JPH0671432B2 - ヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents
ヒト血清アルブミンの製造方法Info
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- JPH0671432B2 JPH0671432B2 JP3081719A JP8171991A JPH0671432B2 JP H0671432 B2 JPH0671432 B2 JP H0671432B2 JP 3081719 A JP3081719 A JP 3081719A JP 8171991 A JP8171991 A JP 8171991A JP H0671432 B2 JPH0671432 B2 JP H0671432B2
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子操作により形質
転換された宿主の培養によるヒト血清アルブミン（以下
ＨＳＡという）の製造方法の改良に関する。
転換された宿主の培養によるヒト血清アルブミン（以下
ＨＳＡという）の製造方法の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＳＡは、血漿の主要な蛋白構成成分で
あり、医薬として、例えば大量出血、ショックや熱傷患
者あるいは低蛋白血症、胎児性赤芽球症等の治療薬とし
て使用されている。
あり、医薬として、例えば大量出血、ショックや熱傷患
者あるいは低蛋白血症、胎児性赤芽球症等の治療薬とし
て使用されている。
【０００３】現在ＨＳＡは、主として採取した血液の分
画からの産物として製造されている。しかし、この製造
法では不経済でありかつ原料の血液の供給が困難であ
る。また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物
質を含んでいるという問題がある。
画からの産物として製造されている。しかし、この製造
法では不経済でありかつ原料の血液の供給が困難であ
る。また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物
質を含んでいるという問題がある。
【０００４】近年組換ＤＮＡ技術の出現によって、多種
多様の有用なポリペプチドの微生物や細胞による生産が
可能となり、ＨＳＡについても遺伝子組換技術による大
量生産の研究開発が活発に行われている。しかし、その
生産収量が低く、いかに高純度で低コストの工業的生産
技術を確立できるかが問題となっている。
多様の有用なポリペプチドの微生物や細胞による生産が
可能となり、ＨＳＡについても遺伝子組換技術による大
量生産の研究開発が活発に行われている。しかし、その
生産収量が低く、いかに高純度で低コストの工業的生産
技術を確立できるかが問題となっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる技術的
背景の下に、特に培養条件の改良によってＨＳＡの生産
量をより増大させることを課題とする。
背景の下に、特に培養条件の改良によってＨＳＡの生産
量をより増大させることを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、遺伝子操作に
より調製されたＨＳＡ産生性宿主を培地で培養するに当
たり、炭素数１０〜２６の高級脂肪酸またはその塩を添
加することを特徴とするＨＳＡの製造方法であり、かく
してＨＳＡ産生量が増大される。
より調製されたＨＳＡ産生性宿主を培地で培養するに当
たり、炭素数１０〜２６の高級脂肪酸またはその塩を添
加することを特徴とするＨＳＡの製造方法であり、かく
してＨＳＡ産生量が増大される。
【０００７】本発明において用いられる遺伝子操作によ
り調製されたＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調
製されたものであれば特に限定されず、既に公知文献記
載のものの他今後開発されるものであっても適宜利用す
ることができる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ
産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌
等）、動物細胞などが挙げられる。特に、本発明におい
ては、宿主として、酵母、就中サッカロマイセス属もし
くはピキア属が使用されることが好ましい。また、栄養
要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。さらにま
た、Ｇ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２株（a, his
4, leu 2, can 1) 等が好適に用いられる。
り調製されたＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調
製されたものであれば特に限定されず、既に公知文献記
載のものの他今後開発されるものであっても適宜利用す
ることができる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ
産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌
等）、動物細胞などが挙げられる。特に、本発明におい
ては、宿主として、酵母、就中サッカロマイセス属もし
くはピキア属が使用されることが好ましい。また、栄養
要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。さらにま
た、Ｇ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２株（a, his
4, leu 2, can 1) 等が好適に用いられる。
【０００８】これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法およ
びその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳ
Ａの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手
法を採用することによって実施される。例えばＨＳＡ産
生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法としては、
例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法
（特開昭６２−２９９８５）、新規なヒト血清アルブミ
ン遺伝子を用いる方法（特開平１−９８４８６）、合成
シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９
１）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開
平２−１６７０９５）、組換えプラスミドを染色体上に
組込む方法（特願平１−１２９９２７）、宿主同士を融
合させる方法（特願平１−１８８１７３）、メタノール
含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プ
ロモーターを用いる方法等が例示される。
びその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳ
Ａの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手
法を採用することによって実施される。例えばＨＳＡ産
生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法としては、
例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法
（特開昭６２−２９９８５）、新規なヒト血清アルブミ
ン遺伝子を用いる方法（特開平１−９８４８６）、合成
シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９
１）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開
平２−１６７０９５）、組換えプラスミドを染色体上に
組込む方法（特願平１−１２９９２７）、宿主同士を融
合させる方法（特願平１−１８８１７３）、メタノール
含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プ
ロモーターを用いる方法等が例示される。
【０００９】このうち、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわ
ち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的に
はＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
のＡＯＸ1 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ1 プロモータ
ー支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラ
スミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４
