DE69432336T2

DE69432336T2 - Schimmel-Protease

Info

Publication number: DE69432336T2
Application number: DE69432336T
Authority: DE
Inventors: Dr. Buxton; Dr. Jarai; Prof.Dr. Visser
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1993-11-03
Filing date: 1994-10-25
Publication date: 2003-12-04
Anticipated expiration: 2014-10-26
Also published as: US5674728A; ES2196019T3; EP0655497A3; JP3727678B2; HU9403136D0; US5756338A; KR950014309A; DK0655497T3; HU220360B; NO944181L; AU688379B2; EP0655497A2; EP0655497B1; FI119060B; ATE235556T1; ZA948619B; FI945163L; DE69432336D1; HUT69954A; CA2134863A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue DNA Sequenz, die für eine Asparaginsäureprotease von Aspergillus kodiert, eine Asparaginsäureprotease von Aspergillus an sich und ein Verfahren zur Herstellung hiervon. Die Erfindung betrifft ferner einen neuen Mutantenstamm von Aspergillus der bezüglich einer Asparaginsäureprotease defekt ist, der zur Expression eines heterologen Proteins brauchbar ist und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Mutantenstamms.

Hintergrund der Erfindung

Aspergillus Spezies und insbesondere Aspergillus niger werden für die industrielle Produktion von Enzymen verwendet, die in der Lebensmittelverarbeitungsindustrie verwendet werden. A. niger hat aufgrund der großen Fähigkeit zur Sekretion von Proteinen und durch die Zugänglichkeit der Systeme für molekulargenetische Veränderungen Vorteile als Wirt zur Herstellung von rekombinanten Proteinen. Jedoch hat sich die Anwesenheit von Proteasen in der Kulturflüssigkeit, dem periplasmatischen Raum oder dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi Apparat auf die Expression von heterologen Proteinen in A. niger als schädlich erwiesen und in der Praxis werden Aspergillen kommerziell zur Herstellung von Proteasen verwendet. Es wurden viele extrazelluläre Proteasen von Aspergilli in der Literatur beschrieben. Das Gen pepA, das Aspergillopepsin A von Aspergillus awamori kodiert, würde kürzlich kloniert. Das pepA Genprodukt macht einen Hauptteil der sekretierten sauren Proteasen von A. niger aus und Stämme, worin das pepA Gen deletiert wurde, erlauben eine erhöhte Expression von heterologen Proteinen in A. niger var. awamori. Es wurden auch andere Proteasegene kürzlich aus Aspergilli kloniert und diese umfassen eine alkalische Asparaginsäureprotease von A. oryzae, eine alkalische Asparaginsäureprotease von A. fumigatus eine saure Protease, die nicht vom Pepsintyp ist von A. niger var. macrosyorus, eine Metalloprotease, die neutrale Protease II aus A. oryzae genannt wird und zwei Serinproteasen von A. niger.
Isolierte und mutierte Proteasegene von A. niger können auch für Genzerstörungsexperimente verwendet werden, das heißt zur Herstellung von Mutantenstämmen, worin das entsprechende natürliche Gen zerstört ist. Beispielsweise wurde das pepA Gen von Aspergillus awamori durch Genzerstörung zerstört, um Stämme herzustellen, die für Aspergillopepsin A defizient sind.
Wie jedoch oben erwähnt, bilden Aspergilli eine große Anzahl an verschiedenen Proteasen und so besteht ein kontinuierlicher Bedarf für Aspergillus Stämme für die industrielle Herstellung von Proteinen, die bezüglich anderer Proteasen defizient sind. Für diesen Zweck besteht auch ein Bedarf für andere Proteasegene, die zur Herstellung der für Protease defizienten Stämme durch in vitro Mutagenese verwendet werden können, beispielsweise zur Genzerstörung. Darüberhinaus besteht auch ein Bedarf für rekombinante Proteaseproteine, die industriell zur Proteinprozessierung angewendet werden können.
Ein weiterer Hautbestandteil der sekretierten Proteaseaktivitäten in A. niger sind Asparaginsäureproteasen. Asparaginsäureproteasen wurden in mehreren Pilzen kloniert, beispielsweise das Vakuolenprotein pep4 (= pepA) von S. cerevisiae und die sekretierten Proteasen von Candida, Mucor, Rhizopus, Cryphonectria und Penicillium Spezies und die sekretierten sauren Hauptproteasen sowohl von A. niger als auch A. oryzae. Kürzlich wurde ein Vakuolenproteingen aus Neurospora crassa isoliert und es wurde gezeigt, daß es eine beträchtliche Sequenzhomologie zu pep4 der Hefe aufweist.
Es wurde nun festgestellt, daß Aspergillus auch eine weitere Asparaginsäureprotease herstellt, die zu den Pepsinen homolog ist, aber fast keine Homologie zum bekannten Aspergillopepsin zeigt. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Protease.

Ziel der Erfindung

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein DNA Molekül bereitzustellen, das für eine Asparaginsäureprotease von Asperaillus kodiert.
Es ist ein weiteres Ziel, eine rekombinante Aspergillus Asparaginsäureprotease bereitzustellen und für diesen Zweck auch einen transformierten Aspergillus Stamm zur Herstellung hiervon.
Ein weiteres Ziel ist es, einen Aspergillus Stamm bereitzustellen, der für ein Asparaginsäureproteasegen defizient ist, wobei der Stamm für eine effizientere Produktion von heterologen oder homologen Proteinen verwendet werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Asparaginsäureprotease von Aspergillus. Eine solche Protease wird hierin als "Aspergillus Asparaginsäureproteinase" bezeichnet. Eine "Aspergillus Asparaginsäureproteinase" der vorliegenden Erfindung wird so verstanden, daß sie (a) von Aspergillus spec. stammt, (b) eine Proteaseaktivität aufgrund eines katalytischen Asparaginsäurerests im aktiven Zentrum aufweist und (c) ausreichende Aminosäuresequenzhomologie mit bekannten Asparaginsäureproteasen aufweist, um in die Asparaginsäureproteinasefamilie eingruppiert zu werden. Innerhalb der Bedeutung des Ausdrucks "Aspergillus Asparaginsäureproteinase", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind jedoch auch Fragmente eines solchen Enzyms, die die Asparaginsäureproteaseaktivität behalten, jedoch sind Vollängenenzyme bevorzugte Ausführungsformen. Es ist verständlich, daß auch Fusionsproteine, die eine "Aspergillus Asparaginsäureproteinase" der Erfindung an zusätzliche Aminosäuren, Peptide oder Proteine angefügt aufweisen, Teil der Erfindung sind.
In einer bevorzugten Bedeutung beschreibt die Aspergillus Asparaginsäureproteinase eine Protease oder ein aktives Fragment, das von Aspergillus niger stammt, bevorzugter eine Protease oder ein aktives Fragment mit der Aminosäuresequenz oder einem Tel der Sequenz, die unter SEQ ID Nr: 1 gezeigt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine isolierte DNA Sequenz, die eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase der vorliegenden Erfindung kodiert und einen Hybridvektor zur Klonierung und Vermehrung einer solchen DNA Sequenz. Die Erfindung betrifft ferner einen Expressionshybridvektor zur Herstellung einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase, worin eine solche DNA Sequenz funktionell mit regulatorischen Regionen verbunden ist, die zur Expression des Gens für die Aspergillus Asparaginsäureproteinase in einer geeigneten Wirtszelle geeignet sind. Die Erfindung betrifft auch transformierte Wirtszellen, die zur Expression einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase fähig sind, beispielsweise einen Aspergillus Stamm, der zur Überexpression der Aspergillus Asparaginsäureproteinase aufgrund einer erhöhten Kopiezahl des Gens nach der Transformation fähig ist.
Die Erfindung betrifft, auch einen Aspergillus Stamm, der bezüglich eines Aspergillus Asparaginsäureproteinasegens defizient ist und ein Verfahren zur Herstellung hiervon durch eine DNA Sequenz, die eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodiert, die nicht mehr zur Expression eines funktinellen Gens aufgrund von Mutagenese, beispielsweise Genzerstörung, fähig ist.
Darüberhinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer DNA Sequenz, eines Hybridvektors, eines Expressionsvektors und einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase der Erfindung wie auch Verfahren zur Herstellung eines Aspergillus Stamms, der in einem Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen defizient ist und eines Wirtsstamms, der eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase überproduziert.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

DNA, die Aspergillus Asparagingsäureproteinase kodiert und Hybridvektoren zur Klonierung und Expression

Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA Molekül, das eine DNA Sequenz umfaßt, die für eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodiert, vorzugsweise von Aspergillus niger. Die DNA Sequenz kam eine oder mehrere Introns aufweisen, wie dies bei DNA Molekülen der Fall ist, die von einer genomischen Bank isolierbar sind, wie beispielsweise das in SEQ ID Nr: 1 gezeigte pepE gen. Jedoch betrifft die Erfindung auch eine Intron-freie Variante der DNA Sequenz, wie sie beispielsweise durch cDNA Klonierung oder nach einer Mutagenese isolierbar ist, beispielsweise durch Anwendung der PCR Technologie. Solche Intron-freien Gene sind besonders zur Expression in Nicht-Aspergillus Wirten brauchbar, vorzugsweise in Prokaryonten oder Hefe.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein DNA Molekül, das eine DNA Sequenz umfaßt, welche für die Asparaginsäureprotease PepE von A. niger kodiert mit der in SEQ ID Nr: 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder ein Fragment hiervon, das eine Asparaginsäureproteaseaktivität behält. Eine DNA Sequenz der Erfindung ist vorzugsweise die für reife PepE Protease kodierende Region, die in der Nukleotidsequenz mit der SEQ ID Nr: 1 gezeigt ist. Jedoch betrifft die Erfindung auch degenerierte DNA Sequenzen, die für PepE oder ein Fragment hiervon kodieren, das heißt Sequenzen, worin die Nukleotide ohne Veränderung der kodierten Aminosäuresequenz ersetzt sind. Solche DNA Sequenzen sind beispielsweise aufgrund der unterschiedlichen Codonverwendung in unterschiedlichen Wirten oder aufgrund des Vorkommens von neuen Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme brauchbar.
Die Erfindung betrifft auch einen Hybridvektor, der als Insert eine DNA Sequenz umfaßt, die für eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase der Erfindung kodiert, vorzugsweise einer bevorzugten Form hiervon. Ein solcher erfindungsgemäßer Hybridvektor ist zur Vermehrung und Vervielfältigung einer DNA Sequenz der Erfindung brauchbar. Die Erfindung betrifft auch einen Expressionsvektor, der zur Herstellung einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase der Erfindung brauchbar ist, vorzugsweise der bevorzugten Formen. Ein solcher Expressionsvektor umfaßt eine "Expressionskassette", worin eine DNA Sequenz, die für eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodiert, funktionell mit regulatorischen Regionen verbunden ist, die zur Kontrolle der Expression einer solchen DNA Sequenz in einer gewünschten Wirtszelle geeignet sind.
Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor, einschließlich eines Expressionsvektors, kann sich von einem Vektor ableiten, der in der Gentechnik brauchbar ist, wie von Viren, Phagen, Cosmiden, Plasmiden oder chromosomaler DNA, wie Derivaten von SV40, Herpesviren, Papillomaviren, Retroviren, Baculoviren, λ Phagen, beispielsweise NM 989 oder EMBL4 oder M13 Phagen, beispielsweise M13mp8, bakteriellen Plasmiden, beispielsweise pBR322, pUC18 oder Hefeplasmiden, beispielsweise Hefe 2 u Plasmid, oder von einem defekten Virus, Phagen oder Plasmid in Gegenwart eines Helfervirus, -phagen oder -plasmids, das die Replikation des defekten Virus, Phagen oder Plasmids erlaubt, beispielsweise M13(+)KS Vektor in Gegenwart von beispielsweise dem M14K07 Helferphagen oder auch von chromosomaler DNA, die beispielsweise von filamentösen Pilzen stammt, wie Aspergillus spec., beispielsweise A. niger, beispielsweise die, die von EP 0 184 438 A bereitgestellt wird. Bevorzugt sind Vektoren für S. cerevisiae oder filamentöse Pilze, vorzugsweise für Aspergillus spec. und noch bevorzugter A. niger.
Ein Hybridvektor der Erfindung, einschließlich eines Expressionsvektors, sorgt für eine Replikation einer gewünschten DNA in einer geeigneten Wirtszelle, entweder als extrachromosomales Element oder durch die Integration in das Wirtschromosom. Es sind mehrere mögliche Vektorsysteme zur Integration und Expression der klonierten DNA der Erfindung verfügbar. Im Prinzip sind alle Vektoren geeignet, die replizieren und in der gewählten Wirtszelle stabil sind. Daher wird der Vektor in Abhängigkeit der zur Transformation ausgewählten Wirtszelle ausgewählt. Im allgemeinen können solche Wirtszellen prokaryontische oder eukaryontische Mikroorganismen sein, wie Bakterien, Pilze, wie Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae oder filamentöse Pilze, vorzugsweise Aspergillus spec., bevorzugter A. niger oder Zellen höheren eukaryontischen Ursprungs, wie Vertebraten, beispielsweise Säugerzellen. Geeignete Wirtszellen werden später im Detail diskutiert. Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor, einschließlich eines Expressionsvektors, der als extrachromosomales Element aufrechterhalten wird, umfaßt einen Replikationsursprung (ori) oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), Selektionsmarkersequenzen und wahlweise zusätzliche Restriktionsschnittstellen. Ein Vektor, der für eine Integration in ein Wirtschromosom bestimmt ist, muß keinen ori oder keine ARS umfassen, da er in der Zelle im Zusammenhang mit dem Chromosom repliziert wird.
Ein Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ein DNA Element, das extrachromosomalen Elementen autonom replizierende Fähigkeiten verleiht) wird entweder durch die Konstruktion eines Vektors, der einen exogenen Ursprung aufweist, wie er vom Simianvirus (SV 40) oder einer anderen viralen Quelle stammen kann oder durch die chromosomalen Mechanismen der Wirtszelle bereitgestellt.
Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor, einschließlich eines Expressionsvektors, kann auch in Abhängigkeit des Wirts, in den er transformiert, selektiert und kloniert wird, Selektionsmarker enthalten. Es kann jeder Marker verwendet werden, der die Selektion von Transformanden aufgrund der phänotypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind insbesondere diejenigen, die eine Antibiotikumresistenz exprimieren, beispielsweise gegenüber Tetracyclin oder Ampicillin oder im Fall von auxotrophen Pilzmutanten, Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene vermitteln beispielsweise eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Cycloheximid oder sorgen für die Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, vorzugsweise S. cerevisiae Mutante, beispielsweise das ura3, leu2, his3 oder das trp1 Gen. Es ist auch möglich, Strukturgene als Marker zu verwenden, die mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, vorausgesetzt, daß der zur transformierende Wirt für das durch den Marker exprimierte Produkt auxotroph ist.
Von besonderem Interesse im Zusammenhang mit Hybridvektoren, insbesondere Expressionsvektoren für A. niger sind Markergene, die A. niger Wirtsläsionen komplementieren, wie das argB Gen, das für die Ornithincarbamoyltransferase kodiert und beispielsweise von A. niger oder A. nidulans stammt (EP 0 184 438 A) oder A. nidulans DNA Fragmente, die zum N. crassa pyr4 Gen homolog sind. Andere geeignete Markergene sind hierin später in Zusammenhang mit der Beschreibung der transformierten Wirte der Erfindung beschrieben.
Ein Hybridvektor der Erfindung, der zur Vermehrung der DNA geeignet ist, die für die Aspergillus Asparaginsäureproteinase in E. coli kodiert, ist beispielsweise das Plasmid pPEPE, das hierin späte in den begleitenden Beispielen beschrieben ist.
Der Ausdruck "Expressionskassette" meint im Zusammenhang mit einem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung eine DNA Sequenz, die zur Expression einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase fähig ist und umfaßt einen Promotor, der operativ mit einer für Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodierenden Region verbunden ist und wahlweise ein oder mehrere weitere regulatorische Elemente der Gruppe, die besteht aus einer Signalsequenz, einem Transkriptionsterminator, einem Transkriptionsenhancer, einer Ribosomenbindungsstelle, einer Sequenz zur effizienten RNA Prozessierung, einer Sequenz, die für eine effiziente Proteinprozessierung kodiert und eine Sequenz, die für eine korrekte Proteinlokalisation kodiert. In einer erfindungsgemäßen Expressionskassette kann eine für Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodierende Region mit homologen Regulationselementen kombiniert werden, das heißt, wie sie hiermit natürlich verbunden sind oder mit heterologen Regulationselementen, das heiß solchen, die von anderen Genen stammen.
Es kann eine große Vielzahl an Promotorsequenzen in Abhängigkeit der Wirtszelle verwendet werden. Promotoren, die stark sind und gleichzeitig gut reguliert sind, sind die brauchbarsten.
Beispiele für Promotoren sind die prokaryontischen λPL, λPR, λPR E.coli lac, trp oder tac Promotoren. Promotoren, die zur Expression in Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae geeignet sind, sind TRP1-, ADHI-, ADHII-, PHO3-, PHO5-, GAL10- oder glycolytische Promotoren, wie der Promotor der Enolase-, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, 3-Phosphoglyceratkinase- (PGK), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofruktokinase-, Glucose-6-phosphatisomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- und Glucokinasegene oder der PHO5-GAPDH Hybridpromotor (EP 0 213 593 A). Andere Beispiele für eukaryontische Promotoren sind Promotoren, die von eukaryontischen Viren stammen, beispielsweise SV40, Rous Sarcoma Virus, Adenovirus 2, Rinderpapillomavirus, Papovavirus, Cytomegalievirus oder von Säugerzellen stammende Promotoren, beispielsweise des Actin-, Kollagen-, Myosin- oder β-Globulingens. Die eukaryontischen Promotoren können mit Enhancersequenzen kombiniert werden, wie der stromaufwärts aktivierenden Sequenzen (UAS) der Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, oder virale oder zelluläre Enhancer, wie die Cytomegalievirus IE Enhancer, SV40 Enhancer, Immunglobulingenenhancer oder andere.
Enhancer sind Transkriptions-stimulierende DNA Sequenzen, die beispielsweise von Viren stammen, wie Simianvirus, Polyomavirus, Rinderpapillomavirus oder Moloneysarcomavirus oder aus genomischem Ursprung. Eine Enhancersequenz kann auch von der extrachromosomalen, ribosomalen DNA von Physarum polycephalum (WO 85/00278) stammen. Geeignete Enhancer sind beispielsweise auch stromaufwärts liegende Aktivietungsstellen, die vom Gen der sauren Phosphatase PHO5 der Hefe stammen.
Signalsequenzen können beispielsweise eine Präsequenz oder eine Sekretionssequenz oder dergleichen sein, die die Sekretion des Polypeptids steuern. Eine Signalsequenz ist beispielsweise ein Signal- oder Leaderpeptid der Aspergillus Asparaginsäureproteinase, wie die in SEQ ID Nr: 1 gezeigte Signalsequenz. Es sind weitere Signalsequenzen aus der Literatur bekannt, beispielsweise die, die von G. Heijne, Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986) zusammengestellt sind.
Sequenzen, die zur Initiation und Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind, sind herkömmlich jeweils aus den nicht-kodierenden 5'-Regionen und 3'-Regionen der viralen oder eukaryontischen cDNAs erhältlich, beispielsweise vom Expressionswirt.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Expressionsvektor, der eine Intron-freie Region, die sich aus den drei Exons der in SEQ ID Nr: 1 gezeigten kodierenden Region zusammensetzt, zur Expression der Aspergillus Asparaginsäureproteinase in Prokaryonten, beispielsweise in E. coli oder vorzugsweise in einer Hefe, bevorzugter in S. cerevisiae unter der Kontrolle des GALIO Promotors umfaßt, wie beispielsweise in Plasmid pGALPEPE.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen Expressionsvektor, der zur Expression einer DNA Sequenz, die für eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase in einem Aspergillus Stamm kodiert, fähig ist.
Ein Typ eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält eine DNA Sequenz, die für eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodiert, vorzugsweise von A. niger unter der Kontrolle eines Promotors, der natürlicherweise mit dieser DNA Sequenz verbunden ist, das heißt des homologen Promotors. Bevorzugter ist ein Expressionsvektor, der eine DNA Sequenz, die für PEPE von SEQ ID Nr: 1 kodiert, am bevorzugtesten die in SEQ ID Nr: 1 gezeigte DNA Sequenz, unter der Kontrolle der in SEQ ID Nr: 1 gezeigten Promotorregion umfaßt.
Falls ein solcher Expressionsvektor zur Expression der Aspergillus Asparaginsäureproteinase in einem Wirt verwendet wird, von dem das Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen natürlicherweise stammt, wird die Aspergillus Asparaginsäureproteinase überexprimiert, da sowohl das rekombinante als auch das ursprüngliche Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen unter denselben Expressionsbedingungen exprimiert werden.
Ein weiterer Typ eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors umfaßt eine DNA Sequenz, die für eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodiert unter der Kontrolle eines Promotors, der in Aspergillus funktionsfähig ist, der nicht natürlicherweise mit dieser DNA Sequenz verbunden ist. Ein Promotor, der zur Expression einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase in Aspergillus spec., insbesondere in A. niger geeignet ist, ist beispielsweise ein Promotor eines Aspergillus spec. Pectinlyasegens, vorzugsweise der Promotor der A. niger Gene PLI (siehe EP 0 278 355 A), PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF (siehe EP 0 353 188 A), ein Promotor eines Aspergillus spec. Polygalacturonasegens, vorzugsweise ein Promotor des A. niger Gens PGI oder PGII (siehe EP 0421 919 A), ein Promotor des Aspergillus spec. Pyruvatkinasegens, vorzugsweise der Promotor des A. niger pki Gens (EP 0 439 997 A).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, beispielsweise im Plasmid pPKIPEPE, ist der Pyruvatkinasepromotor von A. niger funktionsfähig mit der in SEQ ID Nr: 1 gezeigten kodierenden Region verbunden, die eine an ihre homologe Singalsequenz gebundene Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodiert.

