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ES2539955T3 - Celulasa tolerante a los tensioactivos y procedimiento de modificación de la misma - Google Patents

Celulasa tolerante a los tensioactivos y procedimiento de modificación de la misma Download PDF

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ES2539955T3
ES2539955T3 ES10180094.4T ES10180094T ES2539955T3 ES 2539955 T3 ES2539955 T3 ES 2539955T3 ES 10180094 T ES10180094 T ES 10180094T ES 2539955 T3 ES2539955 T3 ES 2539955T3
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ES
Spain
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amino acid
protein
stce1
nce4
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ES10180094.4T
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English (en)
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Manabu Watanabe
Koji Yanai
Yumiko Tsuyuki
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Meiji Seika Pharma Co Ltd
Original Assignee
Meiji Seika Pharma Co Ltd
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Abstract

Una combinación de un polinucleótido y una célula huésped, en la que el polinucleótido está seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 37 o 39; (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos en la que de 1 a 90 nucleótidos han sido eliminados, sustituidos, insertados o añadidos en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 37 o 39 y que codifica una proteína en la que el extremo N-terminal es ácido glutámico o glutamina y que tiene una actividad endoglucanasa; y (c) un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 37 o 39 y que codifica una proteína en la que el extremo N-terminal es ácido glutámico o glutamina y que tiene una actividad endoglucanasa, y en la que la célula huésped es un huésped en el que se lleva a cabo la formación de piroglutamato del aminoácido N-terminal.

Description

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técnicos comunes de los expertos en la técnica. En este caso, la síntesis puede llevarse a cabo utilizando parte de una proteína de origen natural.
Proteína de la presente invención
La proteína de la presente invención se prepara por la modificación del extremo N-terminal de una proteína original que tiene una actividad endoglucanasa a ácido piroglutámico [por ejemplo, preparada por la obtención de celulasa perteneciente a la familia 45 y la adición de ácido piroglutámico (pQ) o un péptido que contiene ácido piroglutámico al lado del aminoácido N-terminal de la proteína madura de la misma] y tiene una actividad endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña. Además, la presente invención incluye una proteína que se puede preparar por el procedimiento descrito anteriormente y tiene una actividad endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña.
Más concretamente, la proteína de la presente invención incluye una proteína seleccionada del grupo que consiste en las siguientes proteínas:
(a)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 38 o 40;
(b)
una proteína modificada que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se han eliminado, sustituido, insertado o añadido en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 38 o 40 y que tiene una actividad endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña; y
(c)
una proteína homóloga que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de homología con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 38 o 40 y que tiene una actividad endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de NCE4 modificada en el extremo N-terminal (véase Ejemplo A2) en la que se añade un péptido que consiste en cinco aminoácidos (Nterminal: ácido piroglutámico) al extremo N-terminal de la endoglucanasa NCE4 derivada de Humicola insolens MN200-1.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de STCE1 modificada en el extremo N-terminal (véase Ejemplo B2) en la que se sustituye el aminoácido N-terminal (Ala) de la endoglucanasa STCE1 derivada de Staphylotrichum coccosporum IFO 31817 por un péptido que consiste en cuatro aminoácidos (N-terminal: ácido piroglutámico).
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 es la secuencia de aminoácidos de la STCE1 modificada en el extremo N-terminal (véase Ejemplo B3) en la que se añade ácido piroglutámico al extremo N-terminal de la endoglucanasa STCE1 derivada de Staphylotrichum coccosporum IFO 31817.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 es la secuencia de aminoácidos de la STCE1 modificada en el extremo N-terminal (véase Ejemplo B4) en la que se añade un péptido que consiste en cuatro aminoácidos (Nterminal: ácido piroglutámico) al extremo N-terminal de la endoglucanasa STCE1 derivada de Staphylotrichum coccosporum IFO 31817.
El término “proteína modificada” como se utiliza en el presente documento significa una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o una pluralidad de aminoácidos (por ejemplo, uno o varios aminoácidos) se han eliminado, sustituido, insertado o añadido en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 38 o 40 y que tiene una actividad endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña. El número de aminoácidos a modificar, tal como “eliminar, sustituir, insertar o añadir”, es de preferencia de 1 a 30, de más preferencia de 1 a 10, de la mayor preferencia de 1 a 6.
