DE3685985T2

DE3685985T2 - Mutanten von saccharomyces cerevisiae mit stark vermehrter sekretion.

Info

Publication number: DE3685985T2
Application number: DE8686302575T
Authority: DE
Inventors: Margaret Janet Duncan; Robert Andrew Smith
Original assignee: Collaborative Research Inc
Current assignee: Oscient Pharmaceuticals Corp
Priority date: 1985-04-09
Filing date: 1986-04-08
Publication date: 1992-12-17
Anticipated expiration: 2006-04-09
Also published as: EP0201208A1; EP0201208B1; DE3685985D1; US5057416A; ATE78298T1

Description

Hintergrund

Jüngste Entwicklungen in der rekombinanten DNA-Technologie erlauben die Expression von Genen aus höheren Organismen in Bakterien und Hefe, die durch Fermentation in großem Maßstab gezüchtet werden können. Diese Technologie hat zahlreiche Anstrengungen zur Entwicklung kommerziell rentabler Fermentationsprozesse hervorgerufen, bei denen diese Mikroorganismen Proteine wie etwa Enzyme oder Hormone erzeugen, die ansonsten aus tierischem oder menschlichem Gewebe isoliert werden müssen. In vielen Fällen beruht ein großer Teil der Kosten solcher Fermentationsprozesse auf den Schritten, die zur Gewinnung des gewünschten Produktes in ausreichend reinem Zustand erforderlich sind. Üblicherweise müssen die Mikroorganismen zerstört und ihre Inhaltsstoffe mit Denaturierungsmitteln solubilisiert werden, bevor das gewünschte Produkt isoliert und von anderen Zellkomponenten aufgereinigt werden kann. Jeder Verarbeitungsschritt trägt zu den Endkosten des Produkts bei.
Ein Weg zur Vermeidung einer solchen umständlichen Reinigungsprozedur ist es, dafür zu sorgen, daß die Mikroorganismen das gewünschte Produkt während der Fermentation direkt in ihr Wachstumsmedium sekretieren. Auf diese Weise kann man das Produkt sofort, in einer relativ reinen Form, einfach durch Entfernung der Produktionszellen in einem einzigen Zentrifugations- oder Filtrationsschritt erhalten.
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde oft als Mikroorganismus der Wahl zur sekretorischen Erzeugung von Proteinprodukten genannt. Da sie seit Jahrhunderten in der Back- und Brauindustrie verwendet worden ist, kennt man viel über die Kultivierung dieser Spezies im großen Maßstab. Weiterhin ist bekannt, daß sie in der Lage ist, einen erheblichen Anteil des Proteins, das sie erzeugt, zu sekretieren.
Bisherige Versuche zur Verwendung von Saccheromyces cerevisiae für die Erzeugung und Sekretion von Proteinprodukten mit heterologen Genen hatten jedoch unterschiedlichen Erfolg. Die sekretierte Ausbeute an Proteinprodukt war sowohl von dem exprimierten Gen als auch den für seine Expression ausgewählten Promotor- und Signalsequenzen abhängig (Hitzeman, R.A., Leung, D.W., Perry, L.J., Kohr, W.J., Levine, H.L. und Goeddel, D.V. (1983) Science 219, 620-625; Bitter, G.A., Chen, K.K., Banks, A.R. und Lai, P.-H. (1984) Proc.Natl.Acad. Sci. USA 81, 5330-5334; Brake, A.J., Merryweather, J.P., Coit, D.G., Heberlein, U.A., Masiarz, F.R., Mullenbach, G.T., Urdea, M.S., Valenzuela, P. und Barr, P.J. (1984) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81, 4642-4646; Brake, A.J., Cousens, L.S., Urdea, M.S., Valenzuela, P.D.T. (1984) Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. 0 121 884). Obwohl es üblicherweise möglich ist, ausreichend gute Produktionsgrade für ein bestimmtes Protein zu erhalten, kann man oft nur einen geringen Anteil der erzeugten Gesamtmenge tatsächlich frei im Medium finden. Der größte Anteil des Proteins bleibt innerhalb der Zelle gefangen, oft in der intrazellulären Vakuole, die man in dieser Spezies findet. In der Hefe kann man die Sekretion als verzweigten Weg betrachten, wobei einige sekretierte Hefeproteine in die Vakuole "sekretiert" werden und andere durch die Plasmamembran in das Periplasma und darüber hinaus dirigiert werden (Sheckman, R. und Novick, P., in Strathern, J.N., Jones, E.W. und Broach, J.R. (eds.), Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1981, S. 361-398). Offenbar werden einige Proteinprodukte von Fremdgenen in den vakuolären Zweig dieses Weges dirigiert.
Jüngste Studien von Rothstein, J.H. und Stevens, T.H. (Präsentation beim Jahrestreffen der Genetics Society of America, 13. August 1984) und Emr, S. (Präsentation beim Yeast Expression Vectors Symposium, Banbury Center, Cold Spring Harbor Laboratory, 21. bis 24. Juni 1984) haben gezeigt, daß Wirtszellenmutationen isoliert werden können, welche die intrazelluläre Lokalisierung von Hefeproteinen im Sekretionsweg der Hefe beeinflussen können. Sowohl ein natürliches Hefeprotein (Carboxypeptidase Y) als auch eine Fusion von zwei Hefeproteinen (Carboxypeptidase Y und Invertase) wurden durch Wirtszellenmutagenese und Selektion von der Vakuole zum Äußeren der Zelle umdirigiert. Die Nützlichkeit der Verwendung der nach einer dieser Selektionsmethoden zur sekretorischen Erzeugung von fremden Proteinen erzeugten Mutantenstämmen ist jedoch nicht gezeigt worden. Weiterhin wurde in jedem Fall ein starker Selektionsdruck für die extrazelluläre Sekretion eines spezifischen Proteins auf die mutagenisierten Zellen ausgeübt. Diese Methode unterscheidet sich stark von einem quantitativen Musterungstest auf ein nicht-essentielles Genprodukt und hat möglicherweise zu einer starken Verzerrung in der Verteilung von erhaltenen Mutanten geführt. Auch war keine dieser Untersuchungen auf die Erhöhung der Ausbeute von sekretierten Proteinen per se gerichtet, sie waren stattdessen zur Isolierung von Mutationen bestimmt, um die allgemeine Untersuchung der Sekretion in Hefe zu unterstützen.
Eine Gruppe hat über einen Versuch zur Isolierung von Hefemutantenstämmen berichtet, welche das Killertoxin übersekretieren, das mit einigen Hefestämmen assoziiert ist (Bussey, H., Steinmetz, O. und Saville, D. (1983) Current Genetics, 7: 449-456). Diese Gruppe isolierte zwei chromosomale Mutationen in Saccharomyces cerevisiae, die eine Übersekretion des K&sub1;- Killertoxins bewirken. Von diesen Mutationen wurde berichtet, daß sie eine rezessive Mutation im Gen ski5, die anscheinend zur Toxinübersekretion aufgrund eines Defekts in der PMSF- inhibierten Zelloberflächenprotease führte, und in einem nukleären Gen kre 1 sind, die in einem defekten (1-6)-β-D- Glucan-Zellwallrezeptor für Killertoxin resultierte. Es wurde festgestellt, daß beide Mutationen auch Übersekretion von bestimmten anderen homologen Proteinen verursachten.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, mutierte Hefezellen bereitzustellen, die eine gesteigerte Fähigkeit zur Sekretion heterologer Polypeptide, wie etwa Proteine, aufweisen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Musterung von mutierten Hefezellen zu erzeugen, um solche zu bestimmen, die eine gesteigerte Fähigkeit zur Sekretion heterologer Polypeptide, wie etwa Proteine, aufweisen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Erzeugung eines heterologen Polypeptids, wie etwa einem Protein, durch Sekretion aus einer Hefezelle bereitzustellen, die mit einem rekombinanten Plasmid oder einem Teil davon transformiert worden ist, welches das Gen für ein heterologes Polypeptid, wie etwa ein Protein, trägt.
Es ist eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mutantenstämme von Saccharomyces cerevisiae bereitzustellen, die heterologe Polypeptide, wie etwa Proteine, erzeugen und sekretieren.
