DK175535B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt cysteinholdigt peptid - Google Patents

Description

i DK 175535 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt peptid, der indeholder mindst én cysteinrest (i det følgende betegnet målpeptid).

Der har været mange forsøg på at udvinde fysiologisk aktive peptider ' 5 eller proteiner af eukaryot oprindelse i mikrobeceller såsom Escheri chia coli-celler under anvendelse af rekombinant-DNA-teknikker.

Til fremstilling af et relativt lille peptid, som let nedbrydes i mikrobeceller såsom E. coli, anvendes der sædvanligvis en fremgangsmåde, ved hvilken et ønsket peptid eller protein produceres i mikro-10 beceller som en proteinfusion med et andet peptid eller protein, og det producerede fusionsprotein spaltes derefter kemisk eller enzymatisk, hvilket frigør det ønskede peptid eller protein, og det ønskede peptid eller protein isoleres og oprenses.

Der kendes forskellige metoder til frigørelse af et ønsket peptid fra 15 et fusionsprotein. I tilfælde af, at det ønskede peptid ikke indeholder methioninrester, produceres det ønskede peptid soro et fusionsprotein, hvor det ønskede peptid fusioneres med et partnerprotein via en methioninrest, og det ønskede peptid frigøres fra partnerproteinet ved spaltning ved methioninresten med cyanogenbromid (Science 198, 20 1059 (1977), og Proc. Hati. Acad. Sci. USA 76, 106 (1978)). I til fælde af, at det ønskede peptid ikke indeholder arginin- eller lysin-rester, produceres det ønskede peptid som et fusionsprotein, hvor det ønskede peptid fusioneres med et partnerprotein via arginin- eller lysinresten, og det ønskede peptid frigøres fra partnerproteinet ved 25 proteolytisk spaltning ved arginin- eller lysinresten med trypsin, som specifikt spalter en peptidbinding ved C-terminalen af arginin-eller lysinresten (Nature 285, 456, 1980). I nogle tilfælde kan der desuden anvendes Achroroobacter-protease I (i det følgende betegnet API, også kendt som lysyl-endopeptidase), som specifikt spalter en 30 peptidbinding ved C-terminalen af en lysinrest.

I mange tilfælde vælges et partnerprotein, der danner et fusionsprotein i kombination med et ønsket peptid, blandt proteiner, som naturligt produceres af en værtsorganisme. I dette tilfælde anvendes der som partnerprotein sædvanligvis et polypeptidfragment, der har en

I DK 175535 B1 I

I 2 I

I passende størrelse, og som er afledt fra den N-terminale del af et I

I protein, som produceres i store mængder af værten. 1 et sådant til- I

I fælde antages det, at partnerproteinets størrelse påvirker det ønske* I

de peptids produktivitet. Selv om det fx antages, at der ved anven- I

5 delse af et partnerprotein med lille størrelse fås en større mængde I

I af det ønskede peptid, fordi der er en højere andel af det ønskede ,. I

I peptid i fusionsproteinet, observeres dette ikke altid. I tilfælde af I

I insulinproduktion under anvendelse af E. coli Ø-galactosidase som I

I partner i et fusionsprotein gælder det fx, at selv om en nedgang i I

I 10 størrelsen af £-galactosidase-området giver en forøget produktion af I

I det ønskede insulin, da formindsker en yderligere nedgang i størrel- I

I sen af /?-galactosidasen produktionen af det ønskede insulin (Gene 29, I

I 251, 1984). Det fremgår af ovenstående, at når et bestemt peptid skal I

I produceres som et fusionsprotein, er der ingen regler, som afgør den I

I 15 størrelse af et partnerprotein, der giver den maksimale produktivitet I

af et ønsket peptid. I

I Det mest afgørende punkt roed hensyn til effektiv produktion af et I

målpeptid er derfor valg af det bedst egnede partnerprotein, således I

I at målpeptidet effektivt udtrykker et fusionsprotein af målpeptidet I

I 20 og partnerproteinet, og målpeptidet effektivt kan isoleres fra fu- I

sionsproteinet. Da der imidlertid ikke er fastslået en generel regel I

I for et sådant valg, må de optimale betingelser for et bestemt målpep- I

tid findes ved eksperimenter. I

I Som eksempler på et målpeptid, der indeholder cysteinrester, kan der I

I 25 nævnes α-type human atrial natriuretisk polypeptid (i det følgende I

I betegnet α-hANP) og human calcitonin-precursor (i det følgende be- I

I tegnet HPTC), og problemerne med at producere disse peptider ved I

I rekombinant-DNA-teknik er beskrevet i detaljer nedenfor. I

I α-hANP er et peptid, som består af 28 aminosyrerester og indeholder I

I 30 to cysteinrester i position 7 og 23, der danner en intramolekylær I

disulfidbinding, og det har følgende formel (I) I

3 DK 175535 B1 5 10 H-Ser-Leu-Arc-Aro-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arc- (1) L-S-S—i 15 20 ! 25

(2) -Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH

hvor (1) og (2) er direkte forbundet.

o-hANP blev ekstraheret og oprenset fra humane atrier af Matsuo og 5 Kangawa (EP 0147193). o-hANP har en bemærkelsesværdig natriuretisk virkning og blodtrykssænkende virkning (Biochem. Biophys. Res. Com-mm.,118, 131-139, 1984).

HPCT er på sin side et peptid, der består af 36 aminosyrerester og indeholder to cysteinrester i position 1 og 7, der danner en intra-10 molekylær disulfidbinding, og det har følgende formel (II) i-s~s-1 H-Cye-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Ket-Leu-Gly-Thr-Tyr-(1) (2)-Thr-Gln-Asp-Phe-ABn-Lye-Phe-Hie-Thr-Phe-Pro-Gln-(3)

(4)-Thr- Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lye-LyE-Arg-OH

hvor (1) er direkte forbundet med (2), og (3) er direkte forbundet med (4).

15 HPCT er kendt som et mellemprodukt for human calcitonin svarende til en sekvens fra den første aminosyre til den 32. aminosyre i formlen (II) (Nature 295, 345-347, 1982).

Selv om disse peptider nu kan syntetiseres kemisk, er fremgangsmåden til kemisk syntese af en stor mængde af disse peptider arbejdskræven-20 de og tidsrøvende. Da disse peptider især er beregnet til brug som farmaceutiske midler, er der derfor et stort behov for en enkel og billig fremgangsmåde til storskala-produktion af disse peptider.

For at løse de ovenfor nævnte problemer er der gjort forsøg på at producere sådanne peptider under anvendelse af rekombinant-DNA-tek-

DK 175535 B1 I

nik. Til fremstilling af α-hANP udtrykkes α-hANP fx som et fusions- I

protein, der omfatter α-hANP og E. coli Trp E-proteinet, og en rå-

ekstrakt, der indeholder fusionsproteinet fremstillet fra en sprængt I

celle, behandles med lysyl-endopeptidase eller en koagulationsfaktor

5 Xa for at frigøre α-hANP fra fusionsproteinec (Seikagaku 57(8), 854, I

1984). Ved denne fremgangsmåde er isoleringsprocessen imidlertid _ I

kompliceret, og den isolerede mængde målpeptid fra fusionsproteinet I

er lille, hvorfor denne fremgangsmåde ikke er praktisk. For at løse I

dette problem har nærværende opfindere tilvejebragt en fremgangsmåde,

10 ved hvilken målpeptidet udtrykkes som et fusionsprotein til frem- I

stilling af et fysiologisk aktivt peptid, der ikke indeholder en I

lysinrest, repræsenteret af α-hANP, hvilket fusionsprotein omfatter I

målpeptidet og et partnerpolypeptid på 90-220 aminosyrerester, der I

ikke indeholder en lysinrest, som er bundet via en lysinrest, og I

15 fusionsproteinet behandles med lysyl-endopeptidase for at frigøre

målpeptidet (JP 61-101100). Imidlertid giver denne forbedrede frem- I

gangsmåde ikke en tilfredsstillende isoleringseffektivitet af målpep- I

tidet. I

Til fremstilling af HPCT har nærværende opfindere på den anden side I

20 beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af et HPCT-derivat, ved

hvilken fremgangsmåde den 8. methioninrest omdannes til en valinrest I

i formlen (II) (JP 58-203953). Ved denne fremgangsmåde udtrykkes I

målpeptidet først som et fusionspeptid med E. coli-alkalisk phospha- I

tase, hvorefter fusionsproteinet behandles med cyanogenbromid til I

25 dannelse af målpeptidet. Som beskrevet for α-hANP har denne frem- I

gangsmåde imidlertid heller ikke en tilfredsstillende isolerings- I

effektivitet af målpeptidet fra fusionsproteinet. I modsætning til I

disse tilfælde er det kendt, at isoleringseffektiviteten af målpepti- I

det fra et fusionsprotein ved fremstilling af et peptid, der ikke I

30 indeholder cysteinrester, ved rekombinant-DNA-teknik er højere end i I

tilfælde af et målpeptid, der indeholder én eller flere cysteinre- ster. En nøglefaktor ved effektiv produktion af et peptid, der inde-

holder én eller flere cysteinrester, er derfor en forøgelse i isole- I

ringseffektiviteten af målpeptidet fra fusionsproteinet. En løsning I

35 på dette problem er for tiden meget efterstræbt. I

5 DK 175535 B1

Den foreliggende opfindelse angår derfor en fremgangsmåde, der kan anvendes til storskala-produktion af et peptid, som indeholder én eller’ flere cysteinrester, og den angår især selektion af et partnerprotein og en linkeraminosyre, som binder partnerproteinet og 5 målpeptidet i et fusionsprotein.

Nærværende opfindere har i detaljer undersøgt årsagerne til den kendte tekniks ulemper og har fundet, at der i tilfælde af et fusionsprotein, der omfatter et ønsket peptid og et partnerprotein, der begge indeholder en cysteinrest, dannes en disulfidbinding mellem 10 cysteinresten i det ønskede peptid og cysteinresten i partnerproteinet, hvilket medfører et lavere udbytte af det ønskede peptid, og de har fundet, at hvis der anvendes et partnerprotein, som ikke indeholder en cysteinrest, kan problemet løses.

15 Den foreliggende opfindelse angår derfor en fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt cysteinholdigt målpeptid, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: (1) dyrkning af Escherichia coli, som er transformeret med plasmid, der er i stand til at udtrykke et fusionsprotein under 20 regulering af en promotor af E. coli-oprindelse eller en pro motor af fagoprindelse, idet fusionsproteinet har følgende formel A - L - B, hvor B betegner målpeptidet; A betegner et cysteinfrit part-nerpolypeptid, som omfatter fra 90 til 220 aminosyrer svarende 25 til et N-terminalt område af E. coli-β-galactosidase, og som har aminosyrerester, der ikke er cystein, substitueret på et hvilket som helst cystein-sted i den native sekvens; og L betegner en linker-aminosyre mellem C-terminalen på partner-polypeptidet og N-terminalen på målpeptidet, idet linker-aminosyren er valgt på en sådan måde, at den kan spaltes af en 30 protease eller kan selektivt kemisk nedbrydes, og ikke er til stede i målpeptidet;

I DK 175535 B1 I

I I

I (2) sprængning a£ de dyrkede celler og udvinding af en uopløselig I

I fraktion, som indeholder fusionsproteinet; I

I (3) solubilisering af fusionsproteinet med et solubiliserings- I

I middel og behandling af det solubiliserede fusionsprotein med I

I proteasen eller det egnede kemiske stof for at frigøre målpep- - I

I tidet, og isolering af målpeptidet. I

I Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret under I

I henvisning til tegningen, på hvilken I

I fig. 1 viser en fremgangsmåde til konstruktion af et ekspressions- I

I plasmid pGHa210(Ser)rop* til et fusionsprotein, der omfatter I

I 10 o-hANP som målpeptid og /Jgal 210(Ser) som partnerprotein. I

I Øgal 210(Ser) er et derivat af et Øgal 210-protein, hvor I

I cysteinrester er erstattet med serinrester; I

I fig. 2 en fremgangsmåde til konstruktion af et ekspressionsplasmid I

I pGHa97(Ser)rop‘ til et fusionsprotein, der omfatter o-hANP og I

I 15 Øgal 97(Ser) som partnerprotein, Øgal 97(Ser) er et derivat I af et Øgal 97-protein, hvor cysteinresteme i Øgal 97 er

I erstattet med serinrester; -I

I fig. 3 en fremgangsmåde til konstruktion af et ekspressionsplasmid I

I pGHa97S for Øgala97(Ser)ohANP, hvilket plasmid er et derivat I

I 20 af plasmidet pGJla97(Ser)rop', hvor en attenuatorterminator af I

I tryptophan-operon (trp a) er indsat umiddelbart nedstrøms for I

I α-hANP-strukturgenet i pGHa97(Ser)rop*, og det 3'-ikke-koden- I

I de område i α-hANP cDNA er elimineret; I

I fig·. 4 resultatet af SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) af I

