DE69233031T2

DE69233031T2 - Hefepromotor und seine verwendung

Info

Publication number: DE69233031T2
Application number: DE69233031T
Authority: DE
Inventors: Claudio Falcone; Reinhard Fleer; Michele Saliola
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1991-08-21
Filing date: 1992-08-19
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2012-08-20
Also published as: AU2489392A; DE69233031D1; ES2199217T3; EP0599971A1; WO1993004176A1; FR2680518B1; DK0599971T3; NZ244018A; PT599971E; EP0599971B1; JPH07500008A; CA2113925A1; FR2680518A1; US5627046A; EP0531187A1; ATE239087T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie. Insbesondere betrifft sie eine neue DNA- Sequenz, die eine Aktivität eines Transkriptionspromotors besitzt, Expressionsvektoren, die diese Sequenz enthalten, und deren Verwendung zur Produktion von rekombinanten Proteinen und beispielsweise von heterologen Proteinen. Die Erfindung betrifft auch rekombinante Zellen, die diese DNA-Sequenz enthalten.
Die auf dem Gebiet der Molekularbiologie erzielten Fortschritte erlaubten die Modifikation von Mikroorganismen, um sie zur Produktion von heterologen Proteinen zu veranlassen. Insbesondere bezogen sich zahlreiche genetische Studien auf das Bakterium E.coli. Jedoch ist die industrielle Anwendung dieser neuen Produktionsvarianten noch beschränkt, insbesondere durch Probleme der Wirksamkeit der Expression von Genen in diesen rekombinanten Mikroorganismen. Ebenso mit dem Ziel, die Leistungsfähigkeiten dieser Produktionssysteme zu erhöhen, wurden Forschungen durchgeführt, um starke Promotoren zu isolieren, die den Erhalt von erhöhten Expressionsspiegeln an heterologen Proteinen erlaubten. Bei E.coli können insbesondere die Promotoren der Operons Tryptophan und Lactose genannt werden.
Jüngst wurden bei der Hefe S. cerevisiae Untersuchungen zu Promotoren durchgeführt, die von an der Glykolyse beteiligten Genen abgeleitet sind. Es können insbesondere die Arbeiten über den Promotor des Gens der 3-Phosphoglyceratkinase PGK (Dobson et al., Nucleic Acid Res. %Q, 1982, 2626; Hitzeinan et al., Nucleic Acid Research 1982, 7791), über den des Gens der Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase GAPDH (Holland et al., J. Biol. Chem. 254, 1979, 9839; Musti et al., Gene 25, 1983, 133), über den des Gens der Alkoholdehydrogenase 1 ADH1 (Bennentzen et al., J. Biol. Chem. 257, 1982, 3018; Denis et al., J. Biol. Chem. 25, 1983, 1165) oder über den des Gens der Enolase 1 ENO1 (Uemura et al., Gene 45, 1986, 65) genannt werden.
Jüngst wurden genetische Werkzeuge entwickelt, um der Hefe Kluyveromyces als Wirtszelle zur Produktion von rekombinanten Proteinen zu dienen. Der Nachweis eines Plasmids vom Typ 2-Mikron mit Ursprung aus K.drosophilarum (Plasmid pKD1 - EP 241 435) erlaubte die Etablierung eines sehr wirksamen Wirt/Vektor-Systems zur Produktion von rekombinanten Proteinen (EP 361 991). Jedoch wurden die in diesem System verwendeten Promotoren niemals optimiert. Insbesondere handelt es sich im Wesentlichen um heterologe Promotoren, d. h. solche, die aus anderen Mikroorganismen, wie insbesondere S. cerevisiae stammen. Die Situation kann verschiedene Nachteile mit sich bringen und insbesondere die Aktivität des Promotors aufgrund des Fehlens bestimmter Elemente der Transkriptionsmaschinerie (beispielsweise Transaktivatoren) beschränken, eine bestimmte Toxizität für die Wirtszelle infolge der Abwesenheit der Regulation zeigen oder die Stabilität des Vektors beeinträchtigen.
Unter diesen Bedingungen stellt das Fehlen von homologen starken Promotoren bei Kluyveromyces einen begrenzenden Faktor in der industriellen Ausnutzung dieses Expressionssystems dar.
Die Anmelderin hat nun eine Region des Genoms von Kluyveromyces lactis, die eine Transkriptionspromotoraktivität besitzt (siehe Fig. 1), identifiziert, cloniert und sequenziert. Genauer entspricht diese Region dem Promotor des ADH4-Gens von K. lactis (KlADH4), das Alkoholdehydrogenase IV codiert. Das Gen KlADH4 wurde aus einer genomischen Bank von K. lactis (Saliola et al., Yeast 7: 391-400 (1991) identifiziert und cloniert, aber die Promotorregion dieses Gens wurde nicht identifiziert und seine Eigenschaften wurden nie nachgewiesen. Die von der Anmelderin identifizierte Region oder Derivate oder Fragmente dieser Region können sehr leistungsfähig zur Produktion von rekombinanten Proteinen bei Hefen der Gattung Kluyveromyces verwendet werden. Es ist zu verstehen, dass diese Sequenz auch in anderen Wirtsorganismen verwendet werden kann.
Außerdem erlaubte die Analyse der erhaltenen Region des Genoms von Kluyveromyces den Nachweis einer bidirektionellen Promotoraktivität. Diese Beobachtung zeigt an, dass der Komplementärstrang der in Fig. 1 dargestellten Region auch eine Promotoraktivität besitzt, die in die andere Richtung wirkt.
Außerdem beruht ein anderer Vorteil der erhaltenen Promotoraktivität in dessen regulierbarem Charakter. Daher ist es je nach den Verwendungsbedingungen (Medium, Stamm) möglich, die Aktivität des Promotors zu kontrollieren und somit die Expression eines rekombinanten Gens auszulösen oder zu reprimieren.
Ein weiterer Vorteil der erhaltenen Promotorregion liegt in der Abwesenheit von Repression durch Glucose. Dieses Ergebnis ist überraschend, da es sich um das erste Beispiel eines Promotors, der von dem ADH-Gen abgeleitet ist, handelt, der durch Ethanol induziert wird und durch Glucose nicht reprimiert wird. In der Tat, im Fall von S. cerevisiae wird das Gen ADH2 auf verschiedenen nichtfermentierbaren Kohlenstoffquellen (Glycerin, Ethanol, Lactat, Pyruvat) exprimiert, aber im Gegensatz zu KlADH4 wird die Expression dieses Gens starkt reprimiert, wenn Glucose dem Medium zugesetzt wird (Denis et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 355). Ebenso wird die Expression des alcA-Gens, das eine Alkoholdehydrogenase I bei Aspergillus nidulans codiert, durch Ethanol induziert, aber ist gegenüber Repression durch Glucose sensibel (Falenbok, J. Biotechnol. 17 (1991) 11).Berg, J. Biotechnol. 8 (1990), 2, führte eine Subclonierung der Promotorfragmente des lac 4- gens von K. lactis durch. Die Signale, die die Sekretion des Expressionsprodukts erlaubten, sind in diesem Dokument auch offenbart.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun eine DNA-Sequenz, die aus der Gesamtheit oder einem Teil der in Fig. 1 dargestellten Sequenz oder dessen Komplementärstrang oder einem Derivat davon besteht und eine Aktivität eines Transkriptionspromotors besitzt.
Erfindungsgemäß wird unter Derivat jede Sequenz, die aus der in Fig. 1 angegebenen Sequenz durch strukturelle Modifikation (Mutationen, Deletionen, Substitutionen, Additionen, Fragmentationen), erhalten wird und eine Promotoraktivitä beibehält, verstanden. Insbesondere können die Mutationen ein oder mehrere Nukleotide betreffen und die Additionen und/oder Substitutionen können die Regulationselemente oder die Aktivatorregionen, wie die "UAS" betreffen.
Wenn ein Derivat hergestellt wird, kann dessen Aktivität als Transkriptionspromotor auf mehrere Weisen nachgewiesen werden und insbesondere, wenn unter dia Kontrolle der untersuchten Sequenz ein Resistenzgen oder ein Komplementationsmarker gestellt wird. Jede andere Technik, die einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, kann natürlich hierfür verwendet werden.
Als Beispiele für erfindungsgemäße Derivate können insbesondere ein Promotor, der das ScI-BamHI-Fragment zu etwa 500 bp, dessen Sequenz in Fig. 2 dargestellt ist, oder ein SalI-HindIII-Fragment zu etwa 700 bp, dessen Sequenz in Fig. 3 dargestellt ist, oder das BglII-SacI-Fragment zu etwa 700 bp, das dem Fragment zwischen den Nukleotiden 1 und 723 des Komplementärstrangs der in Fig. 1 dargestellten Sequenz entspricht, umfasst, genannt werden.
Die Konstruktion dieser Promotor ist ausführlich in den Beispielen beschrieben.