Es wurde jetzt festgestellt, daß man Mutantenstämme von Hefe erhalten kann, welche die Fähigkeit zur Sekretion heterologer Polypeptide, wie etwa Proteine, mit hoher Effizienz aufweisen. Nach Expression des Proteinprodukts innerhalb der Hefezelle wird das exprimierte Produkt, sofern erforderlich, prozessiert und dann in das Medium der Zellkultur transportiert.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung eines gewünschten Polypeptidprodukts gemäß Anspruch 1 bereitgestellt. Bevorzugte Ausführungsformen dieses ersten Gesichtspunkts werden in den Unteransprüchen 2 bis 10 beschrieben. Weitere Gesichtspunkte und Ausführungsformen der Erfindung werden in den restlichen Ansprüchen 11 bis 29 definiert und beschrieben. Somit kann bei Durchführung der vorliegenden Erfindung ein gewünschtes Polypeptidprodukt, wie etwa ein reifes Protein, in hohen Ausbeuten aus übersekretierenden Hefezellen durch Gewinnung der aus den Hefezellen sekretierten Polypeptidprodukte erhalten werden. Die Hefezellen sollten erhalten werden, indem man einen transformierbarer Hefeausgangsstamm auswählt und veranlaßt, daß dieser Hefestamm einer Mutagenese unterzogen wird und Mutantenzellen gebildet werden. Die Mutantenzellen sollten transformiert werden, um ein heterologes Polypeptid zu sekretieren. Die Mutantenzellen werden dann gemustert, um solche Endproduktzellen auszuwählen, welche das gerade genannte heterologe Polypeptid in mehr als zweifacher Menge sekretieren als die Menge, die von dem auf diese Weise transformierten Ausgangsstamm sekretiert wird. Die Endproduktzellen, die man vor der Kultivierung von dem rekombinanten Plasmid reinigen kann, werden erneut mit einem Gen transformiert, welches das gewünschte Polypeptid-Endprodukt ergibt, oder nicht gereinigt, sondern einfach mit dem Gen für ein anderes Polypeptid transformiert.
Die oben diskutierten Mutantenzellen können vor der Mutagenese oder nach der Mutagenese transformiert werden.
In einer bevorzugten Form ist das Polypeptid Prochymosin, da seine Expression und Sekretion einfach und wirksam in einem Musterungstest bestimmt werden kann, um die übersekretierenden Mutanten zu identifizieren, die aus der Mutagenese resultieren. Saccharomyces cerevisiae ist die bevorzugte transforformierte Hefespezies. Der Hefestamm wird mit DNA-Sequenzen zur Expression und Sekretion versehen, die für das in den Stamm eingeführte Gen besonders geeignet sind. Ein zweiter Transformationsschritt oder eine Kreuzung mit einem anderen transformierten Stamm führt vorzugsweise ein Gen ein, welches in der Lage ist, die Sekretion des gewünschten heterologen Polypeptid-Endprodukts zu bewirken, das vorzugsweise ein reifes Protein ist.
Es werden Hefemutantenstämme bereitgestellt, die übersekretierende Stämme für gewünschte Polypeptid-Endprodukte sind, indem sie eine höhere Kapazität zur Sekretion heterologer Polypeptide oder Proteine, als es oft in Hefestämmen der Fall ist, aufweisen. Überraschenderweise zeigen die Stämme eine Übersekretion für gewünschte Produkte, unabhängig davon, ob die Expressionshöhen der Produkte im allgemeinen gleich wie in den Ursprungsstämmen sind, aus denen die übersekretierenden Stämme stammen.
Es wird eine Musterungsmethode bereitgestellt, durch die ein übersekretierender Hefestamm selektioniert wird. Die Methode umfaßt das Ausstreichen von Hefezellen auf einer festen Nährstoffträgerplatte und die Kultivierung von Einzelkolonien, die mit dem Gen für Prochymosin transformiert worden sind. Die sichtbare Kultur wird vom Träger entfernt und eine Casein-haltige Lösung wird in einem sich verfestigenden Material als Überzug aufgebracht. Die Casein-haltige Lösung ist vorzugsweise Milch und das sich verfestigende Material ist vorzugsweise Agarose. Nach Inkubation notiert man Gerinnselbildung und die Zellen, die solche Gerinnsel erzeugen, werden zur Verwendung als übersekretierende Hefestämme gewonnen.
Eine erfindungsgemäße Musterungsmethode durchläuft vorzugsweise die oben beschriebenen Transformations-, Mutagenese- und Selektionsschritte. Nach Selektion können die übersekretierenden Stämme gereinigt und erneut transformiert werden, oder in manchen Fällen ist das verwendete Produkt, das eine wirksame Musterungsmethode erleichterte, das gewünschte Endprodukt und keine weitere Transformation ist erforderlich.
Spezifische übersekretierende Stämme von Saccharomyces cerevisiae, die sich als besonders wünschenswert zur Gewinnung unterschiedlicher reifer Proteine oder Polypeptide erwiesen haben, umfassen Stämme, die als American Type Culture Collection Hinterlegungsnummern 20750, 20751 und 20752, hinterlegt am 05. April 1985, hinterlegt wurden. Wie in dieser Beschreibung ausgeführt wird, sollen solche Stämme Zellen umfassen, in denen das Prochymosingen durch andere bekannte Gene zur Erzeugung von Polypeptiden und spezifischen reifen Proteinprodukten ersetzt worden ist. Daher kann man gebräuchliche Techniken und Methoden zur weiteren Transformation der hinterlegten Stämme für die Erzeugung jeweils bezeichneter Polypeptide verwenden. Überraschenderweise findet man, daß Stämme, welche ein bestimmtes Polypeptidprodukt in hohen Ausbeuten sekretieren, andere Polypeptidprodukte mit hohen Ausbeuten erzeugen, wenn sie mit den erforderlichen DNA-Segmenten versehen sind.
Es ist ein Merkmal dieser Erfindung, daß die hier beschriebenen Methoden unter Verwendung bekannter Laborausrüstung einfach ausgeführt werden können, um eine hohe Ausbeute an gewünschtem Polypeptid und spezifischen reifen Proteinprodukten aus Hefestämmen, die üblicherweise eine geringere Produktionskapazität haben, zu liefern, da sie weniger als die Mutanten sekretieren, obwohl sie möglicherweise so viel Produkt wie die Mutanten exprimieren. Es ist ein weiteres Merkmal dieser Erfindung, daß besonders wünschenswerte, stark sekretierende Hefestämme erhalten werden und sich bei richtiger Transformation zur Erzeugung einer Vielzahl unterschiedlicher Polypeptidprodukte nützlich erweisen.
Obwohl Prochymosin als Genprodukt zur Anwendung bei der Musterung besonders wünschenswert ist, um eine Identifizierung von übersekretierenden Zellen zu ermöglichen, sind in manchen Fällen Produkte erwünscht, die von Prochymosin verschieden sind. In solchen Fällen können die ausgewählten übersekretierenden Stämme wie bekannt gereinigt werden, indem solche Zellen aus der übersekretierenden Zellpopulation ausgewählt werden, die nicht länger das genetische Material von Prochymosin enthalten. Die ausgewählten, so gereinigten Zellen können dann nach bekannten Transformationsmethoden, wie sie für die anfängliche Transformation verwendet wurden, einschließlich - aber nicht beschränkt auf - die Lithiumchlorid- Methode, wie von Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. und Kimura, A. (1983) J.Bacteriol. 153, 163-168 und die Sphäroplasten- Methode, wie in Methods in Yeast Genetics Laboratory Manual, Sherman, F., Fink, G.R. und Hicks, J.B. (1981) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York oder durch Kreuzung mit anderen transformierten Stämmen weiter transformiert werden.
Eine Abtrennung des gewünschten Endprodukts vom Medium, in oder auf dem die endgültig transformierten übersekretierenden Zellen wachsen, kann nach bekannten Methoden ausgeführt werden. Beispielsweise kann das Kulturmedium, wenn es sich um Flüssigkeiten handelt, von den Zellen physikalisch abgetrennt und durch Filtration, Säulentrennung oder dgl., abhängig vom gewünschten Endprodukt, behandelt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Die obigen und andere Merkmale der Erfindung werden einem Fachmann aus der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen verdeutlicht, worin:
Tabelle 1 eine Figur enthält, welche die Struktur des rekombinanten DNA-Plasmids pCGS5l4 einschließlich der relativen Positionen und der Quellen (bakterielle Plasmid-DNA, Hefe-DNA und komplementäre DNA) der verschiedenen, dieses Plasmid bildenden Segmente zeigt und auch die Nukleotidsequenz von einigen Teilen dieser Segmente ist gezeigt;
Tabelle 2 listet die Allelzahlen auf und zeigt das Komplementationsverhalten von 19 rezessiven übersekretierenden (ssc) Mutationen.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die folgenden, hier verwendeten Bezeichnungen haben ihre in der Technik bekannte Bedeutung, die wie folgt definiert ist:
Mutagenese - wie hier verwendet - bedeutet Behandlung einer Hefezelle mit entweder einem bekannten Mutagen, wie etwa einer chemischen Substanz oder Strahlung, oder Einführung von neuen DNA-Materialien in eine Hefezelle, wobei dadurch eine genetische Veränderung induziert wird.
Mutantenhefezelle - wie hier verwendet - bedeutet die Hefezelle, die das Ergebnis einer genetischen Veränderung ist.