I 23 ekspressionsprodukter fra plasmiderne pGHa97(Ser)rop' (bane I

I 2) og pGHa97S (bane 3), hvilket repræsenterer virkninger på I

I produktionen af fusionsprotein ved fjernelse af det 3'-ikke- I

I kodende område i α-hANP-genet og indføring af trp a umiddel-

I bart nedstrøms for α-hANP-genet; I

I 30 fig. 5 resultatet af SDS-PAGE af ekspressionsprodukter fra E. coli I

I W3110/pGHa97S, hvor M betegner en molekylvægtstandard, T I

I betegner ekspressionsprodukter i en dyrket sprængt celle, S I

DK 175535 B1 7 betegner produkter i en supernatant fra den sprængte celle, og P betegner produkter i et præcipitat fra den sprængte celle; fig. 6 en fremgangsmåde til konstruktion af et ekspressionsplasmid 5 pGHa97SE for Øgal 97(Ser)ahANP, hvor et forbindelsessted mellem Øgal 97(Ser) og o-hANP er omdannet til Clu-Phe-Lys; fig. 7 resultatet af SDS-PAGE af ekspressionsprodukter fra plasmidet pGHa97S og pGHa97SE hydrolyseret med API. SDS-PAGE sammenligner den forskel i effektiviteten af hydrolyse af fusions-10 proteinerne, der skyldes forskellen i o-hANP-forbindelses- stedet, med Øgal 97(Ser); fig. 8 en fremgangsmåde til konstruktion af et ekspressionsplasmid pPLlacZ'97(Ser)ehANP, som udtrykker et fusionsprotein under kontrol af en P^-promotor fra λ-fagen; 15 fig- 9 en fremgangsmåde til konstruktion af et ekspressionsplasmid pINlacZ*97(Ser)cthANP, som udtrykker et fusionsprotein under kontrol af en E. coli-lpp-promotor; fig. 10 en elueringsprofil af omvendt-fase-højtryksvæskechromatogra-fi (HPLC) for et o-hANP-målpeptid oprenset fra et Øgal 20 97(Ser)ahANP-fusionsprotein; fig. 11 en fremgangsmåde til konstruktion af et ekspressionsplasmid pGHel007 for et ØgalehANP-fusionsprotein; fig. 12 en fremgangsmåde til konstruktion af ekspressionsplasmiderne pGHa650, pGHct439 og pGHa210, der hver især udtrykker et 25 forkortet ØgalahANP-fusionsprotein; fig. 13 en fremgangsmåde til konstruktion af plasmidet pGHo210rop'; fig. 14 en fremgangsmåde til konstruktion af plasmidet pGHa210EcoRI; fig. 15 en fremgangsmåde til konstruktion af plasmidet pLacZ'210a- hANP, der udtrykker et fusionsprotein under kontrol af en P^-30 promotor fra en λ-fag; fig. 16 en fremgangsmåde til konstruktion af plasmidet pGHaBal43; fig. 17 en fremgangsmåde til konstruktion af plasmidet pIN5GIF54; fig. 18 en fremgangsmåde til konstruktion af plasmidet pIN5T4; fig. 19 en fremgangsmåde til konstruktion af plasmidet pG97SHPCT; og 35 fig- 20 skæring af fusionsproteinet ØGal97SHPCT med proteasen Vg.

Den foreliggende opfindelse kan anvendes ved fremgangsmåder til fremstilling af et hvilket som helst fysiologisk aktivt peptid, der

I DK 175535 B1 I

I 8 I

I indeholder mindst én cysteinrest. Sådanne peptider omfatter foruden I

I a-hANP og HPCT, der er beskrevet i detaljer i nærværende beskrivelse, I

I insulin A-kæde og B-kæde, calcitonin-precursor af en anden oprindelse I

I end human, somatostatin og lignende. I

I 5 Partnerproteinet er et hvilket som helst protein, der ikke inde- I

I holder en cysteinrest. Sådanne proteiner omfatter naturlige proteiner I

I og en del deraf, der ikke indeholder en cysteinrest, og modificerede I

I proteiner, hvor cysteinrester i naturlige proteiner eller en del I

I deraf er slettet eller omdannet til andre aminosyrerester. Partner- I

I 10 proteinet kan foruden ovennævnte protein indeholde nogle få, fx 1-5, I

I yderligere aminosyrer. Et eksempel er polypeptider, der omfatter 90- I

I 220 aminosyrerester af E. coli /9-galactosidase. Særlige udførelses- I

I former for partnerproteinet omfatter et polypeptid, der består af et I

I polypeptid af E. coli /9-galactosidaseprotein fra den første aminosyre I

I 15 ved N-terminalen til den 210. aminosyre regnet fra den N-terminale I

I aminosyre og to yderligere aminosyrer såsom glutaminsyre og phenyl- I

I alanin; et polypeptid, der består af et polypeptid af E. coli β~ I

I galactosidase fra den første aminosyre ved N-terminalen til den 97. I

I aminosyre regnet fra den N-terminale aminosyre og to yderligeré I

I 20 aminosyrerester såsom glutamin og phenylalanin; og et polypeptid, der I

I består af et polypeptid af E. coli ^-galactosidase fra den første I

I aminosyre ved N-terminalen til den 97. aminosyre regnet fra den N- I

I terminale aminosyre og tre yderligere aminosyrerester såsom glutamin- I

I syre, phenylalanin og leucin. I

I 25 Disse yderligere aminosyrer indføres fx under den rekombinante DNA- I

I manipulation som en aminosyre, der indkodes af et linker-DNA. I

I Da den naturlige form af disse polypeptider indeholder cysteinrester, I

I skal cysteinresterne imidlertid slettes eller erstattes med andre I

I aminosyrer. Dette udføres let ved steddirigeret mutagenese. En hvil- I

I 30 ken som helst aminosyre kan anvendes til erstatning af cysteinrester- I

I ne, men der anvendes fortrinsvis serin. Det skal bemærkes, at lysin I

I ikke foretrækkes. Da de ovenfor nævnte polypeptider i naturlig form I

I fra E. coli ^-galactosidaseprotein ikke indeholder lysinrester, spal- I

I tes partnerpolypeptidet ikke indeni, når et fusionsprotein, der om- I

9 DK 175535 B1 fatter et målpeptid og et partnerpolypeptid, spaltes med lysyl-endo-peptidase, og målpeptidet kan derfor let isoleres og oprenses.

Ifølge den foreliggende opfindelse udtrykkes et fysiologisk aktivt peptid, dvs. et målpeptid, som et fusionsprotein, hvor partnerpoly-5 peptidets C-terminal er forbundet med målpeptidets N-terminal via eh linker-aminosyrerest. Linker-aminosyren er fortrinsvis lysin, argi-nin, glutaminsyre eller methionin. Når lysin anvendes som linker· aminosyre, spaltes peptidbindingen mellem et målpeptid og linker-lysinen proteolytisk med fx lysyl-endopeptidase, hvilket frigiver 10 målpeptidet. Når arginin anvendes som linker-aminosyre, spaltes peptidbindingen mellem et målpeptid og linker-argininen proteolytisk med fx clostripain, hvilket frigiver målpeptidet. Når glutaminsyre anvendes som linker-aminosyre, spaltes peptidbindingen mellem et målpeptid og 1inker-glutaminsyren proteolytisk med fx protease Vg, 15 hvilket frigiver målpeptidet. På den anden side nedbrydes linker-methioninen med cyanogenbromid, når methionin anvendes som linker-aminosyre, hvilket frigiver målpeptidet fra partnerproteinet.

Et fusionsprotein udtrykkes af et gen, der omfatter DNA, som koder for et partnerprotein, såsom et β-gal-fragment, der er forbundet i 20 læseramme med DNA, som koder for et målpeptid, via en syntetisk dobbeltstrenget oiigonukleotid-linker indeholdende en kodon for en linker-aminosyre såsom lysin eller glutaminsyre. I dette tilfælde indeholder oligonukleotid-linkeren fortrinsvis en DNA-sekvens, der koder for en del af målpeptidets N-terminal umiddelbart nedstrøms for 25 kodonen for linker-aminosyren såsom lysin eller glutaminsyre, og har hensigtsmæssige restriktionssteder ved begge terminaler deraf.

Det gen, der koder for /}-galactosidase, stammer fx fra plasmidet paNE2, som indeholder et /)-gaiactosidasegen under kontrol af en lac-promotor. Et gen, der koder for α-hANP, et målpeptid, stammer fx fra 30 et gen, der koder for y-hANP, som er en precursor for o-hANP, hvilket gen er indeholdt i plasmidet pS224-3 (EP 0 164 273).

Det gen, der koder for HPCT, stammer fx fra plasmidet pAHPC38.

DK 175535 B1 I

10 I

Den promotor, der anvendes for effektivt at udtrykke et fusionspro- I

teingen, kan vare en hvilken som helst promotor fra et gen for et I

5 protein, der produceres i store mængder i E. coli, eller fra fager. I

En Lac-promotor fra et E. coli-lactosegen, en lpp-promotor fra et

E.coli ydre membranlipoproteingen samt en PL-promotor fra λ-faggenet I

foretrækkes. Disse promotorer kan let fås ud fra kendte plasmider ved I

konventionelle rekombinant-DNA-teknikker. For eksempel fås en PL-pro- I

motor fra plasmidet pP^lacZ'210ahANP (fig. 8), og en lpp-promotor fås I

10 fra plasmidet pIN5T4 (fig. 9). Disse plasmider er beskrevet i JP 61- I

101100 og JP 61-132186. Plasmidet pPLlacZ'210ahANP blev afledt af I

plasmidet pS20. E. coli (N4830/pS20) indeholdende plasmidet pS20 blev I

den 31. maj 1984 deponeret hos Fermentation Research Institute Agency I

of Industrial Science and Technology (FRI), Higashi 1-1-3, Tsukuba- I

15 shi, Ibaraki, Japan, med deponeringsnummer FERM BP-535 i henhold til I

Budapest-traktaten. Plasmidet pIN5T4 blev afledt af plasmidet I

plNI-A2. E. coli (JA221/pINI-A2) indeholdende plasmidet pINI-A2 blev I

deponeret hos FRI den 18. juli 1983 som FERM BP-320. I

Et fusionsprotein kan udtrykkes I

20 med høj effektivitet under anvendelse af et ekspressionsplasmid, hvor I

en attenuatorterminator fra tryptophan-operon (trp a) er indsat vuaid- I

delbart nedstrøms for et strukturgen for fusionsproteinet. Som det I

fremgår af eksemplerne og fig. 4, medfører indføring af trp a i I

plasmidet pGHa97(Ser)rop' umiddelbart nedstrøms for o-hANP-struktur- I

25 genet fx dannelse af plasmidet pGHo97S, og det ønskede fusionspro- I

teins produktivitet forøges i høj grad. I

Et gen, der koder for et fysiologisk aktivt målpeptid, kan synteti- I

seres kemisk. Alternativt kan det cDNA-fremstilles ud fra mRNA vundet I

fra celler, der producerer målpeptidet eller en precursor derfor. I 1

Et gen, der koder for α-hANP, kan fås fra plasmiderne pGHa210rop- og I

pGHa439rop', som indeholder α-hANP-genet med lac-promotoren. Frem- I

gangsmåderne til konstruktion af disse plasmider er beskrevet i sam- I

menligningseksempel 1-3. I

11 DK 175535 B1

Fremgangsmåden til spaltning mellem et. målpeptidområde, og et part-nerproteinområde i et fusionsprotein afhænger af arten af den linker-aminosyre, der forbinder begge områder. Når lysin anvendes som linker- aminosyre, anvendes lysyl-endopeptidase, der spalter lysinresters 5 C-terminal. Der anvendes fortrinsvis Achronobacter protease I (API) stammende fra Acbromobacter lyticus. Dette enzym er kommercielt tilgængeligt fra Wako Junyaku, Japan.

Til fremstilling af et målpeptid dyrkes E. coli, der er transformeret med et ekspressionsplasmid indeholdende et gen, der koder for et 10 fusionsprotein omfattende målpeptidet og et passende partnerprotein, i et hensigtsmæssigt medium, og ekspression af fusionsproteinet induceres. £. coli-celler isoleres derefter, og cellerne sprænges. Centrifugering af de sprængte celler giver et præcipitat, der indeholder fusionsproteinet. Denne fremgangsmåde er fordelagtig, fordi største-15 delen af de kontaminerende proteiner og peptider forbliver i superna-tanten. Præcipitatet behandles derpå fortrinsvis med 5-10M urea for at solubilisere fusionsproteinet. Anvendelse af urea er fordelagtig frem for andre solubiliseringsmidler såsom natriumdodecylsulfat (SDS), fordi urea ikke inhiberer enzymet API. Efter solubilisering af 20 fusionsproteinet roed urea såsom 8M urea fortyndes den behandlede blanding med en hensigtsmæssig buffer, og API sættes til blandingen for at spalte fusionsproteinet, hvilket medfører frigivelse af målpeptidet. Det frigivne målpeptid isoleres og oprenses ifølge en konventionel procedure til oprensning af et peptid eller protein.

25 Da partnerproteinet i fusionsproteinet ikke indeholder cysteinrester, dannes der ikke nogen disulfid- binding mellem partnerproteinet og målproteinet. Derfor isoleres målpeptidet fra partnerproteinet med et meget højt udbytte. I en udførelsesform for nærværende fremgangsmåde, ved hvilken partnerpro-30 teinet ikke indeholder nogen lysinrester, medfører spaltning af fusionsproteinet med lysyl-endopeptidase såsom API endvidere ikke samtidig spaltning inden for partnerproteinet. Derfor kan målpeptidet meget let isoleres og oprenses.