Die in Fig. 1 dargestellte Sequenz wurde ausgehend von einem etwa 8 kb großen BamHI-Fragment erhalten, das durch Absuchen einer Gesamtbank von genomischer DNA von Kluyveromyces lactis mit einer heterologen Sonde, die von dem Strukturgen von ADH2 von S. cerevisiae stammte, erhalten wurde. Die Anmelderin hat in der Tat gezeigt, dass es möglich ist, eine Promotorregion bei Kluyveromyces durch Hybridisierung ausgehend von heterologen Sonden, entsprechend einem S. cerevisiae-Gen, zu clonieren. Die Einzelheiten der Clonierung der Sequenz sind in den Beispielen angegeben. Die erfindungsgemäßen Derivate können anschließend, ausgehend von diesen Sequenzen, wie in den Beispielen angegeben, hergestellt werden.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine rekombinante DNA, umfassend eine DNA-Sequenz wie vorstehend definiert und ein oder mehrere Strukturgen(e), ausgenommen das Gen KlADH4 von K. lactis.
Diese rekombinante DNA kann beispielsweise die Promotorsequenz, die in Fig. 1 dargestellt ist, oder ein Derivat davon enthalten, in das eine Restriktionsspaltstelle insertiert ist, die die Verwendung dieser Sequenz als tragbaren Promotor erlaubt.
Bevorzugt enthält diese rekombinante DNA ein oder mehrere Strukturgene. Insbesondere kann es sich um Gene handeln, die Proteine von pharmazeutischem oder agroalimentärem Interesse codieren. Als Beispiel können die Enzyme (wie insbesondere Superoxiddismutase, Katalase, Amylasen, Lipasen, Amidasen, Chymosin etc.), Blutderivate (wie Serumalbumin, alpha- oder beta-Globin, Faktor VIII, Faktor IX, von- Willebrand-Faktor, Fibronectin, alpha-I-Antitrypsin etc.), Insulin und dessen Varianten, Lymphokine (wie Interleukine, Interferone, koloniestimulierende Faktoren [G-CSF, GM- CSF, M-CSF...J, TNF, TRF usw.), Wachstumsfaktoren (wie Wachstumshormon, Erythropoietin, FGF, EGF, PDGF, TGF etc.), Apolipoproteine, antigene Polypeptide zur Herstellung von Impfstoffen (Hepatitis, Cytomegalievirus, Eppstein-Barr, Herpes etc.) oder auch Fusionen von Polypeptiden, wie insbesondere Fusionen, umfassend einen aktiven Teil, fusioniert an einen stabilisierenden Teil (beispielsweise Fusionen zwischen Albumin oder Albuminfragmenten und dem Rezeptor oder einem Teil des Rezeptors des Virus [CD4 etc.]) genannt werden.
Noch bevorzugter enthält die rekombinante DNA auch Signale, die die Sekretion des Expressionsprodukts des oder der Strukturgene erlauben. Die Signale können natürlichen Sekretionssignalen des in Betracht gezogenen Proteins entsprechen, aber können auch anderen Ursprungs sein. Insbesondere können die Sekretionssignale, die von Hefegenen abgleitet sind, wie diejenigen der Gene des Killertoxins Stark und Boyd, EMBO J 5 (1986) 1995) oder des Pheromons alpha (Kurjan und Herskowitz, Cell 30 (1982) 933; Brake et al., Yeast 4 (1988) 5436) verwendet werden.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die rekombinante DNA Teil eines Expressionsplasmids, das der autonomen oder integrativen Replikation dient.
Insbesondere können die Vektoren mit autonomer Replikation unter Verwendung von autonomen Replikationssequenzen beim gewählten Wirt erhalten werden. Insbesondere bei Hefe kann es sich um Replikationsorigins, die von Plasmiden (pKD1, 2u, etc.) abgeleitet sind, oder auch um chromosomale Sequenzen (ARS) handeln.
Integrative Vektoren können insbesondere unter Verwendung von zu bestimmten Regionen des Wirtsgenoms homologen Sequenzen erhalten werden, die durch homologe Rekombination die Integration des Vektors erlauben.
Weiterhin betrifft die Erfindung rekombinante Zellen, die eine DNA-Sequenz wie vorstehend definiert enthalten.
Vorteilhafterweise werden diese Zellen aus Hefen und noch bevorzugter aus Hefen der Gattung Kluyveromyces ausgewählt. Es ist jedoch zu verstehen, dass die Erfindung alle anderen rekombinanten Zellen umfasst, in denen die Promotorregionen der Erfindung aktiv sind.
Diese Zellen können durch jedes Verfahren erhalten werden, das die Einschleusung einer Fremd-DNA in eine Zelle erlaubt. Es kann sich insbesondere um Transformation, Elektroporation oder jede andere einem Fachmann bekannte Technik handeln.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Sequenz wie vorstehend definiert zur Expression rekombinanten Gene. Wie die Beispiele erläutern, erlauben die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in der Tat eine Produktion der rekombinanten Proteine in erhöhten Mengen.
Außerdem erlaubt die bidirektionelle Promotoraktivität der erfindungsgemäßen Sequenzen eine besonders vorteilhafte Verwendung. Insbesondere ist es möglich, diese Sequenzen zur gleichzeitigen Expression mehrerer rekombinanter Gene in den zwei entgegengesetzten Orientierungen zu verwenden.
Vorteilhafterweise betrifft die Erfindung die Verwendung einer Sequenz wie vorstehend definiert zur gleichzeitigen Expression von zwei rekombinanten zu beiden Seiten des Promotors insertierten Genen in den beiden entgegengesetzten Orientierungen.
Vorteilhafterweise können die erfindungsgemäßen Sequenzen zur Expression von Genen, die Proteine von pharmazeutischem oder agroalimentärem Interesse codieren, verwendet werden. Als Beispiel können die vorstehend aufgezählten Proteine genannt werden.
Die Erfindung erlaubt auch die Realisierung eines Verfahrens zur Produktion von rekombinanten Proteinen, wonach man eine rekombinante Zelle wie vorstehend definiert züchtet und das gebildete Protein isoliert. Als Beispiel für ein Protein können die vorstehend aufgezählten Proteine genannt werden.
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren auf die Produktion von Humanserumalbumin oder eines seiner molekularen Varianten anwendbar. Unter molekularer Variante von Albumin werden natürliche Varianten als Ergebnis des Polymorphismus von Albumin, gekürzte Formen oder jedes Hybridprotein auf der Basis von Albumin verstanden.
Außerdem beruht ein besonders vorteilhafter Gesichtspunkt der Erfindung auf der Möglichkeit, die Aktivität der Promotoren zu regulieren. Die Anmelderin hat in der Tat gezeigt, dass die Promotoraktivität spezifisch durch Ethanol induziert wird. Dazu kann Ethanol als Induktor entweder direkt dem Kulturmedium zugesetzt werden oder intracellulär durch den Wirtsstamm entsprechend den Fermentationskapazitäten, ausgehend von der in das Medium eingebrachten Kohlenstoffquelle, produziert werden. Die Regulierung kann nun unter mehreren Bedingungen erhalten werden:
- entweder durch Züchten der rekombinanten Zelle in einem Medium, das eine andere Kohlenstoffquelle als Alkohol enthält, die von der Zelle nicht in Ethanol umwandelbar ist. In diesem Fall wird die Aktivität des Promotors durch Zugabe von Ethanol zu dem Medium induziert. Beispielsweise im Falle von K. lactis 2359/152 und K. lactis MW98-8C ist der Promotor KlADH4 inaktiv, wenn die Zellen in einem Medium, das Glycerin enthält, gezüchtet werden, aber wird nach Zugabe von Ethanol induziert.
- oder durch Züchten in einem Medium, das eine fermentierbare Kohlenstoffquelle (beispielsweise Glucose) enthält, einer rekombinanten Zelle, die einen Defekt auf der Ebene ihres fermentativen Metabolismus besitzt und daher Ethanol aus dieser Kohlenstoffquelle nicht produzieren kann, induziert. In diesem Fall wird die Aktivität des Promotors entweder durch Zugabe von Ethanol zu dem Medium oder durch Zugabe eines anderen fermentierbaren Zuckers, der auf eine Stufe nach der defekten eingreift, und in Ethanol trotz des Defekts metabolisiert werden kann. Als Beispiel kann ein Stamm, der eine rag2-Mutation besitzt und daher keine Phosphoglucoseisomeraseaktivität besitzt, verwendet werden. In diesem Fall ist der Promotor KlADH4 in dem Glucosemedium inaktiv, und die Aktivität des Promotors kann durch Zugabe von Ethanol oder von Fluctose induziert werden.
Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der Lektüre der folgenden Beispiele hervor, die nur als Erläuterung und nicht als Beschränkung gelten sollen.

