JP2019504932A - 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、それらの全開示がこれにより参照して本明細書に組み込まれる、2015年11月13日に出願された米国仮特許出願第62/255,217号明細書の優先権の利益を主張するものである。
配列表の正式な写しは、91,265バイトのサイズを有して本明細書と同時に提出される、2016年11月2日に作成された20161104_CL6278WOPCT_SequenceListing_ST25.txtのファイル名を備えるASCIIフォーマットの配列表としてEFS−Webを介して電子的に提出される。このASCIIフォーマット文献に含有された配列表は、本明細書の一部であり、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
a.
i. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散性指数を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物;および
b. 少なくとも1つの追加の織物ケア成分を含む織物ケア組成物が提供される。
a.
i. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散性指数を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物;および
b. 少なくとも1つの追加の洗濯ケア成分を含む洗濯ケア組成物が提供される。
i. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
i. 5未満の多分散性指数を含むα−グルカンエーテル組成物であって;少なくとも1つの有機基との約0.05〜約3.0の置換度(DoS)を有するα−グルカンエーテル組成物が提供される。
a.
i. 上記の織物ケア組成物;
ii. 上記の洗濯ケア組成物;
iii. 上記のグルカンエーテル組成物;
iv.
a. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
b. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
c. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
d. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
e. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
f. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
g. 5未満の多分散性指数を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物;および
v. (i)〜(iv)の任意の組み合わせから選択される組成物を提供する工程;
b. 好適な条件下で(a)の組成物を織物、布地もしくは衣料品と接触させる工程であって、これにより織物、布地もしくは衣料品が処理されて利益を得る工程;および
c. 任意選択的に、(b)の処理された織物、布地もしくは衣料品をすすぎ洗う工程を含む方法が提供される。
a.
i. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv.5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散性指数を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を提供する工程;
b. アルカリ性条件下の反応中で(a)のα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を1つの有機基を含む少なくとも1種のエーテル化剤と接触させる工程であって;これにより少なくとも1つの有機基との約0.05〜約3.0の置換度(DoS)を有するα−グルカンエーテルが生成される工程;および
c. 任意選択的に、工程(b)で生成されたα−グルカンエーテルを単離する工程を含む方法が提供される。
a.
i. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散性指数を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物;
b.
i. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散性指数を含むグルカンエーテル組成物であって;ここで少なくとも1つの有機基との約0.05〜約3.0の置換度(DoS)を有するα−グルカンエーテル組成物;または
c. それらの任意の組み合わせを含む布地、糸、織物もしくは繊維が提供される。
下記の文章は、米国連邦規則法典第37編規則1.821〜1.825(ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列の開示を含有する特許出願のための要件−配列規則)を順守しており、世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(2009)、欧州特許条約(EPC)および特許協力条約(PCT)規則5.2および49.5(a−bis)ならびに実施細則の第208章および附属書Cの配列表要件と一致している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用した記号およびフォーマットは、米国連邦規則法典第37巻§1.822に規定された規則を順守している。
Mw=ΣNiMi 2/ΣNiMi;(式中、Miは鎖の分子量であり、Niはその分子量の鎖の数である)として計算される。
重量平均分子量は、静的光散乱、小角中性子散乱、X線散乱および沈降速度などの専門技術によって決定できる。
(構造I中、R2、R3およびR4は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アラルキル基もしくははアルカリル基を示す)を含む。
構造I中の炭素原子(C)は、正荷電有機基の1個以上の炭素の鎖(「炭素鎖」)の一部である。炭素原子は、α−グルカンポリマーのグルコースモノマーと直接的にエーテル結合している、またはα−グルカンポリマー/オリゴマーのグルコースモノマーにエーテル結合している2個以上の炭素原子の鎖の一部である。構造I中の炭素原子は、−CH2−、−CH−(ここで、1つのHは、ヒドロキシ基などの別の基で置換されている)、または−C−(ここで、両方のH’が置換されている)であってよい。
(式中、R2、R3およびR4のそれぞれはメチル基である)として表すことができる。
構造IIは、第4級アンモニウムヒドロキシプロピル基の1つの例である。
においては周知である。本開示のためには、置換は、下記の5つの基の1つ内の交換であると定義されている。
1. 小さな脂肪族の非極性もしくは弱極性残基:Ala、Ser、Thr(Pro、Gly);
2. 極性負荷電残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln;
3. 極性正荷電残基:His、Arg、Lys;
4. 大きな脂肪族の非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys);および5. 大きな芳香族残基:Phe、TyrおよびTrp。
本可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物は、スクロース(例えば、サトウキビ)から、ヒトへの曝露の長い歴史を有する微生物(口腔内で自然に見いだされる、または例えばビール、発酵大豆などの食品中で見いだされる微生物)から自然において見出されるものと同一のアミノ酸配列(もしくはそれらの活性切断形)を本質的に有する1種以上の酵素加工助剤を使用して調製した。可溶性オリゴマー/ポリマーは、(広範囲の用途における使用を可能にする)低粘度を有する。
a. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
b. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
c. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
d. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
e. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;h. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
i. 5未満の多分散性指数。
a. 25〜35のα−(1,3)−グリコシド結合;
b. 55〜65%のα−(1,6)−グリコシド結合;および
c. 5〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合によって特徴付けられる。
a. 27〜31のα−(1,3)−グリコシド結合;
b. 57〜61%のα−(1,6)−グリコシド結合;および
c. 7〜11%のα−(1,3,6)グリコシド結合によって特徴付けられる。
所望の用途に依存して、本α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物および/またはその誘導体(例えば本α−グルカンエーテル)は、洗濯ケア、布地/織物ケアおよび/またはパーソナルケア製品において使用するために好適な1つ以上の他の物質および/または有効成分を用いて調製(例えば、ブレンド、混合、組み込むなど)することができる。したがって、本開示は、本グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を含む組成物を含む。この状況における用語「本グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を含む組成物」は、例えば、本グルカンオリゴマー/ポリマー、レオロジー改質組成物、織物処理/ケア組成物、洗濯ケア調製物/組成物、織物柔軟剤、パーソナルケア組成物(ヘア、スキンおよびオーラルケア)などを含む水性調製物を含むことができる。
a.
i. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散性指数を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物;
b. 少なくとも1つの追加の織物ケア成分を含む織物ケア組成物が提供される。
a.
i. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散性指数を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物;および
b. 少なくとも1つの追加の洗濯ケア成分を含む洗濯ケア組成物が提供される。
a. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
b. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
c. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
d. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
e. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
f. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
g. 5未満の多分散性指数;ここで本組成物が少なくとも1つの有機基との約0.05〜約3.0の置換度(DoS)を有するα−グルカンエーテル組成物が提供される。
を表す。構造IのR2、R3およびR4のそれぞれは、独立して、水素原子、またはアルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アラルキル基もしくはアルカリル基を表す。または、R2、R3およびR4のそれぞれは、独立して水素原子もしくはアルキル基を表すことができる。アルキル基は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノ二ル基もしくはデシル基であってよい。R2、R3およびR4の2つもしくは3つがアルキル基の場合、それらは同一もしくは異なるアルキル基であってよい。
LIPASE(商標)、LUMA FAST(商標)およびLIPOMAX(商標)(Genencor);LIPEX(登録商標)、LIPOLASE(登録商標)およびLIPOLASE(登録商標)ULTRA(Novozymes);ならびにLIPASE P(商標)「Amano」(天野製薬株式会社、日本)が含まれる。
2(A1)号パンフレット、同第2010090915(A1)号パンフレット、同第2010135238(A1)号パンフレット、同第2011094687(A1)号パンフレット、同第2011094690(A1)号パンフレット、同第2011127102(A1)号パンフレット、同第2011163428(A1)号パンフレット、同第2008000567(A1)号パンフレット、同第2006045391(A1)号パンフレット、同第2006007911(A1)号パンフレット、同第2012027404(A1)号パンフレット、欧州特許第1740690(B1)号明細書、国際公開第2012059336(A1)号パンフレット、米国特許第6730646(B1)号明細書、国際公開第2008087426(A1)号パンフレット、同第2010116139(A1)号パンフレットおよび同第2012104613(A1)号パンフレットに開示されている。
a.
i. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv.5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散性指数を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を提供する工程;
b. アルカリ性条件下の反応中で(a)のα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を1つの有機基を含む少なくとも1種のエーテル化剤と接触させる工程であって;これにより少なくとも1つの有機基との約0.05〜約3.0の置換度(DoS)を有するα−グルカンエーテルが生成される工程;および
c. 任意選択的に、工程(b)で生成されたα−グルカンエーテルを単離する工程を含む方法が提供される。
a.
i. 上記の織物ケア組成物;
ii. 上記の洗濯ケア組成物;
iii. 上記のα−グルカンエーテル組成物;
iv.
i. 25%〜35%のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55%〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5%〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散性指数を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を提供する工程;および
v. (i)〜(iv)の任意の組み合わせから選択される組成物を提供する工程;
b. 好適な条件下で(a)の組成物を織物、布地もしくは衣料品と接触させる工程であって、これにより織物、布地もしくは衣料品が処理されて利益を得る工程;および
c. 任意選択的に、(b)の処理された織物、布地もしくは衣料品をすすぎ洗う工程を含む方法が提供される。
上記エーテル化反応を調製するために、下記の工程を実施できる。
本グルカンオリゴマー/ポリマーおよび/または本α−グルカンエーテルは、パーソナルケア製品において使用できる。例えば、そのような物質は、保湿剤、親水コロイドもしくは場合により増粘剤として使用することが可能な場合がある。本α−グルカンオリゴマー/ポリマーおよび/または本α−グルカンエーテルは、所望であれば、その開示が参照により本明細書に全体として組み込まれる米国特許第8,541,041号明細書に開示されている増粘剤などの1種以上の他のタイプの増粘剤と結び付けて使用されてよい。
可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を酵素的に生成するための方法を提供する。1つの実施形態では、本方法は、基質としてスクロースを使用して消化耐性可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物の合成を触媒できるグルコシドヒドロラーゼ70型(E.C.2.4.1.−)に属する少なくとも1種の組換え生成グルコシルトランスフェラーゼの使用を含む。グリコシドヒドロラーゼファミリー70酵素は、例えばストレプトコッカス(Streptococcus)属、ロイコノストック(Leuconostoc)属、ワイセラ(Weisella)属もしくはラクトバチルス(Lactobacillus)属などの乳酸菌によって生成されるトランスグルコシダーゼ(炭水化物活性酵素データベース;「CAZy」;Cantarel et al.,(2009)Nucleic Acids Res 37:D233−238を参照されたい)である。組換え発現グルコシルトランスフェラーゼは、好ましくは、自然において見いだされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する(すなわち、起源生物もしくはそれらの触媒活性切断形において見いだされる全長配列と同一である)。
少なくとも1種のα−グルカノヒドロラーゼを少なくとも1種の上記のグルコシルトランスフェラーゼと組み合わせて(すなわち、反応混合物中で同時に)使用して本可溶性グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を酵素的に生成するための方法が提供される。2種の酵素の同時使用は、同一酵素の連続投与(すなわち、最初にグルコシルトランスフェラーゼを使用してスクロースからグルカンポリマーを合成し、その後に引き続いてグルカンポリマーをα−グルカノヒドロラーゼにより処理する)に比較して異なる製品プロファイル(すなわち、可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物のプロファイル)を生成する。1つの実施形態では、α−グルカノヒドロラーゼとのグルコシルトランスフェラーゼの連続的投与に基づくグルカンオリゴマー/ポリマー合成法は特に除外される。
a.
i. スクロース;
ii. グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドであって、配列番号10もしくは12との少なくとも90%の同一性を有するポリペプチド;
iii. α−グルカノヒドロラーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドであって:
1. ムタナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号1もしくは3との少なくとも90%の同一性を有するポリペプチド;
2. デキストラナーゼ活性を含むポリペプチド;および
3. 1および2の組み合わせ、からなる群から選択されるポリペプチド;および
iv. 任意選択的に1種以上のアクセプター、を含む一連の反応成分を提供する工程;
b. 好適な反応条件下で結合する工程であって、それにより可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を含む生成物が生成される工程;および
c. 任意選択的に、工程(b)の生成物から可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を単離する工程、を含む方法が提供される。
当業者であれば、所望の活性(すなわち、所望のグリコシド結合を有するグルカンもしくは標的グリコシド結合に向かう内加水分解活性を有するα−グルカノヒドロラーゼを形成できるグルコシルトランスフェラーゼ活性)が維持される限り、さらに、本組成物および方法において実質的に類似の酵素配列を使用できることを認識している。例えば、所望の活性が保持される(または比活性に関して改善さえされている)限り、触媒活性切断形を調製して使用できることは証明されている。1つの実施形態では、実質的に類似の配列は、本明細書に例示した配列と関連する核酸分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするそれらの能力によって定義される。また別の実施形態では、配列アラインメントアルゴリズムを使用すると、本明細書に提供したDNAもしくはアミノ酸配列との同一性パーセントに基づいて実質的に類似の配列を定義することができる。
反応系から本可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を入手するためには、遠心分離、濾過、分別、クロマトグラフィー分離、透析、蒸発、沈殿、希釈もしくはそれらの任意の組み合わせ、好ましくは透析もしくはクロマトグラフィー分離、最も好ましくは透析(限外濾過)を含むがそれらに限定されない任意の数の一般的精製技術を使用することができる。
本配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞内、特に微生物宿主の細胞内で生成できる。本遺伝子および核酸分子を発現させるために好ましい異種宿主細胞は、真菌科もしくは細菌科内で見いだすことができる、および広範囲の温度、pH値および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、任意の細菌、酵母および糸状菌が本核酸分子の発現に宿主として好適に機能できることが企図されている。酵素は、細胞内、細胞外または細胞内および細胞外両方の組み合わせで発現させることができるが、ここで細胞外発現は、発酵生成物からの所望のタンパク質の回収を細胞内発現により生成されたタンパク質を収集するための方法よりも容易にさせる。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを生成するために使用される細胞供給原料に対して不変のままである;機能的遺伝子は無関係に発現させられるであろう。