Verfahren zur Herstellung eines Aspergillus Asparaginsäureproteinasegens

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines DNA Moleküls der Erfindung, das heißt eines, das für die erfindungsgemäße Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodiert, das vorzugsweise eine bevorzugte Form der Aspergillus Asparaginsäureproteinase der Erfindung kodiert, oder zur Herstellung eines Hybridvektors, der ein solches DNA Molekül enthält, wobei das Verfahren die Kultivierung eines Wirts umfaßt, der mit einem solchen DNA Molekül oder Hybridvektor der Erfindung transformiert ist. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann ein DNA Molekül der Erfindung durch eine chemische Synthese über die Nukleotidkondensation hergestellt werden.
Die Kultivierung der Wirte wird in einem herkömmlichen Nährmedium ausgeführt, das mit chemischen Verbindungen versetzt ist oder auch nicht, die eine negative oder positive Selektion der Transformanden, das heißt der Wirte, die das gewünschte DNA Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker enthalten, gegenüber nicht transformierten Zellen erlaubt, das heißt Wirten, denen das gewünschte DNA Molekül fehlt.
Es können alle transformierbaren in der Technik brauchbaren Wirte verwendet werden, beispielsweise Bakterien, wie E. coli, Pilze, wie Saccharomyces cerevisae, Kluyveromyces lactis, höhere eukaryontische Zellen, wie Insektenzellen oder Säugerzellen, beispielsweise CHO Zellen oder insbesondere filamentöse Pilze, wie Aspergillus, beispielsweise A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius. A. awamori, A. japonicus und speziell A. niger. Die Transformation der Wirte wird durch herkömmliche Verfahren ausgeführt.
Eine DNA Sequenz, die für eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodiert, kann aus dem Genom eines Aspergillus Stamms erhalten werden, der zur Expression einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase fähig ist oder kann beispielsweise durch die Kultivierung eines Wirts hergestellt werden, der mit einem rekombinanten DNA Molekül transformiert ist, das eine DNA Sequenz enthält, die für eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodiert und erforderlichenfalls der Isolierung der gewünschten DNA Sequenz hieraus.
Insbesondere kann eine solche DNA durch ein Verfahren hergestellt werden, das einen Schritt umfaßt, ausgewählt aus
a) Isolierung einer genomischen DNA aus geeigneten Aspergillus Zellen und die Auswahl der gewünschten DNA, beispielsweise mittels einer DNA Sonde oder die Verwendung eines geeigneten Expressionssystems und Screenen auf die Expression des gewünschten Polypeptids,
b) Isolierung der mRNA aus geeigneten Aspergillus Zellen, Auswahl der gewünschten mRNA, beispielsweise durch Hybridisierung mit einer DNA Sonde oder durch Expression in einem geeigneten Expressionssystem und Screenen auf die Expression des gewünschten Polypeptids, Präparation der einzelsträngigen cDNA, die zu dieser mRNA komplementär ist und anschließend der doppelsträngigen cDNA hiervon,
c) Isolierung der cDNA aus einer cDNA Genbank und Selektion der gewünschten cDNA, beispielsweise mittels einer DNA Sonde oder mittels eines geeigneten Expressionssystems und Screening auf die Expression des gewünschten Polypeptids,
d) Synthese der doppelsträngigen DNA in vitro durch PCR Technologie der gesamten Aspergillus DNA mittels Oligonukleotidprimern, die für das für A. niger pepE kodierende Gen entworfen sind, oder
e) Einbau einer doppelsträngigen DNA, die gemäß dem Schritt a), b), c) oder d) erhalten werden kann in einen geeigneten Vektor, Transformation eines geeigneten Wirts, Vermehrung des Wirts und Isolierung der DNA.
Die genomische DNA kann bezüglich der gewünschten DNA isoliert und gescreent werden (Schritt a). Die genomische DNA wird aus einem Aspergillus Stamm isoliert, der zur Expression einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase fähig ist. Es wird eine DNA Genbank hieraus durch den Verdau mit geeigneten Restriktionsendonukleasen und einem Einbau hiervon in geeignete Vektoren gemäß etablierter Verfahren hergestellt. Die DNA Genbank wird mit einer DNA Sonde gescreent, wie dies hierin später beschrieben wird oder in einem geeigneten Expressionsystem exprimiert und die erhaltenen Polypeptide werden auf herkömmliche Weise gescreent.
Eine Genbank kann beispielsweise durch einen Partialverdau der genomischen DNA eines A. niger Stamms, beispielsweise NW756 oder N400, mit beispielsweise Sau3AI oder MboI und der Klonierung der hochmolekularen DNA Fragmente in einen geeigneten Wirtsvektor, beispielsweise dem E. coli Plasmid pUN121 oder einem Lambda Vektor, beispielsweise EMBL4, hergestellt werden.
Andere Pilzstämme, die die gewünschte Aspergillus Asparaginsäureproteinase herstellen, beispielsweise A. japonicus, A. oryzae, A. nidulans und A. niger können als Quelle für die Genbank dienen und andere geeignete Vektoren, beispielsweise die vorher erwähnten, können als Empfänger für diese Fragmente verwendet werden.
Um die Genbank erfolgreich auf DNA Sequenzen zu screenen, die für Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodieren, ist eine DNA Hybridisierungssonde erforderlich. Dies kann eine synthetische DNA Sonde sein, falls die Aminosäuresequenz oder ein Teil hiervon einer gewünschten Aspergillus Asparaginsäureproteinase bekannt ist oder ein anderes Asparaginsäureproteinasegen, beispielsweise von Neurospora crassa, oder ein Teil hiervon, die mit einem Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen hybridisieren.
Es wird eine polyadenylierte Boten-RNA (Schritt b) aus den geeigneten Zellen durch bekannte Verfahren isoliert. Die Isolierungsverfahren umfassen beispielsweise die Homogenisierung in Gegenwart eines Detergenzes und eines Ribonukleaseinhibitors, beispielsweise Heparin, Guanidiniumisothiocyanat oder Mercaptoethanol, die Extraktion der mRNA mit geeigneten Chloroform-Phenol-Gemischen, wahlweise in Gegenwart von Salz und Pufferlösungen, Detergenzien und/oder Kationchelatmitteln, und die Ausfällung der mRNA aus der verbleibenden wäßrigen, salzenthaltenden Phase mit Ethanol, Isopropanol oder dergleichen. Die isolierte mRNA kann ferner durch die Zentrifugation in einem Cäsiumchloridgradienten, gefolgt von einer Ethanolfällung und/oder von chromatographischen Verfahren gereinigt werden, beispielsweise Affinitätschromatographie, beispielsweise Chromatographie auf Oligo(dT)-Cellulose oder auf Oligo(U)-Sepharose. Vorzugsweise wird eine so gereinigte Gesamt- mRNA nach der Größe durch Gradientenzentrifugation fraktioniert, beispielsweise in einem linearen Saccharosegradienten oder durch Chromatographie auf geeigneten Größenfraktionierungssäulen, beispielsweise auf Agarosegelen.
Die gewünschte mRNA wird durch Screenen der mRNA direkt mit einer DNA Sonde oder durch Translation in geeigneten zellhaltigen oder zellfreien Systemen und Screening der erhaltenen Polypeptide ausgewählt.
Die Selektion der gewünschten mRNA wird vorzugsweise mittels einer DNA Hybridisierungssonde erreicht wie dies später beschrieben wird, wobei der zusätzliche Schritt der Translation vermieden wird. Geeignete DNA Sonden sind DNAs mit bekannter Nukleotidsequenz, beispielsweise synthetische DNAs, cDNAs, die von mRNA stammen, die für die gewünschten Polypeptide kodieren oder genomische DNA Fragmente, die beispielsweise benachbarte DNA Sequenzen enthalten, welche aus einer natürlichen Quelle oder einem genetisch veränderten Mikroorganismus isoliert wurden.
Fraktionierte mRNA kann in Zellen, beispielsweise Froschoocyten, oder in zellfreien Systemen, beispielsweise in Reticulocytenlysaten oder Weizenkeimextrakten translatiert werden. Die erhaltenen Polypeptide werden auf enzymatische Aktivität oder auf Reaktion mit Antikörpern getestet, die gegenüber dem nativen Polypetid erzeugt wurden, beispielsweise in einem Immuntest, beispielsweise Radioimmuntest, Enzymimmuntest oder Immuntest mit Fluoreszenzmarkern. Solche Immuntests und die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern sind gut bekannt und werden dementsprechend angewendet.
Die Herstellung einer einzelsträngigen, komplementären DNA (cDNA) aus der ausgewählten mRNA Matrize ist in der Technik gut bekannt, wie auch die Herstellung einer doppelsträngigen DNA aus einer einzelsträngigen DNA. Die mRNA Matrize wird inkubiert mit einem Gemisch aus Desoxynukleosidtriphosphaten, wahlweise radioaktiv markierten Desoxynukleosidtriphosphaten (um in der Lage zu sein, das Ergebnis der Reaktion zu screenen), einer Primersequenz, wie einem Oligo-dT Rest, der mit dem Poly-A-Schwanz der mRNA hybridisiert und einem geeigneten Enzym, wie einer reversen Transkriptase, beispielsweise aus dem Vogelmyoblastosevirus (AMV). Nach dem Abbau der mRNA Matrize, beispielsweise durch alkalische Hydrolyse, wird die cDNA mit einem Gemisch aus Desoxynukleosidtriphosphaten und einem geeigneten Enzym unter Bildung einer doppelsträngigen DNA inkubiert. Geeignete Enzyme sind beispielsweise eine reverse Transkriptase, das Klenow-Fragment der E. coli DNA Polymerase I oder die T4 DNA Polymerase. Gewöhnlich dient eine durch die einzelsträngige cDNA gebildete spontane Haarnadelstruktur als Primer für die Synthese des zweiten Strangs. Diese Haarnadelstruktur wird durch den Verdau mit S1 Nuklease entfernt. Alternativ dazu wird das 3'-Ende der einzelsträngigen DNA zuerst durch homopolymere Desoxynukleotidverlängerungen vor der Hydrolyse der mRNA Matrize und der anschließenden Synthese des zweiten cDNA Strangs verlängert.
Alternativ dazu wird die doppelsträngige cDNA aus einer cDNA Bank isoliert und auf die gewünschte cDNA gescreent (Schritt c). Die cDNA Bank wird durch Isolierung der mRNA aus geeigneten Zellen und der Herstellung einer einzelsträngigen und doppelsträngigen cDNA hiervon wie oben beschrieben konstruiert. Die cDNA wird mit geeigneten Restriktionsendonukleasen verdaut und in den λ-Phagen, beispielsweise λ Charon 4A oder λ gt 11, gemäß etablierter Verfahren eingebaut. Die auf geeigneten Membranen replizierte cDNA Bank, beispielsweise Nitrocellulosemembranen, geladenen Nylon Membranen, wie Hybond®, Immobilon® oder GeneScreen®, wird durch die Verwendung einer DNA Sonde, wie dies hierin vorher beschrieben wurde, gescreent oder in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert und die erhaltenen Polypeptide werden auf die Reaktion mit einem Antikörper gescreent, der für die gewünschten Verbindungen spezifisch ist.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung einer doppelsträngigen DNA ist die PCR Technologie (Schritt d). Dieses Verfahren kann insbesondere zur Herstellung einer großen Menge an doppelsträngiger DNA ausgehend von einer kleinen Menge an DNA oder RNA mit zumindest teilweise bekannten Sequenzen verwendet werden. Jedoch kann auch ein DNA Insert mit unbekannter Sequenz, das durch bekannte Vektorsequenzen flankiert ist, als Ausgangsmaterial verwendet werden. Bei der PCR Technologie werden DNA Moleküle, beispielsweise Oligonukleotide, als Primer für die enzymatische, Matrizen-abhängige Synthese der DNA verwendet. Es können große Mengen hergestellt werden, da die Denaturierung der doppelsträngigen DNA, die Hybridisierung mit den Primern und die enzymatische Synthese sequenziell wiederholt werden können. Die Anzahl an synthetisierten DNA Molekülen steigt exponentiell, da sie sich mit jeder Runde verdoppelt. Die PCR Technologie ist Stand der Technik und kann herkömmlich in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Oligonukleotidprimer kann so entworfen werden, daß er mit der DNA hybridisiert, die die konservierten Asparaginsäureproteaseproteinsequenzen basierend auf einem Vergleich zwischen bekannten Asparaginsäureproteasen kodieren würde. Die PCR Technologie ist in der Technik gut bekannt und es können herkömmliche PCR Techniken in der vorliegenden Erfindung angewendet werden, wie sie beispielsweise beschrieben sind in: M. A. Innis et al., (Herausgeber), PCR Protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego (1990).
Es ist eine Vielzahl an Verfahren zum Einbau einer doppelsträngigen cDNA oder einer genomischen DNA in einen geeigneten Vektor bekannt (Schritt e). Beispielsweise können komplementäre Homopolymerabschnitte an die doppelsträngige DNA und die Vektor DNA durch die Inkubation in Gegenwart der entsprechenden Desoxynukleosidtriphoshate und eines Enzyms, wie der terminalen Desoxynukleotidyltransferase angefügt werden. Der Vektor und die doppelsträngige DNA werden dann durch Basenpaarung zwischen den komplementären Homopolymerschwänzen zusammengebracht und schließlich durch spezifische verbindende Enzyme, wie Ligasen, ligiert. Andere Möglichkeiten sind die Anfügung von synthetischen Linkem an die Enden der doppelsträngigen DNA oder der Einbau der doppelsträngigen DNA in den Vektor durch eine Ligation mit stumpfen oder abgestuften Enden. Geeignete Vektoren werden später im Detail diskutiert.
Die Transformationsverfahren zur Transformation von geeigneten Wirtszellen mit dem erhaltenen Hybridvektor und die Selektion und Vermehrung der transformierten Wirtszellen sind in der Technik gut bekannt. Beispiele für diese Verfahren werden später angeführt.
Die Isolierung der erfindungsgemäßen gewünschten DNA und von Mutanten und Fragmenten hiervon wird durch in der Technik bekannte Verfahren erreicht, beispielsweise durch Extraktion mit Phenol und/oder Chloroform. Wahlweise kann die DNA weiter manipuliert werden, beispielsweise durch die Behandlung mit mutagenen Mitteln unter Bildung von Mutanten oder durch einen Verdau mit Restriktionsenzymen, um Fragmente zu erhalten, ein oder beide Enden zur Erleichterung des Einbaus in den Vektor zu modifizieren, intervenierende Sequenzen zu entfernen und dergleichen.