LEGENDE DER FIGUREN

Fig. 1: Nukleotidsequenz des 1,2 kb-Fragments, das dem KlADH4-Promotor von K. lactis entspricht.
Fig. 2: Nukleotidsequenz des SacI-BamHI-Fragments von etwa 0,5 kb, das dem verkürzten KlADH4- Promotor in dem Vektor pP4-15Kan entspricht.
Fig. 3: Nukleotidsequenz des SalI-HindIII-Fragments von etwa 0,7 kb, entsprechend dem verkürzten KlADH4-Promotor in den Vektoren pYG129 und pGY130.
Fig. 4: Schematische Darstellung des Plasmids p6-4- 98 und Konstruktion der Plasmide p6-2200-2 und pP4-33.
Fig. 5: Schematische Darstellung des Plasmids pSK- Kan401 und Konstruktion der Plasmide pP4- Kan und pP4R-Kan.
Fig. 6: Konstruktion und Darstellung der Plasmide pP4-GUS und pSK-GUS.
Fig. 7: Schematische Darstellung des Plasmids pKan707 und Konstruktion der Derivate des Phagen M13, pYG64 und pYG65.
Fig. 8: Konstruktion und Darstellung der Plasmide pYG69 und pYG70.
Fig. 9: Konstruktion und Darstellung der Plasmide pYG69 und pYG70.
Fig. 10: Schematische Darstellung des Plasmids pYG404 und Konstruktion des Plasmids pYG404ΔH.
Fig. 11: Konstruktion und Darstellung des Plasmids pYG128.
Fig. 12: Konstruktion und Darstellung der Plasmide pYG121 und pYG132.
Fig. 13: Konstruktion und Darstellung der Plasmide pP4-15Kan und pP4-60Kan.
Fig. 14: Konstruktion und Darstellung der Plasmide pYG129 und pYG130.
Fig. 15: Natives Polyacrylamidgel (5%), gefärbt gemäß dem in Beispiel 7.1.2 beschriebenen Protokoll, das die Expression der β-Glucuronidaseaktivität in dem Stamm MW98-8C zeigt, der mit dem Plasmid pP4-GUS (Bahnen 1 bis 6, entsprechend 6 unabhängigen Clonen) transformiert wurde. Die ausgehend von dem Stamm MW98-8C der mit dem Plasmid pSK- GUS (Kontrolle) transformiert wurde, erhaltenen Ergebnisse sind in den Bahnen C angegeben.
Fig. 16: SDS-Polyacrylamidgel mit 8,5% nach Anfärbung mit Coomassieblau, das die Sekretion von Humanserumalbumin aus dem Stamm MW98-8C zeigt, der mit dem Vektor pYG132 transformiert wurde. Bahnen a bis c, Albumin, extrahiert aus Humanplasma (Sigma), verwendet als Standard und aufgebracht in ansteigenden Konzentrationen (0,5, 1,0 und 1,5 ug pro Bahn). Die anderen Bahnen entsprechen 25 ul Kulturüberstand, erhalten aus den in Beispiel 7.2.1 beschriebenen Medien. Glu, Glucose; Glu/EtOH, Glucose/Ethanol; Gly, Glycerin; Gly/EtOH Glycerin/Ethanol.
Fig. 17: SDS-Polyacrylamidgel zu 8,5% nach Anfärbung mit Coomassieblau, das die Sekretion von Humanserumalbumin aus dem Stamm CBS 293.91, der mit dem Vektor pYG132 transformiert wurde, zeigt. Bahnen a bis c, Albumin, extrahiert aus Humanplasma (Sigma), verwendet als Standard und aufgebracht in ansteigenden Konzentrationen (0,5, 1,0 und 1,5 ug pro Bahn). Die anderen Bahnen entsprechen 25 ul Kulturüberstand, erhalten aus den in Beispiel 7.2.1 beschriebenen Medien. Glu, Glucose; Glu/EtOH, Glucose/Ethanol; Gly, Glycerin; Gly/EtOH Glycerin/Ethanol.
Fig. 18: SDS-Polyacrylamidgel zu 8,5% nach Anfärbung mit Coomassieblau, das die Sekretion von Humanserumalbumin aus dem Stamm CBS 293.91, der mit dem Vektor pYG130 transformiert wurde, zeigt. Bahnen a bis c, Albumin, extrahiert aus Humanplasma (Sigma), verwendet als Standard und aufgebracht in ansteigenden Konzentrationen (0,5, 1,0 und 1,5 ug pro Bahn). Die anderen Bahnen entsprechen 25 gl Kulturüberstand, erhalten aus den in Beispiel 7.2.1 beschriebenen Medien. Glu, Glucose; Glu/EtOH, Glucose/Ethanol; Gly, Glycerin; Gly/EtOH Glycerin/Ethanol.
Tabelle 1: Zusammenfassung verschiedener Konstruktionen, die aus dem ganzen Promotor von KlADH4 hergestellt wurden (1,2 kb-Fragment, entweder in Form des BglII-BamHI-Fragments [pP4-Kan, pP4R-Kan und pP4-GUS] oder in Form eines SalI-HindIII-Fragments [pYG131 und pYG132]).
Tabelle 2: Zusammenfassung verschiedener Konstruktionen, die ausgehend von dem verkürzten KlADH4-Promotor hergestellt wurden (SacI- BamHI-Fragment zu 0,5 kb, dessen Nukleotidsequenz in Fig. 2 [pP4-15Kan] angegeben ist; BglII-SacI-Fragment zu 0,7 kb entsprechend den Positionen 1-723 der in Fig. 1 angegebenen Nukleotidsequenz [pP4-60Kan]; SalI-HindIII-Fragment zu 0,67 kb, dessen Nukleotidsequenz in der Fig. 3 [pYG129 und pYG130] angegeben ist).
Tabelle 3: Untersuchung der Regulierung des Gens KlADH4. Die Anwesenheit oder Abwesenheit der enzymatischen ADH-IV-Aktivität, die gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll nachgewiesen wurde, wird durch die Symbole + oder - angegeben.

ALLGEMEINE CLONIERUNGSTECHNIKEN

Die klassischen Methoden der Molekularbiologie wie die Plasmid-DNA-Zentrifugation in Caesiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten, die Spaltung durch Restriktionsenzyme, Gelelektrophorese, Elektroelution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen, Transformation von E.coli etc. sind in der Literatur (Maniatis et al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986; Ausubel et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987) beschrieben.
Die durch Oligodesoxynukleotide gesteuerte Mutagenese in vitro wird nach dem von Taylor et al. (Nucleic Acidss Res. 13 (1985) 8749-8764) entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits durchgeführt. Die Sequenzierung der Nukleotide wird gemäß dem Didesoxyverfahren, das von Sanger et al. beschrieben ist (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) durchgeführt. Die enzymatische Amplifikation der spezifischen DNA-Fragmente wird durch PCR-Reaktion ("Polymerase-catalyzed Chain Reaction") unter den von Mullis und Faloona (Meth. Enzym., 155 (1987) 335-350) und Saiki et al. (Science 230 (1985), 1350-1354) beschriebenen Bedingungen unter Verwendung eines DNA-Thermozyklers (Perkin Eimer Cetus) unter Befolgung der Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.

