequenz von R5-3 codiert, 1 Stunde bei 37°C mit 20 Einheiten T₄-Polynucleotidkinase in 100 μl einer T₄-Polynucleotidkinase-Reaktionslösung (50 mM Tris/HCl, pH = 8,0, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM ATP) behandelt, um das 5'-Ende zu phosphorylieren.
Danach wurde eine Verknüpfung von 2 μl dieses phosphorylierten Oligonucleotids und des vorstehend genannten, mit EcoRI gespaltenen, mit alkalischer Phosphatase behandelten pG97S4DhCNP-22 vorgenommen. Das Verknüpfungsgemisch diente dazu, Escherichia coli W3110 zu transformieren, und es wurden tetracyclinresistente Transformanten erhalten. Die Plasmide wurden durch Restriktionsenzyme analysiert, und es wurde W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3 erhalten.
Beispiel 7: Expression des Human-CNP-22-Fusionsproteins
Um den Zusammenhang zwischen den isoelektrischen Punkten der Fusionsproteine, die in mikrobiellen Zellen ausgeprägt worden sind, und der Produktivität zu prüfen, wurden Mikroorganismen gezüchtet, und die Produktivität des Fusionsproteins pro Anzahl der Zellen wurde unter Anwendung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht.
Stämme von Escherichia coli wurden 12 Stunden bei 37°C in Kolben in 500 ml Nul-Medium (0,4 g/l Hefeextrakt, 4 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 4 g/l Dikaliumhydrogenphosphat, 2,7 g/l Dinatriumhydrogenphosphat, 1,2 g/l Ammoniumsulfat, 0,2 g/l Ammoniumchlorid, 0,8% Glycerin, 2 g/l Magnesiumsulfat und 10 mg/l Tetracyclin) gezüchtet.
Nach der Züchtung wurde die Trübung (OD₆₆₀) der Nährbouillon mit einem Spektrophotometer gemessen, und die Nährbouillon wurde so eingestellt, daß der Wert für (OD660-Wert × Kulturvolumen (ml)) 5 betrug und es wurde 5 Minuten mit 12000 U/min zentrifugiert, um die mikrobiellen Zellen abzutrennen. 1 ml des SDS-Probenpuffers (63 mM Tris/HCl, pH = 6,8, 10% Glycerin, 10% SDS, 5% 2-Mercaptoethanol und 12,5 mg/l Bromphenolblau) wurden diesem Zellniederschlag zugesetzt und er wurde 5 Minuten bei 95°C erwärmt, wodurch die Probe für die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese erhalten wurde.
Die SDS-Gelelektrophorese mit 15% Polyacrylamid (TEFCO) wurde 90 Minuten mit 15 μl der vorstehend genannten Probe unter den Bedingungen von 18 mA durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in einer Farbstofflösung (10% Essigsäure, 40% Methanol und 2 g/l Coomassie-Brilliantblau R-250) gefärbt, und es wurde die Produktivität pro Zelle des in jedem Stamm erzeugten Human-CNP-22-Fusionsproteins verglichen. Die Ergebnisse der Elektrophorese sind in 14 gezeigt.
Wie in 14 gezeigt, ist es klar, daß, wenn der Stamm W3110/pG97S4DhCNP-22, der einen isoelektrischen Punkt von 4,56 liefert, mit den anderen Stämmen verglichen wird (W3110/pG97S4DhCNP-22R3-2, der einen isoelektrischen Punkt von 4,95 liefert, W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2, der einen isoelektrischen Punkt von 6,22 liefert, und W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3, der einen isoelektrischen Punkt von 5,59 liefert), die Stämme W3110/pG97S4DhCNP-22R3-2, W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 und W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3 eine bessere Produktivität des Fusionsproteins als der Stamm W3110/pG97S4DhCNP-22 zeigten.
Es wurde insbesondere deutlich, daß die Stämme W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 und W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3 eine große Menge des Fusionsproteins ausprägten. Folglich wurde in diesem Beispiel auch bestätigt, daß eine Regelung des isoelektrischen Punktes des Fusionsproteins im Bereich von 4,9 bis 6,9 zu einer verbesserten Produktivität des Fusionsproteins führt.
Beispiel 8: Freisetzung von Human-CNP-22 aus dem Fusionsprotein durch V8-Protease
Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um die Effizienz der Freisetzung von Human-CNP-22 aus dem Fusionsprotein unter Verwendung von V8-Protease zu prüfen.
Nach der Züchtung der Stämme W3110/pG97S4DhCNP-22R3-2, W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 und W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3 im vorstehend genannten Nul-Medium wurden 400 ml der Nährbouillon gewonnen und mit einem Hochdruck-Homogenisierapparat (Manton . Gaulin Laboratory Homogenizer 15M-8TA) mit 600 kg/cm2 homogenisiert.