Sekretion - wie hier verwendet - bedeutet den Transport eines Polypeptids oder Proteinprodukts nur durch die Plasmamembran oder zusätzlich durch den Zellwall der Hefe in das umgebende Medium.
Sekretionssignalsequenz - wie hier verwendet - bedeutet eine Sequenz von hydrophoben Aminosäureresten, die an den Aminoterminus eines Polypeptids angefügt sind und für das Prozessieren des Vorläuferpolypeptids und die Translokation des reifen Proteins in den Sekretionsweg der Zelle essentiell sind. Andererseits kann Sekretionssignalsequenz die DNA-Sequenz bezeichnen, welche für diese Sequenz von Aminosäuren kodiert. Diese DNA-Sequenz ist zwischen dem Translationsinitiationscodon (ATG) und der für die reife Form des Polypeptids kodierenden Region angeordnet.
Prozessieren - wie hier verwendet - bedeutet (a) den Verlust oder die proteolytische Spaltung der Signalsequenz aus dem Polypeptid oder Protein, um das Polypeptid oder Protein in reifer Form zu erzeugen, und/oder (b) das Anfügen von Oligosaccharid an die Glykosylierungs-Erkennungssequenzen, die inhärent anwesend sind oder durch angefügte Glykosylierungssequenzen im reifen Protein bereitgestellt werden können.
Reifes Protein - wie hier verwendet - bedeutet diejenige Form des Proteinprodukts, die tatsächlich von der Zelle sekretiert wird.
Vorläufer (eines Polypeptids oder Proteins) - wie hier verwendet - bedeutet ein Polypeptid oder Protein, wie es innerhalb einer Zelle synthetisiert wird, wobei eine Signalsequenz an die reife Form des Proteins angefügt ist. Das nachfolgende Prozessieren des Vorläufers resultiert in seinem reifen Polypeptid oder Protein.
Reinigen bedeutet ein Verfahren, das alle Kopien eines Plasmids aus einem Hefestamm eliminiert.
Transformierbarer Hefestamm bedeutet Hefezellen, in die fremde DNA eingeführt werden kann.
Das Ausmaß der Sekretion eines Proteins wird u.a. durch seinen Wirtsstamm und die spezifischen DNA-Sequenzen, die das Protein exprimieren, reguliert. Nach Mutagenese von Hefezellen, die normalerweise sehr geringe Mengen des im Inneren erzeugten Proteinprodukts sekretieren, kann man Mutantenstämme mit einer Sekretionseffizienz auswählen, die mindestens zweifach höher als die des nicht-mutierten Stammes ist und solche Mutantenstämme werden als "übersekretierend" bezeichnet.
Die Verwendung von "übersekretierenden" Stämmen zur sekretorischen Erzeugung von Genprodukten aus Hefe ist in solchen Fällen vorteilhaft, in denen Polypeptide, deren Vorläufer Signalsequenzen enthalten, erzeugt, aber manchmal ineffizient sekretiert werden, wenn die Gene für diese Proteine in Hefe exprimiert werden. Beispiele solcher Proteine umfassen - aber sind nicht beschränkt auf - Prochymosin, Rinderwachstumshormon (BGH), Proinsulin, Prourokinase (PUK), alpha-1-Antitrypsin, Gewebeplasminogenaktivator (tPA), Interleukin-2 (IL-2) und humanes Wachstumshormon (HGH).
Bei Hefestämmen, die durch die hier beschriebenen genetischen Verfahren hergestellt worden sind, handelt es sich beispielsweise um Kulturen, die jetzt bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland hinterlegt worden sind. Diese Kulturen haben die Hinterlegungsnummer 20750, Stammbezeichnung CGY1285, Hinterlegungsnummer 20751, Stammbezeichnung CGY1083, Hinterlegungsnummer 20752, Stammbezeichnung CGY1291 und Hinterlegungsnummer 20753, Stammbezeichnung CGY998 und wurden von Collaborative Research Inc. am 05. April 1985 hinterlegt.
Wie im folgenden ausführlicher beschrieben ist, können die Stämme, die in der vorliegenden Erfindung mutagenisiert werden sollen, beliebige Hefestämme sein, die mit DNA transformiert werden können und die geeigneten genetischen Marker, die eine Selektion von Transformanten ermöglichen, aufweisen, oder transformiert werden können, um sie aufzuweisen. Zur Erkennung als solcher enthält ein übersekretierender Stamm DNA-Sequenzen, die zur Expression und Sekretion des gewünschten Genprodukts erforderlich sind, oder er kann transformiert werden, um sie zu enthalten. Nach Mutagenese des Hefestamms ist eine Musterungsmethode erforderlich, so daß solche Stämme, die neu als "übersekretierende" Stämme gefunden werden, von solchen Stämmen isoliert werden können, die es nicht sind.
Die Mutagenese kann - wie in der Technik bekannt - durch Behandlung mit einem beliebigen bekannten chemischen Mutagen, einschließlich Ethylmethansulfonat (EMS) und Nitrosoguanidin, durchgeführt werden. Der Stamm oder eine gemischte Gruppe von Stämmen kann auch durch Behandlung mit DNA-schädigender Strahlung, wie etwa ultraviolettem Licht, Röntgenstrahlen oder Teilchenstrahlen mutagenisiert werden. Eine Mutagenese kann auch durch Einführung von neuen DNA-Materialien eintreten. Solche DNA-Materialien könnten Fragmente von Hefe-DNA umfassen, die sich auf Plasmidvektoren mit hoher Kopienzahl befinden. Bei der Variation in diesen DNA-Veränderungen kann es sich um neue Kombinationen von Promotor- und/oder Sekretionssignalsequenzen mit einem gewünschten Gen handeln, oder es kann sich um neu erzeugte Verbindungen zwischen Segmenten von DNA, wie etwa solche, die durch Spaltung mit einer bekannten Restriktionsnuklease und anschließender limitierter Spaltung mit einer Exonuklease und Behandlung mit einer DNA- Ligase erzeugt werden, handeln. Andererseits kann es sich bei diesen Variationen um neu eingeführte Änderungen in der DNA- Sequenz der Promotor/Sekretionssignalsequenz/Gensequenz handeln, die durch eine beliebige in vitro Mutagenesetechnik eingeführt worden sind (Shortle, D., Dimaio, D. und Nathans, D. (1981) Ann.Rev.Genetics 15, 265-294). Eine große Anzahl von neu erzeugten Veränderungen in der Hefe-DNA kann in dem zu mutagenisierenden Hefestamm durch ein einziges Transformationsexperiment eingeführt werden.
Nachdem man einmal eine wirksame Mutagenesebehandlung zum Erhalten einer Sammlung unterschiedlicher Mutantenzellen eingesetzt hat, wird eine Musterungsmethode durchgeführt, um die gewünschten Mutantenzellen zu identifizieren und isolieren. Die Musterungsmethode gemäß vorliegender Erfindung beruht auf dem Vorhandensein sowohl eines fremden, zu exprimierenden Gens als auch der zu dessen Expression und Sekretion erforderlichen DNA-Sequenzen. Das Genprodukt sollte ein Material sein, das in einem Test nachgewiesen werden kann. Gemäß vorliegender Erfindung ist das Gen vorzugsweise Prochymosin zusammen mit DNA-Sequenzen, die seine Expression und Sekretion aus Hefe erlauben. solche DNA-Sequenzen umfassen eine Promotorsequenz, wie etwa die 5'-flankierende Region aus dem Hefetriosephosphat-Isomerasegen (TPI) oder eine ähnliche Region aus einem anderen Hefegen, wie etwa Phosphoglyceratkinase (PGK), Galactokinase (GAL1), Alkoholdehydrogenase (ADH1) oder Invertase (SUC2). Es wird auch eine Sekretionsignalsequenz (auch als "Prä"-Sequenz bekannt) bereitgestellt, welche die kodierende Region für den aminoterminalen Teil eines sekretierten Hefegens, wie etwa Invertase, saure Phosphatase oder Paarungsfaktor Alpha ist. Eine solche Sekretionsignalsequenz könnte auch eine ähnlich funktionierende Sequenz aus einem Nicht-Hefegen sein, wie etwa die "Prä"-Sequenz von Prochymosin, eine synthetische "Prä"-Sequenz oder eine ,"Prä"- Sequenz, die durch Kombination von Teilen aus zwei oder mehreren bekannten "Prä"-Sequenzen erzeugt wird.
Nach Mutagenese des Prochymosin erzeugenden Hefestammes werden die mutagenisierten Hefezellen auf Agarplatten kultiviert. Die Platten können mit einem beliebigen Medium hergestellt werden, das normalerweise zur Kultivierung von Hefe verwendet wird. Vorzugsweise wird ein Medium wie etwa "SD"-Medium verwendet, das in Methods in Yeast Genetics Laboratory Manual, Sherman, F., Fink, G.R. und Hicks, J.B. (1981) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York beschrieben ist, welches eine begrenzte Fähigkeit zur Regulation der Azidität einer wachsenden Hefekultur aufweist, so daß ein Abfall des pH nahe den Hefekolonien im späteren Teil der Kultivierungsperiode ermöglicht wird. Dies erleichtert die Umwandlung von Prochymosin (dem tatsächlich sekretierten Produkt des Stammes) zu Chymosin (die aktive Form des Enzyms) und beseitigt die Erfordernis eines Aktivierungsschrittes.
