DE69034051T2

DE69034051T2 - Stabil transformierte Hefezellen und ihre Verwendung zur Herstellung von Albumin

Info

Publication number: DE69034051T2
Application number: DE1990634051
Authority: DE
Inventors: Kazumoto Hirabayashi; Haruhide Kawabe; Masami Miura; Hideyuki Oi; Ken Okabayashi; Miho Shimizu
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1989-05-22
Filing date: 1990-05-22
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2010-05-23
Also published as: EP0399455B1; EP0399455A3; DE69034051D1; EP0399455A2; AU640654B2; ES2189783T3; AU5578690A; CA2017176A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Plasmid zur Verwendung der Herstellung von Albumin unter Nutzung rekombinanter DNA- Techniken, einen Hefewirt transformiert mit diesem Plasmid, ein Verfahren zur Herstellung der so transformierten Hefezellen und ein Verfahren zur Herstellung von Albumin unter Verwendung dieser transformierten Hefewirte.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Ein Albumin, insbesondere humanes Serumalbumin (im folgenden abgekürzt als "HSA"), ist ein wesentliches plasmakonstituierendes Protein. Dieses Protein wird in der Leber hergestellt und dient hauptsächlich in der Blutzirkulation zur Aufrechterhaltung des osmotischen Drucks in einem normalen Bereich.
Es funktioniert weiterhin als Träger für verschiedene Serummoleküle.
HSA wird bei verschiedenen klinischen Zuständen verabreicht. Bei Schock oder Verbrennungsfällen ist z. B. eine häufige Verabreichung von HSA im allgemeinen zur Wiedergewinnung eines normalen Blutvolumenspiegels notwendig, um so die Traumaassoziierten Symptome zu verbessern. Bei einigen Patienten mit, Hypoproteinämie oder fötaler Erythroblastose ist eine therapeutische Behandlung mit HSA ebenfalls notwendig.
Entsprechend liegt die grundsätzliche therapeutische Signifikanz der HSA-Verabreichung in der Behandlung von Zuständen, in denen ein Flüssigkeitsverlust aus einem Blutgefäß, z. B. Zustände aufgrund von chirurgischen Eingriffen, Schock, Verbrennungen oder Ödem-induzierter Hypoproteinämie eintritt.
Z. Zt. wird HSA hauptsächlich als fraktioniertes Produkt aus dem Blut von Spendern gewonnen. Dieses Produktionsverfahren ist nachteilhaft dahingehend, dass es nicht ökonomisch ist und es schwierig ist die Blutversorgung aufrecht zu erhalten. Unter bestimmten Umständen kann Blut ungewünschte Substanzen, wie Hepatitisvirus, enthalten. Daher ist es sehr hilfreich ein HSA-Substitut zu entwickeln.
Zwischenzeitlich hat es die Entwicklung von rekombinanter DNA- Technologie bereits möglich gemacht, eine Vielzahl von nützlichen Polypeptiden in Mikroorganismen herzustellen. Eine Anzahl von Säugetier-Polypeptiden, z. B. humanes Wachstumshormon und Interferone, werden bereits im großen Maßstab mit verschiedenen Mikroorganismen hergestellt. Diese Technologie hat die Produktion von verschiedenen Vaccinen, Hormonen, Enzymen und Antikörpern in Mikroorganismen ermöglicht.
Allerdings ist bei Proteinprodukten aus Mikroorganismen, insbesondere Escherichia coli, häufig eine Kontamination mit Endotoxinen zu finden. Diese müssen aus den gewünschten Proteinprodukten entfernt werden.
Es hat sich herausgestellt, dass das Wachstum von Säugetierzellen in einem großen Maßstab ausreichend um mit niedrigen Kosten vorteilhafte Proteine, die von den Zellen ausgeschieden werden, herzustellen schwierig zu erreichen ist. Eine Generation von Säugetierzellen ist im Vergleich zu einer Generation von Mikroorganismen wesentlich länger und daher ist eine lange Kultivierungsperiode notwendig, um eine ausreichend hohe Zellkonzentration zu erzielen. Weiterhin ist die maximale Zellkonzentration, erhältlich durch Kultivieren von Säugetierzellen, im allgemeinen wesentlich geringer als bei der Kultivierung von Mikroorganismen in großem Maßstab. Weiterhin ist eine Verbesserung der Zelllinie im Vergleich zu Mikroorganismen schwierig.
Da alle Eukaryoten Mechanismen zur Expression von genetischer Information haben wird erwartet, dass eukaryotische Gene effinzienter in eukaryotischen Wirten als in prokaryotischen, wie Escherichia coli, exprimiert werden. Unter den verwendbaren Eukaryoten können die Hefen am leichtesten gehandhabt werden. Es ist bekannt, dass der sekretorische Weg in Hefen dem in höheren tierischen Zellen ähnelt und weiterhin, dass in den Hefezellen Proteine in einer Art und Weise prozessiert werden, dass die Signalssequenz (nicht- geladener N-terminaler Bereich des Proteins; im allgemeinen während des Transports zur Ausscheidung abgeschnitten) abgeschnitten wird. Proteine, die in eukaryotischen Wirten den sekretorischen Weg betreten und durchlaufen, haben möglicherweise eine bessere dreidimensionale Struktur im Vergleich zu Proteinen synthetisiert im Cytoplasma. Es ist bemerkenswert, dass Prokaryoten, wie Escherichia coli, anscheinend keine großen Proteine in dreidimensionaler Struktur aufweisen.
Weiterhin ist das Glykolysierungssystem in Eukaryoten mit dem sekretorischen System verbunden. Der Grundschritt zum erzielen von glykosylierten Proteinen ist bei allem Eukaryoten ähnlich. Hefezellen können glykosylierte Proteine herstellen, im Gegensatz zu Prokaryoten, wie Escherichia coli.
Da Hefen Mikroorganismen sind, ist es einfach diese zu kultivieren. Die Anzahl von Hefezellen, erhältlich pro Volumeneinheit der Kultur, ist wesentlich größer im Vergleich zu Escherichia coli. Das Verhalten von Hefen bei der Fermentation wurde ausführlich untersucht und optimale Bedingungen zur Fermentation im industriellen Maßstab wurden hierfür bereits etabliert. Weiterhin sind Hefezellen Endotoxin-frei.
Es ist daher klar, dass es vorteilhaft ist Albumin, insbesondere HSA, in Hefen unter Verwendung gut-entwickelten industriellen Mikrobiologie-Techniken und der kürzlich entwickelten rekombinanten DNA-Techniken herzustellen, wenn dieses gelingt.
Einige Verfahren sind zur Herstellung von HSA unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie mit Hefen als Wirt- Organismus bekannt (U.S. Patentanmeldung Nr. 488323 oder EP-A-123544, EP-A-248637 und EP-A-251744).
Wenn eine großvolumige Produktion von HSA gewünscht wird, ist eine umfassende Hefekultivierung essentiell. Im derzeitigen Stand der Technik wird das Plasmid mit dem gewünschten Gen häufig während der Kultivierung von Wirtzellen verloren, wenn eine transformierte Hefe kultiviert wird. Um das Wachstum von Hefen zu verhindern, die das Plasmid verloren haben, ist es notwendig, einen Selektionsmarker in diesem Plasmid bereitzustellen (z. B. einen Nährstoff-voraussetzenden Marker, Wirkstoff-resistenten Marker). In diesem Fall muss allerdings eine Aminosäure oder ein Wirkstoff entsprechend dem Selektionsmarker zum Medium zugesetzt werden. Dies bedeutet eine Erhöhung der Produktionskosten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Entsprechendes ist ein Ziel der Erfindung die Bereitstellung eines Plasmids zur Rekombination, in dem das gewünschte Gen, nämlich das Albumingen, insbesondere das HSA-Gen, verbleibt ohne Anwendung eines Selektionsdrucks, eine Transformante transformiert mit diesem Plasmid, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Transformante und ein neues Verfahren zur Herstellung von Albumin, insbesondere HSA.
Die Erfindung stellt somit bereit:
(1) Ein Plasmid für einen Hefewirt, das Plasmid umfasst die Sequenz: (1) ein Promotor von der Hefe, (2) eine Albuminkodierende Region, die unter der Kontrolle des Hefe- Promotors ist, (3) einen Transkriptions-Terminator und (4) eine Sequenz homolog zu einem Teil der chromosomalen Hefewirt-Sequenz, so dass das Plasmid in der Lage ist in das Chromosom der Hefewirtszelle zu integrieren und wobei das Plasmid nicht in der Lage ist sich autonom in den Hefewirtszellen zu replizieren;
(2) ein Hefewirt transformiert mit obigem Plasmid;
(3) ein Verfahren zur Herstellung einer Hefetransformante, umfassend das Transformieren eines Hefewirts durch Integrieren von mindestens zwei verschiedenen Plasmiden, die jeweils eine Sequenz homolog zu einem Teil der chromosomalen Hefewirt-Sequenz haben, gleichzeitig in das Chromosom der Hefewirtszelle;
(4) ein Verfahren zur Herstellung von Albumin, umfassend das Kultivieren mit einem Plasmid für einen Hefewirt, das Plasmid umfasst in der Reihenfolge: (1) einen Promotor von der Hefe, (2) eine Albumin-kodierende Region, die sich unter der Kontrolle des Promotors aus der Hefe befindet, (3) einen Transkriptions-Terminator und (4) eine Sequenz homolog zu einem Teil der chromosomalen Hefewirt-Sequenz, wo das Plasmid in der Lage ist, in das Hefewirtzell- Chromosom integriert (insertiert) zu werden, und wobei das Plasmid nicht in der Lage ist sich autonom in Hefezellen zu replizieren und Gewinnen des so hergestellten Albumins.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pYI014 und pYI016.
Fig. 2 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pYO-020 und pYO-026.
Fig. 3 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pKM-007.
Fig. 4 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pMM-006.
Fig. 5 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pMS-008.
Fig. 6 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pRO-011.
Fig. 7 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pYI-032.
Fig. 8 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pHRA33.
Fig. 9 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pLFA33.
Fig. 10 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pTF418.
In den Fig. 1 bis Fig. 10 bezeichnet den Promotor, bezeichnet Signalsequenz, bezeichnet das HSA- Strukturengen, bezeichnet den Terminator, bezeichnet die Sequenz homolog zu der entsprechenden Region des Hefechromosoms und → bezeichnet die Richtung der Transkription.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Im folgenden wird die Erfindung bezüglich HSA als zentrale Figur weiter beschrieben.
Das erfindungsgemäße Plasmid enthält eine homologe Sequenz umfassend die DNA-Sequenz eines Genabschnitts, der im Hefewirt-Chromosom vorkommt (z. B. LEU2, HIS4, TRP1, URA3, Ribosomen-DNA-Gen) und das somit stabil integriert werden kann, entweder so wie es ist oder in seiner linearisierten Fragmentform in das Wirtschromosom aufgrund einer Rekombination. So können Nachkommen der Zellen das transformierte genetische Material stabil während der Proliferation bewahren, selbst wenn kein Selektionsdruck angelegt ist.
Wenn das Plasmid z. B. zusammen mit dem HSA-Gen eine Sequenz enthält, die natürlicherweise in einem Gen eines Hefewirt- Chromosoms vorkommt, kann das Plasmid stabil in das Chromosom am Genlokus auf dem Chromosom integriert werden.
Die Sequenz, die homolog zu einem Teil eines Gens auf dem Hefewirt-Chromosom ist, kann eine Sequenz die homolog zu einem gesamten Gen oder einem Teil eines gesamten Gens ist, sein.
Insbesondere nützlich als Sequenz homolog zu einem Teil der Hefewirts-chromosomalen Sequenz ist u. a. ein Gen zur Synthese von Aminosäure- oder Nukleinsäurebasen (oder Vorläufer davon), Ribosomen-DNA und Ty-Element. Genauer kann ein Gen zur Synthese von Aminosäure- oder Nukleinsäurebasen als Selektionsmarker für Transformanten verwendet werden, wenn der Hefewirt ein Aminosäure- oder Nukleinsäure-defizienter Stamm ist, nämlich ein Stamm der defizient ist in einem Aminosäure- oder Nukleinsäurebasen-Synthesegen, somit dient das Gen zur Synthese der Aminosäure- oder Nukleinsäurebasen als Gen zur Komplementierung des relevanten Mutation im Wirt. In diesem Fall wird der auxotrophe Hefewirt prototroph. Als Synthesegen für Aminosäure- oder Nukleinsäurebasen kann genannt werden LEU2, HIS4, TRP1 und URA3.
Wenn der Hefewirt auxotroph ist, können, wie oben erwähnt, nützliche genetische Selektionsmarker in Hefen Synthesegene von Aminosäuren oder Nukleinsäuren sein. Wenn der Wirt ein Antibiotika-zugänglicher Stamm ist, kann das Gen für die Antibiotikaresistenz verwendet werden. Als solche Gene können Gene genannt werden, die Antibiotika, wie Cycloheximid-, G418-, Chloramphenicol-, Bleomycin- und Hygromycin-Resistenz verleihen. Das erfindungsgemäße Plasmid kann einen oder mehrere dieser genetischen Selektionsmarker aufweisen.
Die Albumin-kodierende Region, die das erfindungsgemäße Plasmid enthält, ist insbesondere eine DNA-Sequenz identisch oder homolog zu der Sequenz kodierend für humanes Serumalbumin (HSA) und kann z. B. erhalten werden aus einer humanen Zelllinie, die in der Lage ist, HSA herzustellen. Solche DNA kann eine chromosomale DNA sein oder ein cDNA. Die chromosomale DNA kann unter anderem aus einer Genbibliothek, enthaltend ein HSA-Gen, isoliert werden, während die HSA-cDNA über die entsprechende mRNA unter Verwendung von geeigneten Verfahren isoliert werden kann.