BEISPIELE

In den Beispielen verwendete Plasmide und Stämme

Die folgenden Plasmide dienten in den verschiedenen Clonierungsstufen oder während der Konstruktion der Expressionsvektoren.
- Ersatzvektor Lambda-L47: Loenen und Brammar, Gene 10 (1980) 249-259;
- Plasmid pBR322 (Pharmacia, Uppsala, Schweden);
- Plasmid pTZ19 (Pharmacia, Uppsala, Schweden);
- Plasmid pSK-Kan401: Chen und Fukuhara, Gene 69 (1988) 181-192;
- Plasmid pBI221 (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA);
- Plasmid pBC SK +/- (Stratagene, La Jolla, CA, USA);
- Plasmid pYG404 (EP 361 991);
- Plasmid pKan707 (EP 361 991);
- Bakteriophage M13mp7: Messing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 3652.
Die folgenden Stämme wurden zur Clonierung, Konstruktion und Verwendung der erfindungsgemäßen Promotoren verwendet.
- K. lactis CBS2359/152 (Nr. CBS 289.91)
- K. lactis MW98-8C (Nr. CBS 579.88)
- K. lactis CBS 293.91

1/ Isolierung des Promotors RlADH4 von K. lactis

Die in Fig. 1 angegebene Sequenz wurde durch Absuchen einer gesamten genomischen DNA-Bank von Kluyveromyces lactis CBS2359/152 mit einer heterologen Sonde, die von Gen ADH&sub2; von S. cerevisiae stammt, erhalten. Genauer wurde die Bank durch Clonierung in die BamHI-Spaltstelle des Ersatzvektors Lambda-L47 des Produkts einer Teilspaltung durch das Enzym Sau3A der DNA von K. lactis CBS2359/152 erhalten. Die zur Hybridisierung verwendete Sonde ist ein EcoRV- BamHI-Fragment zu 980 bp, das die codierende Region des Strukturgens von ADH2 von S. cerevisiae, ausgenommen die ersten 70 bp, umfasst (Sonde A). Dieses Fragment wurde durch enzymatische Spaltung ausgehend von einem Plasmid mit der Bezeichnung pBR322.ADR2.BSa (Williamson et al., Cell 23 (1981) 605-614; Russell et al., J. Biol. Chem. 258 (1983) 2674-2682) erhalten.
Ein Fragment zu etwa 8 kb wurde so isoliert und an die BamHI-Spaltstelle des Plasmids pBR322 subcloniert, um das Plasmid p6-4-98 (Fig. 4) zu erzeugen. Die BamHI- Insertion, die von diesem Plasmid getragen wird, wurde anschließend mit Restriktionsenzym kartographiert und die Promotorregion des KlADH4-Gens wurde aus diesem Fragment durch differentielle Hybridisierung unter Verwendung der Sonde A sowie einer zweiten Sonde entsprechend dem BamHI- EcoRV-Fragment zu etwa 1100 bp des Plasmids pBR322.ADR2.BSa (Sonde B) lokalisiert.
In einer zweiten Stufe wurde das Plasmid p6-4-98 mit dem Enzym HindIII gespalten und ein 2,2 kb-Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde anschließend mit Standardtechniken gereinigt und an die HindIII-Spaltstelle des Plasmids pTZ19 subcloniert, um das Plasmid p6-2200-2 zu ergeben (Fig. 4). Die Analyse des subclonierten Fragments zeigt, dass es die ersten 14 Codons des KlADH4-Gens und die Region, die stromaufwärts davon lokalisiert ist, die Elemente der der Regulation der Expression umfasst, enthält.
Ein Teil zwischen der BglII-Stelle und dem Translations- Startcodon ATG (Fragment zu etwa 1, 2 kb) wurde unter Verwendung des Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci 74 (1977) 5463) sequenziert. Die Sequenz dieses Fragments ist in Fig. 1 dargestellt.

2/ Konstruktion eines tragbaren RIADH4-Promotors (BglII- BamHI

Ein tragbarer Promotor wurde durch Insertion einer BamHI- Restriktionsspaltstelle in Position -16, bezogen auf das ATG-Codon des Gens KlADH4, in das HindIII-Fragment zu 2, 2 kb, das auf dem Plasmid p6-2200-2 vorhanden ist, hergestellt.
Die Insertion dieser Stelle erlaubt die Erzeugung eines BglII-BamHI-Fragments zu 1,2 kb, umfassend ausschließlich die Promotorregion KlADH4. Sie erlaubt auch die Einschleusung jedes Gens, das man exprimieren möchte, stromabwärts des so erhaltenen Promotors.
Die BamHI-Spaltstelle wurde in Position -16, bezogen auf die Translations-Startstelle ATG des KlADH4-Gens, durch gesteuerte Mutagenese unter Verwendung der Doppelprimertechnik (Sambrood, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab Press, 1989) eingeführt. Die Sequenz der verwendeten synthetischen Oligodesoxynukleotide für diese Mutagenese ist nachstehend angegeben. Die erzeugte BamHI-Spaltstelle ist unterstrichen, ATG ist kursiv gekennzeichnet und die Sternchen bezeichnen die modifizierten Basen, bezogen auf die ursprüngliche Sequenz. SI = ursprüngliche Sequenz; SM = modifizierte Sequenz.
Das so erhaltene Plasmid wurde als pP4-33 bezeichnet ( Fig. 4):

3/ Konstruktion der Clonierungs- oder Exgressionsvektoren, die den ganzen Promotor enthalten

Die Tabelle 1 fasst dem in diesem Beispiel beschriebenen Konstruktionen zusammen.

3.1. Konstruktion eines Expressionsvektorens des Gens aph:

Die DNA des Plasmids pP4-33 (vergleiche Beispiel 2) wurde mit BglII und BamHI gespalten, um das 1,2 kb-Fragment, das den Promotor KlADH4 enthält, zu erzeugen. Dieses Fragment wurde anschließend in die BamHI-Spaltstelle des Plasmids pSK-Kan401 stromabwärts des Reportergens aph, das Aminoglycosid-3-phosphattransferase (I) (Oka et al., J. Mol. Biol. 147 (1981) 217) ohne den eigenen Promotor codiert, eingeschleust, das bei seiner Expression der Hefe eine Geneticinresistenz (G418) (Jimenez und Davies, a.a.0.) verleiht. Nach Amplifikation in E.coli wurden zwei rekombinante Plasmide erhalten, die sich in der Orientierung der Insertion unterscheiden. In dem Plasmid pP4-Kan liegt das 1,2 kb-Fragment in der gleichen Orientierung, bezogen auf das aph-Gen, vor, die man im Kontext mit ADH4 beobachtet, während es sich in dem Plasmid kP4R-Kan in entgegengesetzter Orientierung befindet (siehe Fig. 5):

3.2. Konstruktion eines Expressionsvektors der Gene GUS und aph

Das Plasmid pP4R-Kan wurde zur Konstruktion eines Expressionsvektors verwendet, worin zwei heterologe Gene ohne ihre jeweiligen Promotoren beiderseits des 1,2 kb-Promotor KlADH4 gesetzt sind. Die verwendeten heterologen Gene sind genauer:
- das aph-Gen, dessen Expression G418 Resistenz verleiht und
- das β-Glucuronidasegen von E.coli (GUS-Gen), dessen Expression durch enzymatische Reaktion nachgewiesen werden kann.
Zur Durchführung dieser Konstruktion wurde das Plasmid pP4R-Kan mit EcoRI und BamHI gespalten. Außerdem wurde ausgehend von Plasmid pBI221 das β-Glucuronidasegen von E.coli in Form eines BamHI-EcoRI-Fragments zu 2,1 kb isoliert. Dieses Letztere wurde anschließend durch Ligierung in das Plasmid pP4R-Kan, das wie angegeben linearisiert worden war, eingeschleust, um das Plasmid pP4-GUS zu ergeben (siehe Fig. 6). Parallel wurde ein Kontrollplasmid durch Insertion des 2,1 kb-BamHI-EcoRI-Fragments, das aus dem Plasmid pBI221 hervorgegangen ist, das das GUS-Gen trägt, in das Plasmid pSK-Kan401, das zuvor mit BamHI und EcoRI gespalten worden war, hergestellt. Das so erhaltene Plasmid wird als pSK-GUS bezeichnet (Fig. 6). Diese Konstruktion unterscheidet sich von dem Plasmid pP4-GUS nur durch die Abwesenheit des Promotors KlADH4 zu 1, 2 kb.