Además, la proteína modificada incluye una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos están sustituidos de manera conservadora en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 38 o 40 y que tiene una actividad endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña. La expresión “sustitución conservadora” como se utiliza en el presente documento significa que uno o varios residuos de aminoácidos contenidos en una proteína están sustituidos con diferentes aminoácidos que tienen propiedades químicas similares de modo que las actividades de la proteína no se modifican sustancialmente. Como sustitución conservadora, se pueden citar, por ejemplo, una sustitución de un residuo de aminoácido hidrófobo por otro residuo de aminoácido hidrófobo, o la sustitución de un residuo de aminoácido polar por otro residuo de aminoácido polar que tiene la misma carga. Los aminoácidos que tienen propiedades químicas similares y que pueden estar sustituidos de manera conservadora entre sí son conocidos por los expertos en la técnica. Más en particular, como aminoácidos no polares (hidrófobos), se pueden citar, por ejemplo, alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptófano, fenilalanina o metionina. Como aminoácidos polares (neutros), se pueden citar, por ejemplo, glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina o cisteína. Como aminoácidos básicos que tienen una carga positiva, se pueden citar, por ejemplo, arginina, histidina o lisina. Como aminoácidos ácidos que tienen una carga negativa, se pueden citar, por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico.
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La expresión “proteína homóloga”, como se utiliza en el presente documento significa una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % (de preferencia el 90 % o más, de la mayor preferencia el 95 % o más) de homología (identidad de secuencia) con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 38 o 40 y que tiene una actividad endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña. La homología como se utiliza en el presente documento se muestra como el valor (identidad) calculado por FASTA3 [Science, 227, 1435-1441 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85, 2444-2498 (1988); http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html], un programa de búsqueda de homología conocido, de conformidad con los parámetros por defecto.
Como se describió anteriormente, en la “proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2” de la presente invención, la porción salvo el péptido N-terminal que consiste en cinco aminoácidos deriva de la endoglucanasa NCE4. Además, en la “proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, 38 o 40” de la presente invención, la porción salvo el aminoácido o péptido N-terminal deriva de la endoglucanasa STCE1. Las endoglucanasas NCE4 y STCE1 pertenecen a la familia 45. Como endoglucanasa conocida perteneciente a la familia 45, se pueden citar, por ejemplo, NCE5 derivada del género Humicola (documento WO01/90375).
En las figuras 1 y 2, se muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de la endoglucanasa STCE1 [péptido señal (SEQ ID NO: 43) y proteína madura (SEQ ID NO: 44)], la endoglucanasa NCE4 [péptido señal (SEQ ID NO: 45) y proteína madura (SEQ ID NO: 46)] y la endoglucanasa NCE5 [péptido señal (SEQ ID NO: 47) y proteína madura (SEQ ID NO: 48)].
La figura 1 muestra la alineación de la mitad N-terminal y la Figura 2 muestra la de la mitad C terminal. El símbolo “*” en las figuras 1 y 2 indica un aminoácido común al de STCE1.
Como se muestra en las figuras 1 y 2, las endoglucanasas pertenecientes a la familia 45 contienen el dominio catalítico (1º a 207º) como un dominio común y a veces contienen la región conectora (208º a 258º) y/o el dominio de unión a la celulosa (CDB) (259º a 295º). En este sentido, los números entre paréntesis después de los dominios anteriores representan el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 44) de la endoglucanasa STCE1.
En cada región, hay muchos aminoácidos conservadores entre dos o más endoglucanasas en el dominio catalítico y el dominio de unión a la celulosa, pero no se observa ninguna región conservadora notable en la región del conector. Las regiones que contienen muchos aminoácidos conservadores (por ejemplo, el dominio catalítico o el dominio de unión a la celulosa, en particular, el dominio catalítico), o aminoácidos comunes contenidos en las regiones son consideradas regiones o aminoácidos importantes para la actividad enzimática de las endoglucanasas (tales como STCE1 o NCE4). Por lo tanto, cuando se lleva a cabo una modificación de aminoácidos (por ejemplo, eliminación, sustitución, inserción y/o adición, en particular, sustitución conservadora) en una región o un aminoácido distinto de tales regiones o aminoácidos importantes, puede obtenerse con una alta posibilidad y sin excesiva experimentación una proteína modificada u homóloga que mantiene la actividad de la enzima.
