TR201906371T4 - Bacillus türlerinin serin proteazları. - Google Patents

Abstract

Mevcut açıklama Bacillus akibai'den ve Bacillus clarkii'den klonlanmış serin proteazları ve bunların varyantları ile ilgilidir. Serin proteazlarını içeren bileşimler kumaşları ve sert yüzeyleri temizlemede aynı zamanda çeşitli endüstriyel uygulamalarda kullanım için uygundur.

Description

TARIFNAME BACILLUS TÜRLERININ SERIN PROTEAZLARI BULUS SAHASI Mevcut açiklama BaciI/us spp.'den klonlanmis serin proteazlari ve bunlarin varyantlari ile ilgilidir.

BULUSUN ALT YAPISI Serin proteazlari proteinlerin peptit baglarinin hidrolizini baslatan bir serin aktif yerine sahip olan enzimlerdir (EC No. 3.4.21). Bunlarin yapisina göre iki genis serin proteazlari kategorisi vardir: kimotripsin-benzeri (tripsin-benzeri) ve subtilisin-benzeri.

Prototipik subtilisin (EC No. 3.4.21.62) ilk olarak Baci'I/us subtilis'ten elde edilmistir.

Subtilisinler ve bunlarin homologlari MEROPS siniflandirma semasinin S8 peptidaz familyasinin üyeleridir. S8 familyasinin üyeleri bunlarin amino asit dizisinde Asp, His ve Ser sirasinda bir katalitik triada sahiptir.

Serin proteazlarinin endüstriyel enzimler tekniginde uzun süredir bilinmesine ragmen, özel durumlar ve kullanimlar için uygun olan ilave serin proteazlarina yönelik bir ihtiyaç hâlâ vardir.

WO subtilisin tipindeki bir yeni alkalin proteazi ayni zamanda bunlarin ilgili proteinlerini ve türevlerini tarif eder. WO subtilisin tipindeki bir yeni alkalin proteaz ve bunun çesitli ilgili proteinleri ve türevleri ile ilgilidir.

Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bilesimler ve yöntemler, bu tarz yöntemlerin ve bilesimlerin istemlerde tanimlandigi sekilde olmasi kaydiyla, Bacillus spp.'den klonlanmis rekombinant serin proteazlari ve bunlarin varyantlari ile ilgilidir. Serin proteazlarini içeren bilesimler kumaslari ve sert yüzeyleri temizlemede ayni zamanda çesitli endüstriyel uygulamalarda kullanim için uygundur ve istemlerde tanimlandigi sekildedir.

Bir birinci yönünde, bulus bir rekombinant Bacillus akibai/c/arkii-kladi subtilisin polipeptididir veya bunun bir aktif fragmanidir, burada rekombinant polipeptit veya bunun aktif fragmani proteolitik aktiviteye sahiptir ve SEO ID NO: 11'in, 14'ün, 17'nin, Bazi uygulamalarda, yukaridaki rekombinant polipeptitlerin en az biri proteaz aktivitesine, spesifik olarak kazein hidrolizine, sahiptir. Bazi uygulamalarda, yukaridaki rekombinant polipeptitlerin en az biri 8 ila 12'lik bir pH araliginda bunun maksimal proteaz aktivitesinin en az %50'sini muhafaza eder. Bazi uygulamalarda, yukaridaki rekombinant polipeptitlerin en az biri 50°C ila 75°C'Iik bir sicaklik araliginda bunun maksimal proteaz aktivitesinin en az %50'sini muhafaza eder. Bazi uygulamalarda, yukaridaki rekombinant polipeptitlerin en az biri bir otomatik bulasik yikama deterjani ve bir çamasir yikama deterjani dâhil olmak üzere bir deterjan bilesimi içinde temizleme aktivitesine sahiptir.

Bazi uygulamalarda, bulus bir sürfaktan ve yukarida ifade edilen rekombinant polipeptitlerin en az birini içeren bir bilesimdir. Bazi uygulamalarda, sürfaktan bir iyonik- olmayan sürfaktandan, bir anyonik sürfaktandan, bir katyonik sürfaktandan, bir zwitteriyonik sürfaktandan, bir amfolitik sürfaktandan, bir yari-polar iyonik-olmayan sürfaktandan ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilir. Bazi uygulamalarda, bilesim bir deterjan bilesimidir, örnegin, bir çamasir deterjanidir, bir kumas yumusatici deterjandir, bir bulasik yikama deterjanidir ve bir sert-yüzey temizleme deterjanidir. Bazi uygulamalarda, bilesim ilaveten en az bir kalsiyum iyonu ve/veya çinko iyonu, en az bir stabilazör, en az bir agartma ajani, fosfat veya borat içerir. Bazi uygulamalarda, bilesim fosfatsizdir ve/veya boratsizdir. Bazi uygulamalarda, bilesim bir granüler, pudra, kati, çubuk, sivi, tablet, jel, macun veya birim doz bilesimidir. Bazi uygulamalarda, bilesim ilaveten açil transferazlardan, alfa- amilazlardan, beta-amilazlardan, alfa-galaktosidazlardan, arabinosidazlardan, aril esterazlardan, beta-galaktosidazlardan, karajenazlardan, katalazlardan, sellobiyohidrolazlardan, selülozlardan, kondroitinazlardan, kütinazlardan, endo-beta- 1,4-glukanazlardan, endo-beta-mannanazlardan, esterazlardan, ekzo- mannanazlardan, galaktanazlardan, glukoamilazlardan, hemiselülazlarda n, hiyalüronidazlardan, keratinazlardan, Iakkazlardan, Iaktazlardan, Iigninazlardan, pektin asetil esterazlardan, pektinazlardan, pentozanazlardan, peroksidazlardan, fenoloksidazlardan. fosfatazlardan, fosfolipazlardan, fitazlardan, poligalaktüronazlardan, proteazlardan, pullulanazlardan, redüktazlardan, ramnogalaktüronazlardan, beta-glukanazlardan, tannazlardan, transglutaminazlardan, ksilan asetiI-esterazlardan, ksilanazlardan, ksiloglukanazlardan, ksilosidazlardan, metalloproteazlardan, ilave serin protezlarindan ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla ilave enzim veya enzim türevi içerir.

Bazi uygulamalarda, bulus temizlemenin, bir yüzeyi veya bir esyayi yukarida listelenen bir bilesim ile temas ettirmeyi içeren, bir yöntemidir. Bazi uygulamalarda, bulus bir rekombinant polipeptit üretmek için, bir konak hücreyi yukaridaki rekombinant polipeptidin en az birini sifreleyen bir polinükleotid içeren bir ekspresyon vektörü ile kalici bir sekilde transforme etmeyi içeren, bir yöntemidir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI plazmid haritasini saglar. haritasini saglar.

Sekil 3, BspAI02518'in bir DMC substrati üzerindeki proteaz aktivitesinin bir grafigini Sekil 4, BspU02193'ün bir DMC substrati üzerindeki proteaz aktivitesinin bir grafigini Sekil 5A, BspAIO çamasir deterjanlarindaki temizleme etkililigi egrilerini saglar. Sekil SB, BspAI çamasir deterjanlarindaki temizleme etkililigi egrilerini saglar. Sekil SC, BspAIO2518'in otomatik bulasik yikama (ADW) deterjanlarindaki temizleme etkililigi egrilerini saglar.

Sekil 6A, BspU çamasir deterjanlarindaki temizleme etkililigi egrilerini saglar. Sekil GB, BspU deterjanlarindaki temizleme etkililigi egrilerini saglar.

Sekil 7A-F, BspAl matür formlarinin amino asit dizilerinin çesitli bakteriyel serin proteazlarinin amino asit dizileri (SEQ ID NO.'lari: 49-79) ile bir hizalamasini saglar. Bir konsensüs dizisi hizalamanin altinda gösterilir (SEQ ID NO: 81). filogenetik agacini saglar.

SEKIL 9A-C, BspAl, Bakn ve SWT66_254731'in (SEQ ID NO: 17) matür formlarinin amino asit dizilerinin bir kaç bakteriyel serin proteazinin dizileri bir bir hizalamasini saglar. B. pseudofirmus'tan (SEO ID NO: 49), B. lentus'tan (SEQ ID NO: , B. licheni'formis'ten (SEQ ID NO: 67) ve B. amy/oliquefaciens'ten (SEQ ID NO: 73) elde CAA24990 NCBI Erisim Numaralari`na karsilik gelir.

SWT66_254731'in ve çesitli baska bakteriyel serin proteazlarinin bir filogenetik agacini Sekil 11A, SWT çamasir deterjanindaki (HDD) çamasir deterjanindaki temizleme etkililik egrilerini saglar. Sekil 11C, SWT66_254731'in pH 9'da durulanmamis numunelik kumas parçalari kullanilarak Quantum otomatik bulasik yikama (ADW) deterjanindaki temizleme etkililik egrilerini kullanilarak Quantum otomatik bulasik yikama (ADW) deterjanindaki temizleme etkililik kumas parçalari kullanilarak GSMB otomatik bulasik yikama (ADW) deterjanindaki numunelik kumas parçalari kullanilarak GSMB otomatik bulasik yikama (ADW) deterjanindaki temizleme etkililik egrilerini saglar.

Sekil 12A-C, asagidakilerin matürformlarina: BspAI, BspU, SWT, COG104 (SEQ ID NO: amy/oiiquefaciens'ten, B. Ientus'tan, B. Iicheniformis'ten, Bacillus sp. LG12'den ve B. amino asitlik dizilerin bir hizalamasini saglar.

AC889'un, ACB92'riin, DETPh35'in ve çesitli baska bakteriyel serin proteazlarinin B. akibaiYC/arkii-kladi subtilisinleri kapsayan dizileri gösteren bir köseli parantez ile bir filogenetik agacini saglar. amy/oliquefaciens'ten BPN' subtilisini (pdb kaydi ZSTI), B. licheniformis'ten Carlsberg (pdb kaydi 3UNX), B. Ientus subtilisini (pdb kaydi 1JEA) ve subtilisin LG12'in tecilli yapisi ile bir yapi-temelli dizi hizalamasini saglar. Asp32, H62 ve 8215 aktif yer triadi ve Bacillus subtilisinlerinin oksianyon deligine katkida bulunan N153 (BspAI02518 numaralandirmasi) vurgulanir. Ayrica, burada B. akibaiVc/arkiilkladi subtilisin dizilerinin Val (V)91 ila Gly (G)99 veya Ser (S)99 arasinda bir ortak motife sahip oldugu yapi- temelli hizalamanin bir bölgesi de vurgulanir.

Sekil 15, B. Ientus subtilisin (pdb kaydi 1JEA) yapisi üzerinde modellenmis B. akibaiVc/arkii-kladi subtilisinlerin ana zincir katlanmasindaki DRN motifinin katalitik triad açisindan beklenen Iokasyonunu gösterir. Tüm serin proteazlari için ortak olan katalitik triadin rezidü yan zincirleri siyah renklendirilir.

DETAYLI AÇIKLAMA edilen rekombinant serin proteazlari ile ilgili bilesimler ve yöntemler tarif edilir.

Bilesimler ve yöntemler, kismen, rekombinant BspAIO2518'in ve BspU02193'ün bir sürfaktan varliginda, bazik reaksiyon kosullarinda ve yükseltilmis sicakliklarda proteaz ACBBQ, ACBQZ ve DETPh35 tarafindan paylasildigi tahmin edilen, bu özellikleri bu proteazlari kumaslari ve sert yüzeyleri temizlemede ayni zamanda tekstil, deri ve tüy islemede kullanim için gayet uygun hâle getirir. Sonuç olarak, en azindan BspAIO2518 kalmamak kaydiyla, çamasir ve bulasik yikama deterjanlari dâhil olmak üzere, protein parçalanmasi için bilesimlere dâhil edilme için gayet uygundur. BspAl02518 ve COGtO4, AC883, ACBQO, ACB82, ACBSQ, ACBQZ ve DETPh35 de kisisel bakim bilesimlerine ayni zamanda insan gida ve hayvan yemi uygulamalarina dâhil edilme için uygundur. l. Tanimlar Mevcut bilesimleri ve yöntemleri detayli bir sekilde tarif etmeden önce, asagidaki terimler açik olmasi için tanimlanir. Tanimlanmamis terimler ve kisaltmalar teknikte kullanildigi üzere bunlarin olagan anlamina uyumlu hâle getirilmelidir. Burada aksi tanimlanmadikça, burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler teknikte normal uzmanligi olan bir kisi tarafindan yaygin bir sekilde anlasilan ile ayni anlama sahiptir.

Aksi gösterilmedikçe, mevcut açiklamanin tatbiki moleküler biyolojide, protein mühendisliginde ve mikrobiyolojide yaygin bir sekilde kullanilan geleneksel teknikleri içerir. Burada tarif edilenlere benzer veya es-deger olan herhangi bir yöntemin veya malzemenin mevcut açiklamanin tatbikinde kullanim alani bulmasina ragmen, bazi uygun yöntemler ve malzemeler burada tarif edilir. Hemen asagida tanimlanan terimler Spesifikasyon'a atif ile bir bütün olarak daha tam olarak tarif edilir.

Burada kullanildigi sekliyle, tekil "bir", "biri" ve "bu" baglam açik bir sekilde aksini göstermedikçe çogullari içerir. Aksi gösterilmedikçe, nükleik asit dizileri 5' ila 3' oryantasyonunda soldan saga dogru yazilir ve amino asit dizileri amino ila karboksi oryantasyonunda soldan saga dogru yazilir. Bu açiklamanin, aksinin bir gösterimi olmadikça, burada tarif edilen özel metodoloji, protokoller ve reaktifler ile sinirlandirilmadigi anlasilacaktir.

Bu Spesifikasyon boyunca verilen her maksimum sayisal sinirlandirmanin, bu tarz daha düsük sayisal sinirlandirmalar burada açik bir sekilde yazilmis gibi, her daha düsük sayisal sinirlandirmayi içermesi amaçlanir. Bu Spesifik boyunca verilen her minimum sayisal sinirlandirma, bu tarz daha yüksek sayisal sinirlandirmalar burada açik bir sekilde yazilmis gibi, her daha yüksek sayisal sinirlandirmayi içerecektir. Bu Spesifikasyon boyunca verilen her sayisal aralik, bu tarz daha dar sayisal araliklarin tümü burada açik bir sekilde yazilmis gibi, bu tarz daha genis sayisal araligin içinde kalan her daha dar sayisal araligi içerecektir.

Bir sayisal deger ile baglantili olarak burada kullanildigi üzere, "yaklasik" terimi, terim baglamda spesifik olarak baska sekilde tanimlanmadikça, sayisal degerin +/- 0,5'i olan bir araligi ifade eder. Örnegin, bir "yaklasik 6 olan pH degeri“, pH degeri spesifik olarak baska sekilde tanimlanmadikça, 5,5 ila 6,5 araligindaki pH degerlerini ifade eder.

Burada kullanildigi sekliyle, "proteaz" ve "proteinaz" terimleri proteinlerin ve peptitleri yikama yetisine sahip olan bir enzimi ifade eder. Bir proteaz proteini olusturan bir peptit veya polipeptit zinciri içinde amino asitleri birbirine baglayan peptit baglarinin hidrolizi ile "proteoliz" gerçeklestirme yetisine sahiptir. Bir proteazin bir protein-sindirme enzimi olarak bu aktivitesi "proteolitik aktivite" olarak ifade eder. Proteolitik aktiviteyi ölçmek için çok sayida iyi-bilinen prosedür vardir. Örnegin, proteolitik aktivite ilgili proteazin bir uygun substrati hidrolize etme yetisini analiz eden karsilastirmali analizler ile tespit edilebilir. Proteaz veya proteolitik aktivitenin analizinde kullanisli olan emsal substratlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, di-metil kazeini (Sigma C-9801), bovin kollajenini (Sigma C-9879), bovine elastinini (Sigma E-1625) ve bovine keratinini (ICN Biomedical 902111), içerir. Bu substratlardan yararlanan kolorimetrik analizler teknikte iyi bilinir konsantrasyonunu belirlemede kullanim alani bulur. Bu analiz enzim bir çözünebilen sentetik substrati, örnegin, süksinIl-alanin-alanin-prolin-fenilalanin-p-nitroanilidi (sük- AAPF-pNA), hidrolize ettikçe p-nitroanilinin salindigi hizi ölçer. Hidroliz reaksiyonundan sari rengin üretim hizi bir spektrofotometrede 410 nm'de ölçülür ve aktif enzim konsantrasyonu ile orantilidir. Buna ek olarak, 280 nano metredeki (nm'deki) absorbans ölçümleri saflastirilmis proteinin bir örnegindeki toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanilabilir. Substrat/protein konsantrasyonu üzerindeki aktivite enzim spesifik aktiviteyi verir.

Bir polipeptit açisindan "varyant" terimi, bunun bir amino asidin bir veya birden fazla dogal-olusumlu veya insan eliyle yapilmis sübstitüsyonunu, içeri yerlestirmesini veya silinmesini içermesi açisindan bir belirtilmis dogal-tip, parenteral veya referans polipeptitten farkli olan bir polipeptidi ifade eder. Benzer sekilde, bir polinükleotid açisindan "varyant" terimi, nükleotid dizisi açisindan bir belirtilmis dogal-tip, parental veya referans polinükleotidden farklilik gösteren bir polinükleotidi ifade eder. Dogal-tip, parental veya referans polipeptidin veya polinükleotidin kimligi baglamdan asikâr olacaktir.

Burada kullanildigi sekliyle, "Bacillus cinsi“, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, B. subtilis, B. Iicheniformis, B. Ientus, B. brevis, B. stearothermophi/us, B. alkalophilus, B. amy/oliquefaciens, B. clausi'i', B. ha/odurans, B. megaterium, B. coagu/ans, B. circulans, B. Iautus, B. gibsonii, B. agaradhaerens, B aki'bai', B. Clark/'i ve B. thuringiensis, dâhil olmak üzere teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilindigi üzere "Bacillus" cinsindeki tüm türleri içerir. Bacillus cinsinin taksonomik yeniden-organizasyon geçirmeye devam ettigi fark edilir. Dolayisiyla, Cinsin. bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, simdi "Geobaci'lius stearothermophilus" olarak adlandirilan, B. stearothermophi/us tarzindaki organizmalar dâhil olmak üzere, yeniden-siniflandirilmis olan türleri içermesi amaçlanir. Bu karakteristigin ayrica yakin tarihlerde adlandirilan Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurini'bacillus, Anoxybaci'llus, Brevi'bacillus, Filobacillus, Graci'libacillus, Halobacillus, Paenibaci'llus, Salibaci'llus, Thermobacillus, Ureibaoillus ve Virgibacillus için de geçerli olmasina ragmen, stresli çevresel kosullar altinda dirençli endosporlarin üretimi Bacillus cinsinin tanimlayici özelligi olarak düsünülür.

Burada birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilan "polinükleotid" ve "nükleik asit" terimleri bir zincir içinde kovalent olarak baglanmis herhangi bir uzunluktaki nükleotid monomerlerinin bir polimerini ifade eder. DNA (deoksiribonükleik asit), deoksiribonükleotidler içeren bir polinükleotid, ve RNA (ribonükleik asit), ribonükleotidlerin bir polimeri, belirgin biyolojik fonksiyonlara sahip olan polinükleotidlerin veya nükleik asitlerin örnekleridir. Polinükleotidler veya nükleik asitler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir tek-, çift- veya üç-sarmalli DNA'yi, genomik DNA'yi, CDNA'yi, RNA'yi, DNA-RNA hibridini veya pürin ve pirimidin bazlari veya baska dogal, kimyasal olarak, biyokimyasal olarak modifiye edilmis, dogal-olmayan veya türevlendirilmis nükleotid bazlari içeren bir polimeri, içerir. Asagidakiler, polinükleotidlerin sinirlayici-olmayan örnekleridir: genler, gen fragmanlari, kromozomal fragmanlar, eksprese edilmis dizi etiketi (etiketleri) (EST (EST'Ier)), ekzonlar, intronlar, mesajci RNA (mRNA), tasiyici RNA (tRNA), ribozomal RNA (rRNA), ribozimler, komplementer DNA (CDNA), rekombinant polinükleotidler, dallanmis polinükleotidler, plazmidler, vektörler, herhangi bir dizinin izole edilmis DNA'si, herhangi bir dizinin izole edilmis RNA'si, nükleik asit problari ve primerler.

Burada kullanildigi sekliyle, "mutasyon" terimi bir referans amino asit veya nükleik asit dizisine yapilmis degisimleri ifade eder. Terimin sübstitüsyonlari, içeri yerlestirmeleri ve silinmeleri kapsamasi amaçlanir.

Burada kullanildigi sekliyle, "vektör" terimi nükleik asidi (asitleri) bir hedef hücreye veya dokuya uygulamak veya transfer etmek için kullanilan bir nükleik asit yapisini ifade eder. Bir vektör tipik olarak yabanci DNA'yi bir hücreye veya dokuya uygulamak için kullanilir. Vektörler, plazmidleri, klonlama vektörlerini, bakteriyofajlari, virüsleri (öm., viral vektörü), kozmidleri, ekspresyon vektörlerini, mekik vektörlerini ve benzerlerini içerir. Bir vektör tipik olarak bir replikasyon orijini, bir çoklu-klonlama yeri ve bir seçilebilen belirteç içerir. Bir vektörü bir hedef hücreye yerlestirme prosesi tipik olarak transformasyon olarak ifade edilir. Mevcut bulus, bazi uygulamalarda, bir uygun konakta DNA dizisinin ekspresyonunu ve rekombinant polipeptit dizisinin katlanmasini ve translokasyonunu gerçeklestirebilen bir uygun pro-diziye (örn., sekretuvar, sinyal peptidi dizisine, vb.) operatif olarak baglanmis bir serin proteazi polipeptidini (örn., öncül veya matür serin proteazi polipeptidini) sifreleyen bir DNA dizisi içeren bir vektör Burada kullanildigi sekliyle, "ekspresyon kaseti", "ekspresyon plazmidi" veya ekspresyonu için rekombinant olarak veya sentetik olarak üretilmis bir nükleik asit yapisini veya vektörü ifade eder. Bir ekspresyon vektörü veya ekspresyon kaseti tipik olarak, yabanci nükleik asidin ekspresyonunu tahrik eden bir promotör nükleotid dizisi içerir. Ekspresyon vektörü veya kaseti ayrica tipik olarak, bir özel nükleik asidin bir hedef hücredeki transkripsiyonuna izin veren herhangi bir baska belirtilmis nükleik asit elemani da içerir. Bir rekombinant ekspresyon kaseti bir plazmide, kromozoma, mitokondriyal DNA'ya, plastid DNA'sina, virüse veya nükleik asit fragmanina katilabilir. Çok sayida prokaryotik ve ökaryotik ekspresyon vektörü piyasada satilmaktadir.

Burada kullanildigi sekliyle, bir "plazmid" kromozomal DNA'dan bagimsiz olarak kopyalayabilen bir ekstrakromozomal DNA molekülünü ifade eder. Bir plazmid çift- sarmallidir (ds) ve dairesel olabilir ve tipik olarak bir klonlama vektörü olarak kullanilir.