Da størrelsen af partnerproteinet er begrænset til området 90-220 35 aminosyrerester, er andelen af målproteinet i et fusionsprotein

I DK 175535 B1 I

I 12 I

I endvidere høj, medens stabiliteten af fusionsproteinet og dermed I

målpeptidet bevares i værtsceller. I

I Eftersom det ønskede fusionsprotein ifølge den foreliggende frem- I

I gangsmåde først isoleres i en uopløst fraktion, dvs. præcipitat fra I

I 5 sprængte celler, og fusionsproteinet ekstraheres fra den uopløste I

fraktion, elimineres proteinurenheder effektivt. Når der desuden I

anvendes et enzym såsom API til frigivelse af målpeptidet, kan dette I

I trin udføres uden yderligere oprensning af fusionsproteinet. Disse I

I procedurer giver en effektiv og simpel produktion af målpeptidet. I

I 10 EKSEMPLER I

Den foreliggende opfindelse vil blive belyst ved, men er på ingen I

I måde begrænset til, nedenstående eksempler. I

I Først beskrives i sammenligningseksempel 1-5 fremgangsmåder til I

I konstruktion af plasmiderne pGHa210rop", pGHa439rop* og pPLlacZ'210a- I

I 15 hANP indeholdende DNA, der koder for et fusionsprotein, som omfatter I

α-hANP som målpeptid, og en del af nativ /9-galactosidaseprotein, der I

I stadig indeholder cysteinrester. I

I SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 1 I

I 20 Konstruktion af ekspressionsplasmidet pGHal007 (fig. 11) I

I A. Konstruktion af pBR322-SalI I

I 5 /ig af plasmidet pBR322 blev fuldstændigt skåret med 16 enheder I

I EcoRI i 50 pi Hindlll-buffer indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), I

I 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 ved 37eC i 60 minutter, og det skårne DNA I

I 25 blev isoleret ved ethanoludfældning. Dernæst blev EcoRI-ender på I

I DNA'et omdannet til blunt-ender med 2 /il af 25 mM dNTP'er (dATP, I

I dGTP, dCTP og dTPP) under anvendelse af 4 enheder T4-DNA-polymerase i I

I 100 /il TA-buffer indeholdende 33 mM Tris-acetat (pH 7,9), 66 mM I

I ΟΗβΟΟΟΝβ, 10 mM (CHjCOO^Mg og 0,5 mM dithiothreitol. Derpå blev I

13 DK 175535 B1 DNA'et isoleret: ved ethanoludfældning, og DNA'et blev inkuberet i 20 pi af en ligeringsblanding indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2. 10 mM dithiothreitol og 1 mM ATP suppleret med 0,5 pg af følgende Sall-linker 5 5'-GGGTCGACCC-3' 3'-CCCAGCTGGG-5' med 1 enhed T4-DNA-ligase ved 15eC i 18 timer.

Reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli W3110, og der blev vundet en klon, der udviste ampicillin- og tetracyclin-10 resistens (Apr, Tcr), et plasmid blev isoleret fra klonen, og plasmi· det blev analyseret ved restriktionsenzymskæring for at bekræfte omdannelse af EcoRI-stedet til et Sall-sted. Plasmidet blev betegnet pBR322-SalI.

B. Konstruktion af pGHa201 15 5 pg af plasmidet pBR322-Sall blev partielt skåret med 8 enheder Sall i 50 pi Sall-buffer indeholdende 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 150 mM NaCl og 6 mM MgCl2 ved 37eC i 60 minutter og blev derpå fuldstændigt skåret med 24 enheder BamHl. Reaktionsblandingen blev underkastet agarosegelelektroforese for at isolere det andet store DNA-fragment, 20 der indeholdt et tetracyclinresistensgen-promotorområde (fragment nr. 1 i fig. 11).

På den anden side blev 5 pg af plasmidet paNE2 skåret fuldstændigt med 24 enheder BamHl og 24 enheder EcoRI i 100 pi Sall-buffer ved 37*C i 60 minutter, og reaktionsblandingen blev underkastet agarose-25 gelelektroforese for at isolere det største DNA-fragment, der indeholdt /?-gal 1007-genet udtrykt under kontrol af lac-promotoren og ampicillinresistensgenet (fragment nr. 2 i fig- 11). Plasmidet paNE2 er beskrevet i detaljer i JP 58-63395, og E. coli WA 802/paNE2 blev betegnet SBM 102 og deponeret hos FRI som FERM P-6031 den 19. juni 30 1981.

I DK 175535 B1 I

I 14 I

I Desuden blev 5 μ% af plasmidec pS224-3 Indeholdende -y-hANP-genet, I

I hvis 3'-terminale del svarer til et α-hANP-gen som beskrevet i JP 60- I

I 262592 og EP 0 164 273, fuldstændigt skåret med 24 enheder Pvull og I

I 80 enheder Sall i 100 pi Sall-buffer ved 37eC i 60 minutter. Reak- I

I 5 tionsblandingen blev derefter underkastet agarosegelelektroforese for I

I at isolere det mindste DNA-fragment, som indeholdt α-hANP-genet uden I

I den N-terminale portion (fragment nr. 3 i fig. 11). I

I På den anden side blev der syntetiseret et DNA-fragment med følgende I

I struktur I

I 10 EcoRl |Lys| ·* ohANP (N-terminal) Pvull I

I 5' AATTCAAGAGCCTGCGGAGATCCAG 3' I

I 3' GTTCTCGGACGCCTCTAGGTC 5' I

I DNA-fragmentet indeholder en kodon for en lysinrest som linker-amino- I

I syre og en del af α-hANP-genet, der supplerer den ovenfor nævnte I

I 15 portion, der mangler nr. 3-fragmentet, og har henholdsvis et EcoRl- I

I sted og et Pvull-sted i begge terminaler. DNA-fragmentet er nr. 4 i I

I fig- 11. I

I Ovenævnte fire DNA-fragmenter blev ligeret ved samme fremgangsmåde I

I som beskrevet ovenfor, og ligeringsblandingen blev anvendt til at I

I 20 transformere E. coli W3110, og dette gav kloner, der udviste ampicil- I

I lin- og tetracyclinresistens. Fra klonerne blev der isoleret plasmi- I

I der, som blev analyseret ved restriktionsenzymskæring for at få det I

I ønskede plasmid, pGHa201. I

I C. Konstruktion af pGHal007 I

I 25 S fig af plasmidet pGHa201 blev fuldstændigt skåret med 24 enheder I

I Dral i 50 /il Sall-buffer ved 37®C i 60 minutter, og det største DNA- I

I fragment blev isoleret ved agarosegelelektroforese. DNA-fragmentet I

I blev ligeret ved samme fremgangsmåde som ovenfor, og ligeringsblan- I

I dingen blev anvendt til at transformere E. coli W3110, og der vandtes I

I 30 ampici11insensitive og tetracyclinresistente kloner. Plasmider fra I

I klonerne blev analyseret ved restriktionsenzymskæring for at udvælge I

I det ønskede plasmid, pGHal007. I

15 DK 175535 B1 E. coli W3110/pGHal007 indeholdende plasmidet pGH<*1007 fik betegnelsen SBM 284 og er den 3. april 1986 deponeret hos FRI som FERM P-8728 og blev den 22. februar 1988 overført til deponering i henhold til Budapest-traktaten med nummeret FERM BP-1748.

5 SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 2

Konstruktion af plasmiderne pGHa650, pGHa439 og pGH<*210 (formindskelse af størrelsen af ^gal-genet) (fig. 12) 5 pg af plasmidet pGHal007 blev fuldstændigt skåret med 8 enheder EcoRI og 24 enheder SacI i 50 μΐ TA-buffer ved 37°C i 60 minutter.

10 Reaktionsblandingen blev underkastet agarosegelelektroforese for at isolere det største DNA-fragment. DNA-fragmentets EcoRI- og Sacl-ender blev omdannet til blunt-ender ved samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, og DNA-fragmentet blev selvligeret. Ligeringsblandingen blev derpå anvendt til at transformere E. coli W3110 til 15 dannelse af tetracyclinresistente kloner. Et plasmid blev isoleret fra klonerne ved en konventionel fremgangsmåde ved restriktionsenzymskæring, hvilket gav det ønskede plasmid, pGHo650.

Plasmidet pGHo439 blev konstrueret ved samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor for konstruktionen af plasmidet pGHa650 bortset fra, 20 at der blev anvendt Hindlll-buffer i stedet for TA-bufferen, og at i der blev anvendt 24 enheder Mlul i stedet for SacI. Desuden blev plasmidet pGHa210 konstrueret ved samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor for konstruktionen af plasmidet pGHa650 bortset fra, at der anvendtes Hindlll-buffer i stedet for TA-buffer, og at der anvendtes 25 24 enheder Aatll i stedet for SacI.

Plasmidet pGHa650 indeholder et DNA-fragment, der koder for et fusionsprotein med betegnelsen /9gal 650ahANP, hvor C-terminalen af et polypeptid svarende til 650 aminosyrerester af en N-terminal af et β-gal-protein som partnerprotein var forbundet med en N-terminal af a-30 hANP som målpeptid via to yderligere aminosyrerester Glu-Phe og en linker-aminosyre, lysin. Plasmidet pGHa439 har en lignende struktur

I DK 175535 B1 I

I 16 I

I som pGHa650 bortsec fra, at pGHa439 indeholder et DNA-fragment, der I

I koder for et fusionsprotein Øgal439ahANP, hvor partnerproteinet I

I svarer til N-terminalen af et β-gal-protein, som består af 439 amino- I

I syrerester. Plasmidet pGHa210 har en lignende struktur som pGHa650 I

I 5 bortset fra, at pGHo210 indeholder et DNA-fragment, der koder for et I

I fusionsprotein /)gal210ahANP, hvor partnerproteinet svarer til den N- I

I terminale del af et ^-gal-protein, som består af 210 aminosyrerester. I

I SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 3 I

Konstruktion af pGHc«210rop* (fig. 13) I

I 10 A. Konstruktion af pBR322ABalI I

I 5 #ig pBR322 blev fuldstændigt skåret med 10 enheder Ball i 50 μΐ I

I Ball-buffer indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) og 12 mM MgCl2 ved I

I 37®C i 60 minutter, og det skårne DNA blev isoleret ved ethanolud- I

H fældning. Dernæst blev det isolerede DNA opløst i 50 μΐ Sail-buffer I

15 og skåret fuldstændigt med 24 enheder PvuII, og reaktionsblandingen I

blev underkastet agarosegelelektroforese for at isolere det største I

DNA-fragment, der havde blunt-ender. DNA-fragmentet blev derefter I

selvligeret ved den samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, og I

reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli W3110.

I 20 Der vandtes plasmider fra tetracyclin- og ampicillinresistente klo- ner, og man fik et plasmid, som manglede PvuII-Ball-DNA-fragmentet på I 622 bp, og som blev betegnet pBR322ABall.

I B. Konstruktion af pGHa210rop~ I 5 /tg pBR322ABalI blev fuldstændigt skåret med 24 enheder Dral og 24 I 25 enheder EcoRV i 50 μΐ Sall-buffer ved 37°C i 60 minutter, og det I største DNA-fragment indeholdende et replikationsorigin blev isoleret I ved agarosegelelektroforese. På den anden side blev 5 pg af plasmidet I pGHo210, der blev konstrueret ifølge sammenligningseksempel 2, skåret I fuldstændigt med 24 enheder EcoRV ved 37*Ό i 60 minutter, og det I 30 næststørste DNA-fragment, der indeholdt et gen, som koder for fusi- I onsproteinet /9gal210ahANP, blev isoleret ved agarosegelelektroforese.

17 DK 175535 B1

Disse to DNA-fragmenter blev ligeret ved samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, og reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli W3110 til dannelse af tetracyclinresistente kloner. Plasmider vundet fra klonerne blev analyseret på konventionel måde, 5 og man fik en ønsket klon, E. coli W3110/pGHa210rbp*. Dette plasmid pGHa210rop" mangler en funktion af et område, der regulerer plasmid-replikation (betegnet "rop").

Ved samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, men idet man gik ud fra plasmidet pGHa439, blev der konstrueret plasmidet pGHa439rop', 10 som manglede en rop-funktion.

Efter fremstilling af transformanterne E. coli W3110/pGHa439rop~ transformeret med pGHo439rop· og E. coli W3110/pGHa210rop* transformeret med pGHa210rop' blev mængderne af producerede fusionsproteiner /7gal439ahANP og Øgal210cthANP målt ved SDS-PAGE, og resultatet blev 15 sammenlignet med de resultater, der blev opnået for plasmiderne pGHa439 og pGHa210. Det viste sig, at specielt i tilfælde af pGHa210 forøgede manglende rop-funktion i høj grad produktionen af fusionsproteinet. Det skal bemærkes, at selv om produktionen af fusionsproteinet var lille, var tilsætning af en inducer, IPTG, meget effektiv, 20 og hvis kopitallet steg på grund af manglende rop-funktion, var tilsætning af IPTG mindre effektiv.

REFERENCEEKSEMPEL 4 Konstruktion af pP^lacZ'210ahANP

Der blev konstrueret plasmidet pP^lacZ'210crhANP, hvor lac-promotoren 25 i pGHa210 var erstattet med en PL*promotor fra λ-fagen.

A. Konstruktion af pGHa210-EcoRI (fig- 14)

Ved den procedure, der er beskrevet af Y. Morinaga, Biotechnology 2, 636, 1984, blev der indsat et EcoRI-sted i pGHa210 umiddelbart opstrøms for lacZ'-genet til konstruktion af et plasmid, pGHa210-EcoRI.