宿主菌株の例としては、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピチア(Pichia)属、ファフィア(Phaffia)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、カンジダ(Candida)属、ハンセヌラ(Hansenula)属、ヤロウィア(Yarrowia)属、サルモネラ(Salmonella)属、バチルス(Bacillus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、ジモモナス(Zymomonas)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、エリスロバクター(Erythrobacter)属、クロロビウム(Chlorobium)属、クロマチウム(Chromatium)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、サイトファガ(Cytophaga)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトミセス(Streptomyces)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリア(Corynebacteria)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、デイノコッカス(Deinococcus)属、エシェリキア(Escherichia)属、エルウィニア(Erwinia)属、パントエア(Pantoea)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属、メチロモナス(Methylomonas)属、メチロバクター(Methylobacter)属、メチロコッカス(Methylococcus)属、メチロシヌス(Methylosinus)属、メチロミクロビウム(Methylomicrobium)属、メチロシスティス(Methylocystis)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、シネコシスティス(Synechocystis)属、シネココッカス(Synechococcus)属、アナバエナ(Anabaena)属、チオバチルス(Thiobacillus)属、メタノバクテリウム(Methanobacterium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属およびミクソコッカス(Myxococcus)属などの細菌種、真菌種もしくは酵母種が挙げられるが、それらに限定されない。1つの実施形態では、真菌宿主細胞は、トリコデルマ(Trichoderma)属、好ましくはトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)の菌株である。1つの実施形態では、細菌宿主菌株には、エシェリキア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属およびシュードモナス(Pseudomonas)属が含まれる。1つの好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、枯草菌(Bacillus subtilis)もしくは大腸菌(Escherichia coli)である。
酵素を生成するためには、様々な培養方法を適用できる。例えば、組換え微生物宿主からの過剰発現した特定遺伝子産物の大規模生産は、バッチ式、フェドバッチ式および連続式培養方法によって生成できる。バッチ式およびフェドバッチ式培養方法は一般的であり、当分野では周知であり、例は:Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology by Wulf Crueger and Anneliese Crueger(authors),Second Edition,(Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(1990) and Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology,Third Edition,Richard H.Baltz,Arnold L.Demain,and Julian E.Davis(Editors),(ASM Press,Washington,DC(2010)の中に見いだすことができる。
第1の実施形態(「第1実施形態」)では、可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物であって:
a. 25〜35のα−(1,3)グリコシド結合、好ましくは27〜31%のα−(1,3)グリコシド結合;
b. 55〜75%のα−(1,6)グリコシド結合、好ましくは55〜65%、より好ましくは57〜61%のα−(1,6)グリコシド結合;
c. 5〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合、好ましくは7〜11%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
d. 5,000ダルトン未満;好ましくは2,500ダルトン未満、より好ましくは500〜2,500ダルトンおよび最も好ましくは約500〜約2,000ダルトンの重量平均分子量;
e. 20℃の水中において12重量%で、250cP(0.25パスカル秒(Pa・s))未満、好ましくは10cP(0.01Pa・s)未満、好ましくは7cP(0.007Pa・s)未満、より好ましくは5cP(0.005Pa・s)未満、より好ましくは4cP(0.004Pa・s)未満および最も好ましくは3cP(0.003Pa・s)未満の粘度;
f. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%、好ましくは少なくとも30%、40%、50%、60%もしくは70%の溶解度;および
g. 5未満の多分散指数、を含む可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物が提供される。
a.
i. 好ましくは少なくとも50g/L、より好ましくは少なくとも200g/Lの濃度にあるスクロース;
ii. グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドであって、配列番号10もしくは12との少なくとも90%の同一性、好ましくは91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有するポリペプチド;
iii. α−グルカノヒドロラーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドであって:
1. ムタナーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号1、3、6もしくは8との少なくとも90%の同一性、好ましくは少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有するポリペプチド;
2. デキストラナーゼ活性;好ましくはケトミウム・エラチクム(Chaetomium erraticum)由来のデキストラナーゼ活性;より好ましくはケトミウム・エラチクム(Chaetomium erraticum)由来のデキストラナーゼLを含むポリペプチド;および
3. 1および2の組み合わせ、からなる群から選択されるポリペプチド;および
iv. 任意選択的に1種以上のアクセプターを含む1組の反応成分を提供する工程;b. 好適な反応条件下で(a)の一連の反応成分を結合する工程であって、それにより可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を含む生成物が提供され;好ましくはグルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドおよびα−グルカノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが反応混合物中に同時に存在する工程;および
c. 任意選択的に、工程(b)の生成物から可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を単離する工程であって;好ましくはここで単離する工程(c)が存在する工程、を含む方法が提供される。
1) グルコシルトランスフェラーゼGTF4154(配列番号10、12もしくはそれらの組み合わせ)およびムタナーゼmut3264(配列番号1、3、6もしくはそれらの組み合わせ)および
2)グルコシルトランスフェラーゼGTF4154(配列番号10、12もしくはそれらの組み合わせ)およびデキストラナーゼ;好ましくはケトミウム・エラチクム(Chaetomium erraticum)デキストラナーゼの組み合わせ、から選択される方法。