２９０を参照）。この形質転換体はメタノール培地中で
の増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタノール
含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株
のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、
０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工培
地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５
〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわ
ち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的に
はＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
のＡＯＸ1 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ1 プロモータ
ー支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラ
スミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４
２９０を参照）。この形質転換体はメタノール培地中で
の増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタノール
含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株
のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、
０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工培
地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５
〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
【００１０】また、ＨＳＡ産生性宿主の培養方法（すな
わちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他にフェッドバッチによる方法（特願平１
−２１９５６１）等が例示される。さらにＨＳＡの分離
採取方法としては、上記の各公報に記載された方法の他
に加熱処理によるプロテアーゼの不活化（特願平１−２
３９８７７）、各種クロマト処理による着色抑制方法
（特願平２−１６６０９１）等が例示される。
わちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他にフェッドバッチによる方法（特願平１
−２１９５６１）等が例示される。さらにＨＳＡの分離
採取方法としては、上記の各公報に記載された方法の他
に加熱処理によるプロテアーゼの不活化（特願平１−２
３９８７７）、各種クロマト処理による着色抑制方法
（特願平２−１６６０９１）等が例示される。
【００１１】形質転換宿主の培養に用いられる培地は、
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一
般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然
培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、
合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素
源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養
素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩
としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ
などが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イースト
ナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコー
ス〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社
製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコ
ース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基
性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合
は、メタノール含有培地を用いることができる。この場
合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一
般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然
培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、
合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素
源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養
素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩
としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ
などが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イースト
ナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコー
ス〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社
製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコ
ース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基
性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合
は、メタノール含有培地を用いることができる。この場
合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
【００１２】培養温度は、１５〜４０℃（酵母は２０〜
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。 なお、当該培養に先立って前培養を行うことが好まし
い。この際の培地としては、例えばＹＮＢ液体培地やＹ
ＰＤ液体培地が使用される。前培養の培養条件は次の通
りである。すなわち、培養時間は１０〜１００時間、温
度は酵母では３０℃、細菌では３７℃程度が好ましい。
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。 なお、当該培養に先立って前培養を行うことが好まし
い。この際の培地としては、例えばＹＮＢ液体培地やＹ
ＰＤ液体培地が使用される。前培養の培養条件は次の通
りである。すなわち、培養時間は１０〜１００時間、温
度は酵母では３０℃、細菌では３７℃程度が好ましい。
【００１３】本発明で使用される脂肪酸は、炭素数１０
〜２６のものであり、例えばミリスチン酸、パルミチン
酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ｔ−バクセン酸、
リノール酸、アラキドン酸などの飽和または不飽和脂肪
酸が挙げられる。これらの脂肪酸の塩としては、例え
ば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などのア
ルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または有機アミン塩
が挙げられる。その培地への添加濃度は約０．００５〜
０．２％（ｗ／ｖ）であり、０．０１〜０．２％がより
好ましい。添加量が０．００５以下では所望の効果が得
られず、また０．２％以上では好ましくなく、却って生
産が阻害される場合がある。当該脂肪酸は、一般的には
培地組成中に適量添加して培養が開始されるが、培養の
初期段階で添加してもよい。
〜２６のものであり、例えばミリスチン酸、パルミチン
酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ｔ−バクセン酸、
リノール酸、アラキドン酸などの飽和または不飽和脂肪
酸が挙げられる。これらの脂肪酸の塩としては、例え
ば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などのア
ルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または有機アミン塩