Die Nukleotidsequenz einer erfindungsgemäßen DNA kann durch an sich bekannte Verfahren bestimmt werden, beispielsweise durch das Maxam-Gilbert Verfahren mittels endmarkierter DNA oder durch das Didesoxykettenabbruchverfahren von Sanger.
Die Aspergillus Asparaginsäureproteinasegensequenzen der vorliegenden Erfindung können auch durch eine in vitro Synthese gemäß herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Die in vitro Synthese ist speziell für die Herstellung von kleineren Fragmenten eines Aspergillus Asparaginsäureproteinasegens anwendbar, das für Fragmente einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase mit Asparaginsäureproteaseaktivität kodiert. Die in vitro Synthese ist auch insbesondere anwendbar für die Synthese von DNA, die für einen Promotor oder ein Signalpeptid kodiert. Die in vitro Synthese wird vorzugsweise auf das von A. niger stammende Aspergillus Asparaginsäureproteasegen oder auf Fragmente hiervon angewendet, am bevorzugtesten auf das in SEQ ID Nr: 1 gezeigte pepE Gen oder die Signalsequenz hiervon.
Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann ein Asparaginsäureproteinasegen einer anderen Spezies, beispielsweise N. crassa, oder ein Fragment hiervon als Sonde zur Identifizierung einer Aspergillus spec., beispielsweise einer A. niger Asparaginsäureproteinase mRNA in einer RNA Fraktion oder eine Asparaginsäureproteinase DNA in einer genomischen oder cDNA Bank verwendet werden. Aus der Pimärsequenz des A. niger Gens und einem Vergleich mit anderen Proteasen kann, die kodierende Region der Protease abgeleitet werden und die Beziehung des Gens zur Asparaginsäureproteinasegenfamilie kann bestätigt werden. Das erhaltene Gen kann zur Herstellung einer rekombinanten Protease verwendet werden, wie dies später im Detail beschrieben ist.
Synthetische DNA Sonden können gekauft oder gemäß bekannter Verfahren synthetisiert werden. Gemische der gewünschten Oligonukleotide können mittels Gemischen aus zwei, drei oder vier Nukleotiden aus dA, dc, dG und/oder dT in geschützter Form oder der entsprechenden Dinukleotidkupplungseinheiten im geeigneten Kondensationsschritt erhalten werden, wie dies von Y. Ike et al. beschrieben ist (Nucleic Acids Research 11, 477, 1983).
Zur Hybridisierung werden die DNA Sonden markiert, beispielsweise durch eine Kinasereaktion radioaktiv markiert. Die Hybridisierung der größenfraktionierten mRNA mit den eine Markierung enthaltenden DNA Sonden wird gemäß bekannter Verfahren ausgefüllt, das heißt in Puffer und Salzlösungen, die Zusätze enthalten, beispielsweise Calciumchelatbildner, Viskositäts-regulierende Verbindungen, Proteine, nicht-homologe DNA und dergleichen, bei Temperaturen, die eine selektive Hybridisierung favorisieren, beispielsweise zwischen 0ºC und 80ºC, wie zwischen 25ºC und 50ºC oder um etwa 65ºC, vorzugsweise um etwa 20ºC niedriger als die Schmelztemperatur der doppelsträngigen Hybrid-DNA.

Transformierte Wirte und Präparationen hiervon

Ferner betrifft die Erfindung Wirtszellen, die mit einem Hybridvektor oder Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung transformiert sind, der vorzugsweise die bevorzugten Formen der erfindungsgemäßen Aspergillus Asparaginsäureproteinase der Erfindung kodiert.
Beispiele für geeignete Wirte, insbesondere zur Vermehrung der rekombinanten DNA Moleküle der Erfindung sind Mikroorganismen, die keine oder wenige Restriktionsenzyme oder Modifikationsenzyme aufweisen, wie Bakterien, insbesondere Stämme von Escherichia coli, beispielsweise E. coli X1776, E. coli Y1090, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA 221, E. coli DH5α oder vorzugsweise E. coli DH5αF', JM109, MH1 oder HB101 oder E. coli K12 Stämme. Geeignete Wirte sind auch andere prokaryontische Zellen, beispielsweise Bacillus subtilis Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere und Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevisae, wie S. cerevisiae GRF 18. Weitere geeignete Wirtszellen sind Zellen höherer Organismen, insbesondere etablierte kontinuierliche humane oder tierische Zellinien, beispielsweise humane, embryonale Lungenfibroblasten L132, humane, maligne Bowes Melanomzellen, HeLa Zellen, mit SV40 Virus transformierte Nierenzellen der afrikanischen Meerkatze COS-7 oder Ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO).
Beispiele für geeignete Zellen zur Expression eines Aspergillus Asparaginsäureproteinasegens sind die vorher erwähnten Zellen, die mit einem geeigneten Expressionsvektor transformiert sind und zusätzliche geeignete Insektenzellen, die mit einem geeigneten Baculovirus Expressionsvektor transformiert sind und insbesondere filamentöse Pilze, beispielsweise Penicillium, Cephalosporium oder vorzugsweise Aspergillus spec., beispielsweise A. carbonarius, A. awamori, A. nidulans, A. oryzae oder bevorzugter A. niger, die mit einem geeigneten Expressionsvektor transformiert sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von solchen Transformanden, das die Behandlung einer geeigneten Wirtszelle unter Transformationsbedingungen mit einem DNA Molekül oder Hybridvektor der Erfindung, wahlweise zusammen mit einem geeigneten Markergen und wahlweise die Selektion der Transformanden umfaßt. Das Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen kann auch nach der Transformation in das Wirtsgenom integriert werden, insbesondere falls eukaryontische Zellen, beispielsweise Aspergillus spec. als Wirt verwendet werden.
Die Transformation von Mikroorganismen wird gemäß herkömmlicher Verfahren ausgeführt, wie sie in der Literatur beschrieben sind, beispielsweise für S. cerevisiae (A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978), für B. subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741, 1961), für E. coli (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159, 1970) und für Aspergillus [F. Buxion et al., Gene 37 : 207-214 (1985), D. J. Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284-289 (1983)].
Demnach umfaßt das Transformationsverfahren für E. coli Zellen beispielsweise eine Ca²&spplus; Vorbehandlung der Zellen, um die DNA Aufnahme zu ermöglichen, und die Inkubation mit dem Hybridvektor. Die anschließende Selektion der transformierten Zellen kann beispielsweise durch den Transfer der Zellen in ein selektives Wachstumsmedium erreicht werden, das die Trennung der transformierten Zellen von den Ausgangszellen in Abhängigkeit der Art der Markersequenz der Vektor DNA erlaubt. Vorzugsweise wird ein Wachstumsmedium verwendet, das kein Wachstum von Zellen erlaubt, die keinen Hybridvektor enthalten.
Die Transformation von Pilzen, wie Hefe oder Aspergillus spec. umfaßt beispielsweise Schritte der enzymatischen Entfernung der Zellwand durch Glucosidasen, die Behandlung der so erhaltenen Spheroplasten mit dem Hybridvektor in Gegenwart von Polyethylenglycol und Ca²&spplus; Ionen und die Regeneration der Zellwand durch das Einbetten der Spheroplasten in Agar. Vorzugsweise wird der Regenerationsagar auf eine Weise hergestellt, die die Regeneration und Selektion der wie oben beschrieben transformierten Zellen zur selben Zeit erlaubt.
Die Transformation von Zellen höheren eukaryontischen Ursprungs, wie Säugerzellinien, wird vorzugsweise durch Transfektion erreicht. Die Transfektion wird durch herkömmliche Techniken ausgeführt, wie Calciumphosphatfällung, Mikroinjektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, das heißt Einführung der DNA durch einen kurzen elektrischen Impuls, der vorübergehend die Permeabilität der Zellmembran erhöht oder in Gegenwart von Hilfsverbindungen, wie Diethylaminoethyldextran, Dimethylsulfoxid, Glycerin oder Polyethylenglycol und dergleichen. Nach dem Transfektionsverfahren werden die transfizierten Zellen identifiziert und beispielsweise durch Kultivierung in einem geeigneten Selektivmedium in Abhängigkeit der Art des Selektionsmarkers ausgewählt, beispielsweise durch Standardkulturmedien, wie Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), Mimimal Essential Medium, RPMI 1640 Medium und dergleichen, die beispielsweise das entsprechende Antibiotikum enthalten.
Die transformierten Wirtszellen werden durch in der Technik bekannte Verfahren in einem Flüssigmedium kultiviert, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose oder Lactose, Stickstoff, beispielsweise Aminosäuren, Peptide, Proteine oder ihre Abbauprodukte, wie Peptone, Ammoniumsalze oder dergleichen und anorganische Salze, beispielsweise Sulfate, Phosphate und/oder Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium enthält. Das Medium enthält ferner wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, beispielsweise Eisen, Zink, Mangan und dergleichen.
Das Medium wird vorzugsweise so ausgewählt, daß es einen Selektionsdruck ausübt und das Wachstum der Zellen verhindert, die nicht transformiert wurden oder den Hybridvektor verloren haben. Daher wird beispielsweise ein Antibiotikum zum Medium gegeben, falls der Hybridvektor ein Antibiotikumresistenzgen als Marker enthält. Falls beispielsweise eine Wirtszelle verwendet wird, die für eine essentielle Aminosäure auxotroph ist, während der Hybridvektor ein Gen enthält, das für ein Enzym kodiert, welches den Wirtsdefekt komplementiert, wird ein Minimalmedium, dem diese Aminosäure fehlt, zur Kultivierung der transformierten Zellen verwendet.
Zellen höheren eukaryontischen Ursprungs, wie Säugerzellen, werden unter Gewebekulturbedingungen mittels im Handel erhältlicher Medien angezogen, wie beispielsweise Dulbeccos Modified Eagle Medium, Minimal Essential Medium (DMEM), RPMI 1640 Medium und dergleichen, wie sie oben erwähnt sind, die wahlweise mit wachstumsfördernden Substanzen und/oder Säugerseren supplementiert sind. Die Techniken zur Zellkultivierung unter Gewebekulturbedingungen sind in der Technik gut bekannt und umfassen die homogene Suspensionskultur, beispielsweise in einem Airliftreakor oder in einem kontinuierlichen Rührreaktor oder einer immobilisierten oder eingeschlossenen Zellkultur, beispielsweise in Hohlfasern, Mikrokapseln, auf Agarosemikrobetten, porösen Glaskügelchen, Keramikkartuschen oder anderen Mikroträgern.
Die Kultivierung wird durch Verfahren bewirkt, die in der Technik bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so ausgewählt, daß ein maximaler Titer des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats erhalten wird. Daher wird ein E. coli oder Hefestamm vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durch submerse Kultur mit Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20ºC bis 40ºC, vorzugsweise bei etwa 30ºC und einem pH Wert von 4 bis 8, vorzugsweise etwa 7, für etwa 4 bis 30 Stunden geschüttelt oder gerührt, vorzugsweise bis maximale Ausbeuten des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats erreicht sind.
Um die Selektion der transformierten von den nicht-transformierten Zellen zu erlauben, tragen die DNA Moleküle der Erfindung einen Selektionsmarker oder die Zellen werden alternativ dazu mit einem zweiten Vektor cotransformiert, der einen solchen Marker enthält. Wie in anderen Systemen ist ein solcher Selektionsmaker ein exprimierbares Strukturgen, dessen exprimiertes Polypeptid (ein Enzym) eine Resistenz gegenüber Verbindungen verleiht, die für den Empfängerorganismus toxisch sind oder die das Enzymsystem einer Mutante vervollständigen, der dieses essentielle Polypeptid fehlt. Solche Markergene, die zur Selektion von transformierten filamentösen Pilzzellen geeignet sind, sind beispielsweise die bekannten qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS oder argB Gene.
Wie in EP 0 278 355 A beschrieben, wird ein pyrA genanntes Markergen aus einer Genbank von A. niger isoliert, das mit pyrG von A. niger und pyr4 von N. crassa verwandt ist und dieselbe Funktion hat, nämlich das Enzymorotidin-5'-phosphatdecarboxylase bildet. Dieses Enzym katalysiert die Decarboxylierung von Orotidin-5'- phosphat zu Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch von Fluororotsäure zum toxischen Fluoruridin. Jedoch kann die DNA von jedem anderen pyr Gen verwendet werden, das für die Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase kodiert. Aus einem positiven Klon mit dem Namen E. coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968) wird das Plasmid pCG59D7, das das pyrA gen umfaßt, isoliert und zur Cotransformation einer A. niger pyrA Mutante verwendet. Eine solche pyrA Mutante ist im Orotidin-5'-phosphatdecarboxylasegen defekt und ist daher zur Bildung des entsprechenden Enzyms unfähig. Eine solche Mutante wird durch die Behandlung der Konidiosporen von A. niger N756 unter mutierender UV Bestrahlung hergestellt und es werden Kolonien selektiert, die in Gegenwart von Fluororotsäure und Uridin überleben. Kolonien, die in Gegenwert von Fluororotsäure und in Abwesenheit von Uridin überleben, werden eliminiert. Die verbleibenden Uridin-bedürftigen Mutanten gehören gemäß ihrer Fähigkeit zur Transformation zu den zwei Komplementationsgruppen pyrA und pyrB, die jeweils von den A. niger Mutanten An8 und An10 repräsentiert werden. Sie werden in Form von Protoplasten hiervon unter einer transformierenden Bedingung mit dem pyrA enthaltenden Plasmid pCG59D7 (DSM 3968) behandelt. Nur die A. niger An8 (DSM 3917) Kolonien werden transformiert und enthalten das pyrA Gen, wie dies durch die Hybridisierbarkeit der verdauten DNA hiervon mit DNA von pUN121 gezeigt wird.