Der erfindungsgemäß verwendbare Promotor stammt aus der genetischen DNA von Hefe, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae (EP-A-206733 oder U.S. Patentanmeldung Nr. 745,524). Es wird bevorzugt, den Promotor eines stark exprimierten Hefegens zur Expression des HSA zu verwenden. Somit sind verwendbare Promotoren, die vom TRPI-Gen, ADHI- oder ADHII-Gen, Säurephosphatase (PHO3 oder PHO5) -Gen oder Cytochrom-c-Gen, der Galaktose-Stoffwechsel-Systempromotor (GAL1, GAL10 oder GAL7), der Invertaspromotor (SUC2), der Promotor für ein Gen das für ein Enzym kodiert, das in der Glykolyse involviert ist, z. B. der Promotor der Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP-DH), 3- Phosphoglyceratkinase (PGK), Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofruktokinase, Glukose-6-phosphatisomerase, 3- Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triphosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase oder Glukokinasegen oder dgl. und der Promotor des Hefe-Pheromon-Paarungsgens, kodierenden für den a-Faktor oder α-Faktor. Unter diesen sind bevorzugte Promotoren GAP-DH-Promotor, PGK-Promotor und GAL1-Promotor.
Das erfindungsgemäße Plasmid ist nicht in der Lage sich autonom in Hefewirten zu replizieren. Somit ist es im wesentlichen frei von irgendeiner Region die in der Lage ist, eine autonome Replikation in Hefewirten zu induzieren, z. B. der 2 um-DNA-Replikationsursprung oder der ARS (autonom replizierbare Sequenz).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Signalsequenz in die Plasmidstruktur eingeführt. Verwendbar als Signalsequenz sind Signalsequenzen von der Hefe, wie das Hefe-Invertasegen (SUC2-Signalsequenz), α-Faktorgen, wobei die SUC2-Signalsequenz bevorzugt wird. Die HSA-Signalsequenz ist eine bevorzugte und eine Signalsequenz die insbesondere zur sekretorischen Expression in Hefen synthetisiert ist, kann ebenfalls bevorzugt verwendet werden (U.S. Patentanmeldung Nrn. 190,553 und 311,556 entsprechend EP-A-319641 und EP-A-329227).
Als Ergebnis des Einfügens einer solchen Signalsequenz geht das HSA-Genprodukt nach Expression des Gens, in den sekretorischen Weg und wird zum periplasmatischen Raum transportiert. Das Protein kann weiter durch die Zellwand in das Medium sekretiert werden. Dies führt zu einem bemerkenswerten Anstieg der Ausbeute. Da weiterhin kein Zellaufschluss notwendig ist, kann der Wiedergewinnungsschritt vereinfacht werden.
Das erfindungsgemäße Plasmid kann weiterhin einen entsprechenden Terminator zur Beendigung der Transkription beinhalten, z. B. den PH05-oder GAP-DH-Terminator.
Das erfindungsgemäße Plasmid kann weiter einen Replikationsursprung aus bakteriellen Wirten enthalten, insbesondere Escherichia coli, genauso wie genetische Selektionsmarker aus Escherichia coli zusätzlich zu dem Promotor, der HSA-kodierenden Region, den Transkriptionsterminator und der Region homolog zu einem Teil der chromosomalen Hefewirtsequenz. Die Verwendung eines solchen Replikationsursprungs aus Escherichia coli und eines selektiven Markers aus Escherichia coli, um ein Hefehybridvektor zu ergeben, weist nützliche Eigenschaften auf. Erstens, kann die Hybridvektor-DNA in großen Mengen durch Wachsenlassen von Escherichia coli zur Replikation der DNA hergestellt werden. Zweitens, kann solch ein Hybridvektor einfach durch Ausnutzen der Klonierungstechniken auf Escherichia coli-Basis, wie sie derzeit zur Verfügung stehen, einfach konstruiert werden. Escherichia coli-Plasmide, z. B. pBR322, enthalten den Replikationsurspung aus Escherichia coli und einen Escherichia coli-genetischen Marker, der eine Resistenz gegenüber Antibiotikum oder Antibiotika, wie Tetracyclin und Ampicillin, verleiht. Solche Plasmide können vorteilhaft zur Konstruktion der Hefehybridvektoren, wie sie oben genannt sind, verwendet werden.
Entsprechend enthält das erfindungsgemäße Plasmid nacheinander: (1) einen Promotor aus der Hefe, (2) eine Albumin-kodierende Region, die unter der Kontrolle dieses Promotors ist, (3) einen Terminator zur Beendigung der Transkription, der dieser Region folgt und (4) ein Sequenz homolog zu einem Teil der chromosomalen Hefewirt-Sequenz. Bevorzugt enthält das Plasmid weiterhin (5) eine Signalsequenz zur sekretorischen Produktion die sich unmittelbar stromabwärts vom Promotor befindet, (6) einen genetischen Selektionsmarker zur Auswahl von Escherichia coli- Transformanten der sich unmittelbar stromabwärts von der homologen Sequenz befindet und unmittelbar stromabwärts davon (7) einen genetischen Selektionsmarker für Hefen. Noch bevorzugter enthält das Plasmid weiterhin (8) einen Replikationsursprung aus Escherichia coli der sich unmittelbar stromabwärts vom genetischen Selektionsmarker für die Selektion von Escherichia coli-Transformanten befindet. Dieses Plasmid ist im wesentlichen frei vom Replikationsursprung der Hefen.
Die oben beschriebenen konstituierenden Sequenzen, die für das erfindungsgemäße Plasmid verwendet werden, sind aus bekannten Plasmiden erhältlich. Das erfindungsgemäße Plasmid kann in herkömmlicher Weise hergestellt werden, z. B. durch Ausschneiden der gewünschten konstituierenden Sequenz aus dem entsprechenden Plasmid durch Schneiden mit entsprechendem Restriktionsenzym, die Ligation jeder konstituierenden Sequenz in der bestimmten Reihenfolge und Einfügen des Ligationsprodukts in ein entsprechendes Vektorplasmid. Alternativ kann das Plasmid konstruiert werden durch Einfügen der konstituierenden Sequenzen in das Plasmid enthaltend die anderen konstituierenden Sequenzen. Als Vektorplasmid geeignet ist ein Escherichia coli-Plasmid, wie pUC19, pBR322 oder pAT153.
Normalerweise wird in der Erfindung ein Hefe als Wirt verwendet, insbesondere ein Stamm der Gattung Saccharomyces oder Pichia. Der Wirt sollte bevorzugt ein auxotropher und/oder Antibiotika-zugänglicher Stamm sein.
Eine Albumin-produzierende Transformante kann unter Verwendung des obengenannten rekombinanten Plasmids in folgender Art und Weise hergestellt werden.
Das rekombinante Plasmid wird in das Chromosom der Hefewirtszelle integriert. Die Integration des Plasmids in das Hefechromosom kann gemäß dem Verfahren beschrieben in Methods in Enzymology, 101, 228 (1983) durchgeführt werden. Insbesondere ist es wünschenswert, dass das Plasmid an einer ggf. ausgewählten Stelle innerhalb der enthaltenen Sequenz und homolog zu einem Teil des Hefezellwirt-Chromosoms durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und das so linearisierte Plasmid in den Wirt eingefügt wird. Das linearisierte Plasmid wird in die Region auf dem Hefewirt- Zellchromosom, die homolog ist zu der in das Plasmid eingeführten Region, integriert. Das linearisierte Plasmid wird mit einer höheren Frequenz im Vergleich zur zirkulären Form in das Wirtschromosom integriert. Der zu verwendende Hefewirt ist bevorzugt eine Mutante, die eine Mutation enthält, zu der das Selektionsmarkergen zur Hefeselektion enthalten im Plasmid komplementär ist, z. B. Saccharomyces cerevisiae AH22 (a, his4, leu2, can1), dies ist ein Leucin- und Histidin-benötigender G418-empfänglicher Stamm.
Die Transformation der Hefewirtszellen wird durch geeignete bekannte Verfahren durchgeführt, z. B. durch das Protoplast- Polyethylenglykolverfahren oder dem Elektroporationsverfahren.
Ob das Plasmid dann an der gewünschten Stelle integriert wurde oder das eingefügte Gen stabil ist, sollte überprüft werden. Genauer, ob das Plasmid an der erwarteten Stelle integriert wurde, kann durch ein Southern-Blot überprüft werden, wobei als Probe die Sequenz homolog zu einem Teil der chromosomalen Sequenz der Hefewirtszelle, die zum Zweck der Transformation verwendet wurde, verwendet wird. Bezüglich der Stabilität des Albumin-kodierenden Gens, können die Ausbeute an Albumin und die Verbesserung der Auxotrophie und Aufrechterhaltung der Prototrophie als Indizes verwendet werden und es sollte bestätigt werden, dass diese Indizes sich selbst nach einer Vielzahl von Generationen und Subkultivierungen der Transformante in einem nicht-selektiven Medium nicht verändert.
Ein Stamm der die Voraussetzungen der obigen Identifikations- oder Überprüfungstests erfüllt, ist somit unzweifelhaft eine Transformante in der das Albumin-kodierende Region-enthaltende Plasmid in das Hefewirtszell-Chromosom an der gewünschten Stelle integriert wurde. Diese Transformante kann einem anderen Plasmid, enthaltend in einer Albumin-kodierenden Region unter Verwendung dieser Transformante als Wirt transformiert werden. In diesem Fall kann die Region homolog zu einem Teil der chromosomalen Hefezellsequenz verschieden von der homologen Region mit die von der ersten Transformation verwendet wurde, sein. Das erste Plasmid und das zweite Plasmid sind unterschiedlich.
Als unterschiedlich nützliche Sequenzen homolog zu einem Teil der chromosomalen Wirtshefezell-Sequenz können genannt werden die Ribosomen-DNA und das Ty-Element (Hefetransposonelement). Da jede Hefezelle diese Gene in einer Mehrzahl enthält, erlaubt die Verwendung von solchen Genen die Integration des gewünschten Gens in das Wirtschromosom an einer Vielzahl von Stellen durch ein Transformationsverfahren.
Als Beispiel wird unten ein typisches Verfahren zur Integration beschrieben. Es wird angemerkt, dass die beschriebene Technik allerdings nur eine ist von bevorzugten Mitteln und es ist keineswegs bezüglich des Bereichs der vorliegenden Erfindung beschränkend. Homologe Sequenzsubstitution ist durch selektive Wiederholung möglich.
Saccharomyces cerevisiae AH22, der ein Leucin- und Histidinbenötigender G418-zugänglicher Stamm ist mit Mutationen in LEU2 des Leucinssynthesegens und HIS4 des Histidinsynthesegens, wird als Wirt verwendet.
Zuerst wird der Stamm mit einem Plasmid enthaltend LEU2 als Sequenz homolog zu einem Teil der chromosomalen Hefewirt- Zellsequenz transformiert, um eine nicht-Leucin-benötigende Transformante zu erhalten. Die erhaltene Transformante hat das Plasmid, enthaltend die Albumin-kodierende Region, an der LEU2-Genstelle des Chromosoms eingefügt, sie benötigt nicht länger Leucin und kann in einem Leucin-freien Medium wachsen.
Diese Transformante wird dann als Wirt verwendet und mit einem Plasmid mit HIS4, das Gen, das die erhaltene Transformante umwandelt, so dass es kein Histidin mehr benötigt, als Sequenz homolog zu einem Teil der Hefewirtszellen-chromosomalen Sequenz, transformiert (das Plasmid enthält natürlich eine Albumin-kodierende Region). Die so erhaltene Transformante trägt das Plasmid enthaltende Albumin-kodierende Region, eingefügt in die HIS4-Genstelle auf dem Chromosom und ist nun ein Stamm der nicht Histidin benötigt und in der Lage ist, in einem Histidin-freiem Medium zu wachsen. Zu diesem Zeitpunkt kann das gewünschte Gen exprimiert werden, nämlich das Albumingen, welches an zwei Stellen integriert wurde, nämlich LEU2 und HIS4.
Anschließend wird die obige Transformante, die nun nicht länger Leucin oder Histidin benötigt, als Wirt verwendet und mit einem Plasmid mit TRP1 als Sequenz homolog zu einem Teil der chromosomalen Hefewirtszell-Sequenz. Dieses Plasmid enthält zusätzlich das G418-Resistenzgen, genauso wie eine für Albumin-kodierende Region. Die so erhaltene Transformante trägt die Albumin-kodierende Region- und das G418- Resistenzgen-enthaltende Plasmid eingefügt in der TRP1- Genstelle auf dem Chromosom, so dass es nun eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418 aufzeigt. Diese so erhaltene Transformante enthält das Albumin in insgesamt drei Stellen, nämlich LEU2, HIS4 und TRP1 auf dem Chromosom. Bei der Herstellung dieser Transformante ist die Reihenfolge der Integration nicht besonders kritisch.
Wenn ein Stamm, der eine Anzahl von Nährstoffen benötigt oder ein Stamm der empfindlich gegenüber einer Anzahl von Antbiotika ist, zur Verfügung steht, kann die entsprechende Zähl an Regionen als Integrationsstellen für ein nützliches Gen verwendet werden.
Hierdurch kann das gewünschte Gen in das Wirtschromosom in einer Vielzahl von Stellen integriert werden. Jedes in das Chromosom integrierte Gen kann stabil bleiben ohne verloren zu gehen und die Genintegration an einer Vielzahl von Stellen erlaubt es, dass ein gewünschtes Produkt in einer großen Menge herzustellen.
Die Transformante wird in einem bekannten Medium kultiviert, z. B. YPD-Flüssigmedium [1% Hefeextrakt (Difco), 2% Bacto- Polypepton (Difco) 2% Glukose]. Im allgemeinen wird die Kultivierung bei einer Temperatur von 15 bis 43ºC (bevorzugt ca. 30ºC) für ca. 20 bis 100 Stunden durchgeführt, mit Belüften und/oder Rühren, wenn notwendig.
Nach Kultivierung wird das Produkt durch ein bekanntes Verfahren aufgereinigt, z. B. durch Fraktionieren, Chromatographie, usw.
Der Assay für Albumin kann unter Verwendung einer RPHA- oder ELISA-Technik durchgeführt werden.
Das folgende Referenzbeispiel zeigt den Hintergrund der Erfindung genauer auf.
Die Reaktion, Analyse und anderen verwendeten Techniken sind allgemein bekannt. So lange nicht anders angegeben, sind die verwendeten Enzyme kommerziell erhältlich, z. B. von New England BioLabs (NEB), Massachusetts, USA; Amersham, Großbritannien; und Bethesda Research Laboratories (BRL), Maryland, USA.
So lange nicht anders angegeben, wurden die enzymatischen Reaktionen unter Verwendung von Puffern und Reaktionsbedingungen, wie sie durch den Hersteller der entsprechenden Enzyme empfohlen werden, durchgeführt.
Die Transformation von Escherichia coli mit jedem Plasmid, Plaque-Hybridisierung, Elektrophorese und DNA-Wiedergewinnung aus Gelen, wurde gemäß den Verfahren, beschrieben in "Molecular Coloning", Cold Spring Harbor Laboratory (1982) durchgeführt. Die Transformation der Hefe wurde durch das Verfahren durchgeführt beschrieben in "Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory (1981).