3.3. Konstruktion eines Expressionsvektors des Gens, das Humanserumalbumin (HSA) codiert:

Zur Konstruktion verschiedener Expressionsvektoren von Humanserumalbumin wurde ein Derivat des Plasmids pYG404 (vgl. EP 361 991) hergestellt, das enthält:
- ein Hefereplikon (quasi vollständige Sequenz des natürlichen Plasmids pKDl),
- das Gen, das Human-Prepro-Albumin (HSA) codiert, unter Kontrolle des Promotors des Gens LAC4 von K. lactis und gefolgt von einem Terminator des PGK-Gens von S. cerevisiae; dem Strukturgen, das HSA codiert, geht eine Sequenz zu 25 Nukleotiden voraus, die der direkt stromaufwärtigen Region des PGK-Gens von S. cerevisiae entspricht,
- das aph-Gen, das Resistenz gegenüber Geniticin (G418) der Hefe verleiht, und
- ein Replikon und einen Selektionsmarker (bla-Gen, das Ampicillinresistenz verleiht) für E.coli.
Dieses Plasmid mit der Bezeichnung pYG404ΔH unterscheidet sich von pYG404 nur durch die Zerstörung der HindIII- Spaltstelle, die in dem aph-Gen lokalisiert ist, durch gesteuerte Mutagenese. Diese Modifikation erlaubt anschließend die Substitution des Promotor LAC4, der in dem Plasmid pYG404ΔH vorhanden ist, in Form eines SalI-HindIII- Fragments durch verschiedene Varianten des Promotors KlADH4, die ebenfalls als tragbare Promotoren in Form von SalI-HindIII-Fragmenten konstruiert waren.

3.3.1. Konstruktion des Plasmids pYG404ΔH (Fig. 7 bis 10)

Um die Deletion der HindIII-Spaltstelle in dem Clonierungsvektor pYG404 zu bewirken, wurden verschiedene Subclonierungsstufen durchgeführt, die zu einer Intermediärkonstruktion führten: pYG72 (Fig. 9). Dieser Vektor entspricht dem Plasmid pKan707 (EP 361 991), worin das SacI- Fragment, das das URA3-Gen enthält, sowie die einzigartige HindIII-Spaltstelle, die in dem aph-Gen vorhanden ist, eliminiert wurden. Um die gesteuerte Mutagenese an dieser Stelle durchzuführen, wurde das PstI-Fragment zu 1,3 kb, das das aph-Gen trägt, ausgehend von dem Plasmid pKan707 in den Bakteriophagen M13mp7 subcloniert, um den Vektor pYG64 zu ergeben (Fig. 7). Die HindIII-Spaltstelle wurde durch gesteuerte Mutagenese zerstört (vergleiche alllgemeine Clonierungstechniken), wobei das folgende Oligodesoxynukleotid 5'-GAA ATG CAT AAG CTC TTG CCA TTC TCA CCG- 3' verwendet wurde, das den Ersatz des Tripletts CTT, das Leucin 185 codiert, durch das Triplett CTC erlaubt. Diese Veränderung modifiziert nicht die resultierende Proteinsequenz. Das erhaltene Plasmid wurde als pYG65 (Fig. 7) bezeichnet. Zur Konstruktion des Plasmids pYG72 wurde der Teil, der das bakterielle Replikon des Vektors pKan707 enthält, durch Spaltung mit dem Enzym EcoRI und Rezirkularisation mit T4-DNA-Ligase isoliert, wodurch das intermediäre Plasmid pYG69 erzeugt wurde. Das darin vorhandene Fragment PstI, das das aph-Gen enthält, wurde anschließend durch das mutierte äquivalente Fragment, das aus dem Plasmid pYG65 stammt, ersetzt. Diese Konstruktion wurde als pYG70 (Fig. 8) bezeichnet. Die Sequenz von pKD1 zu 4,7 kb zwischen den EcoRI- und den SacI-Spaltstellen wurde anschließend in diesen Vektor eingeschleust, wodurch pYG72 (Fig. 9) erhalten wurde.
Der Vektor pYG404ΔH wurde durch Insertieren der Expressionskassette aus dem Plasmid pYG404 (EP 361 991) in Form eines SalI-SacI-Fragments an den entsprechenden Stellen von pYG72 (Fig. 10) erhalten.

3.3.2. Konstruktion eines tragbaren KlADH4-Promotor [SalI-HindIII] (Fig. 11):

Der KlADH4-Promotor, der von dem BgIII-BamHI-Fragment getragen wird, das aus dem Plasmid pP4-33 (Beispiel 2) stammt, wurde wie folgt modifiziert, um ihn der Verwendung in Expressionsvektoren, die von dem Plasmid pYG404AH abgeleitet sind, anzupassen:
Nach Spaltung des Plasmids pP4-33 durch die Enzyme BglII und BamHI, gefolgt von einer Behandlung mit 'Mungbohnen'- nuklease, um die Enden glatt zu machen, wurde das 1,2 kb- Fragment, das den KlADH4-Promotor trägt, aus einem Agarosegel isoliert und in den Vektor pBC SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA), der zuvor mit dem Enzym ClaI linearisiert worden war, und mit 'Mungbohnen'-Nuklease sowie mit einer alkalischen Kälberphosphatase (CIP) behandelt worden war, subcloniert. Das so erhaltene Plasmid (pYG128, Fig. 11) erlaubt die Isolierung eines KlADH4-Promotors in Form eines 1,2-kb-HindIII-Fragments.

3.3.3. Konstruktion der Vektoren pYG121 und pYG132 ( Fig. 12)

Die Spaltung des Expressionsvektors pYG404ΔH (Beispiel 3.3.1.) durch die Enzyme SalI und HindIII erlaubt den Ersatz des Promotors LAC4 durch den vorstehend beschriebenen Promotor KlADH4.
Zur Durchführung dieser Clonierung wurden das 8,7 kb-SalI- HindIII-Fragment, das den pKDl-Teil und die Selektionsmarker enthält, sowie das 1,9 kb-HindIII-HindIII-Fragment, das das Gen, das Prepro-HSA codiert, enthält, aus dem Vektor pYG404ΔH isoliert und in Gegenwart eines 1,2 kb-SalI- HindIII-Fragments aus dem Plasmid pYG128, das den KlADH4- Promotor trägt, religiert. Zwei Plasmide wurden so erhalten:
- pYG131 (Fig. 12) entsprechend einem Clonierungsvektor, der die Insertion jedes Gens, das man exprimieren möchte, an die einzigeartige HindIII-Spaltstelle erlaubt, unter Kontrolle des KlADH4-Promotors und
- pYG132 (Fig. 12), das mit dem Plasmid pYG131 identisch ist, ausgenommen, dass es das an die HindIII- Spaltstelle eingeschleuste Prepro-HSA-Gen enthält.

4/ Konstruktion von Clonierungs- oder Expressionsvektoren, die verkürzte Derivate des Promotor KlADH4 enthalten

Die Tabelle 2 fasst die in diesen Beispielen beschriebenen Konstruktionen zusammen.