Burada kullanildigi sekliyle, bir nükleik asit dizisini bir hücreye uygulama baglaminda, herhangi bir yöntemi ifade eder. Uygulama için bu tarz yöntemler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, protoplast füzyonunu, transfeksiyonu, transformasyonu, elektroporasyonu, konjugasyonu ve transdüksiyonu, içerir. Transformasyon bir hücrenin genetik materyalin (örn., DNA'nin) alimindan, opsiyonel genomik katilimindan ve ekspresyonundan kaynaklanan genetik degisimini ifade eder.

Burada kullanildigi sekliyle, bir nükleik asit, bu bir baska nükleik asit dizisi ile bir fonksiyonel iliski hâlinde yerlestirildiginde, bir baska nükleik asit dizisine "operatif olarak baglanir". Örnegin, bir promotör veya hizlandirici, promotör kodlama dizisinin transkripsiyonunu etkilendiginde, bir nükleotid kodlama dizisine operatif olarak baglanir.

Bir ribozom baglama yeri, bu kodlama dizisinin translasyonunu kolaylastiracak sekilde konumlandirildiginda, bir kodlama dizisine operatif olarak baglanabilir. Tipik olarak, olmasi gerekmez. Baglama geleneksel restriksiyon yerlerinde Iigasyon ile yapilir. Bu tarz yerler var olmadiginda, sentetik oligonükleotid adaptörleri veya baglayicilari geleneksel tatbike uygun sekilde kullanilabilir.

Burada kullanildigi sekliyle, "gen" terimi bir polipeptidi sifreleyen ve kodlama bölgelerinden önce gelen ve sonra gelen bölgeleri içeren bir polinükleotidi (örn., bir DNA segmentini) ifade eder. Bazi durumlarda, bir gen münferit kodlama segmentleri (ekzonlar) arasindaki araya giren dizileri (intronlari) içerir.

Burada kullanildigi sekliyle, bir hücreye atfen kullanildiginda "rekombinant" tipik olarak hücrenin bir yabanci nükleik asit dizisinin uygulanmasi ile modifiye edilmis oldugunu veya hücrenin bu sekilde modifiye edilmis bir hücreden türetildigini gösterir. Örnegin, bir rekombinant hücre hücrenin natif (rekombinant-olmayan) formundaki ile özdes formda bulunmayan bir gen içerebilir veya bir rekombinant hücre modifiye edilmis olan ve hücreye yeniden-uygulanmis olan (hücrenin natif formunda bulunan) bir natif gen içerebilir. Bir rekombinant hücre hücreden nükleik asidi çikarmadan modifiye edilmis olan hücreye endojen olan bir nükleik asit içerebilir; bu tarz modifikasyonlar gen replasmani, yer-spesifik mutasyon ve teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen ilgili teknikler ile elde edilenleri içerir. Rekombinant DNA teknolojisi in vitro rekombinant DNA üretimi ve rekombinant DNA'nin eksprese edilebildigi veya çogaltilabildigi böylece bir rekombinant polipeptidin üretilebildigi hücrelere transferi için teknikleri içerir. Polinükleotidlerin veya nükleik asitlerin "rekombinasyonu" veya yeniden-birlestirilmesi" genel olarak, iki veya daha fazla nükleik asit veya polinükleotid sarmalinin veya fragmaninin bir yeni polinükleotid veya nükleik asit üretecek sekilde birlesmesini veya birlestirilmesini ifade eder.

Bunun natif hâlinde veya teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen yöntemler ile manipüle edildiginde, polipeptidi veya bunun bir fragmanini üretecek sekilde transkribe edilebildiginde ve/veya aktarilabildiginde, bir nükleik asidin veya polinükleotidin, bir polipeptidi "sifreledigi" söylenir. Bu tarz bir nükleik asidin rehber sarmalinin da diziyi sifreledigi söylenir. ekspresyon vektörü için bir uygun konagi ifade eder.

Bir "protein" veya "polipeptit" amino asit rezidülerinin bir polimerik dizisini içerir. lUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) ile uyumlu olarak tanimlandigi üzere amino asitler için tek ve 3-harfli kod bu açiklama boyunca kullanilir.

Tek X harfi yirmi amino asidin herhangi birini ifade eder. Ayrica, bir polipeptidin genetik kodun dejenere olmasindan dolayi birden fazla nükleotid dizisi tarafindan kodlanabilecegi de anlasilir. Mutasyonlar ana amino asit için tek harfli kod sonrasinda bir pozisyon numarasi ve akabinde varyant amino asit için tek harfli kod ile adlandirilabilir. Örnegin, pozisyon 87'deki glisinin (G'nin) serine (S'ye) mutasyona ugratilmasi "G087S" veya “G87S” olarak temsil edilir. Modifikasyonlari tarif ederken, bir pozisyon akabinde parantezler içinde listelenen amino asitler listelenen amino asitlerin herhangi biri tarafindan bu pozisyondaki sübstitüsyonlarin bir listesini gösterir. Örnegin, 6(L,I) pozisyon 6'nin bir Iösin veya izolösin ile sübstüte edilebilecegi anlamina gelir.

Bazen, bir dizi içinde, bir egik çizgi (/) sübstitüsyonlari tanimlamak için kullanilir, örn., F/V, özel pozisyonun bu pozisyonda bir fenilalanine veya valine sahip olabilecegini gösterir.

Bir "pro-dizi" veya "pro-peptit dizisi", proteazin uygun katlanmasi ve salgilanmasi için gerekli olan, sinyal peptidi dizisi ve matür proteaz dizisi arasindaki bir amino asit dizisini ifade eder; bunlar bazen intra-moleküler saperonlar olarak ifade edilir. Pro-dizi veya pro-peptit dizinin klevaji bir matür aktif proteaz ile sonuçlanir. Bakteriyel serin proteazlari siklikla pro-enzimler olarak eksprese edilir. salgilanmasina veya dogrudan tasinmasina katilabilen amino asit rezidülerinin bir dizisini ifade eder. Sinyal dizisi tipik olarak öncül veya matür protein dizisinin N-ucunda konumlandirilir. Sinyal dizisi endojen veya ekzojen olabilir. Bir sinyal dizisi normal olarak matür proteinde bulunmaz. Bir sinyal dizisi tipik olarak protein tasindiktan sonra bir sinyal peptidazi tarafindan proteinden yarilir.

Bir proteinin, polipeptidin veya peptidin "matür" formu terimi sinyal peptidi dizisi ve pro- peptit dizisi olmadan proteinin, polipeptidin veya peptidin fonksiyonel formunu ifade Bir proteinin veya peptidin "öncül" formu terimi proteinin amino veya karbonil ucuna operatif olarak baglanmis bir pro-diziye sahip olan proteinin bir matür formunu ifade eder. Öncül ayrica, pro-dizinin amino ucuna operatif olarak baglanmis bir "sinyal" dizisine de sahip olabilir. Öncül ayrica post-translasyonel aktiviteye dâhil edilen ilave polipeptitlere (örn., bir proteinin veya peptidin matür formunu serbest birakacak sekilde bundan yarilan polipeptitlere) de sahip olabilir.

Bir amino asit dizisine veya nükleik asit dizisine atfen "dogal-tip" terimi, amino asit dizisinin veya nükleik asit dizisinin bir natif veya dogal-olusumlu dizi oldugunu gösterir.

Burada kullanildigi sekliyle, "dogal-olusumlu" terimi dogada bulunan herhangi bir seyi (öm, proteinleri, amino asitleri veya nükleik asit dizilerini) ifade eder. Aksine, "dogal- olusumlu olmayan" terimi, dogada bulunmayan herhangi bir seyi (öm, laboratuvarda üretilen rekombinant nükleik asitleri ve protein dizilerini veya dogal-tip dizinin modifikasyonunu) ifade eder.

Amino asit rezidüsü pozisyonlarina iliskin burada kullanildigi sekliyle, "-'e karsilik gelen" veya "-e karsilik gelir" veya "karsilik gelir", bir proteindeki veya peptitteki sayilan pozisyondaki bir amino asit rezidüsünü veya bir proteindeki veya peptitteki bir sayilan rezidüye analog, homolog veya es-deger olan bir amino asit rezidüsünü ifade eder.

Burada kullanildigi sekliyle, "karsilik gelen bölge" genel olarak bir ilgili proteinlerdeki veya bir referans proteindeki bir analog pozisyonu ifade eder. susu tarafindan üretilmis veya üretilebilen bir proteini degil ayni zamanda bu tarz sustan izole edilmis bir DNA dizisi tarafindan sifrelenen ve bu tarz DNA dizisini içeren bir konak organizmada üretilen bir proteini de ifade eder. Ek olarak, terim sentetik ve/veya CDNA orijinli bir DNA dizisi tarafindan sifrelenen ve söz konusu proteinin tanimlayici karakteristiklerine sahip olan bir proteini ifade eder. Örneklendirmek amaciyla, "Bacillustan türetilmis proteazlar" Bacillus tarafindan dogal olarak üretilen proteolitik aktiviteye sahip olan enzimleri ayni zamanda Bacillus kaynaklari tarafindan üretilenlere benzeyen ancak genetik mühendisligi tekniklerinin kullanimi yoluyla serin proteazlarini sifreleyen bir nükleik asit ile transforme edilmis baska konak hücreler tarafindan üretilen serin proteazlarini da ifade eder.

Iki polinükleotid veya polipeptit dizisi baglaminda "özdes" terimi, dizi karsilastirma veya analiz algoritmalari kullanilarak ölçüldügü üzere, iki dizide maksimum korespondans için hizalandiginda ayni olan rezidüleri ifade eder.

Burada kullanildigi sekliyle, "özdeslik %'si" veya "özdeslik yüzdesi" veya "PID" dizi özdesligini ifade eder. Özdeslik yüzdesi teknikte bilinen standart teknikler kullanilarak belirlenebilir. Kullanisli algoritmalar BLAST algoritmalarini (Bakiniz, Altschul et al., J 5787, 1993) içerir. BLAST programi, çogu varsayilan degerlere ayarlanmis olan, bir kaç arama parametresi kullanir. NCBI BLAST algoritmasi biyolojik benzerlik açisindan en ilgili dizileri bulur ancak 20 rezidüden daha kisa olan sorgu dizileri için tavsiye varsayilan BLAST parametreleri asagidakileri içerir: Komsu sözcükler esik-degeri = 1; E-degeri kesim-degeri = 10; Skorlama Matriksi = NUC.3.1 (eslesme = 1, yanlis- eslesme = -3); Bosluk Açikligi = 5 ve Bosluk Uzantisi = 2. Bir amino asit dizisi aramalari için emsal varsayilan BLAST parametreleri asagidakileri içerir: Sözcük boyutu = 3; E-degeri kesim-degeri = 10; Skorlama Matriksi = BLOSUM62; Bosluk Açikligi eslesen özdes rezidülerin sayisini optimal/maksimum hizalama için program tarafindan 11 ve Bosluk Uzantisi = 1. Bir amino asit dizisi özdeslik yüzdesi (%) degeri olusturulan herhangi bir bosluk dâhil olmak üzere "referans" dizinin rezidülerinin toplam sayisina bölme ile belirlenir. BLAST algoritmalari i'referans" diziyi "sorgu" dizisi olarak ifade eder.

Burada kullanildigi sekliyle, "homolog proteinler" veya "homolog proteazlar" primer, sekonder ve/veya tersiyer yapida belirgin benzerlige sahip olan proteinleri ifade eder.

Protein homoloji proteinler hizalandiginda lineer amino asit dizisindeki benzerligi ifade edebilir. Protein dizilerinin homolog aramasi 0,001 olan esik-degeri (E-degeri kesim- degeri) ile NCBI BLAST'tan BLASTP ve PSI-BLAST kullanilarak yapilabilir. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Bir fliogenetik agaç amino asit dizileri kullanilarak insa edilebilir. Amino asit dizileri bir programa, örnegin, Vector NTI Advance program çiftine, girilmistir ve bir Kilavuz Agaç Komsu Birlestirme (NJ) yöntemi kullanilarak olusturulmustur (Saitou ve Nei, Mol Biol olan pozisyonlari yok sayma kullanilarak hesaplanabilir. Bir program, örnegin, AIian, filogenetik agaç üzerinde gösterilen molekül adindan sonra parantez içinde hesaplanan mesafe degerlerini gösterebilir.

Moleküller arasindaki homoloji anlama moleküllerin evrimsel tarihini ayni zamanda bunlarin fonksiyonu hakkindaki bilgiyi ortaya çikarabilir; bir yeni dizilenmis protein bir hâlihazirda karakterize edilen proteine homolog oldugunda, burada yeni proteinin biyokimyasal fonksiyonunun bir güçlü gösterimi vardir. Iki varlik arasindaki en temel iliski homolojidir; bunlar bir ortak atadan türetilmis oldugunda, iki molekülün homolog oldugu söylenir. Homolog moleküller veya homologlar paraloglar ve ortologlar olan iki sinifa bölünebilir. Paraloglar bir tür içinde bulunan homologlardir. Paraloglar siklikla bunlarin detaylandirilmis biyokimyasal fonksiyonlari açisindan farklilik gösterir.

Ortologlar farkli türlerde bulunan homologlardir ve çok benzer veya özdes fonksiyonlara sahiptir. Bir protein süper-familyasi bunlar için ortak atanin çikariminin yapilabildigi proteinlerin en genis gruplamasidir (kladidir). Genel olarak bu ortak ata dizi hizalamasina ve mekanistik benzerlige dayandirilir. Süper-familyalar tipik olarak familya içinde dizi benzerligi gösteren bir kaç protein familyasi içerir. "Protein klani" terimi yaygin olarak MEROPS proteaz siniflandirma sistemine göre proteaz süper- familyalari için kullanilir.

CLUSTAL W algoritmasi bir dizi hizalama algoritmasinin bir baska örnegidir (Bakiniz, için varsayilan parametreler asagidakileri içerir: Bosluk açikligi kaybi = 10,0; Bosluk uzantisi kaybi = 0,05; Protein agirlikli matriks = BLOSUM serisi; DNA agirlikli matriks = lUB; Geç iraksak diziler %'si = 40; Bosluk ayirma mesafesi = 8; DNA geçisleri agirligi = 0,50; Hidrofilik rezidüler listesi = GPSNDQEKR; Negatif matriks kullanimi = KAPALI; Toggle Rezidüsü spesifik kayiplar = AÇIK; Toggle hidrofilik kayiplari = AÇIK ve Toggle uç bosluk ayirma kaybi = KAPALI. CLUSTAL algoritmalarinda her bir uçta bulunan silinmeler dâhil edilir. Örnegin, 500 amino asitlik bir polipeptidin her bir ucunda (veya polipeptit içinde) bir bes amino asitlik silinme tasiyan bir varyant "referans" polipeptide olacaktir. Bu tarz bir varyant, polipeptide "en az %99'Iuk dizi özdesligine" sahip olan bir varyant tarafindan kapsanacaktir.

Bir nükleik asit veya polinükleotid, bu, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, diger proteinleri, nükleik asitleri, hücreleri, vb., içeren, diger bilesenlerden en azindan kismen veya tamamen ayrildiginda, "izole edilmistir". Benzer sekilde, bir polipeptit, protein veya peptit, bu, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, diger proteinleri, nükleik asitleri, hücreleri, vb., içeren, diger bilesenlerden en azindan kismen veya tamamen ayrildiginda, "izole edilmis"tir. Bir molar temelde, bir izole edilmis tür bir bilesim içindeki diger türlere kiyasla daha boldur. Örnegin, bir izole edilmis tür mevcut tüm makro- moleküler türlerin (bir molar temelde) en az yaklasik %60'ini, yaklasik %65'ini, yaklasik yaklasik %96'sini, yaklasik %97'sini, yaklasik %98'ini, yaklasik %99'unu veya yaklasik (yani, kontaminant tür geleneksel saptama yöntemleri ile bilesim içinde saptanamayabilir). Saflik ve homojenlik teknikte iyi bilinen çok sayida teknik, örnegin, bir nükleik asit veya bir protein örneginin, sirasiyla, agaroz veya poliakrilamid jel elektroforezi, akabinde boyama üzerine görsellestirme, kullanilarak belirlenebilir. Arzu edildiginde, bir yüksek-çözünürlüklü teknikten, örnegin, yüksek performansli sivi kromatografisinden (HPLC'den) veya bir benzer araçtan malzemenin saflastirilmasi için yararlanilabilir.

Nükleik asitlere veya polipeptitlere uygulandigi üzere "saflastirilmis" terimi genel olarak, teknikte iyi bilinen analitik teknikler ile belirlendigi üzere baska bilesenlerden esasen yoksun olan bir nükleik asidi veya polipeptidi gösterir (örn., bir saflastirilmis polipeptit veya polinükleotid bir elektroforetik jelde, kromatografik eluatta ve/veya yogunluk gradyanli sentrifügasyona tâbi tutulan bir vasatta bir ayrik bant olusturur). Örnegin, bir elektroforetik jelde esasen bir banda sebebiyet veren bir nükleik asit veya polipeptit "saflastirilmistir". Bir saflastirilmis nükleik asit veya polipeptit en az yaklasik saftir (örn., bir molar temelde agirliga göre yüzde). Bir ilgili anlamda, bir bilesim, burada bir saflastirma veya zenginlestirme tekniginin uygulanmasindan sonra molekülün konsantrasyonunda bir kayda deger artis oldugunda, bir molekül açisindan zenginlestirilmistir. "Zenginlestirilmis" terimi, bir bilesim içinde bir baslangiç bilesimine kiyasla daha yüksek olan bir bagil veya mutlak konsantrasyonda bulunan bir bilesigi, polipeptidi, hücreyi, nükleik asidi, amino asidi veya baska belirtilmis materyali veya bileseni ifade eder.

Burada kullanildigi sekliyle, "fonksiyonel analiz" terimi, bir proteinin aktivitesinin bir gösterimini saglayan bir analizi ifade eder. Bazi uygulamalarda, terim bir proteinin bunun olagan kapasitesinde bunun islev gösterme yetisi için analiz edildigi analiz sistemlerini ifade eder. Örnegin, bir proteaz durumunda, bir fonksiyonel analiz proteazin bir proteinöz substrati hidrolize etme etkililigini belirlemeyi içerir. baska prosesi sirasinda hakim olan kosullar altinda bir serin proteazi polipeptidi veya referans proteaz tarafindan saglanan bir temizleme performansini ifade eder. Bazi uygulamalarda, bir serin proteazi polipeptidinin veya referans proteazin temizleme performansi bir esya veya yüzey üzerindeki bir veya birden fazla çesitli enzime duyarli yumurta proteininden kaynaklanan bir Iekeyi) temizlemek için çesitli analizler kullanilarak belirlenebilir. Bir varyant veya referans proteazin temizleme performansi esya veya yüzey üzerindeki Iekeyi standart yikama kosuluna (kosullarina) tabi tutma ve lekenin çikarilma derecesini çesitli kromatografik, spektrofotometrik veya baska kantitatif metodolojileri kullanarak degerlendirme ile belirlenebilir. Emsal temizleme analizleri ve yöntemleri teknikte bilinir ve bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, WO asagida saglanan Örnekler'e dâhil edilen temizleme analizlerini ve yöntemlerini, içerir.

Bir serin proteazi polipeptidinin veya referans proteazin "temizleme etkili miktari" terimi, proteazin bir spesifik temizleme bilesimi içinde bir arzu edilen düzeyde enzimatik aktivite saglayan miktarini ifade eder. Bu tarz etkili miktarlar teknikte normal uzmanligi olan bir kisi tarafindan kolaylikla tespit edilir ve çok sayida faktöre, örnegin, kullanilan özel proteaza, temizleme uygulamasina, temizleme bilesiminin spesifik bilesimine ve bir sivi veya kuru (örn., granüler, tablet, çubuk) bilesimin gerekli olup olmamasina, vb., baglidir. disinda temizleme bilesimine dâhil edilen herhangi bir sivi, kati veya gazli malzemeyi ifade eder. Bazi uygulamalarda, mevcut açiklamanin temizleme bilesimleri bir veya birden fazla temizleme yardimci malzemesi içerir. Her bir temizleme yardimci malzemesi tipik olarak temizleme bilesiminin özel tipine ve formuna (örn., sivi, granül, pudra, çubuk, macun, sprey, tablet, jel, köpük veya baska bilesim) bagli olarak seçilir.

Tercihen, her bir temizleme yardimci malzemesi bilesim içinde kullanilan proteaz enzimi ile uyumludur.

Temizleme bilesimleri ve temizleme formülasyonlari herhangi bir objeyi, esyayi ve/veya yüzeyi temizlemek, agartmak, dezenfekte etmek ve/veya sterilize etmek için uygun olan herhangi bir bilesim içerir. Bu tarz bilesimler ve formülasyonlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, temizleme veya deterjan bilesimleri (örn., sivi, tablet, jel, çubuk, granül ve/veya kati çamasir temizleme veya deterjan bilesimleri ve ince kumas deterjan bilesimleri) dâhil olmak üzere sivi ve/veya kati bilesimleri; sert yüzey, örnegin, cam, yün, seramik ve metal mutfak tezgahlari ve pencereler için, temizleme bilesimlerini ve formülasyonlarini; hali temizleyicilerini; firin temizleyicilerini; kumas tazeleyicilerini; kumas yumusaticilarini ve tekstil, çamasir destekleyici temizleme veya deterjan bilesimlerini, çamasir katki maddesi temizleme bilesimlerini ve çamasir beneklenme-öncesi temizleme bilesimlerini; el ile veya manüel bulasik yikama bilesimleri (öm, "el ile" veya "manüel" bulasik yikama deterjanlari) ve otomatik bulasik yikama bilesimleri (örn., "otomatik bulasik yikama deterjanlari") dâhil olmak üzere bulasik yikama bilesimlerini, içerir. Ayrica, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, haplar, tabletler, jel kapsüller veya baska tek dozajli birimler, örnegin, önceden-ölçülmüs pudralar veya sivilar, dâhil olmak üzere, tek dozajli birim formlar da mevcut bulus ile kullanim alani bulur.

Burada kullanildigi sekliyle, temizleme bilesimi veya temizleme formülasyonlari, aksi gösterilmedikçe, granüler veya pudra-formlu çok-amaçli veya agir-is yikama ajanlarini, özellikle temizleme deterjanlarini; sivi, granüler, jel, kati, tablet, macun veya birim dozaj formunda çok-amaçli yikama ajanlarini, özellikle agir-is sivi (HDL) deterjan veya agir-is kuru (HDD) deterjan olarak adlandirilan deterjan tiplerini; sivi ince-kumas deterjanlarini; yüksek-köpürme tipinde olanlar dâhil olmak üzere el ile veya manüel bulasik yikama ajanlarini; ev içi ve kurumsal kullanim Için çesitli tablet, pudra, kati, granüler, sivi, jel ve parlatici tipleri dâhil olmak üzere el ile veya manüel bulasik yikama, otomatik bulasik yikama veya tabak çanak veya sofra takimi yikama ajanlarini; antibakteriyel el-yikama tipleri, temizleme çubuklari, agiz çalkanti sulari, dentur temizleyicileri, araba sampuanlari, hali sampuanlari, banyo temizleyicileri dâhil olmak üzere sivi temizleme ve dezenfekte etme ajanlarini; insanlar ve diger hayvanlar için saç sampuanlarini ve/veya saç durulamalarini; dus jellerini ve banyo köpüklerini ve metal temizleyicilerini ayni zamanda temizleme yardimcilarini, örnegin, çamasir suyu katki maddelerini ve "leke-çubugunu" veya ön-muamele tiplerini, içerir. Bazi uygulamalarda, granüler bilesimler "kompakt" formadir; bazi uygulamalarda, sivi bilesimler bir "konsantre" formdadir.