REFERENZBEISPIEL 1

[I] KLONIERUNG DER GAP-DH-PROMOTORREGION, SUC2-SIGNALREGION, LEU2-REGION, HIS4-REGION, TRP1-Region und PHO5- Terminatorregion und Präparation des HSA-Gens und des G418-RESISTENZGENS

Die oberen Regionen und Gene wurden durch Verfahren, beschrieben in der Literatur oder durch Modifikationen davon, gewonnen oder durch Beschaffung von kommerziellen Quellen, wie folgt:
GAPDH-Promotor: Holland, H. J. und Holland J. P., J. Biol. Chem., 254 (12), 5466 (1979); Holland, H. J, und Holland, J. P., J. Biol. Chem., 254 (19), 9839 (1979); U.S. Patentanmeldung Nr. 057,143 oder EP-A-248410;
SUC2-Signalsequenz: U.S. Patentanmeldungen Nr. 488,337 und 057,143 entsprechend EP-A-127304 bzw. EP-A-248410;
HSA-Gen: U.S. Patentanmeldung Nr. 745,524 oder EP-A-206733;
PHO5-Terminator: U.S. Patentanmeldung Nr. 296,868 oder EP-A-216573;
G418-Resistenzgen: Oka, A., Sugisaki, H. und Takanami, M., J. Mol. Biol., 147, 217 (1981); Jimenez, A. und Davies, J., Nature, 287, 869 (1980); U. S. Patentanmeldung Nr. 612,796 oder EP-A-163491;
TRP1: Aus dem Plasmid pBTI-10 (kommerziell erhältlich von Boehringer-Mannheim);
LEU2: Aus dem Plasmid pBTI-1 (kommerziell erhältlich von Boehringer-Mannheim);
HIS4: Donahue, T. F., Daves, R. S. et al., Cell, 32, 89 (1983).
Escherichia coli-Region des Replikationsursprungs und das Ampicillin-Resistenzgen: aus dem Plasmid pUC19 (kommerziell erhältlich von Takara Shuzo).