本明細書で使用する標準組換えDNAおよび分子クローニング技術は、当分野において周知であり、Sambrook,J.and Russell,D.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2001);Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.and Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor,NY(1984);およびMolecular Biology,5th Ed.Current Protocols and John Wiley and Sons,Inc.,N.Y.,2002の中でAusubel,F.M.et.al.,Short Protocolsによって記載されている。
機能的GTF酵素を発現する大腸菌(Escherichia coli)菌株は、振とうフラスコ内で、アンピシリン(100μg/mL)を含むLB培地を使用して37℃および220rpmでOD600nm=0.4〜0.5へ増殖させ、その時点にイソプロピル−β−D−チオ−ガラクトシド(IPTG)を最終濃度が0.5mMとなるように加え、37℃で2〜4時間にわたりインキュベーションを継続した。細胞は15分間にわたる5,000×gでの遠心分離によって採取し、50mMのリン酸バッファー(pH7.0)中に再懸濁させた(20〜25重量/体積%の湿潤細胞)。95%を超える細胞溶解を保証するために、再懸濁細胞をFrenchプレッシャーセル(SLM Instruments,Rochester,NY)に2回通過させた。細胞溶解物を12,000×gおよび4℃で30分間遠心分離した。生じた上清(細胞抽出物)は、GTF酵素の発現を確証するためにBCAタンパク質アッセイおよびSDS−PAGEによって分析し、細胞抽出物を−80℃で保管した。
pHYTベクター主鎖は、枯草菌(Bacillus subtilis)aprEプロモーターを含有する複製枯草菌(Bacillus subtilis)発現プラスミドであった。pHYTベクター主鎖は、大腸菌(Escherichia coli)−
枯草菌(Bacillus subtilis)シャトルベクターpHY320PLK(GENBANK(登録商標)アクセッション番号D00946、およびタカラバイオ株式会社(日本国大津市)から市販で入手できる)由来であった。大腸菌(Escherichia coli)の複製起源およびアンピシリン耐性遺伝子は、pACYC177(GENBANK(登録商標)X06402、およびNew England Biolabs Inc.,Ipswich,MAから市販で入手できる)由来であった。枯草菌(Bacillus subtilis)の複製起源およびテトラサイクリン耐性遺伝子は、pAMalpha−1(Francia et al.,J Bacteriol.2002 Sep;184(18):5187−93))由来であった。
aprEプロモーター−関心対象の酵素をコードするAprEシグナルペプチド配列コーディング配列(例えば、様々なGTFに対するコーティング配列)−BPN’ターミネーターを含有する全発現カセット(EcoRI−BamHI断片)は、HindIII部位を破壊したBamHI−HindIIIリンカーを使用してpHYTのEcoRI部位およびHindIII部位内にクローニングした。リンカー配列は、5’−GGATCCTGACTGCCTGAGCTT−3’(配列番号14)であった。aprEプロモーターおよびAprEシグナルペプチド配列(配列番号4)は、枯草菌(Bacillus subtilis)にとって天然であった。BPN’ターミネーターは、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)のサブチリシン由来であった。天然シグナルペプチドを使用した場合は、AprEシグナルペプチドを発現遺伝子の天然シグナルペプチドと置き換えた。
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)胞子懸濁液を約6cm径のアセトアミダーゼ形質転換プレート(150μLの5×107〜5×108個(胞子)/mL(懸濁液))の中心上に広げた。プレートを次に生物学的フード内で風乾させた。ストッピングスクリーン(BioRad 165−2336)およびマクロキャリアホルダー(BioRad 1652322)を70%のメタノール中に浸漬して風乾させた。DRIERITE(登録商標)乾燥剤(硫酸カルシウム乾燥剤;W.A.Hammond DRIERITE(登録商標)Company,Xenia,OH)を小さなペトリ皿(6cm、Pyrex)内に配置し、ワットマン濾紙(GE Healthcare Bio−Sciences,Pittsburgh,PA)を被せた。マクロキャリア(BioRad 165−2335;Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)を含有するマクロキャリアホルダーを濾紙の上に水平に配置し、ペトリ皿の蓋を取り換えた。タングステン粒子懸濁液は、60mgのタングステンM−10粒子(マイクロキャリア、0.7ミクロン、BioRad #1652266,Bio−Rad Laboratories)をエッペンドルフ型試験管に加えることによって調製した。エタノール(1mL)(100%)を加えた。タングステンはエタノール溶液中でボルテックスミキサーにかけ、15分間浸漬させた。タングステンをペレット化するために、エッペンドルフ型試験管を最高速度で短時間にわたり微量遠心した。エタノールをデカントし、無菌蒸留水を用いて3回洗浄した。水洗を3回デカントした後、タングステンを1mLの無菌50%グリセロール中に再懸濁させた。形質転換反応は、各形質転換のために25μLの懸濁化タングステンを1.5mLのエッペンドルフ型試験管に加えることによって調製した。その後の添加は、2μLのDNA pTrex3発現ベクター(配列番号9;米国特許第6,426,410号明細書を参照されたい)、25μLの5MのCaCl2、10μLの0.1Mのスペルミジンの順序で実施した。反応は、タングステンを懸濁させながら、5〜10分間にわたり継続的にボルテックスミキサーにかけた。次にエッペンドルフ型試験管を短時間微量遠心し、デカントした。タングステンペレットを200μLの70%のエタノールを用いて洗浄し、短時間微量遠心し、ペレット化してデカントした。ペレットを200μLの100%のエタノールを用いて洗浄し、短時間微量遠心してペレット化してデカントした。タングステンペレットを24μLの100%のエタノール中に再懸濁させた。エッペンドルフ型試験管を15秒間にわたり超音波水浴中に入れ、8μLのアリコートを乾燥マクロキャリアの中心に移した。マクロキャリアを放置して乾燥ペトリ皿内で乾燥させた。
第I部、500mLの蒸留水(dH2O)中で作成する
1,000×の塩 1mL
ノーブル寒天 20g
pHを6.0へ、オートクレーブ滅菌する
第II部、500mLのdH2O中で作成する
アセトアミド 0.6g
CsCl 1.68g
グルコース 20g
KH2PO4 15g
MgSO4・7H2O 0.6g
CaCl2・2H2O 0.6g
pHを4.5にし、0.2ミクロンのフィルターで滅菌する;50℃のオーブン内に入れて加温し、寒天に加え、混合し、プレートに注入する。室温(約21℃)で保管した。
1,000×の塩(1L当たり)
FeSO4・7H2O 5g
MnSO4・H2O 1.6g
ZnSO4・7H2O 1.4g
CoCl2・6H2O 1g
1LのdH2Oにする。
0.2ミクロンのフィルターで滅菌する
グルコシルトランスフェラーゼ活性アッセイは、25g/Lのデキストラン(約1,500のMW、Sigma−Aldrich、製品番号31394)の存在下もしくは非存在下で、25mMもしくは50mMの酢酸ナトリウムバッファー(pH5.5)中で1〜10体積/体積%のGTF酵素を含有する粗タンパク質抽出物を200g/Lのスクロースとともに37℃で125rpmの軌道振とうによってインキュベートすることにより実施した。1時間後、2時間後および3時間後に1アリコートの反応混合物を取り出し、90℃で5分間にわたり加熱してGTFを不活性化した。13,000×gで5分間にわたる遠心分離によって不溶性物質を除去し、その後に0.2μmのRC(再生セルロース)膜に通した濾過を実施した。生じた濾液は、2基のAminex HPX−87Cカラムシリーズ(Bio−Rad,Hercules,CA)を使用するHPLCによって85℃で分析し、スクロース濃度を定量した。各時点のスクロース濃度を反応時間に対してプロットし、線形プロットの勾配から初期反応速度を決定した。1単位のGTF活性は、アッセイ条件下で1分間中に1μM(マイクロモル)のスクロースを消費するために必要とされる酵素の量として定義された。