Die Zellen werden vorzugsweise auf den Nährstoffagarplatten mit einer Dichte ausgestrichen, die das Wachstum von 1 bis 10 Kolonien pro cm² zur Folge hat, in manchen Fällen ist es aber günstig, größere Dichten zu verwenden. Nach Inokulation werden die Platten bei 30ºC von 48 bis 96 Stunden inkubiert, obwohl niedrigere Temperaturen wie 15ºC oder höhere Temperaturen wie 37ºC in manchen Fällen verwendet werden können. Die letzteren Temperaturen werden verwendet, wenn es gewünscht wird, Mutationen zu isolieren oder zu testen, die für hohe oder tiefe Temperatur sensitiv sind. Eine Änderung der Temperatur weg vom Optimum bei 30ºC wird jedoch üblicherweise die zur Kultivierung erforderliche Zeit vergrößern.
Die Hefezellen werden von den Agarmediumplatten durch Auflegen steriler Scheiben, die aus absorbierendem Material, wie etwa Filterpapier, bestehen, auf die Oberfläche des Agarmediums, auf dem die Zellen wachsen, entfernt. Der Prozeß wird wiederholt, bis alle sichtbaren Zellen entfernt sind. Die erste Scheibe von jeder Platte wird vorzugsweise in einer sterilen Petrischale zur späteren Gewinnung der Mutantenzellen aufbewahrt.
An diesem Punkt ist es wünschenswert, einen Test auf die Menge an aktivem Chyinosin durchzuführen, das in Bereichen der Nährstoffagarplatte vorliegt, die zuvor gerade unter den Hefekolonien lagen. In der üblichen Praxis wird Chymosinaktivität durch Einführung einer Probe des zu testenden Materials in ein spezifisches Volumen von Milch und Notieren der Zeit, die für die Coagulation oder Gerinnselbildung dieser Milch erforderlich ist, getestet. Im Falle einer festen Oberfläche, auf der kleine Bereiche getestet werden sollen, wird vorzugsweise Milch direkt auf diese Oberfläche aufgebracht. Das Milchvolumen, das auf jeden kleinen Bereich einwirkt, kann wirksam durch Vermischen der Milch mit einem Mittel, wie etwa geschmolzener Agarose, begrenzt werden, welches kurz nach dem Aufbringen auf die Oberfläche eine Verfestigung verursacht. Geronnene Milch kann als opake Bereiche in dem normalerweise durchsichtigen Milch/Agarosegemisch sichtbar gemacht werden.
Somit wird ein Milch-Agarose-Überzug, der geschmolzene Agarose, Magermilchpulver, CaCl&sub2;, NaPO&sub4; und Pepstatin enthält, auf die Oberfläche jeder Platte gegossen und fest werden gelassen. Pepstatin, ein Proteaseinhibitor, ist im Überzugsgemisch enthalten, um eine Musterung auf Mutanten mit verschiedenen Hintergrundstämmen und DNA-Konstruktionen zu ermöglichen, die unterschiedliche Sekretionsaktivitäten vor der Mutagenese aufweisen. Ohne Pepstatin bilden sich schnell intensive, opake Bereiche über Kolonien, die nur 0,1 Einheiten Gerinnungsaktivität pro Gramm Naßgewicht der Zellen sekretieren. Mit Pepstatin wird die Chymosinaktivität teilweise gehemmt und die opaken Bereiche, die sich über nicht mutierten Kolonien bilden, sind viel weniger intensiv und benötigen mehrere Stunden zu ihrer Bildung, wodurch eine Identifizierung von Mutantenkolonien ermöglicht wird. Die Menge an Pepstatin, die von 0 bis 100 mg/ml variieren kann, hängt von der Höhe des Hintergrunds an sekretierter Aktivität, die gehemmt werden soll, und der gewünschten Höhe an sekretierter Aktivität, die in den Mutanten gefunden werden soll, ab. Die Konzentration von Magermilchpulver kann auch von 2 % bis 20 % Gew./Vol. oder mehr, abhängig von der gewünschten Intensität des opaken Bereiches und der Zeit zur Bildung eines solchen Bereiches variieren.
Jede der einen Milch-Agarose-Überzug enthaltenden Platten wird vorzugsweise bei Raumtemperatur (25ºC) inkubiert, der Bereich der Inkubationstemperatur kann jedoch von 0ºC bis 40ºC reichen. Sobald die ersten opaken Bereiche von geronnener Milch beobachtet werden, notiert man ihre Positionen, da diese wahrscheinlich solchen Kolonien entsprechen, die das meiste Chymosin sekretiert haben. Der Inkubationsschritt wird fortgesetzt, bis sich mindestens schwache Gerinnsel über den Bereichen der Platte gebildet haben, welche dem Großteil der Kolonien entsprechen. Dieser Hintergrund von schwachen Gerinnseln ermöglicht es einem, die Filterpapierreplikas hinsichtlich der Nährstoffagarplatten zu orientieren, wodurch die Identifizierung von Kolonien auf den Filterpapierreplikas erleichtert wird, die Gerinnseln entsprechen, die sich schnell gebildet haben oder die besonders groß oder intensiv waren.
Nachdem Zellen aus Kolonien, die intensiven oder sich schnell bildenden Gerinnseln entsprechen, auf Nährstoffagarplatten ausgestrichen und inkubiert werden, bis sich Einzelkolonien gebildet haben, testet man mehrere unabhängige Kolonien von jedem vermutlichen Mutantenstamm auf sekretierte Chymosinaktivität. Dies erfolgt auf verschiedene Arten, es ist jedoch bevorzugt, ein schnelles Verfahren zur verwenden, das es einem ermöglicht, eine große Anzahl von Stämmen in einer relativ kurzen Zeitdauer zu testen. Eine Methode besteht darin, Zellen aus einer isolierten Kolonie zu verwenden, um einen Punkt auf einer Nährstoffagarplatte zu inokulieren und diese Platte zu inkubieren, bis ein dichter Punkt einer Hefekultur sichtbar ist. Zellen von diesem Punkt werden dann in Puffer suspendiert und auf Eis inkubiert. Eine Probe dieser Suspension wird dann zu einem spezifischen Volumen von rehydratisiertem Magermilchpulver gegeben und unter Schütteln bei 30ºC inkubiert, wobei die zur Koagulation der Milch erforderliche Zeit notiert wird. Die sekretierte Aktivität eines Stammes wird berechnet, indem eine Konstante durch das Produkt der zur Koagulation erforderlichen Zeit und der Anzahl der verwendeten Zellen dividiert wird.
Diese Messung wird vorzugsweise mit mindestens drei Kolonien aus jedem vermutlichen Mutantenstamm durchgeführt und die Ergebnisse gemittelt, um eine genaue Bestimmung der sekretierten Aktivität dieses Stammes zu erhalten. Normalerweise wird ein willkürlicher Grenzwert definiert, wobei ein Stamm mit einer darüberliegenden Aktivität als einen übersekretierenden Phänotyp besitzend angesehen werden kann. Zum Zwecke dieser Erfindung wird dieser Grenzwert als die zweifache sekretierte Aktivität des nicht-mutagenisierten Ausgangsstammes definiert.
Nachdem eine Anzahl von übersekretierenden Stämmen identifiziert worden ist, werden sie üblicherweise einer Reihe genetischer Analysen unterzogen, um den Typ der aufgetretenen Mutation zu bestimmen. Man kann Standardtechniken der Hefegenetik und den oben beschriebenen quantitativen Test verwenden, um zu bestimmen, ob der übersekretierende Phänotyp eines bestimmten Stammes das Ergebnis einer einzelnen Mutation ist, ob diese Mutation dominant oder rezessiv ist, wo die chromosomale Lokalisierung unterschiedlicher Mutationen liegt und ob verschiedene Paare rezessiver Mutationen einander komplementieren oder nicht. Es ist auch möglich, übersekretierende Stämme mit nicht-mutagenisierten Stämmen zu kreuzen und die resultierenden diploiden Stämme zu sporulieren, um übersekretierende Stämme zu erhalten, die nicht eine Anzahl uncharakterisierter Mutationen enthalten, die das Zellwachstum beeinflussen können (d.h. die übersekretierenden Mutationen werden in einen unterschiedlichen genetischen Hintergrund gebracht). Weiterhin ist es auch möglich, übersekretierende Stämme, die Mutationen in unterschiedlichen Komplementationsgruppen enthalten, miteinander zu kreuzen und die resultierenden Diploide zu sporulieren, um Mehrfachmutantenstämme zu isolieren, die mehr als eine Übersekretionsmutation enthalten. Oft sekretieren solche Mehrfachmutantenstämme Prochymosin oder andere heterologe Proteine sogar noch effizienter als Einfachmutantenstämme. Es ist auch möglich, übersekretierende Stämme mit zusätzlichen rekombinanten Sequenzen zu transformieren, die andere Promotor/Signalsequenz/Gen-Kombinationen enthalten, entweder nachdem das darin befindliche Plasmid entfernt worden ist oder zusätzlich zu diesem. Ein übersekretierender Stamm, der durch diese Methode isoliert worden ist, kann auch als Ausgangsstamm für weitere Runden von Mutagenese und Musterung, wie hier beschrieben, verwendet werden.