Verfahren zur Herstellung von Aspergillus Asparaginsäureproteinase

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase der Erfindung, vorzugsweise der bevorzugten Formen hiervon, das die Kultivierung eines Wirts, der mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert ist, unter Bedingungen umfaßt, die für die Expression des Aspergillus Asparaginsäureproteinasegens geeignet sind. Erforderlichenfalls wird das Polypetid auf herkömmliche Weise isoliert. In Abhängigkeit der Konstruktion des Expressionsvektors wird die Aspergillus Asparaginsäureproteinase entweder gebildet oder, falls eine Signalsequenz vorhanden ist, gebildet und aus dem Cytoplasma in das Medium oder andere Zellkompartimente sekretiert.
Ob ein ausgewählter Wirt zur Expression geeignet ist oder nicht hängt hauptsächlich von den Regulationssequenzen ab, die zur Konstruktion des Expressionsvektors ausgewählt wurden, insbesondere vom Promotor.
Falls beispielsweise ein Promotor, der von einem Gen von Aspergillus, vorzugsweise A. niger stammt, zur Expression eines erfindungsgemäßen Aspergillus Asparaginsäureproteinasegens verwendet wird, ist ein Aspergillus Stamm, vorzugsweise A. niger, ein geeigneter Wirt. Falls jedoch ein Promotor, der nicht von einem Aspergillus Gen stammt, zur Konstruktion eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors verwendet wird, sind andere Wirte zur Expression geeignet, beispielsweise Bakterien, wie E. coli oder Hefe, wie S. cerevisiae. Geeignete Wirte und Promotoren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß der Erfindung sind auch die, die zur Transformation geeignet sind, wie sie vorher angegeben wurden.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, worin ein transformierter Aspergillus Wirt das exogene Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen unter Bedingungen exprimiert, unter denen endogene Aspergillus Asparaginsäureproteinasegene aktiv sind und daher mehr als die natürliche Menge der Aspergillus Asparaginsäureproteinase aufgrund der erhöhten Gendosis exprimiert. Für diesen Zweck wird der Aspergillus Wirt, insbesondere A. niger, mit einem Expressionsvektor transformiert, der ein Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen unter der Kontrolle seiner homologen, das heißt natürlich gebundenen Expressionskontrollsequenzen umfaßt, insbesondere Promotor- und Signalsequenz.
Insbesondere betrifft die Erfindung auch ein Verfahren, worin ein transformierter Aspergillus Wirt das exogene Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen in einer größeren Menge oder unter unterschiedlichen Bedingungen exprimiert, als das endogene Gen, da es an einen unterschiedlichen Promotor fusioniert ist.
Die Bedingungen für die maximale Expression des exogenen Gens oder der exogenen Gene hängt vom ausgewählten Expressionssystem ab. Falls beispielsweise ein Promotor einer Pectinlyase (PL) oder eines Polygalacturonasegens (PG) von A. niger verwendet wird, ist die Expression des hiermit verbundenen Aspergillus Asparaginsäureproteinasegens in einer A. niger Zelle durch die Zugabe von Pectin oder Pectinabbauprodukten in das Kulturmedium induzierbar. In Gegenwart von ausreichend Glucose ist jedoch der Promotor nicht induzierbar, falls ein A. niger Stamm als Wirt verwendet wird, beispielsweise An8 (DSM 3917). Dies meint, daß ein Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen unter der Kontrolle eines A. niger PL oder PG Promotors in A. niger "katabolitreprimiert" ist. Falls jedoch ein anderer Aspergillus Stamm verwendet wird, vorzugsweise A. oryzae oder am bevorzugtesten A. nidulans wird ein Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen unter der Kontrolle eines A. niger PL oder PG Promotors konstitutiv exprimiert, das heißt auch in Abwesenheit von Pectin und/oder der Anwesenheit von Glucose. Es kann daher vorteilhaft sein, ein Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen unter der Kontrolle eines A. niger PL oder PG Promotors in einem anderen Aspergillus Wirt als A. niger zu exprimieren, vorzugsweise A. oryzae oder am bevorzugtesten A. nidulans, da beispielsweise Glucose anstelle von Pectin in das Nährmedium als Energie- und Kohlenstoffquelle während der Expression des Gens gegeben werden kann.
Falls ein Pyruvalkinasepromotor von Aspergillus, vorzugsweise A. niger zur Expression eines Aspergillus Asparaginsäureproteinasegens verwendet wird, wird das Gen exprimiert, falls ein Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoff und Energiequelle verwendet wird.
Es ist nun möglich, die Aspergillus Asparaginsäureproteinase überzuexprimieren, wobei verschiedene Verfahren angewendet werden können. Eine gereinigte einzelne Aspergillus Asparaginsäureproteinase kann durch ein Verfahren hergestellt werden, worin ein geeigneter Wirt, der nicht zur Expression einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase fähig ist oder der eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase in geringen Mengen exprimiert oder der keine Aspergillus Asparaginsäureproteinase unter den zur Expression des exogenen Aspergillus Asparaginsäureproteinasegens verwendeten Inkubationsbedingungen exprimiert, mit einem Hybridvektor transformiert wird, der ein Strukturgen umfaßt, das für eine Aspergillus Asparaginsäureproteinase, vorzugsweise von A. niger kodiert, am bevorzugtesten PEPE, die in SEQ ID Nr: 1 gezeigt ist oder ein Fragment einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase mit Asparaginsäureproteaseaktivität und das Strukturgen wird exprimiert. Falls ein Wirt verwendet wird, der zu keiner Expression einer anderen Asparaginsäureproteinase fähig ist, kann die jeweilige einzelne Aspergillus Asparaginsäureproteinase in reiner Form erhalten werden, das heißt ohne Kontamination durch eine andere Aspergillus Asparaginsäureproteinase.
Ein Wirt, der nicht zur Expression einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase fähig ist, ist entweder ein Mikroorganismus ohne einem entsprechenden Gen oder ein Aspergillus Stamm, dessen Expression der endogenen Aspergillus Asparaginsäureproteinasegene in einem geeignet konditionierten Wachstumsmedium supprimiert wurde, während der exogene Aspergillus Asparaginsäureproteinasepromotor, der operativ mit dem gewünschten Aspergillus Asparaginsäureproteinasestrukturgen verbunden ist, beispielsweise ein von A. niger stammender Promotor, unter diesen Bedingungen aktiv ist oder worin das Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen mit einem anderen Promotor fusioniert ist.
Andere Promotoren und Stämme, die zur Herstellung einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase fähig sind, sind die hierin vorher in der Beschreibung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren angegebenen.

Aspergillus Asparaginsäureproteinase und die Verwendung hiervon

Die Erfindung betrifft auch eine reine Aspergillus Asparaginsäureprotease an sich, die hierin "Aspergillus Asparaginsäureproteinase" genannt wird. Eine solche Protease wird so verstanden, daß sie (a) von Aspergillus spec stammt, (b) eine Proteaseaktivität aufgrund eines katalytischen Asparaginsäurerests im aktiven Zentrum zeigt und (c) eine ausreichende Aminosäuresequenzhomologie mit bekannten Asparaginsäureproteasen aufweist, um in die Familie der Asparaginsäureproteinase eingruppiert zu werden. Vom Ausdruck Aspergillus Asparaginsäureproteinase umfaßt werden auch Fragmente eines solchen Enzyms, die eine Asparaginsäureproteaseaktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft bevorzugt eine reine Aspergillus Asparaginsäureproteinase von Aspergillus niger, vorzugsweise die Asparaginsäureprotease PEPE mit der Aminosäuresequenz, die in der Sequenzliste unter SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist und Fragmente und Mutanten hiervon, die eine Asparaginsäureproteaseaktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft ferner enzymatische Zusammensetzungen, die eine oder mehrere Aspergillus Asparaginsäureproteinasen und/oder Derivate hiervon mit Asparaginsäureproteaseaktivität und/oder biologisch annehmbare Salze hiervon wahlweise in einer vorbestimmten Kombination mit einem oder mehreren geeigneten Enzymen mit einer anderen Aktivität als die Aspergillus Asparaginsäureproteinaseaktivität umfassen.

Aspergillus Stamm, der bezüglich einer Aspergillus Asparaginsäureproteinase defizient ist

