DE3586889T2

DE3586889T2 - Regulatorregion fuer die expression von heterologen genen in hefe.

Info

Publication number: DE3586889T2
Application number: DE8585113737T
Authority: DE
Inventors: Paul Frederick Brust; Steven Bradley Ellis; Thomas Raymond Gingeras; Michael Miller Harpold; David Womack Stroman; Juerg Friedrich Tschopp
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Current assignee: Research Corp Technologies Inc (ndgesd
Priority date: 1984-10-30
Filing date: 1985-10-29
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2005-10-30
Also published as: JP2552807B2; JP2502508B2; AR242988A1; EP0183071B1; HU205627B; KR870003197A; HUT38678A; EP0483115A3; IE930804L; JPH08173161A; NZ213842A; PT81399B; EP0483115A2; JPH06233686A; DD254211A5; FI94427C; IL76765A; PL256012A1; JP2552808B2; ATE83263T1

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet rekombinanter DNA-Biotechnologie. In einem ihrer Aspekte betrifft die Erfindung DNA-Fragmente, die die Transkription von DNA in Messenger RNA regulieren, und die Initiierung und Termination der Translation von Messenger RNA in Protein. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Expressionsvektoren, die die oben beschriebenen DNA-Fragmente eingebaut haben. In einem noch anderen Aspekt betrifft die Erfindung neue Mikroorganismen, die mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren transformiert sind. In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Herstellung von Polypeptiden.
Durch die Entwicklung rekombinanter DNA-Technologie in früheren Jahren, wurde die kontrollierte Herstellung einer enormen Vielzahl von nützlichen Polypeptiden durch Mikroorganismen möglich. Viele eukaryotische Polypeptide, wie z. B. menschliches Wachstumshormon, Leukozyten- Interferone, menschliches Insulin und menschliches Proinsulin, wurden schon durch verschiedene Mikroorganismen hergestellt. Von der fortdauernden Anwendung von sich schon in der Hand befindlichen Techniken wird in der Zukunft erwartet, daß sie die Herstellung einer Vielzahl von anderen nützlichen Polypeptidprodukten durch Mikroorganismen erlauben.
Die Basistechniken, die auf dem Gebiet rekombinanter DNA-Technologie angewendet werden, sind Fachleuten bekannt. Die wünschenswerterweise anwesenden Elemente für einen Wirt-Mikroorganismus, der für die Durchführung rekombinanter DNA-Technologie nützlich ist, beinhaltet, ist aber nicht darauf beschränkt:
(1) ein Gen, das ein oder mehrere gewünschte(s) Polypeptid(e) codiert und mit adäquaten Kontrollsequenzen, die für die Expression in einem Wirt-Mikroorganismus erforderlich sind, ausgestattet ist,
(2) ein Vektor, gewöhnlich ein Plasmid, in welchen das Gen insertiert werden kann. Der Vektor dient dazu, den Transfer des Gens in die Zelle und das Beibehalten der DNA-Sequenzen in der Zelle sowie eine Expression mit hoher Ausbeute des oben erwähnten Gens zu garantieren und
(3) ein geeigneter Wirt-Mikroorganismus, in den der Vektor der das gewünschte Gen trägt, transformiert werden kann, wobei der Wirt-Mikroorganismus auch den zellulären Apparat hat, der die Expression der Information, die durch das insertierte Gen codiert ist, erlaubt.
Ein Basiselement, das in rekombinanter DNA-Technologie verwendet wird, ist das Plasmid, welches extrachromosomale, doppelsträngige DNA ist, die in einigen Mikroorganismen gefunden wird. Wo Plasmide natürlicherweise vorkommend in Mikroorganismen gefunden werden, wird oft gefunden, daß sie in vielen Kopien pro Zelle vorkommen. Zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Plasmiden wurde eine Vielzahl von durch Menschen gemachten Plasmiden oder Hybridvektoren hergestellt. Eingeschlossen in die durch die Plasmid-DNA codierte Information ist diejenige Information, die erforderlich ist, das Plasmid in Tochterzellen zu reproduzieren, d. h. eine autonom replizierende Sequenz oder ein Replikations-Ursprung. Eine oder mehrere phänotypische Selektions-Charakteristiken müssen auch in die durch die Plasmid-DNA codierte Information eingeschlossen sein. Die phänotypischen Selektions-Charakteristiken erlauben Klonen der Wirtszelle, die das interessierende Plasmid enthält, erkannt zu werden und durch bevorzugtes Wachstum der Zellen in selektiven Medien selektiert zu werden.
Die Verwendbarkeit der Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktionsendonuklease oder durch das eine oder andere Restriktionsenzym geschnitten werden können, jede von ihnen erkennt eine spezifische, einmalige (Schnitt-) Stelle auf der Plasmid-DNA. Danach können homologe Gene, heterologe Gene, d. h. Gene, die aus anderen Organismen als dem Wirt stammen, oder Genfragmente in das Plasmid insertiert werden durch Verbinden an den Enden des geschnittenen Plasmids und des gewünschten genetischen Materials an der Schnittstelle oder an rekonstruierten Enden benachbart zu der Schnittstelle. Das resultierende rekombinierte DNA-Material kann als ein Hybridvektor bezeichnet werden.
DNA-Rekombination wird außerhalb des Wirt-Mikroorganismus ausgeführt. Der resultierende Hybridvektor kann in den Wirt-Mikroorganismus durch ein Verfahren, das als Transformation bekannt ist, eingeführt werden. Durch Wachsen des transformierten Mikroorganismus, können große Mengen des Hybridvektors erhalten werden. Wenn das Gen passend mit Bezug auf die Anteile des Plasmids, welche die Transkription und Translation der codierten DNA-Nachricht steuern, insertiert ist, kann der resultierende Hybridvektor verwendet werden, um die Herstellung der Polypeptid-Sequenz, für welche das insertierte Gen codiert, zu lenken. Die Herstellung des Polypeptids in dieser Weise wird als Genexpression bezeichnet.
Genexpression wird in einer DNA-Region initiiert, die als Promotor- Region bekannt ist. In der Transkriptions-Phase der Expression windet sich die DNA auf, um sich als Matrize für die Synthese von Messenger RNA zu präsentieren. RNA-Polymerase bindet an die Promotor-Region und bewegt sich entlang der entwundenen DNA von seinem 3' Ende zu seinem 5' Ende, unter Transkribieren der in dem codierenden Strang enthaltenen Information in Messenger RNA (mRNA) vom 5' Ende zum 3' Ende der mRNA. Die Messenger RNA ist ihrerseits an Ribosomen gebunden, wo die mRNA in die Polypeptidkette translatiert wird. Jede Aminosäure wird durch ein Nukleotid-Triplett oder Codon codiert, was als das Strukturgen bezeichnet werden kann, d. h. der Teil des Gens, der die Aminosäuresequenz des exprimierten Produkts codiert. Weil drei Nukleotide für die Herstellung jeder Aminosäure codieren, ist es für eine Nukleotid-Sequenz möglich, in drei verschiedenen Weisen gelesen zu werden. Der spezifische Leserahmen, der das gewünschte Polypeptidprodukt codiert, wird als der passende Leserahmen bezeichnet.
Nach Bindung an den Promotor transkribiert die RNA-Polymerase zuerst eine 5' Vorläufer-Region der mRNA, dann ein Translations-Initiationsoder Start-Codon, gefolgt durch die Nukleotid-Codons innerhalb des Strukturgens selbst. Um das gewünschte Genprodukt zu erhalten, ist es notwendig, für das Initiations- oder Start-Codon die Translation der Messenger RNA am Ribosom in dem passenden Leserahmen korrekt zu initiieren. Schließlich werden die Stop-Codons am Ende des Strukturgens transkribiert, was verursacht, daß jede Zusatzsequenz von mRNA untranslatiert in Peptid an den Ribosomen verbleibt, sogar obwohl zusätzliche Sequenzen von mRNA durch die Interaktion von RNA-Polymerase mit der DNA-Matrize gebildet worden sind. Somit bestimmen Stop-Codons das Ende der Translation und deshalb das Ende des weiteren Einbaus von Aminosäuren in das Polypeptidprodukt. Das Polypeptidprodukt kann erhalten werden durch Lysieren der Wirtszellen und Gewinnen des Produkts durch geeignete Reinigung von anderem mikrobiellen Protein, oder unter gewissen Umständen durch Reinigung des Fermentations- Mediums, in welchem die Wirtszellen gewachsen sind und in welche sie das Polypeptidprodukt sekretiert haben.
In der Praxis kann die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie Mikroorganismen erzeugen, die fähig sind, heterologe Polypeptide vollständig zu exprimieren, d. h. Polypeptide, die gewöhnlich nicht in einem gegebenen Mikroorganismus gefunden oder produziert werden - sog. direkte Expression. Alternativ kann ein Fusionsprotein exprimiert werden, d. h. ein heterologes Polypeptid fusioniert an einen Anteil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptids, d. h. Polypeptide, die im Wild- Typ (nicht-transformiert) Wirt-Mikroorganismus gefunden oder produziert werden - sog. indirekte Expression. Mit indirekter Expression ist das anfänglich erhaltene Fusionsprotein-Produkt manchmal inaktiv für seinen beabsichtigten Gebrauch bis das fusionierte homologe/heterologe Polypeptid in einer extrazellulären Umgebung gespalten wird. Somit hat Bromcyan-Spaltung von Methionin-Resten Somatostatin, Thymosin Alpha 1 und die Komponenten A und B Ketten von Humaninsulin von fusionierten homologen/heterologen Polypeptiden ergeben, während der enzymatische Verdau von definierten Resten Beta-Endorphin ergeben hat.
Bis jetzt haben sich kommerzielle Bemühungen, rekombinante DNA- Technologie zur Herstellung verschiedener Polypeptide zu verwenden, auf Escherichia coli als Wirt-Organismus konzentriert. Jedoch in einigen Situationen kann sich E. coli als Wirt für ungeeignet herausstellen. Z. B. enthält E. coli eine Anzahl von toxischen pyrogenen Faktoren, die von einem Polypeptid, das als pharmazeutisches Produkt geeignet ist, entfernt werden müssen. Die Effizienz mit der diese Reinigung erreicht werden kann, wird natürlich mit dem speziellen Polypeptid variieren. Zusätzlich können die proteolytischen Aktivitäten von E. coli die Ausbeuten an einigen geeigneten Produkten ernsthaft limitieren. Diese und andere Überlegungen haben zu einem wachsenden Interesse an alternativen Wirten geführt, insbesondere die Verwendung von eukaryotischen Organismen für die Herstellung von Polypeptidprodukten ist dringend.
Die Verfügbarkeit von Mitteln für die Herstellung von Polypeptidprodukten in eukariotischen Systemen, z. B. Hefe, konnte einen signifikanten Vorteil bereitstellen, relativ zu der Verwendung von prokariotischen Systemen, wie E. coli für die Herstellung von Polypeptiden, die durch rekombinante DNA codiert werden. Hefe wird schon seit Jahrhunderten in Fermentationen großen Ausmaßes verwendet, verglichen mit der relativ kurzen Anwendung von E. coli Fermentationen großen Ausmaßes. Hefe kann im allgemeinen zu höheren Zelldichten wachsen gelassen werden als Bakterien und ist leicht an kontinuierliche Fermentations-Prozessierung anpaßbar. In der Tat ist das Wachstum von Hefen wie Pichia Pastoris zu ultrahohen Zelldichten, d. h. Zelldichten über 100 g/l durch Wegner in US 4.414.329 (übertragen auf Phillips Petroleum Co.) offenbart. Zusätzliche Vorteile von Hefe-Wirten schließen die Tatsache ein, daß viele kritische Funktionen des Organismus, z. B. oxidative Phosphorylierung innerhalb von Organellen lokalisiert sind und daher nicht den möglichen zerstörerischen Effekten bei der Herstellung durch den Organismus von Polypeptiden, die fremd zu den Wild-Typ Wirtzellen sind, ausgesetzt sind. Als ein eukariotischer Organismus kann sich Hefe als fähig erweisen, exprimierte Polypeptidprodukte zu glykosylieren, wo solche Glykosylierung wichtig für die Bioaktivität des Polypeptidproduktes ist. Es ist auch möglich, daß als eukariotischer Organismus Hefe die gleichen Codon- Bevorzugungen wie ein höherer Organismus zeigt, was zu einer effizienteren Herstellung von Expressionsprodukten von Säugetiergenen oder von komplementärer DNA (cDNA), die durch reverse Transkription von z. B. Säugetier-mRNA erhalten wird, abzielt.
Die Weiterentwicklung von schlecht charakterisierten Hefe-Spezies als Wirt-/Vektor-Systeme wird durch das Fehlen von Wissen über Transformationsbedingungen und geeigneter Vektoren ernsthaft behindert. Zusätzlich sind auxotrophe Mutationen oft nicht vorhanden, was eine direkte Selektion auf Transformanten durch auxotrophe Komplementierung ausschließt. Falls rekombinante DNA-Technologie seine Versprechen voll einhalten soll, müssen neue Wirt-/Vektor-Systeme erdacht werden, welche die Manipulation von DNA erleichtern und auch die Expression von insertierten DNA-Sequenzen optimieren, so daß die gewünschten Polypeptidprodukte unter kontrollierten Bedingungen und mit hoher Ausbeute hergestellt werden können.
Eine Aufgabe dieser Erfindung ist deshalb eine neue regulatorische Region, die auf die Anwesenheit von Methanol anspricht.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist eine neue Katabolit-sensitive regulatorische Region, die auf die Anwesenheit von einigen Kohlenstoffquellen anspricht, aber nicht auf die Anwesenheit von anderen Kohlenstoffquellen anspricht.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist eine neue regulatorische Region, die auf Kohlenstoffquellenmangel anspricht.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung sind neue Vektoren, die fähig sind, eine insertierte Polypeptid-codierende Sequenz zu expremieren.
Weiter ist eine Aufgabe dieser Erfindung ein neuer Hefestamm der Gattung Pichia.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, das den hier oben beschriebenen neuen Hefestamm verwendet.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden deutlich von der hier bereitgestellten Offenbarung und den hier bereitgestellten Ansprüchen.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung haben wir DNA- Sequenzen entdeckt, isoliert und charakterisiert, die die Transkription von DNA in Messenger RNA und die Translation von Messenger RNA, um ein Polypeptidprodukt zu geben, kontrollieren. Die neuen DNA-Sequenzen dieser Erfindung sind nützlich für die Herstellung von Polypeptidprodukten durch (a) Hefe-Stämme, die fähig sind, auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen (b) Hefestämme, die fähig sind, auf Glucose, Ethanol, Fruktose und ähnlichem zu wachsen; und (c) Hefestämme, die fähig sind, auf Glyzerin, Galaktose, Acetat und ähnlichem zu wachsen.
Fig. 1 ist eine Korrelation der Beziehung zwischen dem genomischen Klon (pPG 6.0) und cDNA-Klon (pPC 15.0) für Protein p76.
Fig. 2 ist eine Korrelation der Beziehung zwischen dem genomischen Klon (pPG 4.0) und den cDNA-Klonen (pPC 8.3 und pPC 8.0) für Protein p72 (Alkoholoxidase).
Fig. 3 ist eine Korrelation der Beziehung zwischen dem genomischen Klon (pPG 4.8) und cDNA-Klon (pPC 6.7) für Protein p40.
Fig. 4 stellt Restriktionskarten der regulatorischen Regionen der Erfindung von Klon pPG 6.0 bereit.
Fig. 5 ist eine Restriktionskarte der regulatorischen Region der Erfindung von Klon pPG 4.0.
Fig. 6 ist eine Restriktionskarte der regulatorischen Region der Erfindung von Klon pPG 4.8.
Fig. 7 ist eine Restriktionskarte der DNA-Sequenz, die vom 3' Ende des p76 Strukturgens erhalten wurde.
Fig. 8 stellt Restriktionskarten von DNA-Sequenzen, die vom 3' Ende des p72 (Alkoholoxidase) Strukturgens erhalten wurden, bereit.
Fig. 9 ist eine Restriktionskarte einer DNA-Sequenz, die vom 3' Ende des p40 Strukturgens erhalten wurde.
Fig. 10 ist eine Restriktionskarte des Protein p76 Strukturgens und der 5' regulatorischen Region dafür.
Fig. 11 ist eine Restriktionskarte des Protein p40 Strukturgens und der 5' regulatorischen Region dafür.
Fig. 12 ist eine Restriktionskarte von Protein p76-cDNA.
Fig. 13 ist eine Restriktionskarte von Protein p72 (Alkoholoxidase) cDNA.
Fig. 14 ist eine Restriktionskarte von Protein p40-cDNA.
Fig. 15 stellt Restriktionskarten von zwei neuen p76 regulatorischen Region-lacZ DNA-Konstrukten der Erfindung bereit.
Fig. 16 ist eine Restriktionskarte von einem neuen p72 (Alkoholoxidase) regulatorischer Region-lacZ DNA-Konstrukt der Erfindung.
Fig. 17 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pSAOH 1.
Fig. 18 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pSAOH 5.
Fig. 19 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pSAOH 10.
Fig. 20 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pTAFH.85.
Fig. 21 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pT76H1.
Fig. 22 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pT76H2.
Fig. 22a ist eine Restriktionskarte von Plasmid pT76H3.
Fig. 22b ist eine Restriktionskarte von Plasmid pT76H4.
Fig. 23 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pYA2.
Fig. 24 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pYA4.
Fig. 25 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pYJ8.
Fig. 26 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pYJ8ΔCla.
Fig. 27 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pYJ30.
Fig. 28 stellt eine Restriktionskarte von Plasmid pTAFH1 bereit und zeigt wie das Plasmid erhalten wurde.
Fig. 29 stellt eine Restriktionskarte von Plasmid pTAO12 bereit und zeigt wie das Plasmid erhalten wurde.
Fig. 30 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pTAO13.
Fig. 30a ist eine Restriktionskarte von Plasmid pT76U1.
Fig. 31 stellt eine Restriktionskarte von Plasmid pTAO1 bereit und zeigt wie das Plasmid erhalten wurde.
Fig. 32 stellt eine Restriktionskarte von Plasmid pTAF.85 bereit und zeigt wie das Plasmid erhalten wurde.
Fig. 33 stellt eine Restriktionskarte von Plasmid YEp13 bereit.
Fig. 34 ist eine Restriktionskarte von pBPf1.
Die folgenden Abkürzungen wurden in dieser Anmeldung verwendet, um die verwendeten Restriktionsenzym darzustellen:
A = AsuII
B = BamHI
B&sub2; = BglII
Bc = BclI
C = ClaI
H&sub2; = HincII
H&sub3; = HindIII
K = KpnI
Nd&sub1; = NdeI
Nr = NruI
Ps = PstI
Pv&sub1; = PvuI
Pv&sub2; = PvuII
R&sub1; = EcoRI
R&sub5; = EcoRV
Rs = RsaI
S = SalI
S&sub3; = Sau3AI
Sc = SacI
Sm = SmaI
Sp = SphI
Ss = SstI
St = StuI
T = TaqI
Th = ThaI
Xb = XbaI
Xh = XhoI
Xm = XmaI
In den anhängenden Figuren werden die für die Manipulation von DNA- Fragmenten verwendeten Restriktionsstellen, die aber durch Ligation zerstört wurden, durch Einschließen der Abkürzung in Klammern für die zerstörte Stelle, angezeigt.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird ein neues DNA-Fragment bereitgestellt, das eine regulatorische Region umfaßt, die mindestens auf eine der folgenden Bedingungen anspricht: die Anwesenheit von Methanol, Kohlenstoffquellen-Mangel, wenn die Zellen auf einigen anderen Substraten als Methanol wachsen, und die Anwesenheit von anderen Nicht-Katabolit reprimierenden Kohlenstoffquellen als Methanol. Die regulatorische Region des DNA-Fragments dieser Erfindung ist fähig, die Transkription von Messenger RNA zu kontrollieren, wenn sie am 5' Ende der DNA positioniert ist, die für die Herstellung der Messenger RNA codiert. Eingeschlossen in den Umfang unserer Erfindung sind auch Mutanten des oben beschriebenen DNA - Fragments.
Weiter in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein DNA-Fragment bereitgestellt, das eine regulatorische Region umfaßt, die fähig ist, die Polyadenylation, Termination der Transkription und Termination der Translation von Messenger RNA zu kontrollieren, wenn sie am 3' Ende der Polypeptid-codierenden Region angebracht ist, welche für die Herstellung der Messenger RNA codiert, wobei die Transkription und Translation von Messenger RNA durch eine regulatorische Region kontrolliert wird, die auf mindestens eine der folgenden Bedingungen anspricht: die Anwesenheit von Methanol, Kohlenstoffquellen-Mangel, wenn die Zellen auf einigen anderen Substraten als Methanol wachsen und die Anwesenheit von anderen Nicht-Katabolit reprimierenden Kohlenstoffquellen als Methanol. Auch eingeschlossen in den Umfang unserer Erfindung sind Mutanten des oben beschriebenen DNA-Fragments.
Weiter in Übereinstimmung mit einem spezifischen Ausführungsbeispiel der Erfindung werden DNA-Fragmente bereitgestellt, welche den Einbau von codierten Polypeptiden in Peroxisomen bewirken. Peroxisomen sind intrazelluläre Körper, die in großer Menge in auf Methanol gewachsenen Hefezellen anwesend sind. Diese intrazellulären Körper dienen dazu, das eingebaute Polypeptidprodukt von intrazellulären Flüssigkeiten und Enzymen, wie Proteasen, fernzuhalten.
In Übereinstimmung mit einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung werden Gene bereitgestellt, die für die Herstellung von Alkoholoxidase, für ein Protein von ungefähr 40 Kilodalton und für ein Protein von ungefähr 76 Kilodalton codieren.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung werden Plasmide und transformierte Organismen bereitgestellt, die die oben beschriebenen DNA-Fragmente enthalten.
In Übereinstimmung mit einem noch weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung werden Verfahren bereitgestellt zur Herstellung von sowohl Plasmiden und DNA-Fragmenten der Erfindung als auch heterologen Polypeptiden, d. h. Polypeptiden, die nicht aus dem Wirt-Organismus stammen.