[II] PLASMIDKONSTRUKTION

Die Konstruktion der Plasmide wurde unter Verwendung der herkömmlichen Verfahren, beschrieben in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory (1982) durchgeführt.

1. KONSTRUKTION DES PLASMID pYI011

Eine Hefe-genomische DNA wurde aus Saccharomyces cerevisiae GRF18 pho80 cir&sup0; gewonnen (EP-A-180958). Diese genomische DNA wurde mit HincII und BamHI verdaut und die 2,3 bis 3,2 kb DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel nach Elektrophorese isoliert. Diese DNA- Fragmente wurden in die HincII- und BamHI-Stelle von Plasmid pUC18 integriert. Das erhaltene Plasmid wurde in Escherichia coli JM109 kompetente Zellen eingefügt. Somit wurden ca. 7.500 Kolonien der Hefe-genomischen DNA-Bibliothek erhalten.
Getrennt davon wurde die unten gezeigte DNA-Sequenz, die für einen Teil eines Hefe-Invertase-Strukturgens kultiviert, synthetisiert.
Die genomische Hefe-DNA-Bibliothek wurde unter Verwendung der obigen synthetischen DNA als Probe gescreent. Unter den positiven Klonen (die Nachweisrate = 1/360) wurde ein Klon mit einem Plasmid, enthaltend die Promotor- und Signalsequenzregion des Hefe-Invertasegens (SUC2) ausgewählt. Dieses Plasmid wurde als pYI011 bezeichnet.

2. KONSTRUKTION DER PLASMIDE pYI013, pYI014 UND pYI016 (siehe Fig. 1)

Die DNA-Sequenz, kodierende die SUC2-Signalsequenz, wurde synthetisiert. Ihre DNA-Sequenz ist unten gezeigt.
Diese synthetische DNA wurde mit dem vom pYI011stammenden 880 bp EcoRI-HindIII-DNA-Fragment ligiert und das Ligationsprodukt wurde in die EcoRI-XbaI-Stelle von pUC19 eingeführt. Das erhaltene Plasmid (pYI012) wurde einem Verdau mit BglII unterworfen, einer Behandlung mit der Mung-Bohnen-Nuklease und einem weiteren Verdau mit EcoRI. Das 0,97 kb-DNA-Fragment wurde isoliert.
Getrennt davon wurden die folgenden DNA-Fragmente, A-1 und A-2 synthetisiert.
Diese DNA-Fragmente wurde miteinander annealed und das Annealing-Produkt wurde mit dem DNA-Fragment, erhalten durch Verdau von pGC-1043 (Genex) mit DraI und XbaI ligiert, um Plasmid pKO-001 zu erhalten. Dieses Plasmid wurde mit HincII und XbaI verdaut, um das 1 kb-HincII- XbaII-DNA-Fragment zu erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem oben erhaltenen 0,97 kb-DNA-Fragment ligiert.
Getrennt davon wurde pGC-1043 mit XbaI und HindIII verdaut und das Verdauprodukt wurde in pUC19 in die XbaI-HindII-Stelle eingefügt. Dieses Plasmid (pKM-001) wurde mit HindII verdaut und die kohäsiven Enden des erhaltenen DNA-Fragments wurden mit der T4-Polymerase aufgefüllt. Anschließend wurde dieses mit dem SalI-Linker ligiert, um das Plasmid pKO-002 zu erhalten. Dieses Plasmid wurde einem Verdau mit EcoRI und XbaI unterworfen. Das 2,5 kb-DNA-Fragment wurde isoliert und mit dem oben erhaltenen Ligationsprodukt ligiert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pYI013 bezeichnet.
Plasmid pYI013 wurde mit EcoRI und SalI verdaut und anschließend wurde das 2,75 kb-DNA-Fragment isoliert. Die kohäsiven Enden des DNA-Fragments wurden zu Blunt-Enden unter Verwendung der DNA-Polymerase I-Klenow-Fragments umgewandelt. Das DNA-Fragment wurde mit dem BamHI-Linker ligiert und das Ligationsprodukt wurde mit dem BamHI verdaut. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit dem BamHI- Verdau (7,7 kb) vom Plasmid pHIN/G-2 (Biogen) ligiert und das erhaltene Plasmid wurde als pYI014 bezeichnet.
Getrennt davon wurde der oben beschriebene BamHI-Verdau (8,7 kb) selbst ligiert, um das Plasmid pYI016 zu ergeben.

3. KONSTRUKTION DER PLASMIDE pKO-020 und pKO-026 (siehe Fig. 2)

Plasmid pYI016 wurde teilweise mit HindIII verdaut und anschließend mit EcoRI verdaut. Das 5,3 kb-DNA-Fragment wurde isoliert und die kohäsiven Enden wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem EcoRI-Linker ligiert und das Ligationsprodukt wurde selbst ligiert, um Plasmid pKO-017 zu erhalten. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut und das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit dem aus pYI014- stammenden 2,7 kb-BamHI-DNA-Fragment ligiert um Plasmid pKO-020 zu erhalten.
Plasmid pYI014 wurde mit SalI verdaut und das 2,0 kb-DNA- Fragment wurde isoliert. Getrennt davon wurde das Plasmid pKO-020 mit SalI verdaut, um ein 3,3 kb-DNA-Fragment zu erhalten und dieses DNA-Fragment wurde mit alkalischer Phosphatase vom Kälberdarm (CIP) zur 5'- Dephosphorylierung behandelt. Anschließend wurde das erhaltene DNA-Fragment mit oben erhaltenem 2,0 kb-DNA- Fragment ligiert um Plasmid pKO-026 zu erhalten.

4. KONSTRUKTION VON pKM-007 (siehe Fig. 3)

Das kommerziell erhältliche Plasmid pUC19 wurde mit PstI und SalI verdaut. Die kohäsiven Enden des erhaltenen DNA- Fragments wurden zu Blunt-Enden unter Verwendung der T4- DNA-Polymerase umgewandelt. Nach Ligation wurde das zirkuläre Plasmid mit EcoRI und BamHI verdaut und das 2,65 kb-DNA-Fragment wurde isoliert. Getrennt davon wurde Plasmid pGG5 (JP-A-63-84498) mit EcoRI und BamHI verdaut und das 0,65 kb-DNA-Fragment wurde isoliert. Dieses DNA- Fragment wurde mit dem oben erhaltenen 2,65 kb-DNA- Fragment ligiert, um Plasmid pYI018 zu erhalten. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI verdaut und die kohäsiven Enden des erhaltenen DNA-Fragments wurden unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase in Blunt-Enden umgewandelt, gefolgt von der Ligation mit einem SalI-Linker. Dieses Ligationsprodukt (pYI019) wurde mit BamHI und XbaI verdaut.
Getrennt davon wurde die unten gezeigte DNA-Sequenz, die für den GAP-DH-Promotor und für einen Teil der SUC2- Signalsequenz kodiert, synthetisiert.
Die synthetische DNA wurde mit dem pYI013-stammenden 1,1 kb-HindIII-XbaI-DNA-Fragment ligiert und das erhaltene DNA-Fragment wurde einem Verdau mit BamHI und XbaI unterworfen und ligiert mit dem oben aus pYI029- stammenden Erhaltenen, um Plasmid pKM004 zu erhalten. Dieses wurde weiterhin mit SalI und XbaI verdaut und in die SalI-XbaI-Stelle des Plasmid pUC19 eingefügt, um Plasmid pKM007 zu erhalten (4,4 kb).

5. KONSTRUKTION DES PLASMID pMM-006 (siehe Fig. 4)

Plasmid pBTI-1 wurde mit PstI verdaut, um ein 4,1 kb-DNA- Fragment zu erhalten. Plasmid pUC19 wurde mit PstI verdaut und das erhaltene DNA-Fragment wurde mit CIP behandelt und mit dem obigen 4,1 kb-DNA-Fragment ligiert um Plasmid pHO-001 zu erhalten (6,8 kb).
Plasmid pHO-001 wurde mit SalI und XhoI verdaut und das 2,3 kb-DNA-Fragment wurde isoliert. Die kohäsiven Enden dieses DNA-Fragments wurden unter Verwendung der Klenow- Fragment-DNA-Polymerase I in Blunt-Enden umgewandelt, gefolgt von der Ligation mit dem AatII-Linker.
Getrennt davon wurde Plasmid pKO-026 mit AatII verdaut und das erhaltene 6,3 kb-DNA-Fragment wurde mit CIP behandelt und mit dem oben erhaltenen DNA-Fragment ligiert um Plasmid pKH001 zu erhalten. Diese Plasmid wurde mit XbaI und SphI verdaut und das 6,4 kb-DNA- Fragment wurde isoliert.
Getrennt davon wurde Plasmid pKM-007 mit XbaI und SphI verdaut um das 1,7 kb-DNA-Fragment zu erhaltenen. Dieses Fragment wurde mit dem obigen 5,4 kb-DNA-Fragment ligiert und das Plasmid pMM006 zu erhalten.
Das Plasmid pMM-006 enthält die kodierende Region des LEU2-Gens als Sequenz homolog zu der Sequenz im Hefewirtszellchromosom. In diesem Plasmid sind die SUC2- Signalsequenz, das Strukturgen für HSA und der PH05- Terminator unter Kontrolle des GAP-DH-Promotors miteinander verbunden.

6. KONSTRUKTION DES PLASMID pMS-008 (siehe Fig. 5)

Plasmid pYI014 wurde mit PstI und BamHI verdaut und das so erhaltene 3,1 kb-DNA-Fragment wurde in die PstI-BamHI- Stelle von pUC19 eingefügt, um Plasmid pKO-014 zu erhalten. Dieses Plasmid wurde mit SmaI verdaut und das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit dem SphI-Linker ligiert und mit SphI verdaut, um ein 3,1 kb-DNA-Fragment zu erhalten.
Getrennt davon wurde pYI014 mit SphI verdaut und das erhaltene DNA-Fragment (11,5 kb) wurde mit CIP zur 5'- Dephosphorylierung behandelt. Dieses wurde dann mit dem obigen 3,1 kb-DNA-Fragment ligiert um Plasmid pMM003 zu erhalten.
Das Ligationsprodukt (pMM-003) wurde mit XbaI verdaut und das 9,0 kb-DNA-Fragment wurde isoliert. Nach Behandlung mit CIP wurde das 9,0 kb-DNA-Fragment mit dem aus pKM-007-stammenden 1,7 kb-XbaI-SphI-DNA-Fragment ligiert. Das Ligationsprodukt wurde mit SphI verdaut und das 2,9 kb-DNA-Fragment wurde isoliert.
Plasmid pYeHis4 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78/6), 3496 (1981) und Mol Gen. Genet., 188, 44 (1982)) wurde mit PstI und SphI verdaut und das 6,3 kb-DNA-Fragment wurde isoliert. Dieses DNA-Fragment wurde in die PstI-SphI- Stelle von pUC19 eingefügt und mit SphI verdaut. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit CIP behandelt und mit dem oben erwähnten 2,9 kb-DNA-Frägment ligiert. Somit wurde Plasmid pMS-008 erhalten.
Das Plasmid pMS-008 enthält den kodierenden Bereich des HIS4-Gens als Sequenz homolog zu einem Teil der chromosomalen Hefewirtszell-Sequenz. In diesem Plasmid sind unter der Kontrolle vom GAP-DH-Promotor die SUC2- Signalsequenz, das Strukturgen für HSA und der PHO5- Terminator miteinander verbunden.