ムタナーゼ活性を決定するために必要とされる不溶性ムタンポリマーは、ストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)ATCC(登録商標)33478(商標)により生成された分泌酵素を使用して調製した。詳細には、1ループのS.ソブリヌス(sobrinus)ATCC(登録商標)33478(商標)のグリセロールストックをBHI寒天プレート(Brain Heart Infusion agar,Teknova,Hollister,CA)上に画線し、プレートを37℃で2日間インキュベートした;ループを使用して小数のコロニーを取り上げ、Teknova製のオリジナル培地瓶中の2×の100mLのBHI液体培地を接種し、この培養を24時間にわたり静的に37℃でインキュベートした。生じた細胞を遠心分離によって除去し、生じた上清を0.2μmの滅菌フィルターに通して濾過した;2×の101mLの濾液を採取した。濾液に2×の11.2mLの200g/Lのスクロース(最終スクロース20g/L)を加えた。反応を撹拌せずに37℃で67時間にわたりインキュベートした。生じた多糖ポリマーは、10分間にわたる5,000×gでの遠心分離によって収集した。上清は注意深くデカントした。不溶性ポリマーは、40mLの無菌水を用いて4回洗浄した。生じたムタンポリマーを48時間にわたり凍結乾燥させた。ムタンポリマー(390mg)を39mLの無菌水中に懸濁させて10mg/mLの懸濁液を作成した。ムタン懸濁液は、超音波処理(大きな塊が消失するまで40%の振幅、計約10分間)によってホモジナイズした。均質化懸濁液をアリコートに分割し、4℃で保管した。
一次元1H NMRデータは、高感度凍結探針を使用して500MHzで作動するVarian Unity Inovaシステム(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)上で獲得した。水抑制は、「前飽和」実験における残留水シグナルについての共鳴上の観察トランスミッター周波数を注意深く配置し、その後に全期サイクル(32回という多数)および10msの混合時間を用いた「tnnoesy」実験を使用して入手した。
グルカン中のグルコシド結合の分布は、一般に「メチル化分析」もしくは「部分メチル化分析」と名付けられた周知の技術によって決定した(例えば:F.A.Pettolino,et al.,Nature Protocols,(2012)7(9):1590−1607を参照されたい)。この技術は、多数の小さな変化を有するが、必ず:1.グルコース単位の全遊離ヒドロキシル基のメチル化、2.メチル化グルカンの個別モノマー単位への加水分解、3.アノマーを排除してメチル化グルシトールを作成するための還元的開環;アノマー炭素は、典型的には特徴的質量スペクトルを作り出すための重水素原子を用いてタグ付けされる、4.部分メチル化生成物としても公知である、部分メチル化酢酸グルシトールを作成するための(加水分解および開環により作成された)遊離ヒドロキシル基のアセチル化、5.生じた部分メチル化生成物の質量分析法および/または水素炎イオン化検出法と結合されたガスクロマトグラフィーによる分析を含む。
可溶性オリゴマー/ポリマーの12重量%の水溶液の粘度は、コーンおよびプレートの形状を備えたTA Instruments AR−G2制御ストレス回転式レオメーター(TA Instruments−Waters,LLC,New Castle,DE)を使用して測定した。形状は、どちらも平滑な表面を備える40mmの2°の上方コーンおよびペルチェ下方プレートからなる。試験中の溶媒(水)蒸発を最小限に抑えるために、水飽和スポンジを装備した環境チャンバーを使用した。粘度は、20℃で測定した。ペルチェは、所望の温度に設定し、0.65mLのサンプルは、エッペンドルフ型ピペット(Eppendorf North America,Hauppauge,NY)を使用してプレート上に装填した。コーンは、コーンの底部とプレートとの間のギャップを50μmに低下させた。サンプルは、3分間にわたり熱平衡させた。剪断速度掃引は、500〜10s−1の剪断速度範囲にわたって実施した。サンプル安定性は、試験の終了時に反復剪断速度点をランすることによって確証した。
スクロース、グルコース、フルクトースおよびロイクロースは、2基の直列Aminex HPX−87Cカラム(Bio−Rad,Hercules,CA)を用いるHPLCによって定量した。使用したクロマトグラフィー条件は、カラム区画および検出器区画で85℃、サンプルおよびインジェクター区画で40℃、流量0.6mL/分および注入量10μLであった。データ整理のために使用したソフトウエアパッケージは、Waters(Waters Corp.,Milford,MA)製のEMPOWER(商標)バージョン3であった。較正は、各個別糖に対する様々な濃度の標準物質を用いて実施した。
可溶性オリゴ糖は、2基の直列Aminex HPX−42Aカラム(Bio−Rad)を用いるHPLCによって定量した。使用したクロマトグラフィー条件は、85℃のカラム温度および40℃の検出器区画温度、移動相としての水(流量0.6mL/分)および10μLの注入量であった。データ整理のために使用したソフトウエアパッケージは、Waters Corp.製のEMPOWER(商標)バージョン3であった。DP2〜DP7由来のオリゴ糖サンプルは、Sigma−Aldrich:マルトヘプタオース(DP7、製品番号47872)、マルトヘキサノース(DP6、製品番号47873)、マルトペントース(DP5、製品番号47876)、マルトテトラオース(DP4、製品番号47877)、イソマルトトリオース(DP3、製品番号47884)およびマルトース(DP2、製品番号47288)から入手した。較正は、様々な濃度の標準物質を用いて各個別オリゴ糖に対して実施した。
下記の実施例で記載するような添加ムタナーゼを含む、もしくは含まないグルコシルトランスフェラーゼ酵素を使用したスクロースの転換により精製される生成混合物中に存在する可溶性オリゴ糖オリゴマー/ポリマーを精製し、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)によって単離した。典型的な手技では、生成混合物を15分間〜30分間にわたり60℃〜90℃で熱処理し、その後に10分間にわたり4,000rpmで遠心分離した。生じた上清は、溶離液としての水を0.7mL/分で使用して、1.1LのBio−Gel P2 Gel(Bio−Rad,Fine 45〜90μm)が充填されたGE HK 50/60カラムと接続したAEKTAprime精製システム(SEC;GE Healthcare Life Sciences)(10mL〜50mLの注入量)に注入した。SEC分画(チューブ1本当たり約5mL)をBio−Rad HPX−47Aカラムを使用してオリゴ糖について分析した。>DP2のオリゴ糖を含有する分画を結合し、3重量/重量%〜6重量/重量%の固体を含有する溶液を生成するために結合分画の回転式蒸発によって可溶性オリゴマー/ポリマーを単離し、ここで生じた溶液は固体生成物としての可溶性オリゴマー/ポリマーを生成するために凍結乾燥させた。
大腸菌(E.coli)BL21(DE3)中でのムタナーゼmut3264 GI:257153264の生成
GENBANK(登録商標)においてGI:257153264(配列番号1)であると同定されたパエニバチルス・フミクス(Paenibacillus Humicus)NA1123由来のムタナーゼをコードする遺伝子は、GenScript(GenScript USA Inc.,Piscataway,NJ)によって合成された。タンパク質配列(「mut3264」;配列番号3)をコードするヌクレオチド配列(配列番号2)をpET24a(Novagen;Merck KGaA,Darmstadt,Germany)内にサブクローニングした。生じたプラスミドは、SGZY6と同定された菌株を生成するために大腸菌(E.coli)BL21(DE3)(Invitrogen)内に形質転換させた。この菌株を220rpmで振とうしながら37℃で約0.7のOD600へ増殖させ、次にこの温度を18℃へ低下させ、IPTGを0.4mMの最終濃度になるように添加した。培養を一晩増殖させ、その後に4,000gでの遠心分離によって採取した。600mLの培養由来の細胞ペレットを22mLの50mMのKPiバッファー(pH7.0)中に懸濁させた。細胞は、French Cell Press(15,000psi(103.4MPa)で2回の通過)によって破砕した;細胞残屑は40分間にわたる遠心分離(SORVALL(商標)SS34ローター、13,000rpmで;Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA)によって除去した。上清は、「mut3264」ムタナーゼの発現を確証するためにSDS−PAGEによって分析し、活性アッセイのためには粗抽出物を使用した。ムタナーゼ遺伝子を含まないコントロール菌株は、pET24aベクターを用いて大腸菌(E.coli)BL21(DE3)細胞を形質転換させることによって作成した。
枯草菌(B.subtilis)菌株BG6006株SG1021−1中でのムタナーゼmut3264 GI:257153264の生成
SG1021−1は、発酵大豆の納豆から単離されたパエニバチルス・フミクス(Paenibacillus humicus)NA1123由来のムタナーゼを発現する枯草菌(Bacillus subtilis)ムタナーゼ発現菌株である。枯草菌(B.subtilis)中での組換え発現のために、天然シグナルペプチドをバチルス(Bacillus)属AprEシグナルペプチド(GENBANK(登録商標)アクセッション番号AFG28208;配列番号4)と取り換えた。mut3264(配列番号5)をコードするポリヌクレオチドは、配列番号6として提供されたバチルス(Bacillus)属発現mut3264をコードするAprEシグナルペプチド(配列番号4)の下流で機能的に結合された。ポリヒスチジンタグをコードする配列の前に終止コドンを提供するために、C末端リシンを欠失させた。