Die Erfindung betrifft auch einen mutierten Aspergillus Stamm, vorzugsweise einen mutierten A. niger Stamm, der bezüglich eines endogenen Aspergillus Asparaginsäureproteinasegens defizient ist. Bevorzugt ist ein A. niger Stamm, der im pepE gen defizient ist, das in SEQ ID Nr: 1 gezeigt ist. Bevorzugt ist auch ein A. niger Stamm, der im pepE Gen defizient ist und bezüglich anderen Proteasegenen defizient ist, wie pepA, pepB, pepC oder pepD.
Ein mutierter Aspergillus Stamm der Erfindung mit einem defekten Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen kann in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung durch eine Genzerstörung hergestellt werden, das heißt eine DNA Sequenz, die dem endogenen Aspergillus Gen entspricht, das zerstört werden soll, wird in vitro zu einem defekten Gen mutiert und in die Aspergillus Wirtszelle transformiert. Aufgrund eines homologen Rekombinationsereignisses in der Zelle wird das intakte endogene Gen durch das defekte exogene ersetzt. Gewöhnlich wird das exogene Gen durch die Insertion eines Markergens in die kodierende Region zerstört. Dies führt zu einem defekten Gen, das leicht verfolgt werden und zur Selektion von Transformanden verwendet werden kann, bei denen das entsprechende endogene Gen zerstört wurde. Jedoch können auch andere Verfahren zur Mutagenese zur Herstellung eines mutierten Aspergillus Stamms verwendet werden, vorzugsweise eines mutierten A. niger Stamms, worin ein endogenes Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen so mutiert ist, daß keine funktionelle Aspergillus Asparaginsäureproteinase exprimiert werden kann.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein A. niger Stamm mit einem Hybridvektor transformiert, der eine Defektmutante des pepE Gens aufweist, das in SEQ ID Nr: 1 gezeigt ist, beispielsweise ein zerstörtes pepE Gen mit einem inserierten Selektionsmarkergen, wie dies beispielsweise im Plasmid pPEPEPYRA enthalten ist, das in den Beispielen beschrieben ist, und es werden Transformanden selektiert.
Ein mutierter Aspergillus Stamm der Erfindung mit einem defekten Aspergillus Asparaginsäureproteinasegen ist zur Expression einer verbesserten Bildung von heterologen oder homologen Proteinen entweder intra- oder extrazellulär brauchbar.
Die Expression von heterologen oder homologen Proteinen in Aspergillus spec. kann gemäß herkömmlicher Verfahren erreicht werden. Gewöhnlich wird ein Expressionsvektor konstruiert, der ein homologes oder heterologes Gen umfaßt, das operativ mit einem homologen oder heterologen Promotor verbunden ist, der in Aspergillus funktionsfähig ist und wahlweise mit anderen Expressionskontrollsequenzen, die in Aspergillus funktionsfähig sind, beispielsweise den vorher definierten. Erforderlichenfalls wird das Polypeptid auf herkömmliche Weise isoliert. In Abhängigkeit der Konstruktion des Expressionsvektors werden die Produkte entweder in der Wirtszelle oder, falls eine Signalsequenz vorhanden ist, in der Zelle produziert und sekretiert.
Strukturgene sind in diesem Zusammenhang beispielsweise Strukturgene, die von Viren, prokaryontischen Zellen oder eukaryontischen Zellen stammen und die aus einer genomischen DNA oder aus einer cDNA stammen, die über die mRNA Route hergestellt wurde oder chemisch synthetisiert wurden, die für eine große Vielzahl an brauchbaren Polypeptiden kodieren, einschließlich glycosylierter Polypeptide, insbesondere höheren eukaryontischen Ursprungs, speziell Säugerursprungs, wie tierischen oder speziell menschlichen Ursprungs, wie Enzyme, die beispielsweise zur Herstellung von Nahrungsmitteln verwendet werden können und zur Durchführung von enzymatischen Reaktionen in der Chemie, oder Polypeptide, die brauchbar und wertvoll zur Behandlung von Erkrankungen beim Menschen oder Tier oder zur Prävention hiervon sind, beispielsweise Hormone, Polypeptide mit immunmodulatorischen, Antivirus- und Antitumoreigenschaften, Antikörper, virale Antigene, Impfstoffe, Gerinnungsfaktoren, Nahrungsmittel und dergleichen.
Beispiele für solche Strukturgene sind beispielsweise die, die kodieren für Aspergillus Polygalacturonase, beispielsweise PGI oder PGII, oder Aspergillus Pectinlyase, beispielsweise PLI, PLA, PLB, PLC, PLE und PLF oder Hormone, wie Sekretin, Thymosin, Relaxin, Calcitonin, luteinisierendes Hormon, Parathyroidhormon, Adrenocorticotropin, Melanozyten-stimulierendes Hormon, β-Lipotropin, Urogastron oder Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermaler Wachstumsfaktor, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF), beispielsweise IGF-I und IGF-II, Mastzellwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, von Gliazellen stammender Nervenzellwachstumsfaktor oder transformierender Wachstumsfaktor (TGF), wie TGFβ, Wachstumshormone, wie humane oder Rinderwachstumshormone, Interleukin, wie Interleukin-1 oder 2, humaner Makrophagenmigrationshemmfaktor (MIF), Interferone, wie humanes α-Interferon, beispielsweise Interferon-αA, αB, αD oder αF, β-Interferon, λ-Interferon oder ein Hybridinterferon, beispielsweise ein αA-αD- oder ein αB-αD-Hybridinterferon, speziell das Hybridinterferon BDBB, Proteinaseinhibitoren, wie α&sub1;-Antitrypsin, SLPI und dergleichen, Hepatitisvirusantigene, wie Hepatitis B Virusoberflächen- oder -kernantigen oder Hepatitis A Virusantigen, oder Hepatitis nonA-nonB Antigen, Plasminogenaktivatoren, wie Gewebsplasminogenaktivator oder Urokinase, Tumornekrosefaktor, Somatostadn, Renin, β-Endorphin, Immunglobuline, wie die leichten und/oder schweren Ketten von Immunglobulin D, E oder G oder Mensch-Maus Hybridimmunglobuline, Immunglobulinbindungsfaktoren, wie Immunglobulin E Bindungsfaktor, Calcitonin, Humancalcitonin-verwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX oder VIIIc, Erythropoetin, Eglin, wie Eglin C, Hirudin, Desulfatohirudin, wie Desulfatohirudinvariante HV1, HV2 oder PA, humane Superoxiddismutase, virale Thymidinkinase, β-Lactamase und Glucoseisomerase. Bevorzugte Gene sind die, die für ein humanes α- Interferon oder Hybridinterferon kodieren, insbesondere Hybridinterferon BDBB, humanen Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), Hepatitis B Virusoberflächenantigen (HBVsAg), Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I und II, Eglin C und Desulfatohirudin, beispielsweise die Variante HVI.
Die am meisten bevorzugten Ausführungsformen sind die, die in den begleitenden Beispielen beschrieben sind.

Beispiele

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, sollen sie jedoch nicht beschränken.
Die Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
BSA Rinderserumalbumin
DTT 1,4-Dithiothreit
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
kb Kilobasenpaare
PEG Polyethylenglycol
SDS Natriumdodecylsulfat
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactosid

Puffer, Medien und Reagenzien

SM 100 mM NaCl, 8,1 mM MgSO&sub4;, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,01% Gelatine
LB 1% Trypticasepepton (BBL), 0,5% Hefeextrakt (BBL), 1% NaCl und 0,5 mM Tris-HCl pH 7,5
LM 1% Trypticasepepton (BBL), 0,5% Hefeextrakt (BBL), 10 mM NaCl und 10 mM MgCl&sub2;
SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M Trinatriumcitrat
PSB 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;
TE 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA pH 8,0
Minimalmedium 1 Liter enthält 1,5 g K&sub2;PO&sub4;, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 0,9 mg ZnSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 0,2 mg MnCl&sub2; · 4 H&sub2;O, 0,06 mg CoCl&sub2; · 6 H&sub2;O, 0,06 mg CuSO&sub4; · 5 H&sub2;O, 0,29 mg CaCl&sub2; · 62 H&sub2;O, 0,2 mg FeSO&sub4; · 7 H&sub2;O, Stickstoff und Kohlenstoffquellen werden im Text angegeben oder die Quellen sind 6 g NaNO&sub3; und 10 g Glucose pro Liter, falls diese Quellen nicht explizit erwähnt werden, eingestellt auf pH 6,0 mit NaOH
Vollmedium Minimalmedium mit 6 g NaNO&sub3; und 10 g Glucose pro Liter plus 2 g Trypticasepepton (BBL), 1 g Casaminosäuren (Difco), 1 g Hefeextrakt (BBL), 0,5 g Ribonukleinsäure-Natriumsalz aus Hefe (ICN, Cleveland, USA), 2 ml Vitaminlösung pro Liter, eingestellt mit NaOH auf pH 6,0
Vitaminlösung pro 100 ml 10 mg Thiamin, 100 mg Riboflavin, 10 mg Panthothensäure, 2 mg Biotin, 10 mg p- Aminobenzoesäure, 100 mg Nicotinamid, 50 mg Pyridoxin-HCl
TBE 1 Liter enthält 4 ml einer 0,5 M EDTA pH 8,0 Lösung, 10,8 g Tris und 5,5 g H&sub3;BO&sub3;
Phenol Phenol, das wie von Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982 (Seite 438) beschrieben behandelt wurde
Probenpuffer 10% (V/ V) Glycerin, 100 mM EDTA pH 8,0 und 0,01% Bromphenolblau
RNase A RNase A, die wie von Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 (Seite 451) beschrieben behandelt wurde
Die folgenden Stämme und Vektoren werden verwendet:
A. niger N400. Wildtyp
A. niger An8 Uridin-auxotrophe Mutante des den Pectinasekomplex stark produzierenden Stamms A. niger N756, die in EP 0 278 355 A beschrieben ist und als DSM 3917 hinterlegt ist.
E. coli LE392 F&supmin;, hsdR514 (rk&supmin;, mk&spplus;), supE44, supF58, lacY1 oder (lac1ZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55, λ&supmin;
E. coli DH5αF' F' endA1, hsdR17 (rK&supmin;, mK&spplus;), supE44, thi-1, recA1, gyrA, relA1) 80 lac Z M15, Δ(lacZYA- argF)U169, λ&supmin;.
EMBL4 EMBL4 ist ein Lambdaaustauschvehtor mit einer Klonierungskapazität von 9-23 kb (Frischauf et al., J. Mol. Biol. 170: 827-842, 1983). Es enthält einen Polylinker zwischen den Lambdaarmen und der nichtessentiellen Pufferregion. Dies erlaubt einen mehrfachen Verdau mit Restriktionsenzymen, der so ausgeführt wird, daß die Religation des Puffers an die Vektorarme reduziert wird, wenn die Fremd DNA von Interesse eingebaut wird. Der Vektor verwendet auch den Spi Phänotyp, um eine direkte Selektion auf Rekombinante zu ermöglichen (Zissler et al. in: A. D. Hershey (Herausgeber), The Bacteriophage lambda, Cold Spring Harbor Laboratory, 1971).
In den Beispielen wird eine Reihe an Oligonukleotiden in der PCR Technologie eingesetzt. Es folgt eine kurze Charakterisierung der Oligos. Die Sequenzen sind in der Sequenzliste gezeigt.
Oligonukleotid 1: Entworfen, um direkt vor der BamHI Schnittstelle im pki Promotor zu binden.
Oligonuldeotid 2: Entworfen, um eine PstI Schnittstelle direkt vor dem ATG der Pyruvalkinase einzubauen.
Oligonukleotid 3: Entworfen, um eine PstI Schnittstelle direkt vor dem ATG von pepE einzubauen.
Oligonuldeotid 4: Entworfen, um eine XhoI Schnittstelle direkt nach dem Stopcodon von pepE einzubauen.
Oligonuldeotid 5: Entworfen, um eine SaII Schnittstelle direkt nach dem Stopcodon der Pyruvatkinase einzubauen.
Oligonukleotid 6: Entworfen, um eine BamHI Schnittstelle an das Ende des Pyruvatkinaseterminators zu legen.
Oligonuldeotid 7: Entworfen, um das erste Intron in pepE herausfallen zu lassen.
Oligonukleotid 8: Entworfen, um das zweite Intron in pepE herausfallen zu lassen.
Oligonukleotid 9: Entworfen, um das dritte Intron in pepE herausfallen zu lassen.
Oligonukleotid A: Entworfen, um das Runoff-Transkript der pepE RNA zu primen.
Oligonukleotid B: Entworfen als PCR Primer, um Teile des ersten und dritten und das gesamte zweite Exon von pepE zu amplifizieren.
Oligonuldeotid C: Entworfen, um die cDNA Synthese von pepE RNA zu primen und Teile des ersten und drillen und des gesamten zweiten Exons von pepE zu amplifizieren.
Oligonukleotid D: Entworfen als PCR Primer, um Teile des dritten und vierten Exons von pepE zu amplifizieren.
Oligonukleotid E: Entworfen, um die cDNA Synthese von pepE RNA zu primen und Teile des dritten und vierten Exons von pepE zu amplifizieren.

Beispiel 1: Konstruktion einer Genbank von Aspergillus niger

Beispiel 1.1: Isolierung von hochmolekularer DNA von A. niger N400

Konidiosporen von Aspergillus niger Stamm N400 werden in 200 ml Minimalmedium auf eine schließliche Sporendichte von 10&sup6; Sporen/ml angeimpft und in einen 11 fassenden Erlenmeyerkolben für 24 h bei 28ºC bei 300 Upm geschüttelt. Das Myzel wird durch Filtration durch Myracloth auf einer Buchner Nutsche geerntet, mit kalter Kochsalzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und entweder bei -60ºC gelagert oder direkt verwendet. Das zur Isolierung der DNA zur Herstellung einer Genbank verwendete Verfahren basiert auf dem von Yelton et al., beschriebenen Verfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 (1984)].
Zur Genbankkonstruktion werden 10 g Myzel in flüssigem Stickstoff in 1 g Portionen in einem Braun Mikrodismembrator gemahlen. Das gemahlene Myzel wird in einen sterilen 1 l Erlenmeyerkolben überführt, der 200 ml Extraktionspuffer (50 mM EDTA pH 8,5, 0,2% SDS) und 200 ul Diethylpyrocarbonat enthält. Das Gemisch wird langsam auf Raumtemperatur erwärmt und dann für 20 Minuten auf 68ºC mit zeitweisem Schütteln erhitzt. Die Suspension wird auf Raumtemperatur abgekühlt und für 15 Minuten bei 12 000 · g zentrifugiert. 1/16 Volumen einer 8 M Kaliumacetatlösung mit pH 4,2 wird zum Überstand gegeben und das Gemisch wird für 1 h auf Eis gehalten. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation entfernt (20 min. 16 000 · g, 4ºC). Die Nukleinsäuren werden aus dem Überstand durch die Inkubation mit 0,6 Volumen Isopropanol auf Eis für 15 Minuten gefällt. Die gefällte Nukleinsäure wird durch Zentrifugation (10 Minuten, 6 000 · g, 4ºC) gewonnen, mit 70% Ethanol gewaschen und kurz getrocknet. Das Pellet wird in 10 ml TE suspendiert, worin 20 ug/ml RNase A (Boehringer Mannheim) enthalten sind und für 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die DNA wird mit Nuklease-freier Pronase (1 mg/ml Endkonzentration) (Kochlight, Coinbrook) für 1 h bei 37ºC inkubiert.
8,5 g CsCl wird in 9 ml erhaltener DNA Lösung gelöst, 0,2 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid werden zugegeben und die Lösung wird entweder in einem Beckman SW41 Rotor für 60 h bei 33 000 Upm oder in einem Beckman 50 Ti Rotor für 40 h bei 45 000 Upm zentrifugiert. Die DNA Bande wird gewonnen und das Ethidiumbromid wird durch mehrfache Extraktionen mit Isopropanol entfernt, das mit einer gesättigten NaCl Lösung in Wasser äquilibriert ist. Es werden 5 Volumina TE zugegeben und die DNA Lösung wird nacheinander behandelt mit TE gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25/24/1 und Chloroform/Isomylalkohol 24/1. Die DNA wird durch die Zugabe von 0,1 Volumina an 3 M Natriumacetat mit pH 5,2, 2,5 Volumina Ethanol und einer Inkubation über Nacht bei -20ºC gefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen (1 h, 30 000 · g, 4ºC), mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 400 ul TE gelöst.

Beispiel 1.2: Partialverdau der A. niger N400 DNA mit MboI und Isolierung der Fragmente

Um die MboI Konzentration auszutesten, die die größte Menge an DNA Fragmenten zwischen 13,6 und 23 kb ergibt, werden 1 ug Mengen der A. niger N400 DNA mit dem geeigneten Puffer, der vom Hersteller empfohlen wird, mit abnehmenden Mengen an MboI (0,5-0,001 E) für 1 h bei 37ºC in einem Volumen von 10 ul verdaut. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 1 ul 0,25 M EDTA gestoppt und die Proben werden auf ein 0,6% Agarosegel in TBE Puffer aufgetragen, das 1 ug/ml Ethidiumbromid enthält. Die für eine hohe Ausbeute der gewünschten 13,6- 23 kb Fragmente erforderliche MboI Konzentration beträgt etwa 0,02 E/ug DNA. Demnach werden 200 ug DNA in einem Gesamtvolumen von 2 ml verdaut. Nach 1 Stunde bei 37ºC wird EDTA in einer Endkonzentration von 25 mM zugegeben, das Enzym wird bei 65ºC für 10 Minuten hitzeinaktiviert und die DNA wird gefällt, gewaschen, getrocknet und in 400 ul TE gelöst. Die fragmentierte DNA wird auf einem präparativen 0,4% Agarosegel bei 4ºC und 40 V (3 V/cm) aufgetrennt. Fragmente der korrekten Größe werden aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA wird aus dem Gel in ein steriles Dialyseröhrchen in 2 ml TBE für 2-3 Stunden bei 100 V elektroeluiert. Die Spannung wird für 30 Sekunden umgekehrt und der die DNA enthaltende Puffer wird gewonnen. Die Fragmente werden dann durch Ethanolfällung konzentriert und in 100 ul TE gelöst.