Además, incluso cuando tiene lugar en las regiones que contienen muchos aminoácidos conservadores, una modificación de un aminoácido o aminoácidos no comunes entre dos o más endoglucanasas a aminoácido(s) diferente(s) [de preferencia aminoácido(s) que son similares y que pueden estar sustituidos de manera conservadora] probablemente podrá mantener la actividad de la enzima. Por lo tanto, por una de tales modificaciones, puede obtenerse una proteína modificada u homóloga que mantiene la actividad de la enzima con una alta probabilidad, sin experimentación excesiva.
En relación con lo anterior, incluso si aminoácido(s) común/comunes en la región que contiene muchos aminoácidos conservadores se modifica(n) a aminoácido(s) diferente(s), la actividad de la enzima a veces se mantiene. En particular, en una modificación a aminoácido(s) que es/son similar(es) y que puede(n) estar sustituido(s) de manera conservadora, la posibilidad se incrementa. La proteína modificada u homóloga de la presente invención incluye una proteína en la que uno o más aminoácidos contenidos en cualquier región, tal como el dominio catalítico, la región conectora o el dominio de unión a la celulosa, se modifican, con la condición de que presente una actividad endoglucanasa.
Polinucleótido que codifica la proteína de la presente invención
De acuerdo con la presente invención, se puede proporcionar un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO 2, 4, 38 o 40, o una de sus proteínas modificadas u homólogas (en adelante denominadas colectivamente como la proteína de la presente invención). Cuando se da la secuencia de aminoácidos de una proteína, se puede seleccionar fácilmente una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos y por lo tanto pueden seleccionarse diversas secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de la presente invención. El término “polinucleótido” como se utiliza en el presente documento, incluye ADN y ARN y resulta de preferencia el ADN.
El polinucleótido de la presente invención incluye un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los siguientes polinucleótidos:
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Patentes Internacionales de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzadas [(Nombre anterior) Instituto Nacional de Biocencia y Agencia de Tecnología Humana de Ciencia y Tecnología Industrial (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón)] el 15 de julio de 1996 y se trasladó a un depósito internacional el 13 de junio de 1997. El número de depósito internacional (un número entre paréntesis [] después del número de depósito internacional es un número de depósito nacional) es FERM BP-5977 [FERM P-15736].
Se depositó la cepa de Trichoderma viride MC300-1 (FERM BP-6047), que puede ser utilizada como huésped para el vector de expresión de la presente invención, en el país en el Instituto Nacional Depositario de Organismos de Patentes Internacionales de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzadas [(Nombre anterior) Instituto Nacional de Biocencia y Agencia de Tecnología Humana de Ciencia y Tecnología Industrial (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón)] el 9 de septiembre de 1996 y se trasladó a un depósito internacional el 11 de agosto de 1997. El número de depósito internacional (un número entre paréntesis [] después del número de depósito internacional es un número de depósito nacional) es FERM BP-6047 [FERM P15842].
Se depositó la cepa de Escherichia coli DH5α transformada con el vector de expresión pUC118-STCEex (FERM BP10127) en el país en el Instituto Nacional Depositario de Organismos de Patentes Internacionales de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzadas (Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón) el 1 de diciembre de 2003 y se trasladó a un depósito internacional el 15 de septiembre de 2004. El número de depósito internacional (un número entre paréntesis [] después del número de depósito internacional es un número de depósito nacional) es FERM BP-10127 [FERM P-19602]. En relación con lo anterior, el plásmido pUC118-STCEex es un plásmido obtenido por la inserción del gen de STCE en el sitio BamHI del plásmido pUC118. El gen de la endoglucanasa STCE1 presente en el fragmento BamHI contiene un intrón y tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 5.
Ejemplos
La presente invención ahora se ilustrará con más detalle por, pero de ningún medio está limitada a, los siguientes Ejemplos.