Burada kullanildigi sekliyle, "kumas temizleme bilesimleri" çamasir katki maddesi bilesimleri ve Iekelenmis kumaslarin (örri., elbiselerin, ev tekstilinin veya baska tekstil malzemelerinin) sivi içinde bekletilmesinde ve/veya ön-muamelesinde kullanim için uygun olan bilesimler dâhil olmak üzere es ile ve makine çamasir deterjani bilesimlerini Burada kullanildigi sekliyle, "kumas-disi temizleme bilesimleri", bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, el ile veya manüel veya otomatik bulasik yikama deterjani bilesimleri, oral temizlik bilesimleri, dentur temizleme bilesimleri, kontakt lens temizleme bilesimleri, yara debridman bilesimleri ve kisisel temizlik bilesimleri dâhil olmak üzere tekstil-disi (yani, kumas-disi) yüzey temizleme bilesimlerini içerir.

Burada kullanildigi sekliyle, "deterjan bilesimi" veya "deterjan formülasyonu" terimi özel kumas ve/veya kumas-disi objeler veya esyalar dâhil olmak üzere kirlenmis veya kirli objelerin temizlenmesi için bir yikama vasatinda kullanim için amaçlanan bir bilesime atfen kullanilir. Mevcut açiklamanin bu tarz bilesimleri herhangi bir özel deterjan bilesimi veya formülasyonu ile sinirlandirilmaz. Bazi uygulamalarda, açiklamanin deterjanlari açiklamanin en az bir serin proteazi polipeptidini ve buna ek olarak bir veya birden fazla sürfaktan, transferaz (transferazlar), hidrolitik enzimler, oksido redüktazlar, insa ediciler (öm, bir insa edici tuz), agartma ajanlari, çamasir suyu aktivatörleri, mavilestirme ajanlari, flüoresan boyalar, keklestirme inhibitörleri, maskeleme ajanlari, enzim aktivatörleri, antioksidanlar ve/veya çözündürücüler, içerir. Bazi durumlarda, bir insa edici tuz, tercihen fosfata (öm, sodyum tripolifosfata) kiyasla daha fazla silikat (örn., sodyum metasilikat) ile, bir silikat tuzunun ve bir fosfat tuzunun bir karisimidir.

Açiklamanin bazi bilesimleri, örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, temizleme bilesimleri veya deterjan bilesimleri herhangi bir fosfat (öm, fosfat tuzu veya fosfatli insa edici) içermez.

Burada kullanildigi sekliyle, "agartma" terimi bir malzemenin (öm, kumasin, çamasirin, kâgit hamurunun, vb.) veya yüzeyin malzemenin bir parlamasini (yani, beyazlamasini) ve/veya temizlenmesini gerçeklestirmek için yeterli olan bir süre boyunca ve/veya uygun pH ve/veya sicaklik kosullari altinda muamelesini ifade eder. Agartma için uygun olan kimyasallarin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, CIO2'yi, HzO'yi, persitleri, NOg'yi, vb., içerir.

Burada kullanildigi sekliyle, bir proteazin (öm., açiklamanin bir serin proteazi polipeptidinin) "yikama performansi" bir serin proteazi polipeptidinin yikamaya, bilesime serin proteazi polipeptidi eklenmeden deterjana kiyasla deterjana ilave temizleme performansi saglayan, katkisini ifade eder. Yikama performansi ilgili yikama kosullari altinda karsilastirilir. Bazi test sistemlerinde, diger ilgili faktörler, örnegin, deterjan bilesimi, sabun köpügü konsantrasyonu, su sertligi, yikama mekanikleri, süresi, pH'i ve/veya sicakligi, bir belirli piyasa diliminde ev içi uygulama (örn., el ile veya manüel bulasik yikama, otomatik bulasik yikama, tabak çanak temizleme, sofra takimi temizleme, kumas temizleme, vb.) için tipik olan kosulun (kosullarin) taklit edildigi sekilde kontrol edilebilir. veya çamasir deterjani piyasa diliminde ev içinde gerçekten kullanilan kosullari, özel olarak yikama sicakligini, süresini, yikama mekaniklerini, sabun köpügü konsantrasyonunu, deterjan tipini ve su sertligini, göstermek için kullanilir.

Burada kullanildigi sekliyle, "dezenfekte etme" terimi, yüzeylerden kontaminantlarin uzaklastirilmasini ayni zamanda esyalarin yüzeyleri üzerindeki mikroplarin inhibisyonunu veya öldürülmesini ifade eder. Mevcut açiklamanin herhangi bir özel yüzey, esya veya uzaklastirilacak olan kontaminant (kontaminantlar) veya mikroplar ile sinirlandirilmasi amaçlanmaz.

Buradaki temizleme bilesimlerinin "kompakt" formu yogunluk ile ve bilesim açisindan, inorganik dolgu tuzunun miktari ile en iyi yansitilir. Inorganik dolgu tuzlari pudra formundaki deterjan bilesimlerinin geleneksel içerik maddeleridir. Geleneksel deterjan bilesimlerinde, dolgu tuzlari kayda deger miktarlarda, tipik olarak, toplam bilesimin agirligi olarak yaklasik %17'si ila yaklasik %35'i araliginda bulunur. Aksine, kompakt bilesimlerde, dolgu tuzu toplam bilesimin yaklasik %15'ini asmayan miktarlarda bulunur. Bazi uygulamalarda, dolgu tuzu bilesimin agirligi olarak yaklasik %10'unu veya daha tercihen yaklasik %5'ini asmayan miktarlarda bulunur. Bazi uygulamalarda, inorganik dolgu tuzlari sülfatlarin ve klorürlerin alkali ve toprak alkali metal tuzlarindan seçilir. Bazi uygulamalarda, dolgu tuzu sodyum sülfattir. ll. Serin Proteazi Polipeptitleri Mevcut açiklama yeni serin proteazi enzimleri saglar. Mevcut açiklamanin serin proteazi polipeptitleri izole edilmis, rekombinant, büyük ölçüde saf veya dogal-olusumlu olmayan polipeptitleri içerir. Bazi uygulamalarda, polipeptitler temizleme uygulamalarinda kullanislidir ve buna ihtiyaci olan bir esyayi veya bir yüzeyi temizleme yöntemlerinde kullanisli olan temizleme bilesimlerine katilabilir.

Bazi uygulamalarda, bulus subtilisinlerin bir B. akibai/clarkii-kladidir. Diger uygulamalarda, bulus bir DRN motifi içeren bir B. akibai/c/arkii-kladi subtilisinin bir rekombinant polipeptididir veya bunun aktif fragmanidir. Bazi uygulamalarda, DRN motifi VKVLDRNGR1G'dir, burada R1, G veya 8 arasindan seçilir (SEO ID NO: 42).

Diger uygulamalarda, DRN motifi VKVLDRNGGG'dir (SEO ID NO: 43). Daha da baska uygulamalarda, DRN motifi VKVLDRNGSG'dir (SEO ID NO: 44). Bir baska uygulamada, DRN motifi D. Bir ilave uygulamada, DRN motifi V. Bir daha ilave (SEO ID NO: 48). Hatta bir ilave uygulamada, DRN motifi VKVLDRNGR1G, burada R1, G veya 8 arasindan seçilir (SEO ID NO: 42); VKVLDRNGGG (SEO ID NO: 43); VKVLDRNGSG (SEO NO: 44); D; V arasindan seçilir. SEO ID SEO ID NO: 3 dizi numaralandirmasina göredir.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun polipeptidi, emsallendirilmis polipeptitlere bir belirtilen derecede amino asit dizisi homolojisine, öm., SEO ID NO: 3'ten, SEO ID NO: 6'dan olusan gruptan seçilen amino asit dizisine %70'Iik, %72'Iik, %74'Iük, %76'Iik, uygulamada, mevcut bulusun polipeptidi, emsallendirilmis polipeptitlere bir belirtilen derecede amino asit dizisi homolojisine, örn., SEQ ID NO: 3'ün, SEQ ID NO: 6'nin, SEQ ID NO: 11'in, SEQ ID NO: 14'ün, SEQ ID NO: 17'nin, SEQ ID NO: 20'nin, SEQ ID NO: 23'ün, SEQ ID NO: 26'nin, SEQ ID NO: 29'un, SEQ ID NO: 32'nin, SEO ID NO: 'in, SEQ ID NO: 38'in, SEQ ID NO: 41'in veya SEQ ID NO: 84'ün amino asit dizisine Homoloji, burada tarif edildigi üzere, örn., bir program, örnegin, BLAST, ALIGN veya CLUSTAL, kullanilarak, amino asit dizisi hizalamasi ile belirlenebilir. Bazi uygulamalarda, polipeptit proteaz aktivitesine sahip olan bir izole edilmis, rekombinant, büyük ölçüde saf veya dogal-olusumlu olmayan enzimdir.

Diger uygulamalarda, mevcut bulusun polipeptidi veya bunun bir aktif fragmani, bir B. akibaiYc/arkii-kladi subtilisinden elde edilir, burada polipeptit veya bunun aktif fragmani proteolitik aktiviteye sahiptir.

Bir baska uygulamada, mevcut bulusun polipeptidi veya bunun bir aktif fragmani, bir B. akibaiVc/arkii-kladi subtilisinden elde edilir, burada polipeptit veya bunun aktif fragmani veya 48'in bir amino asit dizisini içerir.

Mevcut bulusa göre, mevcut bulusun polipeptidi veya bunun bir aktif fragmani, bir B. akibaiVc/arkii-kladi subtilisinden elde edilir, burada proteolitik aktiviteye sahip olan ve içeren polipeptit veya bunun aktif fragmani ilaveten en azindan asagidakilere sahip veya 17'nin bir amino asit dizisine %72'lik özdeslik; (iii) ID NO: 3'ün, 6'nin, 20'nin, 23'ün, 26'nin, 29'un bir amino asit dizisine %70'Iik özdeslik veya (iv) SEQ ID NO: 3'ün, Mevcut bulusa göre, mevcut bulusun polipeptidi veya bunun bir aktif fragmani, SEQ ID proteolitik aktiviteye sahiptir ve en azindan asagidakilere sahip olan bir amino asit dizisi içerir: (i) SEQ ID NO: 3'ün, SEQ ID NO: 6'nin, SEQ ID NO: 20'nin, SEQ ID NO: 23'ün, SEQ ID NO: 26'nin veya SEQ ID NO: 29'un amino asit dizisine %70'Iik özdeslik; (ii) SEQ ID NO: 3'ün, SEQ ID NO: 6'nin amino asit dizisine %70'Iik özdeslik; (iii) SEQ ID NO: 11'in, SEQ ID NO: 14'ün, SEQ ID NO: 17'nin, SEO ID NO: 32'nin, SEO ID NO: 'in, SEQ ID NO: 38'in, SEQ ID NO: 41'in veya SEQ ID NO: 84'ün amino asit dizisine amino asit dizisine %72'Iik özdeslik veya (v) SEQ ID NO: 32'nin, SEQ ID NO: 35'in, SEO ID NO: 38'in, SEQ ID NO: 41'in veya SEQ ID NO: 84'ün amino asit dizisine Mevcut bulusa göre, proteaz aktivitesine, örnegin, SEQ ID NO: 42'nin, 43'ün, 44'ün, 45'in, 46'nin, 47'nin veya 48'in bir amino asit dizisini içeren alkali proteaz aktivitesine, sahip olan ve önceden tarif edilen hizalama yöntemlerinin herhangi biri kullanilarak amino asit rezidüsü (rezidüleri) ile farklilik gösteren bir amino asit dizisi içeren, mevcut bulusun bir polipeptit enzimi saglanir.

Yukarida bildirildigi üzere, bulusun varyant enzim polipeptitleri enzimatik aktiviteye (örn., proteaz aktivitelerine) sahiptir ve bundan dolayi, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, tabak çanak esyalarini, sofra takimi esyalarini, kumaslari ve sert yüzeylere sahip olan esyalari (öm, bir tablonun, masa üstünün, duvarin, mobilya esyasinin, zeminin, tavanin, vb. sert yüzeyini) temizlemek için yöntemler dâhil olmak üzere temizleme uygulamalarinda kullanislidir. Bulusun bir veya birden fazla varyant serin proteaz enzimi polipeptidini içeren emsal temizleme bilesimleri infra tarif edilir. Bulusun bir enzim polipeptidinin enzimatik aktivitesi (örn., proteaz enzimi aktivitesi) teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinen prosedürler kullanilarak kolaylikla belirlenebilir. Infra sunulan örnekler enzimatik aktiviteyi ve temizleme performansini degerlendirmek için yöntemleri tarif eder. Bulusun polipeptit enzimlerinin lekeleri (öm, bir protein lekesini, örnegin, kan/süt/mürekkep veya yumurta sarisi), çikartmadaki, sert yüzeyleri temizlemedeki veya çamasirlari, tabak çanak veya sofra takimi esyasini (esyalarini) temizlemedeki performansi teknikte iyi bilinen prosedürler kullanilarak ve/veya Örnekler'de izah edilen prosedürler kullanilarak kolaylikla belirlenebilir. Bazi uygulamalarda, bulus bulusun bir rekombinant polipeptididir veya bunun aktif fragmanidir, burada polipeptit bir sürfaktan varliginda proteaz aktivitesine sahiptir. Bazi uygulamalarda, proteaz aktivitesi kazein hidroliz aktivitesini içerir. Bazi uygulamalarda, proteaz aktivitesi dimetilkazein hidroliz aktivitesini içerir.

Mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri bir genis pH araligi kosullarinda proteaz aktivitesine sahip olabilir. Bazi uygulamalarda, serin proteazi polipeptitleri, Örnek 4'te gösterildigi üzere, bir substrat olarak azo-kazein üzerinde proteaz aktivitesine sahiptir.

Bazi uygulamalarda, serin proteazi polipeptitleri yaklasik 4,0 ila yaklasik 12,0 araliginda olan bir pH'ta proteaz aktivitesine sahiptir. Bazi uygulamalarda, serin proteazi polipeptitleri yaklasik 8,0 ile yaklasik 12,0 araliginda olan bir pH'ta proteaz aktivitesine sahiptir. Bazi uygulamalarda, serin proteazi polipeptitleri yaklasik 8,0 ile yaklasik 12,0 araliginda olan bir pH'ta maksimal proteaz aktivitesinin en az %50'sine, bir pH'ta proteaz aktivitesine sahiptir. Bazi uygulamalarda, serin proteazi polipeptitleri Bazi uygulamalara, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri yaklasik 10°C ila yaklasik 90°C araligindaki bir sicaklikta proteaz aktivitesine sahiptir. Bazi uygulamalara, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri yaklasik 50°C ila yaklasik 75°C araligindaki bir sicaklikta proteaz aktivitesine sahiptir. Bazi uygulamalara, serin proteazi polipeptitleri yaklasik 50°C ila yaklasik 75°C araligindaki bir sicaklikta maksimal proteaz aktivitesinin en az %50'sine, %60'ina, %70'ine, %80'ine veya 65°C'nin veya 70°C'nin üstündeki bir sicaklikta aktiviteye sahiptir. Bazi uygulamalarda, sicaklikta aktiviteye sahiptir.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri bir temizleme bilesimi içinde temizleme performansi gösterir. Temizleme bilesimleri siklikla, temizleme bilesimlerini, fonksiyonunu idame ettirmesi için enzimler, örn., serin proteazlari, için bir zorlu ortam hâline getiren, enzimlerin kararliligi ve performansi için zararli olan içerik maddeleri içerir. Dolayisiyla, bir enzimin bir temizleme bilesimine konulmasi ve enzimatik fonksiyon (örn., mesela temizleme performansi ile gösterilen, serin proteazi aktivitesi) beklenmesi önemsiz degildir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri otomatik bulasik yikama (ADW) deterjani bilesimlerine temizleme performansi gösterir. Bazi uygulamalarda, otomatik bulasik yikama (ADW) deterjani bilesimlerindeki temizleme performansi yumurta sarisi Iekelerinin temizlenmesini içerir.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri çamasir deterjani bilesimlerinde temizleme performansi gösterir. Bazi uygulamalarda, çamasir deterjani bilesimlerindeki temizleme performansi kan/süt/mürekkep Iekelerinin temizlenmesini içerir. Temizleme bilesimlerinin her birinde, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri bir çamasir suyu bileseni ile veya bir çamasir suyu bileseni olmadan temizleme performansi gösterir.

Bulusun bir polipeptidi, burada bu tarz degisimlerin polipeptidin enzimatik aktivitesini büyük ölçüde degistirmedigi degisimler dâhil olmak üzere, çesitli degisimlere, örnegin, bir veya birden fazla amino asit içeri yerlestirmesine, silinmesine ve/veya sübstitüsyonuna, konservatif veya konservatif-olmayan, tabi tutulabilir. Benzer sekilde, bulusun bir nükleik asidi de, çesitli degisimlere, örnegin, bir özel kodonun (örn., sifrelenmis amino asit nükleotid mutasyonu tarafindan degistirilmediginde) bir sessiz varyasyon veya sessiz-olmayan varyasyon ile sonuçlanan, ayni veya bir farkli amino asidi sifreleyecegi sekilde, bir veya birden fazla kodondaki bir veya birden fazla nükleotidin bir veya birden fazla sübstitüsyonuna, dizideki bir veya birden fazla nükleik asidin (veya kodonun) bir veya birden fazla silinmesine, dizideki bir veya birden fazla nükleik asidin (veya kodonun) bir veya birden fazla eklenmesine veya içeri yerlestirilmesine ve/veya dizideki bir veya birden fazla nükleik asidin (veya kodonun) klevajina veya bir veya birden fazla kirpilmasina, tabi tutulabilir. Nükleik asit dizisindeki çok sayida bu tarz degisim, orijinal nükleik asit dizisi tarafindan sifrelenen polipeptit enzime kiyasla elde edilen sifrelenmis polipeptit enzimin enzimatik aktivitesini büyük ölçüde degistirmeyebilir. Bulusun bir nükleik asit dizisi ayrica, arzu edildiginde, söz konusu bir veya birden fazla kodon hâlâ ayni amino asidi (asitleri) sifrelerken, bir ekspresyon sisteminde (örn., bakteriyel ekspresyon sisteminde) optimum ekspresyon saglayan bir veya birden fazla kodon içerecek sekilde de modifiye edilebilir.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulus burada tarif edilen amino asit sübstitüsyonlarina sahip olan diziler içeren ve ayni zamanda bir veya birden fazla ilave amino asit sübstitüsyonu, örnegin, konservatif ve konservatif-olmayan sübstitüsyon, içeren arzu edilen enzimatik aktiviteye (örn., proteaz enzimi aktivitesine veya temizleme performansi aktivitesine) sahip olan enzim polipeptitlerinin bir cinsini saglar, burada polipeptit arzu edilen enzimatik aktiviteyi (örn., istem 1'e göre polipeptit enziminin temizleme aktivitesinde veya performansinda yansitildigi üzere, proteolitik aktiviteyi) gösterir, idame ettirir veya yaklasik olarak idame ettirir. Bazi uygulamalarda, proteolitik aktivitesi istem 1'e göre polipeptit enziminin temizleme aktivitesinde veya performansinda yansitilir. Bulusa uygun sekilde amino asit sübstitüsyonlari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir veya birden fazla konservatif-olmayan sübstitüsyonu ve/veya bir veya birden fazla konservatif amino asit sübstitüsyonunu, içerebilir. Bir konservatif amino asit rezidüsü sübstitüsyonu tipik olarak, amino asit rezidülerinin bir fonksiyonel sinifi içindeki bir üyeyi ayni fonksiyonel sinifa ait olan bir rezidü ile degistirmeyi içerir (konservatif amino asit rezidülerinin fonksiyonel olarak homolog oldugu fonksiyonel homoloji yüzdesini hesaplamada korunmus oldugu düsünülür). Bir konservatif amino asit sübstitüsyonu tipik olarak bir amino asit dizisi içindeki bir amino asidin bir fonksiyonel olarak benzer amino asit ile sübstitüsyonunu içerir. Örnegin, alanin, glisin, serin ve treonin fonksiyonel olarak benzerdir ve dolayisiyla bir digeri için konservatif amino asit sübstitüsyonlari görevi görebilir. Aspartik asit ve glutamik asit bir digeri için konservatif sübstitüsyonlar görevi görebilir. Asparajin ve glutamin bir digeri için konservatif sübstitüsyonlar görevi görebilir. Arjinin, Iizin ve histidin bir digeri için konservatif sübstitüsyonlar görevi görebilir. Izolösin, Iösin, metiyonin ve valin bir digeri için konservatif sübstitüsyonlar görevi görebilir. Fenilalanin, tirozin ve triptofan bir digeri için konservatif sübstitüsyonlar görevi görebilir.

Diger konservatif amino asit sübstitüsyonu gruplari göz önünde bulundurulur. Örnegin, amino asitler benzer fonksiyon veya kimyasal yapi veya bilesim ile (örn., asidik, bazik, alifatik, aromatik, sülfür-içeren) gruplandirilabilir. Örnegin, bir alifatik gruplama asagidakileri içerebilir: Glisin (G), Alanin (A), Valin (V), Lösin (L), Izolösin (l). Bir digeri için konservatif sübstitüsyonlar oldugu düsünülen amino asitler içeren diger gruplar asagidakileri içerir: aromatik: Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W); sülfür-içeren: Metiyonin (M), Sistein (C); Bazik: Arjinin (R), Lizin (K), Histidin (H); Asidik: Aspartik asit (D), Glutamik asit (E); polar-olmayan yüksüz rezidüler: Sistein (C), Metiyonin (M) ve Prolin (P); hidrofilik yüksüz rezidüler: Serin (S), Treonin (T), Asparajin (N) ve Glutamin (Q). Amino asitlerin ilave gruplamalari teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi- bilinir ve çesitli standart ders kitaplarinda tarif edilir. Yukaridaki sübstitüsyon gruplari ile baglantili olarak, buradaki bir polipeptit dizisinin Iistelemesi tüm konservatif bir sekilde sübstüte edilmis polipeptit dizilerinin bir açik Iistelemesini saglar.

Daha konservatif sübstitüsyonlar, ayni zamanda veya alternatif olarak uygun olabilen, yukarida tarif edilen amino asit rezidüsü siniflari içinde var olur. Daha konservatif olan sübstitüsyonlar için konservasyon gruplari asagidakileri içerir: valin-lösin-izolösin, fenilalanin-tirozin, Iizin-arjinin, alanin-valin ve asparajin-glutamin.