Beispiel 1.3: Herstellung der Vektor DNA

Die Genbank des A. niger Stamms N400 wird im Lambdavektor EMBL4 konstruiert. Der Vektor, der eine Klonierungskapazität von 9-23 kb aufweist, wird von Frischauf et al. [J. Mol. Biol. 170: 827-842 (1983)] und Kam et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5172-5176 (1980)] beschrieben und kann von Promega Biotechnology Inc. bezogen werden. Um zu vermeiden, daß zwei Inserts, die von unterschiedlichen Teilen des Genoms stammen, in einen Phagen kloniert werden können, wird eine minimale Fragmentlänge von 13,6 kb zur Klonierung verwendet.
10 ug Lambda EMBL4 DNA wird vollständig mit 50 Einheiten BamHI im vom Hersteller empfohlenen Puffer in einem Volumen von 100 ul für 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Das Enzym wird für 10 Minuten bei 65ºC inaktiviert. Die NaCl Konzentration wird auf 150 mM erhöht und 50 Einheiten SalI werden zugegeben und die Inkubation bei 37ºC wird für weitere 2 Stunden fortgesetzt. Nach der Zugabe von EDTA bis 25 mM wird das Enzym durch Erhitzen für 10 Minuten auf 65ºC inaktiviert. Die Lösung wird mit gleichen Volumina Phenol (TE gesättigt), Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25 : 24 : 1 und Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Um die kleinen BamHI/SalI Polylinkerfragmente zu eliminieren, wird die DNA mit 0,6 Volumina Isopropanol nach der Zugabe von 0,1 Volumina an 3 M Natriumacetat pH 5,2 gefällt. Nach 15 Minuten auf Eis und einer Zentrifugation für 15 Minuten bei 12 000 · g bei 4ºC wird der Niederschlag gründlich mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 40 ul TE gelöst.

Beispiel 1.4: Ligation und in vitro Verpackung von genomischen A. niger N400 DNA Fragmenten

Es ist wesentlich, daß die cos-Stellen des gemäß Beispiel 2.3 hergestellten Vektors vor der Ligationsreaktion anneliert werden. Der Vektor wird in 100 mM Tris-HCl pH 7,5 und 10 mM MgCl&sub2; für 10 Minuten auf 65ºC erhitzt und dann für 1 Stunde bei 42ºC aneliert. Aus Testligationen ergibt ein Verhältnis von Vektor zu Fragmenten von etwa 1 : 1 (bezogen auf das Gewicht) die meisten Rekombinationen. Die Ligation findet in 50 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP mittels 9,5 ug Vektor und 10 ug DNA Fragmenten in einem Gesamtvolumen von 100 ul statt. Es wird DNA Ligase (BRL) in einer Konzentration von 0,5 E/ug DNA zugegeben und das Ligationsgemisch wird über Nacht bei 14ºC inkubiert. Um die Ligation zu testen, wird eine Probe der ligierten DNA auf einem Agarosegel aufgetrennt. Als Kontrolle werden 0,5 ug des Vektors ohne Zugabe von Fragmenten in einem Volumen von 5 ul ligiert.
Das Ligationsgemisch wird durch Ethanolfällung konzentriert und in 20 ul TE vor der in vitro Verpackung gelöst. Die in vitro Verpackung wird mit Promega Packagene Extrakten gemäß der Anleitung des Herstellers mittels 10 ul Portionen zur Verpackung von 1 ug DNA ausgeführt. 1 ug des hochmolekularen Lambda Kontrollphagen cI857 Sam7, der mit den Extrakten mitgeliefert wird, wird getrennt als Kontrolle verpackt. Nach dem Verpacken werden 500 ul Phagenlösungspuffer (PSB) und 5 ul Chloroform zugegeben. Die rekombinanten Phagenstammlösungen können bei 4ºC gelagert werden.

Beispiel 1.5: Titration und Amplifizierung der A. niger Stamm N400 Genbank

Zellen von E. coli NM539 werden in LB Medium, das 0,2% Maltose, 10 mM MgSO&sub4; und 1 mM CaCl&sub2; enthält, bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 1,0 angezogen. 0,2 ml Aliquots dieser Kultur werden zu 0,1 ml einer geeigneten Phagenverdünnung in PSB gegeben. Nach der Adsorption der Phagen für 20 Minuten bei 37ºC werden 3 ml an 0,6% LB Überschichtungsagar bei 45ºC zugegeben, das Gemisch wird auf LB Platten plattiert und diese werden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Anzahl an Plaques-bildenden Einheiten (PFU) pro ml Phagensuspension beträgt 12 · 10&sup5; und 4,2 · 10&sup5; PFU/ml für die zwei Phagenstammlösungen, die in Beispiel 1,4 hergestellt wurden. Nach dem Abzug des Hintergrunds, der aus den Kontrolligationen ohne Fragmente berechnet wird (jeweils 17% und 40%) beträgt die absolute Anzahl an Rekombinanten 6 · 10&sup5;. Die in den Rekombinanten enthaltene DNA ist zu mehr als 200 Genomen von Aspergillus niger äquivalent.
Um die Genbank zu amplifizieren, werden 80 ul beider Phagenstammlösungen zur Infektion von E. coli NM539 Zellen verwendet, die in LB Überschichtungsagar auf LB Platten plattiert und dann über Nacht bei 37ºC inkubiert werden. Die Phagen werden aus der Agarose durch sanftes Schütteln der Platten mit 5 ml PSB pro Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur eluiert. Der PSB wird gewonnen, zentrifugiert (10 Minuten bei 6000 · g), um Bakterien zu entfernen und es wird Chloroform zugegeben (0,5% Endkonzentration). Beide Phagenstammlösungen, die etwa im gleichen Ausmaß amplifiziert wurden, werden dann gemischt (40 ul Stammlösung), titriert (8 · 10&sup9; PFU/ml) und bei 4ºC gelagert.

Beispiel 2: Herstellung einer N. crassa pep4 Sonde

Beispiel 2.1: Herstellung der N. crassa Sonde

Das Plasmid pNCPEP4 enthält ein 3,8 kb Fragment der N. crassa DNA, das das N. crassa pep4 Gen kodiert. Ein Teil der kodierenden Region kann bequem mit SalI herausgeschnitten werden. Das Plasmid pNCPEP4 wird daher mit SalI verdaut und die Fragmente werden auf einem 1,2% Agarosegel getrennt. Das 0,6 kb Fragment wird ausgeschnitten und die DNA wird elektroeluiert. 100 ng dieses Fragments werden mit ³²P-dATP als markierendes Nukleotid nick-translatiert und unmittelbar entweder für Southern- oder Plaquesondierungen verwendet.

Beispiel 2.2: Southern Blots von A. niger DNA

2 ug Aliquots der wie oben präparierten A. niger DNA werden entweder mit BamHI oder HindIII verdaut und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt. Nach der Photographie des mit Ethidiumbromid gefärbten Gels wird die DNA durch Kapillarblot auf Nitrocellulosefilter überführt [E. M. Southern, J. Mol. Biol. 98: 503-517 (1975)] und mit der markierten Hefe PRB Sonde hybridisiert, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Getrennte Nitrocellulosestreifen, die beide Verdaus enthalten, werden einer Vielzahl an Waschschritten unterzogen, um die Bedingungen zu bestimmen, die das stärkste Signal-zu-Rausch Verhältnis ergeben. Es wurde festgestellt, daß ein Waschschritt in 2 · SSC für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei Waschschritten für 30 Minuten bei 56ºC in 2 · SSC die besten Ergebnisse ergibt.

Beispiel 3: Screening der A niger N400 Genbank mit der N.crassa pep4 Sonde

Ein Teil der oben beschriebenen Genbank des Aspergillus niger Stamms N400 (Beispiel 1) wird in SM verdünnt und 0,1 ml Portionen, die jeweils etwa 2000 PFU enthalten, werden plattiert. Die Wirtszellen werden durch die Beimpfung von 50 ml LB Medium, das mit 0,2% Maltose supplementiert ist, mit 0,5 ml einer Übernachtkultur von E. coli NM539 in LB Medium, einem Schütteln für 4 h bei 250 Upm bei 37ºC, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml an 1 M MgSO&sub4; und 0,5 ml CaCl&sub2; hergestellt. 0,2 ml Aliquots dieser Zellen werden jeweils mit einer 0,1 ml Portion der Phagensuspension gemischt und bei Raumtemperatur für eine halbe Stunde inkubiert. Dann werden 3 ml an 0,7% Agarose in LM Medium bei 47ºC zugegeben, kurz gemischt und sofort auf LM Agarplatten plattiert. Die Platten werden über Nacht bei 37ºC inkubiert und für 2 Stunden bei 4ºC gekühlt.
Aus jeder Platte werden zwei Abdrücke gemäß dem Benton und Davis Plaquehybridisierungsverfahren hergestellt [W. D. Benton und R. W. Davis, Science 196: 180-182 (1977)]. Das erste Filter (Schleicher und Schuell BA85) wird für 1 Minute auf die Platte gelegt, der zweite Abdruck für 2 Minuten und die Position der Abdrücke wird mittels chinesischer Tusche markiert. Nach der Entfernung der Filter werden sie in eine Schale, die 100 ml einer Denaturierungslösung (1 M NaCl, 0,5 M NaOH) enthält für 0,5 Minuten gegeben und dann für 1 Minute in 100 ml Neutralisierungslösung (0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl). Die Filter werden dann in eine Schale überführt, die 3 · SSC enthält und sanft mit einer Handschuh bestückten Hand abgerieben, um den Bakteriendebris zu entfernen und dann mit 3 · SSC gewaschen. Die Filter werden geblottet, für 10 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet und auf Whatman 3 mm Papier in einem Ofen bei 80ºC für 2 Stunden gebacken.
Die gebackenen Filter werden in 3 · SSC befeuchtet, in dieser Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur gewaschen und dann in eine Schale überführt, die 250 ml vorgewärmtes (56ºC) Prähybridisierungsgemisch enthält (6 · SSC, 10 · Denhardts (0,2% BSA, Boehringer Fraktion V, 0,2% Ficoll 400, Pharmacia, 0,2% Polyvinylpyrrolidon-10, Sigma) 0,1% SDS und 0,1 mg/ml durch Scherkräfte zerkleinerte und frisch denaturierte Heringssperma DNA). Nach 1 Stunde Prähybridisierung bei 56ºC in einem Schüttelwasserbad werden die Filter für 1,5 Stunden in 250 ml vorgewärmtem (56ºC) Hybridisierungsgemisch gewaschen, das dasselbe ist, wie das Prähybridisierungsgemisch, außer daß ihm die Heringssperma DNA fehlt. Dann werden die Filter in eine Schale überführt, die 150 ml vorgewärmtes (56ºC) Hybridisierungsgemisch enthält, zu der die vorher markierte Sonde frisch zugegeben wurde.
Nach der Hybridisierung für 14 Stunden bei 65ºC werden die Filter einmal in 250 ml, gefolgt von einem Waschschritt bei Raumtemperatur und dann bei 56ºC in 250 ml 2 · SSC jeweils für 30 Minuten gewaschen. Die Filter werden getrocknet und gegenüber einem Kodak XARS Film für 1 bis 3 Tage bei -70ºC mittels eines Verstärkerschirms exponiert.
Auf diese Weise erhält man 3 positive Signale aus den 3 gescreenten Platten. Die positiven Plaques werden mit einer sterilen Pasteurpipette ausgestanzt, indem man die Platten sorgfältig mittels der Tuschemarkierungen auf dem Autoradiogramm positioniert. Die Agarstücke, die die positiven Plaques enthalten, werden in 1 ml SM gegeben und 2,5 ul Chlorofom werden zugegeben. Die Phagen können für 1 Stunde bei Raumtemperatur aus dem Agar diffundieren, wobei zeitweise gemischt wird und sie werden dann über Nacht bei 4ºC inkubiert. Der Agar und der Zelldebris werden durch Zentrifugation für 5 Minuten entfernt, 2,5 ul Chloroform werden zugegeben und die Phagenstanunlösungen werden bei 4ºC gelagert.
Die positiven Klone werden λ1, λ2 und λ4 genannt. Da Phagen mit einer hohen Dichte plattiert werden, werden die positiven Plaques dreimal durch Plattieren bei niedriger Dichte und der Wiederholung des kompletten Verfahrens der Replikaplattierung, Hybridisierung und Picken der positiven Plaques gereinigt.

Beispiel 4: Charakterisierung der Lambda Klone

Beispiel 4.1: Isolierung der Lambda DNA

Um DNA aus den rekombinanten Klonen zu isolieren, werden die Phagen zuerst amplifiziert. Zu diesem Zweck werden E. coli LE392 Wirtszellen bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 1,0 in LB Medium angezogen, das mit 10 mM MgSO&sub4; und 0,2% Maltose supplementiert ist. Dann werden 50 ul der Stammlösungen der gereinigten Phagen getrennt plattiert, wie dies oben beschrieben ist. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC werden die Phagen aus den nicht-konfluenten Platten durch Verteilen von 5 ml SM über die Platten und einer Inkubation für 2 Stunde unter sanftem Schütteln eluiert. Die eluierten Phagen werden geerntet und es werden 0,1 ml Chloroform zugegeben. Das Gemisch wird kurz geschüttelt und der Zelldebris wird durch Zentrifugation entfernt. Die Überstände werden gewonnen, Chloroform wird mit 0,3% zugegeben und das entstandene Plattenlysat wird bei 4ºC gelagert.
Um fast vollständig konfluente Platten als Ausgangsmaterial zur Isolierung der Phagen DNA zu erhalten, werden 10 ml Portionen der Plattenlysate mit E. coli LE392 Wirtszellen plattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC wird die Agaroseüberschichtung von drei fast konfluenten Platten abgeschabt. Diese Lagen werden vereinigt, 20 ml SM und 0,4 ml Chloroform werden zugegeben und das entstehende Gemisch wird bei 37ºC für 30 Minuten geschüttelt. Der Zelldebris und die Agarose werden durch Zentrifugation entfernt, der Überstand wird gewonnen und das Volumen wird mit SM auf 18 ml eingestellt. Ein gleiches Volumen an 2 M NaCl, 20% PEG 6000 (BDH, Poole, GB) in SM wird zugegeben und die Lösungen werden gemischt und auf Eis gestellt. Nach 75 Minuten werden die Phagen durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 1200 · g bei 4ºC pelletiert. Der Überstand wird dekantiert und die verbleibende Flüssigkeit wird mit einem Kleenextuch entfernt. Das Pellet wird in 3 ml SM resuspendiert und anschließend mit 3 ml Chloroform extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit RNase A (67 ug/ml) und DNaseI (33 ug/ml) für 20 Minuten bei 37ºC behandelt. Dann wird dieses Gemisch durch die Zugabe von 2 ml Phenol, einem Vortexen, einer Zugabe von 1 ml Chloroform, einem erneuten Vortexen und einer Trennung der zwei Phasen durch Zentrifugation extrahiert. Die wäßrige Phase wird weitere zweimal jeweils mit 3 ml Phenol/Chloroform (1 : 1) und 3 ml Chloroform extrahiert. Dann wird die DNA aus der wäßrigen Phase durch die sequentielle Zugabe von 0,3 ml an 3 M Natriumacetatpuffer (pH 5,2) und 6 ml Ethanol gefällt. Das Gemisch wird bei 4ºC für 16 Stunden stehengelassen und dann wird die DNA durch Zentrifugation gewonnen (10 Minuten, 12 000 · g, 4ºC). Das Pellet wird in 0,4 ml TE Puffer gelöst, RNase A wird bis 200 ug/ml zugegeben und es wird bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert. Die DNA wird durch die Zugabe von 38 ul an 3 M Natriumacetatpuffer (pH 5,2) und 0,8 ml Ethanol bei 4ºC für 1 Stunde gefällt. Die DNA wird durch Zentrifugation gewonnen und anschließend in 100 ul TE gelöst.