Der Niederschlag, der Einschlußkörper enthielt, wurde durch 30minütiges Zentrifugieren mit 7000 U/min aufgefangen. Der entstandenen Niederschlagsfraktion wurden 400 ml Puffer A (50 mM Tris/HCl, pH = 8,0, 2 mM EDTA und 1% Triton X-100) zugesetzt, und der Niederschlag wurde gewaschen, indem er nach dem Suspendieren erneut zentrifugiert wurde. Dieses Fällungsverfahren wurde zweimal mit dem Puffer A und einmal mit deionisiertem Wasser durchgeführt. Nach dem Suspendieren des schließlich erhaltenen Niederschlags in deionisiertem Wasser, so daß der OD660-Wert 20 betrug, wurde das Fusionsprotein durch V8-Protease abgespalten, wobei das nachstehend gezeigte Verfahren angewendet wurde.
6 μl 1 m Tris/HCl (pH = 8,0), 0,6 μl 0,5 mM EDTA, 36 mg Harnstoff und 3 μl 1 m DTT wurden zu 60 μl der Suspension der Einschlußkörper gegeben und danach wurde das Ganze 10 Minuten stehengelassen. Nach dem Stehenlassen wurde deionisiertes Wasser zugesetzt, damit das Endvolumen 300 μl erreichte. Dann wurde 1 μl V8-Protease (1 mg/ml) zugesetzt, und die Spaltungsreaktion konnte 1 Stunde bei 30°C andauern. Die quantitative Bestimmung des aus dem Fusionsprotein abgespaltenen Human-CNP-22 wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) mit der YMC-Füllkörperkolonne A-302 (2,46 cm × 15 cm, Yamamura Chemical Research) durchgeführt.
Die Reaktionslösung von V8-Protease wurde mit 20 m Harnstoff und einer 6%-igen Essigsäurelösung um den Faktor 20 verdünnt, danach folgte die HPLC-Analyse unter Verwendung von 20 μl dieser verdünnten Lösung. Die HPLC-Elution erfolgte bei einem linearen Konzentrationsgradienten mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), 0,1% TFA und 50% Acetonitril. Die Elutionskurven vor und nach der Spaltung des β-gal97S4DhCNP-22R5-3-Fusionsproteins durch V8-Protease sind in 15 bzw. 16 gezeigt. Wie aus den 15 und 16 deutlich wird, stimmte der Peak, der vom mit V8-Protease aufgeschlossenen Fusionsprotein erschien, mit dem des Human-CNP-22-Standards überein, was darauf hinweist, daß das Human-CNP-22 spezifisch vom Fusionsprotein freigesetzt wird.
Die Freisetzung von Human-CNP-22 fand auch in β-ga197S4DhCNP-22R5-2 und β-ga197S4DhCNP-22R3-2 wirksam statt, wobei Peaks identifiziert wurden, die mit dem Human-CNP-22-Standard übereinstimmten. Die Effizienz der Freisetzung des Human-CNP-22, das unter den vorstehend genannten Bedingungen abgespalten worden war, betrug für pG97S4DhCNP-22R3-2 99%, für pG97S4DhCNP-22R5-2 95 und für β-gal97S4DhCNP-22R5-3 92%.
Auf der Basis der vorstehend beschriebenen Ergebnisse wurde nicht nur in dem Beispiel von Human-Calcitonin, von dem die hier genannten Erfinder bereits berichtet hatten, sondern auch in diesem Beispiel bestätigt, daß bei der Produktion von Human-CNP-22 in einer großen Menge Human-CNP-22 produziert werden kann, wenn die Ladung der Aminosäuren der Linker-Peptid-Region so geändert werden, daß der isoelektrische Punkt des Fusionsproteins im Bereich von 4,9 bis 6,9 liegt, und daß CNP-22 auch spezifisch aus dem Fusionsprotein freigesetzt wird, das in der vorstehend genannten Weise in einer großen Menge erzeugt worden ist, wenn V8-Protease verwendet wird.
In der vorliegenden Arbeit wurde von den hier genannten Erfindern zum ersten Mal bestätigt, daß ein Fusionsprotein in großen Mengen in Form von Einschlußkörpern in mikrobiellen Zellen produziert werden kann, wenn das Fusionsprotein so gestaltet wird, daß dessen isoelektrischer Punkt auf der sauren Seite ist, wodurch die Produktion einer großen Menge des Fusionsproteins möglich wird, das das Zielpeptid enthält.
Folglich kann eine hohe Produktivität des Fusionsproteins, das das Zielpeptid enthält, durch Züchtung in einem großen Volumen unter Verwendung von Wirtszellen erreicht werden, die im erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, wobei dies in industriellem Umfang angemessen bei der Produktion physiologisch aktiver Peptide angewendet werden kann.