Bulusun bir polipeptit dizisinin konservatif olarak sübstüte edilmis varyasyonlari (örn., bulusun varyant serin proteazlari), ayni konservatif sübstitüsyon grubunun, bir konservatif olarak seçilmis amino asidi ile, polipeptit dizisinin amino asitlerinin bir küçük yüzdesinin, bazen %5'inden, %4'ünden, %3'ünden, %2'sinden veya %1'inden daha azinin sübstitüsyonlarini veya 10'dan, 9'dan, 8'den, 7'den, 6'dan, 5'ten, 4'ten, 3'ten, Z'den veya 1'den daha az amino asidinin sübstitüsyonlarini içerir.

Bulus, bulusun polipeptitlerini sifreleyen, topluca "bulusun nükleik asitleri" veya bulusun polinükleotidleri" olarak ifade edilebilen izole edilmis, dogal-olusumlu veya rekombinant nükleik asitler saglar. Asagida tarif edilenlerin tümü dâhil olmak üzere, bulusun nükleik asitleri, tipik olarak söz konusu polipeptidi veya bunun fragmanini sifreleyen bir dizi içeren bir plazmid ekspresyon vektörünün ekspresyonu yoluyla, bulusun polipeptitlerinin rekombinant üretiminde (öm, ekspresyonunda) kullanislidir. Yukarida tartisildigi üzere, polipeptitler temizlenmeye ihtiyaci olan bir esyayi veya bir yüzeyi (örn., bir esyanin yüzeyini) temizleme için temizleme uygulamalarinda ve temizleme bilesimlerine kullanisli olan enzimatik aktiviteye (öm, proteolitik aktiviteye) sahip olan serin proteazi polipeptitlerini içerir.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun polinükleotidi emsallendirilen polinükleotide bir belirtilen derecede nükleik asit homolojisine sahip olan bir polinükleotiddir. Bazi uygulamalarda, polinükleotid SEO ID NO: 1'den, SEQ lD NO: 4'ten, SEQ ID NO: 9'dan, SEQ ID NO: 12'den ve SEO ID NO: 15'ten olusan gruptan seçilen bir nükleik asit dizisi içerir. Diger uygulamalarda, polinükleotid SEO ID NO: 1'e, 4'e, 18'e, 21'e, 24'e veya bulusun polinükleotidi ayrica SEO ID NO: 1'den, SEQ ID NO: 4'ten, SEQ ID NO: 9'dan, SEQ ID NO: 12'den ve SEO ID NO: 15'ten olusan gruptan seçilen bir nükleik asit dizisine bir komplementer nükleik asit dizisine de sahip olabilir. Bir ilave uygulamada, olabilir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun bir polinükleotidi SEQ ID NO: 3'ün, 6'nin, program, örnegin, BLAST, ALIGN veya CLUSTAL, kullanilarak, amino asit dizisi Bir ilave uygulamada, mevcut bulusun polinükleotidi SEQ ID NO: 42'nin, 43'ün, 44'ün, 45'in, 46'nin, 47'nin veya 48'in bir amino asit dizisini sifreler ve ilaveten SEQ ID NO: özdeslige sahip olan bir amino asit dizisini sifreler. Bir baska uygulamada, mevcut bir amino asit dizisini sifreler ve ilaveten SEQ ID NO: 3'ün veya 6'nin bir amino asit dizisine %70'Iik özdeslige sahip olan bir amino asit dizisini sifreler. Mevcut bulusa göre, veya 48'in bir amino asit dizisini sifreler ve ilaveten SEQ ID NO: 11'in, 14'ün, 17'nin, amino asit dizisini sifreler. Daha bir ilave uygulamada, mevcut bulusun polinükleotidi sifreler ve ilaveten SEO ID NO: 11'in, 14'ün veya 17'nin bir amino asit dizisine %72'Iik özdeslige sahip olan bir amino asit dizisini sifreler.

Bazi uygulamalarda, bulus yukarida "Bulusun Polipeptitleri" baslikli bölümde ve burada baska yerde tarif edilen bulusun (herhangi bir füzyon proteini, vb. dâhil olmak üzere) herhangi bir polipeptidini sifreleyen bir nükleotid dizisi içeren bir izole edilmis, rekombinant, büyük ölçüde saf veya dogal-olusumlu olmayan nükleik asit saglar. Bazi uygulamalarda, bulus burada tarif edilen bulusun (herhangi bir füzyon proteini, vb. dâhil olmak üzere) herhangi bir polipeptidini sifreleyen bir nükleotid dizisi içeren bir sentetik olarak türetilmis nükleik asit saglar. Bulus ayrica, yukarida veya burada baska yerde tarif edilen bulusun herhangi bir polipeptidinin ikisinin veya daha fazlasinin bir kombinasyonunu sifreleyen bir izole edilmis, rekombinant, büyük ölçüde saf veya dogal-olusumlu olmayan nükleik asit de saglar. Bulus ayrica burada tarif edilen bulusun herhangi bir polipeptidinin ikisinin veya daha fazlasinin bir kombinasyonunu sifreleyen bir nükleotid dizisi içeren bir sentetik olarak türetilmis nükleik asit de saglar. Mevcut bulus, mevcut bulusun bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen nükleik asitler saglar, burada serin proteazi polipeptidi proteolitik aktiviteye sahip olan bir matürformdur. Bazi uygulamalarda, serin proteazi (örn., BspAI02518) bir homolog pro-peptit dizisi (örn., BspAl02518 pro-peptidi) ile rekombinant olarak eksprese edilir. Diger uygulamalarda, serin proteazi bir heterolog pro-peptit dizisi (örn., asagidaki sekilde izah edilen GG36 pro-peptit dizisi: ile rekombinant olarak eksprese edilir.

Bulusun nükleik asitleri herhangi bir uygun sentez, manipülasyon ve/veya izolasyon teknigi veya bunlarin kombinasyonlari kullanilarak üretilebilir. Ömegin, bulusun bir polinükleotidi standart nükleik asit sentezi teknikleri, örnegin, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi-bilinen kati-faz sentez teknikleri, kullanilarak üretilebilir. Bu tarz tekniklerde, en fazla 50 veya daha fazla nükleotid bazlik fragmanlar tipik olarak sentezlenir, akabinde esasen herhangi bir arzu edilen bitisik nükleik asit dizisini olusturmak için (örn., enzimatik veya kimyasal Iigasyon yöntemleri ile) baglanir.

Bulusun nükleik asitlerinin sentezi ayrica, tipik olarak otomatiklestirilmis sentetik yöntemlerde tatbik edildigi üzere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, klasik fosforamidit veya Matthes et al., tarafindan tarif edilen yöntemin (Bakiniz, Matthes et al., EMBO J. uygun yöntem ile de kolaylastirilabilir. Bulusun nükleik asitleri ayrica bir otomatik DNA sentezleyici kullanilarak da üretilebilir. Istege göre uyarlanmis nükleik asitler çesitli ticari kaynaklardan (örn., The Midland Certified Reagent Company, the Great American Gene Company, Operon Technologies Inc., ve DNA2.0) siparis edilebilir. Nükleik asitleri sentezlemek için diger teknikler ve ilgili prensipler teknikte bilinir (Bakiniz, örn., Yukarida gösterildigi üzere, nükleik asitlerin modifikasyonunda kullanisli olan rekombinant DNA teknikleri teknikte iyi bilinir. Örnegin, teknikler, örnegin, restriksiyon endonükleaz sindirimi, Iigasyon, ters transkripsiyon ve cDNA üretimi ve polimeraz zincir reaksiyonu (örn., PCR) teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinir ve kolaylikla kullanilir. Bulusun nükleotidleri ayrica, bulusun bir serin proteazi polipeptidini (polipeptitlerini) sifreleyen polinükleotidlere hibridize olabilen veya bunlari PCR ile çogaltabilen bir veya birden fazla oligonükleotid probunu kullanarak cDNA kütüphanelerini tarama ile de elde edilebilir. cDNA klonlarini taramak ve izole etmek için prosedürler ve PCR amplifikasyon prosedürleri teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinir ve teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen standart referanslarda tarif edilir. Bulusun bazi nükleik asitleri bir dogal-olusumlu (öm, bir enzimi veya ana proteazi sifreleyen) polinükleotid omurgasini, örnegin, bir bilinen mutajenez prosedürü (örn., yere-yönlendirilmis mutajenez, yer satürasyon mutajenezi ve in vitro rekombinasyon), ile degistirme ile elde edilebilir. Bulusun serin proteazi polipeptitlerini sifreleyen bulusun modifiye edilmis polinükleotidlerini üretmek için uygun olan, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, yer-satürasyon mutajenezi, tarama mutajenezi, içeri yerlestirme ile ilgili mutajenez, silinme mutajenezin, rastgele mutajenez, yere-yönlendirilmis mutajenez ve yönlendirilmis-evrim ayni zamanda çesitli baska rekombinasyonel yaklasimlar, dâhil olmak üzere, çesitli yöntemler teknikte bilinir.

Serin Proteazlari Üretmek için Vektörler, Konak Hücreler ve Yöntemler Mevcut bulus, burada tarif edilen bulusun en az bir serin proteazi polinükleotidini (öm., burada tarif edilen bulusun bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen bir polinükleotid) içeren vektörler, bulusun en az bir nükleik asidini veya polinükleotidini içeren ekspresyon vektörleri veya ekspresyon kasetleri, bulusun en az bir nükleik asidini veya polinükleotidini içeren büyük ölçüde saf veya rekombinant DNA yapilari, bulusun en az bir polinükleotidini içeren izole edilmis veya rekombinant hücreler ve bu tarz vektörlerin, nükleik asitlerin, ekspresyon vektörlerinin ekspresyon kasetlerinin, DNA yapilarinin, hücrelerin, hücre kültürlerinin veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunun veya karisiminin birini veya birden fazlasini içeren bilesimler saglar.

Bazi uygulamalarda, bulus bulusun en az bir nükleik asidini veya polinükleotidini içeren bulusun en az bir vektörünü (örn., ekspresyon vektörünü veya DNA yapisini) içeren rekombinant hücreler saglar. Baska yöntemlerin teknikte mevcut olmasina ve bilinmesine ragmen, bazi bu tarz rekombinant hücreler bu tarz en az bir vektör ile transforme edilir veya transfekte edilir. Bu tarz hücreler tipik olarak konak hücreler olarak ifade edilir. Bazi bu tarz hücreler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Bacillus sp. hücreleri, örnegin, B. subtilis hücreleri, dâhil olmak üzere, bakteriyel hücreleri içerir.

Bulus ayrica, bulusun en az bir serin proteazi polipeptidini içeren rekombinant hücreler (örn., rekombinant konak hücreler) de saglar.

Bazi uygulamalarda, bulus bulusun bir nükleik asidini veya polinükleotidini içeren bir vektör saglar. Bazi uygulamalarda, vektör, içinde bulusun bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen bulusun bir polinükleotid dizisinin etkili gen ekspresyonu için gerekli olan bir veya ilave nükleik asit segmentine (öm., bulusun bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen bulusun polinükleotidine operatif olarak baglanmis bir promotöre) operatif olarak baglandigi, bir ekspresyon vektörüdür veya ekspresyon kasetidir. Bir vektör bir transkripsiyon sonlandirici ve/veya bir seleksiyon geni, örnegin, plazmid ile enfekte edilmis konak hücrelerin anti-mikrobiyal-içeren vasatlarda büyümesi ile sürekli kültürel idamesine olanak saglayan, bir antibiyotik direnç geni, içerebilir.

Bir ekspresyon vektörü bir plazmidden veya viral DNA'dan türetilebilir veya alternatif uygulamalarda, her ikisinin elemanlarini da içerir. Emsal vektörler, bunlarla sinirli Cutting [eds.], Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons Bakiniz, ayrica, Perego, lntegrational Vectors for Genetic Manipulations in B. subtilis, in Sonenshein et al., [eds.] B. subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics, American Society for Microbiology, Washington, Bir hücre içinde söz konusu proteinin (öm, serin proteazi polipeptidinin) ekspresyonu ve üretimi için, serin proteazi polipeptidini sifreleyen bir polinükleotidin en az bir kopyasini içeren ve bazi durumlarda çok sayida kopyasini içeren en az bir ekspresyon vektörü serin proteazinin ekspresyonu için uygun olan kosullar altinda hücreye transforme edilir. Mevcut bulusun bazi uygulamalarinda, serin proteazi polipeptidini sifreleyen bir polinükleotid dizisi (ayni zamanda vektöre dâhil edilen diger diziler) konak hücrenin genomuna entegre edilirken, diger uygulamalarda, serin proteazi polipeptidini sifreleyen bir polinükleotid dizisi içeren bir plazmid vektörü hücre içinde otonom ekstrakromozomal element olarak kalir. Bulus hem ekstrakromozomal nükleik asit elementlerini hem de konak hücre genomuna entegre edilmis yeni gelen nükleotid dizilerini saglar. Burada tarif edilen vektörler bulusun serin proteazi polipeptitlerinin üretimi için kullanislidir. Bazi uygulamalarda, serin proteazi polipeptidini sifreleyen bir polinükleotid yapisi serin proteazi polipeptidini sifreleyen polinükleotidin konak kromozomuna entegrasyonuna ve opsiyonel olarak amplifikasyonuna olanak saglayan bir entegre etme vektörü üzerinde bulunur. Entegrasyon için yerlerin örnekleri teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinir. Bazi uygulamalarda, bulusun bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen bir polinükleotidin transkripsiyonu seçilmis öncül proteaz için dogal-tip promotör olan bir promotör tarafindan gerçeklestirilir. Bazi baska uygulamalarda, promotör öncül proteaza heterologdur ancak konak hücre içinde fonksiyoneldir. Spesifik olarak, bakteriyel konak hücrelerde kullanim için uygun promotörlerin örnekler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, amyE, amyQ, amyL, pstS, sacB, pSPAC, pAprE, pVeg, pHpall promotörlerini, B. stearothermophilus maltojenik amilaz geninin, B. amy/oliquefaciens (BAN) amilaz geninin, B. subti'lis alkalin proteaz geninin, B. clausi'i' alkalin proteaz geninin, B. pumi'lis ksilosidaz geninin, B. thuringiensis crylIIA'nin ve B. Iicheni'formis alfa-amilaz geninin promotörünü, içerir.

Ilave promotörler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, A4 promotörünü ayni zamanda faj Lamda PR veya PL promotörlerini ve E. co/i lac, trp veya tac promotörlerini, içerir.

Mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri bakteriler ve funguslar dâhil olmak üzere, herhangi bir uygun mikroorganizmanin konak hücrelerinde üretilebilir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri Gram-pozitif bakterilerde üretilebilir. Bazi uygulamalarda, konak hücreler Bacillus spp.'dir, Streptomyces spp.'dir, Escheri'chia spp.'dir, Aspergillus spp.'dir, Trichoderma spp.'dir, Pseudomonas spp.'dir, Corynebacterium spp.'dir, Saccharomyces spp.'dir veya Pichi'a spp.'dir. Bazi uygulamalarda, serin proteazi polipeptitleri Bacillus sp. konak hücreleri tarafindan üretilir. Bulusun serin proteazi polipeptitlerinin üretiminde kullanim alani bulan Bacillus sp. konak hücrelerinin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, B. Ii'cheniformis'i, B. Ientus'u, B. subtilis'i, B. amyIo/iquefaciens'i, B. Ientus'u, B. brevis'i, B. stearothermophilus'u, B. alka/ophilus'u, B. coagulans'i, B. Circu/ans'i, B. pumilis'i, B. thuringiensis'i, B. clausii'yi ve B. megaterium'u ayni zamanda Bacillus cinsi içindeki diger organizmalari, içerir. Bazi uygulamalarda, B. subtilis konak hücreleri serin proteazi polipeptitlerinin üretimi için kullanilir. 5,264,366 ve 4, Numarali U.S. Patentleri, baska uygun suslarin kullanilabilmesine ragmen, bulusun serin proteazi polipeptidini üretmek için kullanilan çesitli bacillus konak suslarini tarif Bulusun serin proteazi polipeptitlerini üretmek için kullanilabilen bir kaç bakteriyel sus, rekombinant-olmayan (yani, dogal-tip) Bacillus sp. suslarini ayni zamanda dogal- olusumlu suslarin ve/veya rekombinant suslarin varyantlarini içerir. Bazi uygulamalarda, konak sus bir rekombinant sustur, burada söz konusu bir polipeptidi sifreleyen bir polinükleotid konaga uygulanmistir. Bazi uygulamalarda, konak sus bir B. subti/is konak susudur ve özel olarak bir rekombinant B. subtilis konak susudur.

Bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, , 8819, susu dâhil olmak üzere çok sayida B. subtii'is susu bilinir (Bakiniz, örn., Hoch et al., Patentleri ve EP 0134048). B. subti/i's'in bir ekspresyon konak hücreleri olarak kullanimi Bazi uygulamalarda, Bacillus konak hücresi asagidaki genlerin en az birinde bir mutasyon veya silinme içeren bir Baci/Ius sp.'dir, degU, degS, degR ve degQ. Bazi uygulamalarda, mutasyon bir degU genindedir ve bazi uygulamalarda, mutasyon oppA'da veya opp operonunun diger genlerinde (Bakiniz, örn., Perego et al., Mol. operonunda oppA'daki bir mutasyon ile ayni fenotipe neden olan herhangi bir mutasyonun bulusun degistirilmis Bacillus susunun bazi uygulamalarinda kullanim alani bulacagi düsünülür. Bazi uygulamalarda, bu mutasyonlar tek basina gerçeklesirken, diger uygulamalarda, mutasyonlarin kombinasyonlari mevcuttur. Bazi uygulamalarda, bulusun bir serin proteazi polipeptidini üretmek için kullanilabilen bir degistirilmis Bacillus konak hücresi susu yukarida-bahsedilen genlerin birinde veya birden fazlasinda hâlihazirda bir mutasyon içeren bir Bacillus konagi susudur. Buna ek olarak, endojen proteaz genlerinin mutasyonunu (mutasyonlarini) ve/veya silinmelerini içeren Bacillus sp. konak hücreleri kullanim alani bulur. Bazi uygulamalarda, Bacillus konak hücresi aprE ve nprE genlerinin bir Silinmesini içerir. Diger uygulamalarda, Bacillus sp. konak hücresi 5 proteaz geninin bir Silinmesini içerirken, diger uygulamalarda, Bacillus sp. konak hücresi 9 proteaz geninin bir Silinmesini içerir Konak hücreler bulusun en az bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen en az bir nükleik asit ile teknikte bilinen herhangi bir uygun yöntem kullanilarak transforme edilir. Bir nükleik asidi (örn., DNA'yi) plazmid DNA yapilarindan veya vektörlerden yararlanan Bacillus hücrelerine veya E. coli hücrelerine uygulamak ve bu tarz plazmid DNA yapilarini veya vektörleri bu tarz hücrelere transforme etmek için yöntemler iyi bilinir.

Bazi uygulamalarda, plazmidler bunu takiben E. coli hücrelerinden izole edilir ve Bacillus hücrelerine transforme edilir. Bununla birlikte, araya giren mikroorganizmalar, örnegin, E. coli, kullanmak esansiyel degildir ve bazi uygulamalarda, bir DNA yapisi veya vektör bir Bacillus konagina dogrudan uygulanir.

Teknikte uzmanligi olan kisiler bulusun nükleik asit dizilerini Bacillus hücrelerine uygulamak için uygun olan yöntemlerin gayet farkindadir (Bakiniz, örn., Ferrari et al., dâhil olmak üzere transformasyon, transdüksiyon ve protoplast füzyonu tarzindaki yöntemler iyi bilinir ve mevcut bulusta kullanim için uygundur. Bacillus hücrelerini transforme etmek için teknikte bilinen yöntemler bir donör plazmidin bir kismen homolog yerlesik plazmid tasiyan kompetan hücreler tarafindan alimini içeren plazmid belirteçli kurtarma transformasyonu tarzinda yöntemleri içerir (Bakiniz, Contente et al., transformasyonu taklit eden bir proseste yerlesik "yardimci“ plazmidin homolog bölgesi ile yeniden-birlesir.

Yaygin olarak kullanilan yöntemlere ek olarak, bazi uygulamalarda, konak hücreler bulusun bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen bir nükleik asit içeren bir DNA yapisi veya vektör ile dogrudan transforme edilir (yani, bir ara hücre konak hücreye uygulamadan önce DNA yapisini veya vektörü çogaltmak veya baska sekilde islemek için kullanilmaz). Bulusun DNA yapisinin veya vektörünün konak hücrelere uygulanmasi konak genomuna içeri yerlestirme olmadan bir konak hücreye bir nükleik asit dizisini (örn., DNA dizisini) uygulamak için teknikte bilinen fiziksel ve kimyasal yöntemleri içerir. Bu tarz yöntemler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, kalsiyum klorür presipitasyonunu, elektroporasyonu, çiplak DNA'yi, Iipozomlari ve benzerlerini, içerir.

Ilave uygulamalarda, DNA yapilari veya vektör, plazmid içine yerlestirilmeden, bir plazmid ile birlikte-transforme edilir. Ilave uygulamalarda, bir selektif belirteç degistirilmis Bacillus susundan teknikte bilinen yöntemler ile silinir (Bakiniz, Stahl et al., Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun transforme edilmis hücreleri geleneksel besin vasatlari içinde kültürlenir. Uygun spesifik kültür kosullari, ömegin, sicaklik, pH ve benzerleri teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinir ve bilimsel literatürde iyi tarif edilir. Bazi uygulamalarda, bulus bulusun en az bir serin proteazi polipeptidini veya en az bir nükleik asidini içeren bir kültür (örn., hücre kültürü) saglar.

Bazi uygulamalarda, bulusun en az bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen en az bir polinükleotid dizisi ile transforme edilmis konak hücreler mevcut proteazin ekspresyonuna izin veren kosullar altinda bir uygun besin vasati içinde kültürlenir, bundan sonra elde edilen proteaz kültürden geri-kazanilir. Bazi uygulamalarda, hücreler tarafindan üretilen proteaz, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, konak hücreleri sentrifügasyon veya filtrasyon ile vasattan ayirma, süpernatantin veya filtratin proteinöz bilesenlerini bir tuz (örn., amonyum sülfat) vasitasiyla çökeltme, kromatografik saflastirma (örn., iyon degisim, jel filtrasyon, afinite, vb.), dâhil olmak üzere, geleneksel prosedürler ile kültür vasatindan geri-kazanilir.