Beispiel 1:

In einem ersten erfindungsgemäßen Beispiel wird der Hefestamm CGY998, der bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland am 05. April 1985 hinterlegt und durch die Hinterlegungsnummer 20753 identifiziert worden ist, als Ausgangsstamm verwendet. CGY998 ist der Ausgangsstamm CGY339 (Kreuzungstyp alpha, his4-29, ura3-52, pep4-3), der das Plasmid pCGS514 enthält, das in Tabelle 1 gezeigt ist. Dieses Plasmid wurde aus dem Hefe/E.coli- Shuttlevektor pCGS40 erhalten, der bei Goff, C.G., Moir, D.T., Kohno, T., Gravius, T.C., Smith, R.A., Yamasaki, E. und Taunton-Rigby, A. (1984) Gene 27, 35-46 beschrieben worden ist. pCGS40 stammte wiederum vom wohlbekannten Bakterienplasmid pBR322 und enthält das Gen für die Ampicillinresistenz (Amp ) und den Ursprung der Replikation (ori) aus diesem Plasmid, so daß es in E.coli propagiert werden kann. Die Propagierung in Hefe wird durch den Einbau des Hefe URA3 Gens als selektierbarer Marker und einem Ursprung der Replikation aus dem Hefe 2 Mikron-Plasmid (Broach, J.R. und Hicks, J.B. (1980) Cell 21, 501-508) sichergestellt. In pCGS514 wurde der Bereich von pBR322 DNA zwischen den Spaltstellen für die Restriktionsendonukleasen EcoR1 und Sal1 durch eine DNA mit etwa 2100 Basenpaaren ersetzt, welche in Reihenfolge die folgenden Segmente von DNA enthält: etwa 850 Basenpaare aus der 5'-flankierenden Region des Hefe-Triosephosphatisomerasegens (pTPI), wie von Alber, T. und Kawasaki, G. (1982) J.Mol.Appl.Genet. 1, 432-451 beschrieben, welche die RNA- Transkription von benachbarten Sequenzen fördern; ein 15 Basenpaare langer synthetischer DNA-Adaptor; 79 Basenpaare aus dem Hefe SUC2 Gen (Taussig, R. und Carlson, M. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1943-1954), die zusammen mit dem Adaptor für den aminoterminalen Bereich von Invertase einschließlich seiner Sekretionssignalsequenz kodieren und die gesamte komplementäre DNA (cDNA)-Sequenz für Chyinosin, einschließlich eines zusätzlichen aminoterminalen Methioninrestes (Moir, D.T., Mao, J.-I., Schumm, J.W., Vovis, G.F., Alford, B.L. und Taunton-Rigby, A. (1982) Gene 19, 127-138). Hefestämme wie CGY998, die mit diesem Plasmid transformiert worden sind, exprimieren typischerweise etwa 0,2 % ihres Zellproteins als Prochymosin. Bei solchen nicht-mutierten Hefestämmen werden jedoch nur 1 bis 2 % dieses Prochymosins (0,002 bis 0,004 % des Zellproteins) in das Medium sekretiert.
Bei dem in diesem Beispiel verwendeten Musterungstest wird die Tatsache ausgenützt, daß Prochymosin vom Hefestamm CGY998 in diesem geringen Ausmaß exprimiert und sekretiert wird und daß die Aktivität dieses Prochymosins durch Aufbringen eines Milch/Agarose-Überzugs auf Nährstoffagarplatten, die zur Kultivierung von Kolonien solcher Zellen verwendet worden sind, getestet werden kann. Da dieser Test ziemlich quantitativ ist, kann man Zellen identifizieren, die mehr Chymosin-Aktivität gegenüber einem Hintergrund von Zellen sekretieren, die bereits etwas sekretieren.

1. Mutagenese

Zellen aus dem Stamm CGY998 wurden mit Ethylmethansulfonat gemäß dem Verfahren von Sherman et al. (1981) supra mutagenisiert. Aliquots von mutagenisierten Zellen wurden bei -70ºC in 40 % (v/v) Glycerin eingefroren und jeweils einzeln aufgetaut, wenn sie für Musterungsexperimente über eine Dauer von etwa 30 Tagen benötigt wurden.

2. Musterung von mutagenisierten Zellen

Mutagenisierte Zellen wurden auf 9 cm Nährstoffagarplatten, die jeweils etwa 25 ml SD-Medium, wie von Sherman et al. (1981) supra beschrieben, enthielten, mit einer Dichte ausgestrichen, die empirisch bestimmt wurde, so daß etwa 100 Kolonien pro Platte erhalten wurden. Nach dreitägiger Kultivierung bei 30ºC wurden Zellkolonien von der Oberfläche der Platten durch Blotten mit sterilen 9 cm Whatman Nr. 1 Filterpapierscheiben entfernt. Ein Filterpapierreplika von jeder Platte wurde zur späteren Gewinnung von Mutantenzellen aufbewahrt. 8 ml eines Gemisches von Wasser, geschmolzener Agarose (0,25 % w/v), Magermilchpulver (5 % w/v), CaCl&sub2; (5 mmol/l), NaPO&sub4; (50 mmol/l, pH 5,8) und Pepstatin (20 mg/ml) wurden dann über die Oberfläche der Platten gegossen und fest werden gelassen. Während einer Inkubationsperiode von 4 Stunden bei Raumtemperatur wurden opake Bereiche von geronnener Milch in diesem Überzugsgemisch beobachtet, die Bereichen auf der Platte entsprachen, welche sekretiertes Chymosin aus den Hefekolonien absorbiert hatten. Gerinnsel, die besonders intensiv waren oder die sich besonders schnell gebildet hatten, wurden notiert und die entsprechenden Hefekolonien wurden von den Filterpapierreplikas gewonnen. Diese Kolonien wurden dann einem exakteren quantitativen Test auf sekretierte Chymosinaktivität unterzogen und solche mit sekretierten Aktivitäten, die erheblich höher als diejenigen des Ausgangsstammes waren, wurden als vermutliche übersekretierende Mutanten aufbewahrt. Insgesamt wurden 120.000 mutagenisierte Kolonien gemustert und 39 Mutantenstämme wurden als übersekretierende Stämme gefunden.