Isolation von regulierbaren Genen aus Pichia pastoris

Eine ungefähr 20.000 Mitglieder umfaßende cDNA-Bibliothek wurde in E. coli hergestellt mit poly A&spplus; RNA, die aus Pichia pastoris Zellen, die auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle (siehe Beispiel III) gewachsen waren, isoliert worden war. Die Bibliothek wurde durch Hybridisierung "gescreent" unter Verwendung von kinasierter poly A&spplus; RNA, die von Pichia pastoris Zellen, die in der Anwesenheit von entweder Methanol oder Ethanol gewachsen waren, isoliert worden war. Nach einigen Runden dieses "Plus-Minus-Screenings", wurden drei verschiedene, nicht homologe cDNA-Klone als Kopien von methanol-spezifischen Messenger RNAs identifiziert. Diese Klone wurden als pPC 6.4, pPC 8.0 und pPC 15.0 bezeichnet und es wurde bestimmt, daß sie Inserts von 470, 750 bzw. 1100 Nukleotiden enthalten.
In einem Versuch cDNA-Klone längerer Länge zu erhalten, wurde eine zweite cDNA-Bibliothek hergestellt unter Verwendung milderer S1 Nuklease-Verdau-Bedingungen als sie für die Herstellung der ersten cDNA- Bibliothek verwendet worden waren und die Mitglieder dieser neuen Bibliothek wurden individuell mit ³²P-markierten cDNA-Klonen pPC 6.4, pPC 8.0 und pPC 15.0 "gescreent". Als ein Ergebnis wurden längere cDNA-Klone isoliert, die den cDNA-Klonen pPC 6.4 und pPC 8.0 entsprechen. Es wurde gefunden, daß die längeren Klone, pPC 6.7 und pPC 8.3, Inserts von 1200 bzw. 2100 Nukleotiden (siehe Fig. 2 und 3) enthalten. Ein cDNA-Klon, der ein Insert größer als 1100 Nukleotide für pPC 15.0 besitzt, wurde nicht beobachtet nach "Screenen" von mehr als 40.000 cDNA-Klonen.
Die Isolation von genomischen DNA-Fragmenten, die jedem dieser cDNA-Klone entsprechen, wurde ausgeführt durch zunächst Herrauschneiden und Elektroeluieren von Pichia pastoris DNA-Fragmenten aus Restriktionsendonuklease-behandelter chromosomaler DNA, die mit ³²P-markiertem pPC 15.0, pPC 8.0 oder pPC 6.4 hybridisierte, aus Agarose- Gelen. Dann wurden die eluierten genomischen DNA-Fragmente in Escherichia coli kloniert und die geeigneten genomischen Klone wurden durch mehrmaliges "Screenen" mit jedem der obigen cDNA-Sonden identifiziert.
Die Beziehung von jedem cDNA-Klon zu seinem entsprechenden genomischen Klon ist in den Fig. 1, 2 und 3 gezeigt. pPC 15.0 wird innerhalb eines 6000 Nukleotid HindIII genomischen Fragments, das in Klon pPG 6.0 (Fig. 1) anwesend ist, codiert. Das 5' Ende des Gens, das durch pPC 15.0 codiert wird, ist gegen das 1300 bp HindIII-EcoRI Fragment, das in pPG 6.0 enthalten ist, orientiert, während das 3' Ende des Gens benachbart zu den PstI-Stellen in pPG 6.0 ist.
Der cDNA-Klon pPC 8.3 ist innerhalb des genomischen Klons pPG 4.0 (Fig. 2) enthalten. pPG 4.0 enthält ein EcoRI-PvuII Insert von 4000 Nukleotiden benachbarter genomischer DNA. Die Orientierung von pPC 8.3 innerhalb von pPG 4.0 plaziert das 5' Ende des Gens für diesen cDNA-Klon nahe an die BamHI Stellen, während das 3' Ende dieses Gens nahe der PvuII Stelle lokalisiert ist. Die Orientierung von pPC 8.0 (einem verwandten cDNA-Klon) innerhalb von pPG 4.0 plaziert das 5' Ende dieses cDNA-Klons nahe an die KpnI Stelle am 3' Ende von pPG 4.0 und das 3' Ende des cDNA-Klons ist nahe der PvuII-Stelle lokalisiert.
Der cDNA-Klon pPC 6.7 ist vollständig innerhalb eines 4800 Nukleotid EcoRI-BamHI genomischen Fragments (Fig. 3) lokalisiert. Klon pPC 6.4 wiederum ist vollständig innerhalb des cDNA-Klons pPC 6.7 lokalisiert. Weil pPC 6.7 eine vollständigere Kopie als pPC 6.4 war, wurde letzterer nicht weiter untersucht. Das 5' Ende von dem Gen ist näher am BamHI Ende als am EcoRI Ende des genomischen Klons pPG 4.8 (Fig. 3) positioniert.
In allen diesen oben beschriebenen genomischen Klone gibt es mindestens 1,2 Kilobasenpaare flankierender genomischer DNA-Sequenzen, welche 5' zu den Strukturgenen sind, die in jedem der cDNA-Klone kopiert sind.
Jeder der oben beschriebenen genomischen und cDNA-Klone wurden beim Northern Regional Research Center of the United States of America, Peoria, Illinois hinterlegt. Alle Klone wurden in E. coli Wirten hinterlegt: PLASMID WIRT HINTERLEGUNGS-Nr.
Jeder der obigen Organismen wurde unwiderruflich hinterlegt und am 31. August 1984 der Öffentlichkeit zugänglich gemacht.

Einmaligkeit von pPG 6.0. pPG 4.0 und pPG 4.8 für Methanol assimilierende Hefen

Jeder der oben beschriebenen cDNA-Klone wurde markiert und als Sonde chromosomaler DNA-Sequenzen von zahlreichen Methanol assimilierenden Hefen und Methanol nicht-assimilierenden Hefen verwendet. Es wurde gefunden, daß homologe Gene für alle drei der cDNAs existieren, im wesentlichen in allen Methanol assimilierenden Hefen, aber sie waren klar nicht anwesend in Methanol nicht-assimilierenden Hefen (S. cerevisiae). Es wird deshalb angenommen, daß diese Gene nur in Methanol assimilierenden Hefen vorkommen. Zusätzlich zeigen die Southern-Hybridisierungsexperimente detailliert in Beispiel XVII, daß ein hohes Ausmaß von Homologie zwischen diesen einmaligen auf Methanol ansprechenden Genen aus verschiedenen Methanol assimilierenden Hefen existiert.

Charakterisierung der RNA-Transkripte von pPG 6.0. pPG 4.0 und pPG 4.8 Genen

Der Einfluß von Methanol auf die Expression von jedem dieser klonierten Gene kann durch Studieren der Effekte auf die Transkription dieser Gene beobachtet werden. Isolierte poly A&spplus; RNA von Pichia pastoris Zellen, die mit Ethanol oder Methanol als einziger Kohlenstoffquelle gewachsen waren, wurde verwendet, um Northern-Hybridisierungs-Filter anzufertigen (siehe Beispiel IV). Drei identische Paare von Filtern mit Methanol und Ethanol gewachsenen Zellen (siehe Beispiel I) wurden separat mit ³²P-markierten Klonen pPC 15.0, pPC 8.0 und pPC 6.4 "geprobt". Die Klone pPC 15.0, pPC 8.0 und pPC 6.4 hybridisierten mit RNA-Molekülen (von ungefähr 2400, 2300 bzw. 1300 Nukleotiden) von Zellen, die auf Methanol gewachsen waren. Keine Hybridisierung der Klone pPC 15.0 und pPC 8.0 mit den Hybridisierungs-Sonden wurde beobachtet mit RNA, die von Zellen erhalten worden war, die in Anwesenheit von Ethanol gewachsen waren. Jedoch, wenn RNA, die von Zellen isoliert worden war, die auf Ethanol gewachsen waren, mit pPC 6.4 "geprobt" wurde, hybridisierte der Klon mit einem 1300-Nukleotid- RNA-Molekül identisch zu dem, das mit Methanol gewachsenen Zellen gesehen wurde, aber mit einem geschätzten (qualitativ) 5-fach geringeren Level.

Größenbestimmung von Proteinprodukten, die durch pPG 6.0. pPG 4.0 und pPG 4.8 codiert sind

Um zu bestimmen, welches Proteinprodukt durch jeden der oben identifizierten cDNA-Klone codiert worden ist, wurde Poly A&spplus;RNA von auf Methanol gewachsenen Pichia pastoris-Zellen selektiv mit jedem der cDNA-Klone hybridisiert. Die hybrid-selektierte mRNA, d. h. mRNA, die mit jedem der cDNA-Klone hybridisierte, wurde dann in-vitro translatiert und jedes der Proteinprodukte wurde durch Elektrophorese unter Verwendung von SDS-denaturierenden Bedingungen (siehe Beispiel V) aufgelöst. Die Ergebnisse dieser in-vitro positiven Hybridisierungs-Translations-Experimente zeigten an, daß die Klone pPC 15.0, pPC 8.3 und pPC 6.7 mRNAs, die für eine Information für Polypeptide von 76.000 (p76), 72.000 (p72) beziehungsweise 40.000 (p40) Daltons codieren, auswählen. Dieselben Proteine werden beobachtet, wenn Gesamt-Poly A&spplus; RNA (d. h. nicht hybrid-selektiert) von auf Methanol gewachsenen Pichia pastoris-Zellen im gleichen in-vitro-System translatiert worden ist.

Identifizierung von p72 als Alkoholoxidase

A. Molekulargewicht-Vergleich

Eine Probe, die mit Alkoholoxidaseprotein hoch angereichert war, wurde hergestellt durch Dialyse eines geklärten Zell-Lysates gegen H&sub2;O (siehe Beispiel VII). Es wurde durch SDS-Elektrophorese gezeigt, daß das aus dieser Dialyse resultierende kristalline Präzipitat vorwiegend zwei Polypeptide von 76.000 bzw. 72.000 Dalton enthielt. Das Präzipitat wurde durch Sephacryl 200 Chromatographie (siehe Beispiel VII) weiter gereinigt, was zeigte, daß die Alkoholoxidase-Aktivität der Aktivität des gereinigten 72.000-Dalton-Polypeptids entspricht. Die Größe dieses Polypeptids war identisch zu dem des Proteinprodukts, das durch cDNA-Klon pPC 8.3 ausgewählt worden war (siehe Beispiel X).

B. Immunopräzipitation

Zusätzliche Stütze, daß die Klone pPC 8.3 und pPG 4.0 das Alkoholoxidase-Strukturgen codieren, wurde mittels einem immunologischen Versuch (Beispiel XI) erhalten. Die aus Pichia pastoris isolierte Protein- Präparation, die sowohl die 76.000 und 72.000 Dalton Polypeptide enthielt, wurde verwendet, spezifische Antiseren für diese Polypeptide in Kaninchen zu erzeugen. Wenn die hybrid-selektierte Poly A&spplus; RNA von Klon pPC 8.3 in-vitro translatiert worden war, wurde nur das 72.000 Dalton Translations-Produkt durch die Antiseren präzipitiert, die gegen die Protein-Präparation von Pichia pastoris-Zellen gemacht worden waren.

C. Vorhergesagter/Aktueller Aminosäuresequenz-Vergleich

Um weiter zu verifizieren, daß Klon pPC 8.3 in der Tat der cDNA-Klon ist, der für Pichia pastoris-Alkoholoxidase codiert, wurde die Aminosäuresequenz für das aminoterminale Ende des Proteins mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die von pPC 8.3 codiert wird, verglichen. Somit wurde bestimmt, daß die NH&sub2;-terminale Aminosäuresequenz (Sequenz A) des isolierten 72.000 Dalton Proteins ist (Beispiel VIII):
Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly--Ser

Sequenz A

Parallel dazu wurde die Nukleotidsequenz vom 5' Ende des Gens, das durch pPC 8.3 und pPG 4.0 codiert wird, bestimmt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für die Aminosäuren 2-19 (siehe Sequenz B), die sich von den DNA-Sequenzen sowohl der genomischen als auch der cDNA- Klone ergab, stimmte perfekt mit den ersten 18 Aminosäuren der oben bestimmten Aminosäuresequenz (Sequenz A) für die isolierte Pichia pastoris Alkoholoxidase überein: Vorhergesagte Aminosäuresequenz Nukleotidsequenz

Sequenz B

Zusätzlich wurde die gesamte Nukleotidsequenz für die codierende Region des Alkoholoxidase-Gens bestimmt. Die bestimmte Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz werden in Sequenz B' fortgesetzt und es wird geglaubt, daß sie sind: Vorhergesagte Aminosäuresequenz Nukleotidsequens
Ein Vergleich der obigen Nukleotidsequenz mit der publizierten Nukleotidsequenz (Ledeboer et al.) für die früher beschriebene Alkoholoxidase von Hansenula polymorpha zeigt zahlreiche signifikante Unterschiede, einschließlich der abgeleiteten Aminosäuresequenz, der tatsächlichen Größe des Gens (und des resultierenden Proteins), der Codon-Verwendungsneigung, und ähnlichem.

Identifizierung von p76 als Dihydroxyacetonsynthase

Die Nukleotidsequenz für die ersten 51 Nukleotide des p76-Gens wurde durch Standardtechniken bestimmt. Von dieser Sequenz kann die Aminosäuresequenz für das aminoterminale Ende des p76-Proteins vorausgesagt werden: Aminosäuresequenz Nukleotidsequenz
Diese abgeleitete Aminosäuresequenz für p76 kann verglichen werden mit der publizierten Aminosäuresequenz für das Dihydroxyacetonsynthase (DHAS)-Protein von Hansenula polymorpha (Manowicz et al.). Obwohl verschiedene Unterschiede in der Sequenz auftauchen, gibt es Ähnlichkeiten zwischen den zwei Proteinen, die wahrgenommen werden können: Pichia DHAS Hansenula
Basierend auf dem signifikanten Homologie-Grad und der ähnlichen Protein-Größe (ungefähr 76.000 Dalton) von Pichia p76 und Hansenula DHAS, wurde p76 versuchsweise als DHAS von Pichia identifiziert.
Wie oben bei dem Alkoholoxidase-Gen zeigte ein Vergleich der Nukleotidsequenz für die ersten 51 Nukleotide des Pichia DHAS-Proteins mit der früher publizierten (Janowicz et al.) Nukleotidsequenz von Hansenula DHAS zahlreiche Unterschiede in der Codon-Verwendungsneigung, der abgeleiteten Aminosäuresequenz, der Gesamtgröße des Gens, usw.

DNA-Fragmente, die regulierbare Promotoren von Pichia Pastoris enthalten

Die 5' regulatorischen Regionen der Erfindung sind detailliert in den Restriktionskarten in den Fig. 4, 5 und 6 gezeigt. Die 5' regulatorische Region, die die Expression von Polypeptid p76 kontrolliert, ist innerhalb des DNA-Fragments, das in Fig. 4a gezeigt ist, lokalisiert. Es wurde klar gezeigt, daß das ungefähr 2,9 Kilobasenpaar HindIII-XhoI- Fragment die regulatorische Funktion, wie sie unten detaillierter dargestellt wird, enthält. Weil cDNA-Klon pPC 15.0 keine cDNA vollständiger Kopie ist, ist es sehr wahrscheinlich, daß mindestens ein Teil des in Fig. 4a gezeigten DNA-Fragments strukturelle codierende Sequenzen für Polypeptid p76 enthält. Somit wird angenommen, daß die regulatorische Funktion in dem ungefähr 1.300 Basen-Paar HindIII-EcoRI-Fragment, gezeigt in Fig. 4b, liegt. Neue β-Galaktosidasegen enthaltene Konstrukte, unten in größerer Einzelheit diskutiert, unterstützen diese Annahme.
Die 5' regulatorische Region, die die Expression von Polypeptid p72 (Alkoholoxidase) kontrolliert, ist innerhalb des ungefähr 2000 Basen-Paar EcoRI-EcoRV-DNA-Fragments, das in Fig. 5 gezeigt ist, lokalisiert. Neue β-Galaktosidasegen enthaltene Konstrukte, wie unten diskutiert, zeigen die regulierbare Natur dieses DNA-Fragments.
Fig. 6 zeigt eine Restriktionskarte für das ungefähr 3 Kilobasen-Paar BamHI-SalI-DNA-Fragment, das die 5' regulatorische Region enthält, die die Produktion von Polypeptid p40 kontrolliert. Dieses Fragment ist klar von den 5' regulatorischen Regionen, die detailliert in den Fig. 4 und 5 dargestellt sind, auf der Basis, unter anderem, von den verschiedenen Restriktionsstellen, die innerhalb des DNA-Fragments lokalisiert sind, unterscheidbar.
Fig. 10, 2a und 11 zeigen Restriktionsenzymdaten für die regulatorischen Regionen plus Strukturgene für Polypeptide p76, p72 (Alkoholoxidase) bzw. p40. Daher zeigt Fig. 10 Details für das 3,8 Kilobasen- Paar HindIII-PstI-Fragment von Pichia pastoris genomischer DNA, welches die Herstellung von Polypeptid p76 kontrolliert und codiert. Fig. 2a handelt von dem 4,0 Kilobasen-Paar EcoRI-PvuII-Fragment von Pichia pastoris genomischer DNA, das die Produktion von Polypeptid p72 (Alkoholoxidase) kontrolliert und codiert. Fig. 11 zeigt das 3,7 Kilobasen-Paar BamHI-EcoRV-Fragment von Pichia pastoris genomischer DNA, das die Herstellung von Polypeptid p40 kontrolliert und codiert.
Die genomischen Klone pPG 6.0, pPG 4.0 und pPG 4.8 wurden auch durch Restriktions-Kartierung charakterisiert. Somit ist Klon pPG 6.0 detailliert in Fig. 1a dargestellt. Als Referenzpunkt wird das 5' Ende des DNA-Fragments als Ursprung angenommen. Klon pPG 6.0 ist ein HindIII-Fragment von Pichia pastoris chromosomaler DNA, der ungefähr 6 Kilobasen-Paare lang ist und durch verschiedene Restriktionsenzyme wie folgt geschnitten wird: Restriktionsenzym Schnittstellen Abstand vom Ursprung
Klon pPG 4.0 wird im Detail in Fig. 2a illustriert. Der Klon ist ein EcoRI-HindIII-Fragment chromosomaler DNA, der ungefähr 4 Kilobasen- Paare lang ist. Bezogen auf das 5' Ende des Klons als Ursprung, wurden die folgenden Restriktions-Daten für pPG 4.0 erhalten: Restriktionsenzyme Schnittstellen Abstand vom Ursprung
Klon pPG 4.8 wird im Detail in Fig. 3a illustriert. Der Klon ist ein 4.8 Kilobasen-Paar BamHI-EcoRI-Fragment von Pichia pastoris chromosomaler DNA mit den folgenden zusätzlichen Restriktions-Stellen: Restriktonsenzyme Schnittstellen Abstand vom Ursprung
Die genomischen Klone pPG 6.0, pPG 4.0 und pPG 4.8 wurden manipuliert durch Insertion in einmalige Restriktions-Stellen auf dem E. coli Plasmid pBR322. Klon pPG 6.0, der ein HindIII-Fragment ist, wurde passend in die HindIII-Stelle von pBR322 kloniert. Klon pPG 4.0 wurde in die EcoRI-PvuII-Stellen von pBR322 kloniert und Klon pPG 4.8 wurde in die EcoRI-BamHI-Stellen von pBR322 (siehe Beispiel VI) kloniert. E. coli Stämme, die mit diesen Plasmiden transformiert worden waren, wurden beim Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, hinterlegt, um der Öffentlichkeit nach Erteilung eines Patentes auf diese Anmeldung freien Zugang zu sichern. Den hinterlegten Stämmen wurden die folgenden Hinterlegungsnummern gegeben: Genomische Klasse Labor-Bezeichnung Hinterlegungs-Nr.
Fig. 7, 8 und 9 zeigen die Restriktionskarten-Daten für die 3' regulatorischen Regionen der Polypeptide p76, p72 (Alkoholoxidase) bzw. p40. Die 3' regulatorischen Regionen sind nützlich für die Kontrolle der Polyadenylation, Termination der Transkription und Termination der Translation von Messenger RNA, welche durch die vorhergehenden Nukleotidsequenzen codiert wird. Somit ist die 3' regulatorische Region des Polypeptid p76-Gens, ein 2,7 Kilobasenpaar EcoRI-HindIII-Fragment, das in Fig. 7 gezeigt ist, nützlich für sowohl die Kontrolle der Polyadenylation als auch der Termination der Transkription und Termination der Translation von mRNA, welche für Polypeptid p76 codiert, oder irgendeine andere mRNA, die von einem Gen, das "upstream" der 3' regulatorischen Region insertiert ist, stammt. Das 0,2 Kilobasen-Paar StuI- PvuII-Fragment des p72-Gens, detailiert in Fig. 8a dargestellt, das 0,3 Kilobasen-Paar StuI-HindIII-Fragment des p72-Gens, detailliert in Fig. 8b dargestellt, das 3,2 Kilobasen-Paar SalI-EcoRI-Fragment des p72-Gens und das 1,9 Kilobasen-Paar SalI-EcoRI-Fragment von p40-Gen, detailliert in Fig. 9 dargestellt, haben ähnliche Verwendungen, sowohl in Hinsicht auf die Strukturgene, mit welchen sie in Wildtyp Pichia pastoris assoziiert sind, und irgendwelchen fremden (d. h. heterologen) Genen, welche "upstream" dieser 3' regulatorischen Region insertiert werden können.
Weil das Alkoholoxidase-Gen in pPG4.0 innerhalb weniger hundert Basenpaare der AO-Gen-Transkriptions-Terminations-Stelle endet, wurde die zusätzliche 3' Sequenz, detailliert in Fig. 8c dargestellt, wie folgt erhalten. Der erste Schritt war, Pichia chromosomale DNA mit EcoRI und SalI zu verdauen, und die verdaute DNA mit einem 2,0 kbp ³²Pmarkierten BamHI-HindIII-Fragment des AO-Gens mittels der Southern Blot-Methode zu hybridisieren. Unter den Pichia EcoRI-SalI-Verdau- Fragmenten, welche mit der AO-Gen-Sonde hybridisierten, war ein 3,2 kbp-Fragment, das den 3' Teil des AO-Gens und die Sequenzen, die den 3' Terminus des Gens flankieren, codiert.
Das 3' AO-Gen-Fragment wurde dann kloniert durch Erhalten von Eco- RI-SalI-geschnittenen Pichia DNA-Fragmenten von ungefähr 3,2 kbp mittels Gen-Elution und Insertieren der Fragmente in EcoRI und SalIverdautes pBR322. Schließlich wurde ein rekombinantes Plasmid, pPG3.2, das das 3' AO-Gen-Fragment enthielt, durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung des markierten AO-Gen-Fragments als Sonde identifiziert. Ein E. coli-Stamm, der mit Plasmid pPG 3.2 transformiert worden ist, wurde beim Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, hinterlegt. Der hinterlegte Stamm erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL B-15999. Fig. 8c zeigt eine Restriktionsendonuklease-Schnittstellenkarte des Pichia DNA-Fragments von pPG 3.2. Das Fragment enthält ungefähr 1,5 kbp, das den 3' Teil von AO (von SalI bis HindIII) codiert und ungefähr 1,7 kbp der Sequenz 3' des AO Gens.

Charakterisierung der cDNA-Klone

Die cDNA-Klone für die regulierbaren Gene von Pichia pastoris wurden auch durch Restriktions-Kartierung charakterisiert. In Fig. 12 ist die p76 cDNA, ein 1,1 Kilobasen-Paar-Fragment detailliert gezeigt. Bezogen auf das 5, Ende der DNA-Sequenz als Ursprung, schneidet das Restriktionsenzym XhoI p76-cDNA ungefähr 500 Basenpaare vom Ursprung, HincII schneidet ungefähr 950 Basenpaare vom Ursprung und EcoRI schneidet p76-cDNA ungefähr 1050 bis 1100 Basenpaare vom Ursprung. Der cDNA-Klon, der in Fig. 12 gezeigt ist, ebenso wie die cDNA-Klone, die in den Fig. 13 und 14 gezeigt sind, sind alle mit PstI-Enden gezeigt. Diese sind künstlich erzeugte Restriktionsstellen, die durch G-C-"Tailing" der anfangs erhaltenen komplementären DNA hergestellt worden sind, um die Klonierung der DNA-Fragmente in pBR322 zu erleichtern. Basierend auf Northern-Hybridisierungs-Studien und auf der Größe des Polypeptidproduktes wird geschätzt, daß der cDNA-Klon pPC 15.0 eine inkomplette Kopie von p76 mRNA ist, wobei er nur ungefähr die Hälfte der gesamten Messenger RNA-Sequenz darstellt.
In Fig. 13 wird eine zusammengesetzte Restriktions-Karte für p72 (Alkoholoxidase) cDNA, die durch Überlappen der Klone pPC 8.3 und pPC 8.0 konstruiert worden ist, dargestellt. Wie oben wird das 5' Ende der DNA-Sequenz als Ursprung angenommen. Somit erhält man durch Behandlung von Alkoholoxidase cDNA mit einer Vielzahl von Restriktionsenzymen, die folgenden Größenfragmente: Restriktionsenzyme Schnittstellen Abstand vom Ursprung
Restriktionsenzym-Kartierung des 3' Endes des Alkoholoxidase-Gens in den Klonen pPC 8.0 und pPC 8.3 zeigt, daß dem cDNA-Klon pPC 8.3 ungefähr 250 Nukleotide der Alkoholoxidase mRNA-Sequenz (Fig. 2) fehlen. Die am 3' Ende der Alkoholoxidase mRNA vorhandene Sequenz ist vorhanden im cDNA-Klon pPC 8.0, der pPC 8.3 ungefähr 500 Nukleotide überlappt.
Fig. 14 zeigt eine Restriktions-Karte für die cDNA von Polypeptid p40, ein 1,2 Kilobasen-Fragment. Bezogen auf das 5' Ende des cDNA-Klons als Ursprung, wird Klon pPC 6.7 durch SalI (und HincII) ungefähr 1000 Basen vom Ursprung geschnitten.
Jedes der cDNA-Fragmente wurde in pBR322 kloniert, welches dann in E. coli transformiert wurde. Die transformierten Stämme wurden beim Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois hinterlegt. Die hinterlegten Stämme erhielten die folgenden Hinterlegungs-Nummern: cDNA-Klone Labor-Bezeichnung Hinterlegungs-Nr.
Jeder der oben beschriebenen cDNA-Klone war verwendbar als Sonde für die Identifizierung und Isolierung von chromosomaler DNA, die für die Herstellung von Polypeptiden codierte, die einzigartig für das Wachstum von Hefe auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle sind. Deshalb, wie schon beschrieben, wurden diese Klone verwendet zur Identifizierung von P. pastoris chromosomalen DNA-Fragmenten, die die regulatorischen Regionen und strukturellen Codierungs-Informationen für die einzigartigen Polypeptide, die beobachtet wurden, wenn P. pastoris auf Methanol wächst, enthielten. In ähnlicher Weise haben diese cDNA- Klone Verwendung als Sonden für die Identifizierung und Isolierung von analogen Genen von anderen Methanol-assimilierenden Hefen wie, z. B. Torulopsis molischiana, Hansenula capsulatum, H. nonfermantens und ähnlichem (siehe Beispiel XVII).