Ejemplo A1: Construcción de vectores de expresión para expresar celulasa modificada en su extremo Nterminal y celulasa de tipo natural en Humicola insolens
(1) Construcción del vector de expresión pMKD01 para expresar celulasa modificada en su extremo N-terminal
El plásmido pUC118 (Takara Bio) se digirió con BamHI. Se generaron extremos romos en el fragmento resultante con un kit de generación de extremos romos de ADN (Takara Bio) y se auto-unió con un kit de unión de ADN (Takara Bio) para obtener pUC118-BN. El pUC118-BN se digirió con SphI, se generaron extremos romos y se autounió para obtener pUC118BSN. A continuación, se obtuvo un fragmento PstI-XbaI de 3,4 kb que comprendía el gen de celulasa NCE2 a partir de Humicola insolens MN200-1 (FERM BP-5977) según el procedimiento descrito en la Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) N.º: 8-126492. El fragmento se unió con pUC118BSN previamente digerido con la misma enzima de restricción para obtener pUC118BSN-PX. Se introdujo la mutación dirigida al sitio en pUC118BSN-PX con un sistema de mutagénesis in vitro Sculptor (Amersham Bioscience) para obtener el plásmido pM21. Como oligonucleótidos para la mutagénesis, se usaron los oligonucleótidos MNC-02 y MNC-03.
MNC-02: 5'-GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAATG-3' (SEQ NO: 6)
MNC-03: 5'-TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3' (SEQ NO: 7)
El plásmido pM21 se digirió utilizando con BamHI y se unió con un fragmento de PCR digerido con BamHI de un gen de celobiohidrolasa (NCE3) derivado de Humicola insolens MN200-1 para obtener el plásmido pKM04. El fragmento de PCR de NCE3 se amplificó utilizando ADN genómico (documento WO98/03640) de Humicola insolens MN200-1 (FERM BP-5977) como un molde y los siguientes cebadores MKA-05 y MKA-06.
MKA-05: 5'-GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAGG-3' (SEQ NO: 8)
MKA-06: 5'-TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCAC-3' (SEQ NO: 9)
A continuación, se utilizaron un promotor y un terminador (Mullaney, EJ y col., Mol. Gen. Genet., 199, 37-45, 1985) del gen trpC derivado de Aspergillus nidulans para preparar un gen capaz de expresar un gen de resistencia a la destomicina en Humicola insolens. El gen resultante se unió con el plásmido pKM04 previamente digerido con XbaI para construir el vector de expresión pMKD01 (FERM BP-5974) para expresar la celulasa modificada en el extremo N-terminal. En pMKD01, se introdujeron los sitios de reconocimiento de BamHI a 10 pb secuencia abajo del extremo N-terminal de la proteína madura del gen de NCE2 y a 3 pb secuencia abajo del codón de parada del mismo y por lo tanto se pueden añadir cinco residuos de aminoácidos al extremo N-terminal de una celulasa deseada perteneciente a la familia 45.
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(2) Construcción del vector de expresión pJD01 para expresar la celulasa de tipo natural
Se introdujo la mutación dirigida al sitio utilizando el oligonucleótido pMN-Bam en el plásmido pM21 obtenido en el punto anterior (1) para obtener el plásmido pM21-m-A1.
pMN-Bam:
5'-GGTCAAACAAGTCTGTGCGGATCCTGGGACAAGATGGCCAAGTTCTTCCTTAC-3' (SEQ NO: 12)
El plásmido pM21-m-A1 se digirió con las enzimas de restricción HindIII y BamHI y se recuperó el fragmento resultante de aproximadamente 1 kb. A continuación, el pMKD01 obtenido en el Ejemplo A1(1) se digirió con HindIII y BamHI y se recuperó un fragmento de aproximadamente 7 kb. Estos fragmentos se unieron para obtener el plásmido pJD01. En este vector, se introdujeron los sitios de reconocimiento de BamHI a 15 pb secuencia arriba del sitio de iniciación de la traducción del gen de NCE2 y a 3 pb secuencia abajo del codón de parada del mismo y por consiguiente se expresó una celulasa deseada perteneciente a la familia 45 desde el punto de iniciación de la transcripción.
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(1) Construcción de los vectores de expresión
Como un vector de expresión para NCE4 de tipo natural, se unió la región codificadora del gen de NCE4 con pJD01 obtenido en el Ejemplo A1(2) para construir pN2EX-N4.
En primer lugar, se amplificó la región codificadora del gen de NCE4 por PCR utilizando ADN genómico de Humicola insolens MN200-1 como un molde y NCE4-Ne y NCE4-Ce como cebadores. El producto de PCR resultante de aproximadamente 0,9 kpb se digirió con BamHI y se unió con pJD01 previamente digerido con la misma enzima de restricción para construir pN2EX-N4.