7. KONSTRUKTION DES PLASMIDS pH0-011 (siehe Fig. 6)

Plasmid pKM-007 wurde mit XbaI und SphI verdaut und das 1,7 kb-DNA-Fragment wurde isoliert. Getrennt davon wurde Plasmid pKO-020 mit XbaI und SphI verdaut und das erhaltene DNA-Fragment (5,9 kb) wurde mit dem obigen 1,7 kb-DNA-Fragment ligiert. Anschließend wurde das Ligationsprodukt (pKH010) mit AatII verdaut, gefolgt von einer Behandlung mit CIP.
Plasmid pBTI-10 wurde mit EcoRI verdaut und das 1,45 kb- DNA-Fragment wurde erhalten. Getrennt davon wurde pUC19 mit EcoRI verdaut und das erhaltene DNA-Fragment wurde mit CIP behandelt. Dies wurde dann mit dem obigen 1,45 kb-DNA-Fragment ligiert um Plasmid pH0003 zu erhalten. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI und BglII verdaut und die kohäsiven Enden des so erhaltenen 0,85 kb-DNA-Fragments wurden in Blunt-Enden umgewandelt, gefolgt von der Ligation mit AatII-Linker. Dieses Ligationsprodukt wurde mit dem von pKH010-stammenden oben erhaltenen DNA-Fragment ligiert und Plasmid pHO-011 wurde erhalten.
Das Plasmid pHO-011 enthält des kodierenden Bereich des TRPI-Gens als Sequenz homolog zu einem Teil der Hefewirtszell-chromosomalen Sequenz. In diesem Plasmid stehen unter Kontrolle des GAP-DH-Promotors die SUC2- Signalsequenz, das Strukturgen für HSA und der PHO5- Terminator die miteinander verbunden sind.
Dieses Plasmid enthält das G418-Resistenzgen als Selektionsmarkergen für die Hefen.
Die Plasmide pMM-006, pMS-008 und pHO-011 wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry am 28. April 1989 gemäß Budapestvertrag, wie folgt hinterlegt:
(1) Name des Mikroorganismuses: pMM006/E. coli JM109
Hinterlegungsnummer: FERM BP-2404
(2) Name des Mikroorganismuses: pMS008/E. coli JM109
Hinterlegungsnummer: FERM BP-2406
(3) Name des Mikroorganismuses: pH0011/E. coli HB101
Hinterlegungsnummer: FERM BP-2405

[III] TRANSFORMATION VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE AH22 MIT PLASMID pMM-006

Saccharomyces cerevisiae AH22 wurde als Wirt verwendet.
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae AH22 ist vom Paarungstyp "a" und hat Mutationen in Histidin- Synthesegen (his4) und Leucin-Synthesegen (leu2). Daher kann er nicht proliferieren so lange kein Histidin oder Leucin zum Kulturmedium zugegeben wird.
Das Plasmid pMM-006 zur sekretorischen HSA-Expression wurde in das Chromosom des Hefestamms Saccharomyces cerevisiae AH22 wie folgt eingefügt.
Saccharomyces cerevisiae AH22 würde für 16 Stunden im 50 ml YPD-Medium (hergestellt durch Lösen von 10 g Hefeextrakt und 20 g Bacto-Pepton in Wasser, Auffüllen der Lösung auf 900 ml, Autoklavieren und Vermischen mit 100 ml separat autoklavierter 20% Glukose) bei 37ºC schüttel-kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 20 ml Wasser suspendiert und anschließend durch Zentrifugation wiedergewonnen. Die Zellen wurden in 10 ml einer Lösung, enthaltend 50 mM Dithiothreitol, 1,2 M Sorbitol und 25 mM EDTA (pH 8,5) suspendiert und die Suspension wurde leicht bei 30ºC für 10 Minuten geschüttelt. Die durch Zentrifugation gesammelten Zellen wurden in 10 ml 1,2 M Sorbitol suspendiert und durch Zentrifugation wiedergewonnen und die Zellen würden in 10 ml 1,2 M Sorbitol suspendiert, durch Zentrifugation gewonnen und in 10 ml 10 mM EDTA-0,1 M Natriumcitrat (pH 5,8), enthaltend 0,2 mg/ml Zymolyase 100T (Kirin Brewery Co.) und 1,2 M Sorbitol suspendiert. Die Suspension wurde leicht bei 30ºC für 1 Stunde geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, mit 10 ml von jeweils 1,2 M Sorbitol, 10 mM Kalziumchlorid und 1,2 M Sorbitol in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 1 ml 10 mM Kalziumchlorid- 1,2 M Sorbitol suspendiert. Ein 100 ul-Teil der Suspension wurde in sterilisiertes Teströhrchen gegeben, 5 ul (5 ug) pMM-006 (linearisiert durch Verdau der einzigen KpnI-Stelle im LEU2-Gen) wurde dazugegeben und die Mischung durfte bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen.
Anschließend wurden 1,2 ml 10 mM Trishydrochlorid (pH 7,5), enthaltend 20% Polyethylenglykol 4000 und 10 mM Kalziumchlorid zugegeben und nach leichtem Schütteln konnte die Mischung bei Raumtemperatur für 20 Minuten stehen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 0,1 ml YPD-Medium, enthaltend 1,2 M Sorbitol und 10 mM Kalziumchlorid suspendiert. Die Mischung wurde leicht bei 30ºC für 30 Minuten geschüttelt. Ein 1,5-, 10-, 20- oder 50 ul Teil der Suspension wurde mit Agarmedium vermischt und die Mischung wurde auf eine 10 ml auf 45ºC gehaltene Leucin-freie Mediumplatte ausgestrichen. Nach Verfestigung der gesamten Platte wurde eine stationäre Kultur für 3 Tage bei 30ºC durchgeführt. Die gebildeten Kolonien wurden mit Hilfe eines Zahnstochers gepickt und in 3 ml Medium zusammengesetzt aus 0,7% Hefe-Stickstoffbase und 2% Glukose suspendiert und bei 30ºC für 2 Tage schüttelkultiviert. Ein 1,5 ml-Teil der Kultur wurde zentrifugiert, die Zellen wurden gesammelt und im 3 ml YPD-Medium suspendiert (hergestellt durch Lösen von 10 g Hefeextrakt und 20 g Bacto-Pepton in Wasser, Auffüllen der Lösung auf 900 ml, Aufklavieren und Mischen mit 100 ml separat aufklavierten 20% Dextrose) und eine Schüttelkultur wurde bei 30ºC durchgeführt. Der Kulturüberstand wurde auf HSA-Konzentration intervallmäßig mit dem RPHA-Verfahren untersucht. Am dritten Tag erreichte die HSA-Konzentration ein Maximum von 40 ug/ml.
Die so erhaltene Transformante wurde als TMM-21-17 bezeichnet.

[IV] SCREENEN VON DER TRANSFORMANTE TMM-21-17 (STABILITÄT DES LEU2-GENS UND AUSBEUTE AN HSA)

(1) Die Integrationsstelle des HSA-Gens in TMM-21-17 wurde unter Verwendung der Southern-Blot-Technik bestimmt und es wurde bestätigt, dass das Gen sich tatsächlich in die LEU2-Region des Chromosoms integriert hat.
(2) Die Stabilität des HSA-Gens wurde bestimmt mit der Ausbeute an HSA unter Abwesenheit an notwendigem Leucin als Indizes. Nach ca. 60 Generationen an Subkultivierung in einem nicht-selektiven Medium, war die HSA-Genretention 100%.

[V] TRANSFORMATION DER TRANSFORMANTE TMM-21-17 MIT PLASMID pMS-008

Das gleiche Verfahren wie in Sektion [III] beschrieben wurde durchgeführt mit der folgenden Ausnahme:
Wirt: Transformante TMM-21-17;
Plasmid: pMS-008;
Zustand des eingefügten Plasmids: Linearisiert durch Verdau der einzigen NheI-Stelle im HIS4-Gen im pMS-008
Transformationsmedium: Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren wurde anstelle von Hefe-Stickstoffbasen verwendet (als Ergebnis war das Medium Leucin- und Histidin-frei).
Ausbeute humanes Serum-Albumin: 70 ug/ml.
Die so erhaltene Transformante wurde als TMS-31-3-7 bezeichnet.

[VI] SCREENING DER TRANSFORMANTE (TMS-31-3-7

Das obige Verfahren, wie beschrieben in Sektion [IV] wurde verwendet.
(1) Die Integrationsstelle des HSA-Gens wurde mit Southern-Blot-Technik bestimmt. Es wurde bestätigt, dass sich das Gen tatsächlich in die LEU2-Region und die HIS4-Region des Chromosoms integriert hat.
(2) Die Stabilität des HSA-Gens wurde durch Ausbeute an HSA unter Abwesenheit der Notwendigkeit Histidin als Indizes bestimmt. Nach ca. 60 Generationen Subkultivierung in einem nicht-selektiven Medium, war die HSA-Genretention 100%.

[VII] TRANSFORMATION DER TRANSFORMANTE TMS-31-3-7 MIT PLASMID pH0-011

Das gleiche Verfahren, wie in Sektion [III] beschrieben, wurde genutzt mit der folgenden Ausnahme:
Wirt: Transformante TMS-31-3-7;
Plasmid: pHO-011;
Zustand des eingefügten Plasmids: Linearisiert durch Verdau der einzigartigen Schnittstelle EcoRV im TRP1-Gen von pHO-011
Transformationsmedium: eine Protoplasten-Präparation zur Transformation wurde in YPD-Medium, versetzt mit 1,2 M Sorbitol, 2% Feinagar und 0,2% Monokaliumphosphat suspendiert;
Platten: YPD-Medium versetzt mit 1,2 M Sorbitol, 3% Feinagar und 100 ug/ml G418;
Ausbeute humanes Serum-Albumin: 80 ug/ml.
Der so erhaltene Transformante wurde als TMS-312 bezeichnet.