4.1. Konstruktion von Expressionsvektoren des aph-Gens

Die Plasmide pP4-Kan und pP4R-Kan (Beispiel 3.1.) wurden zur Herstellung von Konstruktionen, die reduzierte Formen des Promotors enthalten, verwendet. Dafür wurden die Plasmide pP4-Kan und pP4R-Kan durch das Enzym SacI gespalten, dann gemäß dem in Fig. 13 beschriebenen Schema religiert.
Diese Manipulation erlaubte:
- die Herausschneidung des 0,7 kb großen SacI- Fragments aus dem Plasmid pP4-Kan, das gegenüber dem aph- Gen liegt. In dem erhaltenen Plasmid (pP4-15Kan) ist das aph-Gen nun unter der Kontrolle eines reduzierten Promotors, der dem 0,5 kb-SacI-BamHI-Fragment entspricht, dessen Sequenz in Fig. 2 angegeben ist, in der gleichen Orientierung wie in Zusammenhang mit ADH4 beobachtet wird.
- die Herausschneidung des etwa 0,5 kb großen SacI- Fragments aus dem Plasmid pP4R-Kan, das gegenüber dem aph- Gen gelegen ist. In dem erhaltenen Plasmid (pP4-60Kan) ist das aph-Gen nun unter der Kontrolle eines reduzierten Promotors entsprechend dem Komplementärstrang des 0,7 kb BglII-SacI-Fragments (Nukleotide 1 bis 723), das Teil der in Fig. 1 angegeben Sequenz ist.

4.2. Konstruktion eines Expressionsvektors des Prepro- HSA-Gens

4.2.1. Konstruktion eines tragbaren verkürzten KlADH4- Promotors [SalI-HindIII] (Fig. 14):

Ein verkürztes Derivat des 1,2 kb-BglII-BamHI-Fragments, das aus dem Plasmid pP4-33 hervorgeht und den ganzen KlADH4-Promotor zeigt, wurde durch enzymatische Amplifikation (PCR) eines Teils dieses Promotors, der zwischen der BsmAI-Stelle in Position 541 auf der in Fig. 1 angegebenen Sequenz und der BamHI-Stelle in Position -16, bezogen auf ATG des ADH4-Gens, lokalisiert ist, erhalten. Die für die PCR-Reaktion verwendete Oligodesoxynukleotide waren:
- 5'-GGGGTCGACGCGAGACAACACTATTGTGAG-3', das eine SalI- Spaltstelle (Sequenz unterstrichen) genau stromaufwärts der vorstehend genannten BsmAI-Stelle einbringt, und
- 5'-GGGAAGCTTTGTGTTGTTGATGGGGGAG-3', das die in der Konstruktion pP4-33 vorhandene BamHI-Spaltstelle durch eine HindIII-Spaltstelle (Sequenz unterstrichen) ersetzt.

4.2.2. Konstruktion der Vektoren pYG129 und pYG130

Das durch PCR erhaltene 672 bp große Fragment wurde mit den Enzymen SalI und HindIII gespalten, auf einem Agarosegel gereinigt und mit dem 8,7 kb-SalI-HindIII-Fragment, das den pKD1-Teil und die Selektionsmarker aus dem pYG404ΔH-Vektor enthält, ligiert. Diese Ligierung wurde in Gegenwart des 1,9 kb großen HindIII-HindIII-Fragments durchgeführt, das das Gen trägt, das Prepro-HSA codiert, das aus dem gleichen Vektor isoliert wurde. Zwei Plasmide wurden so erhalten:
- pYG129 (Fig. 14) entsprechend einem Clonierungsvektor, der die Insertion jedes Gens, das man unter der. Kontrolle des verkürzten KlADH4-Promotors exprimieren möchte, an der einzigen HindIII-Spaltstelle erlaubt und
- pYG130 (Fig. 14), das mit dem Plasmid pYG129 identisch ist, ausgenommen, dass es das an die HindIII- Spaltstelle eingeschleuste Prepro-HSA-Gen enthält.
Die Nukleotidsequenz des etwa 0,7 kb großen SalI-HindIII- Fragments entsprechend dem verkürzten KlADH4-Promotor, das in diesen zwei Konstruktionen verwendet wurde, ist in Fig. 3 angegeben.

5/ Untersuchung der Regulierung der Expression des KlADH4-Gens

Diese Untersuchung wurde mit dem Stämmen K. lactis MW98-8C und K. lactis 2359/152 durchgeführt.
Der Stamm MW98-8C besitzt einen Rag2&supmin;-Phänotyp infolge einer Mutation (ra 2) auf die Ebene des Gens, das Phosphoglucoseisomerase (PGI) codiert, die ihn unfähig zur Produktion von Ethanol auf Glucosemedium macht. Der Stamm 2359/152 ist Rag2&spplus;.
Die Aktivität des ADH4-Promotors wurde unter verschiedenen Kulturbedingungen durch Nachweis der ADHIV-Aktivität unter Verwendung der von Lusttorf und Megnet (Archiv. Biochem. Biophys. 126 (1968) 933) beschriebenen Technik bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengestellt.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Aktivität des KlADH4- Promotor spezifisch durch Ethanol induziert wird und in Abwesenheit von Glucose nicht reprimiert wird. In der Tat wurde überraschenderweise gefunden, dass im Gegensatz zu den Promotoren anderer Alkoholdehydrogenasen wie ADH2 von S. cerevisiae oder alcA von A. nidulans der KlADH4-Promotor durch Glucose nicht reprimiert wird (Tabelle 3). Ethanol als Induktor kann entweder dem Kulturmedium zugesetzt werden oder intracellulär durch Fermentation einer Kohlenstoffquelle wie Glucose oder Fructose gebildet werden (Tabelle 3).
Es wurde auch gezeigt, dass ein bezüglich eines Gens, das an der Glykolyse beteiligt ist, mutierter Stamm, der aus diesem Grund Ethanol nicht aus Glucose produzieren kann, vorteilhafterweise als Wirt für die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren verwendet werden kann. In der Tat, der Promotor KlADH4 ist in dem Medium, das Glucose als alleinige Kohlenstoffquelle enthält, in Stämmen wie MW98-8C (rag2), deren Gen, das Phosphoglucoseisomerase codiert, defekt ist, inaktiv. Ln diesem Stamm wird die Aktivierung des KlADH4-Promotors durch Zugabe von Ethanol zu dem Kulturmedium bewirkt.
Außerdem wurde überraschenderweise gefunden, dass in den Stämmen CBS2359/152 und MW98-8C der KlADH4-Promotor in einem Medium inaktiv ist, das Glycerin als alleinige Kohlenstoffquelle enthält. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von dem, das für den Promotor der Alkoholdehydrogenase-II- Gens von S. cerevisiae (ADH&sub2;) bekannt ist, der auf verschiedenen nichtfermentierbaren Kohlenstoffquellen einschließlich Glycerin aktiv ist.
Diese Ergebnisse zeigen nun, dass bestimmte Stämme wie CBS2359/152, selbst mit einem Rag&spplus;-Phänotyp den Erhalt einer regulierten Expression des KlADH4-Promotors erlauben können: die in Gegenwart von Glycerin als alleiniger Kohlenstoffquelle gezüchteten Zellen produzieren nicht das Protein, dessen Gen unter der Kontrolle des KlADH4- Promotors (nicht-induzierter Promotor) steht, während sie zur Produktion dieses Proteins durch Zugabe von Ethanol zu dem Kulturmedium induziert werden können.

6/ Transformation von Kluyveromyces

Verschiedene Techniken, die die Einschleusung von DNA in Hefe erlauben, können verwendet werden.
Vorteilhafterweise werden die verschiedenen verwendeten Stämme von Kluyveromyces dadurch transformiert, dass die ganzen Zellen in Gegenwart von Lithiumacetat und Polyethylenglykol gemäß der von Ito et al. (J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168) beschriebenen Technik behandelt werden. Die von Durrens et al. (Curr. Genet. 18 (1990) 7) beschriebene Transformationstechnik, bei der Ethylenglykol und Dimethylsulfoxid verwendet werden, wurde auch verwendet. Es ist auch möglich, Hefen durch Elektroporation beispielsweise nach dem von Karube et al. (FEBS Letters 182 (1985) 90) beschriebenen Verfahren zu transformieren.
Ein alternatives Protokoll wurde auch ausführlich in der Anmeldung EP 361 991 beschrieben.