ムタナーゼmut3325 GI:212533325の生成
GENBANK(登録商標)においてGI:212533325であると同定されたペニシリウム・マルネフェイ(Penicillium marneffei)ATCC(登録商標)18224(商標)ムタナーゼをコードする遺伝子は、GenScript(Piscataway,NJ)によって合成された。タンパク質配列(mut3325;配列番号8)をコードするヌクレオチド配列(配列番号7)は、選択のためにアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)アセトアミダーゼを用いて、CBHIプロモーターおよびターミネーターの制御下で、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)中で関心対象の遺伝子を発現させるために設計されたベクターであるプラスミドpTrex3(配列番号9)内にSacIIおよびAscI制限部位でサブクローニングした。生じたプラスミドは、上記の一般的方法の項に記載したようにバイオリスティック注入によってT.リーゼイ(reesei)内に形質転換させた。バイオリスティック形質転換の詳細な方法は、国際公開第2009/126773(A1)号パンフレットに記載されている。安定性クローンTRM05−3由来の胞子を含む1cm2の寒天プラグを使用して生成培地(下記で記載する)に接種した。この培養を28℃および220rpmで4〜5日間にわたり振とうフラスコ内で増殖させた。分泌タンパク質を採取するために、細胞塊を最初に10分間にわたる4,000gでの遠心分離によって除去し、上清を0.2μMの滅菌フィルターに通して濾過した。ムタナーゼmut3325の発現は、SDS−PAGEによって確証した。
発酵によるmut3325の生成
発酵種培養は、mut3325発現菌株TRM05−3の1.0mLの凍結胞子懸濁液を含む2Lのバッフル付きフラスコ内の0.5Lの最小培地を接種することによって調製した(実施例3)(最小培地は、5g/Lの硫酸アンモニウム、4.5g/Lの一塩基性リン酸カリウム、1.0g/Lの硫酸マグネシウム七水化物、14.4g/Lのクエン酸無水物、1g/Lの塩化カルシウム二水化物、25g/Lのグルコースならびに0.4375g/Lのクエン酸、0.5g/Lの硫酸鉄七水化物、0.04g/Lの硫酸亜鉛七水化物、0.008g/Lの硫酸銅五水化物、0.0035g/Lの硫酸マンガン一水和物および0.002g/Lのホウ酸を含む微量元素から構成された。pHは5.5であった)。この培養を32℃でおよび170rpmで48時間増殖させ、その後に14Lの発酵槽内の8Lの生成培地に移した。生成培地は、75g/Lのグルコース、4.5g/Lの一塩基性リン酸カリウム、0.6g/Lの塩化カルシウム脱水物、1.0g/Lの硫酸マグネシウム七水化物、7.0g/Lの硫酸アンモニウム、0.5g/Lのクエン酸無水物、0.5g/Lの硫酸鉄七水化物、0.04g/Lの硫酸亜鉛七水化物、0.00175g/Lの硫酸銅五水和物、0.0035g/Lの硫酸マンガン一水和物、0.002g/Lのホウ酸および0.3mL/Lのfoam blast 882から構成された。
大腸菌(E.coli)TOP10中でのGTF GI:51574154の生成
GENBANK(登録商標)においてgi:51574154(配列番号10)として同定されたラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)由来のgtf酵素の切断バージョンをコードする遺伝子は、大腸菌(E.coli)(DNA2.0,Menlo Park,CA)中での発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。pMP80として同定されたプラスミドを生成するために、タンパク質4154(配列番号12)をコードする核酸生成物(配列番号11)をPJEXPRESS404(登録商標)(DNA2.0,Menlo Park,CA))内にサブクローニングした。TOP10/pMP80として同定された菌株を生成するために、プラスミドpMP80を使用して大腸菌(E.coli)TOP10(Invitrogen,Carlsbad California)を形質転換させた。
GTF4154およびmut3264の組み合わせによって生成された可溶性オリゴ糖繊維の単離
10mMのリン酸カリウムバッファー(pH6.0)中の100g/Lのスクロース、GENBANK(登録商標)においてgi:51574154(実施例5)であると同定されたラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)由来のGTF酵素を含有する大腸菌(E.coli)粗タンパク質抽出物(1.0体積/体積%)およびパエニバチルス・フミカス(Paenibacillus humicus)由来のムタナーゼ(mut3264、gi:257153264;実施例1)を含む大腸菌(E.coli)粗タンパク質抽出物(1.0体積/体積%)を含有する1,000mLの反応を37℃で30時間攪拌し、次に酵素を不活性化するために15分間にわたり90℃へ加熱した。生じた生成混合物を遠心分離し、生じた上清を可溶性単糖類、二糖類およびオリゴ糖類についてHPLCによって分析し、次に132mLの上清はBioGel P2樹脂(BioRad)を用いるSECによって精製した。≧DP3のオリゴ糖類を含有したSEC分画を結合し、HPLCによる分析のために回転式蒸発によって濃縮した(表1)。
GTF4514およびデキストラナーゼの組み合わせによって生成された可溶性オリゴ糖繊維の単離
10mMのリン酸カリウムバッファー(pH6.5)中の100g/Lのスクロース、GENBANK(登録商標)においてgi:51574154(実施例5)として同定されたラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)由来のGTF酵素を含有する含む大腸菌(E.coli)粗タンパク質抽出物(1.0体積/体積%)および0.01体積/体積%のデキストラナーゼ(ケトミウム・エラチクム(Chaetomium erraticum)由来の1,6−α−D−グルカン6−グルカンヒドロラーゼ、Sigma社製品番号D−0443)を含有する1,200mLの反応を37℃で45時間攪拌し、次に酵素を不活性化するために15分間にわたり90℃へ加熱した。生じた生成混合物を遠心分離し、生じた上清を可溶性単糖類、二糖類およびオリゴ糖類についてHPLCによって分析し、次に上清はBioGel P2樹脂(BioRad)を用いるSECによって精製した。≧DP3のオリゴ糖類を含有したSEC分画を結合し、HPLCによる分析のために回転式蒸発によって濃縮した(表2)。
GTF4154とmut3264もしくはデキストラナーゼとの組み合わせによって生成された可溶性繊維のアノマー結合分析
実施例6および7において記載したように調製したクロマトグラフィー精製可溶性オリゴ糖オリゴマー/ポリマーの溶液を凍結乾燥によって一定重量まで乾燥させ、生じた固体を(上記の)一般的方法の項に記載した1H NMR分光法およびGC/MSによって分析した。これらの可溶性オリゴ糖オリゴマー/ポリマー混合物のそれぞれについてのアノマー結合は、表3および4に報告した。
GTF4154とmut3264もしくはデキストラナーゼとの組み合わせによって生成された可溶性繊維の粘度
実施例6および7において記載したように調製したクロマトグラフィー精製可溶性オリゴ糖オリゴマー/ポリマーの溶液を凍結乾燥によって一定重量まで乾燥させ、生じた固体を使用して蒸留脱イオン水中の可溶性オリゴマー/ポリマーの12重量%溶液を調製した。可溶性オリゴマー/ポリマー溶液の粘度(センチポイズ(cP)で報告したが、ここで1cP=1ミリパスカル秒(mPa/s))(表5)は、一般的方法の項で記載したように20℃で測定した。
GTF4154とmut3264もしくはデキストラナーゼとの組み合わせによって生成された繊維の分子量
実施例6および実施例7において記載したように調製したクロマトグラフィー精製可溶性オリゴ糖オリゴマー/ポリマーの溶液は凍結乾燥によって一定重量まで乾燥させ、生じた固体を一般的方法の項に記載したようにSECクロマトグラフィーによって数平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)、ピーク分子量(Mp)、z平均分子量(Mz)および多分散指数(PDI=Mw/Mn)について分析した(表6)。
枯草菌(BACILLUS SUBTILIS)中のGTF GI:51574154の生成