Beispiel 4.2: Restriktionsanalyse der A. niger N400 pepE Klone

Es wird durch Restriktionsanalyse gezeigt, daß alle drei Phagen Insertionen enthalten, die aus derselben Region des A. niger Genoms stammen und es wird eine partielle Restriktionskarte von λ1 erstellt.
2 ug der Phagen DNA werden mit 20 Einheiten BamHI in einem Volumen von 20 ul für 1 Stunde bei 37ºC im Puffer verdaut, der vom Hersteller (BRL) empfohlen wird, und dann für 10 Minuten auf 65ºC erhitzt. Die Proben werden auf einem 0,7% Agarosegel aufgetrennt und photographiert. Die DNA wird auf eine Nitrocellulosemembran überführt und mit der markierten N. crassa pep4 Sonde hybridisiert. Aus diesen Verdauansätzen wird klar, daß alle drei Phagen identisch sind und daß ein 5,8 kb Fragment das einzige Fragment ist, das an die pep4 Sonde hybridisiert und somit das meiste wenn nicht das gesamte entsprechende Gen von A. niger enthält. Einer von den drei identischen Phagen wird als λ1 bezeichnet und für weitere Experimente ausgewählt.

Beispiel 5: Klonierung von PEPE in ein Plasmid und dessen Sequenzierung und Charakterisierung

Beispiel 5.1: Konstruktion von pPEPE

λ1 DNA wird mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut, wie dies im wesentlichen oben beschrieben ist. Nach einer Extraktion mit Chlorofom wird die DNA gefällt, durch Zentrifugation pelletiert, in Probenpuffer gelöst und einer Elektrophorese auf einem 0,6% Agarosegel in 1 · TBE Puffer unterzogen. Ein Gelstück, das das 5,8 kb BamHI Fragment enthält, wird gewonnen und die DNA wird elektroeluiert. Diese wird dann mit 100 ul Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 40 ul TE Puffer rückgelöst. Die DNA Konzentration wird durch Agarosegelelektrophorese, gefolgt von einer Visualisierung der Bande unter UV Licht abgeschätzt.
Der pTZ18R Vektor wird durch einen BamHI Verdau unter den vom Hersteller (BRL) empfohlenen Bedingungen präpariert. Die DNA wird mit Phenol, Phenol/Chloroform (1 : 1) und Chloroform extrahiert und die DNA wird mit Ethanol gefällt.
100 ng jedes der obigen Fragmente werden in einem Reaktionsvolumen von 25 ul zusammen ligiert, das den von BRL empfohlenen Puffer plus ATP (1mM) und 1,5 E T4 DNA Ligase (BRL) enthält. Das Reaktionsgemisch wird für 16 Stunden bei 16ºC inkubiert und dann zur Transformation von E. coli DH5αF' Zellen verwendet. Die Zellen werden auf LB Agarplatten plattiert, die 25 ug/ml Ampicillin, 0,005% X-Gal und 0,05 mM IPTG enthalten und über Nacht bei 37ºC inkubiert.
Mehrere einzelne weiße Kolonien werden zur Herstellung von Übernachtkulturen in LB Medium verwendet, das mit 0,1% Glucose und 25 mg/ml Ampicillin supplementiert ist. Diese Kulturen werden zur Isolierung des Plasmids mittels Minipräparationsverfahren von Holmes und Quigley verwendet [D. S. Holmes und M. Quigley, Anal. Biochem. 114: 193 (1981)]. Die Plasmide werden mit mehreren Restriktionsenzymen gemäß den Empfehlungen des Herstellers (BRL) und in Gegenwart an RNase A (0,5 mg/ml) verdaut und die Produkte werden auf einem Agarosegel analysiert. Plasmide, die zu BamHI Fragmenten der erwarteten Größe führen, werden selektiert und die E. coli Zellen, die sie enthalten, werden in Glycerin bei -20ºC gehalten. Dieses Plasmid wird pPEPE genannt (hinterlegt bei der DSM).

Beispiel 5.2: Nukleotidsequenz von pepE

Der pepE Subklon, ein 5,8 kb BamHI Fragment im pTZ18R Vektor wird partiell durch das Didesoxykettenabbruchverfahren [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-6467 (1977)] mittels synthetischer Oligonukeotidprimer und Sequenase (United States Biochemical Corp.) sequenziert.
Die vollständige Nukleotidsequenz ist in der Sequenzliste gezeigt. Der offene Leserahmen wird durch Vergleich mit anderen bekannten Asparaginsäureproteasen identifiziert und wird durch Transkriptionskartierung bestätigt.

Beispiel 5.3: RNA Kartierung von PEPE

Die gesamte RNA wird aus gemahlenen, gefriergetrockneten Myzelien hergestellt, die auf Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und Ammoniak als Stickstoffquelle durch das Verfahren von Frederick und Kinsey angezogen wurden [Curr. Genet. 18: 53-58 (1990)]. Das 5'-Ende der Boten-RNA wird durch Hybridisierung der gesamten RNA mit einem durch ³²P endmarkierten Oligonukleotid A (SEQ ID Nr: 12) und der Größenbestimmung des durch reverse Transkriptase gebildeten Runoff-Transkripts auf einem Sequenziergel durch den Vergleich mit Sequenzierreaktionen identifiziert, die durch Didesoxysequenzierung mit demselben Oligonukleotid hergestellt wurden (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Die genauen Spaltstellen der Introns werden durch Klonierung und Sequenzierung von partiellen cDNA Kopien der pepE RNA identifiziert. Die Erststrangsynthese wird durch Standardverfahren (Maniatis et al., obige Literaturstelle) ausgeführt, mit der Ausnahme, daß das primende Oligonukleotid entweder das Oligonukleotid C (SEQ ID Nr: 14) oder Oligonukleotid E (SEQ ID Nr: 16) ist. Diese cDNAs werden mittels der Oligonukleotide B (SEQ ID Nr: 13) und C oder der Oligonukleotide D (SEQ ID Nr: 15) und E einer PCR unterzogen und in pTZISR kloniert. Beide Stränge von zwei unabhängigen Klonen werden jeweils komplett sequenziert. Die gesamte Länge der durch das pepE Gen gebildeten mRNA wird durch Northern Analyse mittels des 2,8 kb BamHI- BglII Fragments als Sonde bestimmt (Maniatis et al. obige Literaturstelle) und wird mit einer Größe zwischen 1,3 und 1,5 kb bestimmt, die der entspricht, welche aus der Größe des offenenen Leserahmens und der Position der Transkriptionsstartstelle erwartet wird.

Beispiel 6: Genomische Zerstörung von PEPE

Beispiel 6.1: Konstruktion von pTZ18REE

pTZ18R wird an der Hindill Einzelschnittstelle geschnitten, die mit T4 Polymerase aufgefüllt wird, und in Gegenwart eines Überschusses an unphosphorylierten EcoRI Linkern ligiert, die die Sequenz 5'-GGAATTCC haben. Nach einer Transformation in E. coli wird ein Plasmid pTZ18REE erzeugt, das zwei EcoRI Schnittstellen aufweist, eine an jedem Ende der Polylinkersequenz. Das korrekte Plasmid wird durch Sequenzierung identifiziert.

Beispiel 6.2: Konstruktion von pPEPEPYRA

Das 4 kb XbaI Fragment, das das pyrA gen enthält, wird aus pAXI ausgeschnitten und von den Vektorsequenzen gereinigt. Das Fragment wird mit T4 Polymerase behandelt, um die klebrigen Enden aufzufüllen, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.
pPEPE wird mit EcoRI geschnitten, mit bakterieller, alkalischer Phosphatase dephosphoryliert, mit T4 Polymerase zur Auffüllung der 5'-Überhänge behandelt und dann mit BamHI geschnitten. Die Fragmente werden auf einem Agarosegel aufgetrennt und das 3,4 kb EcoRI (stumpfendig)-BamHI Fragment wird gereinigt.
pPEPE wird mit Hindill geschnitten, mit bakterieller, alkalischer Phosphatase dephosphoryliert, mit T4 Polymerase zur Auffüllung der 5-Überhänge behandelt und dann mit BamHI geschnitten. Die Fragmente werden auf einem Agarosegel aufgetrennt und das 1,4 kb Hindill (stumpfendig)-BamHI Fragment wird gereinigt.
pTZ18R wird mit BamHI geschnitten und mit bakterieller, alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Die vier obigen Fragmente werden zusammen ligiert. Nach der Transformation von E. coli werden die Kolonien, die die korrekten Plasmide tragen, durch Restriktionsverdau von Miniplasmidpräparationen identifiziert.
pPEPEPYRA besteht aus dem pTZ18R Vektor, der ein EcoRI Fragment enthält, das das PEPE Gen enthält, das die zentralen EcoRI-HindIII und EcoRI-EcoRI Fragmente umfaßt, die das meiste des Leserahmens der reifen Protease enthalten, der durch ein XbaI DNA Fragment, das die Orotidinmonophosphatdecarboxylase kodiert, ersetzt wurde.

Beispiel 6.4: Transformation von A. niger

10 ug von Plasmid pPEPEPYRA werden vollständig mit EcoRI verdaut. Die Vollständigkeit des Verdaus wird durch Auftragen eines Aliquots auf einem Gel überprüft und die restliche DNA wird mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 20 ul sterilem Wasser resuspendiert.
Konidiosporen des auxotrophen A. niger An8 (DSM 3917) werden für 4 Tage bei 28ºC auf Vollmedium angezogen, bis sie voll sporulieren. 2 · 10&sup8; Konidiosporen werden zur Beimpfung von 200 ml Minimalmedium verwendet, das mit 1 g/l Arginin und Uridin supplementiert wird.
Nach 20 Stunden Wachstum bei 28ºC bei 180 Upm wird das Myzel durch Filtration durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; gewaschen und in 20 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2;, 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) resuspendiert. Das Gemisch wird in einem Schüttelwasserbad (30ºC, 50 Upm) inkubiert, bis ausreichend Protoplasten freigesetzt wurden (mikroskopisch nach 90-120 Minuten detektiert). Die Protoplastensuspension wird durch einen Glaswollestopfen in einem Trichter filtriert, um den Myzeldebris zu entfernen. Die Protoplasten werden durch milde Zentrifugation (10 Minuten, 2000 Upm) bei Raumtemperatur pelletiert und zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; gewaschen. Die Protoplasten werden schließlich in 200-500 ul an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; unter Bildung einer Konzentration an 1 · 10&sup8; Sphäroplasten pro ml resuspendiert.
Zur Transformation wird ein 200 ul Aliquot der Protoplastensuspension mit 5 ug der mit EcoRI verdauten pPEPEPYRA in 50 ul PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl&sub2;, 25% PEG 6000) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird für 20 Minuten auf Eis gehalten, es werden weitere 2 ml PCT zugegeben und das Gemisch wird für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 4 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; werden zugegeben und 1 ml Aliquots der schließlichen Transformationslösung werden mit flüssigem Minimalagarmedium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)) gemischt, das mit 0,8 M KCl stabilisiert ist. Das Gemisch wird sofort auf Agarplatten desselben Mediums gegossen und bei 30ºC inkubiert.
Nach 2-3 Tagen Wachstum bei 28ºC erscheinen stabile Transformanden als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Hintergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vermutlich abgestorbenen Transformanden.

Beispiel 6.5: Indentifizierung von Genzerstörungen

Aus den stabilen Kolonien werden einzelne Sporensuspensionen hergestellt und auf frischen Minimalplatten plus Arginin ausgestrichen. Es werden einzelne Kolonien selektiert und erneut ausgestrichen, um reine Kulturen zu ergeben. Diese werden verwendet, um 200 ml flüssiges Minimalmedium anzuimpfen, mit 1 g/l Arginin versetzt ist. Nach 24 h bei 30ºC und einem Schütteln bei 180 Upm wird das Myzel auf Filterpapier geerntet und das Kissen wird gefriergetrocknet. Nach dem Trocknen wird die DNA aus einzelnen Kissen durch Mahlen der Kissen zu einem feinen Pulver mit Stößel und Mörser präpariert. 60 mg dieses Pulvers werden in 3 ml 1% Natriumdodecylsulfat, 0,1% Tween 80 und 1 M Ammoniumacetat durch Vortexen resuspendiert. Dies wird bei 65ºC für 20 Minuten mit zeitweisem Mischen erhitzt. Der Zelldebris wird von der DNA Lösung durch Zentrifugation bei 15 000 Upm für 5 Minuten abgetrennt. Der Überstand wird zweimal mit Phenol und zweimal mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das DNA Pellet wird in 100 ul sterilem TE rückgelöst.
20 ul jeder DNA werden mit EcoRI in Gegenwart von 1 ug RNAse A für 1 Stunde verdaut. Dies wird auf einem Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran überführt und eingebacken. Das BgIII-HindIII Fragment von pPEPE, das das PEPE Gen enthält, wird gereinigt, durch Nick-Translation markiert und zur Sondierung der Filter verwendet. Stämme, die eine Zerstörung des pepE Gens aufweisen, erkennt man leicht, da ihnen das hybridisierende 0,5 kb EcoRI Fragment fehlt und sie eine veränderte Mobilität der zwei anderen flankierenden Fragmente aufweisen.
Einer dieser Stämme wird auf Medien plattiert, die Uridin und 5-Fluororotsäure enthalten. Mutanten mit einer Pyrimidinauxotrophie werden durch das stärkere Wachstum auf diesen Medien identifiziert und gepickt und durch Ausstreichen auf Einzelkolonien gereinigt.