[VIII] SCREENEN DER TRANSFORMANTE TMS-32

Das gleiche Verfahren wie in Sektion [IV] wurde angewendet.
(1) Die Integrationsstellen des HSA-Gens wurden mit Hilfe des Southern-Blots untersucht. Es wurde bestätigt, dass das Gen sich tatsächlich in die LEU2-, HIS4- und TRP1-Regionen des Chromosoms integriert haben.
(2) Die Stabilität des HSA-Gens wurde bestimmt durch die Ausbeute an HSA und der Resistenz gegenüber G418 als Indizes. Selbst nach ca. 60 Generationen Subkultivierung in einem nicht-selektiven Medium, war die HSA-Genretention 100%.
Es wurde somit bestätigt, dass die Transformante TMS-32 das HSA-Gen in das Chromosom des Hefewirts-Saccharomyces cerevisiae AH22 an drei Stellen, nämlich den LEU2-, HIS4- und TRP1-Regionen integriert hat.
Wie oben ausführlich beschrieben, führt die vorliegende Erfindung zu den folgenden Effekten: Das gewünschte Gen, nämlich das HSA-Gen wurde kaum durch die Wirtszelle verloren und verbleibt darin ohne Anwendung eines Selektionsdruck und weiterhin kann der Expression von HSA durch Integration des gewünschten in einer Vielzahl von Stellen erhöht werden.

REFERENZBEISPIEL 2

Saccharomyces cerevisiae AH22 wurde als Wirt verwendet und ein HSA-produzierender mehrfach integrierter Stamm A124 wurde hergestellt.

[I] EINFÜGEN VON DER HSA-TRANSKRIPTIONSEINHEIT IN DEN STAMM AH22

Ein Integrationsvektor, enthaltend die HSA- Transkriptionseinheit zusammengesetzt aus GAP-DH- Promotor/mHSA-Signal-HSA-cDNA/GAP-DH-Terminator wurde in die TRP1-Region von Saccharomyces cerevisiae AH22 inkorporiert und 34 HSA-produzierende integrierte Klone (A1) wurden erhalten. Unter diesen wurden zwei Klone herausgescreent, diese zeigten ein gutes Wachstum, nämlich Al-13, der 50 mg/l HSA produzieren kann und As-32, der 40 mg/l HSA produzieren kann, und diese wurden als Kandidatenstämme zur Mehrfachintegration verwendet.

A. MATERIALIEN UND VERFAHREN

(a) Stamm
Saccharomyces cerevisiae AH22 (a, LEU2, HIS4, CAN1) wurde verwendet.
(b) Der Integrationsvektor pTF418 (Fig. 2) wurde verwendet. pTF418 ist ein Integrationsvektor, enthaltend die HSA-Transkriptionseinheit zusammengesetzt aus GAP-DH-Promotor/mHSA-Signal/HSA-cDNA/GAP-DH-Terminator. Sie enthält das TRP1-Gen als Sequenz homolog zum entsprechenden Teil der Hefewirtszell-chromosomalen Sequenz. Sie enthält weiterhin das G418-Resistenzgen als Hefeselektions-Markergen. In diesem Vektor ist die Richtung der TRP1-Transkription die gleiche wie die der HSA-Transkription. Der verwendete GAP-DH-Terminator ist in JP-A-62 175180 beschrieben und die verwendete mHSA- Signalsequenz ist in EP-A-319641 beschrieben.
pTF418 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV verdaut, dieses kann pTF418 nur an einer einzigen Stelle in der TRP1-Region schneiden und die Konzentration wurde auf 0,5 ug/ul eingestellt.
Die Daten zur Restriktions-Enzymanalyse für pTF418 sind in Tabelle 1 unten gezeigt. TABELLE 1
(c) Transformation von S. cerevisiae AH22 mit Plasmid pTF418
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1, [III] beschrieben, wurde mit Ausnahme des folgenden verwendet:
Plasmid: pTF418
Zustand des eingefügten Plasmids: pTF418 wurde durch Schneider an der einzigartigen EcoRV-Stelle im TRP1-Gen linearisiert.
Transformationsmedium: Eine Protoplastenpräparation zur Transformation wurde im YPD-Medium versetzt mit 1,2 M Sorbitol, 3% Feinagar und 0,2% Kaliumphosphat suspendiert. Für die Plattenpräparation wurde YPD-Medium verwendet, versetzt mit 1,2 M Sorbitol, 3% Feinagar und 100 ug/ml G-418.
(d) Gewinnung der integrierten Klone
Von den Kolonien, die auf den Platten erschienen, wurden 36 Kolonien jeweils mit einem Zahnstocher gepiekt, in sterilisiertem Wasser suspendiert und als Einzelkolonie auf einer YPD-Gen&sub1;&sub0;&sub0;-Platte (YPD-Platte, enthaltend 100 ug/ul) isoliert. Für jede Kolonie wurde ein Klon ggf. als integrierter Klon mit inkorporiertem Vektor in die TRP1-Region des Chromosoms ausgewählt (bestätigt durch Southern-Blot).
(e) Kultivierung der integrierten Klone
1) Kultur in mittleren Teströhrchen: Eine Schlaufe Zellen wurde von der YPD-Gen&sub1;&sub0;&sub0;-Platte gesammelt und in 3 ml YPD-Medium kultiviert, in einem mittleren Teströhrchen bei 30ºC und 140 Upm für 72 Stunden.
2) Kultur in Flaschen: Eine Schlaufe Zellen wurde von der YPD-Gen&sub1;&sub0;&sub0;-Platte gesammelt und in 3 ml YPD- Medium in einem mittleren Teströhrchen bei 30ºC und 140 Upm für 24 Stunden kultiviert und die Kultur wurde dann zum Animpfen von 50 ml YPD in einer 300 ml-Flasche genutzt bei einer anfänglichen Zellkonzentration, entsprechend A540 nm = 0,3. Die Flaschenkultur wurde bei 30ºC und 140 Upm für 72 Stunden durchgeführt.
(f) Bestimmung der Proliferationsrate und der HSA- Ausbeute
Jede der, wie oben beschrieben, erhaltenen Kultur wurde gesammelt und auf ihre Zellproliferationsrate mit Hilfe der A540 nm und auf ihre HSA-Ausbeute mit dem RPHA- Verfahren untersucht.
(g) Stabilität bei Subkultivierung
Subkulturen wurden siebenmal auf einer YPD-Platte (nicht-selektive Platte) wiederholt und weiterhin wurden jeweils Kolonien als Einzelkolonien von der YPD-Platte isoliert. Zehn Klone, die zufällig ausgewählt wurden, wurden auf eine YPD-Platte (nicht-selektive Platte) und eine YPD-Gen&sub1;&sub0;&sub0;-Platte (G418-selektive Platte) ausgestrichen und es wurde bewertet, ob diese das G418- Gen behielten.
Die Stabilität bei der Subkultivierung wurde weiterhin mit Hilfe der HSA-Ausbeute untersucht. Eine Schlaufe Zellen wurde von jeder der anfänglich selektionierten Platte (Subkultur 0) und der 7. Subkulturplatte ausgewählt und in 3 ml YPD-Medium in einem mittleren Teströhrchen bei 30ºC und 140 Upm für 90 Stunden kultiviert. Jede Kultur wurde gesammelt und auf ihre Zellproliferationsrate (ausdrückt als A540 nm) und auf ihre HSA-Ausbeute (mit Hilfe des RPHA-Verfahrens) untersucht.
(h) Konservierung der integrierten Klone
Eine Schlaufe Zellen wurde von der selektiven Platte gesammelt, in 50 ml YPD-Medium in einer 300 ml-Flasche eingeeimpft und bei 30ºC und 140 Upm über 24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (2.500 Upm, 10 Minuten) und 15% Glycerol-YPD- Medium in einer Konzentration entsprechend A540 nm = 100 suspendiert. Die Suspension wurde in eine 1 ml-Portionen in Röhrchen gegeben und gekühlt bei -80ºC gelagert.

B. ERGEBNISSE

(a) Transformationswirksamkeit
Die Zahl von transformierte Kolonien pro Mikrogramm (ug) Vektor war ca. 500. Dieser Wert war ausreichend, um hoch-produktive HSA-produzierende integrierte Klone heraus zu screenen.
(b) Primäres Screening der hoch-produzierenden HSA- herstellenden integrierten Klone (Kultur in mittleren Teströhrchen)
Die 34 isolierten Klone vom Al (Al-1 bis 34) wurde im mittleren Teströhrchen kultiviert und nach 72 Stunden Kultivieren wurde die Proliferationsrate und die HSA- Ausbeute bestimmt. Zwei Klone, Al-13 und Al-29, zeigten eine HSA-Ausbeute von 60 mg/l und acht Klone zeigten eine HSA-Ausbeute von 40 mg/l. Die zwei Klone mit einer HSA-Ausbeute von 60 mg/l und zwei weitere Klone, die aufgrund ihrer Proliferation ausgewählt wurden, Al-25 und Al-32, wurden einem zweiten Screening unterworfen.
(c) Sekundäres Screening von hoch-produzierenden HSA- herstellenden integrierten Klone (Kultur in Flaschen)
Die obengenannten vier klonalen Stämme wurden in Flaschen kultiviert und nach 24, 48 und 72 Stunden kultiviert und die Proliferationsrate und die HSA- Ausbeute bestimmt.
Nach 72 Stunden Kultivierung zeigte Al-29 eine HSA- Ausbeute von 60 mg/l, Al-13 eine HSA-Ausbeute von 50 mg/l und Al-25 und Al-32 eine HSA-Ausbeute von 40 mg/l
Al-29 war gegenüber den anderen Stämmen in seiner Wachstumsrate unterlegen.
(d) Die Stabilität bei der Subkultivierung
Die Stabilität bei der Subkultivierung wurde nach diesen Subkulturen auf einer nicht-selektiven Platte mit dem Verbleib des G-418-Gens als Index bestimmt. Die Stabilität von Al-25 über 90% während die anderen Klone von 100% aufzeigten. Jeder Klon zeigte keinen Abfall in der HSA-Ausbeute.