7/ Verwendung von Expressionsvektoren zur Produktion von rekombinanten Proteinen

7.1. Produktion. von Bakterienproteinen

7.1.1. Produktion von Aminoglykosid-3'-phosphotransferase (I)

Die Expressionsplasmide pP4-Kan und pP4R-Kan (Beispiel 3.1) sowie das Clonierungsplasmid pSK-Kan401 (Kontrolle) wurden zur Transformation der Hefe K. lactis MW98-8C verwendet. Die durch pP4-Kan und pP4R-Kan transformierten Zellen besitzen Resistenz gegenüber G418 in einem YPD- Medium (Hefeextrakt 10 g/l; Pepton 20 g/l; Glucose 20 g/l), das 2% Ethanol und Dosen an Geneticin von 200 bis 400 ug/ml enthält, während die durch das Plasmid pSK- Kan401 transformierten Zellen gegenüber Geneticin empfindlich sind.
Dieses Ergebnis zeigt an:
- dass das aph-Gen in den mit den Plasmiden pP4-Kan und pP4R-Kan transformierten Hefen exprimiert wird, was zeigt, dass das 1,2 kb-Fragment sehr wohl eine funktionelle Promotoraktivität trägt und
- dass dieses Fragment nun eine bidirektionelle Promotoraktivität trägt, da das aph-Gen in den beiden Konstruktionen exprimiert wird, unabhängig von der Orientierung des 1,2 kb-BamHI-BglII-Fragments, das den KlADH4- Promotor enthält.
Die Plasmide pP4-15Kan und pP4-60Kan verleihen nach Transformation dem Stamm MW98-8C, der in einem YPD-Medium, das 2% Ethanol und Dosen an Geneticin über 200 ug/ml enthält, gezüchtet wurden, Geneticinresistenz.
Dieses Ergebnis zeigt klar an, dass die aktiven Derivate des KlADH4-Promotors, der von dem 1,2 kb-Fragment getragen wird, durch Fragmentierung erhalten werden können. Es bestätigt die bidirektionelle Aktivität dieses Promotors.

7.1.2. Produktion von β-Glucuronidase (Fig. 15)

Die Plasmide pP4-GUS und pSK-GUS (Beispiel 3.2) wurden zur Transformation des Stamms K. lactis MW98-8C (ura3 lysA argA) unter Selektionieren der rekombinanten Zellen auf ihre Prototrophie gegenüber Uracil auf einem synthetischen SD-Medium ('yeast nitrogen base w/o amino acids' 0,67%, Glucose 2%), supplementiert mit Arginin (20 mg/l) und Lysin (30 mg/l) verwendet.
Die rekombinanten Zellen wurden in 110 ml YPD bis zur stationären Phase gezüchtet. Die Zellen wurden anschließend mit Glaskügelchen in Eppendorf-Röhrchen aufgebrochen, zentrifugiert und die Überstände wurden durch Minigel- Elektrophorese (5% Acrylamid) unter nicht-denaturierenden Bedingungen analysiert. Die verwendeten Gele und Puffer wurden von Williamson et al. (Nature 283 (1980) 214-216) beschrieben.
Proben, entsprechend 20 bis 40 ug Protein, wurden durch Acrylamidgelelektrophorese (5%) getrennt. Die Wanderung wurde bei 4ºC während 60 Minuten unter einem 20 mA-Strom durchgeführt.
Die β-Glucuronidaseaktivität wird dadurch nachgewiesen, dass die Gele mit einer Färbelösung, die 50 mM Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,0, und 50 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylglucuronid (X- Glu) in 5 mg/ml Dimethylformamid enthält (Jefferson R. A., Plant. Mol. Biol. Report 5 (1987) 387-405), getränkt wurden.
Die Gele wurden in dieser Lösung bei 37ºC zum Auftreten von Banden gehalten.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 15 dargestellt. Das wiedergegebene Gel zeigt klar eine Bande in den Bahnen 1 bis 6, entsprechend MW98-8C-Zellen, die durch das Plasmid pP4-GUS transformiert wurden, und kein Signal in den Bahnen C, entsprechend den MW98-8C-Zellen, die mit dem Plasmid pSK-GUS transformiert wurden, das nicht die erfindungsgemäße Promotorregion enthält.
Außerdem wurden die mit den Plasmiden pP4-GUS und pSK-GUS transformierten Zellen auch auf einem YPD-Medium gezüchtet, das mit Geneticin (200 mg/l) supplementiert war. Die Transformanten, die pP4-GUS enthalten, erwarben Resistenz gegen dieses Antibiotikum, während der Kontrollstamm der pSK-GUS enthält, sensibel blieb.
Diese Ergebnisse bestätigen die bidirektionelle Promotoraktivität des 1,2 kb-Fragments. Sie zeigen außerdem, dass dieses Fragment zur gleichzeitigen Expression von 2 heterologen Genen, die beiderseits des KlADH4-Promotor in 2 entgegengesetzten Orientierungen insertiert sind, verwendet werden kann.

7.2. Produktion von Säugerproteinen

7.2.1. Expression des Prepro-HSA-Gens unter der Kontrolle des ganzen KlADH4-Promotors (Fig. 16- 17)

Das Expressionsplasmid pYG132 wurde zur Transformation der Hefestämme K. lactis MW98-8C (Rag2&supmin;, unfähig zur Produktion von Ethanol aus Glucose) und CBS 293.91 (Rag2&spplus;, metabolisiert Glucose zur Ethanolproduktion) verwendet. Nach Selektion von rekombinanten Zellen auf mit Geneticin (200 mg/l) supplementiertem YPD-Medium wurden die Transformanten etwa 20 Stunden in Erlenmeyer-Kolben in M9EL10-Medium (Medium M9 (Maniatis et al., a.a.O.], das mit 10 g/l Hefeextrakt supplementiert war) in Gegenwart von Glucose (20 g/l) bei 28ºC unter Rühren vorkultiviert. Diese Vorkultur wurde anschließend zur Inokulation in einer Verdünnung von 10&supmin;³ von 300 ml Erlenmeyer-Kolben, die 50 ml M9EL10-Medium enthielten, in Gegenwart von verschiedenen Kohlenstoffquellen (entweder nur Glucose [20 g/l] oder Glucose [20 g/l] plus Ethanol [20 g/l] oder Glycerin allein [20 g/l] oder Glycerin [20 g/l] plus Ethanol [20 g/l] verwendet.
Nach Kultur der rekombinanten Zellen während 5 Tagen bei 28ºC unter Rühren wurden Proben des Überstands jeder Kultur ohne Zellen entnommen und mit einem äquivalenten Volumen an 2X Laemmli-Puffer (Laemmli, Nature 227 [1970] 680) vermischt. Nach 10minütigem Erhitzen auf 96ºC wurden die Proteine, die in einem Äquivalent zu 25 ul Überstand enthalten waren, auf einem 8,5% Polyacrylamidgel abgetrennt (25 mA). Die Sekretion von Albumin wurde anschließend durch Anfärben des Gels mit Coomassieblau nachgewiesen und densitometrisch bewertet (Shimadzu CS930-Densitometer).
Die Fig. 16 zeigt das mit dem Stamm MW98-8C/pYG132 erhaltene Ergebnis, für den man eine Albuminsekretion auf hohem Niveau beobachtet, wenn die Zellen in Gegenwart eines Ethanolzusatzes zu dem Kulturmedium gezüchtet wurden. Im Gegensatz dazu weist man kein HSA in dem Überstand nach, wenn die Zellen in Gegenwart von Glucose oder Glycerin gezüchtet wurden.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die mit dem Stamm MW98- 8C/pYG132 erhalten wurden, können die Transformanten CBS293.91/pYG132 HSA unter allen vorstehend dargelegten Kulturbedingungen produzieren (Fig. 17). Trotzdem ist die Albuminproduktion 2- bis 3fach in einer Kultur erhöht, die einen Ethanolzusatz zu dem Medium enthält, bezogen auf die eine Kultur, in der Ethanol das Produkt des Zellmetabolismus ist.
Diese Ergebnisse bestätigten die Fähigkeit der Wirts/Vektor-Paare, die in den vorstehenden Beispielen beschrieben wurden, erhöhte Mengen oder Induktionsbedingungen eines rekombinanten Proteins zu produzieren, unabhängig davon, ob es bakteriellen oder Säuger-Ursprungs ist. Beispielsweise wurde die Produktion von Albumin im Erlenmeyer- Kolben in dem Stamm CBS 293.91/pYG132 in einem Medium, das Glycerin oder Glucose in Gegenwart von Ethanol enthält (Fig. 17), densitometrisch zu 190 bis 200 mg/l bestimmt.
Diese Ergebnisse bestätigen auch die Abwesenheit von Repression des KlADH4-Promotors durch Glucose, da die Albuminproduktion in dessen Gegenwart nicht verringert wird.