3. Analyse von Mutantenstämmen

a. Sekretierte Aktivität

Die sekretierten Aktivitäten von Mutantenstämmen wurden bestimmt, indem ein dichter Punkt von Zellen auf einer SD-Nährstoffagarplatte bei 30ºC 3 Tage lang kultiviert wurde. Zellen von etwa 1 cm² eines solchen Punktes wurden von der Platte abgeschabt und in 0,4 ml 50 mmol/l NaPO&sub4;-Puffer (pH 5,8) bei 0ºC für 1 Stunde resuspendiert. 0,1 ml dieser Suspension wurden dann zu 1 ml rehydratisiertem Magermilchpulver gegeben und unter Schütteln bei 30ºC inkubiert, wobei die zur Koagulation der Milch erforderliche Zeit notiert wurde. Die sekretierte Aktivität eines Stammes wurde durch die folgende Formel berechnet:
wobei T = Koagulationsdauer in Minuten, K = Dichte einer 1:100-Verdünnung der Zellsuspension, wie in einem Klett Colorimeter (0,6 cm Weglänge, Grünfilter #54) bestimmt wurde und SA = sekretierte Aktivität, ausgedrückt als Einheiten Chymosinaktivität pro Gramm Naßgewicht von Zellen (u/g). Eine Einheit Chymosinaktivität ist als diejenige Menge an Aktivität definiert, die zur Coagulation von 10 ml Milch in 100 Sekunden erforderlich ist. Diese Formel setzt voraus, daß 1 l Zellsuspension mit einer Dichte von 50, wie in einem Klett Colorimeter bestimmt, etwa 1 g Naßgewicht an Zellen enthält.
Im allgemeinen wurde diese Messung mit 3 oder 4 unabhängigen Kolonien eines vermuteten Mutantenstammes durchgeführt und die erhaltenen Werte wurden gemittelt. Ein Stamm wurde als übersekretierend klassifiziert, wenn seine mittlere sekretierte Aktivität (SA) 0,50 u/g oder mehr war. (CGY998 ergibt typischerweise eine sekretierte Aktivität von zwischen 0,15 u/g und 0,25 u/g in diesem Test). Die höchste sekretierte Aktivität, die für einen frisch isolierten Mutantenstamm in diesem Test beobachtet wurde, war 1,5 u/g. Die meisten Mutantenstämme hatten sekretierte Aktivitäten zwischen 0,6 und 0,9 u/g.

b. Dominanz/Rezessivität

Die übersekretierenden Mutationen in Stämmen, die das obige Kriterium erfüllen, wurden in Dominanz oder Rezessivität klassifiziert, indem sie mit einem nicht-mutierten Stamm CGY265 (a, ura3-52, leu1) gekreuzt und die sekretierten Aktivitäten der resultierenden Diploide, die das Plasmid pCGS514 enthielten, getestet wurden. 14 der 39 getesteten Stämme bildeten Diploide mit sekretierten Aktivitäten von weniger als 0,25 u/g und wurden als rezessive Mutationen enthaltend klassifiziert. Die restlichen Stämme bildeten alle Diploide mit sekretierten Aktivitäten zwischen 0,25 u/g und der sekretierten Aktivität des Mutanten-Elternstamms und wurden als semidominant klassifiziert. Es wurden keine diploiden Stämme beobachtet, die höhere sekretierten Aktivitäten als ihr übersekretierender mutierter Elternstamm enthielten.

c. Komplementierung von rezessiven Mutationen.

Rezessive Mutationen wurden in Komplementationsgruppen klassifiziert, indem übersekretierende Mutantenstämme mit übersekretierenden Stämmen des entgegengesetzten Paarungstyps gekreuzt wurden. (Diese waren durch Sporulation der im obigen Schritt b. gebildeten Diploide erhalten worden). Die übersekretierenden (ssc) Mutationen in zwei Stämmen wurden als komplementierend angesehen, wenn der resultierende diploide Stamm eine sekretierte Aktivität von weniger als 0,50 u/g hatte. Paare von Mutationen, die keine Komplementation zeigen, betreffen vermutlich dasselbe Gen und können in eine Gruppe eingeordnet werden. Auf diese Weise haben wir 9 rezessive übersekretierende Mutationen in 3 Komplementationsgruppen (ssc1, ssc2 und ssc3 - siehe Tabelle 2) klassifiziert. Einzelne Allele von Mutationen in jeder Gruppe wurden den Bezeichnungen ssc1-1, ssc1-2 etc. zugeordnet. 5 weitere Mutationen fallen in eine vierte Klasse, die durch alle Mutationen komplementiert wurde, die in Stämmen des entgegengesetzten Paarungstyps verfügbar waren und denen die Bezeichnung sscX zugeordnet wurde. Diese vierte Klasse kann tatsächlich mehr als eine Komplementationsgruppe darstellen und Mutationen in mehr als einem Gen enthalten.

d. Transfer von ssc Mutationen weg vom mutagenisierten Hintergrund.

Um isolierte ssc Mutationen von sonstigen Mutationen abzutrennen, die möglicherweise während der Mutagenese eingeführt worden waren, wurden frisch isolierte Mutantenstämme mit nicht-mutagenisierten Hintergrundstämmen des entgegengesetzten Paarungstyps mutagenisiert und die resultierenden Diploide wurden sporuliert. Die übersekretierende Nachkommenschaft (solche mit sekretierten Aktivitäten nahe denen ihres mutierten Elternstammes) aus diesen Kreuzungen wurden identifiziert und erneut mit nicht-mutierten Stämmen gekreuzt und sporuliert. Von übersekretierenden Stämmen, die ein Ergebnis dieser zweiten Runde des Auskreuzens waren, wurde angenommen, daß sie die ssc Mutation des ursprünglichen Mutantenstammes enthalten, aber ansonsten frei von übrigen Wirkungen der Mutagenese sind. Diese Methode kann auch zum Transfer verschiedener ssc Mutationen in eine Reihe von Stämmen mit unterschiedlichem Hintergrund verwendet werden, um neue übersekretierende Stämme mit zusätzlichen erwünschten Eigenschaften zu erzeugen.

e. Unvermögen von ssc1/ssc1 und ssc2/ssc2 Diploiden zur Sporulation.

Während des Verlaufs dieser Arbeit stellte man fest, daß diploide Hefestämme, die aus der Kreuzung zweier Stämme, von denen jeder eine Mutation in der ssc1 Komplementationsgruppe trug, oder zweier Stämme, von denen jeder eine Mutation in der ssc2 Komplementationsgruppe trug, nicht in der Lage waren, normale viersporige Asci nach Inkubation in einem Sporulationsmedium zu bilden. Tatsächlich bilden sich wenige, wenn überhaupt Sporen in solchen Diploiden, was anzeigt, daß nicht-komplementierte ssc1 und ssc2 Mutationen zu einem Defekt im Sporulationsmechanismus führen. Dieser Sporulationsdefekt zeigt sich in allen Stämmen, die ssc1 oder ssc2 Mutationen tragen, einschließlich solchen, die aus den ursprünglichen Mutantenstämmen durch verschiedene Runden eines Auskreuzens erhalten wurden, wodurch es einem ermöglicht wird, mit einem einfachen Kreuzungs- und Sporulationstest zu bestimmen, ob ein bestimmter Stamm eine ssc1 oder ssc2 Mutation enthält oder nicht, unabhängig davon, ob dieser Stamm Prochymosin expremiert und sekretiert oder nicht.

f. Übersekretierende Mehrfachmutantenstämme.

Durch Kreuzung von Stämmen, die ssc Mutationen aus unterschiedlichen Komplementationsgruppen enthielten, gebildete diploide Stämme wurden sporuliert und die resultierenden haploiden Stämme wurden auf die Fähigkeit zur Sekretion von Prochymosin getestet. In vielen Fällen erhielt man haploide Stämme, die höhere sekretierte Aktivitäten als ihre Elternstämme hatten. Von solchen mit den höchsten sekretierten Aktivitäten (bis zu 5,0 u/g) wurde angenommen, daß sie Mutationen von beiden Elternstämmen enthielten. Im Falle von Stämmen, von denen angenommen wird, daß sie sowohl Mutationen der ssc1 und ssc2 Komplementationsgruppen enthalten, konnte das Vorliegen beider Mutationen durch den in Schritt e. beschriebenen Sporulationstest bestätigt werden.

g. Eliminierung von pCGS514 aus Mutantenstämmen.

Da Plasmide wie etwa pCGS514 nicht immer in beide Tochterzellen während der Zellteilung segregieren, konnten Mutantenstämme wirksam von diesem Plasmid "gereinigt" werden, indem sie einfach für mehrere Generationen auf Medium kultiviert wurden, das keinen Selektionsdurck auf die Expression des in diesem Plasmid enthaltenen Wildtyp URA3 Gens bewirkte. Normalerweise dient dieses Gen zur Komplementation der ura3-52 Mutation in den Mutantenstämmen. Kolonien, die auf einem Vollmedium (YPD, Sherman et al. (1981) supra) kultiviert worden waren, wurden jeweils einzeln auf ihre Fähigkeit zum Wachstum auf Minimalmedium mit und ohne zugesetzem Uracil getestet. ura&supmin;-Kolonien wurden zusätzlich auf sekretierte Chymosinaktivität (Verlust des Plasmids sollte auch das Prochymosingen aus diesen Stämmen eliminieren) getestet und als gereinigte Versionen von verschiedenen Mutantenstämmen aufbewahrt. Diese gereinigten Stämme können mit Plasmiden transformiert werden, die andere Promotor/Signalsequenz/Gen-Kombinationen enthalten.
Beispiele für Hefestämme, die durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, sind Kulturen, die jetzt bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland hinterlegt sind. Diese Kulturen besitzen die Hinterlegungsnummer 20750, Stammbezeichnung CGY1285 (Paarungstyp alpha, ura3-52, pep4-3, ssc1-1); Hinterlegungsnummer 20752, Stammbezeichnung CGY1291 (Paarungstyp alpha, ura3-52, his4-29, pep4-3, ssc2-1) und Hinterlegungsnummer 20751, Stammbezeichnung CGY1083 (Paarungstyp alpha, ura3-52, his4- 27, pep4-3, ssc3-1) und wurden von Collaborative Research, Inc. am 05. April 1985 hinterlegt. Diese drei Stämme wurden ausgewählt, da jeder ein Beispiel einer Mutation von einer der drei definierten Komplementationsgruppen von ssc Mutationen enthält.