30 5 μg pGHa210 blev fuldstændigt skåret med 24 enheder Hpal i 50 pi TA-

I DK 175535 B1 I

I I

I buffer ved 37*C i 60 minutter, og det største DNA-fragment indehol- I

I dende et β-hANP-strukturgen og et tetracyclinresistensgen (Tcr) I

I (fragment nr. 1 i fig. I 4) blev elektroforetisk adskilt og isoleret. I

I Dernæst blev DMA*fragmentet behandlet med alkalisk phosphatase i 50 I

I 5 /il 100 mM Tris-HC1-buffer (pH 8,0) for at eliminere phosphat ved 5'- I

I enderne. Derefter blev 5 Mg pGHa210 skåret fuldstændigt med 80 en* I

I heder Sall i 50 /ti Sall*buffer ved 37DC i 60 minutter, og det største I

I DNA-fragment, som manglede en del af tetracyclinresistensgenet (frag- I

I ment nr. 2 i fig. 14), blev elektroforetisk adskilt og isoleret. På

I 10 den anden side blev der kemisk syntetiseret et enkeltstrenget oligo- I

I nukleotid med følgende sekvens I

I 5' GGATAACAATTTCACACAGGAAGAATTCATGACCATGATTACGG 3' I

I og med et EcoRI-sted og phosphoryleret ved 5'-enden deraf (fragment I

I nr. 3 med et EcoRI-sted i fig. 14). I

15 2 /tg af hvert af de ovenfor fremstillede dobbeltstrengede DNA-frag- I

I menter og 1 /tg af ovennævnte kemisk syntetiserede enkeltstrengede I

I DNA-fragment blev blandet i 36 /il P/L-buffer, der omfattede 6 mM - I

I Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 8 mM MgCl2 og 1 mM /9-mercaptoethanol, I

I og blandingen blev opvarmet til 95°C for at denaturere det dobbelt- I

I 20 strengede DNA-fragment og omdanne det til et enkeltstrenget DNA- I

fragment, hvorefter den gradvis blev afkølet til 30eC i løbet af 60 I

minutter for at sammenføje disse DNA-fragmenter. Til reaktionsbian- I

I dingen blev der sat 1 /il 25 mM dNTP'er og 2 enheder Klenow-fragment I

af DNA-polymerase samt 2 /il 10 mM ATP og 2 enheder T4-DNA-ligase, og I

25 der blev udført en reaktion for at komplettere et dobbeltstrenget I

I cirkulært DNA. -Reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere I

I E. coli W3110, og dette gav tetracyclinresistente kloner. Plasmider I

I fra klonerne blev analyseret på konventionel måde, hvilket gav det I

ønskede plasmid, pGHa210-EcoRI, som indeholdt et nytilføjet EcoRI- I

I 30 sted umiddelbart opstrøms for lacZ'-genet. I

I B. Konstruktion af pPLlacZ'210ahANP (fig. 15) I

I 5 Mg af ovennævnte plasmid pGH<*210-EcoRI blev partielt skåret med 0,2 I

I enheder EcoRI i 50 /il Hindlll-buffer ved 37*C i 60 minutter, og det I

19 DK 175535 B1 lineære DNA-fragment blev elektroforetisk adskilt og isoleret. Dernæst blev det isolerede DNA-fragment fuldstændigt skåret med 80 enheder Sall i 100 μΐ Sall-buffer ved 37*C i 60 minutter, og det næststørste DNA-fragment, der indeholdt et strukturgen for ^gal210ct-5 hANP (fragment nr. 1 i fig. 15), blev elektroforetisk adskilt og isoleret.

På den anden side blev 5 pg af det ovenfor beskrevne plasmid p$224-3 fuldstændigt skåret med 16 enheder EcoRl og 24 enheder Aval i 50 μΐ Hindlll-buffer ved 37eC i 60 minutter, og det største DNA-fragment 10 indeholdende P^-promotoren fra λ-fagen og et ampicillinresistensgen (fragment nr. 2 i fig. 15) blev elektroforetisk adskilt og isoleret.

Et dobbeltstrenget DNA-fragment med følgende sekvens (Sall) 5' TCGACAGCCCGCCTAATGAGCGGC'TTTTTTTTCTGC 3' 3’ GTCGGGCGGATTACTCGCCGAAAAAAAAGACGAGCC 5’ (Aval) 15 og med en Sall-kohæsiv ende og en Aval-kohæsiv ende (fragment nr. 3 i fig. 15) blev fremstillet ved kemisk syntese.

Disse tre DNA-fragmenter blev ligeret ved samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, og ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere £. coli W3110/C^, hvilket gav ampicillin- og kanamycinresi-20 stente kloner. Plasmider fra klonerne blev analyseret på konventionel måde, hvilket gav det ønskede plasmid, ρΡ^1βοΖ'210α1ΐΑΝΡ.

SAMMENLIGNINCS EKSEMPEL 5

Konstruktion af plasmidet pGHaBal med forkortet ^-gal-område (fig.

U) 1 10 /ig af plasmidet pGHa439rop* (konstrueret i sammenligningseksempel 3) blev fuldstændigt skåret med 100 enheder Aatll i 100 μΐ Hindlll-buffer ved 37“C i 60 minutter, og det skårne DNA blev isoleret ved ethanoludfældning. Dernæst blev det isolerede DNA opløst i 100 μΐ

I DK 175535 B1 I

I 20 I

I Bal31-buffer indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12 mM CaCl2, 12 mM I

I MgCl2> 0,2 M NaCl og 1 mM EDTA og behandlet med 10 enheder Bal31. I

I . Efter 5, 10 og 20 minutter blev der taget en prøve på 30 μΐ af reak- I

I tionsblandingen, og denne blev blandet med det samme volumen phe- I

5 nol/chloroform (1:1) for at standse reaktionen. Efter eliminering af I

phenolfasen (nederste fase) blev den vandige fase ekstraheret med I

ethylether for at eliminere resterende phenol, og DMA blev isoleret I

ved ethanoludfældning. Derefter blev et DNA-fragment fra hver prøve I

I opløst i 30 μΐ TA-buf fer og fuldstændigt skåret med 15 enheder EcoRI, I

H 10 og 10 μΐ af reaktionsblandingen blev underkastet 2% agarosegelelek- I

troforese. Til de resterende 20 μΐ prøver fra 10 minutters reaktionen I

og 20 minutters reaktionen, der gav et DNA-fragment, der var mindre I

I end 400 bp, sattes 70 μΐ TA-buffer, 2 μΐ 25 mM dNTP'er, 5 μΐ 100 mM I

I dithiothreitol og 4 enheder T4 DPase, og reaktionen blev udført ved 15 37°C i 30 minutter for at omdanne DNA-fragmentets kohæsive ender til blunt-ender. Efter opsamling af hvert DNA-fragment ved ethanoludfæld- ning blev DNA-fragmentet selvligeret med T4-DNA-ligase ved samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, ligeringsblandingen blev anvendt I til at transformere E. coli W3110, og der blev vundet 54 E. coli I 20 W3110/pGHaBal-kloner. Blandt plasmiderne fra de 54 kloner blev plas- midet pGHaBal 43 anvendt til yderligere forsøg.

I SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 6 I Konstruktion af plasmidet pIN5T4 (fig. 17) I (1) Konstruktion af pIN4GIF54 25 Plasmidet pIN4GIF54 blev konstrueret som vist i fig. 17 ud fra (1) et I DNA-fragment indeholdende lipoprotein-genpromotorområdet (vist med lpp i figuren), der blev vundet ved skæring af plasmidet pINI-A2 med I restriktionsenzymerne Xbal og PstI, (2) et oligonukleotid, soo havde I Xbal- og EcoRI-kohæsive ender, og (3) et DNA-fragment indeholdende I 30 hINF-y-genet vundet ved skæring af plasmidet pGIF54 med EcoRI og I PstI. Den anvendte procedure var som beskrevet nedenfor. De benyttede I restriktionsenzymer var alle produkter fra Takara Shuzo KK.

21 DK 175535 B1 A) Fremstilling af Xbal-PstI-DNA-fragment fra pINI-A2

Plasmidet pINI-A2 er en gave fra Dr. Inoue fra New York State University, En Escherichia coli-værtsstamme, der blev vundet ved transformation med dette plasmid, har fået betegnelsen JA221/pINI-A2 og blev 5 den 18. juli 1983 deponeret i Fermentation Research Institute, 1-3,

Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, med deponeringsnummer FERM BP-320 ifølge Budapest-traktaten.

pINI-A2-DNA (3 /<g) blev skåret med 15 enheder af hver af Xbal og PstI i 150 μΐ 1 X TA-opløsning (33 mM Tris-acetatbuffer, pH 7,6, 66 mM 10 kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat og 0,5 mM dithiothreitol) ved 37eC i 60 minutter. Reaktionsblandingen blev underkastet 1,0X agaro-segelelektroforese, og en gelportion, der befandt sig i stillingen svarende til ca. 980 bp (basepar), blev skåret ud og anbragt i et dialyserør, og Xbal-Pstl-DNA-fragmentet blev elueret ved elektrofore-15 se. Efter fjernelse af ethidiumbromid fra eluatet ved tilsætning af en lige så stor mængde phenol blev der tilsat 2,5 volumen ethanol.

Efter henstand ved -80eC i 30 minutter blev blandingen centrifugeret ved 10.000 omdr./minut i 10 minutter, hvilket gav et DNA-fragment som ethanolpræcipitat. Til dette ethanolpræcipitat sattes 10 μΐ destille-20 ret vand for at opløse DNA-fragmentet.

B) Fremstilling af EcoRI-PstI-DNA-fragment fra pGIF54

Plasmidet pGIF54 er i alt væsentligt det samme plasmid som pGIF4, der er beskrevet i JP 86.180/1982. En Escherichia coli-transformant, WA802/pGIF4, der blev vundet ved transformation med dette plasmid, 25 som indeholdt et kemisk syntetiseret gen, der koder for aminosyrese-kvensen af hIFN-y som vist i fig. 6, har fået betegnelsen SBMG105 og blev den 6. maj 1982 deponeret hos Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology, som FERM P-6522, hvorefter den blev overført til deponering i henhold til Budapest-trakta-30 ten som FERM BP-282 den 2. maj 1983.

pGIF54-DNA (3 μg) blev skåret med 15 enheder af hver af EcoRI og PstI i 30 /il 1 x TA-opløsning ved 37®C i 60 minutter, efterfulgt af 0.7X agarosegelelektroforese, hvorved et EcoRI-PstI-DNA-fragment på ca.

I DK 175535 B1 I

I 22 I

I 3,4 kb blev elueret fra gelen. Eluatet blev underkastet phenolbe- I

I handling og ethanoludfældning på samme måde som ovenfor. TLI ethanol- I

I præcipitatet blev der sat 10 μΐ destilleret vand til opløsning af I

I DNA-fragmentet. I

5 C) Fremstilling af oligonukleotid med Xbal- og EcoRI-kohæsive ender I

I Til ekspression af et komplet hINF-y-protein blev der ved fastfaseme- I

I toden syntetiseret et oligonukleotid, som har Shine-Dalgarno- (SD)- I

I sekvensen nedstrøms for Xbal-spaltningsstedet i pINl-A2 og endvidere I

I har en EcoRI-kohæsiv ende, nemlig oligonukleotidet I

I 10 I

I S P I

I 5' CTAGACGTAG3' I

I 3' TCCATCTTAA5' I

I Xbal-kohæsiv ende EcoRI-kohæsiv ende I

I 15 I

I Synteseproceduren er beskrevet i detaljer i JP 86.180/1982. I 1

Ovenstående oligonukleotid (100 picomol) blev phosphoryleret ved I

I 5'-OH i 30 μΐ af en kinasereaktionsopløsning (50 mM Tris-hydrochlo- I

ridbuffer, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol), hvor der blev I

I 20 tilsat 2 enheder T4-polynukleotidkinase (Takara Shuzo KK), ved 37’C i I

I 60 minutter. I

I D) Konstruktion af pIN4GIF54 I

I Plasmidet pIN4GIF54 blev konstrueret ved ligering af de tre DNA- I

fragmenter, der blev fremstillet ovenfor, ifølge nedenstående frem- I

I 25 gangsmåde. Til en blanding af 5 μΐ af en opløsning af Xbal-Psti-DNA- I

fragmentet fra pINl-A2 (opløsning af ethanolpræcipitatet i 10 μΐ I

I destilleret vand), 5 μΐ af en opløsning af EcoRI-PstI-DNA-fragmentet I

I fra pGIF54 (opløsning af ethanolpræcipitatet i 10 μΐ destilleret I

vand) og 3 μΐ af en opløsning af det phosphorylerede oligonukleotid I

I 30 (10 picomol) blev der således sat 2 μΐ af et ligeringsreaktionsmedi- I

um, som havde en 10 gange højere koncentration (20 mM Tris-hydrochlo- I

I ridbuffer, pH 7,6, 10 mM MgCl2), 2 μΐ 4 mM ATP og 1 μΐ T4-DNA-ligase I

23 DK 175535 B1 (Boehringer Mannheim) (5 enheder), og ligeringen blev udført ved 16®C natten over.

(2) Transformation af Escherichia coli A) Transformation af Escherichia coli WA802 5 Escherichia coli VA802 blev dyrket i 2,0 ml L-broth ved 37"C natten over, 0,3 ml af dyrkningsvæsken blev sat til 30 ml L-broth, og der blev udført rystekultur ved 37‘C i 2 timer, efterfulgt af centrifugering ved 3000 omdr./minut i 10 minutter. Til de således vundne celler sattes 10 ml SO mM CaCl2 til suspension af cellerne, og der 10 blev udført centrifugering ved 3000 omdr./minut i 10 minutter. Til de således vundne celler sattes 1,0 ml 50 mM CaC^-opløsning, og blandingen lodes henstå i et isbad i 60 minutter. Til 0,2 ml af denne suspension af Ca4"1’-behandlede celler sattes 10 pi af den ifølge eksempel 1-D vundne ligeringsreaktionsblanding (som indeholdt oven-15 nævnte tre DNA-fragmenter ligeret sammen), blandingen lodes henstå i et isbad i 60 minutter, og derpå tilsattes 2 ml L-broth, og der blev udført inkubation ved 37®C i 60 minutter. Dyrkningsvæsken blev ud-pladet på næringsagarmedium (BBL) indeholdende 40 pg/ml ampicillin.