7.2.2, Expression des Prepro-HSA-Gens unter Kontrolle des verkürzten KlADH4-Promotors (Fig. 18):

Das Expressionsplasmid pYG130 wurde zur Transformation des Stammes K. lactis CBS 293.91 (Rag2&spplus;) verwendet. Nach Selektion dar rekombinanten Zellen auf mit Geneticin (200 mg/l) supplementiertem YPD-Medium wurden die Transformanten vorgezüchtet und wie in dem vorstehenden Beispiel beschrieben gezüchtet. Die Albuminsekretion wurde durch Elektrophorese von Proben der Kulturüberstände wie unter 7.2.1. beschrieben bewertet. Das mit dem verkürzten Derivat des KlADH4-Promotors erhaltene Ergebnis ist in Fig. 18 gezeigt: das Paar Wirt/Vektor CBS293.91/pYG130 kann klar rekombinantes Albumin produzieren und sezernieren.
Wie in dem Beispiel des Plasmids pYG132 (ganzer KlADH4- Promotor) beobachtet man eine Albuminproduktion in dem Medium, das Glucose als alleinige Kohlenstoffquelle enthält, aber in geringerer Menge, bezogen auf den ganzen Promotor. Im Gegensatz dazu erhöht die Kultur von Zellen in einem Medium, das Glucose plus Ethanol enthält, die HSA- Produktion um einen Faktor 2 bis 3 (Fig. 18).
Eine Probe des Stammes K. lactis 2359/152 wurde am 4. Juni 1991 beim Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) in Baarn, Niederlande, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags unter der Nummer CBS 289.91 hinterlegt ber Stamm K, lactis CBS 293.91 entspricht dem Stamm CBS1065, der am 11. Juni 1991 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags erneut hinterlegt wurde. TABELLE 1 TABELLE 2 TABELLE 3

MIKROORGANISMEN

Fakultative Seite für die Mikroorganismen, die auf S. 21, Zeilen 19-21 der Beschreibung erwähnt sind
A. IDENTIFIKATION DER HINTERLEGUNG:
Andere Hinterlegungen sind auf einem Zusatzblatt identifiziert Name der Hinterlegungsstelle:
Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)
Adresse der Hinterlegungsstelle (einschließlich Postleitzahl und Land)
Oosterstraat 1, P. O. Box 273-3740 AG BAARN (Niederlande)
Datum der Hinterlegung 4. Juni 1991
Hinterlegungsnr. CBS 289.91
B. ZUSÄTZLICHE ANGABEN (nur auszufüllen, sofern notwendig). Ein Zusatzblatt ist zur Fortsetzung der Angaben beigefügt
Bezüglich der Benennungen, in denen ein europäisches Patent beantragt wird, ist eine Probe des hinterlegten Mikroorganismus bis zur Bekanntmachung des Hinweises auf die Erteilung des europäischen Patents oder bis zu dem Datum, ab dem die Anmeldung zurückgewiesen, zurückgenommen ist oder als zurückgenommen gilt, nur durch Herausgabe der Probe an einem vom Antragssteller benannten Sachverständigen zu an lich (Regel 28(4) EPÜ).
C. BENANNTE VERTRAGSSTAATEN, FÜR DIE DIE ANGABEN GELTEN (Wenn die Angaben nicht für alle benannten Staaten gelten)
D. SEPARAT BEIGEFÜGTE ANGABEN (nur auszufüllen, sofern notwendig)
Die vorstehend angegebenen Angaben werden schließlich dem internationalen Btlro mitgeteilt (die allgemeine Natur der Angaben ist zu spezifizieren, z. B. Hinterlegungsnr.)
E. Das vorliegende Formular wurde zusammen mit der internationalen Anmeldung bei Hinterlegung erhalten
(Annahmeamt zu bestätigen)
(Bevollmächtigter Sachbearbeiter)
Annahmedatum vom Hinterleger durch das internationale Büro
(Bevollmächtigter Sachbearbeiter)

Claims

1. DNA-Sequenz bestehend aus der Gesamtheit oder einem Teil der in Fig. 1 dargestellten Sequenz oder deren Komplementärstrang oder einem Derivat davon und im Besitz einer Aktivität eines Transkriptionspromotors.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, bestehend aus der Gesamtheit oder einem Teil des etwa 0,5 kb großen SacI- BamHI-Fragments, das in Fig. 2 dargestellt ist, oder des etwa 0,7 kb großen SalI-HindIII-Fragments, das in Fig. 3 dargestellt ist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, bestehend aus der Gesamtheit oder einem Teil des etwa 0,7 kb großen BglII- SacI-Fragments, das dem Fragment zwischen den Nukleotiden 1 und 723 des Komplementärstrangs der in Fig. 1 angegeben Sequenz entspricht.

4. Rekombinante DNA, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, und ein oder mehrere Strukturgene, ausgenommen das KlADH4-Gen von K. lactis.

5. Rekombinante DNA nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie auch Signale enthält, die die Sekretion des Expressionsprodukts des oder der Strukturgene erlauben.

6. Rekombinante DNA nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Strukturgen(e) Proteine von pharmazeutischem oder agroalimentärem Interesse codiert/codieren.

7. Rekombinante DNA nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Strukturgen(e) Proteine, ausgewählt aus Enzymen (wie insbesondere Superoxiddismutase, Katalase, Amylasen, Lipasen, Amidasen, Chymosin etc.), Blutderivaten (wie Serum-Albumin, alpha- oder beta-Globin, Faktor VIII, Faktor IX, von-Willebrand- Faktor, Fibronectin, alpha-1-Antitrypsin etc.), Insulin und dessen Varianten, Lymphokinen (wie Interleukine, Interferone, koloniestimulierende Faktoren (G-CSF, GM-CSF, M-CSF..., TNF, TRF etc.), Wachstumsfaktoren (wie Wachstumshormon, Erythropoietin, FGF, EGF, PDGF, TGF etc.), Apolipoproteine, antigene Polypeptide zur Herstellung von Impfstoffen (Hepatitis, Cytomegalievirus, Eppstein-Barr, Herpes etc.) oder auch Fusionen von Polypeptiden, wie insbesondere Fusionen, umfassend einen aktiven Teil, fusioniert an einen stabilisierenden Teil (beispielsweise Fusionen zwischen Albumin oder Albuminfragmenten und dem Rezeptor oder einem Teil eines Virusrezeptors (CD4 etc.)) codiert/codieren.

8. Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie Teil eines Expressionsplasmids ist, das der autonomen oder integrativen Replikation dient.

9. Rekombinante Zelle, enthaltend eine DNA-Sequenz oder eine rekombinante DNA nach einem der vorstehenden Ansprüche.

10. Rekombinante Zelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Hefe handelt.

11. Rekombinante Zelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Hefe der Gattung Kluyveromyces handelt.

12. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Expression von rekombinanten Genen.

13. Verwendung nach Anspruch 12 zur gleichzeitigen Expression von rekombinanten Genen, die beiderseits des Promotors in den zwei entgegengesetzten Orientierungen insertiert sind.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 oder 13 zur Expression von Genen, die Proteine von pharmazeutischem oder agroalimentärem Interesse codieren.

15. Verfahren zur Produktion von rekombinanten Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine rekombinante Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 11 züchtet und die gebildeten Proteine isoliert.

16. Verfahren nach Anspruch 15 zur Produktion von Proteinen von pharmazeutischem oder agroalimentärem Interesse.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein bevorzugt Humanserumalbumin oder eine seiner molekularen Varianten ist.