Außerdem wurde ein Verfahren geschaffen, bei dem nach der Züchtung in einem großen Volumen unter Verwendung von Wirtszellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, eine Vorstufe von Human-Calcitonin oder Human-CNP-22 aus dem Fusionsprotein freigesetzt und gereinigt wird. Außerdem wurde nachgewiesen, daß die Vorstufe von Human-Calcitonin in großem Umfang in reifes Calcitonin überführt wurde, wobei ein amidierendes Enzym verwendet wurde.
SEQUENZAUFSTELLUNG

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Zielpeptids, ausgewählt aus Calcitonin, einer Calcitonin-Vorstufe, einem Natriuretikum-Peptid (NP), einem Zellwachstumsfaktor und einem Parathormon, welches umfaßt: (a) Züchten von Wirtszellen, die mit einem Vektor transformiert sind, der ein Gen ausprägen kann, das ein Fusionsprotein codiert, das mit der Formel A-L-B angegeben werden kann, worin B das Zielpeptid ist; A ein Schutzpeptid ist, das ein N-terminales Fragment mit 90 bis 210 Aminosäuren von β-Galactosidase von E.coli ist; und L ein Linker-Peptid zwischen dem C-Terminus des Schutzpeptids und dem N-Terminus des Zielpeptids ist; wobei das Linker-Peptid L ein Teil der in der Sequenzidentifizierungsnummer 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist, die 3 bis 8 Argininreste enthält, das so ausgewählt ist, daß sich das Zielprotein abtrennt, wenn das Fusionsprotein mit einer bestimmten chemischen Substanz, wie einem Enzym, behandelt wird, und das gesamte Fusionsprotein einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 4,9 bis 6,9 erhält; (b) Homogenisieren der gezüchteten Wirtszellen, wodurch eine unlösliche Fraktion erhalten wird, die Einschlußkörper umfaßt; (c) Lösen des Fusionsproteins in den Einschlußkörpern durch Behandeln der unlöslichen Fraktion mit einem löslichmachenden Mittel; und (d) Spalten der Peptidbindung zwischen dem C-terminalen Aminosäurerest des Linkers und dem N-Terminus des Zielpeptids, wodurch das Zielpeptid freigesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Linker-Peptid von einem Teil der Nucleotidsequenz 403 bis 495 des pBR322-Tetracyclin-Resistenzgens codiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Zielpeptid Human-Calciton ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Zielpeptid Natriuretikum-Peptid des Vorhofs, Natriuretikum-Peptid des Gehirns oder Natriuretikum-Peptid vom C-Typ (CNP) ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Zielpeptid CNP-22 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Wirtszellen E.coli sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Schutzpeptid aus den N-terminalen Aminosäuren 1 bis 97 von β-Galactosidase besteht.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei in dem N-terminalen β-Galactosidasefragment-Schutzpeptid Serinreste die Cysteinreste ersetzen und Asparaginsäurereste vier Glutaminsäurereste ersetzen.
Verfahren zur Herstellung eines Zielpeptids, ausgewählt aus Calcitonin, einer Calcitonin-Vorstufe, einem Natriuretikum-Peptid (NP), einem Zellwachstumsfaktor und einem Parathormon, welches umfaßt: (a) Züchten von Wirtszellen, die mit einem Vektor transformiert sind, der ein Gen ausprägen kann, das ein Fusionsprotein codiert, das mit der Formel A-L-B angegeben werden kann, worin B das Zielpeptid ist; A ein Schutzpeptid ist, das ein N-terminales Fragment mit 90 bis 210 Aminosäuren von β-Galactosidase von E.coli ist; und L ein Linker-Peptid zwischen dem C-Terminus des Schutzpeptids und dem N-Terminus des Zielpeptids ist, das Linker-Peptid L so ausgewählt wird, daβ erstens sich das Zielprotein abtrennt, wenn das Fusionsprotein mit einer bestimmten chemischen Substanz, wie einem Enzym, behandelt wird, und zweitens das gesamte Fusionsprotein einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 4,9 bis 6,9 erhält; (b) Homogenisieren der gezüchteten Wirtszellen, wodurch eine unlösliche Fraktion erhalten wird, die Einschlußkörper umfaßt; (c) Lösen des Fusionsproteins in den Einschlußkörpern durch Behandeln der unlöslichen Fraktion mit einem löslichmachenden Mittel; und (d) Spalten der Peptidbindung zwischen dem C-terminalen Aminosäurerest des Linkers und dem N-Terminus des Zielpeptids, wodurch das Zielpeptid freigesetzt wird, wobei jedoch Verfahren ausgenommen sind, bei denen das Linker-Peptid ein einzelner Lysin-, Arginin-, Glutaminsäure- oder ein Methioninrest ist, der im Schritt (d) abgespalten wird.