Efter inkubation ved 37®C natten over blev ampicillinresistente 20 transformanter selekteret. Plasmid-DNA blev separeret fra én af de vundne transformanter ved en konventionel metode (klaret lysat-meto-de). DNA'ets basesekvens ved og omkring det indsatte Xbal-EcoRI-område blev bestemt ved Maxam-Gilbert-metoden (Methods in Enzymology 65, 499-560, 1980), og det blev bekræftet, at DNA'et havde den ønske-25 de DNA-basesekvens. Dette plasmid blev betegnet pIN4GIF54, og den transformerede Escherichia coli-stamme, der bar plasmidet, blev betegnet WA802/pIN4GIF54.

(3) Konstruktion af plasmidet pIN5GIF54 (fig. 17) A) Fremstilling af et oligonukleotid med Xbal- og EcoRI-kohæsive 30 ender

Et oligonukleotid med SD-sekvensen AGGAGGT og Xbal- og EcoRI-kohæsive ender ved 5'-enderne, nemlig

I DK 175535 B1 I

I 24 I

I 5' CTAGGAGGTAG3' I

I 3' CTCCATCTTAA5' I

blev syntetiseret ved fastfasemetoden som beskrevet ovenfor (j fr. JP I

I 86.180/1982). Ovennævnte oligonukleotid (100 picomol) blev phosphory- I

I 5 leret ved 5*-OH ved 37®C i 60 minutter i 50 pi af kinasereaktionsop- I

løsningen tilsat 2 enheder T4-polynukleotidkinase (Takara Shuzo) som I

nævnt ovenfor; I

I B) Fremstilling af Xbal-EcoRI-DNA-fragmentet af pIN4GIF54 I

I pIN4GIF54 (2,5 pg) blev skåret med 5 enheder af hver af Xbal og EcoRl I

I 10 i 30 pi 1 x TA-opløsning ved 37®C i 60 minutter for at skære DNA'et. I

I Efter skæring blev der udført 0,7Z agarosegelelektroforese, og et I

Xbal-EcoRI-DNA-fragment på ca. 4,3 kb (SD-sekvens-fri længere frag- I

ment) blev elueret fra gelen ved elektroforese som nævnt ovenfor. I

Eluatet blev underkastet phenolbehandling og ethanoludfældning som I

H 15 beskrevet ovenfor, og der blev sat 10 pi destilleret vand til etha- I

nolpræcipitatet for at opløse DNA-fragmentet.

I C) Konstruktion af pIN5GIF54

Plasmidet pIN5GIF54 blev konstrueret ved ligering af ovennævnte to I DNA-fragmenter på følgende måde. Til 5 pi af en opløsning af det 20 phosphorylerede oligonukleotid (10 picomol) blev der således sat 3 pi H af ligeringsreaktionsopløsningen i en 10 ganges koncentration (som I nævnt ovenfor), 10 pi 100 mM DTT og 4 mM ATP i destilleret vand og I 1 pi (5 enheder) T4-DNA-ligase (Boehringer Mannheim). Blandingen blev I inkuberet ved 16"C natten over.

I 25 (4) Transformation af Escherichia coli I (A) Transformation af Escherichia coli WA802 I På samme måde som ovenfor (eksempel 2-A) blev celler af Escherichia I coli WA802, der var dyrket i L-broth, behandlet med CaCl2, og 0,2 ml I af cellesuspensionen blev blandet med den ifølge eksempel 4-C vundne 25 DK 175535 B1 ligeringsreaktionsblanding for at udføre transformation af Escherichia coli WA802. Transformantselektion blev udført under anvendelse af et nsringsagarmedium (BBL) indeholdende AO pg/ml ampicillin. Idet én af de således vundne transformanter blev anvendt, blev der fore-5 taget plasmidseparation ved en konventionel metode (jfr. eksempel 2-A), og DNA*basesekvensen ved og omkring det indsatte område, nemlig Xbal-EcoRI-området, blev analyseret. Det fremgår af fig. 5, at pIN5-CIF5A mangler det Xbal-sksringssted, der oprindeligt var til stede i pINAGIF54 (fig. 3). Derfor blev det adskilte plasmid behandlet med 10 Xbal efterfulgt af 0.7X agarosegelelektroforese og, for det plasmid· DNA, der ikke var skåret med Xbal, bestemmelse af DNA-sekvensen ved og omkring det indsatte oligonukleotidfragment ved Maxam-Gilbert-metoden. De vundne resultater bekræftede tilstedeværelsen af den ønskede DNA-basesekvens. Dette plasmid fik betegnelsen pIN5GIF54, og 15 den dermed transformerede UA802-stamme blev betegnet WA802/pIN5GIF54.

(5) Fremstilling af pIN5T4 (fig. 18)

En portion (5 μ%) af pIN5GIF54 blev fuldstændigt skåret med 20 enheder Aatll og 20 enheder Sall. Den kohæsive Aatll-ende (3'-terminal) og Sall-ende (5'-terminal) blev omdannet til blunt-ende med T4-DNA-20 polymerase og 4dNTP (herunder dATP, dGTP, dCTP og dTTP); Aatll-enden blev skåret af, hvorimod Sall-enden blev udfyldt. Det skårne plasmid blev adskilt ved agarosegelelektroforese, og et DNA-fragment (ca. 750 bp) indeholdende lipoproteinpromotor- (lppP) og GIF-genet blev elek-troelueret fra gelen ved elektroforese. DNA-isolering blev derefter 25 udført ved ethanoludfældning.

En portion (5 μg) pBR322 blev fuldstændigt skåret med 20 enheder EcoRl, og den resulterende kohæsive ende blev gjort blunt ved den ovenfor beskrevne udfyldningsteknik. Plasmidet blev derefter skåret fuldstændigt med 20 enheder Ahalll. Det skårne plasmid blev adskilt 30 ved agaroseelektroforese, og et DNA-fragment (ca. 3,3 kd) indeholdende DNA-replikationsinitieringsorigin og tetracyclinresistensgen blev vundet ved den ovenfor beskrevne metode.

De to DNA-fragmenter blev blandet, og blandingen blev ligeret ved 15eC i 18 timer under anvendelse af T4-DNA-ligase (1 enhed) i en

I DK 175535 B1 I

I 26 I

I ligeringsopløsning (20 /il) bestående af 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), I

I 10 mM MgCl2, 10 mM DTT (dithiothreitol) og 1 mM ATP. Efter behandling I

med 0,3 ml CaCl2 blev E. coli W3110 transformeret ved tilsætning af I

I 10 /il af ligeringsoplesningen. Tetracyclinresistente kloner af trans- I

I 5 formanterne blev analyseret rutinemæssigt for at få W3110-kloner I

I indeholdende pIN5T4. I

I EKSEMPEL 1 I

I Forøget udbytte af α-hANP ved hydrolyse af /9gal210ahANP under DTT- I

reduktion I

I 10 A. Isolering af α-hANP fra ^gal210ohANP ved hydrolyse med API I

I Som beskrevet i sammenligningseksempel 2 er /3gal210orhANP et fusions- I

I protein, som omfatter α-hANP og et polypeptid med 210 aminosyrerester I

I af ^-galactosidase. I

I E. coli W3110/pGHa210rop~ blev dyrket i et medium indeholdende 0,5X I

I 15 glycerol, 2,4Z gærekstrakt, 1,2X trypton og 100 mM kaliumphosphat (pH I

I 7,5) og blev tilsat tetracyclin ved 37°C i løbet af 14 timer. Dernæst I

I blev bakteriecellerne høstet og suspenderet i 10 mM Tris-HCl-buffer I

I (pH 9,3) og sprængt ved ultrasonikering. Det sprængte produkt blev I

I centrifugeret ved 10.000 x g i 1 minut til dannelse af et præcipitat. I

I 20 Præcipitatet blev vasket med den samme buffer og solubiliseret i den I

I samme buffer indeholdende 5M urea. En alikvot af blandingen blev I

underkastet SDS-polyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) for at I

I bestemme den producerede mængde fusionsprotein. Den resterende reak- I

I tionsblanding blev hydrolyseret med API (Achromobacter protease I; I

I 25 Wako Junyaku, Japan), og en alikvot af reaktionsblandingen blev I

I underkastet SDS-PAGE for at bekræfte, at hydrolysen var færdig. I

Reaktionsblandingen blev derefter analyseret ved HPLC under anvendel- I

se af en YMC-A-3020DS-søjle for at bestemme mængden af frigivet I

α-hANP. Den ved HPLC bestemte mængde o-hANP var ca. 1/4 af den mæng- I

I 30 de, der blev bestemt ved SDS-PAGE, hvilket antyder, at α-hANP, som I

var bundet til et partnerprotein, /?gal 210, på en vilkårlig måde, ik- I ke kan frigives. Som forklaring på dette fænomen kan det formodes, at 27 DK 175535 B1 mindst én af tre cysteinrester, som er til stede i Øgal 210-proteinet bestående af 210 aminosyrerester, som stammer fra Ø-galactosidase, og mindst én af to cysteinrester, som er til stede i α-hANP, danner én eller flere disulfidbindinger, og derfor er α-hANP-molekylet, som er 5 skåret af fra Øgal 210-molekylet ved en peptidbinding, der granser op til en linker-aminosyre, bundet til Øgal 210-molekylet via disulfidbindingen eller -bindingerne.

For at bekræfte denne formodning blev der udført følgende forsøg.

B. Forøget udbytte af α-hANP fra hydrolyseret Øgal210ahANP ved DTT-10 reduktion

For at bestemme disulfidbindingers rolle blev en API-hydrolyseret Øgal210ahANP-præparation reduceret med DTT, og mængden af α-hANP blev målt ved HPLC. Resultatet fremgår af tabel 1 og viser, at mængden af frigivet α-hANP blev forøget 4 gange i forhold til mængden deraf før 15 reduktion med DTT. Mængden af frigivet α-hANP efter DTT-reduktionen er omtrent den samme som den mængde, der blev beregnet ud fra resultatet af SDS-PACE. Ud fra ovenstående resultat formodes det, at det lave udbytte af α-hANP fra Øgal210ahANP efter API-hydrolyse skyldes tilstedeværelsen af disulfidbindingeme mellem Øgal 210-molekylet og 20 α-hANP-molekylet.

EKSEMPEL 2

Omdannelse af cysteinrest til serinrest i Øgal 210

For at bekræfte disulfidbindingers rolle for det lave udbytte af α-hANP fra Øgal210ahANP efter API-hydrolyse og forbedre nativ Øgal 25 210 som partnerprotein i et fusionsprotein blev alle de cysteinres ter, der fandtes i nativ Øgal 210, erstattet med serinrester. Det modificerede Øgal 210-protein, i hvilket alle cysteinrester er erstattet med serinrester, betegnes Øgal2l0(Ser), og et fusionsprotein omfattende α-hANP og Øgal210(Ser) betegnes Øgal210(Ser)ahANP.

I DK 175535 B1 I

I 28 I

I A. Konstruktion af plasmidet pGHa210(Ser)rop* (fig- 1) I

I /Jgal 210-proteinet indeholder tre cysteinrester i position 76, 122 og I

I 154, regnet fra N-terminalen. Plasmidet pGHa210(Ser)rop' indeholder I

I et gen, som koder for et fusionsprotein omfattende α-hANP og modifi- I

I 5 ceret Øgal 210, i hvilket ovennævnte tre cysteinrester er omdannet I

I til serinrester. Cys -* Ser-omdannelsen giver restriktionsenzymskæ- I

I ringsstedeme Bglll, BamHI og Avail. I

I 3 pg af plasmidet pGHa210rop“, konstrueret ifølge sammenligningsek- I

sempel 3, blev fuldstændigt skåret med 20 enheder Pvul og 12 enheder I

I 10 EcoRl i 50 μΐ H-buffer indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM I

I MgCl2 og 100 mM NaCl ved 37eC i 60 minutter, og det største DNA- I

fragment indeholdende tetracyclingenet (fragment nr. 1 i fig. 1) blev I

I elektroforetisk adskilt og isoleret. På samme måde blev 3 /ig af I

I pGHa210rop" skåret fuldstændigt med 20 enheder Aval og 20 enheder I

I 15 BamHI i 50 μ\ H-buffer ved 37eC i 60 minutter, og det største DNA- I

I fragment indeholdende lacZ'210-ohANP-genet (fragment nr. 2 i fig. 1) I

I blev elektroforetisk adskilt og isoleret. I

I På den anden side blev der kemisk syntetiseret 3 oligonukleotidpri- I

H mere med følgende sekvenser: I

I 20 Bglll I

(3) 5' pCTTGCTGGAGTCAGATCTTCCTGAG 3' I

I BamHI I

I (4) 5' pGAATCCGACGGGATCCTACTCGCTCAC 3' I

I Avail I

I 25 (5) 5' pCATCTGTGGTCCAACGGGCG 3' I

I Hvert oligonukleotid indeholder en kodon for serin i stedet for en I

I kodon for cystein og et restriktionsenzymskæringssted Bglll, BamHI I

eller Avail og er blevet phosphoryleret ved deres 5'-ender. I

I 2 /ig af hvert af de ovenfor fremstillede dobbeltstrengede DNA-frag- I

I 30 menter og 1 pg af hver af de 3 oligonukleotidprimere blev blandet i I

29 DK 175535 B1 30 μΐ P/L-buffer, der omfattede 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 8 mM MgCl2 og 1 mM /?-mercaptoethanol, og blandingen blev opvarmet til 95®C for at denaturere de dobbeltstrengede DNA-fragmenter til dannelse af enkeltstrengede DNA-fragmenter og blev gradvis afkølet til 30®C 5 i 60 minutter til sammenføjning af DNA-fragmenterne. Til reaktions-blandingen sattes 1 pg dNTP'er og 2 enheder Klenow-fragment af DNA-polymerase samt 2 enheder T4-DNA-ligase og 2 pi 10 mM ATP til komplettering af et cirkulært dobbeltstrenget DNA. Reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli W3110 til dannelse af tetra-10 cyclinresistente kloner. Plasmider fra klonerne blev analyseret på konventionel måde, hvilket gav et ønsket plasmid, pGHo210(Ser)rop' indeholdende nyindførte restriktionssteder Bglll, BamHI og Avail.