タンパク質GTF4154をコードする核酸生成物(配列番号11)は、隣接するNheI制限酵素部位およびHindIII制限酵素部位を備える大腸菌(E.coli)発現プラスミドpMP80から増幅させ、aprEプロモーター下で枯草菌(Bacillus subtilis)統合発現プラスミドp4JHのNheI部位およびHindIII部位内にクローニングし、ベクター上の枯草菌(B.subtilis)AprEシグナルペプチド(配列番号4)と融合させた。この構築物を最初に大腸菌(E.coli)DH10B内に形質転換させ、アンピシリン(100μg/mL)を含むLBプレート上で選択した。GTF4154を発現する確証した構築物pDCQ985を次に9つのプロテアーゼ欠失(amyE::xylRPxylAcomK−ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr−ybfJ、ΔnprB)を含有する枯草菌(B.subtilis)BG6006内に形質転換させ、クロラムフェニコール(5μg/ml)を含むLBプレート上で選択した。5μg/mLのクロラムフェニコールを含むLBプレート上で増殖させたコロニーは、25μg/mLのクロラムフェニコールを含むLBプレート上で数回画線した。生じた枯草菌(B.subtilis)発現菌株SG1185は、最初に25μg/mLのクロラムフェニコールを含むLBプレート上で増殖させ、次に2〜3日間にわたり30℃で増殖させた25μg/mLのクロラムフェニコールを含むGrantsII培地中に継代培養した。培養は4℃で30分間にわたり15,000gで回転させ、上清を0.22μmフィルターに通して濾過した。濾過した上清を等分し、−80℃で凍結した。
ナトリウムカルボキシメチルα−グルカンの調製
本実施例では、本明細書に記載したα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を使用して、グルカンエーテル誘導体であるカルボキシメチルグルカンを生成する工程について記載する。
カルボキシメチルα−グルカンを使用した粘度修飾
本実施例では、カルボキシメチルα−グルカンが水性組成物の粘度に及ぼす作用について記載する。
固体デキストランからのカルボキシメチルデキストランの調製
本実施例では、実施例15において使用するためのカルボキシメチルデキストランを調製する工程について記載する。
追加のカルボキシメチルデキストランナトリウムは、異なるMwのデキストランを使用して調製した。本実施例において調製したカルボキシメチルデキストランサンプルのDoS値は、表7に提供した。
剪断速度がカルボキシメチルデキストランの粘度に及ぼす作用
本実施例では、実施例14において調製したカルボキシメチルデキストランサンプルを含有する溶液の粘度および溶液の粘度に剪断速度が及ぼす作用について記載する。
カルボキシメチルα−グルカンの調製
本実施例では、実施例17において使用するためのカルボキシメチルグルカンを調製する工程について記載する。
カルボキシメチルα−グルカンを使用した粘度修飾
本実施例では、カルボキシメチルα−グルカンが水性組成物の粘度に及ぼす作用についあて記載する。
カルボキシメチルセルロースを使用した粘度修飾
本実施例では、カルボキシメチルセルロース(CMC)が水性組成物の粘度に及ぼす作用について記載する。
ダイレクトレッド80およびトルイジンブルーO染料についてのUV吸収を使用した較正曲線の作成
本実施例では、織物表面上へのグルカンエーテル誘導体の吸着の相対レベルを決定するために有用であろう較正曲線の作成について記載する。
第4級アンモニウムグルカンの調製
本実施例では、第4級アンモニウムグルカンエーテル誘導体を生成できるであろう方法について記載する。詳細には、トリメチルアンモニウムヒドロキシプロピルグルカンを生成することができる。
剪断速度が第4級アンモニウムグルカンの粘度に及ぼす作用
本実施例では、実施例22において調製したトリメチルアンモニウムヒドロキシプロピルグルカンの粘度に剪断速度が及ぼす作用について試験できる方法について記載する。このグルカンエーテル誘導体は、剪断減粘性もしくは剪断増粘性挙動を示すことが企図されている。
第4級アンモニウムグルカンの様々な織物への吸着
本実施例は、第4級アンモニウムグルカン(トリメチルアンモニウムヒドロキシプロピルグルカン)の様々なタイプの織物への吸着度を試験できる方法について開示する。
本α−グルカン繊維組成物の様々な織物への吸着
本実施例は、本α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物(未修飾)の様々なタイプの織物への吸着度を試験できる方法について開示する。
カルボキシメチルα−グルカン(CMG)の様々な織物への吸着
本実施例では、α−グルカンエーテル化合物(CMG)の様々なタイプの織物への吸着度を試験できる方法について開示する。
セルラーゼがカルボキシメチルグルカン(CMG)に及ぼす作用
本実施例では、カルボキシメチルセルロース(CMC)の安定性と比較して、セルラーゼの存在下で、α−グルカンエーテルであるCMGの安定性を試験する方法について開示する。セルラーゼに対する安定性は、例えば織物ケアにおけるようにセルラーゼ含有組成物/プロセスを使用するためのCMGの適用可能性を示すであろう。
セルラーゼがカルボキシメチルグルカン(CMG)に及ぼす作用
本実施例では、カルボキシメチルセルロース(CMC)の安定性と比較して、セルラーゼの存在下で、α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物(未修飾)の安定性を試験できる方法について開示する。セルラーゼに対する安定性は、例えば織物ケアにおけるようにセルラーゼ含有組成物/プロセスを使用するための本α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物の適用可能性を示すであろう。
ヒドロキシプロピルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるヒドロキシプロピルα−グルカンを生成する工程について記載する。
ヒドロキシエチルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるヒドロキシエチルポリα−グルカンを生成する工程について記載する。
エチルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるエチルグルカンを生成する工程について記載する。
エチルヒドロキシエチルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるエチルヒドロキシエチルグルカンを生成する工程について記載する。
メチルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるメチルグルカンを生成する工程について記載する。
ヒドロキシアルキルメチルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるヒドロキシアルキルメチルα−グルカンを生成する工程について記載する。
カルボキシメチルヒドロキシエチルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるカルボキシメチルヒドロキシエチルグルカンを生成する工程について記載する。
ナトリウムカルボキシメチルヒドロキシエチルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるナトリウムカルボキシメチルヒドロキシエチルグルカンを生成する工程について記載する。
カルボキシメチルヒドロキシメチルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるカルボキシメチルヒドロキシプロピルグルカンを生成する工程について記載する。
ナトリウムカルボキシメチルヒドロキシプロピルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるナトリウムカルボキシメチルヒドロキシプロピルグルカンを生成する工程について記載する。
カリウムカルボキシメチルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるカリウムカルボキシメチルグルカンを生成する工程について記載する。
リチウムカルボキシメチルα−グルカンの調製
本実施例では、グルカンエーテル誘導体であるリチウムカルボキシメチルグルカンを生成する工程について記載する。
ジヒドロキシアルキルα−グルカンの調製
本実施例では、α−グルカンのジヒドロキシアルキルエーテル誘導体を生成する工程について記載する。詳細には、ジヒドロキシプロピルグルカンを生成する。
Claims (26)
- 織物ケア組成物であって:
a.
i. 25〜35のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散指数、を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物;および
b. 少なくとも1つの追加の織物ケア成分
を含む織物ケア組成物。 - 洗濯ケア組成物であって:
a.