Beispiel 6.6: Herstellung von Interferon im pepE&supmin; A. niger Stamm

Einer der in Beispiel 6.5 isolierten pepE&supmin; A. niger An8 Stämme wird als Wirt für eine anschließende Transformation mit pyrA&spplus; enthaltenden Plasmiden und Expressionskassetten verwendet, die ein heterologes Gen für Interferon enthalten.
Konidiosporen der Uridin-auxotrophen pepE&supmin; Mutante von A. niger An8 werden für 4 Tage bei 28ºC in Vollmedium angezogen, bis sie voll sporulieren. 2 · 10&sup8; Konidiosporen werden zur Beimpfung von 200 ml Minimalmedium verwendet, das mit 1 g/l Arginin und Uridin supplementiert ist.
Nach 20 Stunden Wachstum bei 28ºC und 180 Upm wird das Myzel durch Filtration durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; gewaschen und in 20 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2;, 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) resuspendiert. Das Gemisch wird in einem Schüttelwasserbad (30ºC, 50 Upm) inkubiert, bis ausreichend Protoplasten freigesetzt wurden (mikroskopisch nach 90-120 Minuten detektiert). Die Protoplastensuspension wird durch einen Glaswollestopfen in einem Trichter filtriert, um den Myzeldebris zu entfernen. Die Protoplasten werden durch milde Zentrifugation (10 Minuten, 2000 Upm) bei Raumtemperatur pelletiert und zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; gewaschen. Die Protoplasten werden schließlich in 200-500 ul an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; unter Bildung einer Konzentration an 1 · 10&sup8; pro ml resuspendiert.
Zur Transformation wird ein 200 ul Aliquot der Protoplastensuspension mit 5 ug an pAXI (DSM 7017) und 50 ug an pGIIss-IFN AM119 oder pGII-IFN AM119 DNA (beide Plasmide sind in EP 0 421 919 A beschrieben) in 50 ul PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl&sub2;, 25% PEG 6000) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird für 20 Minuten auf Eis gehalten, es werden weitere 2 ml PCT zugegeben und das Gemisch wird für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert: 4 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; werden zugegeben und 1 ml Aliquots der schließlichen Transformationslösung werden mit flüssigem Minimalagarmedium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)) gemischt, das mit 0,8 M KCl stabilisiert ist. Das Gemisch wird sofort auf Agarplatten desselben Mediums gegossen und bei 30ºC inkubiert.
Nach 2-3 Tagen Wachstum bei 28ºC erscheinen stabile Transformanden als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Hintergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vermutlich abgestorbenen Transformanden.
Die Transformanden werden gepickt und auf eine Interferonexpression analysiert. Die Interferonaktivität wird gemäß dem Verfahren von Armstrong (J. A. Armstrong, Apll. Microbiol. 21; 732 (1971)) mittels humaner CCL-23 Zellen und dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV) als Provokationsvirus bestimmt.
Konidiosporen von Transformanden werden einzeln in 50 ml eines Präkulturmediums vorkultiviert (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) 3 g/l, NH&sub4;Cl 2 g/l, KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g/l, NaCl 0,5 g/l, Mg&sub2;SO&sub4; · 7 H&sub2;O 0,5 g/l, Ca&sub2;SO&sub4; · 2 H&sub2;O 0,5 g/l, pH 7,0, 1% Arginin). Die Vorkultur wird für 72 Stunden bei 250 Upm und 28ºC inkubiert. 10% der Vorkultur werden zum Beimpfen von 50 ml des Hauptkulturmedium (Sojabohnenmehl 20 g/l, Pectin Slow Set 5 g/l, 1% Arginin) verwendet. Die Kultur wird für 72-96 Stunden bei 250 Upm und 28ºC angezogen.
Zu verschiedenen Zeiten (alle 20 Stunden) werden Proben entnommen, die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und durch Gefriertrocknung und trockene Vermahlung aufgebrochen. Der Überstand und die Zellextrakte werden beide auf Interferonaktivität getestet, wie dies beschrieben ist (siehe oben). Die Hauptmenge an Interferonaktivität wird bei Transformanden, die pGIIss-IFN AM119 enthalten, ins Medium sekretiert, während bei Transformanden, die pGII-IFN AM119 enthalten, sie hauptsächlich im Zellextrakt vorkommt.

Beispiel 7: Überexpression von pepE in A. niger

Beispiel 7.1: Überexpression von mehrfachen Kopien

A. niger An8 wird mit 1 ug pAXI plus 10 ug pPEPE transformiert, um Uridinprototrophe zu isolieren. Die Kolonien werden gereinigt und die DNA wird wie oben beschrieben präpariert. Southern Blots mittels des BglII- Hindill Fragments von pPEPE zeigen, daß einige Transformanden eine einzelne Kopie von pPEPE integriert in das Genom enthalten, während andere bis zu und über 10 zusätzliche Kopien in ihrem Genom aufweisen. Diese Stäme bilden entsprechend mehr proteolytische Aktivität und sind mitotisch stabiler.

Beispiel 7.2: Überexpression von pepE aus Genfusionen

Der Promotor der A. niger Pyruvatkinase wird von pGW1100 (DSM 5747) durch PCR Technologie mittels Oligonukleotid 1 (SEQ ID Nr: 3) und Oligonukleotid 2 (SEQ ID Nr: 4) amplifiziert. Das Fragment wird mit BamHI und PstI geschnitten und aus einem Agarosegel gereinigt.
Die für die Aspergillus Asparaginsäureproteinase kodierende Region wird aus pPEPE durch PCR Technologie mittels Oligonukleotid 3 (SEQ ID Nr: 5) und Oligonukleotid 4 (SEQ ID Nr: 6) amplifiziert. Das Fragment wird mit PstI und XhoI geschnitten und aus dem Agarosegel gereinigt.
Der Terminator der A. niger Pyruvatkinase wird aus pGW1100 (DSM 5747) durch PCR Technologie mittels Oligonukleotid 5 (SEQ ID Nr: 7) und Oligonukleotid 6 (SEQ ID Nr: 8) amplifiziert. Das Fragment wird mit BamHI und PstI geschnitten und aus dem Agarosegel gereinigt.
pTZ18R wird mit BamHI geschnitten und mit einer bakteriellen alkalischen Phosphatase dephosphoryliert.
Die Ligation der vier obigen Fragmente und die Transformation von E. coli führt zur Bildung des Plasmids pPKIPEPE, dessen korrekte Struktur durch Restriktionsverdau und Sequenzierung bestätigt wird. pPKIPEPE enthält ein BamHI Fragment inseriert in pTZ18R, wobei das Fragment eine Expressionskassette enthält, die aus dem Pyruvatkinasepromotor von A. niger fusioniert an das ATG Startcodon des pepE Gens von A. niger besteht, das durch den Pyruvatkinaseterminator terminiert wird. pPKIPEPE wird mit pAXI zur Cotransformation von A. niger An8 zur Uridinprototrophie verwendet.
Das Vorkommen der pki-pepE Fusion wird durch Herstellung von DNA aus einzeln gereinigten Transformanden und deren Verwendung für eine Southern Analyse mittels Sonden von pki und pepE bestätigt. Stämme mit einer oder mehreren Kopien dieser in ihr Genom integrierten Genfusion bilden mehr proteolytische Aktivität, wenn die Zellen schnell auf Glucose als C-Quelle wachsen.

Beispiel 8: Expression von pepE in anderen Organismen: Expression in Hefen

Das Plasmid pPEPE wird in vitro mit 3 synthetischen Oligonukleotiden mutagenisiert, die in der Sequenzliste als Oligonukleotid 7,8 und 9 jeweils unter SEQ ID Nr: 9, 10 und 11 gezeigt sind, die alle 3 Introns herausfallen lassen. Dies bildet das Plasmid pPEPEI, dessen Sequenz durch die vollständige Sequenzierung des offenen Leserahmens bestätigt wird.
pFBY 129 (hinterlegt als DSM 7016) wird mit EcoRI geschnitten und mit S1 Nuklease zur Entfernung der klebrigen Enden behandelt. Dieses stumpfendige Molekül wird mit einem Überschuß an unphosphorylierten Linkem der Sequenz 5'-CCTGCAGG religiert und in E. coli transformiert. Das korrekte Plasmid, worin eine PstI Schnittstelle die EcoRI Schnittstelle ersetzt, wird durch Sequenzierung identifiziert und wird pFBY129P genannt.
pFBY25 (DSM 7020) wird mit SnaBI geschnitten und mit T4 Polymerase zum Auffüllen der Enden behandelt. Dieses stumpfendige Molekül wird mit einem Überschuß an unphosphorylierten Linkem der Sequenz 5'- GAGATCTC religiert und in E. coli transformiert. Das korrekte Plasmid mit einer BglII Schnittstelle anstelle der SnaBI Schnittstelle wird durch Restriktionsanalyse von Plasmidminipräparationen identifiziert und wird durch Sequenzierung bestätigt. Dieses Plasmid wird pFBY25Bg genannt. pFBY25Bg wird mit BglII verdaut und mit einer bakteriellen alkalischen Phosphatase dephosphoryliert.
Es wird mittels der Oligonukleotide 3 und 4 durch PCR ein Fragment aus pPEPEI amplifiziert. Dieses Fragment, das den gesamten offenen Leserahmen von PEPE ohne Introns enthält, wird mit PstI und XhoI geschnitten und aus einem Agarosegel gereinigt.
Der Terminator des A. niger Pyruvatkinasegens wird aus pGW1100 (DSM 5747) durch PCR mittels der Oligonukleotide 5 und 6 amplifiziert. Das Fragment wird mit SalI und BamHI geschnitten und aus einem Agarosegel gereinigt.
Der Gal10 Hefepromotor wird aus pFBY129P mit BamHI und PstI herausgeschnitten und das Fragment wird aus einem Agarosegel gereinigt.
Die drei oben erhaltenen Fragmente werden mit dem BgIII verdauten und dephosphorylierten pFBY25Bg unter Bildung von Plasmid pGALPEPE zusammen ligiert. Die korrekte Struktur wird durch Restriktionsanalyse bestätigt. Das Plasmid pGALPEPE wird in Hefe transformiert und die Transformanden bilden das PEPE Protein nach einer Induktion der Expression des rekombinanten Gens mit Galactose.

Hinterlegung von Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismen werden unter dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascher oder Weg 1b, D-38124 Braunschweig hinterlegt:

Sequenzliste

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder:
(A) Name: Ciba-Geigy AG
(B) Straße: Klybeckstr. 141
(C) Stadt: Basel
(E) Land: Schweiz
(F) Postleitzahl (ZIP): 4002
(G) Telefon: +41 61 69 11 11
(H) Telefax: +49 61 69 67 976
(l) Telex: 96 29 91
(ii) Titel der Erfindung: Pilzprotease
(iii) Anzahl an Sequenzen: 16
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: Diskette
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.25 (EPO)
(2) Information für SEQ ID Nr: 1
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 2875 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: Nein
(iii) Anti-Sinn: Nein
(vi) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: pepE
(B) Stamm: Aspergillus niger N400
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: Verbindung von (1269..1370, 1462..1612, 1669..2323, 2382..2667)
(D) Andere Information: Funktion = "Asparaginsäureprotease" Produkt = "PEPE" Gen = "pepE"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Intron
(B) Lage: Reihenfolge (1371..1461, 1613..1668, 2324..2381)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Exon
(B) Lage: Verbindung von (1269..1370, 1462..1612, 1669..2323, 2382..2667) (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 1
(2) Information für SEQ ID Nr: 2
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 398 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr: 2
(2) Information für SEQ ID Nr: 3
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..18
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid 1" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 3
(2) Information für SEQ ID Nr: 4
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ; Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..30
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonuldeotid 2" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 4
(2) Information für SEQ ID Nr: 5
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..30
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid 3" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 5
(2) Information für SEQ ID Nr: 6
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge 30 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..30
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid 4" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 6
(2) Information für SEQ ID Nr: 7
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 28 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..28
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid 5" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 7
(2) Information für SEQ ID Nr: 8
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 28 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..28
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid 6" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 8
(2) Information für SEQ ID Nr: 9
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 36 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..36
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid 7" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 9
(2) Information für SEQ ID Nr: 10
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 38 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..38
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid 8" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 10
(2) Information für SEQ ID Nr: 11
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 38 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..38
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid 9" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 11
(2) Information für SEQ ID Nr: 12
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..30
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid A" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 12
(2) Information für SEQ ID Nr: 13
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..20
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid B" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 13
(2) Information für SEQ ID Nr: 14
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..20
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid C" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 14
(2) Information für SEQ ID Nr: 15
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..20
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid D" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 15
(2) Information für SEQ ID Nr: 16
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1..20
(D) Andere Information: Standardname = "Oligonukleotid E" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 16

Claims

1. Isoliertes DNA Molekül, das eine DNA Sequenz umfaßt, die für eine Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger mit der in SEQ ID Nr: 2 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

2. DNA Molekül nach Anspruch 1, das eine in SEQ ID Nr: 1 gezeigte DNA Sequenz umfaßt.

3. Hybridvektor, der eine DNA Sequenz nach Anspruch 1 umfaßt.

4. Hybridvektor nach Anspruch 3, worin eine DNA Sequenz, die für eine Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger kodiert, funktionell mit regulatorischen Regionen verbunden ist, die zur Expression des Gens für die Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger in einer geeigneten Wirtszelle geeignet sind.

5. Hybridvektor nach Anspruch 4, worin eine DNA Sequenz, die für eine Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger kodiert, funktionell mit regulatorischen Regionen verbunden ist, die zur Expression eines Gens für die Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger in einem Aspergillus Stamm geeignet sind.

6. Hybridvektor nach Anspruch 5, der einen zum gewünschten Asparaginsäureproteasegen von Aspergillus niger homologen Promotor umfaßt.

7. Hybridvektor nach Anspruch 4, der einen Aspergillus Promotor umfaßt, der für das gewünschte Asparaginsäureproteasegen von Aspergillus niger heterolog ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines DNA Moleküls nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Kultivierung einer Wirtszelle, die mit diesem DNA Molekül transformiert ist, und Isolierung dieses DNA Moleküls aus der Wirtzelle.

9. Aspergillus Stamm, der für ein Gen der Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger defizient ist, das für eine Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger mit der in SEQ ID Nr: 2 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

10. Aspergillus Stamm nach Anspruch 9, der bezüglich des pepE Gens mit der in SEQ ID Nr: 1 gezeigten Sequenz defizient ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines Aspergillus Stamms nach einem der Ansprüche 9 oder 10, gekennzeichnet durch die in vitro Mutagenese eines Gens für die Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger, Transformation eines Aspergillus Wirts, der ein entsprechendes endogenes chromosomales Gen der Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger trägt, mit dem mutierten exogenen Gen und Isolierung von Mutanten, worin das endogene Gen durch das mutierte exogene Gen ersetzt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, das die Zerstörung des Gens der Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, das die Zerstörung des pepE Gens von A. niger mit der in SEQ ID Nr: 1 gezeigten Sequenz umfaßt.

14. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Polypeptids, gekennzeichnet durch Transformation eines Aspergillus Stamms nach einem der Ansprüche 9 oder 10 mit einem Expressionsvektor, der eine Expressionskassette trägt, die zur Expression des gewünschten Polypeptids geeignet ist, Kultivierung des transformierten Aspergillus Stamms unter Bedingungen, die zur Expression des gewünschten Polypeptids geeignet sind, und Isolierung des gewünschten Polypeptids.

15. Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger mit der in SEQ ID Nr: 2 gezeigten Aminosäuresequenz und Fragmente hiervon mit einer Asparaginsäureproteaseaktivität.

16. Verfahren zur Herstellung einer Asparaginsäureprotease von Aspergillus niger, wobei das Verfahren die Kultivierung eines geeigneten Wirts umfaßt, der mit einem Hybridexpressionsvektor nach Anspruch 4 transformiert ist.

17. Wirt, der mit einem Hybridexpressionsvektor nach Anspruch 4 transformiert ist.

18. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 17, die ein Aspergillus Stamm ist.

19. Transformierter Wirt nach Anspruch 18, der ein Aspergillus Stamm ist, welcher mit einem Hybridexpressionsvektor transformiert ist, der Regulationselemente umfaßt, die zur Expression eines Gens einer Asparaginsäureprotease von Aspergillus in einem Aspergillus Stamm geeignet sind.

20. Transformierter Wirt nach Anspruch 19, der ein Aspergillus Stamm ist, der mit einem Hybridexpressionsvektor transformiert ist, der einen Promotor umfaßt, der zum gewünschten Asparaginsäureproteasegen von Aspergillus niger homolog ist.

21. Transformierter Wirt nach Anspruch 19, der ein Aspergillus Stamm ist, der mit einem Hybridexpressionsvektor transformiert ist, der einen Promotor umfaßt, der zum gewünschten Asparaginsäureproteasegen von Aspergillus niger heterolog ist.

22. Verfahren zur Herstellung eines transformierten Wirts nach Anspruch 17, das die Transformation eines geeigneten Wirts mit einem Hybridexpressionsvektor nach Anspruch 4 umfaßt.