NCE4-Ne: 5'-GGGGGGATCCTGGGACAAGATGCGTTCCTCCCCTCTC-3' (SEQ NO: 15)
NCE4-Ce: 5'-GGGGGGATCCCTGCGTTTACAGGCACTGATGG-3' (SEQ NO: 16)
Como un vector de expresión para NCE4 modificada en su extremo N-terminal, se unió la región codificadora de la proteína madura en la que se eliminó la secuencia señal para la secreción en el gen de NCE4 con pMKD01 (FERM BP-5974) obtenido en el Ejemplo A1(1) para construir pEGD01 (FERM BP-5973). En primer lugar, se amplificó la región codificadora de la parte de la proteína madura del gen de NCE4 llevando a cabo PCR utilizando ADN genómico de Humicola insolens MN200-1 como molde y NCE4-Ns y NCE4-Cs como cebadores. El producto de PCR resultante de aproximadamente 0,8 kpb se digirió con BamHI y se unió con pMKD01 previamente digerido con la misma enzima de restricción para la construcción del pEGD01.
NCE4-Ns: 5'-CCGGTGTTGGCCGGATCCGCTGATGGCAAG-3' (SEQ NO: 17)
NCE4-Cs: 5'-TAAGGCCCTCAAGGATCCCTGCGTCTACAG-3' (SEQ NO: 18)
(2) Transformantes que contienen NCE4 de tipo natural o NCE4 modificada en su extremo N-terminal
Se cultivó Humicola insolens MN200-1 en un medio S (glucosa al 3,0 %, extracto de levadura al 2,0 %, polipeptona al 0,1 %, cloruro de calcio al 0,03 % y sulfato de magnesio al 0,03 %; pH 6,8) a 37 ºC durante 24 horas. Los micelios resultantes se recogieron por centrifugación, se lavaron con sacarosa 0,5 mol/l y se suspendieron en solución de
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sacarosa 0,5 mol/l que contenía β-glucuronidasa 3 mg/ml (Sigma), quitinasa 1 mg/ml y zimoliasa 20T 1 mg/ml (Seikagaku Corp.). La suspensión se agitó suavemente a 30 ºC durante 60 a 90 minutos para generar protoplastos. Los protoplastos resultantes se recogieron por filtración y centrifugación, se lavaron con un tampón SUTC (sacarosa 0,5 mol/l, cloruro de calcio 10 mmol/l y Tris-HCl 10 mmol/l, pH 7,5) y se resuspendieron en SUTC para preparar una suspensión de protoplastos.
A 100 µl de la suspensión de protoplastos, se añadieron 10 µl de cada solución de ADN (pEGD01 o pN2EX-N4). Tras dejar en reposo cada una en hielo durante 5 minutos, se añadieron 400 µl de una solución de PEG (polietilenglicol 4000 al 60 %, cloruro de calcio 10 mmol/l y Tris-HCl 10 mmol/l, pH 7,5) y todo se dejó en reposo sobre hielo durante 20 minutos. Después de lavar la suspensión de protoplastos resultante con el tampón SUTC, se cubrió la suspensión de protoplastos con un medio YMG (glucosa al 1 %, extracto de levadura al 0,4 %, extracto de malta al 0,2 % y agar al 1 %, pH 6,8) que contenía higromicina B 200 µg/ml junto con agar blando YMG. La placa se incubó a 37 ºC durante 5 días para obtener los transformantes como colonias.
(3) Comparación de las actividades endoglucanasa de NCE4 de tipo natural y NCE4 modificada en su extremo Nterminal en los sobrenadantes de los cultivos
Los transformantes resultantes se cultivaron según el procedimiento descrito en el documento WO98/03667, para obtener los sobrenadantes de los cultivos. Los sobrenadantes de los cultivos se sometieron a SDS-PAGE para seleccionar los sobrenadantes de cultivo en los que se detectaba con claridad la banda de NCE4 de aproximadamente 43 kDa. Se midieron las actividades endoglucanasa en los sobrenadantes del cultivo a pH 10 en ausencia y con presencia de LAS y se compararon los grados de reducción en la actividad en presencia de LAS. Los resultados se muestran en la Tabla 3. En la tabla 3, se representan las actividades endoglucanasa por porcentajes cuando cada actividad endoglucanasa a pH 10 se considera como 100.