Detaillierte Analyse des Alkoholoxidase-Gens

Die 5, regulatorische Region von Klon pPG 4.0 wurde weiter charakterisiert durch Bestimmung der Nukleotidsequenz des Klons upstream (5') von dem Punkt, wo die Strukturinformation für p72 (Alkoholoxidase) codiert ist. Die ersten 250 Nukleotide vor der mRNA-Translationsstartstelle (ATG-Codon) sind:

Sequenz C

Es wird angenommen, daß die Promotor-Funktion von Klon pPG 4.0 innerhalb dieser Nukleotid-Basensequenz enthalten ist.
Um dieses neue DNA-Fragment vollständiger zu beschreiben, wurden zusätzliche 301 Nukleotide weiter "upstream" von der in der obigen Sequenz C gezeigten Sequenz bestimmt. Somit wird angenommen, daß die ersten 551 Nukleotide vor dem mRNA-Translations-Start sind:

Sequenz D

Es wird angenommen, daß die in Sequenz D (verglichen mit Sequenz C) zusätzlich enthaltenen Nukleotide mittels eines unbekannten Mechanismus der Promotorregion, die innerhalb von Sequenz C enthalten ist, zusätzliche regulatorische Funktionen verleihen. Es sollte erkannt werden, daß Sequenz D nur teilweise DNA-Sequenzen für das 1,1 kbp DNA-Fragment dargestellt, das in den Beispielen XIV und XV als fähig gezeigt ist, die Genexpression in Hefe zu kontrollieren. Es kann sein, daß zusätzliche Kontroll-Funktionen in dem Teil des 1,1 kbp DNA-Fragments, der nicht in Sequenz D gezeigt sind, codiert sind.
Um dieses neue 1,1 kbp DNA-Fragment weiter zu beschreiben, wurde zusätzliches Nukleotidsequenzieren ausgeführt, um die Nukleotidsequenz des gesamten 1,1 kbp DNA-Fragments, das in den Beispielen XIV und XV als fähig gezeigt ist, die Genexpression in Hefe zu kontrollieren, vollständig zu bestimmen. Die Nukleotidsequenz wird als Sequenz D' fortgesetzt:

Sequenz D'

Es wird durch einen Fachmann erkannt, daß zusätzliche Kontrollfunktionen, relativ zu den Sequenzen C und D, in dem Teil von Sequenz D' codiert sein können, welcher weiter "upstream" (d. h. in 5' Richtung) der Nukleotidsequenzen, die in den Sequenzen C und D dargestellt sind, ist.
Um zu bestimmen, wo die RNA-Transkription für das Alkoholoxidase- Gen initiiert ist, wurden die DNA-Sequenzen um das 5' Ende dieses Gens vom genomischen Klon pPG 4.0 und vom cDNA-Klon pPC 8.3 miteinander verglichen. Der cDNA-Klon pPC 8.3 enthält ungefähr 100 Nukleotide einer untranslatierten Region 5' zum Alkoholoxidase-Gen. Basierend auf dieser Sequenz wurde ein Oligonukleotid mit 15 Basen (5' CTTCTCAAGTTGTCG-3') komplementär in Hinsicht auf die Nukleotide -29 bis -43, wobei das A der Translations-Startstelle (ATG-Codon) als + 1 bezeichnet wird und das G in 5' Richtung als -1 bezeichnet wird, synthetisiert (siehe Beispiel IX) und als "Primer" verwendet, um die Alkoholoxidase mRNA zum Erreichen des 5' Endes zu verlängern. Die cDNA-Sequenz, die durch dieses "Primer-Extension-Experiment" erhalten wurde, zeigte drei verschiedene Transkriptions-Start-Punkte für Pichia pastoris Alkoholoxidase mRNA. Das Haupttranskript beginnt 114 Nukleotide vom Transkriptions-Start-Codon. Zwei weniger bedeutende alternative Transkripte beginnen 117 und 111 Nukleotide upstream (5') vom Alkoholoxidase AUG Codon.
Die 55 Nukleotide, die dem Start der Alkoholoxidase mRNA vorausgehen, enthalten eine mutmaßliche Goldberg-Hogness Box (TATAA-Box). Die Sequenz TATAAA kommt bei Position -40 vom 5' Ende des Haupt- Transkripts für Alkoholoxidase mRNA vor, und deshalb 165 Nukleotide "upstream" des Start-Codons für dieses Protein.
Die 3' regulatorische Region des Alkoholoxidase-Gens wurde weiter charakterisiert durch Bestimmung der Nukleotidsequenz für ungefähr 120 Nukleotide "downstream" der Stelle, wo die strukturelle Information für p72 (Alkoholoxidase) codiert ist. Die Sequenz wird unten als Sequenz D'' fortgesetzt:

Sequenz D''

Detaillierte Analyse des p76-Gens

Die 5' regulatorische Region von Klon pPG 6.0 wurde weiter charakterisiert durch Bestimmung der Nukleotidsequenz des Klons "upstream" (5') von der Stelle, wo die strukturelle Information für p76 codiert ist. Es wird angenommen, daß die ersten 622 Nukleotide vor der mRNA- Translations-Start-Stelle (ATG-Codon) sind:

Sequenz D'''

Es wird angenommen, daß die Promotor-Funktion von pPG 6.0 innerhalb dieser Sequenz von Nukleotid-Basen enthalten ist, obwohl der Fachmann bemerkt, daß zusätzliche regulatorische Eigenschaften durch Sequenzen weiter "upstream" der Sequenzen, die als Sequenz D''' präsentiert worden sind, verliehen werden können.
Die 3' regulatorische Region von Klon pPG 6.0 wurde weiter charakterisiert durch Bestimmung der Nukleotidsequenz für ungefähr 180 Nukleotide "downstream" (3') von der Stelle, wo die p76 strukturelle Information codiert ist. Die Sequenz wird unten als Sequenz D'''' fortgesetzt:

Sequenz D''''

Expression in transformierter Hefe

Die oben beschriebenen Plasmide der vorliegenden Erfindung haben Verwendung in Hefe-Stämmen, die transformiert werden können. Regulation der Genexpression in Hefe durch die neuen DNA-Fragmente der vorliegenden Erfindung kann erreicht werden, indem man die transformierten Organismen einem Kohlenstoffquellen-Mangel aussetzt. Kohlenstoffquellen-Mangel nach Wachstum auf einer Vielzahl von sowohl Katabolit reprimierenden als auch Nicht-Katabolit reprimierenden Kohlenstoffquellen induziert die Expression des Genprodukts, das unter der Kontrolle der regulatorischen Regionen der Erfindung gehalten wird. Ein anderes Mittel, um Expression des gewünschten Genprodukts in geeigneten Species von transformierten Hefen zu erreichen, ist, die transformierten Hefen auf Methanol wachsen zu lassen. Ein weiteres Mittel, um die Expression des gewünschten Genprodukts zu induzieren, ist, die transformierte Hefe auf einem Medium, das Nicht-Katabolit reprimierende Kohlenstoffquellen enthält, wachsen zu lassen.
Die regulatorischen Regionen dieser Erfindung sind für die Expression in allen Hefestämmen nützlich, weil sich gezeigt hat, daß die regulatorischen Regionen unter einer Vielzahl von Bedingungen induziert werden können. Somit können Hefen, die fähig sind, auf Methanol oder einer Nicht- Katabolit reprimierenden Kohlenstoffquelle zu wachsen, veranlaßt werden, fremde, d. h. heterologe Polypeptide direkt herzustellen; während Hefen, die fähig sind, auf Katabolit reprimierenden Kohlenstoffquellen zu wachsen, veranlaßt werden können, fremde Polypeptide herzustellen durch Aussetzen der so gewachsenen Hefezellen in Bedingungen von Kohlenstoffquellen-Mangel.
Transformierte Hefestämme, welche für das Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, enthalten Mitglieder der Gattungen:
Candida,
Kloeckera,
Saccharomyces,
Schizosaccharomyces,
Rhodoturula,
Hansenula,
Torulopsis,
Pichia, und
Kluyveromyces.
Hefen dieser Gattungen sind bevorzugt, weil ihre Sicherheit der Handhabung, ihre Wachstumsbedingungen und ähnliches etabliert sind und dem Fachmann wohlbekannt sind.
Besonders bevorzugte Hefestämme zur Verwendung in einem der Ausführungsbeispiele des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind solche Hefe-Stämme, die fähig sind, auf Methanol als Kohlenstoff-Energie-Quelle zu wachsen. Hefen, die fähig sind, auf Methanol zu wachsen, enthalten Mitglieder der Gattungen:
Candida,
Kloeckera,
Saccharomyces,
Rhodoturula,
Hansenula,
Torulopsis, und
Pichia.
Weil die regulatorischen Regionen der vorliegenden Erfindung auch durch Wachstum auf sowohl Nicht-Katabolit reprimierenden Kohlenstoffquellen als auch durch Bedingungen von Kohlenstoffquellen-Mangel induziert werden können, sind die Hefe-Stämme, welche fähig sind, auf solchen nicht-methanolischen Substraten zu wachsen wie:
Glucose,
Acetat,
Glycerin,
Ethanol,
Lactose,
Galactose,
Fructose,
Sucrose,
und ähnlichen und Mischungen von zwei oder mehreren davon auch brauchbar für die Ausführung der Erfindung. Durch Wachsen des Wirt- Organismus auf einer geeigneten Nicht-Katabolit reprimierenden, nichtmethanolischen Kohlenstoffquelle wie, z. B. Glycerin und Galactose, oder durch Wachsen des Wirt-Organismus auf einer geeigneten Katabolit reprimierenden Kohlenstoffquelle wie, z. B. Ethanol, Glucose und Fructose und danach Aussetzen des Wirt-Organismus in Kohlenstoffquellen-Mangel- Bedingungen, kann die Expression eines Genprodukts unter der Kontrolle der regulatorischen Regionen der Erfindung erreicht werden.
Zusätzlich, weil die regulatorischen Regionen der Erfindung auf eine Vielzahl von Wachstums-Bedingungen ansprechen, sowohl in Bezug auf Induktion und Repression der Expression, kann die regulierte Expression als Genprodukt unter der Kontrolle der regulatorischen Regionen dieser Erfindung erreicht werden. Somit läßt man Zellen z. B. auf einer Kohlenstoffquelle wachsen, die nur geringe Level einer fremden Genexpression induziert, dann wechselt man sie über in Methanol, das stark die Genexpression induzieren wird. Alternativ kann die regulierte Genexpression durch Verwendung von Mischungen von induzierenden/reprimierenden "Nahrungsstoffen", wie z. B. Methanol-Glucose-Mischungen, erreicht werden. Als eine andere Alternative können die hohen Expressions-Level, die durch das Wachstum auf Methanol erzeugt werden, wie gewünscht reduziert werden durch Zusatz einer reprimierenden Kohlenstoffquelle, wie Glucose oder Ethanol, zu den Wachstums-Medien. Natürlich erkennt der Fachmann, daß andere Variationen der Nahrungsmischungen und Reihenfolge der Nahrungseingabe möglich sind und einen großen Teil der Kontrolle über die Level der Genexpression, die aus der Erfindung der regulatorischen Regionen erhalten werden, gewährleisten.
Ein speziell bevorzugter Wirt-Hefestamm ist die Mutante Pichia pastoris GS 115, welche eine Mutante ist, die einen Defekt hat in der Möglichkeit, Histidin zu produzieren und somit bezeichnet wurde, daß sie den mutanten Genotyp his4 hat. GS 115 stammt von Pichia pastoris NRRL Y-11430 und wurde beim Northern Regional Research Center of the United States Department Agriculture in Peoria, Illinois hinterlegt, um ihn öffentlich zugänglich zu machen. Pichia pastoris GS 115 erhielt die Hinterlegungs-Nummer NRRL Y-15851 am 31. August 1984. Dieser spezielle Wirt ist nützlich, weil er eine auxotrophe Mutante ist, die Defekte im Histidin-Stoffwechsel hat. Transformation dieses Wirts mit einem Vektor, der unter anderen DNA-Sequenzen die HIS4-Gen-Funktion enthält, erlaubt die einfache Selektion auf den transformierten Wirt.
Weil die regulatorischen Regionen der vorliegenden Erfindung sich auch als brauchbar erwiesen haben für die regulierte Expression von heterologen Genprodukten in Hefe-Stämmen der Gattung Saccharomyces, für welche eine große Anzahl von auxotrophen Mutanten bekannt ist, enthalten zusätzliche bevorzugte Wirt-Hefestämme ATCC 24683 (eine 1, 1, 2, 1, 1, 1 Mutante), ATCC 24684 (eine 1, 1, 7 1, 1 Mutante), ATCC 32810 (eine 5, 4, 5, 1, 2, 2 Mutante), ATCC 34182 (eine 3, , , Mutante), ATCC 34352 (eine 2 Mutante), ATCC 34353 (eine 2 Mutante), ATCC 38523 (eine 1, 1 Mutante), ATCC 38626 (eine 2 4 Mutante), ATCC 38660 (eine 4, 2 4 Mutante), ATCC 42243 (eine 3 Mutante), ATCC 42336 (eine 1, 4, 4 Mutante), ATCC 42403 (eine 4, 7 Mutante), ATCC 42404 (eine 1, 4, 2 Mutante), ATCC 42564 (eine 1, 6 Mutante), ATCC 42596 (eine 4, 2, 1 Mutante), ATCC 42957 (eine 4, 2, 4, 5 Mutante), ATCC 42950 (eine Mutante), ATCC 42951 (eine , mutante), ATCC 44069 (eine 1 Mutante), ATCC 44070 (eine 2, 4 Mutante), ATCC 44222 (eine 4 Mutante), ATCC 44376 (eine 4, 2 Mutante), ATCC 44377 (eine 4, 1 Mutante), und ähnliche, die dem Fachmann leicht zugänglich sind.
Es wird durch den Fachmann erkannt, daß brauchbare Wirt-Stämme nicht auf auxotrophe Mutanten limitiert sind. Somit stellt die Transformation von prototrophen Stämmen mit positiven Selektions-Markern, wie z. B. Antibiotika-Resistenz-Genen, auch ein brauchbares Mittel bereit für die Detektion und Isolation von transformierten Stämmen.
Escherichia coli ist auch ein brauchbarer Wirt für die Plasmide der Erfindung. Der Fachmann erkennt, daß viele Stämme von E. coli brauchbare Wirte sind. Verschiedene Stämme, die in der vorliegenden Arbeit verwendet worden sind, sind unten aufgelistet:
Stamm-Bezeichnung Hinterlegungs-Nummer
MC1061 nicht bekannt
LE392 ATCC #33572
MM294 ATCC #33625

Pichia pastoris-Transformations-Verfahren

Die Transformation von Pichia pastoris ist bisher nicht beschrieben worden. Die experimentellen Vorgehensweisen für die Transformation von Pichia pastoris werden im größeren Detail unten präsentiert (Beispiel XII). Um ein Transformations-System für P. pastoris zu entwickeln, wurde die auxotrophe Mutante GS115 (NRRL Y-15851) isoliert und es wurde bestimmt, daß sie einen Defekt im Histidin-Stoffwechsel in der Weise hat, daß der Stamm keine detektierbare Histidinol-Dehydrogenase- Aktivität hat.
GS115 (NRRL Y-15851) kann durch enzymatischen Verdau der Zellwände, um Spheroplasten zu ergeben, transformiert werden; die Spheroplasten werden dann mit der transformierenden DNA gemischt und in der Anwesenheit von Calciumionen und Polyethlylenglycol inkubiert, und dann in einem selektiven Wachstums-Medium, dem Histidin fehlt, regeneriert. Die transformierende DNA enthält das HIS4-Gen, in welchem der Wirts-Stamm einen Mangel hat, somit überleben nur transformierte Zellen auf dem verwendeten selektiven Wachstums-Medium.

Isolation des Pichia pastoris HIS4-Gens

Das HIS4-Gen wurde aus dem Stamm P. pastoris NRRL Y-11430 durch partiellen Verdau von Gesamt-chromosomaler DNA mit Sau3A, dem eine Zentrifugation über einen Sucrose-Gradienten folgte, isoliert (siehe Beispiel XIII). Fragmente von 5 bis 20 kbp wurden in die BamHI-Schnittstelle von S. cerevisiae-E. coli Shuttle Vector YEp13 (ATCC 37115; Fig. 33) kloniert und in E. coli transformiert. Ungefähr 50.000 Kolonien wurden kombiniert und Gesamt-Plasmid-DNA extrahiert. Spheroplasten von S. cerevisiae Stamm 5799-4D (NRRL Y-15859), eine his4ABC-Mutante, wurden mit ungefähr einem ug von YEp 13 Pichia DNA-Bibliothek mittels des Verfahrens von Hinnen et. al. (1978) gemischt und sie durften in einem Medium, dem Histidin fehlte, regenerieren. Die Transformation ergab ungefähr 1·10³ prototrophe Hefe-Kolonien aus einer Population von 5·10&sup7; gesamt-regenerierbaren Spheroplasten. Eine parallele Kontrollprobe, die ohne DNA inkubiert worden war, erzeugte keine Kolonien. Gesamt-Hefe-DNA wurde aus 20 der His+ Kolonien extrahiert und in E. coli zurücktransformiert. 17 der Hefe-DNA-Präparationen erzeugten Ampicillin-resistente Kolonien. Diese klonierten Fragmente wurden weiter charakterisiert durch sowohl Restriktionsenzym- Größenkartierung als auch durch ihre Fähigkeit zur Kreuz-Hybridisierung mit einem markierten S. cerevisiae HIS4-Fragment bei geringer Stringenz (Waschen nach der Hybridisierung in 2x SSC bei 55ºC) durch die in Beispiel XIII, §G beschriebene Methode. HIS4-enthaltene Plasmide enthielten jedes ein oder mehrere Fragment(e), das (die) mit dem S. cerevisiae HIS4-Gen hybridisierte(n). Ein solches HIS4-enthaltenes Plasmid wurde neu kloniert, um ein HIS4-enthaltenes Plasmid, das als pYJ8 bezeichnet wurde und in Fig. 25 gezeigt ist, zu ergeben. Plasmid pYJ8 enthält pBR 325 Sequenzen, einschließlich Chloramphenicol- und Ampicillin-Resistenzgen, ebenso wie das Pichia HIS4-Gen.
Das ARG4-Gen wurde aus P. pastoris NRRL Y-1 1430 unter Verwendung eines analogen Protokolls und des Arg&supmin; S. cerevisiae-Stammes S2072A (eine arg4 leu2 trp1 gal2 Mutante; erhalten aus dem "Yeast Genetic Stock Center, Berkely, CA") isoliert.
Ein Fachmann erkennt, daß andere Marker-Gene von Pichia ähnlich isoliert werden können unter Verwendung von S. cerevisiae-Stämmen mit entsprechendem Mangel.

Isolation von Pichia pastoris Autonom-Replizierenden- Sequenzen

Eine andere brauchbare Komponente der Vektoren der vorliegenden Erfindung sind aus Pichia stammende Autonom-Replizierende-Sequenzen (PARS), welche sowohl die Transformations-Frequenz von GS115 (NRRL Y-15851) als auch die Beibehaltung des Plasmids als stabiles extrachromosomales Element verbessern.
Um nach Pichia ARSen zu suchen, wurde DNA aus Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) partiell mit TaqI verdaut und 5 bis 10 kbp Fragmente wurden isoliert und in die einzige ClaI-Stelle von pYJ8ΔCla (siehe Fig. 26) kloniert. Plasmid-DNA wurde aus ungefähr 10.000 His+ Pichia-Kolonien gewonnen und zur Transformation von E. coli verwendet. Plasmide aus ungefähr 10.000 Ampicillin-resistenten Kolonien wurden isoliert und dann in GS 115 zurücktransformiert. Vierzig der His + Hefe- Kolonien von dieser "Unterbibliothek''-Transformation wurden separat auf selektives Medium gestrichen und in separaten Kulturen in selektivem Medium wachsen gelassen. Gesamt-Hefe-DNA wurde von jeder dieser 40 Kulturen extrahiert und in E. coli transformiert. Zwei Plasmide, pYA63 (PARS 1) und pYA90 (PARS2), deren Hefe-DNA-Präperationen, die am meisten Ampicillin-resistenten E. coli Kolonie produzierten, wurden für die weitere Analyse selektiert. Beide Plasmide transformierten Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) mit einer sehr hohen Häufigkeit und jedes enthielt ein Insert fremder DNA.
Als ein Maß für die Fähigkeit der ARSen die Plasmide als autonome Elemente in Pichia zu behalten, wurden Kulturen von Hefe-Zellen, die mit jedem Plasmid transformiert worden waren, in selektivem Medium wachsen gelassen und es wurden periodisch Proben entnommen. Der Zustand der Plasmid-Sequenzen in den Zellen wurde durch Southern-Hybridisierung von nicht-geschnittenen Hefe-DNAs mit radioaktiv-markiertem pBR325 bestimmt. Die Plasmide pYA63 und pYA90 blieben in Pichia für mindestens 10 Generationen in selektivem Medium erhalten (aber sie waren nach 50 Generationen integriert).
Eine der mutmaßlichen Pichia Autonom-Replizierenden-Sequenzen (PARS1) wurde in verschiedene andere Pichia-Vektoren kloniert, um ihre Fähigkeit zu prüfen, die transformierende DNA als autonomes Element zu behalten. Die Plasmide pYJ30 (Fig. 27) und pBPf1 (Fig. 34) waren noch als autonome Elemente nach 20 Wachstums-Generationen auf selektivem Medium (His&supmin;) vorhanden und waren in mehreren Kopien pro Zelle vorhanden. Southern Blot-Analyse von mit pYJ30 transformierten Zellen zeigte ungefähr 10 Kopien pro Zelle.
Um zu bestimmen, ob die Plasmide pSA0H5 (siehe Fig. 18) und pT76H4 (siehe Fig. 22b), welche PARS1 durch pYJ30 bzw. pBPf1 eingebracht enthielten, den Plasmiden von denen sie stammten ähnliche Stabilität vermitteln, wurden Zellen, die diese Vektoren enthalten, unter selektiven Bedingungen für ungefähr 50 Generationen unter selektiven Bedingungen (His&supmin;) in Anwesenheit von Glucose wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann in nicht-selektive Bedingungen (His&spplus;) übergewechselt und der Verlust der Prototrophie wurde überwacht. Die Stabilität dieser Plasmide war mit der Stabilität von pYJ30 vergleichbar, einschließlich dem schnellen Verlust der His-Prototrophie nach Überwechseln in nichtselektive Medien. Somit wird angenommen, daß diese Experimente, die mit Plasmiden ausgeführt wurden, die die Autonom-Replizierende-Sequenz, PARS 1, enthalten, Ergebnisse über die Genexpression autonomer Plasmid-DNA bereitstellen.