Bazi uygulamalarda, bir rekombinant konak hücre tarafindan üretilen bir serin proteazi polipeptidi kültür vasatina salgilanir. Bir saflastirmayi kolaylastirma alanini sifreleyen bir nükleik asit dizisi proteinlerin saflastirilmasini kolaylastirmak için kullanilabilir. Bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen bir polinükleotid dizisi içeren bir vektör veya DNA yapisi ilaveten, serin proteazi polipeptidinin saflastirilmasini kolaylastirmak için bir saflastirmayi kolaylastirma alanini sifreleyen bir nükleik asit dizisi içerebilir (Bakiniz, alanlari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, immobilize edilmis metaller üzerine saflastirmaya olanak saglayan metal selatlama peptitlerini, örnegin, histidin- edilmis immünoglobülin üzerinde saflastirmaya olanak saglayan protein A alanlarini ve FLAGS uzatma/afinite saflastirma sisteminde yararlanilan alanlari, içerir. Bir yarilabilen baglayici dizinin, örnegin, Faktör XA'nin veya enterokinazin (öm, Invitrogen, San Diego, CA, firmasindan erisilebilen dizilerin) saflastirma alani ve heterolog protein arasina dâhil edilmesi de saflastirmayi kolaylastirmak için kullanim alani bulur.

Bir enzimin, örnegin, bulusun bir serin proteazi polipeptidinin, enzimatik aktivitesini saptamak ve ölçmek için analizler iyi bilinir. Proteazlarin (örn., bulusun serin proteazi polipeptitlerinin) aktivitesini saptamak ve ölçmek için çesitli analizler de teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinir. Özel olarak, proteaz aktivitesini ölçmek için, 280 nm'de absorbans olarak veya Folin yöntemi kullanilarak kolorimetrik olarak ölçülen, kazeinden veya hemoglobinden asitte-çözünebilen peptitlerin salimina dayanan analizler mevcuttur. Baska emsal analizler, kromojenik substratlarin çözündürülmesini içerir (Bakiniz, örn., Ward, "Proteinases," in Fogarty (ed.)., Microbial Enzymes and bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, süksiniI-Ala-AIa-Pro-Phe-para nitroanilid analizini (sük-AAPF-pNA) ve 2,4,6-trinitrobenzen sülfonat sodyum tuzu analizini (TNBS analizini), içerir. Teknikte olanlar tarafindan bilinen çok sayida ilave referans uygun Bir konak hücredeki bir matür proteazin (öm, mevcut bulusun matür serin proteazi polipeptitlerinin) üretim düzeyini belirlemek için çesitli yöntemler kullanilabilir. Bu tarz yöntemler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, proteaza spesifik poliklonal veya monoklonal antikorlardan yararlanan yöntemleri, içerir. Emsal yöntemler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, enzime-bagli bagisiklik analizlerini (ELIZA'yi), radyoimmünoanalizleri (RIA'yi), flüoresan immünoanalizleri (FlA'yi) ve flüoresan aktive edilmis hücre ayirmayi (FACS'i), içerir. Bu ve baska analizler teknikte iyi bilinir (Bakiniz, Bazi baska uygulamalarda, bulus bulusun bir matür serin proteazi polipeptidini yapmak veya üretmek için yöntemler saglar. Bir matür serin proteazi polipeptidi bir sinyal peptidi veya bir pro-peptit dizisi içermez. Bazi yöntemler bulusun bir serin proteazi polipeptidini, bir rekombinant bakteriyel konak hücre, örnegin, mesela, bir Bacillus sp. hücresi (öm, bir B. subti'lis hücresi), içinde yapmayi veya üretmeyi içerir. Bazi uygulamalarda, bulus bulusun bir serin proteazi polipeptidini üretmek içni bir yöntem saglar, bu yöntem bulusun bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen bir nükleik asit içeren bir rekombinant ekspresyon vektörü içeren bir rekombinant konak hücreyi serin proteazi polipeptidinin üretimi için elverisli olan kosullar altinda yetistirmeyi içerir. Bazi bu tarz yöntemler ilaveten serin proteazi polipeptidini kültürden geri-kazanmayi içerir.

Bazi uygulamalarda, bulus bulusun bir serin proteazi polipeptidini üretmenin yöntemlerini saglar, bu yöntemler asagidakileri içerir: (a) bulusun bir serin proteazi polipeptidini sifreleyen bir nükleik asit içeren bir rekombinant ekspresyon vektörünü hücrelerin (ör/1., bakteriyel hücrelerin, örnegin, B. subtilis hücrelerinin) bir popülasyonuna uygulama ve (b) hücreleri ekspresyon vektörü tarafindan sifreleyen serin proteazi polipeptidini üretmek için elverisli olan kosullar altinda bir kültür vasati içinde kültürleme. Bazi bu tarz yöntemler ilaveten asagidakini içerir: (c) serin proteazi polipeptidini hücrelerden veya kültür vasatindan izole etme.

V. Serin Proteazlari Içeren Bilesimler A. Kumas ve Ev Bakim Ürünleri Aksi bildirilmedikçe, burada saglanan tüm bilesen veya bilesim düzeyleri bu bilesenin veya bilesimin aktif düzeyine atfen yapilir ve piyasada satilan kaynaklarda bulunabilen, safsizliklari, örnegin, rezidüel çözücüleri veya yan-ürünleri, disarida birakir. Enzim bilesenlerinin agirliklari toplam aktif proteine göredir. Tüm yüzdeler ve oranlar aksi gösterilmedikçe agirliga göre hesaplanir. Tüm yüzdeler ve oranlar aksi gösterilmedikçe toplam bilesime göre hesaplanir. Bulusun bilesimleri temizleme bilesimleri, örnegin, deterjan bilesimleri, içerir. Emsallendirilmis deterjan bilesimlerinde, enzim düzeyleri toplam bilesimin agirligina göre saf enzim ile ifade edilir ve aksi belirtilmedikçe, deterjan içerik maddeleri toplam bilesimlerin agirligina göre ifade edilir.

Mevcut bulusun amaçlari için esansiyel degil iken, buradan sonra örneklendirilen yardimcilarin sinirlayici-olmayan listesi çabuk hazirlanan temizleme bilesimlerinde kullanim için uygundur. Bazi uygulamalarda, bu yardimcilar, örnegin, temizlenecek olan substratin muamelesi için, temizleme performansina yardimci olmak veya temizleme performansini arttirmak için veya parfümler, renklendiriciler, boyalar veya benzerleri ile olan durumda oldugu gibi temizleme bilesiminin estetiklerini modifiye etmek için, katilir. Bu tarz yardimcilarin mevcut bulusun serin proteazi polipeptitlerine ek oldugu anlasilir. Bu ilave bilesenlerin tam dogasi ve bunlarin katilim düzeyleri bilesimin fiziksel formuna ve bunun bunlar için kullanilacagi temizleme operasyonuna bagli olacaktir. Uygun yardimci malzemeler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, çamasir suyu katalizörlerini, baska enzimleri, enzim stabilize etme sistemleri, selantlari, optik parlaticilari, kir salim polimerlerini, boya transferi ajanlarini, dagiticilari, sabun köpügü baskilayicilarini, boyalari, parfümleri, renklendiricileri, dolgu tuzlarini, foto- aktivatörleri, flüoreserleri, kumas parlaticilari, hidrolize edilebilen sürfaktanlari, koruyuculari, antioksidanlari, anti-çekme ajanlarini, anti-kirisiklik ajanlarini, germisitleri, fungisitleri, renk beneklerini, gümüs-bakimini, anti-matlasma ve/veya anti-korozyon ajanlarini, alkalinite kaynaklarini, çözündürme ajanlarini, tasiyicilari, isleme yardimcilarini, pigmentleri ve pH kontrolü ajanlarini, sürfaktanlari, insa edicileri, selatlama ajanlarini, boya transferini inhibe etme ajanlarini, depolama yardimcilarini, dagiticilari, ilave enzimleri ve enzim stabilazörlerini, katalitik malzemeleri, çamasir suyu aktivatörlerini, çamasir suyu destekleyicilerini, hidrojen peroksidi, hidrojen peroksit kaynagini, önceden-olusturulmus perasitleri, polimerik dagitma ajanlarini, kil kir uzaklastirma/antI-yenIden-depolama ajanlarini, parlaticilari, sabun köpügü baskilayicilarini, tasiyicilari, hidrotoplari, isleme yardimcilarini ve/veya pigmentleri, içerir. Asagidaki açiklamaya ek olarak, bu tarz baska yardimcilarin uygun örnekleri ve bulunur. Temizleme yardimci malzemelerinin temizleme bilesimleri içindeki mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri ile uyumlu olmadigi uygulamalarda, o zaman iki bilesenin kombinasyonu uygun olana kadar temizleme yardimci malzemelerini ve proteazi (proteazlari) ayrilmis (yani, bir digeri ile temas etmeyen) sekilde tutmanin uygun yöntemleri kullanilir. Bu tarz ayirma yöntemleri teknikte bilinen herhangi bir uygun yöntemi (örn., jel kapsüller, enkapsülasyonu, tabletleri, fiziksel ayirmayi, vb.) içerir. Yukarida bahsedilen yardimci içerik maddeleri mevcut bulusun temizleme bilesimlerinin dengesini olusturabilir.

Mevcut bulusun temizleme bilesimleri, örnegin, çamasir uygulamalarinda, sert yüzey temizleme uygulamalarinda, otomatik bulasik yikama ve elde bulasik yikama dâhil olmak üzere bulasik yikama uygulamalarinda ayni zamanda kozmetik uygulamalarda, örnegin, denturlarin, dislerin, saçin ve cildin temizlenmesinde, avantajli bir sekilde kullanilir. Mevcut bulusun enzimleri ayrica kontakt lensin temizlenmesinde ve yarar debridmani uygulamalarinda kullanim için de uygundur. Buna ek olarak, daha düsük sicakliktaki çözeltilerde arttirilmis etkililigin essiz avantajlarindan dolayi, mevcut bulusun enzimleri çamasir uygulamalari için ideal bir sekilde uygundur. ilaveten, mevcut bulusun enzimleri granüler ve sivi bilesimlerde kullanim alani bulur.

Mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri ayrica, temizleme katki maddesi ürünlerinde de kullanim alani bulur. Bazi uygulamalarda, düsük sicakliktaki çözelti temizleme uygulamalari kullanim alani bulur. Bazi uygulamalarda, mevcut bulus, ilave agartma etkililigi arzu edildiginde, bir yikama prosesine dâhil edilmesi ideal olarak uygun olan mevcut bulusun en az bir enzimini içeren temizleme katki maddesi ürünleri saglar. Bu tar durumlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, düsük sicakliktaki çözelti temizleme uygulamalarini, içerir. Bazi uygulamalarda, katki maddesi ürünü bunun en basit formunda, bir veya birden fazla proteazdir. Bazi uygulamalarda, katki maddesi bir temizleme prosesine eklenmesi için dozaj formunda ambalajlanir. Bazi uygulamalarda, katki maddesi bir peroksijen kaynaginin kullanildigi ve arttirilmis agartma etkililiginin arzu edildigi bir temizleme prosesine eklenmesi için dozaj formunda ambalajlanir.

Bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, haplar, tabletler, jel kapsüller veya baska tek dozajli birimler, örnegin, öncede-ölçülmüs pudralar veya sivilar, dâhil olmak üzere herhangi bir uygun tek dozajli birim form mevcut bulus ile kullanim alani bulur. Bazi uygulamalarda, dolgu (dolgular) veya tasiyici malzeme (malzemeler) bu tarz bilesimlerin hacmini arttirmak için dâhil edilir. Uygun dolgu veya tasiyici malzemeler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, sülfatin, karbonatin ve silikatin çesitli tuzlarini ayni zamanda talki, kili ve benzerlerini, içerir. Sivi bilesimler için uygun dolgu veya tasiyici malzemeler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, suyu veya polioller ve dioller dâhil olmak üzere düsük moleküler agirlikli primer ve sekonder alkolleri, içerir. Bu tarz alkollerin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, metanolü, etanolü, propanolü ve izopropanolü, içerir. Bazi uygulamalarda, bilesimler yaklasik %5 ila yaklasik %90 bu tarz malzemelerden içerir. Asidik dolgular pH'yi düsürmek için kullanim alani bulur. Bazi uygulamalarda, temizleme katki maddesi, asagida daha tam bir sekilde tarif edildigi üzere, yardimci içerik maddeleri içerir.

Mevcut temizleme bilesimleri ve temizleme katki maddeleri, tek basina veya baska proteazlar ve/veya ilave enzimler ile kombinasyon hâlinde, burada saglanan serin proteazi polipeptitlerinin en az birinin bir etkili miktarini gerektirir. Enzimin gerekli olan düzeyi mevcut bulusun bir veya birden fazla serin proteazi polipeptidinin eklenmesi ile saglanir. Tipik olarak, mevcut temizleme bilesimleri mevcut bulusun serin proteazi ila yaklasik 0,1 araligindaki agirlik yüzdesinde içerir.

Buradaki temizleme bilesimleri tipik olarak, sulu temizleme operasyonlarinda kullanim sirasinda, yikama suyunun yaklasik 4,0 ile yaklasik 11,5 araliginda veya hatta yaklasik ,0 ila yaklasik 11,5 araliginda veya hatta yaklasik 5,0 ila yaklasik 8,0 araliginda veya hatta yaklasik 7,5 ila yaklasik 10,5 araliginda olan bir pH'a sahip olacagi sekilde formüle edilir. Sivi ürün formülasyonlari tipik olarak yaklasik 3,0 ila yaklasik 9,0 araliginda veya hatta yaklasik 3 ila yaklasik 5 araliginda olan bir pH'a sahip olacak sekilde formüle edilir. Granüler çamasir ürünleri tipik olarak yaklasik 9 ile yaklasik 11 araliginda bir pH'a sahip olacak sekilde formüle edilir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri yikama kosullari altinda bir alkali pH'a, örnegin, yaklasik yaklasik 9,0 ila yaklasik 11,0 araliginda olan bir pH'a, sahip olacak sekilde formüle edilebilir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri yikama kosullari altinda bir nötral pH'a, örnegin, yaklasik 5,0 ile yaklasik 8,0 araliginda veya yaklasik ,5 ile yaklasik 8.0 araliginda veya yaklasik 6,0 ila yaklasik 8,0 araliginda veya yaklasik 6,0 ile yaklasik 7,5 araliginda olan bir pH'a, sahip olacak sekilde formüle edilebilir. Bazi uygulamalarda, nötral pH kosullari temizleme bilesimi (agzag) 1:100 deiyonize su içinde 20°C'de çözündürüldügünde ölçülebilir, bir geleneksel pH metre kullanilarak ölçülebilir. pH'i tavsiye edilen kullanim düzeylerinde kontrol etmek için teknikler, tamponlar, alkaliler, asitler, vb. kullanimlari içerir ve teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinir.

Bazi uygulamalarda, serin proteazi polipeptidi (polipeptitleri) bir granüler bilesim veya sivi içinde kullanildiginda, serin proteazi polipeptidini saklama sirasinda granüler bilesimin diger bilesenlerinden korumak için serin proteazi polipeptidinin bir enkapsüle edilmis parçacik formunda olmasi arzu edilebilir. Buna ek olarak, enkapsülasyon ayrica, temizleme prosesi sirasinda serin proteazi polipeptidinin yararlanilabilirligini kontrol etme yoluyladir. Bazi uygulamalarda, enkapsülasyon serin proteazi polipeptidinin (polipeptitlerinin) ve/veya ilave enzimlerin performansini arttirir. Bu açidan, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri teknikte bilinen herhangi bir uygun enkapsüle etme malzemesi ile enkapsüle edilir. Bazi uygulamalarda, enkapsüle etme malzemesi tipik olarak mevcut bulusun serin proteazi polipeptidinin (polipeptitlerinin) en azindan parçasini enkapsüle eder. Tipik olarak, enkapsüle etme malzemesi suda- çözünebilir ve/veya suda-dagitilabilir. Bazi uygulamalarda, enkapsüle etme malzemesi O°C veya daha yüksek olan bir cam geçis sicakligina (Tg'ye) sahiptir. Cam geçis sicakligi WO 97/11151'de daha detayli bir sekilde tarif edilir. Enkapsüle etme malzemesi tipik olarak karbonhidratlardan, dogal veya sentetik sakizlardan, kitinden, kitozandan, selülozdan ve selüloz türevlerinden, silikatlardan, fosfatlardan, boratlardan, polivinil alkolden, polietilen glikolden, parafin mumlarindan ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilir. Enkapsüle etme malzemesi bir karbonhidrat oldugunda, bu tipik olarak monosakkaritler, oligosakkaritler, polisakkaritler ve bunlarin kombinasyonlari arasindan seçilir. Bazi tipik uygulamalarda, enkapsüle plastikten, örnegin, termoplastiklerden, akrilonitrilden, metakrilonitrilden, poliakrilonitrilden, polimetakrilonitrilden ve bunlarin karisimlarindan, yapilan bir mikro- küredir; kullanim alani bulan piyasada satilan mikro-küreler, bunlarla sinirli kalmamak PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® ve SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA) tarafindan saglananlari, içerir.

Yikamaya dâhil edilen proteazlarin bunlara maruz birakildigi deterjan formülasyonlarini, yikama suyu hacimlerini, yikama suyu sicakliklarini ve yikama süresi uzunluklarini çesitlendirmeyi içeren çesitli yikama kosullari vardir. Bir düsük- derecede deterjan konsantrasyonlu sistem, yikama suyunda yaklasik 800 ppm'den daha az deterjan bilesenlerinin bulundugu deterjanlari içerir. Bir orta-derecede deterjan konsantrasyonlu sistem, yikama suyu içinde yaklasik 800 ppm ila yaklasik 2000 ppm araliginda deterjan bilesenlerinin bulundugu deterjanlari içerir. Bir yüksek-derecede deterjan konsantrasyonlu sistem, yikama suyu içinde yaklasik 2000 ppm'den daha fazla deterjan bilesenlerinin bulundugu deterjanlari içerir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun "soguk sulu yikama“si yaklasik 10°C ila yaklasik 40°C araliginda veya yaklasik °C ila yaklasik 30°C araliginda veya yaklasik 15°C ila yaklasik 25°C araliginda ayni zamanda yaklasik 15°C ila yaklasik 35°C araligi içindeki tüm diger kombinasyonlarda ve 10°C ila 40°C içindeki tüm araliklarda olan sicakliklarda yikama için uygun olan Farkli cografyalar tipik olarak farkli su sertligine sahiptir. Su sertligi genel olarak galon basina karma Ca2*/Mgz*tanecigi cinsinden tarif edilir. Sertlik su içindeki kalsiyum (Ca2+) ve magnezyum (MgZ*) miktarinin bir ölçüsüdür. Amerika Birlesik Devletleri'ndeki çogu su serttir ancak sertligin derecesi degiskenlik gösterir. Orta-derecede sert (60-120 ppm) Tablo I. Su Sertligi Su Galonda tanecik Milyonda parça Yumusak 1,0'dan daha az 17'den daha az Hafif-derecede sert 1,0 ile 3,5 17 ila 60 Orta-derecede sert 3,5 ile 7,0 60 ila 120 Çok sert 10,5'ten daha fazla 180'den daha fazla Bu dogrultuda, bazi uygulamalarda, mevcut bulus yikama kosullarinin (öm, su sicakliginin, su sertliginin ve/veya deterjan konsantrasyonunun) en az bir grubunda sasirtici yikama performansi gösteren serin proteazi polipeptitleri saglar. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri yikama performansi açisindan diger serin proteazi polipeptit proteazlari ile karsilastirilabilir. Mevcut bulusun bazi uygulamalarinda, burada saglanan serin proteazi polipeptitleri arttirilmis oksidatif kararlilik, arttirilmis termal kararlilik, çesitli kosullar altinda arttirilmis temizleme kapasiteleri ve/veya arttirilmis selatör kararliligi gösterir. Buna ek olarak, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri, yine tek basina veya insa ediciler ve stabilazörler ile kombinasyon hâlinde, deterjanlar içermeyen, temizleme bilesimlerine kullanim alani Mevcut bulusun bazi uygulamalarinda, temizleme bilesimleri bilesimin agirligi olarak yaklasik %0,00001 ila yaklasik %10 araliginda olan bir düzeyde mevcut bulusun en az bir serin proteazi polipeptidini ve bilesimin agirligi olarak temizleme yardimci malzemeleri içeren (öm, yaklasik %99,999 ile yaklasik %90,0 araliginda olan) dengeyi içerir. Mevcut bulusun bazi baska uygulamalarinda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri bilesimin agirligi olarak yaklasik %0,0001 ila yaklasik %10 araliginda, yaklasik %0,005 ila yaklasik %0,5 araliginda olan bir düzeyde en az bir serin proteazi polipeptidi ve temizleme yardimci malzemeleri içeren temizleme bilesiminin (öm, dengesini içerir.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri temizleme performansi ve/veya kumas bakimi ve/veya bulasik yikama yararlari saglayan bir veya birden fazla ilave deterjan enzimi içerir. Uygun enzimlerin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, açil transferazlari, alfa-amilazlari, beta-amilazlari, alfa-galaktosidazlari, arabinosidazlari, aril esterazlari, beta-galaktosidazlari, karajenazlari, katalazlari, sellobiyohidrolazlari, selülozlari, kondroitinazlari, kütinazlari, endo-beta-1,4- glukanazlari, endo-beta-mannanazlari, esterazlari, ekzo-mannanazlari, galaktanazlari, glukoamilazlari, hemiselülazlari, hiyalüronidazlari, keratinazlari, Iakkazlari, Iaktazlari, asetil esterazlari, pektinazlari, pentozanazlari, peroksidazlari, fenoloksidazlari, fosfatazlari, fosfolipazlari, fitazlari, poligalaktüronazlari, proteazlari, pullulanazlari, redüktazlari, ramnogalaktüronazlari, beta-glukanazlari, tannazlari, transglutaminazlari, ksilan asetil-esterazlar, ksilanazlari, ksiloglukanazlari ve ksilosidazlari veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu veya karisimini, içerir. Bazi uygulamalarda, enzimlerin amilaz ile baglantili olarak proteaz, Iipaz, kütinaz ve/veya selüloz gibi geleneksel uygulanabilir enzimleri içeren bir kombinasyonu (yani, bir "kokteyl") kullanilir.