Tabla 3
Vector de expresión EGU (%) Sin LAS Con LAS
NCE de tipo natural pN2EX-N4 100 27,1
NCE modificada en su extremo N-terminal pEGD01 100 55,6
Como resultado, el sobrenadante del cultivo obtenido a partir del transformante de NCE4 modificada en su extremo N-terminal mostró una pequeña reducción de la actividad en presencia de LAS. Tras una comparación de las actividades endoglucanasa en presencia de LAS, se encontró que la actividad endoglucanasa de NCE4 modificada en su extremo N-terminal fue 2,1 veces mayor que la de NCE4 de tipo natural. Además, la actividad endoglucanasa de Humicola insolens MN200-1 representó aproximadamente el 4 % de los transformantes, por consiguiente se encontró que casi todas las actividades endoglucanasa derivaron de las enzimas recombinantes expresadas por los vectores de expresión incorporados.
(4) Análisis de las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal de NCE4 de tipo natural y de NCE4 modificada en su extremo N-terminal
Los sobrenadantes de los cultivos de los transformantes anteriores se sometieron a SDS-PAGE y las proteínas sometidas a electroforesis se transfirieron eléctricamente a una membrana de PVDF (Immobilon-PSQ, Millipore). Las bandas de NCE4 de aproximadamente 43 kDa se recortaron de la mancha y se sometieron al secuenciador Protein Sequencer Model 492 (Applied Biosystems) para analizar las secuencias de aminoácidos.
Como resultado, se confirmó que la secuencia de NCE4 de tipo natural obtenida del transformante pN2EX-N4 era coherente con la secuencia de ADN de NCE4 derivada de Humicola insolens MN200-1 descrita en el documento WO98/03667.
Sin embargo, la secuencia de aminoácidos de NCE4 modificada en su extremo N-terminal obtenida a partir del transformante de pEGD01 no pudo determinarse en el procedimiento anterior. Se utilizó una piroglutamato aminopeptidasa Pfu (Takara Bio) para eliminar el extremo N-terminal modificado a partir de NCE4 modificada en su extremo N-terminal y a continuación se determinó el aminoácido (SEQ NO: 2).
Los resultados se resumieron en la Tabla 4, para comparar los aminoácidos del extremo N-terminal y las secuencias de aminoácidos de extremo N-terminal en NCE4 de tipo natural y en NCE4 con el extremo N-terminal añadido y se confirmó a partir de los resultados que cada NCE4 tenía la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal esperada del correspondiente vector de expresión construido.
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(1) Construcción de los vectores de expresión
Como un vector de expresión para STCE1 de tipo natural, se unió la región codificadora del gen de STCE1 con el plásmido pCB1-M2 obtenido en el Ejemplo B1 para la construcción del pCB-Ste.
En primer lugar, se amplificó la región codificadora del gen de STCE1 por PCR utilizando el plásmido pUC118-STCEex (FERM BP-10127) como molde y la combinación de cebadores STCE1-TNERV y STCE1-TCET22I. El producto resultante de la PCR de aproximadamente 1 kpb se digirió con EcoRV y EcoT22I y se unió con pCB1-M2 previamente digerido con StuI y PstI para la construcción del PCB-Ste.
STCE1-TNERV: GGGGATATCGCGCATCATGCGTTCCTCCCCCGTCCTC (SEQ NO: 30)
STCE1-TCET22I: GGGATGCATTTAAAGGCACTGCGAGTACCAGTC (SEQ NO: 31)
Como un vector de expresión para STCE1 modificada en el extremo N-terminal, la región codificadora de la proteína madura en la que se había eliminado la secuencia señal para la secreción en el gen de STCE1, se unió con pCB1-M2 obtenido en el Ejemplo B1 para la construcción del PCB-Sts.
En primer lugar, se amplificó la región codificadora de la proteína madura del gen de STCE1 por PCR utilizando el plásmido pUC118-STCEex (FERM BP-10127) como un molde y STCE1-TmNSph y STCE1-TCET22I como cebadores. El producto de la PCR resultante de aproximadamente 1 kpb se digirió con SphI y EcoT22I y se unió con pCB1-M2 previamente digerido con SphI y PstI para la construcción del PCB-Sts.