Neue β-Galaktosidasegen enthaltene Konstrukte

Um die Fähigkeit der regulatorischen Regionen dieser Erfindung, daß sie die Produktion von Proteinprodukten kontrollieren, zu demonstrieren, wurden neue DNA-Konstrukte hergestellt. Somit wurde das E. coli lacZ Gen in verschiedene Plasmide eingebaut und zwar unter der Kontrolle der regulatorischen Regionen der Gene, die Polypeptide p72 (Alkoholoxidase) oder p76 codieren. Die Präparation der Plasmide pSAOH 1, pSAOH5, pSAOH10, pTAFH.85, pT76H1, pT76H2, pT76H3 und pT76H4 ist im Beispiel XIV beschrieben.
Obwohl die Einführung der Fusion aus regulatorischer Region-β-Galaktosidasegen der Erfindung in Wirt-Hefezellen unter Verwendung von Plasmiden als Vehikel für die Einführung hier beschrieben ist, wird ein Fachman erkennen, daß es nicht für das regulatorische Region-Strukturgen-Konstrukt notwendig ist, in die Zelle via einem Plasmid eingeführt zu werden. Somit kann jedes Molekül, das fähig ist, in Hefe behalten zu werden, verwendet werden. Deshalb kann das regulatorische Region- Strukturgen-Konstrukt der Erfindung via anderen Vektoren als Plasmiden manipuliert werden. Alternativ kann das regulatorische Region-Strukturgen-Konstrukt in das Chromosom der Wirt-Hefezelle integriert werden.
Ein Fachmann erkennt auch, daß der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die Herstellung von β-Galaktosidase unter der Regulation der hier offenbarten regulatorischen Regionen limitiert ist. Die Vielzahl der Polypeptide, die unter der Regulation der regulatorischen Regionen der Erfindung hergestellt werden können, ist nur durch die Vorstellungskraft des Lesers limitiert. Viele Vorgehensweisen existieren für die Herstellung von DNA-Sequenzen, die für gewünschte Polypeptide codieren. Zum Beispiel können Oligonukleotide verschiedener Länge durch bekannte Verfahren synthetisiert werden. Verschiedene solcher Oligonukleotide können sich in längere, doppelsträngige Moleküle zusammenschließen und zwar als Folge ihrer spezifischen Basenpaarungseigenschaften. Die beteiligten Oligonukleotide dieses Doppelstrang-Moleküls können durch das Enzym DNA-Ligase miteinander verbunden (ligiert) werden. Alternativ können DNA-Moleküle mit der gewünschten Codierungs-Sequenz unter Verwendung des Enzyms Reverse Transcriptase synthetisiert werden, wobei die das gewünschte Polypeptid betreffende Messenger RNA als Matrize für die Tätigkeit der Reversen Transcriptase verwendet wird. Eine noch andere Möglichkeit ist das Klonieren von genomischen DNA-Fragmenten und das Beobachten, ob direkte Expression des gewünschten Produktes stattfindet.
Die DNA-Sequenz, die für das gewünschte Polypeptid codiert, kann für die Herstellung des regulatorischen Region-Strukturgen-Konstruktes durch eine Vielzahl von Verfahren modifiziert werden. Zum Beispiel können die Enden der wie oben hergestellten DNA mit dem Enzym DNA-Ligase zu kurzen doppelsträngigen DNA-Molekülen ligiert werden, sogenannte Linker-Moleküle, welche die Nukleotidsequenz enthalten, die durch spezifische Restriktionsendonukleasen erkannt wird. Verdau dieser Moleküle mit einer spezifischen Restriktionsendonuklease nach der Ligation wird Enden erzeugen, die der speziellen Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle an den Enden der hergestellten DNA-Sequenz entsprechen.
Drei spezifische regulatorische Region-β-Galaktosidasegen-Konstrukte, die im Laufe dieser Arbeit hergestellt worden sind, sind anhand der Restriktionskarten bzw. -daten, die in den Fig. 15 und 16 präsentiert sind, beschrieben. Die Restriktions-Karte, die in Fig. 15a präsentiert wird, beschreibt ein Konstrukt, das aus einem 0,85 Kilobasenpaar HindIII- BamHI Teil, der aus der 5' regulatorischen Region von pPG 6.0 und dem lacZ Gen von E. coli (gezeigt wird das 3,6 Kilobasenpaar BamHI- NrvI Fragment) stammt, umfasst. Dieses gleiche Konstrukt ist anwesend in jedem der Plasmide pTAFH.85, pT76H1 und pT76H2, die unten in größerem Detail beschrieben sind (siehe Beispiel XIV). Die Restriktionskarte, die in Fig. 15b präsentiert wird, beschreibt ein Konstrukt umfassend einen 1,3 Kilobasenpaar HindIII-EcoRI Teil, der von der 5' regulatorischen Region von pPG6.0 und dem lacZ Gen von E. coli stammt. Dasselbe Konstrukt ist anwesend in jedem der Plasmid pT76U 1, pT76H3 und pT76H4, die unten in größerem Detail beschrieben werden (siehe Beispiel XIV).
Fig. 16 ist eine Restriktionskarte eines Konstrukts umfassend ein 1.1 Kilobasenpaar EcoRI-BamHI Fragment, das aus einem Teil der 5, regulatorischen Region von pPG 4.0 und dem LacZ-Gen von E. coli stammt. Dieses Konstrukt ist anwesend in jedem der Plasmide pSAOH1, pSAOH5 und pSAOH10, die unten in größerem Detail beschrieben werden (siehe Beispiel XIV).
Plasmid pSAOH1 wird schematisch in Fig. 17 dargestellt. Zusätzlich dazu, daß es das fusionierte Produkt regulatorische Region-β-Galaktosidasegen, das in Fig. 16 gezeigt ist, enthält, wird gezeigt, daß das Plasmid enthält:
(a) pBR322-Sequenzen einschließlich dem Arnp®-Gen;
(b) Pichia pastoris HIS4-Gen;
(c) S. cerevisiae 2 um Ring-DNA; und
(d) das unterbrochene URA3 Gen von S. cerevisiae.
Das Plasmid hat deshalb die Fähigkeit in E. coli-Wirten und Hefe-Wirten zu transformieren und zu replizieren. Selektierbare Marker sind anwesend für die Manipulation von DNA in entweder E. coli- oder Hefe-Wirten.
Plasmid pSAOH5 wird schematisch in Fig. 18 dargestellt. Das Plasmid ist ähnlich zu dem oben beschriebenen pSAOH 1, außer, daß die S. cerevisiae 2 u Ring DNA und etwas der Pichia pastoris HIS4 Gen flankierenden DNA deletiert worden ist, während eine Pichia pastoris autonom replizierende Sequenz (PARS 1 von pYA63) hinzugefügt worden ist.
Plasmid pSAOH10 wird in Fig. 19 schematisch illustriert. Das Plasmid enthält:
(a) die Fusion von regulatorischer Region-β-Galaktosidasegen;
(b) pBR325 Sequenzen, einschließlich Genen, die eine Tetracyclin- Resistenz, Chloramphenicol-Resistenz und Ampicillin-Resistenz (tetR, camR, bzw. ampR) verleihen; und
(c) S. cerevisiae HIS4 Gen (erhalten aus Plasmid pYA2, wie unten beschrieben).
Die Plasmide pTAFH.85, pT76H 1 und pT76H2 sind analog zu den oben beschriebenen drei Plasmiden, außer, daß die verwendete Fusion von regulatorischer Region-β-Galaktosidasegen jene von Fig. 15a ist (anstelle der Fusion, die in Fig. 16 beschrieben ist).
Die Plasmide pT76H3 und pT76H4 sind analog zu pSAOH1 bzw. pSAOH5, außer, daß die verwendete Fusion von regulatorischer Region-β-Galaktosidasegen jene von Fig. 15b war (anstelle der in Fig. 16 beschriebenen Fusion).
Plasmid pTAFH.85 wird schematisch in Fig. 20 gezeigt und umfaßt:
(a) die Fusion regulatorische Region-fi-Galaktosidase Gen, gezeigt in Fig. 15a;
(b) pBR322 Sequenzen einschließlich dem ampR Gen;
(c) Pichia pastoris HIS4 Gen;
(d) S. cerevisiae 2 u Ring-DNA; und
(e) das unterbrochene URA3 Gen von S. cerevisiae.
Plasmid pT76H1 wird schematisch in Fig. 21 gezeigt und umfaßt:
(a) die Fusion regulatorische Region-β-Galaktosidasegen, gezeigt in Fig. 15a;
(b) pBR322 Sequenzen einschließlich den ampR Gen; und
(c) Pichia pastoris HIS4 Gen und autonom replizierende Sequenz (PARS1). Plasmid pT76H2 wird schematisch in Fig. 22 gezeigt und umfaßt:
(a) die Fusion regulatorische Region-β-Galaktosidase Gen, gezeigt in Fig. 15a;
(b) pBR325 Sequenzen einschließlich Genen, die Tetracyclin-Resistenz, Chloramphenicol-Resistenz und Ampicillin-Resistenz verleihen; und
(c) S. cerevisiae HIS4 Gen.
Plasmid pT76H3 wird schematisch in Fig. 22a gezeigt und umfaßt:
(a) die Fusion regulatorische Region-β-Galaktosidasegen, gezeigt in Fig. 15b;
(b) pBR322 Sequenzen einschließlich dem ampR Gen;
(c) P. pastoris HIS4 Gen;
(d) So cerevisiae 2 u Ring-DNA;
(e) das unterbrochene URA3 Gen von S. cerevisiae.
Plasmid pT76H4 wird schematisch in Fig. 22b gezeigt und umfaßt:
(a) die Fusion regulatorische Region-β-Galaktosidasegen, gezeigt in Fig. 15b;
(b) pBR322 Sequenzen einschließlich dem amp Gen
(c) Pichia pastoris HIS4 Gen;
(d) Pichia pastoris autonom replizierende Sequenz (PARS1).

Expression von β-Galaktosidase in Hefe

Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) wurde mit den oben beschriebenen neuen β-Galaktosidasegen-enthaltenen Konstrukten transformiert. Verschiedene der resultierenden transformierten Hefe-Stämme wurden beim Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture hinterlegt und erhielten die Hinterlegungs-Nummern wie folgt: Wirt Plasmid Hinterlegungs-Nr. des transformierten Stamms
Die neuen β-Galaktosidasegen-enthaltenden Konstrukte wurden auch verwendet, um E. coli zu transformieren. Transformierte Bakterienstämme wurden auch beim Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois, hinterlegt. Die transformierten Stämme erhielten die folgenden Hinterlegungs-Nummern: Wirt Plasmid Hinterlegungs-Nr. des transformierten Stamms
Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) transformiert mit jedem der oben beschriebenen ersten acht Plasmide, die die Fusion aus Alkoholoxidase und p76-regulatorischer Region-lacZ Gen der Erfindung enthalten, wurden bis zur stationären Phase auf Minimal-Medium ergänzt mit Biotin plus Glucose als Kohlenstoffquelle wachsen gelassen. Sobald die Zellen die stationäre Phase erreicht hatten, wurden sie in Minimal- Medium ergänzt mit Biotin plus Methanol als Kohlenstoffquelle übergewechselt. Nachdem die Zellen für ungefähr drei bis fünf Generationen bei 30ºC gewachsen waren, wurden sie in frisches Minimal-Medium ergänzt mit Biotin übergewechselt und auf Glucose oder Methanol als Kohlenstoffquelle wachsen gelassen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden Kulturproben entnommen und auf die Anwesenheit von β-Galaktosidase und Alkoholoxidase durch die in den Beispielen VII und XV beschriebenen Methoden analysiert.
Es wurde gefunden, daß die auf Glucose als Kohlenstoffquelle gewachsenen Zellen keine detektierbare Ausbeute an β-Galaktosidase oder Alkoholoxidase produzierten, während die auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle gewachsenen Zellen signifikante Ausbeute von sowohl Alkoholoxidase als auch β-Galaktosidase exprimierten. Es wurde auch gefunden, daß die auf Glucose gewachsenen Zellen, wenn sie Bedingungen von Kohlenstoffquellen-Mangel ausgesetzt worden waren, auch meßbare Mengen von sowohl Alkoholoxidase als auch β-Galaktosidase exprimierten. Somit ist es klar, daß die regulatorischen Regionen dieser Erfindung sowohl auf die Anwesenheit von Methanol als auch auf Bedingungen von Kohlenstoffquellen-Mangel ansprechen.
Als Verifizierung, daß die regulatorischen Regionen der Erfindung sowohl auf Wachstum auf Nicht-Katabolit reprimierenden Kohlenstoffquellen als auch auf Bedingungen von Kohlenstoffquellen-Mangel ansprechen, wurde ein Plasmid enthaltend die Alkoholoxidase regulatorische Region, pTAO 13, und ein Plasmid enthaltend die p76 regulatorische Region, pT76U1, verwendet, um einen nicht-Methanol verwendenden Hefe-Stamm, Saccharomyces cerevisiae, zu transformieren. Einer der verwendeten transformierten Stämme mit der Labor-Kennzeichnung SEY2102-pTAO13 wurde beim Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois hinterlegt. Der transformierte Stamm erhielt die Hinterlegungs-Nummer NRRL Y-15858. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-15858 und SEY2102-pT76U1 wurden auf Glucose, Fructose, Ethanol, Glycerin und Galactose für ungefähr fünf Generationen hochwachsen gelassen, dann Bedingungen von Kohlenstoffquellen-Mangel ausgesetzt. Der übliche Assay auf β-Galaktosidase (siehe Beispiel XV) nach fünf Generationen zeigte an, daß auf Glycerin und Galactose gewachsene Zellen große Mengen an β-Galaktosidase produzierten, während auf Glucose und Fructose gewachsene Zellen im wesentlichen keine β-Galaktosidase produzierten. Wenn die β- Galaktosidase nach 6 Stunden Wachstum unter Kohlenstoffquellen-Mangel gemessen wurde, wurde die Produktion mäßiger Mengen an β-Galaktosidase durch die auf Glucose und Fructose gewachsenen transformierten Organismen als auch wesentliche Mengen an A-Galaktosidase hergestellt durch auf Glycerin und Galactose gewachsenen Zellen beobachtet. Somit sind die regulatorischen Regionen dieser Erfindung fähig, die Produktion von Proteinprodukten in genetisch sehr verschiedenen Hefe-Wirten zu kontrollieren und sind nicht eingeschränkt auf die Verwendung von Methanol verwendenden Stämmen.

BEISPIELE

Die in den folgenden Beispielen verwendeten Puffer und Lösungen haben die unten angegebenen Zusammensetzungen:
1 Tris-Puffer 121,1 g Tris-Base in 800 ml H&sub2;O; auf den gewünschten pH-Wert durch Zusatz von konzentrierter (35%) wässriger HCl einstellen; abkühlen lassen auf Raumtemperatur vor der endgültigen pH-Einstellung, auf ein endgültiges Volumen von 1 l verdünnen.
S-Puffer 1,5 Sorbitol in 004 Natrium-Phosphat-Puffer bei pH 6,6.
PK-Puffer 0,14 NaCl
1% Natriumdodecylsulfat (SDS)
0,01 EDTA
in 0,05 (pH 8.4) Tris-Puffer
ETS-Puffer 10 m EDTA
0,2% SDS
in 0,01 (pH 7.4) Tris-Puffer
TE-Puffer 1,0 m EDTA
in 0,01 (pH 7.4) Tris-Puffer
SSC 0,15 NaCl
15 m Natriumcitrat
auf pH = 7.0 mit NaOH einstellen
TAE 40 m Essigsäure
5 m EDTA
in 0,02 (pH 8,3) Tris-Puffer
PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung) 10 m Natriumphosphat (pH 7,0)
0,15 NaCl
Laemmli Ladungs-Puffer 62,5 m Tris-HCl (pH 6,8)
2% SDS
10% Glycerin
5% 2-Mercaptoethanol
0,01% Bromphenolblau
RIPA-Puffer 1% NP40 (Sigma)
1% Natrium-Deoxycholat
0,1% SDS
in PBS
20x SSPE 20 m EDTA
0,16 NaOH
0,2 NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O
3,6 NaCl
auf pH = 7.0 mit NaOH einstellen
Denhardt's Lösung (50 X) 5 g Ficoll
5 g Polyvinylpyrrolidon
5 g Rinderserumalbumin (BSA; Pentax Fraction V) mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml bringen
Prehybribisierungs-Puffer 5x SSPE
5x Denhardt's Lösung
50% deionisiertes Formamid
0,2% SDS
200 ug/ml gescherte und denaturierte Heringsperm DNA
LB (Luria-Bertani) Medium 5 g Bacto-Trypton
5 g Bacto-Hefe Extract
2,5 g NaCl
in 1 l Wasser, auf pH = 7,5 mit NaOH einstellen
YPD-Medium 1% Bacto-Hefe Extract
2% Bacto-Pepton
2% Dextrose
SD-Medium 6,75 g Hefe-Nitrogen-Base
ohne Aminosäuren (DIFCO)
2% Dextrose
in 1 l Wasser
SED 1 Sorbitol
25 m EDTA
50 m DTT
SCE-Puffer 9,1 g Sorbitol
1,47 g Natriumcitrat
0,168 g EDTA
50 ml H&sub2;O
--pH auf 5,8 mit HCl
CaS 1 Sorbitol
10 m CaCl&sub2;
--Sterilfiltrieren
PEG-Lösung 20% Polyethylenglycol - 3350
10 m Ca Cl&sub2;
10 m Tris-HCl (pH = 7,4)
--Sterilfiltrieren
SOS 1 Sorbitol
0,3x YPD-Medium
10 m CaCl&sub2;
Formamid-Farb-Mix 0,1% Xylencyanol FF
0,2% Bromphenolblau
10 m EDTA
95% deionisiertes Formamid
Top-Gel 76,8 g Harnstoff
24 ml Acrylamid-Stamm
8 ml 10x TBE
auf ein Volumen von 160 ml bringen
Acrylamid-Stamm 38 g Acrylamid
2 g Bis(N,N-methylenbisacrylamid)
Wasser zufügen auf ein Gesamtvolumen von 100 ml
Unteres Gel 14,4 g Harnstoff
3 g Sucrose
7,5 ml 10x TBE
4,5 ml Acrylamid-Stamm
0,3 ml Bromphenolblau-Lösung (0,01 g/ml)
Wasser zufügen auf ein Gesamtvolumen von 30 ml
Prehybridisierungs-Puffer für die Hybridisierungs-Selektion 50% Formamid
0,75 NaCl
0,1 Tris, pH 7,4
0,008 EDTA
0,5% SDS
200 ug/ml Kaninchenleber tRNAs (Sigma)
0,5 NETS-Puffer 0,5 NaCl
10 m EDTA
10 m Tris, pH 7,4
0,2% SDS
10X RT-Puffer 500 m NaCl
340 m Tris, pH 8.3
60 m MgCl&sub2;
50 m DTI (Dithiothreitol)
dil RT 4 ul H&sub2;O
1 ul 10X RT Puffer
5 ul Reverse Transcriptase, 15 U/ul
(Life Sciences, Inc.)
Dideoxy:
dd ATP 0,49 m
dd CTP 0,1165 m
dd GTP 0,369 m
dd TTP 0,82 m
dNTP-Mix 0,625 m dGTP
0,625 m dATP
0,625 m TTP
Chase 1,125 m dATP
1,125 m dCTP
1,125 m dGTP
1,125 m TTP
in 1x RT-Puffer
Falls nicht anders angegeben, stellen die obigen Lösungen die verwendete Basis (1x) Konzentration dar. In den Beispielen, wo die verschiedenen Konzentrations-Level verwendet worden sind, ist diese Tatsache angezeigt durch Hinweis auf die Lösung als ein Vielfaches der Basis (1x) Konzentration.
Die folgenden Abkurzungen werden in den Beispielen mit der folgenden Bedeutung verwendet:
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylendiamin
DTT Dithiothreitol
BSA Rinderserumalbumin
EtBr Ethidiumbromid
Ci Curie
dATP Deoxyadenosintriphosphat
dGTP Deoxyguanosintriphosphat
TTP Thymidintriphosphat
dCTP Deoxycytidintriphosphat
dXTP "allgemeines" Deoxytriphosphatnucleotid
oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; Quelle: Collaborative Research, Inc.
Zymolyase 60,000 Quelle: Miles Laboratories
Verschiedene Verfahrensweisen, die auf einer Routine-Basis ausgeführt worden sind, folgen einem Standardprotokoll, das hier detailliert gezeigt wird.
Eine Zentrifugation wird für eine Zeitspanne und eine Drehrate ausgeführt, die genügt, einen klaren Überstand bereitzustellen. Im allgemeinen wird die Zentrifugation von Hefe-Zellen bei mindestens 1.500 g für mindestens 5 Minuten ausgeführt.
Nukleinsäure-Extraktionen mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol umfassen, daß die Nukleinsäure-enthaltende Lösung mit einem gleichen Volumen von Phenol, Chloroform bzw. Isoamylalkohol mit einem Volumen-Verhältnis von 50 : 48 : 2 kontaktiert wird. Extraktionen mit Chloroform/Isoamylalkohol umfassen, daß die zu behandelnde Lösung mit einem gleichen Volumen einer Mischung von Chloroform und Isoamylalkohol mit einem Volumen-Verhältnis von 48 : 2 kontaktiert wird.
Wenn beschrieben worden ist, daß Gele, Filter, usw. in einer speziellen Lösung gewaschen oder eingeweicht werden, wurde das ganze Gel, Filter o. ä. in einem passenden Gefäß (Pfanne, Schüssel, Fläschchen, usw.) eingetaucht, um die gesamte Oberfläche des Gels, Filters, o. ä. mit der interessierenden Lösung zu kontaktieren.
Die Ethanol-Ausfällung von Nukleinsäuren umfaßt, daß zuerst der Salz- Gehalt der Nukleinsäure-enthaltenden Lösungen angeglichen wird und dann die Lösung mit 2 Volumina kaltem Ethanol kontaktiert wird.

BEISPIEL I

Wachstum und Präration von Hefe-Zellen

Pichia pastoris NRRL Y-11430 wurde unter kohlenstofflimitierten Bedingungen in einer kontinuierlichen Kultur bei 30ºC mit entweder Methanol oder Ethanol als einziger Kohlenstoffquelle in IM1 Satz Minimal- Medium, wie durch Wegner in U.S. 4,414,329 beschrieben, wachsen gelassen. IM1 Minimalmedium enthält pro Liter Medium 36 m KH&sub2;PO&sub4;, 23 m (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2m MgSO&sub4;, 6,7 m KCl 0,7 m CaCl&sub2;, 0,2 uM CuSO&sub4;·5 H&sub2;O, 1,25 uM KI, 4,5 uM MnSO&sub4;, 2 µ Na&sub2;MoO&sub4;, 0,75 u H&sub3;BO&sub3;, 17,5 u ZnSO&sub4;, 44,5 u FeCl&sub2; und 1,6 u Biotin. Die auf Methanol gewachsenen Zellen ließ man hochwachsen auf eine Zelldichte von 140 g/l (Trockengewicht) mit einer Retentions- Zeit von ungefähr 12 Stunden. Die auf Ethanol gewachsenen Zellen ließ man hochwachsen auf eine Zelldichte von 90 g/l mit einer Retentions- Zeit von ungefähr 11,5 Stunden. Wenn Methanol oder Ethanol in den Fermenter eingespeist worden waren, wurden Nahrungs-Stammlösungen, die Konzentrationen von 20 bzw. 45% Alkohol enthielten, verwendet.
Zehn Gramm der im Fermenter gewachsenen Pichia pastoris Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und resuspendiert auf ungefähr 10&sup8; Zellen/ml in 0,1 M Tris (pH 8,0) enthaltend 1% 2-Mercaptoethanol. Diese Zellen wurden für 5 bis 10 Minuten bei 37ºC inkubiert und durch Zentrifugation gesammelt. Das Pellet wurde einmal mit 30 ml S- Puffer gewaschen und in 5 ml S-Puffer pro Gramm Zellen resuspendiert. Zymolyase (Miles Biochemicals) wurde zu der Zell-Suspension hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 500 ug/ml zu geben. Die Zellen wurden bei 37ºC für 20 Minuten inkubiert und dann zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet gesammelt. Dieses Pellet wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei u70ºC für spätere Verwendung aufgehoben.