[I] PRODUKTION VON HSA-PRODUZIERENDEN MEHRFACHINTEGRIERTEN A12 -STÄMMEN

Die Stämme Al-13 und Al-32, hergestellt durch Einfügen von dem Integrationsvektor, enthaltend die HSA- Transkriptionseinheit zusammengesetzt aus GAP-DH- Promotor/mHSA-Signal/HSA-cDNA/GAP-DH-Terminator in die TRP1-Region des Chromosoms des Stamms AH22 wurden als Wirte verwendet um mehrfach integrierte Al2-Stämme mit einem anderen Integrationsvektor, enthaltend die obengenannte Transkriptionseinheit in die LEU2-Region Ausbeute von 80 mg/l aufzeigte, herausgescreent und als Kandidat für weitere Mehrfachintegration verwendet.

A. MATERIALIEN UND VERFAHREN

(a) Stamm
Die Stämme Al-13 und Al-32, die vom Stamm AH22 durch Inkorporation von pTF418 in die TRP4-Region stammen, wurden verwendet.
(b) Der Integrationsvektor pLFA33 (Fig. 4) wurde verwendet. pLAF33 ist ein Integrationsvektor, enthaltend die HSA-Transkriptionseinheit zusammengesetzt aus GAP-DH-Promotor/mHSA-Signal/HSA-cDNA/GAP-DH-Terminator und hat eine Sequenz homolog zu dem entsprechenden Teil des Wirtshefezell-Chromosoms und des LEU2-Gens als Selektionsmarkergen für die Hefen. LEU2 und HSA werden in der gleichen Richtung transkribiert.
pLFA33 wurde mit KpnI geschnitten, dieses schneidet pLFA33 nur an einer einzigen Stelle in der LEU2-Region und die Konzentration wurde auf 1,5 ug/ul eingestellt. Die Daten der Restiktions-Enzymanalyse für pLFAB3 sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2
(c) Transformation von Al-13-Stamm mit Plasmid pLF-A33
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1, [III] beschrieben, wurde mit der folgenden Ausnahme verwendet:
Wirt: Transformante Al-13
Plasmid: pLF-A33.
Zustand des eingefügten Plasmids: Linearisiert durch Verdau mit KpnI an der einzigartigen KpnI-Stelle im LEU2-Gen von pLF-A33.
Transformationsmedium: Eine Protoplastenpräparation zur Transformation wurde im YPD-Medium versetzt mit 0,7% Hefe-Stickstoffbase, 1,2 M Sorbitol, 3% Feinagar und 2% Glukose suspendiert. Zur Plattenherstellung wurde ein Leucin-freies Medium, enthaltend 0,7% Hefe- Stickstoffbase, 1,2 M Sorbitol, 3% Feinagar und 2% Glukose verwendet.
(d) Gewinnung von integrierten Klonen
Die Kolonien die auf der Regenerationsplatte erschienen, wurden in 36 Kolonien mit einem Zahnstocher gepickt, in sterilisiertem Wasser suspendiert und als einzelne Kolonie auf einer YPD-Platte isoliert. Für jede Kolonie wurde ein Klon als integrierter Klon ausgewählt, mit dem Vektor inkorporiert in die LEU2-Region des Chromosoms (bestätigt durch Southern-Blot).
(e) Kultivierung der integrierten Klone
1) Kultur in mittleren Teströhrchen:
Eine Schlaufe Zellen wurde von einer YNB-Platte (0,7% Hefe-Stickstoffbase, 2% Dextrose, 1,5% Agar) gesammelt und in 3 ml YPD-Medium in einem mittleren Teströhrchen bei 30ºC und 140 Upm für 72 Stunden kultiviert.
2) Kultur in Flaschen
Eine Schlaufe Zellen wurde von der YNB-Platte gesammelt und in 3 ml YPD-Medium in einem mittleren Teströhrchen bei 30ºC und 140 Upm für 24 Stunden kultiviert und anschließend wurde die Kultur an 50 ml YPD-Medium in einem 300 ml-Gefäß mit einer anfänglichen Zellkonzentration, entsprechend A540 nm = 0,2 angeimpft. Die Flaschenkultur wurde bei 30ºC und 140 UPM für 72 Stunden durchgeführt.
(f) Bestimmung der Proliferationsrate und der HSA- Ausbeute
Jede so erhaltene Kultur wurde gesammelt und für die Zellproliferationsrate mit Hilfe der A540 nm und der HSA-Ausbeute mit dem RPHA-Verfahren untersucht.
(g) Stabilität der Subkultivierung
Die Subkultur wurde sechsmal auf eine YPD-Platte (nicht- selektive Platte) wiederholt und anschließend wurden Kolonien jeweils als Einzelkolonie auf einer YPD-Platte isoliert. Zehn Klone wurden zufällig ausgewählt und jeder wurde auf eine YPD-Platte (nicht-selektive Platte), eine PD-Gen&sub1;&sub0;&sub0;-Platte (G418-selektive Platte) und einer YNB-Platte (LEU-selektive Platte) ausgestrichen und es wurde beurteilt, ob das G418-Gen oder LEU2-Gen darin verblieb.
(h) Konservierung der integrierten Klone
Eine Schlaufe Zellen wurde von der selektiven Platte gesammelt und in 3 ml YPD-Medium in einem mittleren Teströhrchen bei 30ºC und 140 Upm für 24 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde verwendet um 50 ml YPD- Medium in einer 300 ml-Flasche anzuimpfen und die Kultivierung wurde durchgeführt bei 30ºC und 140 Upm für weitere 24 Stunden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gehärtet (2.500 Upm, 10 Minuten) und in 15% Glycerol-YPD-Medium suspendiert bei einer Konzentration entsprechend einer A540 nm = 100. Die Suspension wurde in 1,5 ml Portionen in Röhrchen gegeben und gefroren bei -80ºC gelagert.

B. ERGEBNISSE

Al2-Transformanten, die von Al-13 stammen, wurde ein Code der Al2-Y-Serie gegeben und Al2-Transformanten, die von Al-32 stammen, wurde ein Code von Al2-Z gegeben.
(a) Transformationswirksamkeit
Für beide Al-13 und Al-32, die als Wirt verwendet wurden, war die Zahl der transformieren Kolonien pro Mikrogramm (ug) Vektor ca. 30.
(b) Primäres Screening der hoch-produzierenden HSA- herstellenden integrierten Klone (Kultivierung in mittleren Teströhrchen)
Die 30 von Al2-stammenden Klone (Al2-1Y bis 15Y, Al2-12 bis 15Z) und die zwei Al2-Transformanten, die als Wirt verwendet wurden, nämlich Al-13 und Al-32, wurden in mittleren Teströhrchen kultiviert und nach 72 Stunden Kultivieren wurde die Proliferationsrate und die HSA- Ausbeute bestimmt. Während der Wirt Al-13 eine HSA- Ausbeute von nicht weniger als 40 mg/l zeigte, der Wirt Al-32 eine HSA-Ausbeute von 40 mg/l zeigten die fünf Klone der Al2-Y-Serie und die drei Klone der Al2-Z-Serie eine HSA-Ausbeute von weniger als 60 mg/l. Unter diesen war Al2-2Y, Al2-10Y und Al2-11Z offensichtlich in der Lage eine relativ hohe Ausbeute an HSA aufzuzeigen und wurden für ein sekundäres Screenen ausgewählt.
(c) Sekundäres Screening der hoch-produzierenden HSA- herstellenden integrierten Klone (Kultivierung in Flaschen)
Jeder der obigen drei Stämme wurde in eine Flasche kultiviert und nach 24, 48 und 72 Stunden Kultivierung wurde die Proliferationsrate und die HSA-Ausbeute bestimmt.
Während die HSA-Ausbeute nach 72 Stunden Kultivierung 60 mg/l bei dem Wirt Al-13 und 40 mg/l, bei dem Wirt Al-32 war, zeigten alle drei Stämme Al2-2Y, Al2-10Y und Al2-11Z eine HSA-Ausbeute von 80 mg/l nach 72 Stunden Kultivierung.
Die drei Transformanten zeigten keine Veränderung in der Proliferationsrate im vergleich zu den Wirten.
(d) Die Stabilität bei der Subkultivierung
Für jeden der drei Stämme wurde die Stabilität nach Subkultivierung unter Verwendung des Verbleibs des G418- Gens nach sechs Wiederholungen von Subkultivierung auf einer nicht-selektiven Platte als Index untersucht, diese war 100% und die Stabilität der Subkultivierung wurde unter Verwendung der Retention des LEU2-Gens als Index untersucht und diese war ebenfalls 100%.

[III] Herstellung VON HSA-PRODUZIERENDEN MEHRFACH INTEGRIERTEN KLONEN Al24

Der Al2-2Y-Stamm mit dem zweiten Integrationsvektoren, die jeweils die HSA-Transkriptionseinheit enthalten, zusammengesetzt aus GAP-DH-Promotor/mHSA-Signal/HSA- cDNA/GAP-DH-Terminator, inkorporiert in die TRP1-Region und LEU2-Region auf dem Chromosom des A22-Stamms wurden als Wirt verwendet um mehrfach integrierte Klone A124- Stämme mit einem dritten Integrationsvektor, enthalten die obengenannte Transkriptionseinheit weiterhin eingefügt in die HIS4-Region herzustellen. Unter diesen wurde ein Stamm Al24-35, der überlegen in der HSA- Ausbeute war, in seiner Fähigkeit zu proliferieren und in der Stabilität des Markergens als Stamm für die Kultivierung in industriellem Maßstab ausgewählt.