Beispiel 2

Verbesserte Sekretionseffizienz für Rinderwachstumshormon

In diesem Beispiel wird gezeigt, daß auf Basis ihrer verbesserten Fähigkeit zur Sekretion von Prochymosin ausgewählte Mutantenhefestämme bei der Erzeugung eines von Chymosin unterschiedlichen heterologen Proteins nützlich sind. Somit sind sie möglicherweise bei der Erzeugung eines beliebigen Proteins, das aus Hefe sekretiert werden soll, allgemein nützlich.
Ein rekombinantes, mit pCGS447 bezeichnetes DNA-Plasmid, das mit pCGS514 identisch war, außer daß pCGS447 anstelle der etwa 2100 Basenpaare langen pTPI-SUC2-Prochymosinsequenz (siehe Tabelle 1) die vollständige kodierende Sequenz für Rinderwachstumshormon (BGH) zusammen mit seiner aminoterminalen Sekretionssignal- oder "Prä"-Sequenz fusioniert an die Promotorregion des Hefe-GAL1-Gens (wie von Goff et al. (1984) supra beschrieben) enthält, wurde zur Transformation von 4 Hefestämmen auf Uracil Prototrophie nach der LiCl-Methode von Ito et al. supra verwendet. Ein Stamm, CGY339 (Paarungstyp alpha, his4-27, ura3-52, pep4-3) wurde als Wildtyp-Kontrollstamm verwendet, der keinen übersekretierenden Phänotyp aufweist (d.h. er ist genotypisch SSC&spplus;). Zwei andere Stämme, CGY1285 (Paarungstyp alpha, ura3-52, pep4-3, ssc1-1) und CGY1291 (Paarungstyp alpha, his4-27, ura3-52, pep4-1, ssc2-1) enthalten jeweils eine einzelne Mutation (ssc1-1 oder ssc2-1) von der bekannt ist, daß sie die von diesen Stämmen sekretierte Menge an Prochymosin steigert. Der vierte Stamm, CGY1293 (Paarungstyp a, ura3-52, pep4-3, ssc1-1, ssc2-1) enthält beide Mutationen und sekretiert bekannterweise Prochymosin wirksamer als Stämme, die eine Mutation alleine enthalten. Alle drei übersekretierenden Stämme wurden während der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeiten erhalten und waren zuvor vom Plasmid pCGS514 gereinigt worden.
Isolierte Transformantenkolonien aus jedem dieser vier Stämme wurden in Punkten auf Agarplatten, die Galactose als Kohlenstoff- und Energiequelle enthielten, kultiviert. (Wachstum auf Galactose ist zur Expression durch den GAL1 Promotor auf pCGS447 erforderlich). Nach einer 96-stündigen Inkubationsperiode wurden etwa 100 mg Zellen aus jedem transformierten Stamm von diesen Platten abgeschabt und in 0,5 ml 100 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8,0) suspendiert. Nach Entfernung der Zellen aus dieser Suspension durch eine kurze Zentrifugation wurde der Überstandanteil gefroren und in vacuo zur Trockene eingedampft.
Die getrockneten Pellets wurden dann in 40 Mikroliter SDS Probenpuffer resuspendiert, wie von Lämmli, U.D. und Favre, M. (1973) J.Mol.Biol. 80, 575-599 beschrieben, und einer Immunoblot-Analyse unterzogen, wie von Towbin, H., Stähelin, T. und Gordon, J. (1979) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76, 4350- 4354 beschrieben. Die Menge an Rinderwachstumshormon (BGH) in jeder Probe wurde durch Vergleich mit gereinigten Standards auf demselben Immunoblot und der Menge an Protein, die pro Gramm Zellen sekretiert wurde, berechnet, indem durch das Naßgewicht der Zellen, die ursprünglich in jeder Suspension vorhanden waren, dividiert wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt: Hintergrundstamm Sekretionsgenotyp Menge an sekretiertem BGH
Klarerweise ist die ssc1-1 Mutation sehr wirksam bei der Verbesserung der Sekretionseffizienz von Rinderwachstumshormon aus Hefe. Die Wirkung von ssc2-1 ist weniger dramatisch, aber immer noch mindestens zweifach die Menge, die in Abwesenheit einer ssc Mutation sekretiert wird, und die Wirkung beider Mutationen im gleichen Stamm ist etwa die Summe der Wirkung der beiden einzelnen Mutationen.

Beispiel 3

Verbesserte Sekretionseffizienz der Prourokinase

Dieses Beispiel, bei dem Prourokinase verwendet wird, ist eine weitere Veranschaulichung, daß Hefemutantenstämme, die auf Basis ihrer verbesserten Fähigkeit zur Sekretion von Prochymosin ausgewählt worden sind, eine allgemeine Anwendbarkeit bei der Herstellung eines beliebigen Proteins aufweisen, das aus Hefe sekretiert werden soll.
Das rekombinante DNA-Plasmid pCGS696 ist identisch mit pCGS514, außer daß pCGS696 anstelle der etwa 1300 Basenpaare langen SUC2-Prochymosinsequenz (siehe Tabelle 1) die vollständige kodierende Sequenz für Präprourokinase (prePUK) (UK Patentanmeldung 2121050 "Preparation of Functional Human Urokinase Proteins", Heyneker, H.L., Holmes, W.E. und Vehar, G.A., auch EP-A 92182) zusammen mit ihrer aminoterminalen Sekretionssignal- oder "Prä"-Sequenz sowie ein 900 Basenpaare langes DNA-Fragment aus dem Hefe SUC2-Gen einschließlich des Transkriptionsterminatorbereichs (Goff et al. (1984) supra) enthält. Das Plasmid pCGS696 wurde zur Transformation von 4 Hefestämmen auf Uracilprototrophie nach der LiCl-Methode von Ito et al. supra verwendet. Ein Stamm, CGY339 (Paarungstyp alpha, his4-27, ura3-52, pep4-3) wurde als Wildtyp-Kontrollstamm verwendet, der keinen übersekretierenden Phänotyp aufweist (d.h. er ist genotypisch SSC&spplus;). Zwei andere Stämme, CGY1285 (Paarungstyp alpha, ura3-52, pep4-3, ssc1-1) und CGY1291 (Paarungstyp alpha, his4-27, ura3-52, pep4-1, ssc2-1) enthalten jeweils eine einzige Mutation (ssc1-1 oder ssc2-1), die bekannterweise die von diesen Stämmen sekretierte Menge an Prochymosin erhöht. Der vierte Stamm, CGY1463 (Paarungstyp alpha, ura3-52, leu2-3,112, pep4-3, ssc1-1, ssc2-1) enthält diese beiden Mutationen und sekretiert Prochymosin bekannterweise wirksamer als Stämme, die nur eine Mutation alleine enthalten. Alle drei übersekretierenden Stämme wurden bei den in Beispiel 1 beschriebenen Arbeiten erhalten und waren zuvor vom Plasmid pCGS514 gereinigt worden.
Isolierte Transformantenkolonien aus jedem dieser vier Stämme wurden in Punkten auf Agarplatten, die SD-Medium plus Leucin und Histidin enthielten, kultiviert. Nach einer 72-stündigen Inkubationsperiode wurden etwa 200 bis 400 mg Zellen aus jedem transformierten Stamm von diesen Platten abgeschabt und in 0,5 ml 50 mM Natriumphosphat (pH 7,0), 100 mM Natriumchlorid suspendiert. Etwa 25 ul jeder Zellsuspension wurden in ein Loch einer an Rinderplasminogen reichen Fibrin-Agaroseplatte (Brakman, P. (1967) Fibrinolysis, Scheltema und Holkema, Amsterdam, 1-124) gegeben. Die Anzahl fibrinolytischer Einheiten von Prourokinase (PUK) in jeder Probe wurde durch Vergleich der erzeugten fibrinolytischen Zone mit einer solchen, die durch gereinigte Standards auf derselben Fibrinplatte erzeugt wurde, abgeschätzt. Die pro Gramm Zellen sekretierte Menge an PUK wurde berechnet, indem durch das Naßgewicht der Zellen, die ursprünglich in jeder Suspension vorhanden waren, dividiert wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt: Hintergrundstamm Sekretionsgenotyp Menge an sekretiertem PUK nicht nachweisbar
Klarerweise sind die ssc1-1 und ssc2-1 Mutationen sehr wirksam bei der Verbesserung der Sekretionseffizienz von PUK aus Hefe. Die Wirkung beider Mutationen im selben Stamm ist größer als die Wirkung der beiden Mutationen einzeln.
Obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung gezeigt und beschrieben wurden, sind verschiedene Modifikationen möglich. Die vorliegende Anmeldung gibt spezifische Beispiele zur Erzeugung und Sekretion von Prochymosin, Rinderwachstumshormon und Prourokinase aus übersekretierenden Mutanten. Es können jedoch auch andere Polypeptid-Genprodukte aus Säugern oder anderen Quellen, wie etwa menschliches Wachstumshormon (HGH), Proinsulin, Gewebeplasminogenaktivator (tPA), alpha-1- Antitrypsin und Interleukin-2 aus den beschriebenen übersekretierenden Mutanten erhalten und sekretiert werden.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung eines gewünschten heterologen Polypeptidprodukts in hoher Ausbeute aus übersekretierenden Hefezellen durch Sammeln des von den Hefezellen sekretierten Produkts,