BEISPIEL II

Isolation von Hefe-RNA

Gesamt-Zellen-RNA wurde hergestellt, indem man das gefrorene Pellets, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war, mit einem Mörser und Pistil pulverisierte und weiter wurde das gefrorene Pellet für ungefähr 2 bis 5 Minuten einem "Waring Blender" in Anwesenheit von flüssigem Stickstoff aufgebrochen. Das pulverisierte Pellet wurde zu PK- Puffer hinzugefügt auf eine Konzentration von 7,5 ml pro Gramm Zellen. Proteinase K (Boehringer Mannheim) wurde zu dem resuspendierten Pellet hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 400 ug/ml zu ergeben und die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Diese Mischung wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, wobei dieser Extraktion eine Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion folgte. Die Nukleinsäuren wurden durch Einstellen der Lösung auf 0,25 NaCl und Hinzufügen von Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde in einem geringsten Volumen von ETS-Puffer resuspendiert, d. h. das Puffer-Volumen reichte aus, die Nukleinsäuren aufzulösen; allgemein ungefähr 100 ug bis zu ungefähr 1 mg DNA pro ml Lösung. Diese Lösung wurde reextrahiert mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, dann mit Chloroform/ Isoamylalkohol reextrahiert und schließlich mit Ethanol präzipitiert.
Die Nukleinsäuren wurden in einem geringsten Volumen von TE-Puffer wieder aufgenommen. Die in dieser Lösung anwesende RNA wurde entweder angereichert durch Zentrifugation durch ein 4 ml CsCl-Kissen (1 g CsCl/ml, 1 m EDTA, in 10 m Tris (pH 7,4) Puffer) oder durch Präzipitation, indem man die Lösung auf 2 LiCl einstellt, bei 4-8ºC über Nacht stehenläßt und durch Zentrifugation sammelt. Die Poly A&spplus; RNA wurde aus der Lösung durch Affinitäts-Chromatographie auf einer Oligo (dT) Cellulose-Säule herausgeholt. Allgemein wurden 0,25 g Oligo (dT) Cellulose, Typ 3 (Collaborative Research) für eine Chromatographie von 5-10 mg Gesamt-RNA hergestellt. 0,25 g Oligo (dT) Cellulose wurde in 2 ml ETS-Puffer aufgeschlämmt und in eine schmale, silikonisierte Glas-Säule gegossen. Diese Oligo (dT) Cellulose-Säule wurde durch Überschichten mit 10 ml 0,1 NaOH über die Oligo (dT) Cellulose gewaschen und die Wasch-Lösung konnte durch die Oligo (dT) Cellulose-Matrix fließen. Die Oligo (dT) Cellulose wurde dann in der gleichen Weise mit 10 ml ETS-Puffer gewaschen und ein letztes Mal wurde sie mit 10 ml 05 NETS-Puffer gewaschen.
Gesamt-RNA (5 bis 10 mg) wurde in ETS-Puffer auf eine Konzentration nicht größer als ungefähr 10 mg/ml resuspendiert, in ein 65ºC Wasser bad für 2 Minuten plaziert und dann sofort auf Eis gestellt. Die RNA- Lösung durfte sich dann auf Raumtemperatur erwärmen und eine Stamm-Lösung von 5 NaCl wurde hinzugegeben, um eine End-Salz- Konzentration in der RNA-Lösung von 0,5 NaCl zu geben. Die resultierende RNA-Lösung wurde auf die präparierte Oligo (dT) Cellulose-Säule geschichtet und durfte langsam mit einer Rate von 1 Tropfen/ 5 Sekunden durch die Säule fließen. Das aus dem Säulenboden fließende Material wurde in einem Röhrchen gesammelt und oben auf die Säule wieder aufgeschichtet. Das vom Säulenboden gesammelte Material wurde oben ein zweites Mal aufgeschichtet, was dazu führte, daß die RNA-Lösung insgesamt drei Mal durch die Oligo (dT) Cellulose- Säule durchging. Nach dem letzten Durchgang durch die Säule wurde das Material gesammelt und als Poly A&supmin; markiert, d. h. nicht-poly-A RNA. Die Säule wurde dann mit 30 ml 0,5 NETS gewaschen und schließlich wurde die Poly A&spplus; RNA von der Säule durch Aufladen von 5 ml ETS-Puffer auf die Säule eluiert, und dieser Puffer durfte langsam durchfließen, Sammeln der Poly A&spplus; RNA-Fraktion in der 5 ml Fraktion, die aus dem Boden der Säule tropfte. Nimmt man an, daß kein NaCl in der Poly A&spplus; RNA-Fraktion war, wurde die NaCl-Konzentration dieser Fraktion auf 0,25 M NaCl eingestellt und die RNA mit Ethanol präzipitiert.

BEISPIEL III

Konstruktion einer cDNA-Bibliothek

Komplementäre DNA (cDNA) Klone wurden wie folgt synthetisiert. Zehn ug von wie in Beispiel 11 beschrieben hergestellter Poly A&spplus; RNA wurden in 7 ul H&sub2;O resuspendiert und auf eine Endkonzentration von 2,7 m CH&sub3;HgOH gebracht, dann bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Der erste cDNA-Strang wurde bei 42ºC für 15 Minuten in einer Lösung synthetisiert, die 50 m Tris (pH 8.3 bei 42ºC), 10 m MgCl&sub2;, 30 m 2-Mercaptoethanol, 70 m KCl, 500 u jedes von dATP, dGTP, und TIP 200 u dCTP, 25 ug/ml Oligo (dT), 60 ug/ml Actinomycin D, 25 Units RNasin (Biotec, Inc.), 25 uCi α-³²P dCTP (32,5 pmoles), und 120 Units Reverse Transcriptase (Life Sciences Inc.) enthält. Dieses Reaktionsgemisch wurde bei 37ºC für weitere 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde terminiert durch Zusatz von 2 ul 0,5 EDTA und 0,5 ul 20% SDS. Die Reaktion wurde auf 0,3 NaOH eingestellt und bei 65ºC für 30 Minuten inkubiert. Das Reaktions-Gemisch wurde dann durch Zusatz von 10 ul 1 Tris (pH 7,4) neutralisiert und das Reaktions-Gemisch wurde auf 0,21 HCl eingestellt. Das Reaktions-Gemisch wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, dann mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und schließlich über eine Sephadex G50-Säule in TE-Puffer chromatographiert. Die radioaktive einzelsträngige cDNA wurde in einer Fraktion "gepoolt" und auf 100 ul entweder durch Butanol-Extraktion oder Verdampfen durch Zentrifugation unter Vakuum konzentriert. Die einzelsträngige cDNA wurde aus der konzentrierten Lösung mit Ethanol präzipitiert, die cDNA durch Zentrifugation gesammelt und in 100 ul Wasser resuspendiert.
Die wässrige einzelsträngige cDNA-Lösung wurde auf 2,5 Ammoniumacetat eingestellt, mit Ethanol präzipitiert, durch Zentrifugation gesammelt und in 20 ul Wasser resuspendiert. Diese einzelsträngige DNA-Lösung wurde auf ein End-Volumen von 50 ul mit 50 m Kaliumphosphat- Puffer (pH 7,4) enthaltend 5 m MgCl&sub2;, 1 m 2-Mercaptoethanol, 250 u jedes von dATP, dGTP und TIII, 125 u dCTP, 25 uCi-α-³²PdCTP (32,5 pmoles), und 8 Units Klenow Fragment DNA PolI (New England Biolabs) gebracht. Das resultierende Reaktions-Gemisch wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert, um den komplementären zweiten DNA-Strang zu der einzelsträngigen cDNA zu synthetisieren. Die Reaktion wurde beendet durch Hinzufügen von 2 ul 0,5 EDTA. Die doppelsträngige cDNA wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und über eine Sephadex G50-Säule in TE-Puffer chromatographiert. Die doppelsträngigen cDNA-Fraktionen wurden "gepoolt" und der "Pool" wurde, wie für die einzelsträngige cDNA beschrieben, konzentriert und präzipitiert.
Nach der letzten Ethanol-Präzipitation und dem Sammeln der doppelsträngigen cDNA durch Zentrifugation wurde das Pellet in 20,25 ul Wasser resuspendiert, dann auf ein Endvolumen von 50 ul mit 50 m Tris (pH 8,3 bei 42ºC) enthaltend 10 m MgCl&sub2;, 30 m 2-Mercaptoethanol, 70 m KCl, 500 µ von dXTP und 150 Units Reverse Transcriptase gebracht. Die resultierende Lösung wurde bei 42ºC für 15 Minuten inkubiert, um die Vervollständigung der Synthese des zweiten cDNA-Stranges zu sichern. Die Reaktion wurde beendet durch den Zusatz von 2 ul 0,5 EDTA und konzentriert und präzipitiert wie für die einzelsträngige cDNA-Reaktion beschrieben.
Das doppelsträngige cDNA-Pellet wurde in 42 ul H&sub2;O resuspendiert und die Lösung wurde auf ein Endvolumen von 47 ul durch den Zusatz von 5 ul einer Stammlösung enthaltend 28 NaCl, 200 m NaOAc und 45 m ZnSO&sub4; gebracht, dann auf einen pH von 4,5 bei 22ºC mit HCl eingestellt. Um den "Hairpin-Loop" zu verdauen, wurden drei getrennte Reaktionen mit drei verschiedenen Konzentrationen S&sub1;-Nuclease (Sigma) ausgeführt. Ein Unit, 10 Units oder 100 Units S&sub1;-Nuclease wurden hinzugefügt, um das Reaktions-Volumen auf 50 ul zu bringen und die Reaktion wurde bei 22ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 2 ul 0,5 EDTA und 2,67 ul 2 Tris-Base beendet. Sechs ug Kaninchenleber-tRNA wurden als Carrier hinzugefügt, und das Reaktions-Gemisch wurde, wie oben beschrieben, konzentriert und präzipitiert außer, daß die DNA-Pellets statt in Wasser in TE-Puffer resuspendiert wurden. Nach der letzten Präzipitation wurde das Pellet in 20 ul TE-Puffer resuspendiert und auf ein Endvolumen von 50 ul in Terminale-Transferase-Puffer (BRL) enthaltend 10 pmole α-³²P-dCTP, 2 u dCTP und 21 Units Terminale Transferase (Ratliff Biochem.) gebracht. Die resultierende Lösung wurde bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert, um poly d(C)-Schwänze an das 3' OH-Ende der doppelsträngigen cDNA anzuhängen. Die Reaktion wurde terminiert durch den Zusatz von 5 ul 0,5 EDTA extrahiert, chromatographiert und als Ethanol-Präzipitat aufbewahrt.
Die doppelsträngige mit d(C)-Schwanz versehene cDNA wurde entweder direkt an mit einem poly d(G)-Schwanz versehenes pBR322, das an der PstI-Stelle geöffnet worden war oder zuerst auf einer Sepharose CL4B-200-Säule (25 ul-Fraktionen) größenfraktioniert worden war, "reannealed". Für die unfraktionierte Bibliothek wurden 150 ug doppelsträngige mit poly d(C)-Schwanz versehene cDNA in 180 ul 10 m Tris (pH 7,4), das 0,1 an NaCl und 1 m an EDTA ist, an 900 ng mit d(G)-Schwanz versehenes pBR322, das an der PstI-Stelle geöffnet ist, "annealed". Jede 25 ul-Fraktion der fraktionierten Bibliothek wurde an 125 ng mit poly d(G)-Schwanz versehenes pBR322 in 50 ul Endvolumen desselben "Annealing-Gemisches" wie oben beschrieben "annealed". Die "Annealing- Reaktionen" wurden bei 65ºC für 3 Minuten, dann für 2 Stunden bei 42ºC inkubiert und dann durften sie langsam auf Raumtemperatur abkühlen.
Die "annealte" cDNA-Bibliothek wurde in kompetente E. coli LE392 (ATCC 33572) transformiert, die wie folgt hergestellt worden waren: Eine Impfkultur von LE392 wurde über Nacht bei 37ºC in 2x LB-Medium wachsen gelassen. Fünf ml dieser Übernachtkultur wurden in 200 ml frisches 2x LB-Medium überimpft und auf eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,2-0,3 bei 37ºC wachsen gelassen. Diese Kultur wurde für 10 Minuten auf Eis gestellt und die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4ºC gesammelt. Das Zellpellet wurde in 80 ml eiskaltem 0,1 CaCl&sub2; resuspendiert und für 25 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4ºC gesammelt, das Zellpellet wurde in 2 ml eiskaltem 0,1 CaCl&sub2; resuspendiert und für mindestens 2 Stunden vor dem Gebrauch bei 4ºC inkubiert. Dann wurden 200 ul kompetente Zellen pro 50 ul "Annealing-Gemisch" für die Transformation verwendet. Die kompetenten Zellen und die DNA wurden kombiniert und bei 4ºC für 10 Minuten inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 37ºC für 5 Minuten und schließlich für 10 Minuten auf Eis gestellt. Ein gleiches Volumen von 2x LB-Medium wurde zu den Transformations-Mischungen hinzugefügt und bei 37ºC 45 Minuten inkubiert. Die transformierten Zellen wurden mit 250 ul/Platte auf 150 mm 2x LB-Platten enthaltend 15 ug/ml Tetracyclin ausplattiert. Die Platten wurden bei 37ºC für 24 Stunden inkubiert und bei 4ºC aufbewahrt.
Replika-Filter wurden hergestellt durch Abdrücken der Nitrozellulosefilter auf einen Originalfilter, der verwendet worden war, um die Kolonien von der Platte abzuheben. Diese Replika-Filter wurden auf 2x LB-Tet-(15 ug/ml Tetracyclin) Platten inkubiert. Die Kolonien auf den Filtern wurden zur Sondierung hergestellt durch Transferieren der Filter auf 2x LB-Tet-Platten enthaltend 200 ug/ml Chloramphenicol, Inkubieren der Filter bei 37ºC für mindestens 12 Stunden, dann Lysieren der Kolonien durch Überschichten der Filter mit einer wässrigen Flüssigkeit, die 15 NaCl und 0,5 NaOH enthält, für 10 Minuten. Die Filter wurden dann neutralisiert durch Überschichten mit einer wässrigen Flüssigkeit, die 1,5 NaCl und 0,5 Tris (pH 7,4) enthält, für 15 Minuten und nochmalige Wiederholung dieser Neutralisierung. Die Filter wurden dann an der Luft getrocknet und schließlich unter Vakuum für 2 Stunden bei 70ºC getrocknet.

BEISPIEL IV

Kolonie-Hybridisierung

Die im Vakuum getrockneten Nitrozellulose-Filter, die die cDNA-Bibliothek (hergestellt wie im vorigen Beispiel beschrieben) enthalten, wurden bei 42ºC für 5 Stunden in Prehybridisierungs-Puffer prehybridisiert. Die Filter wurden aus dem Prehybridisierungs-Puffer entfernt und gleich mit der handschuhtragenden Hand in 5x SSPE gerieben, um Zell-Trümmer zu entfernen. Die Filter wurden in Hybridisierungs-Puffer (der gleiche wie der Prehybridisierungs-Puffer, außer 1x Denhardt's) gelegt. Entweder ³²P-markierte einzelsträngige cDNA (10&sup6; cpm/ml) oder endmarkierte poly A&spplus; RNA wurden mit den Filtern für 17 Stunden bei 42ºC hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter kurz in 2x SSPE bei 22ºC gewaschen. Es folgten zwei jeweils 10-minütige Waschungen bei 65ºC in 0,1x SSPE.
Endmarkierung von poly A&spplus; mRNA wurde durchgeführt durch Zusatz von 2 ug poly A&spplus; mRNA zu einem Volumen von 50 ul enthaltend 50 m Tris (pH 9,5), Aufheizen auf 100ºC für drei Minuten und dann sofortiges Stellen auf Eis. Diese RNA-Lösung wurde auf ein Endvolumen von 200 ul verdünnt und auf 50 m Tris (pH 9,5), 10 m MgCl&sub2;, 5 m DTT und 50 pmole³²P-α-ATP eingestellt. Zehn Units T&sub4;-Polynucleotid-Kinase (Boehringer Mannheim) wurden hinzugefügt und die Mischung wurde bei 37ºC eine Stunde inkubiert. Die kinasierende Reaktion wurde beendet durch Zusatz von 10 ul 0,5 EDTA, Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und Chromatographie durch Sephadex G50, um die nicht eingebauten radioaktiven Markierungen zu entfernen.

BEISPIEL V

Northern-Hybridisierungen

Zwei bis fünf ug poly A&spplus; mRNA wurden auf 65ºC für 5 Minuten in 10 m Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4) enthaltend 50% Formamid, 2,2 M Formaldehyd und 0,5 m EDTA erhitzt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und eine entsprechende Menge (allgemein ungefähr 0,2 Volumen basierend auf dem Volumen der behandelten Probe) 5x Proben-Puffer (0,5% SDS, 0,025% Bromphenolblau, 25% Glycerin, 25 m EDTA) wurde hinzugefügt. Die Proben wurden auf ein 1,5% Agarose-Gel, das in 10 m Natriumphosphat- Puffer (pH 7,4) enthaltend 11 Formaldehyd hergestellt worden war, geladen und in demselben Puffer elektrophoresiert. Das Gel wurde mit Acridinorange (33 ug/ml) in 10 m Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4) angefärbt, das Gel wurde durch Einweichen in demselben Puffer für 10 Minuten entfärbt, in 10x SSPE für mindestens 10 Minuten eingeweicht, und die RNA wurde auf Nitrozellulose übertragen wie in Beispiel VI beschrieben.

BEISPIEL VI

Isolierung von genomischer DNA und Klonen

Pichia genomische DNA wurde unter Verwendung der in Beispiel II für Pichia RNA-Isolation beschriebenen Methode isoliert. Das Nukleinsäure- Pellet wurde in einem minimalen Volumen TE-Puffer resuspendiert und mit 20 ug/ml RNase A für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Lösung wurde auf 0,14 NaCl gebracht und mit Proteinase K bei 200 ug/ml für 15 Minuten bei 22ºC behandelt. Die resultierende Lösung wurde erst mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und dann mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und schließlich mit Ethanol präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde in einem minimalen Volumen TE- Puffer resuspendiert und zentrifugiert, um die DNA-Lösung zu klären. 10 ug Pichia genomische DNA, hergestellt wie in dem früheren Abschnitt beschrieben, wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen (BRL) verdaut und auf einem 1% Agarose-Gel enthaltend TAE elektrophoresisiert. Die DNA-Fragmente im Gel wurden durch Einweichen des Gels in 15 NaCl 0,5 NaOH für 20 Minuten denaturiert. Das Gel wurde durch Einweichen in 15 NaCl, 0,5 Tris (pH 7,4) für 20 Minuten neutralisiert. Vor dem Transfer wurde das Gel in 10x SSPE für mindestens 5 Minuten eingeweicht. Ein Blatt Nitrozellulose wurde auf die Größe des Gels zurechtgeschnitten, mit Wasser benetzt und kurz in 10x SSPE eingeweicht. Dieser Filter wurde oben auf das Gel gelegt, welches umgekehrt auf ein Stück Parafilm gelegt worden war. Ein Blatt Whatman- Filterpapier und ein Stapel Papiertaschentücher wurden oben auf die Nitrozellulose gelegt, um die DNA aus dem Gel zu ziehen und sie auf die Nitrozellulose zu übertragen. Ein Gewicht wurde auf den Stapel gelegt, um den Transfer zu erleichtern. Die DNA wurde in dieser Weise für mindestens 3 Stunden übertragen. Nach dem Transfer wurde der Filter kurz in 5x SSPE eingeweicht, luftgetrocknet und unter Vakuum bei 70ºC für 2 Stunden getrocknet. Komplementäre genomische Fragmente wurden durch Hybridisierung mit den nick-translatierten cDNA-Klonen pPC 8.0, pPC 6.4 und pPC 15.0 unter Verwendung derselben Prehybridisierungs-, Hybridisierungs-, und Wasch-Puffer, wie in Beispiel IV beschrieben, identifiziert.
200 ng der cDNA-Klone wurde nick-translatiert für 90 Minuten bei 14 ºC in 30 ul einer Lösung enthaltend 50 m Tris-HCl (pH 7,4), 10 m MgSO&sub4;, 100 u DTT, 50 ug/ml BSA, 20 u jedes von dGTP, TTP und dATP, 31,25 pmole ³²P-α-dCTP (3200 Ci/mmol, NEN), 2 Units E. coli DNA PolI (BRL), und 0,02 ng DNaseI. Die Reaktion wurde beendet durch Zusatz von 1 ul 05 EDTA und 1 ul 20% SDS. Die markierte DNA-Lösung wurde auf eine Endkonzentration von 03 M NaOH gebracht und in kochendes Wasser für 3 Minuten gestellt. Diese Mischung wurde auf einer Sephadex G50-Säule chromatographiert. Die markierten DNA-Fraktionen wurden vereinigt, die spezifische Aktivität bestimmt und die Sonde in Hybridisierungs-Experimenten verwendet.
Genomische Fragmente, welche mit den cDNA-Sonden hybridisierten, wurden durch Verdau von 200 ug Pichia genomischer DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen (BRL) und Elektrophorese des Verdaus auf einem 1% Agarose-Gel in TAE-Puffer isoliert. Die Bande mit der entsprechenden Größe wurde aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten, die DNA elektroeluiert, über eine Elutip-Säule (Schleicher und Schuell) gegeben und mit Ethanol präzipitiert.
Die elektroeluierten Fragmente wurden in Wasser resuspendiert und 200 ng Fragmente wurden mit 500 ng pBR322, welches an der entsprechenden Restriktionsstelle geschnitten worden war und, falls notwendig, dephosphoryliert worden war, ligiert. Die Ligations-Reaktion wurde ausgeführt in 300 ul 66 m Tris (pH 7,4) enthaltend 6,6 m MgCl&sub2;, 10 m DTT, 0,4 m ATP 25 ug/ml BSA, und 40-80 Units T4-DNA-Ligase, dann bei 4º c für 24 Stunden inkubiert. Das Ligations-Gemisch wurde direkt in kompetente LE392 E. coli-Zellen transformiert. Die Zellen wurden kompetent gemacht und die Transformation wurde, wie in Beispiel III beschrieben, ausgeführt. Eine Serie von drei Transformationen wurde mit 10, 40 und 100 ng pBR322 (plus Insert) ausgeführt, wobei jede Transformation in 100 ul kompetenter Zellen erfolgte. Die Zellen wurden wie in Beispiel III ausplattiert, außer daß die Antibiotika-Selektion über 50 ug/ml Ampicillin erfolgte. Die Klone wurden auf Nitrozellulose übertragen, Replikafilter wurden angefertigt und für die Hybridisierung vorbereitet, wie in Beispiel III beschrieben. Die Filter wurden mit dem entsprechenden nick-translatierten cDNA-Fragment sondiert. Über Ausstreichen gereinigte Kolonien, die bei der Hybridisierung positiv waren, wurden verwendet, um zusätzliches Plasmid wie folgt herzustellen.
Das plasmidtragende LE392 E. coli wurde auf eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 1,0 in 1x LB-Medium enthaltend 50 ug/ml Ampicillin wachsen gelassen und über Nacht durch Zusatz von Chloramphenicol auf eine Endkonzentration von 200 ug/ml amplifiziert. Die Zellen wurden gewaschen in 0,8% NaCl, 20 m Tris (pH 8,0), 20 m EDTA, dann Lysozym-behandelt in 25% Sucrose, 50 m Tris (pH 7,4), 20 m EDTA mit 450 ug/ml Lysozym. Die Lysis wurde erreicht durch Zusatz von 5 NaCl auf eine Endkonzentration von 2,0 , gefolgt durch den Zusatz von einem gleichen Volumen von 0,2% Triton X-100 und 40 m EDTA. Die Präparation wurde durch Zentrifugieren bei 20.000 rpm für 45 Minuten geklärt. Der Überstand wurde dann mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, dann mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde in TE-Puffer resuspendiert, RNase A-behandelt, mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und mit Chloroform/- Isoamylalkohol extrahiert. Festes CsCl wurde hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 800 ug/ml zu ergeben, sowie EtBr wurde hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml zu ergeben. Die resultierende Lösung wurde in einem VTT 50 Rotor bei 49.000 rpm für 18 bis 20 Stunden bei 20ºC zentrifugiert.
Die Plasmid-Bande wurde mit UV-Fluoreszenz sichtbar gemacht und aus dem Röhrchen unter Verwendung einer Nadel und einer Spritze abgezogen. Die Plasmid-Lösung wurde vier Mal mit n-Butanol extrahiert und mit Ethanol bei -20ºC präzipitiert. Die Ethanol-Präzipitation wurde mindestens zwei Mal wiederholt, um alles CsCl zu entfernen. Das Plasmid wurde als Ethanol-Präzipitat bei -20ºC aufbewahrt.