Burada saglanan serin proteazi polipeptitlerine ek olarak, herhangi bir baska uygun proteaz mevcut bulusun bilesimlerindeki kullanim alani bulur. Uygun proteazlar hayvansal, bitkisel veya mikrobiyal orijinli olanlari içerir. Bazi uygulamalarda, mikrobiyal proteazlar kullanilir. kimyasal olarak veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar dâhil edilir. Bazi uygulamalarda, proteaz bir serin proteazidir, tercihen bir alkali mikrobiyal proteazdir veya bir tripsin-benzeri proteazdir. Alkali proteazlarin örnekleri, subtilisinleri, özellikle Baci'llus'tan türetilmis olanlari (ör/1., subtilisin'i, Ientus'u, amyloliquefaciens'i, subtilisin Carlsberg'i, subtilisin 309'u, subtilisin 147'yi ve subtilisin Numarali U.S. Patentleri'nde tarif edilen mutant proteazlari içerir. Ilave proteaz örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, tripisini (örn., of domuz veya bovin orijinli olan) ve WO 89/06270'te tarif edilen Fusarium proteazini, içerir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusta kullanim alani bulan piyasada satilan proteaz enzimleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, MAXATASE®'i, MAXACALTM'I, MAXAPEMTM'i, OPTICLEAN®'i, OPTIMASE®'i, PROPERASE®'i, PURAFECT®'i, PURAFECT® OXP'yi, PURAMAXTM'i, EXCELLASETM'i, PREFERENZTM proteazlarini (öm, P100'ü, P110'u, P280'i), proteazlarini (Örn., P; ALCALASE®'i, SAVINASE®'i, PRIMASE®'i, DURAZYMTM'I, POLARZYME®'I, OVOZYME®'i, KANNASE®'i, LIQUANASE®'i, NEUTRASE®'i, RELASE®'i ve ESPERASE®'i (Novozymes); BLAPTM`I ve BLAPTM varyantlarini (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany) ve KAP'i (B. alkalophilus subtilisinini; Kao Corp., Tokyo, Japan), içerir. Çesitli proteazlar W095/23221'de, WO 8,530,219 Numarali U.S. Patentlerinde ve çesitli baska patentlerde tarif edilir. Bazi mevcut bulusta kullanim alani bulur. Emsal metaloproteazlar nprE'yi, B. subtilis'de eKSprese edilen nötral metal0proteazin rekombinant formunu (Bakiniz, örn., WO 07/044993), ve PMN'yi, B. amyIo/iquefacients'ten saflastirilmis nötral metaloproteazi, Buna ek olarak, herhangi bir uygun Iipaz mevcut bulusta kullanim alani bulur. Uygun Kimyasal olarak veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar mevcut bulus tarafindan kapsanir. Kullanisli Iipazlarin örnekleri, Hum/cola /anug/'nosa Iipazini EP 238 023), Candida Iipazini, örnegin, C. antarctica Iipazini (öm, C. antarctica Iipazi A'yi veya B'yi; Bakiniz, örn., EP 214 761), Pseudomonas Iipazlarini, örnegin, P. alcaligenes Iipazini ve P. pseudoalcaligenes Iipazini (Bakiniz, örn., EP 218 272), P. cepacia Iipazini (Bakiniz, örn., EP 331 376), P. stutzeri Iipazini (Bakiniz, örn., GB 1,372,034), P. fluorescens Iipazini, Bacillus Iipazini (öm, B. subtilis lipazini [Dartois et ilaveten, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Penici/Iium camemberti'i Iipazi (Bakiniz, uygulamalarinda kullanim alani bulur.

Lipaz polipeptit enzimlerinin baska tipleri, örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Pseudomonas mendocina'dan türetilmis kütinaz (Bakiniz, WO 88/0936?) ve Fusarium solani pisfden türetilmis kütinaz (Bakiniz, WO 90/09446), dâhil olmak üzere, kütinazlar, da mevcut bulusun bazi uygulamalarinda kullanim alani bulur.

Ilave uygun Iipazlar, Iipazlari, örnegin, M1 LIPASETM'I, LUMA FASTTM'I ve LIPOMAXTM'i (Genencor); LIPEX®'i, LIPOLASE®'i ve LIPOLASE® ULTRA'yi (Novozymes) ve LIPASE PTM "Amano'"yi (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japan), Mevcut bulusun bazi uygulamalarinda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ilaveten bilesimin agirligi olarak yaklasik %0,00001 ila yaklasik %10 ilave lipaz olan bir düzeyde lipazlar ve bilesimin agirligi olarak temizleme yardimci malzemelerinin dengesini içerir.

Mevcut bulusun bazi baska uygulamalarinda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri olan bir düzeyde lipazlar da içerir.

Mevcut bulusun bazi uygulamalarinda, herhangi bir uygun amilaz mevcut bulusta kullanim alani bulur. Bazi uygulamalarda, alkali çözeltilerde kullanim için uygun olan herhangi bir amilaz (Öm, alfa ve/veya beta) da kullanim alani bulur. Uygun amilazlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bakteriyel veya fungal orijinli olanlari, içerir.

Kimyasal olarak veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar bazi uygulamalara dâhil edilir. Mevcut bulusta kullanim alani bulan amilazlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, B. licheni'formis'ten elde edilen oi-amilazlari, içerir (Bakiniz, örn., GB Mevcut bulusta kullanim alani bulan piyasada satilan amilazlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, DURAMYL®'i. TERMAMYL®'i. FUNGAMYL®'i, STAINZYME®'i.

STAINZYME PLUS®'i, STAINZYME ULTRA®'yi ve BANTM'i (Novozymes) ayni zamanda POWERASETM'i, RAPIDASE®'i ve MAXAMYL® P'yi (Genencor), içerir.

Mevcut bulusun bazi uygulamalarinda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ilaveten bilesimin agirligi olarak yaklasik %0,00001 ila yaklasik %10 ilave amilaz olan bir düzeyde amilazlar ve bilesimin agirligi olarak temizleme yardimci malzemelerinin dengesini içerir. Mevcut bulusun bazi baska uygulamalarinda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ayrica bilesimin agirligi olarak yaklasik %0,0001 ila yaklasik %10, yaklasik %0,5 amilaz olan bir düzeyde amilazlar da içerir.

Bazi ilave uygulamalarda, herhangi bir uygun selülaz mevcut bulusun temizleme bilesimlerinde kullanim alani bulur. Uygun selülazlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bakteriyel veya fungal orijinli olanlari, içerir. Kimyasal olarak veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar bazi uygulamalara dâhil edilir. Uygun selülazlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Hum/'cola inso/ens selülazlarini, içerir (Bakiniz, örn., 4,435,307 Numarali U.S. Patenti). Özel olarak uygun selülazlar renk bakim yararlarina sahip olan selülazlardir (Bakiniz, örn., EP 0 495 257). Mevcut bulusta kullanim alani bulan piyasada satilan selülazlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, CELLUZYME®'i, CAREZYME®`I (Novozymes), REVITALENZTiVI 100'ü (Danisco US lnc) ve KAC- 500(B)TM'yi (Kao Corporation), içerir. Bazi uygulamalarda, selülazlar matür dogal-tip veya varyant selülazlarin kisimlari veya fragmanlari olarak katilir, burada N-ucunun bir kismi silinir (Bakiniz, örn., 5,874,276 Numarali U.S. Patenti). Ilave uygun selülazlar, 7,833,773 Numarali U.S. Patentinde bulunanlari içerir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ilaveten bilesimin agirligi olarak yaklasik %0,00001 ila yaklasik %10 ilave selülaz olan bir düzeyde selülazlar ve bilesimin agirligi olarak temizleme yardimci malzemelerinin dengesini içerir. Mevcut bulusun bazi baska uygulamalarinda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ayrica bilesimin agirligi olarak ila yaklasik %2, yaklasik %0,005 ila yaklasik %0,5 selülaz olan bir düzeyde selülazlar da içerir.

Deterjan bilesimlerinde kullanim için uygun olan herhangi bir mannanaz ayrica mevcut bulusta da kullanim alani bulur. Uygun mannanazlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bakteriyel veya fungal orijinli olanlari, içerir. Kimyasal olarak veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar bazi uygulamalara dâhil edilir. Mevcut bulusta kullanim alani bulan çesitli mannanazlar bilinir (Bakiniz, örn., 6,566,114 Numarali U.S. bulusta kullanim alani bulan piyasada satilan mannanazlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, MANNASTAR®'I, PURABRITETM'i ve MANNAWAY®'i, içerir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ilaveten bilesimin agirligi olarak yaklasik %0,00001 ila yaklasik %10 ilave mannanaz olan bir düzeyde mannanazlar ve bilesimin agirligi olarak temizleme yardimci malzemelerinin dengesini içerir. Mevcut bulusun bazi baska uygulamalarinda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ayrica mannanaz olan bir düzeyde mannanazlar da içerir.

Bazi uygulamalarda, proksidazlar mevcut bulusun bilesimlerinde hidrojen peroksit veya bunun bir kaynagi (örn., bir perkarbonat, perborat veya persülfat) ile kombinasyon hâlinde kullanilir. Bazi alternatif uygulamalarda, oksidazlar oksijen ile kombinasyon hâlinde kullanilir. Enzimlerin her iki tipi de, tercihen bir hizlandirma ajani ile birlikte, tekstil boyasinin bir boyanmis kumastan bir baska kumasa transferini önlemek için) peroksidazlar/oksidazlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bitkisel, bakteriyel veya fungal orijinli olanlari, içerir. Kimyasal olarak veya genetik olarak modifiye edilmis mutantlar bazi uygulamalara dâhil edilir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ilaveten bilesimin agirligi olarak yaklasik %0,00001 ila yaklasik enzimleri ve bilesimin agirligi olarak temizleme yardimci malzemelerinin dengesini içerir. Mevcut bulusun bazi baska uygulamalarinda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ayrica bilesimin agirligi olarak yaklasik %0,0001 ile yaklasik %10, yaklasik enzimleri de içerir.

Bazi uygulamalarda, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, perhidrolazlar, dâhil olmak olarak, bazi uygulamalarda, yukarida bahsedilen enzimlerin karisimlari, özel olarak bir veya birden fazla ilave proteaz, amilaz, Iipaz, mannanaz ve/veya en az bir selülaz, burada kapsanir. Gerçekte, bu enzimlerin çesitli karisimlarinin mevcut bulusta kullanim alani bulacagi düsünülür. Ayrica, serin proteazi polipeptidinin (polipeptitlerinin) ve bir veya birden fazla ilave enzimin çesitlilik gösteren düzeylerinin her ikisinin de bagimsiz bir sekilde temizleme bilesiminin temizleme yardimci malzemeleri olma dengesinin, yaklasik %10 araliginda olabilecegi de düsünülür. Temizleme yardimci malzemelerinin spesifik seçimi temizlenecek olan yüzeyi, esyayi veya kumasi ve (öm, yikama deterjani kullanimi yoluyla) kullanim sirasinda temizleme kosullari için bilesimin arzu edilen formu düsünülerek kolaylikla yapilabilir.

Bazi uygulamalarda, burada saglanan bir veya birden fazla serin proteazi polipeptidinin (polipeptitlerinin) bir etkili miktari proteinöz leke çikarilmasina ihtiyaci olan çesitli yüzeyleri temizleme için kullanisli olan bilesimlere dâhil edilir. Bu tarz temizleme bilesimleri sert yüzeyleri, kumaslari ve tabaklari temizleme tarzinda uygulamalar içi temizleme bilesimleri içerir. Gerçekte, bazi uygulamalarda, mevcut bulus kumas temizleme bilesimleri saglarken, diger uygulamalarda, mevcut bulus kumas-disi temizleme bilesimleri saglar. Göze çarpan bir sekilde, mevcut bulus ayrica (dis temizleme maddeleri, dis macunlari, agiz çalkalama sulari, vb. ayni zamanda dentur temizleme bilesimleri dâhil olmak üzere) oral bakim dâhil olmak üzere kisisel bakim için uygun temizleme bilesimleri, cilt ve saç temizleme bilesimleri de saglar. Mevcut bulusun herhangi bir formda (yani, sivi, granüler, çubuk, yari-kati, jeller, emülsiyonlar, tabletler, kapsüller, vb.) olan deterjan bilesimlerini kapsamasi amaçlanir. Örnek olarak, burada mevcut bulusun serin proteazi polipeptitlerinin kullanim alani buldugu bir kaç temizleme bilesimi asagida daha detayli bir sekilde tarif edilir. Mevcut bulusun temizleme bilesimlerinin çamasir makinesi yikama yönteminde (yöntemlerinde) kullanim için uygun bilesimler olarak formüle edildigi bazi uygulamalarda, mevcut bulusun bilesimleri tercihen en az bir sürfaktan ve en az bir insa edici bilesik ayni zamanda tercihen organik polimerik bilesikler, agartma ajanlari, ilave enzimler, sabun köpügü baskilayicilari, dagiticilar, kalsiyum sabunu dagiticilari, kir süspansiyonu ve ati- yeniden-depolama ajanlari ve korozyon inhibitörleri arasindan seçilen bir veya birden fazla temizleme yardimci malzemesi içerir. Bazi uygulamalarda, çamasir bilesimleri ayrica (yani, ilave temizleme yardimci malzemeleri olarak) yumusatma ajanlari da içerir. Mevcut bulusun bilesimleri ayrica kati veya sivi formda deterjan katki maddesi ürünlerinde de kullanim alani bulur. Bu tarz katki maddesi ürünlerinin geleneksel deterjan bilesimlerinin performansina takviye yapmasi ve/veya bunu desteklemesi amaçlanir ve bunlar temizleme prosesinin herhangi bir evresinde eklenebilir. Bazi uygulamalarda, buradaki çamasir deterjani bilesimlerinin yogunlugu 20°C'de ölçüldügünde bilesimin yaklasik 400 ila yaklasik 1200 g/litresi araliginda iken, diger uygulamalarda, bu yaklasik 500 ila yaklasik 950 g/litre araligindadir.

Manüel bulasik yikama yöntemlerinde kullanim için bilesimler olarak formüle edilen uygulamalarda, bulusun bilesimleri tercihen en az bir sürfaktan ve tercihen organik polimerik bilesikler, sabun köpügü arttirma ajanlari, grup ll metal iyonlari, çözücüler, hidrotroplar ve ilave enzimler arasindan seçilen en az bir ilave temizleme yardimci malzemesi içerir.

Bazi uygulamalarda, çesitli temizleme bilesimleri, örnegin, 6,605,458 Numarali U.S.

Patenti'nde saglananlar, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri ile kullanim alani bulur. Dolayisiyla, bazi uygulamalarda, mevcut bulusun en az bir serin proteazi polipeptidini içeren bilesimler bir kompakt granüler kumas temizleme bilesimi iken, diger uygulamalarda, bilesim renkli kumaslarin yikanmasinda kullanisli olan bir granüler kumas temizleme bilesimidir, ilave uygulamalarda, bilesim yikama kapasitesi yoluyla yumusatma saglayan bir granüler kumas temizleme bilesimidir, ilave uygulamalarda, bilesim bir agir is sivi kumas temizleme bilesimidir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun en az bir serin proteazi polipeptidini içeren bilesimler Patentleri'nde tarif edilenlerdir. Buna ek olarak, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri Avrupa veya Japonya yikama kosullari altinda özel yarari olan granüler çamasir deterjani bilesimlerinde kullanim alani bulur (Bakiniz, örn., 6,610,642 Numarali U.S. Patenti).

Bazi alternatif uygulamalarda, mevcut bulus burada saglanan en az bir serin proteazi polipeptidi içeren sert yüzey temizleme bilesimleri saglar Dolayisiyla, bazi uygulamalarda, mevcut bulusun en az bir serin proteazi polipeptidini içeren bilesimler Numarali U.S. Patentlerinde tarif edilenlerdir.

Daha ilave uygulamalarda, mevcut bulus burada saglanan en az bir serin proteazi polipeptidi içeren bulasik yikama bilesimleri saglar. Dolayisiyla, bazi uygulamalarda, mevcut bulusun en az bir serin proteazi polipeptidini içeren bilesimler bir sert yüzey tarif edilenlerdir. Bazi daha ilave uygulamalarda, mevcut bulus burada saglanan en az bir serin proteazi polipeptidini içeren bulasik yikama bilesimleri saglar. Bazi ilave uygulamalarda, mevcut bulusun en az bir serin proteazi polipeptidini içeren bilesimler Numarali U.S. Patentlerine dâhil edilen bilesiklerin ve temizleme yardimci malzemelerinin formülasyonlari ve açiklamasi burada saglanan serin proteazi polipeptitleri ile kullanim alani bulur.

Mevcut bulusun temizleme bilesimleri herhangi bir uygun formda formüle edilir ve formülatör tarafindan seçilen herhangi bir proses ile hazirlanir (Bakiniz, örn., Bir düsük pH'Ii temizleme bilesimi arzu edildiginde, bu tarz bilesimin pH'ibir malzeme, örnegin, monoetanolamin veya bir asidik malzeme, örnegin, HCI, eklenmesi vasitasiyla ayarlanir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusa göre temizleme bilesimleri bir asitlestirme parçacigi veya bir amino karboksilik insa edici içerir. Bir amino karboksilik insa edicinin örnekleri aminokarboksilik asitleri, bunlarin tuzlarini ve türevlerini içerir.

Bazi uygulamada, amino karboksilik insa edici bir aminopolikarboksilik insa edicidir, örnegin, glisin-N,N-diasetik asittir veya MOOC-CHR-N (CH2000M)2 genel formülünün türevidir, burada R, C1-12 alkildir ve M, alkali metaldir. Bazi uygulamalarda, amino karboksilik insa edici metilglisin diasetik asit (MGDA), GLDA (glutamik-N,N-diasetik asit), iminodisüksinik asit (lDS), karboksimetil inülin ve bunun tuzlari ve türevleri, aspartik asit-N-monoasetik asit (ASMA), aspartik asit-N,N-diasetik asit (ASDA), aspartik asit-N-monopropiyonik asit (ASMP), iminodisüksinik asit (IDA), N-(2-sülfometil) aspartik asit (SMAS), N-(2-sülf0etil)aspartik asit (SEAS), N-(2-sülfometil)glutamik asit (SMGL), N-(2-sülfoetil) glutamik asit (SEGL), IDS (iminodiasetik asit) ve bunun tuzlari ve türevleri, örnegin, N-metiliminodiasetik asit (MIDA), alfa-alanin-N,N-diasetik asit (alfa-ALDA), serin-N,N-diasetik asit (SEDA), izoserin-N,Ndiasetik asit (ISDA), fenilalanin-N,N-diasetik asit (PHDA), antranilik asit-N,N-diasetik asit (ANDA), sülfanilik asit-N,N-diasetik asit (SLDA), taurin-N,N-diasetik asit (TUDA) ve sülfometiI-N,N- diasetik asit (SMDA) ve bunun alkali metal tuzlari ve türevleri olabilir. Bazi uygulamalarda, asitlestirme parçacigi yaklasik 400 u ila yaklasik 1200 p araliginda olan bir agirlikli geometrik ortalamali parçacik boyutuna ve en az 550 g/L olan bir yigin yogunluguna sahiptir. Bazi uygulamalarda, asitlestirme parçacigi insa edicinin en az yaklasik %5'ini içerir.

Bazi uygulamalarda, asitlestirme parçacigi organik asitler ve mineral asitler dâhil olmak üzere herhangi bir asidi içerebilir. Organik asitler bir veya iki karboksile ve bazi durumlarda, en fazla 15 karbona, özellikle en fazla 10 karbona, sahip olabilir, örnegin, formik, asetik, propiyonik, kaprik, okzalik, süksinik, adipik, maleik, fumarik, sebasik, malik, Iaktik, glikolik, tartarik ve glioksilik asitler. Bazi uygulamalarda, asit sitrik asittir.

Mineral asitler hidroklorik ve sülfürik asidi içerir. Bazi durumlarda, bulusun asitlestirme parçacigi bir yüksek düzeyde amino karboksilik insa edici içeren bir hayli aktif parçaciktir. Sülfürik asidin nihai parçacigin kararliligina ilaveten katki sagladigi bulunmustur.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulusa göre temizleme bilesimleri en az bir sürfaktan ve/veya bir sürfaktan sistemi içerir, burada sürfaktan iyonik-olmayan sürfaktanlar, anyonik sürfaktanlar, katyonik sürfaktanlar, amfoterik sürfaktanlar, zwitteriyonik sürfaktanlar, yari-polar iyonik-olmayan sürfaktanlar ve bunlarin karisimlari arasindan seçilir. Bazi uygulamalarda, sürfaktan, temizleme bilesiminin agirligi olarak, yaklasik düzey yaklasik %1 ila yaklasik %50 araliginda iken, daha ilave uygulamalarda, düzey yaklasik %5 ila yaklasik %40 araligindadir.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri bir veya birden fazla deterjan insa edici veya insa edici sistem içerir. En az bir insa edici katilan bazi uygulamalarda, temizleme bilesimleri temizleme bilesiminin agirligi olarak en az yaklasik %1, yaklasik %3 ila yaklasik %60 araliginda veya hatta yaklasik %5 ila yaklasik %40 araliginda insa edici içerir. Insa ediciler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, polifosfatlarin alkali metal, amonyum ve alkanolamonyum tuzlarini, alkali metal silikatlari, toprak alkali ve alkali metal kabonatlari, alüminosilikatlari, polikarboksilat bilesiklerini, eter hidroksipolikarboksilatlari, maleik anhidritin with etilen veya vinil metil eter ile kopolimerlerini, 1,3,5-trihidroksi benzen-2,4,6-trisülkonik asidi ve karboksimetiloksisüksinik asidi, poliasetik asitlerin, örnegin, etilendiamin tetraasetik asidin ve nitrilotriasetik asidin çesitli alkali metal, amonyum veya sübstüte edilmis amonyum tuzlarini ayni zamana polikarboksilatlari, örnegin, mellitik asidi, süksinik karboksimetiloksisüksinik asidi ve bunlarin çözünebilen tuzlarini, içerir. Gerçekte, herhangi bir uygun insa edicinin mevcut bulusun çesitli uygulamalarinda kullanim alani bulacagi düsünülür.

Bazi uygulamalarda, insa ediciler suda-çözünebilen sertlikte iyon kompleksleri (örn., tecrit edici insa ediciler), örnegin, sitratlar ve polifosfatlar (örn., sodyum tripolifosfat ve sodyum tripolifosfat hekzahidrat, potasyum tripolifosfat ve karma sodyum ve potasyum tripolifosfat, vb.) olusturur. Teknikte (Bakiniz, örn., EP 2 100 949) bilinenler dâhil olmak üzere, herhangi bir uygun insa edicinin mevcut bulusta kullanim alani bulacagi düsünülür.

Bazi uygulamalarda, burada kullanim için insa ediciler fosfatli insa ediciler ve fosfat- olmayan insa ediciler içerir. Bazi uygulamalarda, insa edici birfosfatli insa edicidir. Bazi uygulamalara, insa edici bir fosfat-olmayan insa edicidir, Mevcut oldugunda, insa ediciler bilesimin agirligi olarak %0,1 ila %80 araliginda veya %5 ila 60 araliginda veya fosfat-olmayan insa edicilerin bir karisimini içerir. Uygun fosfatli insa ediciler, sodyum tuzlari dâhil olmak üzere, bu bilesiklerin alkali metal tuzlari dâhil olmak üzere, mono- fosfatlari, di-fosfatari, tri-polifosfatlari veya oligomerik-polifosfatlari içerir. Bazi uygulamalarda, bir insa edici sodyum tripolifosfat (STPP) olabilir. Ek olarak, bilesim karbonat ve/veya sitrat, tercihen bulusun bir nötral pH'li bilesimini saglamaya yardimci olan sitrat, içerebilir. Baska uygun fosfat-olmayan insa ediciler, polikarboksilik asitlerin ve bunlarin kismen veya tamamen nötralize edilmis tuzlarinin, monomerik polikarboksilik asitlerin ve hidroksikarboksilik asitlerin ve bunlarin tuzlarinin homopolimerlerini ve kopolimerlerini içerir. Bazi uygulamalarda, yukarida bahsedilen bilesiklerin tuzlari amonyum ve/veya alkali metal tuzlarini, yani, sodyum tuzlari dâhil olmak üzere, lityum, sodyum ve potasyum tuzlarini, içerir. Uygun polikarboksilik asitler asiklik, alisiklik, hetero-siklik ve aromatik karbosiklik asitleri içerir, burada, bazi uygulamalarda, bunlar her bir durumda bir digerinden, bazi durumlarda, en fazla iki karbon atomu, ile ayrilmis olan en az iki karboksil grubu içerebilir.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri en az bir selatlama ajani içerir. Uygun selatlama ajanlari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bakir, demir ve/veya manganez selatlama ajanlarini ve bunlarin karisimlarini, içerir. En az bir selatlama ajaninin kullanildigi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri söz konusu temizleme bilesiminin agirligi olarak yaklasik %0,1 ila yaklasik %15 araliginda veya hatta yaklasik %3,0 ila yaklasik %10 araliginda selatlama ajani içerir.