A. MATERIALIEN UND VERFAHREN

(a) Stamm
Der Stamm Al2-2Y, hergestellt von Einfügen von pTF418 und pLFA33 in die TRP1-Region und LEU2-Region des Stammes AH22, wurde verwendet.
(b) Der Integrationsvektor pHRA33 (Fig. 5) wurde verwendet: pHRA33 ist ein Integrationsvektor, enthaltend die HSA-Transkriptionseinheit zusammengesetzt aus GAP-DH-Promotor/mHSA-Signal/HSA-cDNA/GAP-DH-Terminator und hat eine Sequenz homolog zu dem entsprechenden Teil der Hefewirtszell-Chromosomsequenz und als Hefeselektions-Markergen, das HIS4-Gen. HIS4 und HSA werden in der reversen Richtung transkribiert.
Zur Inkorporation wurde pHRA33 mit NheI verdaut, dabei wird pHRA33 an einer einzelnen Stelle in der HIS4-Region geschnitten und die Konzentration wurde 1,0 ug/ul eingestellt. Die Ergebnisse der Analyse von pHRA33 mit den Restiktionsenzymen ist in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3
(c) Transformation von Al2-2Y mit Plasmid pHRA33
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1, [III], beschrieben, wurde verwendet mit folgender Ausnahme:
Wirt: Transformant Al2-2Y
Plasmid: pHRA33
Zustand des eingefügten Plasmids: Linearisiert zur Einführung durch Verdau (Schneiden) der einzigartigen Stelle NheI im HIS4-Gen von pHRA33.
Transformationsmedium: Eine Protoplastpräparation zur Transformation wurde im YPD-Medium versetzt mit 0,7% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 1,2 M Sorbitol, 3% Feinagar und 2% Glukose suspendiert. Zur Plattenherstellung wurde ein Leucin- und Histidin-freies Medium, enthaltend 0,7% Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 1,2 M Sorbitol, 3% Feinagar und 2% Glukose verwendet.
(d) Gewinnung von integrierten Konen
Von den Kolonien, die auf der Regenerationsplatte erschienen, wurden 42 Kolonien jeweils mit einem Zahnstocher gesammelt, in sterilisiertem Wasser suspendiert und als Einzelkolonie auf einer YPD-Platte isoliert. Für jede Kolonie wurde ein Klon als integrierter Klon mit dem Vektor integriert in die HIS4- Region auf dem Chromosom ausgewählt (bestätigt durch Southern-Blot) nachdem bestätigt wurde, dass diese auf einer YNB-w/o-a.a.-Platte (0,7% Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 2% Dextrose, 1,5% Agar) wachsen konnte.
(e) Kultivierung der integrierten Klone
1) Kultur in mittleren Teströhrchen:
Eine Schlaufe Zellen wurde von der YNB-w/o-a.a.- Platte gesammelt und in 3 ml YPD-Medium in einem mittleren Teströhrchen bei 30ºC und 140 Upm für 72 Stunden kultiviert.
2) Kultur in Flaschen:
Eine Schlaufe Zellen wurde von der YNB-w/o-a.a.- Platte gesammelt und in 3 ml YPD-Medium in einem mittleren Teströhrchen bei 30ºC und 140 Upm für 24 Stunden kultiviert und die Kultur wurde verwendet zum Animpfen von 50 ml YPD-Medium oder Glukoseammoniumacetat-Medium in einer 300 ml-Flasche bei einer anfänglichen Zellkonzentration, entsprechend A540 nm = 0,2. Die Flaschenkultur wurde bei 30ºC und 140 Upm für 72 Stunden durchgeführt.
(f) Bestimmung der Proliferationsrate und der HSA- Ausbeute
Jede oben erhaltene Kultur wurde gesammelt und auf ihre Zellproliferationsrate mit Hilfe der A540 nm und auf ihre HSA-Ausbeute mit dem RPHA-Verfahren hin untersucht.
(g) Stabilität bei Subkultivierung
Subkultur auf einer YPD-Platte (nicht-selektive Platte) wurde sechsmal wiederholt, gefolgt vom Isolieren von jeder Kolonie als Einzelkolonie auf einer YPD-Platte. Zehn Klone wurden jeweils ausgewählt und auf einer YPD- Platte (nicht-selektive Platte), YPD-Gen&sub1;&sub0;&sub0;-Platte (G418-selektive Platte), YNB-Platte (LEU-selektive Platte) und YNB-w/o-a.a.- + LEU-Platte (HIS-selektive Platte) zur Wertung, ob das G418-Gen, LEU-Gen und HIS4- Gen erhalten blieben, angeimpft.
Die Stabilität bei der Subkultivierung wurde weiterhin mit Hilfe der HSA-Ausbeute untersucht. Eine Schlaufe Zellen wurde von jeder der anfänglich Selektionsplatte (Subkultur 0) und der 6. Subkulturplatte gesammelt und in 3 ml YPD-Medium in einem mittleren Teströhrchen bei 30ºC und 140 Upm für 90 Stunden kultiviert. Jede Kultur wurde gesammelt und auf Zellproliferationsrate und HSA- Ausbeute hin untersucht.
(h) Konservierung der integrierten Klone
Eine Schlaufe Zellen wurde von der Selektionsplatte gesammelt, in 5 ml YPD-Medium in einem mittleren Teströhrchen eingeimpft und bei 30ºC und 140 Upm für 24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden in einer 300 ml-Flasche, enthaltend 50 ml YPD-Medium transferiert und die Kultivierung wurde bei 30ºC und 140 Upm für weitere 24 Stunden durchgeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt (2.500 Upm, 10 Minuten) und in 15% Glycerol-YPD-Medium bei einer Konzentration entsprechend A540 nm = 100 suspendiert. Die Suspension wurde in eine 1,5 ml-Protionen in Röhrchen verteilt und gefroren bei -80ºC gelagert.

B. ERGEBNISSE

(a) Transformationswirksamkeit
Die Zahl an transformierten Kolonien erhalten pro Mikrogramm (ug) Vektor war ca. 500. Dieser Wert war ausreichend, um hoch-produzierende HSA-produzierende Stämme zu screenen.
(b) Primäres Screening von Al24-Klonen (Kultivierung in mittleren Teströhrchen)
Die 42 isolierten Al-24 Klone und der Wirt-A12-Stamm, nämlich A12-2Y, wurden in einem mittleren Teströhrchen kultiviert und nach 72 Stunden Kultivierung auf Proliferationsrate und HSA-Ausbeute untersucht. Während der Wert A12-2Y eine HSA-Ausbeute von 60 mg/l zeigte, zeigten alle der Al24-Serie eine HSA-Ausbeute von nicht weniger als 60 mg/l in einigen Fällen von nicht weniger als 80 mg/l. Unter diesen wurden ausgewählt Al24-12, Al24-13, Al24-15, Al24-24 und Al24-35, diese zeigten eine relativ hohe HSA-Ausbeute und wurden einem zweiten Screen unterworfen.
(c) Sekundärscreenen der Al24-Klone (Test auf Stabilität bei der Subkultivierung)
Nach 6 Wiederholungen der Subkultivierung auf einer nicht-selektiven Platte, verblieben die TRP-, Leu- und HIS-Gene zu 100% in den Klonen mit Ausnahme von Al24-13, bei dem war die Retention von TRP 90%. Keine Veränderung wurde in der HSA-Produktivität vor und nach Subkultivierung beobachtet. Al24-15 und Al24-35, die eine 100%ige Genretention aufzeigten, zeigte eine hohe HSA-Ausbeute und eine gute Proliferation, diese wurden dann einem dritten Screening (Flaschenkultur) unterworfen. Die zwei Klone wurden gefroren gelagert.
(d) Drittes Screenen von Al24-Klone (Kultur in Flaschen)
Al24-15 und Al24-35 wurden in Flaschen unter Verwendung eines natürlichen Mediums (YPD-Medium) und eines synthetischen Mediums (Glukoseammoniumacetat-Medium) kultiviert und nach 24, 48 und 70 Stunden auf Proliferationsrate und HSA-Ausbeute untersucht.
In dem natürlichen Medium zeigte Al24-35 eine etwas höhere HSA-Ausbeute als der Wert 80 mg/l erzielt mit dem Wirt Al1-2Y. Beide Klone waren bezüglich ihrer Proliferationsfähigkeit im Vergleich zu der Kontrolle gleich.
In dem synthetischen Medium zeigten beide Klone vergleichbare HSA-Ausbeuten (15 mg/l) und auch ein gleiches Verhalten der Proliferationskapazität gegenüber dem Kontrollstamm TMS-33-1h4.
Bezogen auf die obigen Ergebnisse wurde der Al24-35 als Stamm für die Kultur im industriellen Maßstab ausgewählt.
Die Transformante Al24-35 wurde am 25. Juli 1989 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry gemäß Budapestvertrag hinterlegt wie folgt:
Name des Mikroorganismus: S. cerevisiae Al24-35
Hinterlegungsnummer: FERM BP-2527.

Claims

1. Transformierte Hefewirtszelle, worin mindestens zwei verschiedene rekombinante DNA-Plasmide in entsprechende Stellen des Hefewirtszellchromosoms an bestimmten genetischen Loci des Hefechromosoms integriert sind, diese Plasmide enthalten keine Hefe-autonome Replikationssequenz oder einen Replikationsursprung, umfassend die folgenden Elemente die miteinander in 5'- bis 3'-Richtung funktionell verbunden sind:

1) Promotor von der Hefe,

2) Signalsequenz, die Albuminsekretion aus der Wirtszelle ermöglicht,

3) humanes Serum-Albumin-kodierende Region,

4) Transkriptionsterminator, und

5) Sequenz homolog zu einem Teil der Hefewirtszellen chromosomalen Sequenz, die ein Aminosäure- oder Nukleinsäurebasen (oder Vorläufer) Synthesegen ist, ausreichend zur Integration durch homologe Rekombination, so dass das Plasmid in die Hefewirtszelle integriert ist,

wobei diese mindestens zwei Plasmide sich in der Sequenz homolog zu einem Teil der Hefewirt chromosomalen Sequenz verantwortlich für die Integrationsstelle unterscheiden, so dass die Integration an zwei verschiedenen Loci des Hefechromosoms stattfindet.

2. Hefewirtszelle gemäß Anspruch 1, wobei diese Wirtszelle umfasst eine charakteristische Selektionsart aus der Gruppe, bestehend aus Auxotrophie für eine Aminosäure, Auxotrophie für eine Nukleinsäure und Zugänglichkeit gegenüber einem Antibiotikum.

3. Verfahren zur Herstellung einer transformierten Hefewirtszelle gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend (i) Schneiden jedes Plasmids an einer einzigartigen Restriktionsenzymschnittstelle in der Sequenz homolog zu einem Teil der Hefewirts-chromosomalen Sequenz und (ii) sequentielle Integration der geschnittenen Plasmide in die entsprechende Stelle des Hefewirtszellchromosoms.

4. Verfahren zur Herstellung von humanem Serum-Albumin, umfassend das Kultivieren einer transformierten Hefewirtszelle gemäß Anspruch 1, die in der Lage ist humanes Serum-Albumin zu exprimieren, um die Produktion von dem Albumin zu bewirken und gewinnen des so hergestellten Albumins.