BEISPIEL VII

Reinigung von Alkoholoxidase

Protein-Proben von auf Methanol gewachsenen Pichia pastoris-Zellen, wie in Beispiel I beschrieben, wurden hergestellt durch Lyse der Hefe-Zellen, gefolgt von einer klärenden Zentrifugation, um Zelltrümmer zu entfernen, wie folgt: Ein Teil des Fermenter-Abflusses wurde entfernt und auf einen pH 7,5 mit Ammoniumhydroxid eingestellt, und er wurde auf einer "Dyno-Mill Modell KDL" unter Verwendung eines 0,6 l-Gefässes in einer kontinuierlichen Arbeitsweise bei 30ºC unter Verwendung einer "Belt- Kombination" #3 und einem Fluß von 20-30 ml/h homogenisiert. Die Perlen der Mühle waren bleifreie Perlen aus Glas mit einem Durchmesser von 0,3-0,5 mm. Das resultierende Homogenat wurde bei 5ºC und 20.000xg für 30 Minuten zentrifugiert, um einen zellfreien Überstand zu erhalten.
Sechs 130 ml Portionen des zellfreien Überstandes wurden in Celluloseacetat-Dialysebeutel gegeben und bei 5ºC gegen ungefähr 8 Liter destilliertes Wasser dialysiert. Nach 4 Tagen wurde die wässrige Phase aus jedem Beutel dekantiert. Die überbleibenden Feststoffe in den Beuteln bestanden aus zwei Typen von Feststoffen. Die obere weiße Schicht wurde sorgfältig entfernt und verworfen. Der untere Feststoff war braungelb und war kristalline Alkoholoxidase. Eine Portion der kristallinen Alkoholoxidase wurde in destilliertem Wasser aufgelöst (ungefähr 10 Mal das Volumen des Feststoffs) und ein Assay mit der Farbstoff-Peroxidase- Methode zeigte eine Aktivität von 94 EU/ml an. Die spezifische Aktivität der Alkoholoxidase war 10,4 EU/mg Protein.
Das kristalline Präzipitat, das sich aus der oben beschriebenen Dialyse ergab, wurde gegen 0,05 Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,5) dialysiert und auf eine 2·200 cm Sephacryl 200 (Pharmacia)-Säule, die mit demselben Puffer equilibriert war, gegeben. Fraktionen von 3,5 ml wurden gesammelt bei einer Fließrate von 10 ml/h und auf Alkoholoxidase- Aktivität untersucht.
Die Alkoholoxidase-Aktivität für die Reaktion mit Methanol wurde durch das folgende Assay-Verfahren (Farbstoff-Peroxidase-Methode) bestimmt. Ein Farbstoff-Puffer-Gemisch wurde durch Mischen von 0,1 ml o-Dianisidin-Lösung (1 Gewichts-% o-Dianisidin in Wasser) mit 12 ml begastem 0,1 Natriumphosphat-Puffer (pH 7,5) hergestellt. Das Assay-Gemisch wurde mit 2,5 ml des Farbstoff-Puffer-Gemisches, 50 ul Methanol, 10 ul Peroxidase-Lösung (1 mg Meerrettich-Peroxidase, Sigma, Typ II) und 25 ul Alkoholoxidase-Lösung hergestellt. Das Assay-Gemisch wurde bei 25ºC in einer 4·1·1 cm Küvette gehalten und der Anstieg in der Absorption durch den Farbstoff bei 460 nm wurde für 2 bis 4 Minuten aufgenommen. Die Enzym-Aktivität wurde berechnet durch
Aktivität (u mole/min./ml oder Enzym Units/ml) = ΔA/min·11,5, wobei 11,5 ein Faktor ist, der auf einer Standardkurve basiert, die mit bekannten Aliquots von H&sub2;O&sub2; hergestellt worden war und ΔA der Wechsel in der Absorption während des Versuchszeitraumes ist.
Insgesamt wurden 0,1 ug Gesamt-Protein von jeder Fraktion auch auf ihren AIkoholoxidase-Gehalt durch Gel-Elektrophorese mit SDS-Polyacrylamid (12%) untersucht.

BEISPIEL VIII

DNA- und Protein-Sequenzierung

Die Bestimmung der DNA-Sequenzen wurde durch die Dideoxy-Ketten- Verlängerungs-Methode unter Verwendung von Bakteriophage M13 (Sanger et al, 1980) oder durch die chemische Modifikations-Methode (Maxam und Gilbert, 1980) durchgeführt. Die DNA-Fragmente entsprechend dem 5' Ende des AIkoholoxidase-Gens wurden in M13mp8 und M13mp9-Vektoren insertiert oder endmarkiert für die chemische Modifikations-Methode unter Verwendung von Restriktionsenzym-Stellen, die in dieser Region vorhanden sind.
Das 710bp HindIII/SalI-Fragment von pPG 4.0 wurde für die Maxam- Gilbert-Sequenzierung endmarkiert, und zwar indem man erst 33 ug des Plasmids mit HindIII verdaute. Das Reaktions-Gemisch wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 31 ul Wasser resuspendiert. 100 uCi³² P-αdCTP (3200 Ci/mmol) und 2 Units Klenow-Fragment DNA PolI wurden zu dem Reaktions-Gemisch hinzugefügt, um ein Endvolumen von 50 ul enthaltend 400 u dATP, 400 u dGTP, 50 m Tris (pH 7,4), 10 m MgSO&sub4;, und 1 m DTT zu ergeben. Das Reaktions-Gemisch wurde bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert und durch Hinzufügen von 2 ul 0,5 EDTA gestoppt. Die Mischung wurde dann mit Phenol/Chloroform/- Isoamylalkohol extrahiert, mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, auf einer Sephadex G-50-Säule chromatographiert und die markierten Nukleinsäure-Fraktionen wurden vereinigt und mit Ethanol präzipitiert. Nach der Zentrifugation wurden die DNA-Pellets in Wasser resuspendiert und mit SalI verdaut. Der Verdau wurde auf einem 1% Agarose-Gel in TAE-Puffer elektrophorisiert und die 710 bp-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten, die DNA elektroeluiert, mit Butanol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das Fragment wurde in 100 ul TE-Puffer resuspendiert, auf 25 Ammoniumacetat eingestellt und dann mit Ethanol präzipitiert. Das resultierende DNA-Fragment wurde in TE-Puffer auf eine Konzentration von 50.000 cpm/ul resuspendiert.
Die vier Basen-Modifikations-Reaktionen wurden durchgeführt wie folgt: (a) the G (Guanin)-Reaktion wurde für 8 Minuten bei 22ºC inkubiert und enthielt 1 ul (50.000 cpm) des markierten DNA-Fragments, 4 ul Wasser, 200 ul m Natriumcacodylat (pH 8,0), 1 m EDTA (DMS- Puffer) und 1 ul Dimethylsulfat. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 50 ul DMS-Stop-Puffer enthaltend 1,5 Natriumacetat (pH 7,0), 1 2-Mercaptoethanol und 100 ug/ml tRNA beendet, dann wurde Ethanol (750 ul) hinzugefügt und das Reaktions-Gemisch wurde bei -70ºC gehalten für mindestens 15 Minuten. (b) die G/A (Guanin/Adenin)- Reaktion wurde für 10 Minuten bei 22ºC inkubiert und enthielt 2 ul (100.000 cpm) des markierten DNA-Fragments, 8 ul Wasser und 30 ul Ameisensäure. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 200 ul Hz- Stop-Puffer (0,3 Natriumacetat pH 5,5, 0,1 EDTA und 25 ug/ml tRNA) beendet, dann wurde Ethanol (750 ul) hinzugefügt und das Reaktions-Gemisch wurde bei -70ºC gehalten für mindestens 15 Minuten. (c) die T/C (Thymin/Cytosin)-Reaktion wurde für 10 Minuten bei 22ºC inkubiert und enthielt 2 ul (100.000 cpm) des markierten DNA- Fragments, 18 ul Wasser und 30 ul Hydrazin. Die Reaktion wurde terminiert wie oben in (b) beschrieben. (d) die C (Cytosin)-Reaktion wurde für 10 Minuten bei 22ºC inkubiert und enthielt 1 ul (50.000 cpm) des markierten DNA-Fragments, 4 ul Wasser, 15 ul 5 NaCl und 30 ul Hydrazin. Die Reaktion wurde beendet, wie oben unter (b) beschrieben.
Die DNA-Pellets wurden durch Zentrifugation gesammelt, in 250 ul 0,3 M Natriumacetat (pH 5,5) resuspendiert und mit 750 ul 95% Ethanol präzipitiert. Die Pellets wurden durch Zentrifugation gesammelt, unter Vakuum für 5 Minuten getrocknet und die DNA wurde durch Resuspendieren der Pellets in 100 ul einer 1 bis 10 (v/v) Verdünnung von Piperidin gespalten. Die Spaltungs-Reaktion wurde bei 900 C für 30 Minuten inkubiert und dann durch Zusatz von 500 ul 98% Ethanol, 60 m Natriumacetat (pH 5,5) und 10 ug/ml tRNA beendet. Das Reaktions-Gemisch wurde für ungefähr 5 Minuten in ein Trockeneis/Ethanol- Bad (ungefähr -70ºC) gestellt und die DNA-Fragmente wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die Fragmente wurden in 50 ul 0,3 Natriumacetat (pH 5,5) resuspendiert und dann mit 100 ul 95% Ethanol präzipitiert. Diese Ethanol-Präzipitation wurde wiederholt, die Pellets wurden mit 95% Ethanol gewaschen und unter Vakuum während der Zentrifugation getrocknet. Die Pellets wurden in 10 ul 80% Formamid, 10 m NaOH, 1 m EDTA, 0,1% Xylencyanol und 0,1% Bromphenolblau resuspendiert. Zwei bis drei ul wurden auf einem 10% 0,4 mm dicken Polyacrylamid-Gel in TBE-Puffer elektrophoretisch aufgetrennt.
Die Aminosäuresequenz von Alkoholoxidase wurde durch Sequemat, Inc. (Watertown, Mass.) unter Verwendung von 2 mg gereinigter Alkoholoxidase aus Pichia pastoris bestimmt. Es wurde bestimmt, daß die ersten 18 Aminosäuren des maturierten Proteins sind:
Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser.

BEISPIEL IX

Bestimmung der Alkoholoxidase Transkriptionellen Initiationsstelle

Um zu bestimmen, wo der Start der mRNA für die Alkoholoxidase lokalisiert ist, wurde ein Primer-Extension-Experiment durchgeführt unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids als Primer, das von den DNA-Sequenzen am 5' Ende des Alkoholoxidase-Gens kopiert ist und 10 ug poly A&spplus; Pichia pastoris mRNA als Matrize. Zehn ug Pichia pastoris poly A&spplus; mRNA wurden mit 3 ng Primer (5'-CTT CTC AAG TTG TCG-3') in einem 9,3 ul Endvolumen, das 43 m NaCl, 29,2 m Tris (pH 8,3), 5,2 m MgCl&sub2; und 4,3 m DTT war, kombiniert. Die Nukleinsäuren wurden bei 70ºC für 5 Minuten denaturiert und durften sich durch langsames Abkühlen auf 22ºC "reannealen". Der "Reannealing-Mix" wurde zu einem Röhrchen hinzugefügt, das 4 ul dNTP-Mix, 0,8 ul RT- Puffer und 1 ul³²P-α-dCTP (800 Ci/mmol) enthielt. Drei ul dieser Mischung wurden zu 1 ul des jeweiligen dNTP hinzugefügt. Die endgültigen 3 ul in dem Gemisch wurden zu 1 ul Wasser hinzugefügt. Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 1 ul dil-RT gestartet und bei 42ºC 15 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 3 ul "Chase-RT" bei 42ºC für 15 Minuten "gechast". Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 7,5 ul Formamid-Farbstoff-Gemisch gestoppt und 4-5 ul wurden auf einem 0,4 mm dicken Gradienten-Gel in 1x TBE elektrophoretisch aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in 10% Essigsäure mit 10% Methanol für 20 Minuten fixiert. Das Gel wurde unter Vakuum getrocknet und wurde verwendet, um einen XAR-Röntgen-Film zu belichten.
Das Gradienten-Gel wurde wie folgt hergestellt: 300 ul 10% Ammoniumpersulfat und 14 ul TEMED wurden zu 30 ml des Top-Gels hinzugefügt; 75 ul 10% Ammoniumpersulfat und 3,5 ul TEMED wurden zu 7 ml unterem Gel hinzugefügt, 6 ml des Top-Gels wurde in eine Pipette aufgezogen und dann wurden 6 ml des unteren Gels in dieselbe Pipette aufgezogen. Das Gel wurde zwischen die Gelplatten gegossen, gefolgt von 22 ml Top-Gel.

BEISPIEL X

mRNA Hybridisierungs-Selektion und In-Vitro-Translationen

Positive Hybridisierungs-Translationsexperimente wurden durchgeführt durch Linearisieren von zwanzig Gramm klonierter Pichia genomischer DNA (hergestellt wie beschrieben in Beispiel VI), indem man diese mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaute. Diese DNA wurde durch Einstellen der Lösung auf 0,3 M NaOH und 10-minütige Inkubation bei 65ºC denaturiert. Die denaturierte DNA-enthaltende Lösung wurde schnell auf Eis gestellt und durch Einstellen auf 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) neutralisiert. Ein gleiches Volumen von 20x SSPE wurde zu der denaturierten DNA kurz vor der Bindung der DNA an die Nitrocellulose-Filter hinzugefügt. Vor dem Aufbringen der DNA auf die Nitrocellulose-Filter (Schleicher und Schuell, BA83, 9 mm Durchmesser), wurden die Filter vorbereitet durch Benetzen mit H&sub2;O, Kochen für 10 Minuten und dreimaliges Spülen in 10x SSPE. Zehn ug DNA wurden dann an jeden Filter gebunden durch Aufbringen der DNA auf den Filter, Lufttrocknen und schließlich Trocknen der Filter unter Vakuum bei 70ºC für zwei Stunden.
Vor der Prähybridisierung wurden die Filter mit der gebundenen DNA in 1 ml steriles Wasser gelegt und für eine Minute auf 100ºC erhitzt, auf Eis gekühlt, durch Vortexen in 1 ml sterilem Wasser gespült und mit 1 ml Prähybridisierungs-Puffer gespült. Die Filter wurden in 1 ml Prähybridisierungspuffer prähybridisiert, dann wurden 40 ug (2 ug/ml ETS) Poly A&spplus; mRNA direkt zu dem Prähybridisierungs-Puffer hinzugefügt. Das Hybridisierungs-Gemisch wurde auf 65ºC für 10 Minuten erhitzt und dann bei 42ºC für 24 Stunden inkubiert.
Der Hybridisierung folgend wurden die Filter kurz 2 mal in 1x SSPE, das 0,5% SDS enthielt, bei 22ºC, 7 mal in 1x SSPE, das 0,5% SDS enthielt, bei 50ºC für jeweils 5 Minuten, 3 mal in 0,1x SSPE bei 50ºC für jeweils 5 Minuten und einmal in 0,1x SSPE bei 65ºC für 10 Minuten gewaschen. Die RNA wurde aus den Filtern durch Kochen für 1 Minute in 300 ul H&sub2;O enthaltend 15 ug Rattenleber-tRNA eluiert. Die eluierte RNA wurde schnell in einem Trockeneis-Ethanol-Bad gefroren. Das RNA-Gemisch durfte sich auf Raumtemperatur erwärmen und die Filter wurden entfernt. Das RNA-Gemisch wurde dann durch Einstellen des Mediums auf 2,5 Ammoniumacetat präzipitiert und 2 mal mit Ethanol präzipitiert und schließlich vor der Lyophilisation in 100 ul H&sub2; O resuspendiert.
Die Translationen wurden gemäß dem Fachmann bekannten Standardtechniken durchgeführt, wie z. B. Instruktionen, die durch New England Nuclear In-vitro-Kaninchen-Retikulozyten-Lysat-Translations-Kits bereitgestellt werden. Proteinprodukte wurden auf 8% Polyacrylamid-Gelen enthaltend 4,5% "Stacking-Gel" elektrophoretisch aufgetrennt.

BEISPIEL XI

Antiseren-Herstellungen und Immunopräzipitationen

Antiseren, die in Kaninchen gegen einen Extrakt aus Pichia pastoris Zellen enthaltend sowohl p72 (Alkoholoxidase) als auch p76 Polypeptide erzeugt wurden, wurden unter Verwendung von Standardprotokollen hergestellt. Die Extrakte wurden gegen PBS vor der Injektion dialysiert. Über einen Zeitraum von 8 Wochen erhielt jedes Kaninchen 3 Injektionen, wobei jede davon aus 1 mg Gesamt-Protein in einem Volumen von 0,1 ml mit 0,2 ml Freund's komplettem Adjuvans bestand. Die Injektionen wurden intradermal an 6-10 Stellen in dem Kaninchen gegeben. Am Ende der 8 Wochen wurde den Kaninchen Blut entnommen und ihre Seren wurden gegen gereinigte Pichia pastoris Alkoholoxidase mittels des Ouchterlony-Doppel-Diffusionsverfahrens getestet.
Gereinigte Kaninchen anti-p72 (Alkoholoxidase) und anti-p76 Protein Antikörper wurden hergestellt durch Affinitätschromatographie von gesamten Antiseren über eine CNBr gekoppelte p72 (Alkoholoxidase)-p76 Sepharose 4B Säule (Pharmacia). Ein Gramm von CNBr aktiviertem Gel wurde durch Hydratisieren des Gels für 15 Minuten in 200 ml 1m HCl hergestellt, gefolgt von 3·50 ml Waschungen in Kopplungs-Puffer (0,1 Natriumcarbonat (pH 8) und 0,5 NaCl). 5 ml einer 6 mg/ml Lösung von p72-p76 in Kopplungs-Puffer wurde zu dem Gel hinzugefügt und sanft über Nacht bei 4ºC bewegt. Ungebundes Protein wurde durch Waschen mit 3·50 ml Kopplungs-Puffer entfernt. Die zurückbleibenden aktiven Gruppen wurden durch eine 2 Stunden Inkubation in 1 Ethanolamin (pH 8) eliminiert. Nicht-kovalent gebundenes Material wurde aus dem Gel durch eine 50 ml Waschung mit 2 Natriumthiocyanat in PBS entfernt. Vor der Chromatographie der Antiseren wurde das Gel zum Schluß mit 3·50 ml PBS gewaschen. 5 ml geklärte anti-p72-p76 Antiseren wurden mit dem Gel gemischt und unter leichter Bewegung 2 Stunden bei 4ºC inkubiert. Das Antiseren-Gel-Gemisch wurde dann in eine 1·8 cm Säule pipettiert und mit 150 ml PBS gewaschen. Der gereinigte Antikörper wurde aus der Säule mit 6 ml 2 Natriumthiocyanat in PBS eluiert. Nach der Elution aus dem Gel wurde der gereinigte Antikörper ausgiebig gegen PBS, das 0,02% Natriumazid enthielt, dialysiert.
Die Affinitäts-gereinigten Antiseren wurden zu einem in-vitro-Translations- Mix in PBS, 1% NP40 hinzugefügt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Der Antikörper-Antigen-Komplex wurde mit Pansorbin (Calbiochem) auf Eis für 2,5 Stunden präzipitiert. Pansorbin wurde hergestellt durch Waschen in RIPA-Puffer. Die Pansorbin-Präzipitate wurden 4· in RIPA- Puffer gewaschen und in Laemmli-Ladungs-Puffer vor der Elektrophorese aufgelöst.

BEISPIEL XII

Pichia pastoris Transformations-Verfahren

A. Zellwachstum

1. Überimpfe eine Kolonie Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) in ungefähr 10 ml YPD-Medium, schüttele die Kultur bei 30ºC für 12 bis 20 Stunden.
2. Nach ungefähr 12 bis 20 Stunden verdünne die Zellen auf eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von ungefähr 0,01 bis 0,1 und halte die Zellen in der "log-Wachstumsphase" in YPD-Medium bei 30ºC für ungefähr 6-8 Stunden.
3. Nach ungefähr 6-8 Stunden, überimpfe 100 ml YPD-Medium mit 0,5 ml der "Saat-Kultur" bei einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von ungefähr 0,1 (oder eine äquivalenten Menge). Schüttle bei 30ºC für ungefähr 12-20 Stunden.
4. Ernte die Kultur, wenn die OD&sub6;&sub0;&sub0; ungefähr 0,2-0,3 ist (nach ungefähr 16-20 Stunden) durch Zentrifugation bei 1500 g für 5 Minuten.

B. Herstellung von Spheroplasten

1. Wasche die Zellen einmal in 10 ml sterilem Wasser (alle Zentrifugationen für die Schritte 1-5 werden bei 1500 g für 5 Minuten ausgeführt).
2. Wasche die Zellen einmal in 10 ml frisch bereitetem SED.
3. Wasche die Zellen zwei Mal in 10 ml sterilem 1 Sorbitol.
4. Resuspendiere die Zellen in 10 ml SCE-Puffer.
5. Füge 5-10 ul 4 mg/ml Zymolyase 60.000 (Miles Laboratories) hinzu. Inkubiere die Zellen bei 30ºC für ungefähr 30-60 Minuten.
Weil die Herstellung der Spheroplasten ein kritischer Schritt in dem Transformations-Verfahren ist, sollte man die Spheroplasten-Bildung wie folgt überwachen: Füge 100 ul Aliquots der Zellen zu 900 ul 5% SDS und 900 ul 1 Sorbitol vor oder gerade nach der Zugabe von Zymolase und zu verschiedenen Zeiten während der Inkubationsdauer. Beende die Inkubation an dem Punkt, wo die Zellen in SDS lysieren, aber nicht in Sorbitol (gewöhnlich zwischen 30 und 60 Minuten der Inkubation).
6. Wasche die Spheroplasten zwei Mal in 10 ml sterilem 1 u Sorbitol durch Zentrifugation bei 1000 g für 5-10 Minuten. (Die Zeit und die Zentrifugations-Geschwindigkeit können variieren; zentrifugiere genügend, um die Spheroplasten zu pelletieren, aber nicht soviel, daß sie durch die Kraft zerrissen werden).
7. Wasche die Zellen einmal in 10 ml sterilem CaS.
8. Resuspendiere die Zellen in insgesamt 0,6 ml CaS.

C. Transformation

1. Gebe die DNA-Proben (bis zu 20 ul Volumen) in 12·75 mm sterile Polypropylen-Röhrchen. (Die DNA sollte sich in Wasser oder TE-Puffer befinden; für maximale Transformations-Häufigkeiten mit geringen Mengen von DNA ist es ratsam, ungefähr 1 ul von 5 mg/ml beschallter E. coli DNA zu jeder Probe hinzuzufügen).
2. Füge 100 ul Spheroplasten zu jeder DNA-Probe und inkubiere bei Raumtemperatur für ungefähr 20 Minuten.
3. Füge 1 ml PEG-Lösung zu jeder Probe und inkubiere bei Raumtemperatur für ungefähr 15 Minuten.
4. Zentrifugiere die Proben bei 1000 g für 5-10 Minuten und dekantiere die PEG-Lösung.
5. Resuspendiere die Proben in 150 ul SOS und inkubiere bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
6. Füge 850 ul steriles 1 Sorbitol hinzu und plaziere die Aliquots der Proben wie unten beschrieben.

D. Regeneration der Spheroplasten

1. Rezept für das Regenerations-Agar-Medium:
a) Agar-Sorbitol-9 g Bacto-Agar, 54,6 g Sorbitol, 240 ml H&sub2;O, autoklavieren.
b) 10x Glucose- 20 g Dextrose, 100 ml H&sub2;O, autoklavieren.
c) 10x SC- 6,75 g Hefe-Nitrogen-Base ohne Aminosäuren, 100 ml H&sub2;O, autoklavieren. (Füge jede gewünschte Aminosäure oder Nukleinsäure bis zu einer Konzentration von 200 ug/ml vor oder nach dem Autoklavieren hinzu.)
d) Füge 30 ml 10x Glucose und 30 ml 10x SC zu 240 ml der geschmolzenen Agar-Sorbitollösung. Füge 0,6 ml 0,2 mg/ml Biotin und irgendeine andere gewünschte Aminosäure oder Nukleinsäure auf eine Konzentration von 20 ug/ml zu. Halte den geschmolzenen Regenerations-Agar bei 55-60ºC.

2. Plattieren der Transformations-Proben:

Gieße eine untere Agar-Schicht von 10 ml Regenerations-Agar pro Platte mindestens 30 Minuten bevor die Transformations- Proben fertig sind. Verteile 10 ml Aliquots des Regenerations- Agars in Röhrchen in einem 45-50ºC Bad, und zwar während der Zeit, in der die Transformations-Proben in SOS sind. Füge Aliquots der oben beschriebenen Transformations-Proben in die Röhrchen mit dem Regenerations-Agar und gieße sie auf die untere Agar-Schicht der Platte. Füge eine Menge jeder Probe zu den 10 ml Aliquots des geschmolzenen Regenerations-Agars, der auf 45-50ºC gehalten wird und gieße jede auf Platten, die eine feste 10 ml untere Agar-Schicht des Regenerations-Agars enthalten.