Bazi daha ilave uygulamalarda, burada saglanan temizleme bilesimleri en az bir depolama yardimcisi içerir. Uygun depolama yardimcilari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, polietilen glikolü, polipropilen glikolü, polikarboksilati, kir salim polimerlerini, örnegin, politeleftalik asidi, killeri, örnegin, kaoliniti, montmorilloniti, atapüljiti, illiti, bentoniti, haloysiti ve bunlarin karisimlarini, içerir.

Burada gösterildigi üzere, bazi uygulamalarda, anti-yeniden-depolama ajanlari mevcut bulusun bazi uygulamalarinda kullanim alani bulur. Bazi uygulamalarda, iyonik- olmayan sürfaktanlar kullanim alani bulur. Örnegin, otomatik bulasik yikama uygulamalarinda, iyonik-olmayan sürfaktanlar, film olusumunu ve beneklenmeyi önlemek için ve parlamayi iyilestirmek için, yüzey modifikasyon amaçlari için, özellikle kaplama için, kullanim alani bulur. Bu iyonik-olmayan sürfaktanlar ayrica kirlerin yeniden-depolanmasini önlemede de kullanim alani bulur. Bazi uygulamalarda, anti- yeniden-depolama ajani teknikte bilindigi üzere bir iyonik-olmayan sürfaktandir (Bakiniz, örn., EP 2 100 949). Bazi uygulamalarda, iyonik-olmayan sürfaktan etoksillenmis iyonIk-olmayan sürfaktanlar, epoksi-basliklandirilmis poli(0ksialkillenmis) alkollerin ve amin oksitlerin sürfaktanlari olabilir.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri bir veya birden fazla boya transferini inhibe etme ajani içerir. Uygun polimerik boya transferini inhibe etme ajanlari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, polivinilpirrolidon polimerlerini, poliamin N- oksit polimerlerini, N-vinilpirrolidonun ve N-vinilimidazolün kopolimerlerini, polivinilokzazolidonlari ve polivinilimidazolleri veya bunlarin karisimlarini, içerir. En az bir boya transferini inhibe etme ajaninin kullanildigi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri temizleme bilesiminin agirligi olarak yaklasik %0,0001 ila yaklasik %10 araliginda, yaklasik %0,01 ila yaklasik %5 araliginda veya hatta yaklasik Bazi uygulamalarda, silikatlar mevcut bulusun bilesimlerine dâhil edilir. Bazi bu tarz uygulamalarda, sodyum silikatlar (örn., sodyum disilikat, sodyum metasilikat ve kristalli fillosilikatlar) kullanim alani bulur. Bazi uygulamalarda, silikatlar yaklasik %1 ila yaklasik %20 araliginda olan bir düzeyde mevcuttur. Bazi uygulamalarda, silikatlar bilesimin agirligi olarak yaklasik %5 ila yaklasik %15 araliginda olan bir düzeyde mevcuttur.

Bazi daha ilave uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ayrica dagiticilar da içerir. Uygun suda çözünebilen organik malzemeler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, homo- veya ko-polimerik asitleri veya bunlarin tuzlarini, içerir, burada polikarboksilik asit bir digerinden en fazla iki karbon atomu ile ayrilmis en az iki karboksil radikali içerir.

Bazi ilave uygulamalarda, temizleme bilesimlerinde kullanilan enzimler herhangi bir uygun teknik ile stabilize edilir. Bazi uygulamalarda, burada kullanilan enzimler bu tarz iyonlari enzimlere saglayan bitmis bilesimlerde kalsiyum ve/veya magnezyum iyonlarinin suda-çözünebilen kaynaklarinin varligi ile stabilize edilir. Bazi uygulamalarda, enzim stabilazörleri oligosakkaritleri, polisakkaritleri ve toprak alkali metaller, örnegin, kalsiyum tuzlari, örnegin, kalsiyum format, dâhil olmak üzere inorganik Iki-degerlikli metal tuzlarini içerir. Enzim stabilizasyonu için çesitli tekniklerin mevcut bulusta kullanim alani bulacagi düsünülür. Örnegin, bazi uygulamalarda, burada kullanilan enzimler bu tarz iyonlari enzimlere saglayan bitmis bilesimlerde çinko (II), kalsiyum (II) ve/veya magnezyum (II) iyonlarinin ayni zamanda baska metal iyonlarinin (örn., baryum (II), skandiyum (II), demir (II), manganez (II), alüminyum (III), Kalay (II), kobalt (II), bakir (II), nikel (II) ve oksovanadiyum (IV) iyonlarinin) suda- çözünebilen kaynaklarinin varligi ile stabilize edilir. Klorürler ve sülfatlar da mevcut bulusun bazi uygulamalarinda kullanim alani bulur. Uygun oligosakkaritlerin ve polisakkaritlerin (örn., dekstrinlerin) örnekleri teknikte bilinir (Bakiniz, örn., WO 07/145964). Bazi uygulamalarda, geri-dönüsümlü proteaz inhibitörleri, örnegin, bor- içeren bilesikler (örn., borat, 4-formil fenil boronik asit), de kullanim alani bulur ve/veya bir tripeptit aldehiti, arzu edildigi üzere, kararliligi ilaveten iyilestirmek için kullanim alani Bazi uygulamalarda, çamasir sulari, çamasir suyu aktivatörleri ve/veya çamasir suyu katalizörleri mevcut bulusun bilesimlerinde mevcuttur. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri inorganik ve/veya organik agartma bilesigi (bilesikleri) içerir. Inorganik çamasir sulari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, perhidrat tuzlarini (örn., perborat, perkarbonat, perfosfat, persülfat ve persilikat tuzlarini) içerir. Bazi uygulamalarda, inorganik perhidrat tuzlari alkali metal tuzlaridir. Bazi uygulamalarda, perhidrat tuzlari, bazi baska uygulamalarda, tuzun kaplanmis olmasina ragmen, ilave koruma olmadan, kristalli kati madde olarak dâhil edilir. Teknikte bilinen herhangi bir uygun tuz mevcut bulusta kullanim alani bulur (Bakiniz, örn., EP 2 100 949).

Bazi uygulamalarda, çamasir suyu aktivatörleri mevcut bulusun bilesimlerinde kullanilir. Çamasir suyu aktivatörleri tipik olarak 60°C ve altindaki sicakliklardaki temizleme sürecinde agartma etkisini arttiran organik perasit öncülleridir. Burada kullanim için uygun olan çamasir suyu aktivatörleri, perhidroliz kosullari altinda, tercihen yaklasik 1 ila yaklasik 10 karbon atomuna, özel olarak yaklasik 2 ila yaklasik 4 karbon atomuna, sahip olan alifatik peroksoilkarboksilik asitler ve/veya opsiyonel olarak sübstüte edilmis perbenzoik asitler veren bilesikleri içerir. Ilave çamasir suyu aktivatörleri teknikte bilinir ve mevcut bulusta kullanim alani bulur (Bakiniz, örn., EP 2 100949).

Buna ek olarak, bazi uygulamalarda ve burada ilaveten tarif edildigi üzere, mevcut bulusun temizleme bilesimleri ilaveten en az bir çamasir suyu katalizörü içerir. Bazi uygulamalarda, manganez triazasiklononan ve ilgili bilesikler ayni zamanda kobalt, bakir, manganez ve demir kompleksleri kullanim alani bulur. Ilave çamasir suyu katalizörleri mevcut bulusta kullanim alani bulur (Bakiniz, örn., US 4,246,612, Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri bir veya birden fazla katalitik metal kompleksi içerir. Bazi uygulamalarda, bir metal-içeren çamasir suyu katalizörü kullanim alani bulur. Bazi uygulamalarda, metal çamasir suyu katalizörü, çamasir suyu katalitik aktivitesi tanimlanmis bir geçis metali katyonu (örn., bakir, demir, titanyum, rutenyum, tungsten, molibdenum veya manganez katyonlari), çok az çamasir suyu katalitik aktivitesine sahip olan veya hiç çamasir suyu katalitik aktivitesine sahip olmayan bir yardimci metal katyonu (öm, çinko veya alüminyum katyonlari) ve katalitik ve yardimci metal katyonlari için kararlilik sabitleri tanimlanmis olan bir tecrit edici içeren bir katalizör sistemi içerir, özel olarak etilendiamintetraasetik asit, etilendiamintetra (metilenfosfonik asit) ve bunlarin suda-çözünebilen tuzlari kullanilir (Bakiniz, örn., 4,430,243 Numarali U.S. Patenti). Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri bir manganez bilesigi araciligiyla katalizlenir. Bu tarz bilesiklerin ve kullanim düzeyleri teknikte iyi bilinir (Bakiniz, örn., 5,576,282 Numarali U.S.

Patenti). Ilave uygulamalarda, kobaltli çamasir suyu katalizörleri mevcut bulusun temizleme bilesimlerinde kullanim alani bulur. Çesitli kobaltli çamasir suyu katalizörleri bilinen prosedürler ile kolaylikla hazirlanir.

Bazi ilave uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri bir makropolisiklik sert ligandin (MRL'nin) bir geçis metali kompleksini içerir. Pratik anlamda ve sinirlandirma olmadan, bazi uygulamalarda, mevcut bulus tarafindan saglanan bilesimler ve temizleme prosesleri sulu yikama vasatinda en azindan yüz milyonda bir parça mertebesinde aktif MRL türü saglayacak sekilde ayarlanir ve bazi uygulamalarda, sivi 0,05 ppm ila yaklasik 10 ppm araliginda ve en tercihen yaklasik 0,1 ppm ila yaklasik 5 ppm araliginda, MRL saglar.

Bazi uygulamalarda, çabuk hazirlanan geçis-metalli çamasir suyu katalizöründeki geçis-metalleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, manganezi, demiri ve kromu, içerir.

MRL'Ier ayrica, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, çapraz-köprülenmis özel ultra-sert geçis metalli MRL'er bilinen prosedürler ile kolaylikla hazirlanir (Bakiniz, örn., WO Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri metal bakim ajanlari içerir.

Metal bakim ajanlari alüminyum, paslanmaz çelik ve ferröz-olmayan metaller (öm, gümüs ve bakir) dâhil olmak üzere metallerin matlasmasini, korozyonunu ve/veya oksidasyonunu önlemede ve/veya azaltmada kullanim alani bulur. Uygun metal bakim Bazi uygulamalarda, metal bakim ajani bir çinko tuzudur. Bazi ilave uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri agirlik olarak yaklasik %0,1 ila yaklasik % araliginda bir veya birden fazla metal bakim ajani içerir.

Bazi uygulamalarda, temizleme bilesimi bir varyant serin proteazi polipeptit proteazina sahip olan bir yüksek yogunluklu sivi (HDL) bilesimdir. HDL sivi çamasir deterjani (lineer veya dallanmis veya rastgele zincirli, sübstüte edilmis veya sübstüte edilmemis alkil sülfatlarin, alkil sülfonatlarin, alkil alkoksillenmis sülfatin, alkil fosfatlarin, alkil fosfonatlarin, alkil karboksilatlarin ve/veya bunlarin karisimlarindan olusan bir gruptan seçilen) bir anyonik temizlemeyi sürfaktan ve opsiyonel olarak (lineer veya dallanmis veya rastgele Zincirli, sübstüte edilmis veya sübstüte edilmemis alkil alkoksillenmis alkolün, örnegin, bir 08-013 alkil etoksillenmis alkolün ve/veya Ce-Ciz alkil fenol alkoksilatlarin bir grubundan seçilen) iyonik-olmayan sürfaktan dâhil olmak üzere, bir temizlemeyi sürfaktan (ag/ag %10-%40) içerebilir, opsiyonel olarak burada (6,0 ila 9 araliginda bir hidrofilik indeksi (Hlc'si) olan) anyonik temizleyici sürfaktanin iyonik- olmayan temizleyici sürfaktana agirlik orani 1:1'den daha büyüktür. Uygun temizleyici sürfaktanlar ayrica (alkil piridinyum bilesiklerinin, alkil kuaterner amonyum bilesiklerinin, alkil kuaterner fosfonyum bilesiklerinin, alkil ternari sülfonyum bilesiklerinin ve/veya bunlarin karisimlarinin bir grubundan seçilen) katyonik temizleyici sürfaktanlari; (alkanolamin sülfo-betainlerin bir grubundan seçilen) zwitteriyonik ve/veya amfoterik temizleyici sürfaktanlari; amfolitik sürfaktanlari; yari-polar iyonik-olmayan sürfaktanlari ve bunlarin karisimlarini da içerir.

Bilesim opsiyonel olarak, (ag %0,05-ag %10 araliginda, dallanmis hidrofilik ve hidrofobik özelliklere sahip olan alkoksillenmis polimerlerin, örnegin, alkoksillenmis polialkileniminlerin, bir grubundan seçilen) amfifilik alkoksillenmis makine yagi temizleme polimerlerinden olusan bir sürfaktanlik destekleyici polimer ve/veya (tipik olarak asagidakilerden olusan gruptan seçilen monomerler: doymamis C1-Ca karboksilik asitler, eterler, alkoller, aldehitler, ketonlar, esterler, seker birimleri, alkoksi birimleri, maleik anhidrit, doymus polialkoller, örnegin, gliserol ve bunlarin karisimlarini ve asagidakilerden olusan gruptan seçilen hidrofobik yan zincir (zincirler): 04-025 alkil grubu, polipropilen, polibütilen, bir doymus Ci-Ce mono-karboksilik asidin vinil esterini, akrilik veya metakrilik asidin Ci-Ce alkil esterini ve bunlarin karisimlarini içeren hidrofilik omurgadan olusan) rastgele greft polimerler, Içerebilir.

Bilesim ilave polimerler, örnegin, (aniyonik olarak ucu-basliklandirilmis polyesterleri, örnegin, SRPi'i, sakkarit, dikarboksilik asit, poliol ve bunlarin kombinasyonlari arasindan seçilen en az bir monomer birimini, rastgele veya blok konfigürasyonunda, içeren polimerleri, etilen tereftalat-temelli polimerleri ve rastgele veya blok konfigürasyonunda bunlarin ko-polimerlerini, örnegin, RepeI-o-tex SF`yi, SF-2'yi ve SRN325'i, Marloquest SL'yi) içeren) kir salim polimerlerini; (ag %O,1 ila ag %10, karboksilat polimerlerini, örnegin, akrilik asit, maleik asit (veya maleik anhidrit), fumarik asit, itakonik asit, akonitik asit, mezakonik asit, sitrakonik asit, metilenmalonik asit ve bunlarin herhangi bir karisimi arasindan seçilen en az bir monomer içeren polimerleri, vinilpirrolidon homopolimerini ve/ve 500 ila 100.000 Da araliginda moleküler agirligi olan, polietilen glikolü içeren) anti-yeniden-depolama polimerlerini; (örnekleri karboksimetil selülozu, metil selülozu, metil hidroksietil selülozu, metil karboksimetil selülozu ve bunlarin karisimlarini içeren, alkil selüloz, alkil alkoksialkil selüloz, karboksialkil selüloz, alkil karboksialkil selüloz arasindan seçilenleri içeren) selülozik polimeri ve polimerik karboksilati (örnegin, maleat/akrilat rastgele kopolimerini veya poliakrilat homopolimerini), içerir.

Bilesim ilaveten doymus veya doymamis yag asitleri, tercihen doymus veya doymamis C12-C24 yag asidi (ag %0 ila ag %10); depolama yardimcilari (örnekleri polisakkaritleri, tercihen selülozik polimerleri, poli diaIIiI dimetil amonyum halidleri (DADMAC'yi) ve DAD MAC'in vinil pirrolidon, akrilamidler, imidazoller, imidazolinyum halidleri ve bunlarin karisimlari ile, rastgele veya blok konfigürasyonunda, ko- polimerlerini, katyonik guar zamkini, katyonik selülozu, örnegin, katyonik hidroksietil selülozu, katyonik nisastayi, katyonik poliaçilamidleri ve bunlarin karisimlarini içerir) içerebilir.

Bilesim ilaveten örnekleri manganez ftalosiyanini, peroksidazlari, polivinilpirrolidon polimerlerini, poliamin N-oksit polimerlerini, N-vinilpirrolidonun ve N-vinilimidazolün kopolimerlerini, polivinilokzazolidonlari ve polivinilimidazolleri ve/veya bunlarin karisimlarini içeren boya transferini inhibe etme ajanlari; örnekleri etilen-diamin- tetraasetik asidi (EDTA'yi); dietilen triamin penta metilen fosfonik asidi (DTPMP'yi); hidroksi-etan difosfonik asidi (HEDP'yi); etilendiamin N,N'-disüksinik asidi (EDDS'yi); metil glisin diasetik asidi (MGDA'yi); dietilen triamin penta asetik asidi (DTPA'yi); propilen diamin tetrasetik asidi (PDT A'yi); 2-hidroksipiridin-N-oksidi (HPNO'yu) veya metil glisin diasetik asidi (MGDA'yi); glutamik asit N,N-diasetik asidi (N,N- dikarboksimetil glutamik asit tetrasodyum tuzunu (GLDA'yi); nitrilotriasetik asidi (NTA'yi); 4,5-dihidroksi-m-benzendisülfonik asidi; sitrik asidi ve bunun herhangi bir tuzunu; N-hidroksietiletilendiaminetri-asetik asidi (HEDTA'yi), trietilentetraaminhekzaasetik asidi (TTHA'yi), N-hidroksietiliminodiasetik asidi (HEIDA'yi), dihidroksietilglisini (DHEG'yi), etilendiamintetrapropiyonik asidi (EDTP'yi) ve bunlarin türevlerini içeren selatlama ajanlari içerebilir.

Bilesim opsiyonel olarak proteazlar, amilazlar, Iipazlar, selülazlar, kolin oksidazlar, peroksidazlar/oksidazlar, pektat Iiyazlar, mannanazlar, kütinazlar, Iakkazlar, fosfolipazlar, Iizofosfolipazlar, açiltransferazlar, perhidrolazlar, arilesterazlar ve bunlarin herhangi bir karisimi arasindan seçilen enzimler (genel olarak yaklasik ag %0,01 aktif enzim ila ag %0,5 aktif enzim) içerebilir. Bilesim (örnekleri poliolleri, örnegin, propilen glikolü veya gliserolü, sekeri veya seker alkolünü, Iaktik asidi, geri-dönüsümlü proteaz inhibitörünü, borik asidi veya bir borik asit türevini, örn., bir aromatik borat esterini veya bir fenil boronik asit türevini, örnegin, 4-formilfenil boronik asidi içeren) bir enzim stabilazörü içerebilir.

Bilesim ilaveten silikon veya yag-asidi temelli sabun köpügü baskilayicilari; renk tonlama boyalari, kalsiyum ve magnezyum katyonlari, görsel sinyalleme içerik maddeleri, köpük-önleyici (ag %0,001 ila yaklasik ag %4,0) ve/veya (ag %0,01 ila ag selülozdan, selüloz bazli malzemelerden, mikro-fiber selülozdan, biyopolimerlerden, ksantan sakizindan, jellan sakizindan ve bunlarin karisimlarindan olusan gruptan seçilen) yapilandirici/kivamlastirici içerebilir.

Bilesim herhangi bir sivi formda, örnegin, bir sivi veya jel formunda veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu hâlinde olabilir.

Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun temizleme bilesimleri, tabletler, kapsüller, tek dozluk paketler, keseler ve çok-kompartimanli keseler dâhil olmak üzere birim doz formunda saglanir. Bazi uygulamalarda, birim doz formayi bir çok kompartimanli kese (veya baska birim doz formati) içinde içerik maddelerinin kontrollü salimini saglayacak sekilde tasarlanir. Uygun birim doz ve kontrollü salim formatlari teknikte bilinir (Bakiniz, örn., birim doz ve kontrollü salim formatlarinda kullanim için uygun malzemeler için EP 04/111178). Bazi uygulamalarda, birim doz formu bir suda-çözünebilen film veya suda- çözünebilen keseler ile sarilmis tabletler ile saglanir. Çesitli birim doz formatlari EP 2 Bazi uygulamalarda, temizleme bilesimi bir varyant serin proteazi polipeptit proteazina sahip olan bir yüksek yogunluklu pudra (HDD) bilesimidir. HDD pudra çamasir deterjani anyonik temizleyici sürfaktanlar (örn., lineer veya dallanmis veya rastgele zincirli, sübstüte edilmis veya sübstüte edilmemis alkil sülfatlar, alkil sülfonatlar, alkil alkoksillenmis sülfat, alkil fosfatlar, alkil fosfonatlar, alkil karboksilatlar ve/veya bunlarin karisimlari), (lineer veya dallanmis veya rastgele zincirli, sübstüte edilmis veya sübstüte edilmemis Cg-Cig alkil etoksilatlarin ve/veya C6-C12 alkil fenol alkoksilatlarin bir grubundan seçilen) iyonik-olmayan temizleyici sürfaktan, katyonik temizleyici sürfaktanlar (örn., alkil piridinyum bilesikleri, alkil kuaterner amonyum bilesikleri, alkil kuaterner fosfonyum bilesikleri, alkil ternari sülfonyum bilesikleri ve bunlarin karisimlari), zwitteriyonik ve/veya amfoterik temizleyici sürfaktanlar, örn., alkanolamin sülfo-betainler); amfolitik sürfaktanlar; yari-polar iyonik-olmayan sürfaktanlar ve bunlarin karisimlari dâhil olmak üzere bir temizleyici sürfaktan; insa ediciler (fosfatsiz insa ediciler [örnegin, ag %0 ila ag %10'dan daha az araliginda, örnekleri zeolit A'yi, zeolit X'i, zeolit P'yi ve zeolit MAP'i içeren zeolite insa ediciler]; fosfatli insa ediciler (örnegin, ag %0 ila ag %10'dan daha az araliginda, sodyum tri-polifospat]; ag %15'ten daha az araliginda sitrik asit, sitrat tuzlari ve nitrilotriasetik asit veya bunun tuzlari); silikat tuzu (örn., ag %0 ila ag %10'dan daha az araliginda sodyum veya potasyum silikat veya sodyum meta-silikat veya katmanlastirilmis silikat (SKS-GD; karbonat tuzu (örn., ag %0 ila ag %10'dan daha az araliginda sodyum karbonat ve/veya sodyum bikarbonat) ve (foto-agarticilar, (örn., sülfonatlanmis çinko ftalosiyaninler, sülfonatlanmis alüminyum ftalosiyaninler, ksanten boyalar ve bunlarin karisimlari; (örn., dodekanoil oksibenzen sülfonati, dekanoil oksibenzen sülfonati, dekanoil oksibenzoik asidi veya bunlarin tuzlarini, 3,5,5-trimeti hekzanoil oksibenzen sülfonati, tetraasetil etilen diamin-TAED'yi ve nonanoiloksibenzen sülfonat-NOBS'yi nitril kuatlarini ve bunlarin karisimlarini içeren) hidrofobik veya hidrofilik çamasir suyu aktivatörleri; hidrojen peroksit kaynaklari (örn., örnekleri perboratin, perkarbonatin, persülfatin, perfosfatin veya persilikatin mono veya tetra hidrat sodyum tuzunu içeren inorganik perhidrat tuzlari); önceden-olusturulmus hidrofilik ve/veya hidrofobik perasitler (örn., perkarboksilik asitler ve tuzlari, perkarbonik asitler ve tuzlari, perimidik asitler ve tuzlari, peroksimonosülfürik asitler ve tuzlari ve bunlarin karisimlari) ve/veya çamasir suyu katalizörleri (örn., (örnekleri iminiyum katyonlarini ve poliiyonlari içeren) imin çamasir suyu destekleyioileri; iminiyum zwitteriyonlari; modifiye edilmis aminler; modifiye edilmis amin oksitler; N-sülfonil iminler; N-fosfonil iminler; N-açil iminler; tiyadiazol dioksitler; perfloroiminler; siklik seker ketonlari ve bunlarin karisimlari ve metal-içeren çamasir suyu katalizörleri (Örn., bir yardimci metal katyonlari, örnegin, çinko veya alüminyum ve bir tecrit edici, örnegin, etilendiamintetraasetik asit, etilendiaminetetra(metilenfosfonk asit) ve bunlarin suda-çözünebilen tuzlari, ile birlikte bakir, demir, titanyum, rutenyum, tungsten, molibdenum veya manganez katyonlari) dâhil olmak üzere) agartma ajanlari içerebilir.