が挙げられる。その培地への添加濃度は約０．００５〜
０．２％（ｗ／ｖ）であり、０．０１〜０．２％がより
好ましい。添加量が０．００５以下では所望の効果が得
られず、また０．２％以上では好ましくなく、却って生
産が阻害される場合がある。当該脂肪酸は、一般的には
培地組成中に適量添加して培養が開始されるが、培養の
初期段階で添加してもよい。
【００１４】かくして培養終了後、ＨＳＡは培養濾液ま
たは菌体、細胞からそれぞれ公知の分離、精製手段によ
り採取される。
たは菌体、細胞からそれぞれ公知の分離、精製手段によ
り採取される。
【００１５】
以下に具体例によって、本発明を説明する。 実施例１ １）使用菌株：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＣ
Ｐ１０１株 特開平２−１０４２９０に述べられている方法により、
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）
ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ１遺伝子領域に、Ａ
ＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニ
ットを持つプラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した
断片を置換して、ＰＣ４１３０が得られている。この株
はＡＯＸ１遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素
源とする培地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−
株）。
Ｐ１０１株 特開平２−１０４２９０に述べられている方法により、
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）
ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ１遺伝子領域に、Ａ
ＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニ
ットを持つプラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した
断片を置換して、ＰＣ４１３０が得られている。この株
はＡＯＸ１遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素
源とする培地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−
株）。
【００１６】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％（寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニー
の有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布し
た２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２
０個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株
はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すな
わち、このプレートではコロニーが生じるということは
メタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が
得られたことを示している。生じたコロニーの内の１つ
を適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％（寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニー
の有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布し
た２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２
０個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株
はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すな
わち、このプレートではコロニーが生じるということは
メタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が
得られたことを示している。生じたコロニーの内の１つ
を適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
【００１７】２）培地 前培養用培地 Bacto-Yeast Nitrogen Base (Difco社) ６．７ｇを水に
溶解し１００mlとした後、除菌濾過した１０×ＹＮＢ、
オートクレーブ滅菌した２０％グルコースおよび滅菌水
を１：１：８（ｖ）に混合して使用した。 本培地用培地 メタノールおよびグリセロールを炭素源とした培地（表
１）に各種脂肪酸を添加し、本培養用培地とした（ｐＨ
６．０）。
溶解し１００mlとした後、除菌濾過した１０×ＹＮＢ、
オートクレーブ滅菌した２０％グルコースおよび滅菌水
を１：１：８（ｖ）に混合して使用した。 本培地用培地 メタノールおよびグリセロールを炭素源とした培地（表
１）に各種脂肪酸を添加し、本培養用培地とした（ｐＨ
６．０）。
【００１８】
【表１】
【００１９】３）培養方法 前培養 ２０％グリセロール凍結保存バイアルより１mlを、１０
０mlのＹＮＢブロースに植菌し、バッフル付き３００ml
容三角フラスコ中で３０℃、２４時間振盪培養した。 本培養 前培養液１００mlを遠心集菌後、１０mlの滅菌水に懸濁
し、本培養液５０ml当たり菌体懸濁液０．５mlを植菌し
た。５０mlの培養液をそれぞれバッフル付き３００ml容
三角フラスコに分注し、３０℃で125rpm下120 時間振盪
培養した。
０mlのＹＮＢブロースに植菌し、バッフル付き３００ml
容三角フラスコ中で３０℃、２４時間振盪培養した。 本培養 前培養液１００mlを遠心集菌後、１０mlの滅菌水に懸濁
し、本培養液５０ml当たり菌体懸濁液０．５mlを植菌し
た。５０mlの培養液をそれぞれバッフル付き３００ml容
三角フラスコに分注し、３０℃で125rpm下120 時間振盪
培養した。
【００２０】各種脂肪酸による実験結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】 上段：ＨＳＡ産生量 下段：菌体量
【００２２】（ＨＳＡ濃度の測定）培養液を採取し、1
5,000ｒｐｍで５分間遠心後、得られた上清を用いて逆
受身ヒツジ赤血球凝集反応法（ＲＰＨＡ）により測定
し、標準ＨＳＡ（Miles 社) との比較によりサンプル中
のＨＳＡ濃度を求めた。 （菌体濃度の測定）培養液を採取し、蒸留水で適当に希
釈したのち分光光度計（島津製、ＵＶ２４０型）を用い
て５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
5,000ｒｐｍで５分間遠心後、得られた上清を用いて逆
受身ヒツジ赤血球凝集反応法（ＲＰＨＡ）により測定
し、標準ＨＳＡ（Miles 社) との比較によりサンプル中
のＨＳＡ濃度を求めた。 （菌体濃度の測定）培養液を採取し、蒸留水で適当に希
釈したのち分光光度計（島津製、ＵＶ２４０型）を用い
て５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００２３】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば培
地に炭素数１０〜２６の高級脂肪酸またはその塩をを添
加して培養することにより、遺伝子操作により得られた
宿主の培養によってＨＳＡの産生量を増大する効果があ
る。
地に炭素数１０〜２６の高級脂肪酸またはその塩をを添
加して培養することにより、遺伝子操作により得られた
宿主の培養によってＨＳＡの産生量を増大する効果があ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 福塚 浩利 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 鷲見 昭典 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 大谷 渡 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 大村 孝男 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 遺伝子操作により調製されたヒト血清ア
ルブミン産生性宿主を炭素数１０〜２６の脂肪酸または
その塩を添加した培地で培養することを特徴とするヒト
血清アルブミンの製造方法。 - 【請求項２】 脂肪酸の培地への添加濃度が０．００５
〜０．２％（ｗ／ｖ）である請求項１のヒト血清アルブ
ミンの製造方法。
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