Bestimmung der Qualität der Spheroplasten-Präparation:

Entferne 10 ul von einer Probe und verdünne 100 mal durch Addition zu 990 u 1 Sorbitol. Entferne 10 ul der 100-fachen Verdünnung und verdünne nochmals 100-fach durch Addition zu einem zweiten 990 ul Aliquot von 1 Sorbitol. Streiche 100 ul von beiden Verdünnungen auf YPD Agar-Medium aus, um die Konzentration von nicht-spheroplastizierten ganzen Zellen, die in der Präparation verblieben waren, zu bestimmen. Füge 100 ul jeder Verdünnung zu 10 ml Regenerations-Agar ergänzt mit 40 ug/ml Histidin, um die gesamten regenerierbaren Spheroplasten zu bestimmen. Gute Werte für ein Transformationsexperiment sind 1-3·10&sup7; Gesamt-regenerierbare Spheroplasten/ml und ungefähr 1·10³ ganze Zellen/ml.

4. Inkubiere die Platten bei 30ºC für 3-5 Tage.

Beispiel XIII

Isolation von Pichia pastoris HIS4-Gen und autonom replizierende Sequenzen

A. Stämme

Die verwendeten Stämme beinhalten:
(a) Pichia pastoris Stamm NRRL Y- 11430;
(b) Pichia pastoris GS115 (his4; NRRL Y-15851);
(c) S. cerevlsiae Stamm 5799-4D (ein his4-260 his4-39; NRRL Y-15859);
(d) E. coli Stamm 848 (F&supmin; met thi gal T&sub1;® 80S hsdR&supmin; hsdM&spplus;).

B. Plasmide

pYA2 (siehe Fig. 23; besteht aus dem S. cerevisiae HIS4 Gen auf einem 9,3 kbp PstI Fragment insertiert an der PstI-Stelle von pBR325) war die Quelle von S. cerevisiae HIS4 Gen-Fragmenten und wurde in einem E. coli Wirt hinterlegt und ist für die Öffentlichkeit zugänglich als NRRL B- 15874.
YEpI3 ist erhältlich von der American Type Culture Collection und hat die Hinterlegungs-Nummer ATCC 37115 erhalten.

C. Medien

Pichia pastoris wurde in YPD (reich) oder IMG (minimal) Medien wachsen gelassen. IMG, ein Minimal-Medium, besteht aus dem folgenden:
1. IM&sub1;-Salze auf einer Endkonzentration von 36,7 m KH&sub2; PO&sub4;, 2,7 m (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2,0 m MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 6,7 m KCl 0,7 m CaCl&sub2;·2H&sub2;O, hergestellt als eine 10x Stamm-Lösung und autoklaviert;
2. Spuren-Salze auf einer Endkonzentration von 0,2 µ CuSO&sub4; 5 H&sub2;O, 1,25 u KI, 4,5 u MnSO&sub4;·H&sub2;O, 2,0 u NaMoO&sub4; ·2H&sub2;O, 0,75 u H&sub3;BO&sub3;, 17,5 u ZnSO&sub4;·7H&sub2;O, 44,5 u FeCl&sub3;·6H&sub2;O, hergestellt als eine 400x Stamm-Lösung und sterilfiltriert;
3. 0,4 ug/ml Biotin; und
4. 2% Dextrose
E. coli wurde kultiviert in entweder LB-Medium oder 2B-Medium (0,2% NH&sub4;PO&sub4;, 1,2% Na&sub2;HPO&sub4;, 0,013% MgSO&sub4;· 7H&sub2;O, 0,074% CaCl&sub2;·2H&sub2; 0, 1 ug/ml Thiamin und 0,4% Dextrose) ergänzt mit 100 ug/ml Tryptophan und 0,2% Casaminosäuren.

D. DNA-Isolation

1. Präparationen von Hefe-DNA in großem Maßstab

Sowohl Pichia pastoris als auch S. cerevisiae DNA-Präparationen wurden ausgeführt durch Wachsen der Hefe-Zellen in 100 ml Minimal-Medium bis A&sub6;&sub0;&sub0; gleich 1-2 war und dann Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 2000 g für 5 Minuten. Die Zellen wurden einmal in H&sub2;O, einmal in SED, einmal in 1 Sorbitol gewaschen und dann in 5 ml 0,1 Tris-HCl (pH 7,0), welches 1 an Sorbitol ist, suspendiert. Die Zellen wurden mit 50-100 ul einer 4 mg/ml Lösung Zymolase 60.000 (Miles Laboratories) gemischt und bei 30ºC für eine Stunde inkubiert, um die Zell-Wände zu verdauen. Die Spheroplasten-Präparation wurde dann bei 1000 g für 5-10 Minuten zentrifugiert und in Lysis-Puffer (0,1% SDS, 10 m Tris-HCl (pH 7,4) 5 m EDTA und 50 m NaCl) suspendiert. Proteinase K (Boehringer Mannheim) und RNase A (Sigma) wurden jeweils auf 100 ug/ml hinzugefügt und die Mischung wurde bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Die DNA wurde deproteiniert durch sanftes Mischen der Präparation mit einem gleichen Volumen Chloroform, das Isoamylalkohol enthält (24:1, v/v), und die Phasen wurden durch Zentrifugation bei 12.000 g für 20 Minuten getrennt. Die obere (wässrige) Phase wurde in ein frisches Röhrchen abgezogen und mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Die Phasen wurden wie zuvor getrennt und die obere Phase in ein Röhrchen enthaltend 2-3 Volumen kaltes 100% Ethanol gegeben. Die Probe wurde sanft gemischt und die DNA wurde durch Aufwickeln auf einen Plastikstab gesammelt. Die DNA wurde sofort in 1 ml TE-Puffer aufgelöst und über Nacht bei 4ºC gegen 100 Volumen TE- Puffer dialysiert.

2. Hefe-DNA-Präparationen im kleinen Maßstab

5 ml von Hefe-Kulturen in Minimal-Medium wurden wachsen gelassen bis A&sub6;&sub0;&sub0; gleich 1-5 war und durch Zentrifugation bei 2.000 g für 5 Minuten geerntet. Die Zellen wurden in 1 ml SED suspendiert und in ein 1,5 ml Mikrofugen-Röhrchen, d. h. Eppendorf-Cup, überführt, einmal in 1 Sorbitol gewaschen und in 0,5 ml 0,1 Tris-HCl (pH 7,4), welches 1 an Sorbitol ist, resuspendiert. Zymolase 60.000 (10 ul einer 4 mg/ml Lösung) wurden hinzugefügt und die Zellen wurden für 30-60 Minuten bei 30ºC inkubiert. Die Zellen wurden dann für eine Minute zentrifugiert, in Lysis-Puffer suspendiert und bei 65-70ºC inkubiert. Nach 15 Minuten wurden die Proben mit 100 ul 5 Kaliumacetat gemischt, für 15 Minuten in ein Eisbad gestellt und für 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden in ein frisches Eppendorf-Cup dekantiert, das 1 ml 100% Ethanol enthielt, gemischt und für 10 Sekunden zentrifugiert. Schließlich wurden die DNA-Pellets für 10-15 Minuten luftgetrocknet und in 50 ul TE-Puffer aufgelöst.

E. coli DNA-Isolationen großen Maßstabs

E. coli Kulturen für Plasmid-Präparationen großen Maßstabs (0,5-11) wurden bei 37ºC unter Schütteln in 2B-Medium, das wie oben beschrieben ergänzt war und die entsprechende Menge Antibiotikum enthielt, wachsen gelassen. Für Zellen, die von pBR322 stammende Plasmide enthielten, wurden die Kulturen auf eine A&sub5;&sub5;&sub0; von ungefähr 0,7 wachsen gelassen, zu dieser Zeit wurde genügend Chloramphenicol hinzugesetzt, um eine Konzentration von 100 ug/ml zu ergeben und die Zellen wurden ungefähr 15 Stunden später geerntet. Stämme, die von pBR325 stammende Plasmide enthielten, wurden in das ergänzte 2B- Medium bei einem Ahfangs-A&sub5;&sub5;&sub0; von ungefähr 0,01-0,05 überimpft und unter Schütteln bei 37ºC für 20-24 Stunden vor dem Ernten inkubiert.

4. E. coli DNA-Präparationen kleinen Maßstabs

Für schnelle Plasmid-Isolationen in kleinem Maßstab werden 2 ml Kulturen in dem mit Antibiotika ergänzten 2B-Medium über Nacht bei 37ºC unter Schütteln wachsen gelassen und durch Zentrifugation in 1,5 ml Eppendorf-Cups geerntet. Plasmide von allen Präparationen werden durch die alkalische Lysis-Methode, die von Birnboim und Doly (1979) beschrieben worden ist, isoliert.

E. Schneiden von DNA und Fragment-Isolierung

Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs und Bethesda Research Laboratories erhalten und die Verdaus wurden gemäß Routinetechniken ausgeführt. Restriktions-Kartierungen wurden durch Vergleich von parallelen Verdaus von Plasmiden mit und ohne Insert-DNA ausgeführt. Restriktions-Fragmente wurden durch Elektroelution aus Agarose-Gelen in Whatman 3 MM Papierstreifen, die mit Dialyse-Schlauch verstärkt sind, gereinigt. Die Fragmente wurden aus dem Papier und dem Schlauch durch 3-4 Waschungen mit 0,1- 0,2 ml Volumen einer Lösung bestehend aus 0,1 NaCl 50 m Tris-HC1 (pH 8,0) und 1 m EDTA wiedergewonnen. Schließlich wurden die Fragmente mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in einem kleinen Volumen TE- Puffer wieder aufgelöst.

P. pastoris Bibliothek Konstruktion in E. coli

Für die Pichia pastoris DNA-YEp13 Bibliotheks-Konstruktion wurden 100 ug YEp 13 vollständig mit BamHI verdaut und mit Kälber intestinaler alkalischer Phosphatase behandelt, um die terminalen 5' Phosphate von der DNA zu entfernen. Ein 100 ug Aliquot von Wildtyp Pichia pastoris DNA von Pichia pastoris NRRL Y-1 1430 wurde partiell mit 10 Units Sau3AI durch Inkubation für 5 Minuten bei 37ºC in einem Gesamtvolumen von 1 ml verdaut. Fragmente von 5-10 kbp wurden größenselektiert durch Zentrifugation über einen 5-20% Sucrose-Gradienten. 1 ug des Vektors und 2 ug der Pichia Sau3AI Fragmente wurden gemischt mit 20 Units T4-DNA- Ligase (Bethesda Research Laboratories) in einem Gesamtvolumen von 200 ul und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die ligierten DNAs wurden in E. coli durch Zusatz des gesamten Ligations-Reaktions- Mixes zu 2 ml kompetenten E. coli 848 Zellen und Inkubation für 15 Minuten bei 0ºC transformiert. Die Mischung wurde auf 37ºC für 5 Minuten aufgewärmt, wonach 40 ml LB-Medium zugefügt wurden und die 37ºC Inkubation für eine weitere Stunde andauerte. Ampicillin wurde auf eine Gesamtkonzentration von 100 ug/ml zugegeben und die Inkubation für eine zweite Stunden fortgesetzt. Schließlich wurden die Zellen für 10 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, in 1 ml frischem LB-Medium resuspendiert und in gleichen Aliquots auf 10 LB-Agarplatten enthaltend 100 ug/ml Ampicillin ausgestrichen. Die resultierenden ungefähr 50.000 Kolonien wurden von den Platten gekratzt und ein Teil der Zellen wurde in 500 ml ergänztem 2B-Medium bei einer Start-A&sub5;&sub5;&sub0; von ungefähr 0,1 überimpft. Die Kultur wurde wachsen gelassen und das Plasmid wurde wie oben beschrieben extrahiert. Von den Kolonien, die für die Bibliothek vereinigt worden waren, waren 96 von 100 getesteten Tetracyclin-sensitiv und 7 von 10 getesteten enthielten Plasmide mit Insert-DNA.
Für die Pichia pastoris DNA-pYJ8ΔClaI Bibliotheks-Konstruktion wurden 50 ug pYJ8ΔCla komplett mit ClaI verdaut und mit Kälber intestinaler alkalischer Phosphatase verdaut, um das terminale 5, Phosphat von der DNA zu entfernen. Ein 100 ul Aliquot von DNA aus Pichia pastoris NRRL Y-15851 wurde teilweise mit 20 Units TaqI durch Inkubation für 5 Minuten bei 65ºC in einem Gesamtvolumen von 1 ml verdaut. Fragmente von 5-10 kbp wurden durch Elektroelution aus einem 0,5% Agarosegel größenselektiert (siehe Beispiel II, Sektion E). Ein ug des Vektors und 2 ug der Pichia TaqI Fragmente wurden mit 20 Units T4-DNA-Ligase (Bethesda Research Laboratories) in einem Gesamtvolumen von 200 ul gemischt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die ligierten DNAs wurden in E. coli durch Zusatz des gesamten Ligations-Reaktions- Mixes zu 2 ml kompetenten E. coli 848 Zellen transformiert und für 15 Minuten bei 0ºC inkubiert. Das Gemisch wurde auf 37ºC für 5 Minuten aufgewärmt, wonach 40 ml LB-Medium hinzugefügt wurden und die 37ºC Inkubation für eine weitere Stunde andauerte. Ampicillin wurde dann auf eine Gesamtkonzentration von 100 ug/ml zugesetzt und die Inkubation für eine zweite Stunde fortgesetzt. Schließlich wurden die Zellen für 10 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, in 1 ml frischem LB-Medium resuspendiert und in gleichen Aliquots auf 10 LB-Agarplatten enthaltend 100 ug/ml Ampicillin ausgestrichen. Die resultierenden ungefähr 10.000 Kolonien wurden von den Platten abgekratzt und ein Teil der Zellen wurden in 500 ml ergänztem 2B-Medium bei einer Start-A&sub5;&sub5;&sub0; von ungefähr 0,1 überimpft. Die Kultur wurde wachsen gelassen und die Plasmide wurden wie oben beschrieben extrahiert.

G: Southern Hybridisierungen

Für den Transfer von großen oder von "Supercoil"-DNA Molekülen auf Nitrocellulose, wurde die DNA erst partiell durch Spülen der Agarose-Gele in 0,25 HCl für 10 Minuten vor der alkalischen Denaturierung hydrolysiert. Die Hybridisierung von markierten Fragmenten von dem S. cerevisiae HIS4 Gen mit Pichia pastoris DNA wurde in der Anwesenheit von 50% Formamid, 6x SSC, 5x Denhardtls, 0,1% SDS, 1 m EDTA und 100 ug/ml denaturierter Hering-Sperm-DNA bei 42ºC ausgeführt. Nach der Hybridisierung wurde in 1x SSC 1 m EDTA, 0,1% SDS und 1,0% Natriumpyrophosphat bei 65ºC gewaschen. Die DNA wurde³² P-markiert, wie in Beispiel IV beschrieben.

H.DNA-Sequenzierung

Die DNA wurde durch die Dideoxynucleotid-Ketten-Terminationsmethode von Sanger et al (1980) sequenziert.

Hefe-Transformationen

S. cerevisiae-Transformationen wurden ausgeführt durch die Spheroplasten-Generations-Methode von Hinnen et al (1978).
Pichia pastoris-Transformationen wurden dem oben beschriebenen Verfahren folgend durchgeführt.

J. Analyse der Pichia pastoris-Transformanten

Die Fähigkeit von jedem Plasmid, als autonomes Element in Pichia pastoris Zellen behalten zu werden, wurde wie folgt bestimmt: Eine Transformanten-Kolonie wurde aus der Regenerations-Agarplatte gepickt und auf eine SD-Medium-Agarplatte gestrichen und in flüssige IMG-Medium überimpft. Die SD-Platte wurde bei 30ºC für 3 Tage inkubiert, wonach eine Einzelkolonie von dieser Platte gepickt wurde, auf eine zweite SD-Platte gestrichen und in eine zweite Flasche mit IMG-Medium überimpft wurde. Dieses Verfahren wurde ein drittes Mal wiederholt. Die 3 IMG-Kulturen wurden bei 30ºC unter Schütteln bis zu einer A&sub6;&sub0;&sub0; von ungefähr 1-2 wachsen gelassen und dann durch Zentrifugation geerntet. Die DNA von den Hefe- Kulturen wurde wie oben beschrieben extrahiert, bei 30 Volt 30 mA für 10-15 Stunden in 0,8% Agarose-Gelen elektrophoretisch aufgetrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit den oben beschriebenen ³²P-markierten pBR322 oder pBR325 hybridisiert. Als Kontrolle wurde eine Probe enthaltend 10 ng aus E. coli isoliertes Plasmid und eine Probe enthaltend 1-2 ug untransformierte Pichia pastoris GS 115 DNA parallel mit den experimentellen Proben elektrophoretisch aufgetrennt.

Isolation von Pichia DNA Sequenzen

DNA-Fragmente, die das Pichia HIS4-Gen enthielten, wurden aus einer Pichia DNA-Bibliothek, durch ihre Fähigkeit den S. cerevisiae his4-Stamm zu komplementieren, isoliert. Die Bibliothek war zusammengesetzt aus 5-20 kbp Sau3AI partiell verdauten Fragmenten von Wildtyp Pichia DNA insertiert in die BamHI-Stelle des S. cerevisiae-E. coli Shuttle Vektors YEp13. Spheroplasten von S. cerevisiae NRRL Y-15859 (5799-4D; ein his4ABC&supmin;Stamm) wurden durch die Technik von Hinnen et al (1978) erzeugt, mit der Pichia DNA-Bibliothek gemischt, und sie durften sich in einem Medium, dem Histidin fehlte, regenerieren. Die Transformation lieferte ungefähr 1·10³ prototrophische Hefe-Kolonien aus einer Population von 5·10&sup7; gesamtregenerierbaren Spheroplasten. Gesamt Hefe-DNA wurde aus 20 von den His+ Kolonien extrahiert und in E. coli transformiert. 17 der Hefe DNA-Präparationen produzierten Alnpicillin-resistente Kolonien und jede enthielt ein Plasmid, das YEp13 plus Insert-DNA umfaßte. Um sicherzustellen, daß die His+ transformierenden Plasmide das Pichia His4 Gen enthielten und nicht ein DNA-Fragment mit Suppressor-Aktivität, wurden die Restriktions- Verdaus der Plasmide mit einem markierten DNA-Fragment enthaltend einen großen Teil des S. cerevisiae HIS4 Gens hybridisiert und bei geringer Stringenz gewaschen. Jedes der Plasmide, das die his4 S. cerevisiae Stämme komplementierte, enthielt Sequenzen, die mit dem S. Cerevisiae HIS4-Gen hybridisierten.
Um nach DNA-Fragmenten zu suchen, die Pichia ARS-Aktivität enthielten, wurde DNA aus Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) partiell mit TaqI verdaut und 5 bis 10 kbp Fragmente wurden isoliert und in die einzige ClaI Stelle von pYJ8bCla kloniert (siehe Fig. 26). Plasmid-DNA wurde aus ungefähr 10.000 His+ Pichia Kolonien gewonnen und verwendet, um E. coli zu transformieren. Plasmide von ungefähr 10.000 Ampicillin-resistenten Kolonien wurden isoliert und dann zurück in GS 115 transformiert. Vierzig der His+ Hefe-Kolonien von dieser Unterbibliotheks-Transformation wurden separat auf selektives Medium ausgestrichen und in separaten Kulturen in selektivem Medium wachsen gelassen. Gesamt Hefe-DNA wurde von jedem dieser 40 Kulturen extrahiert und in E. coli transformiert. Zwei Plasmide, pYA63 (PARS1) und pYA90 (PARS2), deren Hefe-DNA-Präparationen die am meisten Ampicillin-resistenten E. coli Kolonien lieferten, wurden für die weitere Analyse ausgesucht. Beide dieser Plasmide transformierten Pichia pastoris GS 115 (NRRL Y-15851) mit einer besonders hohen Frequenz und jedes enthielt ein Insert von fremder DNA.

BEISPIEL XIV

Konstruktion von regulatorische Region-lacZ Gen-Fusionen

A. p72 (Alkoholoxidase) regulatorische Region-Konstrukte

Plasmid pPG 4.0, ein pBR322 Vektor, der das 4 Kilobasenpaar Eco- RI-PvuII genomische DNA-Fragment von Pichia pastoris enthielt, wurde mit PstI geschnitten, mit S1-Nuclease behandelt, um "Blunt- Enden", wo die Spaltung stattfindet, herzustellen, dann mit BamHI, um ein 1,12 kbp DNA-Fragment zu ergeben, geschnitten, welches die Alkoholoxidase regulatorische Region und die Codierungs-Information für die ersten 15 Aminosäuren für Alkoholoxidase enthält. Dieses 1,12 kbp DNA-Fragment hat die folgende Nukleotidsequenz:
Diese 1,12 kbp wurden in den EcoRI/SmaI/BamHI Linker (gespalten mit BamHI und 5mal) des E. coli-S. cerevisiae Shuttle Vektors pSEY101, Douglas et al (1984), ligiert. Vektor pSEY101 enthält das E. coli lacZ Gen und einen Polylinker mit der folgenden Nukleotid- Sequenz:
um das Hybrid-Plasmid pTAO11 (siehe Fig. 29) zu ergeben.
Weil die regulatorische Region-lacZ Gen-Fusion von pTAO11 aus der Phase ist mit Bezug auf die Herstellung von β-Galaktosidase wie in Sequenz E gezeigt: Sequence E
Vektor pTAO11 wird an der einzigen BamHI-Stelle gespalten und der folgende Smal Linker insertiert:
wodurch der Hybridvektor pTAO12 hergestellt wird, der die folgende Nukleotidsequenz hat in Bezug auf die regulatorische Region-lacZ- Fusion: Sequence F
und somit ist die regulatorische Region lacZ-Fusion von pTAO12 immer noch aus der Phase mit Bezug auf den lacZ-Leserahmen. Um die N-terminale Codierungsinformation für das Alkoholoxidase-Strukturgen in einen offenen Leserahmen mit dem strukturellen lacZ-Gen zu bringen, wurde pTAO 12 mit EcoRI-Smal behandelt und das resultierende DNA-Fragment in pSEY101 ligiert, das ebenso mit EcoRI und Smal behandelt worden war, wodurch der Hybridvektor pTAO 13 hergestellt worden ist (siehe Fig. 30 und die Nukleotid- Sequenz unten): Seqience G
Der Vektor pTAO13 wurde dann verwendet, um S. cerevisiae SEY2102 zu transformieren für weitere unten in Beispiel XV beschriebenen Studien.
Vektor pTAO13 wurde dann mit PstI oder PstI-NruI gespalten und die regulatorische Region-lacZ-Fusion, die in dem gespaltenen Fragment enthalten war, wurde mit dem HIS4 Gen-enthaltenen Fragment von Shuttle Vektor pTAFHI (siehe Fig. 28), pYJ30 (siehe Fig. 27) oder pYA2 (siehe Fig. 23) ligiert, um die Plasmide pSAOH 1, pSAOH 5 bzw. pSAOH 10 zu ergeben. plus Resultierende Plasmide

B. p76 regulatorische Region-Konstrukte

Regulatorische Region-lacZ Gen-Fusionen wurden wie folgt mit der p76 regulatorischen Region hergestellt.

1. Verwendung des gesamten 5, Teils von pPG 6,0

Das 1,35 kbp I-Fragment von pPG 6.0 wurde in die einzige RI Stelle von pSEY101, einem E. coli-S. cerevisiae Shuttle Vektor kloniert, wobei sich das Plasmid pT76U1 (siehe Fig. 30a) ergibt. Vektor pT76UI wurde dann mit I- I gespalten und das längere DNA-Fragment mit dem HIS4 Genenthaltenden Fragment von Shuttle Vektor pTAFH1 (Fig. 28) ligiert, um wie oben beschrieben pT76H3 zu ergeben; oder mit dem an dem RI-Ende aufgefüllten I- RI-Fragment des Shuttle Vektors pBPf1 (siehe Fig. 34) ligiert, um pT76H4 zu ergeben.