B. Isolering af α-hANP fra £gal210(Ser)ahANP

E. coli W3110/pGHa210(Ser)rop* blev dyrket i et medium indeholdende 15 0,5X glycerol, 2,4X gærekstrakt, 1,2Z trypton og 100 mM kaliumphos- phat (pH 7,5) og blev tilsat tetracyclin ved 37®C i løbet af 14 timer. Dernæst blev bakteriecellerne høstet og suspenderet i 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 9,3) og sprængt ved ultrasonikering. Det sprængte produkt blev centrifugeret ved 10.000 x g i 5 minutter til dannelse 20 af et præcipitat. Præcipitatet blev vasket med den samme buffer og solubiliseret i den samme buffer indeholdende 5M urea. En alikvot af blandingen blev underkastet SDS-polyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) for at bestemme den producerede mængde fusionsprotein. Den resterende reaktionsblanding blev hydrolyseret med API (Achromobacter 25 protease I; Wako Junyaku, Japan), og en alikvot af reaktionsblandingen blev underkastet SDS-PAGE for at bekræfte, at hydrolysen var færdig. Reaktionsblandingen blev derefter analyseret ved HPLC under anvendelse af en YMC-A-3020DS-søjle for at bestemme mængden af frigivet α-hANP. Den mængde frigivet α-hANP, der blev vundet ved resulta-30 tet af HPLC, var stort set den samme som den, der blev bestemt ved SDS-PAGE, og DTT-reduktion af en API-hydrolyseret prøve forøgede ikke mængden af frigivet α-hANP, hvilket fremgår af tabel 1. Dette resultat viser, at det lavere udbytte af cr-hANP fra Øgal210ahANP skyldes tilstedeværelsen af cysteinrester i /9gal 210-proteinet. Desuden viser 35 ovennævnte resultat, at α-hANP let kan isoleres fra fusionsproteinet

I DK 175535 B1 I

I 30 I

I /Jgal210(Ser)ahANP uden DTT-reduktion og følgelig uden efterfølgende I

oxidation. I

I TABEL 1 I

I Mængde frigivet o-hAHP I

5 Fusionsprotein -DTT +DTT I

I /Jgal210ahANP 6,7 mg 27,3 mg I

I (0,25) (1,00) I

I Øgal210(Ser)ohANP 24,2 mg 25,0 mg I

I 10 (0.97) (1,00) I

En fremgangsmåde til fremstilling af o-hANP via et fusionsprotein I

I /?gal210(Ser)ahANP har følgende fordele: (1) α-hANP kan produceres i I

I store mængder, og (2) da det udtrykte fusionsprotein overføres til et I

I 15 præcipitat, mens proteinurenheder forbliver i en supernatant, kan fusionsproteinet let oprenses som ved anvendelse af /}gal210ohANP, (3) da /?gal210(Ser) ikke indeholder nogen cysteinrest, og der derfor ikke dannes nogen disulfidbinding mellem α-hANP og Øgal210(Ser), kan α-hANP næsten fuldstændig isoleres fra et API-hydrolyseret fusions- I 20 protein uden DTT-reduktion og efterfølgende oxidation. Ved industriel fremstilling af o-hANP er der imidlertid nogle problemer: (a) Da fu- I sionsproteinet /5gal210(Ser)arhANP har en lav opløselighed i en vandig ureaopløsning, kræves der en lav koncentration af fusionsproteinet, I dvs. en høj fortynding af en reaktionsblanding ved API-hydrolysepro- I 25 cessen, og (b) da virkningen af API-hydrolyse på Øgal210(Ser)ahANP er I temmelig lille, er en stor mængde API-enzym pr. substrat og en lang reaktionstid nødvendig, hvilket medfører en mulighed for uønsket modifikation af målproduktet, a-hANP.

I Under hensyntagen til ovennævnte situation har nærværende opfindere 30 forsøgt at formindske partnerproteinets størrelse for at løse pro- I blemerne (a) og (b) og bevare fordelene (1), (2) og (3). Til dette I formål blev der konstrueret et plasmid indeholdende DNA, som koder for et fusionsprotein, der omfatter α-hANP og et partnerpeptid på 97 31 DK 175535 B1 aminosyrederivater svarende cil N-terminalen af et /3-galactosidase-protein, hvor cystein i 76-position er erstattet med serin. Peptidet bestående af 97 aminosyrerester af /J-galac tos idase betegnes /3gal 97, og fusionsproteinet omfattende o-hANP og /3gal 97 betegnes £gal97a-5 hANP. Desuden betegnes det peptid, der består af 97 aminosyrerester af yØ-galactosidase, og i hvilket cystein i 76-position er erstattet med serin, /Jgal97(Ser), og fusionsproteinet omfattende α-hANP og /Jgal97(Ser) betegnes />gal97(Ser)ahANP.

EKSEMPEL 3

10 Konstruktion af plasmidet pGHa97S

A. Konstruktion af plasmidet pGHa97(Ser)rop*

Der blev konstrueret et plasmid, pGHa97(Ser)rop', som indeholder et gen for /Jgal97(Ser)ahANP, hvor den 76. aminosyre cystein er erstattet med serin i fusionsproteinet /3gal97ahANP.

15 10 pg af plasmidet pGHaBal63, der blev konstrueret ifølge sammen ligningseksempel 5, blev fuldstændigt skåret med 50 enheder Pstl og 50 enheder Ddel i 70 pi H-buffer ved 37"C i 60 minutter, og skærings-produktet blev underkastet agarosegelelektroforese for at adskille og isolere et 283 bp langt DNA-fragment indeholdende α-hANP-genet (frag- 20 ment nr. 1 i fig. 2). På den anden side blev 3 pg af plasmidet pGHa210(Ser)rop", der blev konstrueret ifølge eksempel 1, skåret fuldstændigt med 20 enheder Pvul og 20 enheder Pstl i 50 pi H-buffer ved 37eC i 60 minutter, og det største DNA-fragment indeholdende tetracyclinresistensgenet (fragment nr. 2 i fig. 2) blev elektrofore- 25 tisk adskilt og isoleret. Desuden blev 10 pg pGHa210(Ser)rop~ skåret fuldstændigt med 50 enheder Pvul og 50 enheder Ddel i 70 pi H-buffer, og et 101 bp langt DNA-fragment indeholdende en del af lacZ'-genet (fragment nr. 3 i fig. 2) blev adskilt og isoleret ved agarosegelelektroforese . 1

Disse tre DNA-fragmenter blev ligeret i 20 pi ligeringsblanding omfattende 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2 og 10 mM dithiothreitol

I DK 175535 B1 I

I 32 I

I under anvendelse af 1 enhed T4-DNA-ligase ved 15*C i 18 timer, og I

I reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli W3110 I

I til dannelse af tetracyclinresistente kloner. Plasmider fra klonerne I

I blev analyseret på konventionel måde for at selektere det ønskede I

I 5 plasmid, pGHa97(Ser)rop*, der indeholder lacZ'-genet, som koder for I

I fusionsproteinet Øgal97(Ser)ahANP, hvor den 76. cystein er erstattet I

I med serin. I

I Escherichia coli SBK288 indeholdende plasmidet pGHa97(Ser)rop* er I

I deponeret i FRI ifølge Budapest-traktatens bestemmelser som FERM I

I 10 BP-1253 den 9. januar 1987. I

I B. Konstruktion af pGHa97S I

I Når E. coli W3110/pGHa97(Ser)rop", dvs. E. coli W3110 transformeret I

med plasmidet pGHa97(Ser)rop‘, blev dyrket i et medium indeholdende I

I 0.5X glycerol, 2,4X gærekstrakt, 1,2X trypton og 100 raM kalium-H- I

15 phosphat (pH 7,5) og blev tilsat tetracyclin ved 37"C i løbet af 14 I

I timer, var produktiviteten af /Jgal97(Ser)ahANP lavere end /3gal97a- I

I hANP. For at forbedre produktiviteten af /)gal97(Ser)ahANP blev der I

H derfor indsat en attenuator-terminator af tryptophan-operon (trp a) I

umiddelbart nedstrøms for α-hANP-strukturgenet til konstruktion af I

I 20 plasmidet pGHa97S. I

I 10 pg af plasmidet pGHa97(Ser)rop* blev fuldstændigt skåret med 50 I

I enheder Bglll og 50 enheder Rsal i 100 pi H-buffer ved 37°C i 60 I

I minutter, og et 154 bp langt DNA-fragment indeholdende det C-termina- I

I le område af ^gal97(Ser)-genet og det N-terminale område af α-hANP- I

25 genet (fragment nr. 1 i fig. 3) blev elektroforetisk adskilt og I

I isoleret. Dernæst blev 3 pg pGHo97(Ser)rop' skåret fuldstændigt med I 20 enheder Bglll og 40 enheder Sall i 50 pi S-buffer indeholdende 10 I mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl og 7 mM MgCl2 ved 37*C i 60 minut- I ter, og det største DNA-fragment indeholdende en replikationsorigin I 30 (fragment nr. 2 i fig. 3) blev elektroforetisk adskilt og isoleret.

Desuden blev 3 pg pBR322 skåret fuldstændigt med 10 enheder EcoRI og I 40 enheder Sall i 50 pi S-buffer ved 37eC i 60 minutter, og et mindre I DNA-fragment indeholdende et promotorområde fra tetracyclinresistens- 33 DK 175535 B1 genet (fragment nr. 3 i fig. 3) blev elektroforetisk adskilt og Isoleret.

På den anden side blev der fremstillet et kemisk syntetiseret dobbeltstrenget DNA-fragment med følgende sekvens: (Rsal) j j(EcoRI) 3' TGACTCAGCTGTCGGGCCGATTACTCGCCCGAAAAAAAAGAGCTTAA 5' og med en Rsal-blunt ende og en EcoRI-kohæsiv ende ved dets ender (fragment nr. 4 i fig. 3).

De ovenfor fremstillede fire DNA-fragmenter blev ligeret ved samme 10 fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, og ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli W3110. Dette gav tetracyclin-resistente kloner, og plasmider fra klonerne blev analyseret på konventionel måde, hvilket gav det ønskede plasmid pGHe97S.

C. Fremstilling af /Jgal97(Ser)ahANP

15 E. coli W3110/pGHa97(Ser)rop* og E. coli W3110/pGHa97S, dvs. E. coli W3110 transformeret med pGHa97S, blev dyrket i et medium indeholdende 0,5X glycerol, 2,41 gær ekstrakt, 1,2X trypton, 100 mM kalium-H-phos-phat (pH 7,5) tilsat tetracyclin ved 37*C i 14 timer, og mængderne af produceret /)gal97(Ser)ahANP blev sammenlignet ved SDS-PAGE ved samme 20 fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 2 B til analyse af fusionsprotein. Det fremgår af fig. 4, at ved indsætning af trp a umiddelbart nedstrøms for α-hANP-genet blev produktiviteten af /9gal97(Ser)ahANP forøget i bemærkelsesværdig grad. Den mængde /)gal97(Ser)ahANP, der blev produceret af E. coli W3110/pGHa97S, er omtrent den samme som 25 den mængde /Jgal210(Ser)ahANP, der blev produceret af E. coli W3110/-pGHa210(Ser)rop"; dette betyder, at produktiviteten af α-hANP pr. dyrkningsmedium i tilfælde af W3110 pGHa97S er ca. to gange højere end i tilfælde af W3110 pGHo97(Ser)rop‘. Fusionsproteinet /?gal97-(Ser)ohANP blev i lighed med /?gal210ahANP og /3gal210(Ser)ahANP over-30 ført til en præcipitatfraktion under centrifugering af de sprængte celler, mens E. coli-proteiner overføres til en supernatantfraktion (se fig. 5).

I DK 175535 B1 I

I 34 I

I Det fremgår af tabel 2, at selv om den mængde α-hANP, der blev frigi- I

I vet fra API-hydrolyseret /)gal97ahANP, blev forøget ved DTT-reduktion I

I som i tilfælde af /3gal210ahANP, blev den mængde o-hANP, der blev I

frigivet fra API-hydrolyseret /?gal97(Ser)orhANP, ikke forøget ved I

I 5 DTT-reduktion som i tilfælde af /Jgal210(Ser)ahANP. I

I TABEL 2 I

I Mængde frigivet α-hANP I

Fusionsprotein -DTT +DTT I

I 10 /9gal97ahANP 7,8 mg 25,0 mg I

I (0,31) (1,00) I

I /3gal97(Ser)ahANP 29,8 mg 30,9 mg I

I (0,80) (1,00) I

15 Desuden er solubiliteten af fusionsproteinet /3gal97(Ser)ahANP i en I

vandig 5M ureaopløsning ca. 10 gange højere end /Jgal210(Ser)ahANP. I

I Dette betyder, at hvis man tager hensyn til, at mængden af α-hANP i I

I y8gal97(Ser)ohANP er ca. 2 gange større end i /Jgal210(Ser)ahANP, så er I

I koncentrationen af a-hANP i /9gal97(Ser)ahANP opløst i 5M urea ca. 20 I

I 20 gange større end i tilfælde af /3gal210(Ser)ahANP. I

I Følsomheden af ^gal97(Ser)ahANP over for API-hydrolyse var ca. 100 I

I gange højere (ca. 200 gange for α-hANP i sig selv) end /?gal210(Ser)a- I

I hANP.