i. 25〜35のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散指数、を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物;および
b. 少なくとも1つの追加の洗濯ケア成分
を含む洗濯ケア組成物。 - 前記追加の成分は、少なくとも1つのセルラーゼである、請求項1に記載の織物ケア組成物または請求項2に記載の洗濯ケア組成物。
- 前記追加の成分は、少なくとも1つのプロテアーゼである、請求項1に記載の織物ケア組成物または請求項2に記載の洗濯ケア組成物。
- 前記可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物は、4%未満のα−(1,4)グリコシド結合を含む、請求項1に記載の織物ケア組成物または請求項2に記載の洗濯ケア組成物。
- 前記織物ケアもしくは洗濯ケア組成物は、0.01〜90%重量%の前記可溶性α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を含む、請求項1に記載の織物ケア組成物または請求項2に記載の洗濯ケア組成物。
- 前記少なくとも1つの追加の織物ケア成分は、界面活性剤(アニオン性、非イオン性、カチオン性もしくは両性イオン性)、酵素(任意の組み合わせで、プロテアーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ、リパーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペルヒドロラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼおよび/またはラッカーゼ)、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー(本α−グルカンオリゴマー/ポリマーおよび/またはα−グルカンエーテルに加えて)、防汚ポリマー、界面活性増強性ポリマー、漂白系、漂白活性剤、漂白触媒、織物コンディショナー、粘土、発泡増強剤、石鹸泡抑制剤(シリコーン系もしくは脂肪酸系)、防錆剤、汚れ懸濁剤、再汚染防止剤、染料、殺菌剤、変色防止剤、蛍光増白剤、香料、飽和もしくは不飽和脂肪酸、染料移動阻害剤、キレート剤、色相染料(hueing dye)、カルシウムおよびマグネシウムカチオン、視覚信号化成分(visual signaling ingredient)、消泡剤、構造剤、増粘剤、凝結防止剤、デンプン、砂、ゲル化剤およびそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の織物ケア組成物。
- 前記少なくとも1つの追加の洗濯ケア成分は、界面活性剤(アニオン性、非イオン性、カチオン性もしくは両性イオン性)、酵素(任意の組み合わせで、プロテアーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ、リパーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペルヒドロラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼおよび/またはラッカーゼ)、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー(本α−グルカンオリゴマー/ポリマーおよび/またはα−グルカンエーテルに加えて)、防汚ポリマー、界面活性増強性ポリマー、漂白系、漂白活性剤、漂白触媒、織物コンディショナー、粘土、発泡増強剤、石鹸泡抑制剤(シリコーン系もしくは脂肪酸系)、防錆剤、汚れ懸濁剤、再汚染防止剤、染料、殺菌剤、変色防止剤、蛍光増白剤、香料、飽和もしくは不飽和脂肪酸、染料移動阻害剤、キレート剤、色相染料、カルシウムおよびマグネシウムカチオン、視覚信号化成分、消泡剤、構造剤、増粘剤、凝結防止剤、デンプン、砂、ゲル化剤およびそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項2に記載の洗濯ケア成分。
- 前記組成物は、液体、ジェル、粉末、親水コロイド、水溶液、顆粒、タブレット、カプセル、単一区画小袋、多区画小袋またはそれらの任意の組み合わせの形態にある、請求項1に記載の織物ケア組成物または請求項2に記載の洗濯ケア組成物。
- 前記α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物は、セルラーゼ耐性、プロテアーゼ耐性またはそれらの組合せである、請求項1に記載の織物ケア組成物または請求項2に記載の洗濯ケア組成物。
- グルカンエーテル組成物であって:
a. 25〜35のα−(1,3)グリコシド結合;
b. 55〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
c. 5〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
d. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
e. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;f. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
g. 5未満の多分散性指数、を含み、前記少なくとも1つの有機基との約0.05〜約3.0の置換度(DoS)
を有するグルカンエーテル組成物。 - 前記組成物は、少なくとも1つの有機基との約0.05〜約3.0の置換度(DoS)を有する、請求項11に記載のグルカンエーテル組成物。
- 前記少なくとも1つの有機基は、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基およびアルキル基からなる群から選択される、請求項11に記載のグルカンエーテル組成物。
- 前記少なくとも1つの有機基は、カルボキシメチル基、ヒドロキシプロピル基、ジヒドロキシプロピル基、ヒドロキシエチル基、メチル基およびエチル基からなる群から選択される、請求項11に記載のグルカンエーテル組成物。
- 少なくとも1つの有機基は、正荷電有機基である、請求項11に記載のグルカンエーテル組成物。
- 前記グルカンエーテルは、第4級アンモニウムグルカンエーテルである、請求項11に記載のグルカンエーテル組成物。
- 前記第4級アンモニウムグルカンエーテルは、トリメチルアンモニウムヒドロキシプロピルグルカンである、請求項16に記載のグルカンエーテル組成物。
- 前記グルカンエーテル組成物は、セルラーゼ耐性、プロテアーゼ耐性、アミラーゼ耐性もしくはそれらの任意の組み合わせである、グルカンエーテル組成物11。
- 請求項11に記載の前記グルカンエーテル組成物を含む、パーソナルケア組成物、織物ケア組成物もしくは洗濯ケア組成物。
- 衣料品、布地もしくは織物を処理する方法であって;
a.
i. 請求項1に記載の前記織物ケア組成物;
ii. 請求項2に記載の前記洗濯ケア組成物;
iii. 請求項11に記載の前記グルカンエーテル組成物;
iv.
1. 25〜35のα−(1,3)グリコシド結合;
2. 55〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
3. 5〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
4. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
5. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
6. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
7. 5未満の多分散指数、を含む前記α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物;および
v. (i)〜(iv)の任意の組み合わせ、から選択される組成物を提供する工程;b. 好適な条件下で(a)の前記組成物を織物、布地もしくは衣料品と接触させる工程であって、これにより前記織物、布地もしくは衣料品が処理されて利益を得る工程;
c. 任意選択的に、(b)の前記処理された織物、布地もしくは衣料品をすすぎ洗う工程、を含む方法。 - (a)の前記組成物は、セルラーセ耐性、プロテアーゼ耐性、アミラーゼ耐性もしくはそれらの組み合わせである、請求項20に記載の方法。
- 前記α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物もしくは前記α−グルカンエーテル組成物は、表面実質的である、請求項20に記載の方法。
- 前記利益は、改良された織物の風合、汚れ沈着に対する改良された抵抗性、改良された色堅牢度、改良された耐摩耗性、改良された防しわ性、改良された抗真菌活性、改良された染み抵抗性、洗濯した場合の改良されたクリーニング性能、改良された乾燥速度、改良された染料、顔料もしくはレーキ更新およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
- グルカンエーテル組成物を生成するための方法であって:
a.
i. 25〜35のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散指数、を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を提供する工程;
b. アルカリ性条件下の反応中で(a)の前記α−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物を1つの有機基を含む少なくとも1種のエーテル化剤と接触させる工程であって;それにより少なくとも1つの有機基との約0.05〜約3.0の置換度(DoS)を有するα−グルカンエーテルが生成される工程;および
c. 任意選択的に工程(b)において生成された前記α−グルカンエーテルを単離する工程、を含む方法。 - 前記有機基は、ヒドロキシアルキル基、アルキル基もしくはカルボキシアルキル基である、請求項24に記載の方法。
- 布地、糸、織物もしくは繊維であって:
a.
i. 25〜35のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散指数、を含むα−グルカンオリゴマー/ポリマー組成物;
b.
i. 25〜35のα−(1,3)グリコシド結合;
ii. 55〜75%のα−(1,6)グリコシド結合;
iii. 5〜15%のα−(1,3,6)グリコシド結合;
iv. 5,000ダルトン未満の重量平均分子量;
v. 20℃の水中において12重量%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
vi. 25℃の水中において少なくとも20重量/重量%の溶解度;および
vii. 5未満の多分散指数、を含むグルカンエーテル組成物であって;ここで少なくとも1つの有機基との約0.05〜約3.0の置換度(DoS)を有する前記グルカンエーテル組成物;または
c. それらの任意の組合せ、を含む布地、糸、織物もしくは繊維。
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