wobei die Hefezellen erhalten werden durch:

Auswählen eines transformierbaren Hefe-Ausgangsstammes; Bewirken, daß der Hefestamm mutagenisiert wird und Mutantenzellen bildet,

wobei die Mutantenzellen transformiert werden, so daß sie eine DNA-Sequenz oder Sequenzen zur Steuerung der Expression und Sekretion eines zweiten heterologen Polypeptids, das vom gewünschten Polypeptidprodukt verschieden ist, enthalten;

Mustern der Mutantenzellen, um solche Zellen auszuwählen, die das zweite heterologe Polypeptid in mehr als zweifach größeren Mengen als die von dem auf solche Weise transformierten Ausgangs stamm sekretierte Menge sekretieren;

zusätzliches Transformieren der ausgewählten Zellen, so daß sie eine DNA-Sequenz oder Sequenzen zur Steuerung der Expression und Sekretion des gewünschten heterologen Polypeptids enthalten und

Kultivieren der ausgewählten oder zusätzlich transformierten Zellen, um hohe Ausbeuten des gewünschten heterologen Polypeptids zu erzeugen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mutantenzellen vor der Mutagenese transformiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mutantenzellen nach der Mutagenese transformiert werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin eines der Polypeptide Prochyinosin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend den Schritt des Reinigens der ausgewählten Zellen von der DNA, welche die Expression des zweiten heterologen Polypeptids steuert.

7. Verfahren nach Anspruch 4, worin das von den Mutantenzellen sekretierte zweite heterologe Polypeptid Prochymosin ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das gewünschte Polypeptidprodukt Rinderwachstumshormon ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, worin das gewünschte Polypeptidprodukt Prourokinase ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das gewünschte Polypeptidprodukt ein reifes Protein ist.

11. Hefemutantenstamm, der ein übersekretierender Stamm für ein erstes heterologes Polypeptidprodukt ist und erhalten wird durch:

Auswählen eines transformierbaren Ausgangshefestammes, Bewirken, daß der Hefestamm mutagenisiert wird und Mutantenzellen bildet, wobei die Mutantenzellen transformiert werden, um ein heterologes Testpolypeptid zu sekretieren, das sich von dem ersten Polypeptid unterscheidet, und Mustern der Mutantenzellen, um solche Zellen auszuwählen, die heterologes Testpolypeptid in einer mehr als zweifach größeren Menge als die von dem auf solche Weise transformierten Ausgangsstamm sekretierte Menge sekretieren und Transformieren der ausgewählten Zellen, um das erste heterologe Polypeptidprodukt zu sekretieren.

12. Hefemutantenstamm nach Anspruch 11, worin das Verfahren das Transformieren der Mutantenzellen vor der Mutagenese umfaßt.

13. Hefemutantenstamm nach Anspruch 12, worin das Verfahren das Transformieren der Mutantenzellen nach der Mutagenese umfaßt.

14. Hefemutantenstamm nach Anspruch 11, worin eines der heterologen Polypeptide Prochyinosin ist.

15. Hefezellen, die vom Hefestamm American Type Culture Collection Hinterlegungsnummer 20750, Stammbezeichnung CGY1285 stammen.

16. Hefezellen, die vom Hefestamm American Type Culture Collection Hinterlegungsnummer 20751, Stammbezeichnung CGY1083 stammen.

17. Hefezellen, die vom Hefestamm American Type Culture Collection Hinterlegungsnummer 20752, Stammbezeichnung CGY1291 stammen.

18. Hefezellen, die vom Hefestamm American Type Culture Collection Hinterlegungsnummer 20753, Stammbezeichnung CGY998 stammen.

19. Plasmid pCGS514, enthalten im Hefestamm American Type Culture Collection Hinterlegungsnummer 20753, Stammbezeichnung CGY998.

20. Verfahren zur Selektion von Hefestämmen mit verbesserten sekretorischen Fähigkeiten zur Sekretion heterologer Genprodukte, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Mutagenese des Hefestammes CGY998, American Type Culture Collection Hinterlegungsnummer 20753,

(b) Mustern des mutagenisierten Stammes, um solche Zellen zu ermitteln, die mindestens zweifach höhere Mengen an heterologen Genprodukten als nicht-mutierte Zellen sekretieren, und

(c) Isolieren von solchen Mutantenhefezellen, die eine erhöhte Fähigkeit zur Sekretion heterologer Genprodukte aufweisen.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin das heterologe Genprodukt Prochymosin ist.

22. Verfahren zur Selektion von Hefestämmen mit verbesserten sekretorischen Fähigkeiten zur Sekretion heterologer Genprodukte, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Auswählen eines Hefestammes, der das Gen für Prochymosin und DNA-Sequenzen zur Expression und Sekretion enthält,

(b) Mutagenisieren des Hefestammes mit Ethylmethansulfonat,

(c) Mustern des mutagenisierten Stammes, um solche Zellen auszuwählen, die mindestens zweifach höhere Mengen an Prochymosin als nicht-mutierte Zellen sekretieren, und

(d) Transformieren der ausgewählten Zellen, so daß sie ein Gen für ein zweites heterologes Protein enthalten, und Verwenden der transformierten Zellen, um das zweite heterologe Protein zu erzeugen.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin das Mustern den Schritt des Bestimmens der Milchgerinnungsaktivität von Ausscheidungen aus den Zellen umfaßt.

24. Verfahren nach Anspruch 23 und weiterhin umfassend das Zusetzen von Pepstatin zur Milch.

25. Verfahren zur Selektion von Hefestämmen mit verbesserten sekretorischen Fähigkeiten, umfassend die Schritte:

(b) Mutagenisieren des Hefestammes,

(c) Ausstreichen der mutagenisierten Hefezellen auf einer festen Nährstoffplatte und Kultivieren der Kolonien,

(d) Entfernen der sichtbaren Kultur vom Träger,

(e) Auftragen einer Kasein-haltigen Lösung in einem sich verfestigenden Material als Überzug,

(f) Inkubieren bei 0ºC bis 40ºC,

(g) Notieren der Gerinnselbildung und Gewinnung von Kolonien von Zellen, die eine solche Gerinnselbildung verursachen, zur Verwendung als übersekretierende Hefestämme.

26. Verfahren nach Anspruch 25, weiterhin umfassend das Kreuzen von aus Schritt (e) gewonnenen Zellen, um Zellen mit besseren übersekretierenden Eigenschaften zu erhalten.

27. Gesamtes zelluläres DNA-Material, erhalten aus einem Hefemutantenstamm nach einem der Ansprüche 11 bis 14.

28. Gesamtes zelluläres DNA-Material, erhalten aus Hefezellen nach einem der Ansprüche 15 bis 18.

29. Verfahren zur Gewinnung eines gewünschten Polypeptids, umfassend das Kultivieren von Hefezellen nach einem der Ansprüche 15 bis 18, Derivaten davon oder einem Hefestamm nach einem der Ansprüche 11 bis 14 und Gewinnen des gewünschten Proteins aus der resultierenden Kultur.