STCE1-TmNSph: GGGGCATGCGATGGCAAGTCGACCCGCTAC (SEQ NO: 32)
(2) Generación de la cepa 2 de Trichoderma viride
Se irradió una suspensión de esporas (aproximadamente 109 UFC/ml) de Trichoderma viride MC300-1 (FERM BP6047) con UV de dos lámparas UV colocadas a una altura de 30 cm por encima de la misma mientras que se agitaba suavemente. La suspensión se extendió en un medio de selección y se cultivó a 28 ºC durante 7 días. Las cepas cultivadas se seleccionaron obteniéndose la cepa 2 de Trichoderma viride que mostraba requerimiento de uracilo.
Al respecto, el medio de selección era un medio mínimo [dihidrogenofosfato de potasio al 0,2 %, sulfato de amonio al 0,4 %, urea al 0,03 %, sulfato de magnesio heptahidratado al 0,03 %, cloruro de calcio al 0,03 %, glucosa al 0,5 %, agar al 2,5 % y oligoelementos al 0,01 % (preparados por la solución de 5 mg de sulfato de hierro heptahidratado, 1,56 mg de sulfato de manganeso heptahidratado, 1,4 mg de sulfato de cinc heptahidratado y 2 mg de cloruro de cobalto en 1 litro de agua)] suplementado con uridina 10 µg/ml y ácido 5-fluoroorótico 1 mg/ml.
(3) Transformantes que contienen STCE1 de tipo natural o STCE1 modificada en su extremo N-terminal
Se transformó Trichoderma viride con pCB-Ste o pCB-Sts obtenidos en el Ejemplo B2(1), llevando a cabo un procedimiento de co-transformación utilizando la cepa 2 de Trichoderma viride obtenida en el Ejemplo B2(2) y el plásmido marcador pPYR4 que contenía el gen pyr4 derivado de Neurospora crassa, para obtener los transformantes como cepas cultivadas en el medio mínimo.
En primer lugar, se inoculó la cepa 2 de Trichoderma viride en un matraz cónico de 200 ml que contenía 50 ml de un medio de formación de micelios [extracto de levadura al 1 %, extracto de malta al 1 %, polipeptona al 2 %, glucosa al 2,5 %, hidrogenofosfato dipotásico al 0,1 %, sulfato de magnesio heptahidratado al 0,05 % y uridina al 0,0001 % (pH 7,0)] y se cultivó a 28 ºC durante 2 días. Las células resultantes se recogieron por centrifugación, se lavaron con sacarosa 0,5 mol/l y se suspendieron en solución de sacarosa 0,5 mol/l que contenía β-glucuronidasa 3 mg/ml (Sigma), quitinasa 1 mg/ml y zimoliasa 20T 1 mg/ml (Seikagaku Corp.). La suspensión se agitó suavemente a 30 ºC durante 60 a 90 minutos para generar protoplastos. Los protoplastos resultantes se recogieron por filtración y centrifugación, se lavaron con tampón SUTC y se resuspendieron en SUTC para preparar una suspensión de protoplastos.
A 100 µl de la suspensión de protoplastos, se le añadieron 10 µl de cada solución de ADN (pCB-Ste o pCB-Sts). Tras dejar cada una en reposo sobre hielo durante 5 minutos, se añadieron 400 µl de la solución de PEG y se dejó todo en reposo sobre hielo durante 20 minutos. Tras lavar la suspensión de protoplastos resultante con el tampón SUTC, se cubrió el medio mínimo que contenía 0,5 mol/l de sacarosa con la suspensión de protoplastos junto con agar blando. La placa se incubó a 28 ºC durante 5 días y a continuación las colonias que se habían desarrollado se transfirieron al medio mínimo, para obtener los transformantes como colonias desarrolladas en el mismo.
(4) Comparación de las actividades endoglucanasa de STCE1 de tipo natural y STCE1 modificada en su extremo Nterminal en los sobrenadantes de los cultivos
Los transformantes resultantes se cultivaron según el procedimiento descrito en el documento WO98/11239, para obtener los sobrenadantes de cultivo. Los sobrenadantes de los cultivos se sometieron a SDS-PAGE, para seleccionar los sobrenadantes de cultivo en los que se detectaba con claridad la banda de STCE1 de
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aproximadamente 45 kDa. Se midieron las actividades endoglucanasa en los sobrenadantes de los cultivos a pH 10 en ausencia y con presencia de LAS y se compararon los grados de reducción de la actividad en presencia de LAS. Los resultados se muestran en la Tabla 6. En la Tabla 6, se representan las actividades endoglucanasa por porcentajes cuando cada actividad endoglucanasa a pH 10 se considera como 100.