I I det næste eksempel undersøges årsagen til ^gal97(Ser)ohANP's høje I 25 følsomhed over for API-hydrolyse.

35 DK 175535 B1 EKSEMPEL 4

Undersøgelse af årsagen til /?gal97(Ser)ahANP's høje følsomhed over for API-hydrolyse I Øgal97(Ser)ahANP er Øgal97(Ser) bundet til β-hANP via Gln-Phe-Lys, 5 hvor Gin er den 98. aminosyre i /3gal97(Ser)ahANP, og API hydrolyserer en peptidbinding ved den C-terminale side af Lys. På den anden side er /Jgal210(Ser) i /3gal210(Ser)ahANP bundet til α-hANP via Glu-Phe-Lys, hvor Glu er den 211. aminosyre i /Jgal210(Ser)ahANP. Ifølge den foreliggende opfindelse er der opstillet den hypotese, at årsagen 10 til, at )3gal97(Ser)ahANP er mere følsom over for API-hydrolyse end /Sgal210(Ser)ahANP, er, at selv om den negative ladning på σ-carboxyl-gruppen af Glu i /3gal210(Ser)ahANP griber ind i den positive ladning på Lys, har σ-carboxyamidet af Gin i Øgal97(Ser)ahANP ikke en tilsvarende negativ ladning, hvorfor der ikke forekommer nogen inter-15 ferens med en tilsvarende positiv ladning på Lys.

Til bekræftelse af hypotesen konstruerede man plasmidet pGHa97SE indeholdende et gen, der koder for et fusionsprotein Øgal97(Ser)a-hANP, hvor den 97. aminosyre Gin i />gal97(Ser)ahANP er blevet erstattet med Glu (dvs. Gln-Phe-Lys ved forbindelsesdelen er blevet om-20 dannet til Glu-Phe-Lys), og følsomheden af fusionsproteiner fra plasmiderne pGHa97S og pGHa97SE blev sammenlignet.

A. Konstruktion af plasmidet pGHa97SE

3 pg af plasmidet pGHa97S, der blev konstrueret ifølge eksempel 3, blev fuldstændigt skåret med 20 enheder BamHI og 20 enheder Aval i 25 50 pi H-buffer ved 37"C i 60 minutter, og det største DNA-fragment, der indeholdt α-hANP-genet (fragment nr. 1 i fig. 6), blev elektroforetisk adskilt og isoleret. Desuden blev 3 pg pGHa97S skåret fuldstændigt med 20 enheder Bglll og 20 enheder EcoRI i 50 pi H-buffer ved 37“C i 60 minutter, og det største DNA-fragment indeholdende 30 tetracyclinresistensgenet (fragment nr. 2 i fig. 6) blev elektroforetisk adskilt og isoleret.

I DK 175535 B1 I

I 36 I

I På den anden side blev der kemisk syntetiseret et enkeltstrenget I

I oligonukleotid med følgende sekvens: I

I IEcoRII I

I 5' pTTACGATGCGGAATTCAAGAG 3' I

I 5 der indeholdt en kodon for glutaroinsyre i stedet for en kodon for I

glutamin og var phosphoryleret ved 5'-enden deraf (fragment nr. 3 i I

I fig. 6). I

De ovenfor fremstillede to dobbeltstrengede DNA-fragmenter og det I

I enkeltstrengede oligonukleotid blev blandet i P/L-buffer, og blandin- I

I 10 gen blev opvarmet til 95°C for at denaturere de dobbeltstrengede DNA- I

fragmenter og danne enkeltstrengede DNA-fragmenter, og blandingen I

H blev gradvis afkølet til 30®C i løbet af 60 minutter for at sammen- I

føje DNA-fragmenterne til dobbeltstrenget DNA. Til reaktionsblandin- I

gen sattes dNTP'er og DNA-polymerase Klenow-fragment samt T4-DNA- I

15 ligase og ATP, og der blev udført en reaktion til dannelse af et I

lukket cirkulært DNA-fragment. Reaktionsblandingen blev anvendt til I

I at transformere E. coli W3110. Man fik tetracyclinresistente kloner, I

H og plasmider fra klonerne blev analyseret på konventionel måde til I

selektion af det ønskede plasmid, pGHa97SE indeholdende et gen, som I

I 20 koder for /Jgal97(Ser)EahANP, hvor aminosyrerester i forbindelsesom- I rådet Gln-Phe-His er blevet omdannet til Glu-Phe-Lys.

I B. Sammenligning af /9gal97(Ser)ahANP og £gal97(Ser)EahANP med I hensyn til API-følsomhed I E. coli W3110/pGHa97S og E. coli W3110/pGHo97ES blev dyrket i et I 25 medium indeholdende 0,5X glycerol, 2,42 gærekstrakt, 1,22 trypton og I 100 mM kalium-H-phosphat (pH 7,5) tilsat tetracyclin ved 37eC i 14 I timer. Dyrkningsvæsken blev centrifugeret for at høste bakteriecel- I lerne, som derefter blev suspenderet i 10 mM Tris-HCl (pH 9,3) og I sprængt ved ultrasonikering. Det sprængte produkt blev derpå centri- I 30 fugeret ved 10.000 x g i 1 minut, hvilket gav et præcipitat, som derefter blev vasket med samme buffer. Det vaskede præcipitat blev I solubiliseret i samme buffer indeholdende 5M urea, og den solubili- I serede præparation blev opdelt i 4 portioner. Til disse præparationer 37 DK 175535 B1 sattes API i en mængde på henholdsvis 0, 1, 5 og 25 ng/5 pg a-hANP.

Hver blanding blev inkuberet ved 30*C i 45 minutter og analyseret ved SDS-PAGE.

Det fremgår af fig. 7, at Øgal97(Ser)EahANP og Øgal97(Ser)ahANP ikke 5 havde forskellig følsomhed over for API-hydrolyse. Derfor blev ovennævnte hypotese afkræftet. /Jgal97(Ser)ahANP's høje følsomhed over for API-hydrolyse skyldes sandsynligvis selve /?gal97(Ser)ahANP's struktur.

EKSEMPEL 5

10 Konstruktion af pPLlacZ*97(Ser)ahANP

Plasmidet pPjJLacZ'97(Ser)ahANP blev konstrueret ved at erstatte lac-promotoren i pGHo97S med en P^-promotor fra λ-fagen.

10 pg af plasmidet pP^lacZ'210ehANP, hvis konstruktion er vist i fig.

4, blev fuldstændigt skåret med 50 enheder EcoRI og 50 enheder Pvul i 15 100 μΐ H-buffer ved 37"C i 60 minutter, og reaktionsblandingen blev underkastet 5X acrylamidgelelektroforese for at adskille og oprense et 143 bp langt DNA-fragment, som indeholder lacZ'-genet, der koder for N-terminalen af /?-galactosidase (fragment nr. 1 i fig. 8). Desuden blev 3 pg af pPLlacZ'210ahANP skåret fuldstændigt med 20 enheder 20 EcoRI og 20 enheder Aval i 50 pi H-buffer ved 37eC i 60 minutter, og det største DNA-fragment indeholdende P^-promotor og ampicillinresi-stensgen (fragment nr. 2 i fig. 8) blev elektroforetisk adskilt og oprenset. På den anden side blev 3 pg pGHa97S skåret fuldstændigt med 10 enheder Pvul og 10 enheder Aval i 50 pi H-buffer, og dette gav et 25 DNA-fragment indeholdende o-hANP-genet og tetracyclinresistensgenet (fragment nr. 3 i fig. 8).

Disse tre DNA-fragmenter blev ligeret ved samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, og ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli W3110/Ci (E. coli W3110 indeholdende et plasmid med 30 C^875-genet og kanamycinresistensgenet). Dette gav tetracyclin-, ampicillin- og kanamycinresistente kloner. Plasmider fra klonerne

I DK 175535 B1 I

I 38 I

I blev analyseret på konventionel måde til selektion af det ønskede I

I plasmid pP^lacZ'97(Ser)ahANP. I

I EKSEMPEL 6 I

I 5 Konstruktion af pINlacZ' 97(Ser)ohANP I

I Plasmidet pINlacZ'97(Ser)ahANP blev konstrueret ved at erstatte Ρ^- I

I promotoren i plasmidet pP^lacZ'97(Ser)ahANP med lpp-promotoren fra E. I

I coli ydre membran-lipoproteingenet. I

I 10 pg af pPLlacZ'97(Ser)ohANP blev fuldstændigt skåret med 50 enheder I

I 10 BamHI i 100 pg H-buffer ved 37"C i 60 minutter og blev derpå partielt I

I skåret med 5 enheder EcoRI, og skæringsproduktet blev underkastet 1Z I

I agarosegelelektroforese for at adskille og oprense et 809 bp langt I

I EcoRI-BamHI-DNA-fragment indeholdende ^gal97(Ser)ahANP-genet og et I

I promotororaråde fra tetracyclinresistensgenet (fragment nr. 1 i fig. I

I 15 9). På den anden side blev 3 pg af plasmidet pIN5T4 skåret fuldstæn- I

I digt med 20 enheder EcoRI og 20 enheder BamHI i 50 pi H-buffer ved I

I 37°C i 60 minutter, og det største DNA-fragment indeholdende lpp- I

I promotoren (fragment nr. 2 i fig. 9) blev elektroforetisk adskilt og I

I oprenset. I

I 20 Disse to DNA-fragmenter blev ligeret ved samme fremgangsmåde som I

I _ beskrevet ovenfor, og ligeringsblandingen blev anvendt til at trans- I

I formere E. coli W3110. Dette gav tetracyclinresistente kloner, og I

I plasmidet fra klonerne blev analyseret på konventionel måde, hvilket I

I gav det ønskede plasmid, pINlacZ'97(Ser)ahANP. I

I 25 EKSEMPEL 7 I

I Oprensning af α-hANP I

I E. coli W3110/pCEa97S, der blev fremstillet ifølge eksempel 3, blev I

I dyrket i 20 liter af et medium, der indeholdt 0,61 gærekstrakt, 0.4Z I

I KH2P04. 0,4Z K2HP0a, 0,3Z Na2HP04, 0,02Z NH4C1, 0.12Z (NH4)2S04, 0,1Z I

39 DK 175535 B1

MgS0^«7H20, 1,5X glucose, 2X glycerol (tilsat 4 gange) (pH 7,0) tilsat tetracyclin i en 30 liters krukkeferraentor ved 37°C i 18 timer med beluftning og agitation. Dyrkningsvæsken blev underkastet højtrykshomogenisering (Manton Gaulin Laboratory Homogenizer 15Μ-8ΓΑ) 5 ved ca. 55.158 kN/m^ (8000 psi) for at sprænge cellerne. Homogenatet blev centrifugeret til dannelse af et præcipitat, som indeholdt fusionsproteinet, og som derefter blev vasket med 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 9,3). Det vaskede præcipitat blev solubiliseret i 8M ureaopløs-ning. Til ureaopløsningen sattes 27 mM Tris-HCl (pH 9,3) for at brin-10 ge ureakoncentrationen ned på 5M. Denne ureaopløsning blev behandlet med 40 AU API (Wako Junyaku, Japan) ved 30°C i 60 minutter, og reaktionsblandingen blev filtreret gennem et kassette-filer ("cartridge-filter") CWSC (Nippon Millipore Ltd.).

Dernæst blev filtratet chromatograferet gennem en Zeta-Prep QAE-søjle 15 (Nippon Millipore Ltd.), som adsorberer frigivet /Jgal97(Ser) og intakt /Jgal97(Ser)ahANP gennem ^gal97(Ser)-portionen. Der blev opnået en gennemstremmende fraktion indeholdende det frigivne, og denne fraktion blev indstillet til pH 5,0 ved tilsætning af eddikesyre.

Derefter blev fraktionen anbragt på en CM Toyopearl 650M-søjle ækvi-20 libreret med 5M urea i 10 mM ammoniumformiat (pH 5,0). α-hANP blev elueret trinvis med 225 mM NaCl og 400 mM NaCl, hvilket gav en fraktion indeholdende α-hANP. e-hANP-fraktionen blev sat på en SPW-C-ODS-søjle (Chemco) ved mediumydelse-væskechromatografi (MPLC) (Mura-yama Kagaku) for at afsalte. Til slut blev α-hANP oprenset ved C^g-25 HPLC.

Den endelige α-hANP-præparation gav en enkelt top ved omvendt-HPLC (Waters) under anvendelse af en YMC-A-302ODS-søjle som vist i fig.