2. Verwendung eines 31 Verdaus von 5' pPG 6,0

Ein 1,35 kbp EcoRI-Fragment von pPG 6.0 wurde in die einzige EcoRI Stelle von pSEY8, einem E. coli-S. cerevisiae Shuttle Vektor, kloniert, welcher eine einzige SalI-Stelle angrenzend zu der EcoRI-Stelle hat, in welche die Pichia DNA insertiert war, wodurch sich Plasmid pTAO1 ergab (siehe Fig. 31). Das Plasmid pTAO1 wurde mit SalI gespalten, mit Bal31-Exonuclease behandelt, um "Blunt-End"-Fragmente der regulatorischen Region von Polypeptid p76 in verschiedenen Längen herzustellen. Die "Blunt-End"-Fragmente wurde von dem restlichen Plasmid pSEY8 durch Spaltung mit EcoRI befreit. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden in den EcoRI-SmaI-Linker von pSEY101 kloniert, um u. a. Plasmid pTAF.85 (siehe Fig. 32) zu ergeben. Plasmid pTAF.85 ist analog zu pTAO11, das in Fig. 29 gezeigt ist, jedoch mit der p76 regulatorischen Region anstelle der p72 (Alkoholoxidase) regulatorischen Region.
Vektor pTAF.85 wurde dann in analoger Weise wie Vektor pTAO13 behandelt, um die Plasmide pTAFH.85, pT76H1 und pT76H2 zu ergeben. Somit wurden die folgenden Vektoren gespalten und ligiert: plus Resultierende Plasmid

BEISPIEL XV

Regulation der β-Galaktosidase-Produktion in Pichia pastoris

Die Herstellung von β-Galaktosidase durch verschiedene Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) Transformanten, die auf verschiedenen Kohlenstoffquellen und unter verschiedenen Bedingungen gewachsen waren, wurde untersucht. Die transformierten Stämme wurden in Minimal-Medium enthaltend 0,5 ug/ml Biotin und 0,1% Glucose bei 30ºC wachsen gelassen bis sie die stationäre Phase erreichten. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt und in Minimal-Medium enthaltend 0,5 ug/ml Biotin und 0,5% Methanol übertragen und für ungefähr 3 bis 5 Generationen bei 30ºC wachsen gelassen. Nach diesem anfänglichen Wachstum auf Methanol wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in frisches Minimal-Medium enthaltend 0,5 ug/ml Biotin und entweder 0,1% Glucose oder 0,3% Methanol als Kohlenstoffquelle übertragen. Die Zellen wurden dann bei 30ºC für ungefähr 80 Stunden inkubiert, wobei periodisch Proben abgezogen wurden, um die Alkoholoxidase- und β-Galaktosidase-Level zu bestimmen. Nach ungefähr 20-50 Stunden war die Kohlenstoffquelle erschöpft und danach wurden die Zellen unter diesen Kohlenstoffquellen-Mangel-Bedingungen gehalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. TABELLE I Maximale Level (Inkubationszeit, Std.) von β-Galaktosidase und Alkoholoxidase (Units/OD&sub6;&sub0;&sub0;) in Transformanten von Pichia pastoris NRRL Y-15851 β-Galaktosidase Plasmid Glucose Glucose-Mangel Methanol Alkoholoxidase Plasmid Glucose Glucose-Mangel Methanol
a Die Zellen wurden abgezogen zu verschiedenen Zeitpunkten und β- Galaktosidase und Alkoholoxidase Aktivitäts-Assays wurden ausgeführt wie im Text beschrieben.
nd = nicht bestimmt
Die Alkoholoxidase wurde durch die oben beschriebene Farbstoff-Peroxidase-Methode bestimmt (siehe Beispiel VII) und die β-Galaktosidase wurde wie folgt bestimmt: B-Galaktosidase-Assay A. Benötigte Lösungen Z-Puffer End-Konzentration
auffüllen auf 1l; pH sollte 7 sein

O-Nitrophenyl-β-D-Galaktosid (ONPG):

Löse 400 mg ONPG (Sigma N-1127) in 100 ml destilliertem Wasser auf, um eine 4 mg/ml ONPG-Lösung herzustellen.

B. Assay-Verfahren:

1. Ziehe ein Aliquot aus dem Kulturmedium (0,1-0,5 0D&sub6;&sub0;&sub0; Hefe- Zellen) ab, zentrifugiere und wasche das Zellpellet mit Wasser.
2. Füge 1 ml Z-Puffer zu dem Zellpellet, 30 ul CHCl&sub3; und 30 ul 0,1% SDS, vortexe, inkubiere 5 Minuten bei 30ºC.
3. Starte die Reaktion durch Hinzufügen von 0,2 ml ONPG (4 mg/ml), vortexe.
4. Stop die Reaktion durch Hinzufügen von 0,5 ml einer 1 Na&sub2;CO&sub3;-Lösung zu dem entsprechenden Zeitpunkt (A&sub4;&sub2;&sub0; < 1).
5. Lese die Absorption des Überstands bei 420 mn ab.

C. Berechnung der β-Galaktosidase Aktivitäts-Units:

1 U = 1 nmol von Orthonitrophenol (ONP) gebildet pro Minute bei 30ºC und einem pH = 7.
1 nmol von ONP hat bei 420 nm (A&sub4;&sub2;&sub0;) eine Absorption von 0,0045 mit einer Weglänge von 1 cm; somit stellt eine Absorption von 1 bei 420 mn 222 nmole ONP/ml dar oder 378 nmole/ 1,7 ml, weil das Gesamtvolumen des zu analysierenden Überstands 1,7 ml ist. Daher werden die in den Tabellen ausgedruckten Einheiten (Units) berechnet:
Die in Tabelle I präsentierten Ergebnisse zeigen an, daß ein zu Hefe fremdes Protein, d. h. β-Galaktosidase, in Pichia pastoris, die entweder durch die Anwesenheit von Methanol im Wachstums-Medium oder durch Kohlenstoffquellen-Mangel nach Wachstum auf einer Katabolit-reprimierenden Kohlenstoffquelle reguliert wird, produziert werden kann.

BEISPIEL XVI

Regulation der β-Galaktosidase-Produktion in S. cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae SEY2102, ein Stamm, der Uracil, Leucin und Histidin Ergänzung für das Überleben erfordert, wurde mit den Plasmiden pTAO13 und pT76U1 transformiert. Die transformierten Organismen werden leicht durch Selektionieren auf Kolonien, die keinen Uracil-Zusatz für ihr Wachstum benötigen, isoliert. Die isolierten Transformanten erhielten die Labor-Bezeichnungen SEY2102-pTAO13 bzw. SEY2102-pT76U1. SEY2102-pTAO13 wurde beim Northern Research Center in Peoria, Illinois, hinterlegt, um Zugang für die Öffentlichkeit ab einem Hinterlegungs-Datum am 31.08.1984 zu sichern. Dieser Stamm erhielt die Hinterlegungs-Nummer NRRL Y-15858.
Die Zellen von NRRL Y-15858 und SEY2102-pT76Ul wurden bei 30ºC für ungefähr 3-4 Generationen in Minimal-Medium enthaltend 20 ug/ml Histidin und Leucin und 5% Glucose inkubiert. Die Zellen wurden dann übergewechselt, d. h. durch Zentrifugation gesammelt und in YP-Medium mit 3% der Kohlenstoffquelle, wie in Tabelle II angezeigt, transferiert und für ungefähr 5 Generationen bei 30ºC wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann für zusätzliche 50 Stunden unter Kohlenstoffquellen-Mangel-Bedingungen inkubiert und periodisch auf β-Galaktosidase untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt. TABELLE II Produktion von β-Galaktosidase durch S. cerevisiae β-Galaktosidase, Units/OD&sub6;&sub0;&sub0; A. Alkoholoxidase regulatorische Region (pTA013) Kohlenstoffquelle Nach 5 Generationen Mangel-Bedingungen Glucose Fructose Ethanol Glycerin Galaktose B. p76 regulatorische Region
Diese Ergebnisse zeigen an, daß ein zu Hefe fremdes Protein, d. h. β- Galaktosidase, durch Saccharomyces cerevisiae produziert werden kann, reguliert durch die p72 (Alkoholoxidase) und p76 regulatorische Regionen unter Kohlenstoffquellen-Mangel-Bedingungen, wenn eine Katabolit-reprimierende Kohlenstoffquelle für das Wachstum verwendet worden ist oder durch Wachstum von transformierten S. cerevisiae Zellen auf einer relativ Nicht-Katabolit reprimierenden Kohlenstoffquelle wie Glycerin oder Galaktose.
Die Expressions-Level für β-Galaktosidase in S. cerevisiae unter der Kontrolle der regulatorischen Region in dieser Erfindung können verglichen werden mit den Expressions-Level, die mit anderen S. cerevisiae regulierenden Promotoren möglich sind. Promotor Kohlenstoffquelle β-Galaktosidase, Units/OD&sub6;&sub0;&sub0; Cytochrome Raffinose Galactose Galaktose Invertase Glucose
Es wurde gesehen, daß die regulatorischen Regionen dieser Erfindung überraschenderweise als S. cerevisiae Promotoren mindestens ebenso effektiv oder effektiver sind wie solche Promotoren, die nativ zu S. cerevisiae sind.

BEISPIEL XVII

Southern Hybridisierungen mit genomischer Hefe-DNA

Neun verschiedene Methanol assimilierende Hefen und eine Methanol nicht-assimilierende Hefe wurden auf Minimal-Medien (IM1, siehe Beispiel 1) plus 0,75% Methanol bzw. 1,0% Glucose wachsen gelassen. Gesamt-chromosonale DNA wurde, wie in Beispiel VI beschrieben, isoliert, d. h. die gesamten Nukleinsäuren wurden isoliert, mit RNase A behandelt, zuerst mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, dann mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und schließlich mit Ethanol präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde in einem minimalen Volumen TE-Puffer resuspendiert und zentrifugiert, um die DNA-Lösung zu reinigen.
Southern-Hybridisierungs-Filter wurden, wie in Beispiel VI beschrieben, hergestellt, d. h. 10 ug Gesamt-DNA von verschiedenen Hefe-Spezies wurden mit einem Überschuß HindIII verdaut, elektrophoretisch aufgetrennt, die DNA denaturiert, das Gel neutralisiert und die DNA auf Nitrozellulose-Filter übertragen. Die Prähybridisierungsbedingungen für diese Filter schlossen die Behandlung mit 50% deionisiertem Formamid, 6x SSC, 5x Den-hardt's, 1 m EDTA, 0,1% SDS und 100 ug/ml denaturierter Lachs-Sperm DNA bei 42ºC über Nacht ein. Die gleichen Bedingungen wurden als Hybridisierungs-Medium unter Verwendung von ³²P-nick-translatierten Sonden auf eine Endkonzentration von 10&sup6; cpm/ml verwendet. Die Sonden schlossen die cDNA-Inserts (PstI-Fragmente) der Klone pPC 8.3, pPC 15.0 und pPC 6.7, sowie ein 2.7 kbp BglII DNA- Fragment von P. pastoris HIS4-Gen ein. Jede dieser Sonden wurde separat auf identischen Filtern für die Hybridisierung, die 24 Std. bei 42 ºC dauerte, verwendet. Nach der Hybridisierung wurden die Filter zweimal für 15 Min. bei Raumtemperatur und dreimal bei 65ºC für 15 Minuten in einer Lösung enthaltend 2x SSC, 1 m EDTA, 0,1% SDS und 0,1% Natriumpyrophosphat, gewaschen. Andere Waschungen wurden bei geringerer Stringenz versucht, d. h. bei 55ºC und 42ºC, um die Hybridisierungsergebnisse zu bestätigen. Die Filter wurden dann für 72 Std. autoradiografiert. Die Ergebnisse dieser Hybridisierungen sind in Tabelle III zusammengefaßt. TABELLE III Hybridisierung von P. pastoris Genen mit verschiedener chromosomaler Hefe-DNA P. pastoris P. pastoris Hansenula H. henricii H. nonfermentans H. polymorpha H. wickerhamii Torulopsis Saccharomyces Legende Hybridisierung schwache Hybridisierung keine Hybridisierung beobachtet unter den verwendeten Bedingungen
Die in Tabelle III präsentierten Ergebnisse zeigen an, daß die Gene für Polypeptide analog zu p76, p72 und p40 in praktisch allen Methanolassimilierenden Hefen anwesend sind. Es soll bemerkt werden, daß keines dieser drei Gene durch Hybridisierung von DNA aus einer Methanol nicht-assimilierenden Hefe, S. cerevisiae, beobachtet wurde, während Homologie zwischen dem P. pastoris HIS4-Gen und dem HIS4-Gen aus S. cerevisiae leicht beobachtet werden konnte.
Die Beispiele werden lediglich bereitgestellt, um die Praxis der Erfindung zu illustrieren und sollen nicht als Einschränkung des Umfangs dieser Erfindung oder der anhängenden Ansprüche gelesen werden. Vernünftige Variationen und Modifikationen, die nicht von dem Wesen und Geist der Erfindung wegführen, werden als innerhalb des Umfangs des gewünschten und gedachten Patentschutzes liegend betrachtet.

Bibliographie

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Der folgende Teil der Beschreibung sind bevorzugte Ausführungsbeispiele 1 bis 34, dargestellt in Form von Ansprüchen.
1. DNA-Fragment, das eine regulatorische Region, die aus Pichia pastoris stammt, umfaßt, wobei die regulatorische Region auf die Anwesenheit von Methanol im Kulturmedium anspricht, mit dem ein Wirtsorganismus für dieses DNA-Fragment in Kontakt ist, wobei die regulatorische Region fähig ist, die Transkription von Messenger RNA zu kontrollieren, wenn sie am 5' Ende einer DNA positioniert ist, die für diese Messenger RNA codiert, wobei die regulatorische Region ausgewählt ist aus:
a) die regulatorische Region, die die Transkription von Messenger RNA kontrolliert, die für Dihydroxyacetonsynthase codiert, wobei die Region aus Klon pPG 6.0 (NRRL B-15867) von der 5'- HindIII-Schnittstelle bis zur 3'-XhoI-Schnittstelle erhältlich ist;
b) die regulatorische Region, die die Transkription von Messenger RNA kontrolliert, die für Alkoholoxidase codiert, wobei die regulatorische Region aus Klon pPG 4.0 (NRRL B-15868) von der 5'-EcoRI-Schnittstelle bis zur 3'-EcoRV-Schnittstelle erhältlich ist;
c) die regulatorische Region, die die Transkription von Messenger RNA kontrolliert, die für p40 codiert, wobei die regulatorische Region aus Klon pPG4.8 (NRRL B-15869) von der 5' BamHI- Schnittstelle bis zu der 3'-SalI-Schnittstelle erhältlich ist.
2. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 1, wobei die regulatorische Region aus dem Hefestamm Pichia pastoris stammt.
3. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 2, wobei die Hefe Pichia pastoris NRRL Y-11430 ist.
4. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 3, wobei die regulatorische Region die Transkription von Messenger RNA kontrolliert, die für die Produktion von Alkoholoxidase codiert.
5. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 3, wobei die regulatorische Region die Transkription von Messenger RNA kontrolliert, die für die Produktion von Polypeptid p76 codiert.
6. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 3, wobei die regulatorische Region die Transkription von Messenger RNA kontrolliert, die für die Produktion von Polypeptid p40 codiert.
7. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 4, wobei dieses weiter die 3' DNA-Sequenz stromabwärts bzw. "downstream" der DNA umfaßt, die für die Produktion von Alkoholoxidase codiert.
8. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 5, wobei dieses weiter die 3' DNA-Sequenz stromabwärts bzw. "downstream" der DNA umfaßt, die für die Produktion von Polypeptid p76 codiert.
9. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 6, wobei dieses weiter die 3' DNA-Sequenz stromabwärts bzw. "downstream" der DNA umfaßt, die für die Produktion von Polypeptid p40 codiert.
10. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 1, wobei die Messenger RNA für die Produktion eines heterologen Polypeptids codiert.
11. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 4, wobei dieses Fragment die Nukleotidsequenz hat:
12. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 4, wobei das Fragment die Nukleotidsequenz hat:
13. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 4, wobei das Fragment die Nukleotidsequenz hat:
14. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 5, wobei das Fragment die Nukleotidsequenz hat:
15. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 1, wobei dieses weiter umfaßt:
eine Polypeptid codierende Region; wobei die regulatorische Region am 5, Ende dieser Polypeptid codierenden Region positioniert ist.
16. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 15, wobei die Polypeptid codierende Region für die Produktion von Alkoholoxidase codiert.
17. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 16, wobei das Fragment die Nukleotidsequenz hat:
18. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 15, wobei die Polypeptid codierende Region für die Produktion von Polypeptid p76 codiert.
19. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 15, wobei die Polypeptid codierende Region für die Herstellung von Polypeptid p40 codiert.
20. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 15, wobei die Polypeptid codierende Region für die Herstellung eines heterologen Polypeptids codiert.
21. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 20, wobei das heterologe Polypeptid β-Galaktosidase ist.
22. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 15, wobei dieses weiter eine 3' DNA-Sequenz stromabwärts bzw. "downstream" der Polypeptid codierenden Region umfaßt, wobei die 3' DNA-Sequenz fähig ist, die Polyadenylierung, Termination der Transkription und Termination der Translation von Messenger RNA, die für die Polypeptid codierende Region codiert, zu kontrollieren.
23. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 15 oder 22, wobei das DNA-Fragment weiter eine oder mehrere zusätzliche DNA-Sequenzen umfaßt, die aus der Gruppe stammen, die bestehend aus:
bakterielle Plasmid DNA,
Bakteriophagen DNA,
Hefeplasmid DNA und
Hefe-chromosomale DNA.
24. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 23, wobei die Hefe-chromosomale DNA eine autonom replizierende DNA Sequenz und ein Markergen umfaßt.
25. Gen, das für die Herstellung von Alkoholoxidase codiert oder einer Untereinheit davon oder einem Äquivalent eines solchen Gens oder einer solchen Untereinheit.
26. Gen gemäß Ausführungsbeispiel 25, wobei das Gen die Nukleotidsequenz hat:
27. Gen, das für die Herstellung von p76 codiert oder einer Untereinheit davon oder einem Äquivalent eines solchen Gens oder einer solchen Untereinheit.
28. Gen, das für die Herstellung von Polypeptid p40 codiert oder einer Untereinheit davon oder einem Äquivalent eines solchen Gens oder einer solchen Untereinheit.
29. DNA-Fragment gemäß Ausführungsbeispiel 23, wobei das Fragment die Form eines geschlossenen zirkulären Hybridplasmids hat.
30. Transformierter Hefestamm, wobei der transformierte Hefestamm ein Wirt für rekombinantes DNA-Material ist;
wobei das rekombinante DNA-Material umfaßt:
(1) ein DNA-Fragment, und
(2) eine Polypeptid codierende Region;
wobei das DNA-Fragment mindestens auf eine der Bedingungen anspricht, die aus der Gruppe ausgewählt ist:
(i) die Anwesenheit von Methanol in dem Kulturmedium' in dem ein Wirtorganismus für dieses DNA-Fragment in Kontakt ist, und
wobei die regulatorische Region am 5' Ende der Polypeptid codierenden Region positioniert ist; und wobei der transformierte Hefestamm fähig ist, das Polypeptid zu exprimieren, das durch die Polypeptid codierende Region codiert wird.
31. Transformierter Hefestamm gemäß Ausführungsbeispiel 30, wobei der transformierte Hefestamm auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen kann.
32. Transformierter Hefestamm gemäß Ausführungsbeispiel 30, wobei das rekombinante DNA-Material weiter ein zweites DNA-Fragment umfaßt;
wobei das zweite DNA-Fragment fähig ist, die Polyadenylierung, Termination der Transkription und Termination der Translation von Messenger RNA zu kontrollieren, wenn es am 3' Ende der Polypeptid codierenden Region positioniert ist, welche für die Produktion der Messenger RNA codiert.
33. Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden, wobei das Verfahren umfaßt:
Kultivieren eines transformierten Hefestamms in einem Wachstumsmedium, das Methanol enthält, wobei der transformierte Hefestamm fähig ist, eine insertierte Polypeptid codierende Sequenz zu exprimieren, die aus rekombinantem DNA-Material stammt;
wobei das rekombinante DNA-Material umfaßt:
(1) ein auf Methanol ansprechendes DNA-Fragment, und
(2) eine Polypeptid codierende Region;
wobei das auf Methanol ansprechende DNA-Fragment am 5' Ende der Polypeptid codierenden Region positioniert ist.
34. Verfahren gemäß Ausführungsbeispiel 33, wobei dieses weiter umfaßt:
Isolieren und Reinigen des Polypeptids.

Claims

1. DNA-Fragment, das eine regulatorische Region, die aus Pichia pastoris stammt, umfaßt, wobei die regulatorische Region auf die Anwesenheit von Methanol im Kulturmedium anspricht, mit dem ein Wirtsorganismus für dieses DNA-Fragment in Kontakt ist, wobei die regulatorische Region fähig ist, die Transkription von Messenger RNA zu kontrollieren, wenn sie am 5' Ende einer DNA positioniert ist, die für diese Messenger RNA codiert, wobei die regulatorische Region ausgewählt ist aus:

a) die regulatorische Region, die die Transkription von Messenger RNA kontrolliert, die für Dihydroxyacetonsynthase codiert, wobei die Region aus Klon pPG 6.0 (NRRL B-15867) von der 5'- HindIII-Schnittstelle bis zur 3'-XhoI-Schnittstelle erhältlich ist;

b) die regulatorische Region, die die Transkription von Messenger RNA kontrolliert, die für Alkoholoxidase codiert, wobei die regulatorische Region aus Klon pPG 4.0 (NRRL B-15868) von der 5' EcoRI-Schnittstelle bis zur 3' EcoRV-Schnittstelle erhältlich ist;

c) die regulatorische Region, die die Transkription von Messenger RNA kontrolliert, die für p40 codiert, wobei die regulatorische Region aus Klon pPG4.8 (NRRL B-15869) von der 5'-BamHI- Schnittstelle bis zu der 3'-SalI-Schnittstelle erhältlich ist.

2. DNA-Fragment nach Anspruch 1, wobei dieses weiter eine Polypeptid codierende Region umfaßt, wobei die regulatorische Region am 5' Ende der Polypeptid codierenden Region positioniert ist.

3. DNA-Fragment nach Anspruch 2, wobei dieses weiter eine 3'-DNA- Sequenz stromabwärts der Polypeptid codierenden Region umfaßt, wobei die 3' DNA-Sequenz fähig ist, die Polyadenylierung, Termination der Transkription und Termination der Translation von Messenger RNA, für die die Polypeptid codierende Region codiert, zu kontrollieren.

4. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Region aus Pichia pastoris NRRL Y-1 1430 stammt.

5. DNA-Fragment nach Anspruch 3, wobei dieses weiter eine oder mehrere zusätzliche DNA-Sequenzen umfaßt, wobei diese aus der Gruppe Bakterienplasmid-DNA, Bakteriophagen-DNA, Hefeplasmid-DNA und Hefe-chromsomale DNA stammen.

6. DNA-Fragment nach Anspruch 5, wobei die chromosomale Hefe-DNA eine autonom replizierende DNA-Sequenz und ein Marker-Gen umfaßt.

7. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 2-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptid codierende Region für ein heterologes Polypeptid codiert.

8. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 2-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptid codierende Region für Alkoholoxidase codiert.

9. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 2-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptid codierende Region für Dihydroxyacetonsynthase codiert.

10. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 2-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptid codierende Region für Polypeptid p40 Codiert.

11. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 2-6, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment in der Form eines geschlossenen zirkulären Hybridplasmids ist.

12. Aus Pichia pastoris stammendes Gen, das für Alkoholoxidase codiert, wobei das Gen als regulatorische Region eine regulatorische Region hat, die in dem DNA-Fragment von Anspruch 1 enthalten ist.

13. Aus Pichia pastoris stammendes Gen, das für Dihydroxyacetonsynthase codiert, wobei das Gen als regulatorische Region eine regulatorische Region hat, die in dem DNA-Fragment von Anspruch 1 enthalten ist.

14. Aus Pichia pastoris stammendes Gen, das für Polypeptid p40 codiert, wobei das Gen als regulatorische Region eine regulatorische Region hat, die in dem DNA-Fragment von Anspruch 1 enthalten ist.

15. Transformierter Hefestamm, der erhalten wird durch Transformieren eines Pichia pastoris Wirts mit einem Expressionsvektor, der rekombinantes DNA-Material enthält, wobei das rekombinante DNA-Material das DNA-Fragment von Anspruch 3 umfaßt.

16. Transformierter Hefestamm nach Anspruch 15, wobei der Pichia pastoris Wirt GS 115 (NRRL Y-15851) ist.

17. Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden, wobei dieses das Kultivieren des transformierten Hefestamms von Anspruch 15 oder 16 in einem Wachstumsmedium und Induzieren der Expression in Anwesenheit von Methanol und Gewinnen der Polypeptide umfaßt.

18. Verfahren von Anspruch 17, wobei das Wachstumsmedium zum Kultivieren des transformierten Hefestamms von Anspruch 15 oder 16 Methanol enthält.