Tabla 6
Vector de expresión EGU (%) Sin LAS con LAS
STCE1 de tipo natural pCB-Ste 100 14,5
STCE1 modificada en su extremo N-terminal pCB-Sts 100 25,9
Como resultado, al comparar las actividades endoglucanasa en presencia de LAS, se encontró que la actividad endoglucanasa de STCE1 modificada en su extremo N-terminal fue aproximadamente 1,8 veces superior a la de STCE1 de tipo natural. Además, no se detectó la actividad endoglucanasa de la cepa 2 de Trichoderma viride y por lo tanto se encontró que las actividades endoglucanasa se derivaban de las enzimas recombinantes expresadas por los vectores de expresión incorporados.
(5) Análisis de secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal de STCE1 de tipo natural y STCE1 modificada en su extremo N-terminal
A partir de cada sobrenadante de cultivo de los transformantes anteriores, se preparó una solución de los mismos que contenía Tris-HCl 0,05 mol/l (pH 8,0)/sulfato de sodio 1 mol/l que se adsorbió en un lecho de igual volumen (BV) de TOYOPEARL Butil-650S (Tosoh Corporation). Los vehículos se lavaron con tres BV de Tris-HCl 0,05 mol/l (pH 8,0)/sulfato de sodio 1 mol/l para eliminar los componentes no adsorbidos. La elución se realizó con tres BV de Tris-HCl 0,05 mol/l (pH 8,0)/sulfato de sodio 0,5 mol/l y la solución eluida se concentró por medio de Pellicon XL (valor de corte 5000, Millipore) y Ultrafree-15 (valor de corte 5000, Millipore). A partir del concentrado obtenido, se preparó una solución del mismo que contenía fosfato de sodio 0,1 mol/l (pH 5,8)/sulfato de amonio 1 mol/l. La solución resultante se sometió a una cromatografía hidrófoba utilizando Resource PHE (6 ml, Amersham Bioscience), para recuperar una fracción no adsorbida. La fracción no adsorbida se concentró y se desaló por medio de PD-10 (Amersham Bioscience) y a partir de la fracción, se preparó una solución de la misma que contenía solución de Tris-HCl 0,05 mol/l (pH 7,5). La solución se sometió a Resource Q (6 ml, Amersham Bioscience), para recuperar una fracción no adsorbida. La fracción no adsorbida se desaló y a partir de la fracción, se preparó una solución de la misma que contenía solución de acetato de sodio 0,05 mol/l (pH 5,0). La solución se sometió a Resource S (6 ml, Amersham Bioscience), para recuperar una fracción no adsorbida. La fracción no adsorbida se concentró y se sometió a una cromatografía en gel utilizando Superdex 75pg (16 X 60 mm; Amersham Bioscience) para recuperar una fracción con un peso molecular fraccionado de aproximadamente 45.000. Cada fracción (derivada de cada sobrenadante de cultivo de los transformantes anteriores) contenía solo la banda única de 45 kDa.
Las fracciones purificadas se sometieron a SDS-PAGE y las proteínas sometidas a electroforesis se transfirieron eléctricamente a una membrana de PVDF. Las bandas de STCE1 de aproximadamente 45 kDa se recortaron de la mancha y se sometieron al Secuenciador de Proteínas Modelo 492 (Applied Biosystems) para analizar las secuencias de aminoácidos.
Como resultado, se confirmó que la secuencia de STCE1 de tipo natural obtenida del transformante pCB-Ste era coherente con la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 5) de STCE1 derivada de Staphylotrichum coccosporum IFO (nombre actual: NBRC) 31817.
Sin embargo, la secuencia de aminoácidos de STCE1 obtenida del transformante de STCE1 modificada en su extremo N-terminal no pudo determinarse en el procedimiento anterior. Se utilizó una piroglutamato aminopeptidasa Pfu (Takara Bio) para eliminar el extremo N-terminal de la STCE1 modificada en su extremo N-terminal y a continuación se determinó el aminoácido (SEQ NO: 4).
Los resultados se resumieron en la Tabla 7 para comparar los aminoácidos del extremo N-terminal y las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal de STCE1 de tipo natural y STCE1 modificada en su extremo N-terminal. A partir de los resultados se confirmó que cada STCE1 tenía la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal esperada del correspondiente vector de expresión construido.
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