10. Den således vundne α-hANP-præparations aminosyresammensætning, der blev bestemt ved hjælp af et aminosyre-autoanalyseapparat (Hita-30 chi Seisakusho, 835-50), stemte overens med den værdi, der blev bestemt ud fra α-hANP's aminosyresekvens. Desuden var den ovenfor nævnte α-hANP-præparations aminosyresekvens, bestemt ved hjælp af et gasfaseproteinsekventeringsapparat, Model 470A (Applied Biosystems), den samme som α-hANP's. i

I DK 175535 B1 I

I AO I

I Desuden svarede den ved den foreliggende fremgangsmåde fremstillede I

I o-hANP-præparation til en kemisk syntetiseret α-hANP-præparation I

I (Peptide Research) med hensyn til (1) natriuretisk og blodtrykssæn- I

I kende virkning i SD-rotte, (2) relaxationsaktivitet på rektalt hønse- I

I 5 væv, og (3) krydsimmunoreaktivitet ved radioimmunoassay. I

I Ved den foreliggende fremgangsmåde fås ca. S g fusionsprotein (sva- I

I rende til ca. 1 g o-hANP) ud fra 1 liter dyrkningsvæske, og isole- fl

I rings- og oprensningsudbyttet er ca. 50Ϊ for at få α-hANP i ren form. I

I En sådan høj produktivitet og højt udbytte er meget fordelagtig ved fl

fl 10 industriel fremstilling af a-hANP. I

I Det skal bemærkes, at E. coli W3110/C]/pPLlacZ'97(Ser)ohANP inde- I

I holdende plasmidet pPjJlacZ'97(Ser)ahANPf der blev konstrueret ifølge fl I eksempel 5, samt E. coli W3110/pINlacZ'97(Ser)ahANP indeholdende fl fl plasmidet pINlacZ'97(Ser)ahANP, der blev konstrueret ifølge eksempel fl

fl 15 6, producerede en mængde af fusionsproteinet /?gal97(Ser)ahANP, som I

I svarede til ca. 302 af de totale proteiner, der blev produceret af I

I transformanten og fusionsproteinet isoleret fra præcipitatfraktionen. I

I EKSEMPEL 8 I

I Konstruktion af plasmidet pG97SHPCT I

B 20 A. Konstruktion af pG97S18 I

I 5 //g af plasmidet pGHa97SE blev fuldstændigt skåret med 12 enheder I

I EcoRI og 80 enheder Sall i 100 μΐ S-buffer, og det største DNA-frag- I

I ment (1) blev isoleret og oprenset ved agarosegelelektroforese. På I

I den anden side blev 5 /ig af plasmidet pGHa97SE skåret fuldstændigt I

I 25 med 80 enheder Sall i 100 μΐ S-buffer, og det andetstørste DNA-frag- I

I ment (2) indeholdende et promotorområde fra tetracyclinresistensgenet I

I blev isoleret og oprenset ved agarosegelelektroforese. Desuden blev I

I 1 /ig af plasmidet pUC18 (Takara Shuzo) skåret fuldstændigt med 12 I

I enheder EcoRI og 80 enheder Sall i 100 μΐ S-buffer, og reaktions- I

I 30 blandingen blev behandlet med phenol for at inaktivere enzymet og I

fl ekstraheret med ethanol for at eliminere phenol og salte (3). Oven- I

41 DK 175535 B1 nævnte DNA-fragmenter (1), (2) og (3) blev blandet og ligeret, ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli V3110, og der blev opnået tetracyclinresistente kloner. Klonerne blev analyseret ved en konventionel fremgangsmåde til selektion af plasmidet 5 pG97S18, i hvilket et EcoRI-Sall-DNA-fragjnent, der koder for o-hANP- genet i pGHa97SE, er erstattet med et EcoRI-Sall-DNA-fragment fra et polylinkerområde i pUC18 med følgende formel:

EcoRI BamHI Sall 5' GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGCATCCTCTAGAGTCGAC 3' 10 3' CTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTG 5'

B. Konstruktion af pG97SHPCT

3 Mg af plasmidet pG97Sl8 blev fuldstændigt skåret med 12 enheder EcoRI og 12 enheder BamHI i 50 μΐ H-buffer, og det største DNA-fragment (4) blev adskilt og oprenset ved agarosegelelektroforese. På 15 den anden side blev 5 /ig af plasmidet pGH97S18 skåret fuldstændigt med 12 enheder BamHI i 50 m6 H-buffer, og et DNA-fragment (5) indeholdende en tetracyclingenpromotor blev adskilt og oprenset ved agarosegelelektroforese. Desuden blev 10 Mg af piamidet pAHPCT38 skåret fuldstændigt med 12 enheder BamHI og 24 enheder Kpnl i M-20 buffer, og et 81 bp langt Kpnl-BamHI-DNA-fragment (6), der koder for fra den 7. Tyr til den 32. Pro regnet fra N-terminalen af calcitonin, efterfulgt af Gly-Lys-Lys-Arg, blev adskilt og oprenset ved poly-acrylamidgelelektroforese. På den anden side blev der fremstillet et dobbeltstrenget oligonukleotid (7) med følgende sekvens: 25 EcoRI Kpnl 5' pAATTCCTCGAGTGTGGTAACCTGAGCACCTGTATGCTGGGTAC 3' 3' GGAGCTCACACCATTGGACTCGTGCACATACGACCp 5' med en EcoRI -kohæs iv ende og en Kpnl- kohæs iv ende. Ovennævnte DNA-fragmenter (4), (5), (6) og (7) blev blandet og ligeret, og lige-30 ringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli W3110, hvilket gav tetracyclinresistente kloner. Disse kloner blev analyseret ved en konventionel fremgangsmåde til opnåelse af det ønskede plasmid, pG97SHPCT (fig. 19).

I DK 175535 B1 I

I 42 I

I Det skal bemærkes, at ovennævnte plasmid pAHPCT38 er beskrevet i I

I detaljer i JP 58-203953, og E. coli indeholdende plasmidet pAHPCT38, I

I dvs. Escherichia coli E15/pAHPCT38 med betegnelsen SBMC138, blev I

I deponeret hos FRI som FERM P-6523 den 10. juni 1982 og blev den 2. I

I 5 maj 1983 overført til international deponering i henhold til Buda- I

I pest-traktaten som FERM BP-282. I

I EKSEMPEL 9 I

I Oprensning af human calcitonin-precursor I

E. coli W3110/pG97SHPCT transformeret med ovennævnte plasmid I

I 10 pG97SHPCT blev dyrket i et medium, der indeholdt 0,52 glycerol, 2,42 I

I gærekstrakt, 1,22 trypton og 100 mM kaliumphosphat (pH 7,5) tilsat I

tetracyclin ved 37°C i 16 timer. Dernæst blev dyrkningsvæsken centri- I

fugeret, hvilket gav bakterieceller, som derpå blev suspenderet i 10 I

I mM Tris-HCl-buffer (pH 7,8) og sprængt i en fransk presse ("French I

I 15 press disrupter") (SIM-AMINCO) ved ca. 55.158 kN/m2 (8000 psi). Det I

I sprængte materiale blev centrifugeret ved 1000 x g i 10 minutter til I

dannelse af både en supernatant og et præcipitat, som derefter blev I

I analyseret ved SDS-PAGE. Som et resultat heraf blev /Jgal97SHPCT pro- I

duceret i omtrent den samme mængde som /)gal97SahANP og blev isoleret I

20 i præcipitatfraktionen som i tilfælde af /Jgal97SahANP. Dette præcipi- I

I ·* tat blev suspenderet i 8M vandig ureaopløsning, og til suspensionen I

sattes 3 volumen 67 mM Tris-HCl (pH 7,8) for at bringe ureakoncentra- I tionen ned på 2M. Til den fortyndede suspension sattes protease Vg (Boehringer Mannheim) i en mængde på 1/2000 (W/W) i forhold til sub- 25 stratet, og det hele blev inkuberet ved 37"C i 10 minutter. En ali- kvot af reaktionsblandingen blev analyseret ved omvendt-fase-høj - I tryksvæskechromatografi under anvendelse af YMC-A3020DS (Shimazu).

Det viste sig, at det blandt 10 glutaminsyrerester, der fandtes i I /?gal97SHPCT, var lettest at spalte en binding ved en glutaminsyrerest I 30 mellem /?gal97S og HPCT. Desuden blev reaktionsblandingen underkastet I søjlechromatografi under anvendelse af Zeta-Prep QAE ækvilibreret med I 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,8) indeholdende 2M urea, og det viste 43 DK 175535 B1 sig, at ca. 1002 HPCT blev isoleret i en gennemstremmende fraktion i en renhed på ca. 95Ϊ.

Dette betyder, at /9gal97S er egnet som partnerprotein ikke blot til fremstilling af a-hANP, men også til fremstilling af human calcito-5 nin-precursor (HPCT).

. i

Claims (15)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt cystein- I I holdigt målpeptid, hvilken fremgangsmåde omfatter: I I I I (l) dyrkning af Escherichia coli, som er transformeret med plasmid, I I der er i stand til at udtrykke et fusionsprotein under I I regulering af en promotor af E. coli-oprindelse eller en pro- I I motor af fagoprindelse, idet fusionsproteinet har følgende for- I I 10 mel I I A - L - B, I I hvor B betegner målpeptidet; A betegner et cysteinfrit part- I I 15 nerpolypeptid, som omfatter fra 90 til 220 aminosyrer svarende I I til et N-terminalt område af E. coli-β-galactosidase, og som I I har aminosyrerester, der ikke er cystein, substitueret på et I I hvilket som helst cystein-sted i den native sekvens; og L I betegner en linker-aminosyre mellem C-terminalen på partner- I I 20 polypeptidet og N-terminalen på målpeptidet, idet linker- I I aminosyren er valgt på en sådan måde, at den kan spaltes af en I protease eller kan selektivt kemisk nedbrydes, og ikke er til I stede i målpeptidet; I I 25 (2) sprængning af de dyrkede celler og udvinding af en uopløselig I I fraktion,, som indeholder fusionsproteinet; I I (3) solubilisering af fusionsproteinet med et solubiliserings- I I middel og behandling af det solubiliserede fusionsprotein med I 30 proteasen eller det egnede kemiske stof for at frigøre målpep- I I tidet, og isolering af målpeptidet. I

2. Fremgangsmåde ifølge-krav 1, I kendetegnet ved, at serin er substitueret på cystein- I I 35 stedet. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, I kendetegnet ved, at partnerpolypeptidet omfatter gluta- I minsyrephenylalanin eller glutamin-phenylalanin foruden den sekvens, I 40 der svarer til E. coli-/?-galactosidase. I

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, I I kendetegnet ved, at linker-aminosyren er lysin, og I I proteasen er lysyl-endopeptidase. I I 45 I

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, I kendetegnet ved, at linker-aminosyren er arginin, og I proteasen er clostripain. I DK 175535 B1 45

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at linker-aminosyren er glutaminsyre, og proteasen er protease V„. 5

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at linker-aminosyren er methionin, og det egnede kemiske stof til at nedbryde den er cyanogenbromid.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at målpeptidet er et peptid, der stammer fra human atria og har natriuretisk aktivitet.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, 15 kendetegnet ved, at målpeptidet er α-type human atria natriuretisk polypeptid (α-hANP) med følgende struktur: 5 10 20 H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-( 1) I—S-S— 15 20 25 25 ( 2 ) -I le-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH hvor {1) er direkte bundet til (2) . 30

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at målpeptidet er HPCT med følgende struktur: 35 I-S-S-1 H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-( 1) 4Q ( 2 )-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-(3 ) ( 4 ) -Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-OH hvor (1) er direkte bundet til (2), og (3) er direkte bundet til (4). 45 I DK 175535 B1 I I 46 I

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, I I kendetegnet ved, at partnerpolypeptidet består af (i) I I aminosyrer svarende til det N-terminal område af E. coli-β- I I galactosidase fra den l. aminosyre til den 210. aminosyre, hvor I I 5 aminosyrer, der ikke er cystein, er substitueret i stedet for I I cysteinrester i position 76, 122 og 154 i den native sekvens, og (ii) I I yderligere 2 eller 3 aminosyrerester. I

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, I I 10 kendetegnet ved, at partnerpolypeptidet består af (i) I I aminosyrer svarende til det N-terminal område af E. coli-β- I I galactosidase fra den 1. aminosyre til den 97. aminosyre, hvor I I aminosyrer, der ikke er cystein, er substitueret i stedet for I I cysteinrester i position 76 i den native sekvens, og (ii) yderligere I I 15 2 eller 3 aminosyrerester. I

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, I I kendetegnet ved, at promotoren er valgt blandt en promotor I I fra E. coli-lactosegenet, PL-promotoren fra fag og lpp-promotoren fra I I 20 E. coli ydre membran-lipoprotein. I

14. Fremgangsmåde ifølge krav i, i hvilken fremgangsmåde plasmidet er I I et plasmid, der kan opnås fra plasmidet pGHal007 (FERM BP-1748) og I I plasmidet pBR322 ved en fremgangsmåde, der omfatter: I I 25 I I (1) I I (a) spaltning af plasmidet pGHal007 med EcoRI og Aatll og I I ligering af EcoRI- og Aatll-stederne til dannelse af et I I plasmid, der indeholder DNA, som koder for et fusionsprotein I 30 med en N-terminal del af /(-galactosidase på 210 aminosyrer, og I I (b) spaltning af plasmidet, der indeholder fusionsprotein- I I DNA'et med EcoRV og udvælgelse af det næststørste resulterende I I DNA-fragment, som indeholder fusionsprotein-DNA’et; I I 35 I I (2) I I (a) spaltning af plasmidet pBR322 med Ball og PvuII og ligering I I af de tilsvarende steder på det største resulterende DNA- I fragment til dannelse af et modificeret pBR322, som mangler I

40 PvuII-Ball-fragmentet på 622 basepar; I I (b) spaltning af det modificerede pBR322 med EcoRV og Dral og I udvælgelse af det største resulterende DNA-fragment, som har et I replikations-begyndelsessted; I I 45 I I (3> I 47 DK 175535 B1 ligering af fragmenterne fra (l)(b) og (2)(b) til dannelse af et plasmid, der indeholder DNA, som koder for fusionsproteinet, og som mangler et replikation-af-plasmid-område.

15. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at plasmidet er pGHa97(Ser)rop* {FERM BP-1253).

16. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 10 kendetegnet ved, at målpeptidet ("α-hANP) har formlen: H-Ser-Leu-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-( 1)

15 I—S-S- (2)-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-0H 20 (hvor (1) og (2) er direkte forbundet) og plasmidet er et plasmid, der kan dannes ud fra plasmidet "pGHa97(Ser)rop'" (FERM BP-1253), som indeholder struktur-genet for 25 α-hANP, ved at hæfte en attenuator fra tryptophan-operon deri umiddelbart nedstrøms for α-hANP-struktur-genet.