Bilesim tercihen enzimler, örn., proteazlar, amilazlar, Iipazlar, selülazlar, kolin oksidazlar, peroksidazlar/oksidazlar, pektat liyazlar, mannanazlar, kütinazlar, lakkazlar, fosfolipazlar, Iizofosfolipazlar, açiltransferaz, perhidrolaz, arilesteraz ve bunlarin herhangi bir karisimini, içerir.

Bilesim ilaveten, parfüm mikro-kapsülleri, nisasta enkapsüle edilmis parfüm uyumu, renk tonlama ajanlari dâhil olmak üzere ilave deterjan içerik maddeleri, kumas bütünlük ve katyonik polimerler, boya hapsetme içerik maddeleri, kumas-yumusatma ajanlari, parlaticilar (örnegin, C.I. Flüoresan parlaticilar), yumaklastirma ajanlari, selatlama ajanlari, alkoksillenmis poliaminler, kumas depolama yardimcilari ve/veya siklodekstrin dâhil olmak üzere ilave polimerler içerebilir.

Bazi uygulamalarda, temizleme bilesimi mevcut bulusun bir serin proteazina sahip olan bir otomatik bulasik yikama (ADW) deterjani bilesimidir. ADW deterjani bilesimi agirlik olarak %0 ila 10 araligindaki miktarlarda bulunan etoksillenmis iyonik-olmayan sürfaktanlarin, alkol alkoksillenmis sürfaktanlarin, epoksi-basliklandirilmis poli(oksialkillenmis) alkollerin veya amin oksit sürfaktanlarin bir grubundan seçilen iki veya daha fazla iyonik-olmayan sürfaktan; agirlik olarak %05 ila %50 araliginda fosfatin (mono-fosfatlarin, di-fosfatlarin, tri-polifosfatlarin veya oligomerik-polifosfatlarin, tercih edilen sodyum tripolifosfat-STPP'nin veya fosfatsiz insa edicilerin [örnekleri MGDA'yi (metil-glisin-diasetik asit)'i ve bunun tuzlarini ve türevlerini, GLDA'yi (glutamik-N,Ndiasetik asit)'i ve bunun tuzlarini ve türevlerini, lDS'yi (iminodisüksinik asit)'i ve bunun tuzlarini ve türevlerini, karboksi metil inülini ve bunun tuzlarini ve türevlerini ve bunun karisimlarini, nitrilotriasetik asidi (NTA'yi), dietilen triamin penta asetik asidi (DTPA'yi), B-alanindiasetik asidi (B-ADA'yi) ve bunlarin tuzlarini içeren amino asit temelli bilesiklerinin], polikarboksilik asitlerin ve bunlarin kismen veya tamamen nötralize edilmis tuzlarinin, monomerik polikarboksilik asitlerin ve hidroksikarboksilik asitlerin ve bunlarin tuzlarinin homopolimerlerinin ve kopolimerlerinin herhangi birini içeren %5-60 araliginda insa ediciler; agirlik olarak yaklasik %0,1 ila yaklasik %50 araliginda sülfonatlanmis/karboksillenmis polimerler (ürüne boyutsal kararlilik saglar); agirlik olarak yaklasik %0,1 ila yaklasik %10 araliginda (polyesterler, özellikle opsiyonel olarak polikondensasyon için elverisli olan 3 ila 6 islevselligi, spesifik olarak asit, alkol veya ester islevselligi, olan ilave monomerler ile birlikte anyonik polyesterler, polikarbonat-, poliüretan- ve/veya poliüre- poliorganosiloksan bilesikleri veya reaktif siklik karbonat ve üre tipindeki bunun öncül bilesikleri arasindan seçilen) kurutma yardimcilari; agirlik olarak yaklasik %1 ila yaklasik %20 araliginda silikatlar (sodyum veya potasyum silikatlar, örnegin, sodyum disilikat, sodyum meta-silikat ve kristalli fillosilikatlar); çamasir suyu-inorganik (örnegin, perhidrat tuzlari, örnegin, perborat, perkarbonat, perfosfat, persülfat ve persilikat tuzlari) ve organik (örnegin, diaçil ve tetraaçilperoksitler. özellikle diperoksidodekandiok asit, diperoksitetradekandiok asit ve diperoksihekzadekandiok asit, dâhil olmak üzere organik peroksiasitler); agirlik olarak yaklasik %0,1 ila yaklasik %10 araliginda çamasir suyu aktivatörleri-organik perasit öncülleri; (manganez triazasiklononan ve ilgili kompleksler, C0, Cu, Mn ve Fe bispiridilamin ve ilgili kompleksler ve pentamin asetat kobalt(lll) ve ilgili kompleksler arasindan seçilen) çamasir suyu katalizörleri; agirlik olarak yaklasik %0,1 ila %5 araliginda (benzatriazoller, metal tuzlari ve kompleksleri ve/veya silikatlar arasindan seçilen) metal bakim ajanlari; otomatik bulasik yikama deterjani bilesiminin her bir grami için aktif enzimin yaklasik 0,01 ila 5,0 mg'i araliginda enzimler (açil transferazlar, alfa-amilazlar, beta-amilazlar, alfa-galaktosidazlar, arabinosidazlar, aril esterazlar, beta-galaktosidazlar, karajenazlar, katalazlar, sellobiyohidrolazlar, selülozlar, kondroitinazlar, kütinazlar, endo-beta-1,4-glukanazlar, endo-beta-mannanazlar, esterazlar, ekzo-mannanazlar, galaktanazlar, glukoamilazlar, hemiselülazlar, hiyalüronidazlar, keratinazlar, Iakkazlar, laktazlar, ligninazlar, Iipazlar, lipoksijenazlar, mannanazlar, oksidazlar, pektat liyazlar, pektin asetil esterazlar, pektinazlar, pentozanazlar, peroksidazlar. fenoloksidazlar, fosfatazlar, fosfolipazlar, fitazlar, poligalaktüronazlar. proteazlar, pullulanazlar, redüktazlar, ramnogalaktüronazlar, beta-glukanazlar, tannazlar, transglutaminazlar, ksilan asetil- esterazlari, ksilanazlar, ksiloglukanazlar ve ksilosidazlar ve bunlarin herhangi bir karisimi) ve (oligosakkaritler, polisakkaritler ve inorganik iki-degerlikli metal tuzlari arasindan seçilen) enzim stabilazör bilesenleri içerebilir.

Bazi uygulamalarda, temizleme bilesimi boratsizdir. Bazi uygulamalarda, temizleme bilesimi fosfatsizdir. Bazi uygulamalarda, temizleme bilesimi bilesim içinde 10 ppm'den daha az veya 5 ppm'den daha az veya 1 ppm'den daha az boratlara ve/veya fosfatlara sahip olabilir.

Mevcut bulusun bir serin proteazi polipeptidini yararli bir sekilde içeren temsili deterjan 152 arasindaki sayfalardaki tablolarda, bulunan deterjan formülasyonlarini içerir. Serin proteazlari normal olarak bilesimin agirligi olarak %0,00001 ila %10'u olan bir düzeyde enzim proteini deterjan bilesimine katilir. Bazi uygulamalarda, deterjan bilesimi fazla serin proteazi içerir. Bazi uygulamalarda, deterjan bilesimi bilesimin agirligi olarak B. Tekstil Isleme Ayrica, mevcut bulusun bir serin proteazi polipeptidini kullanarak (öm, bir tekstilin hasilini sökmek için) kumaslara muamele etmenin bilesimleri ve yöntemleri de saglanir.

Kumasa-muamele yöntemleri teknikte iyi bilinir (bakiniz, örn., 6,077,316 Numarali U.S.

Patenti). Örnegin, bir kumasin hissi ve görünüsü kumasi bir çözelti içindeki bir serin proteazi ile temas ettirmeyi içeren bir yöntem ile iyilestirilebilir. Kumasa basinç altinda çözelti ile muamele edilebilir.

Mevcut bulusun bir serin proteazi bir tekstilin dokunmasi sirasinda veya sonrasinda, hasil sökme evresinde veya bir veya birden fazla ilave kumas isleme adiminda uygulanabilir. Tekstillerin dokunmasi sirasinda, iplikler kayda deger mekanik gerilmeye maruz birakilir. Mekanik dokuma tezgahlari üzerinde dokunmadan önce, çözgü iplikleri siklikla, bunlarin mukavemetini arttirmak için ve kirilmayi önlemek için hasillama nisastasi veya nisasta türevleri ile kaplanir. Mevcut bulusun bir serin proteazi bu hasillama nisastasini veya nisasta türevlerini uzaklastirmak için dokunma sirasinda veya sonrasinda uygulanabilir. Dokunmadan sonra, serin proteazi bir homojen ve su- geçirmez sonucu garantilemek için kumasi ilave islemeden önce hasil kaplamayi uzaklastirmak için kullanilabilir.

Mevcut bulusun bir serin proteazi, örn., sulu bilesimler içinde, deterjan katki maddeleri olarak, pamuk-içeren kumaslar dâhil olmak üzere kumaslarin hasili sökmek için tek basina veya baska hasil sökme kimyasal reaktifleri ve/veya hasil sökme enzimleri ile kullanilabilir. Bir amilaz da indigo-renkli denim kumasi ve giysiler üzerinde bir taslanmis görünüm üretmek için bilesimlerde ve yöntemlerde kullanilabilir. Elbiselerin üretimi için, kumaslar kesilebilir ve elbiseler veya giysiler olarak dikilebilir, bundan sonra aprelenir. Özel olarak, denim kot pantolonlarin üretimi için, farkli enzimatik apreleme yöntemleri gelistirilmistir. Denim giysinin aprelenmesi normalde, bu sirada giysilerin kumasa yumusaklik saglamak ve pamugu müteakip enzimatik apreleme adimlari için daha erisilebilir hâle getirmek amaciyla proteolitik enzimlerin etkisine tabi tutuldugu, bir enzimatik hasil sökme adimi ile baslatilir. Serin proteazi denim giysileri apreleme (örn., bir biyo-taslama prosesi), enzimatik hasil sökme ve kumaslara yumusaklik saglama ve/veya apreleme prosesi yöntemlerinde kullanilabilir.

C. Deri ve Tüy Isleme Burada tarif edilen serin proteazi polipeptitleri hayvanlardan proteinlerin enzim yardimli uzaklastirilmasinda ve bunlarin, örnegin, tüylerin, cildin, kilin, postun ve benzerlerinin, müteakip parçalanmasinda veya imha edilmesinde ilave kullanim alani bulur. Bazi durumlarda, hayvan karkasinin mevcut bulusun bir serin proteazi polipeptidini içeren bir çözeltiye batirilmasi geleneksel kaynar suya batirma veya tüy yolma prosesine kiyasla cildi hasardan koruyacak sekilde etki edebilir. Bir uygulamada, tüylere kus tüylerini sindirmek veya bunlarin parçalanmasini baslatmak için uygun olan kosullar altinda mevcut bulusun bir izole edilmis serin proteazi polipeptidi püskürtülebilir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun bir serin proteazi, yukarida oldugu gibi, bir oksitleme ajani ile kombinasyon hâlinde, kullanilabilir.

Bazi uygulamalarda, ham tüyler ile iliskilendirilmis sivi yagin veya kati yagin uzaklastirilmasina mevcut bulusun bir serin proteazi polipeptidini kullanma ile yardim edilir. Bazi uygulamalarda, serin proteazi polipeptitleri tüyleri temizlemek için ayni zamanda lifleri sterilize etmek ve kismen dehidrate etmek için bilesimler içinde kullanilir. Daha baska uygulamalarda, açiklanan serin proteazi polipeptitleri kus tüyünden proteinin geri-kazanilmasinda kullanim alani bulur. Bazi baska uygulamalarda, serin proteazi polipeptitleri (hacim/hacim) yaklasik %0,5'te bir sürfaktan ile veya bir sürfaktan olmadan %95'Iik etanol veya baska polar organik çözücü ile kombinasyon hâlinde bir yikama çözeltisi içinde uygulanir.

D. Hayvan Yemi Uygulamalari Bulusun bir ilave yönünde, mevcut bulusun serin proteazi polipeptitleri bir serin proteazi ve bunun varyantlarini içeren bir hayvan yemi bilesiminin bir bileseni, hayvan yemi katki maddesi ve/veya evcil hayvan gidasi olarak kullanilabilir. Mevcut bulus ilaveten bu tarz bir hayvan yemi bilesimini, hayvan yemi katki maddesi bilesimi ve/veya evcil hayvan gidasini hazirlamak için, bir veya birden fazla hayvan yemi içerik maddesi ve/veya hayvan yemi içerik katki maddesi ve/veya evcil hayvan gida içerik maddesi ile serin proteazi polipeptidini karistirmayi içeren, bir yöntem ile ilgilidir. ilaveten, mevcut bulus bir hayvan yemi bilesiminin ve/veya hayvan yemi katki maddesi bilesiminin ve/veya evcil hayvan gidasinin preparasyonunda serin proteazi polipeptidinin kullanimi ile ilgilidir. uygulamada, hayvan bir gevis getirmeyen hayvandir, örnegin, bir attir veya bir tek- mideli hayvandir. Tek-mideli hayvanlarin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, domuzlari (pigs) ve domuzu (swine), örnegin, yavru domuzlari, büyümekte olan domuzlari, disi domuzlari; kümes hayvanlarini, örnegin, hindileri, ördekleri, tavuklari, etlik civcivleri, yumurtlayanlari; baliklari, örnegin, somonu, alabaligi, tatlisu çipurasini, kedi baligini ve sazangilleri ve kabuklulari, örnegin, karidesleri ve büyük karidesleri, içerir. Bir ilave uygulamada, hayvan, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, sigirlar, genç buzagilar, keçiler, koyunlar, zürafalar, bizonlar, muslar, elkler, yaklar, su bufalolari, geyikler, develer, alpakalar, Iamalar, antiloplar, çatalboynuzlu antiloplar ve Hint ceylanlari dâhil olmak üzere, bir gevis getiren hayvandir.

Mevcut baglamda, "evcil hayvan gidasi" teriminin bir ev hayvani, örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, köpekler, kediler, çöl fareleri, hamsterlar, çinçillalar, süslü siçanlar, gine domuzlari; kus evcil hayvanlari, örnegin, kanaryalar, muhabbet kuslari ve papaganlar; Sürüngen evcil hayvanlari, örnegin, kaplumbagalar, kertenkeleler ve yilanlar ve sucul evcil hayvanlar, örnegin, tropikal baliklar ve kurbagalar, için bir gida anlamina gelecek sekilde anlasilmasi amaçlanir. sekilde kullanilir ve a) a) tahillari, örnegin, küçük tanecikleri (öm, bugdayi, arpayi, çavdari, yulaflari ve bunlarin kombinasyonlarini) ve/veya büyük tanecikleri, örnegin, dariyi ve sorgumu; b) tahillardan elde edilen yan ürünleri, örnegin, misir gluten ununu, Kurutulmus damitma kalintilari ve çözünür maddeleri (DDGS) (özellikle misir bazli Kurutulmus damitma kalintilari ve çözünür maddeleri (cDDGS), bugday kepegini, bugday kaba ununu, bugday ince kepegini, pirinç kepegini, pirinç kavuzunu, yulaf kavuzunu, palm çekirdegini ve turunçgil posasini; C) kaynaklardan, örnegin, soyadan, ayçiçeginden, yer fistigindan, aci bakladan, bezelyelerden, bakladan, pamuktan, kanoladan, balik unundan, kurutulmus plazma proteinden, etten ve kemik tozundan, patates proteininden, peynir alti suyundan, kopradan, susamdan, elde edilen proteini; d) bitkisel ve hayvansal kaynaklardan elde edilen sivi yaglari ve kati yaglari; e) mineralleri ve vitaminleri içeren gruptan seçilen bir veya birden fazla yem malzemesi içerebilir.

E. Kâgit Hamuru Beyazlatma Burada tarif edilen proteaz polipeptitleri kâgit hamurlarinin, örnegin, kimyasal hamurlarin, yari-kimyasal hamurlarin, kraft hamurlarin, mekanik hamurlarin veya sülfit yöntemi ile hazirlanan hamurlarin, enzim yardimci beyazlatilmasinda ilave kullanim alani bulur. Genel terimlerde, kâgit hamurlari kâgit hamurunu beyazlatmak için uygun olan kosullar altinda mevcut bulusun bir proteaz polipeptidi ile inkübe edilir.

Bazi uygulamalarda, hamurlar oksijen, ozon, peroksit veya peroksiasitler ile beyazlatilmis klorsuz kâgitlardir. Bazi uygulamalarda, proteaz polipeptitleri düsük lignin içerikleri gösteren modifiye edilmis veya sürekli hamur yapma yöntemleri ile üretilmis hamurlarin enzim yardimci beyazlatilmasinda kullanilir. Bazi baska uygulamalarda, proteaz polipeptitleri tek basina veya tercihen ksilanazlar ve/veya endoglukanazlar ve/veya alfa-galaktosidaz ve/veya sellobiyohidrolaz enzimleri ile kombinasyon hâlinde uygulanir.

F. Protein parçalanmasi Burada tarif edilen proteaz polipeptitleri hayvanlardan proteinlerin enzim yardimli uzaklastirilmasinda ve bunlarin, örnegin, tüylerin, cildin, kilin, postun ve benzerlerinin, müteakip parçalanmasinda veya imha edilmesinde ilave kullanim alani bulur. Bazi durumlarda, hayvan karkasinin mevcut bulusun bir proteaz polipeptidini içeren bir çözeltiye batirilmasi geleneksel kaynar suya batirma veya tüy yolma prosesine kiyasla cildi hasardan koruyacak sekilde etki edebilir. Bir uygulamada, tüylere kus tüylerini sindirmek veya bunlarin parçalanmasini baslatmak için uygun olan kosullar altinda mevcut bulusun bir izole edilmis proteaz polipeptidi püskürtülebilir. Bazi uygulamalarda, mevcut bulusun bir proteazi, yukarida oldugu gibi, bir oksitleme ajani ile kombinasyon hâlinde, kullanilabilir.

Bazi uygulamalarda, ham tüyler ile iliskilendirilmis sivi yagin veya kati yagin uzaklastirilmasina mevcut bulusun bir proteaz polipeptidini kullanma ile yardim edilir.

Bazi uygulamalarda, proteaz polipeptitleri tüyleri temizlemek için ayni zamanda lifleri sterilize etmek ve kismen dehidrate etmek için bilesimler içinde kullanilir. Bazi baska uygulamalarda, proteaz polipeptitleri (hacim/hacim) yaklasik %O,5'te bir sürfaktan ile veya bir sürfaktan olmadan %95'Iik etanol veya baska polar organik çözücü ile kombinasyon hâlinde bir yikama çözeltisi içinde uygulanir. Daha baska uygulamalarda, açiklanan proteaz polipeptitleri kus tüyünden proteinin geri-kazanilmasinda kullanim alani bulur. Açiklanan proteaz polipeptitleri uygun tüy isleme yöntemlerinde ve kullanilabilir, bazi uygulamalarda, geri-kazanilmis protein bunu takiben hayvan veya balik yeminde kullanilabilir.

G. Doku Debridmani Burada tarif edilen proteaz polipeptitleri dokunun enzim yardimli debridmaninda ilave kullanim alani bulur. Bu ölü veya hasar görmüs dokunun uzaklastirilmasini, örnegin, iyilesmeye yardimci olmak için yaralardan uzaklastirilmasini, içerir.

H. Doku Kültürü Burada tarif edilen proteaz polipeptitleri doku kültüründe ilave kullanim alani bulur. Özel olarak, mevcut bulusun proteazlari, örnegin, hücreleri hasat etme prosesi sirasinda, bir hücre kültürü duvarina yapisik hücreleri süspanse etmek veya yeniden-süspanse etmek için kullanilabilir. Mevcut bulusun proteazlari kültürlenmis hücreler ve petri kabi arasindaki protein baglarini yarmak için kullanilabilir bu hücrelerin çözelti içinde süspanse edilmis hâle gelmesine olanak saglar. l. Gida Uygulamalari Burada tarif edilen proteaz polipeptitleri bir gida katki maddesi, bir sindirime yardimci veya bir gida isleme yardimcisi olarak ilave kullanim alani bulur. ÖRNEKLER Asagidaki örnekler mevcut açiklamanin belirli tercih edilen uygulamalarini ve yönlerini göstermek ve açiklamak için saglanir ve bunlardan sinirlayici olarak anlam çikarilmamalidir.

Asagidaki deneysel açiklamada, asagidaki kisaltmalar geçerlidir: ADW (otomatik bulasik yikama); BMI (kan/süt/mürekkep); BSA (bovin serum albümini); CAPS (N- siklohekziI-S-aminopropansüIfonik asit); CHES (N-siklohekziI-Z-aminoetansüIfonik asit); DMC (dimetil kazein); HDD (agir is kuru/pudra): HDL (agir is sivi): HEPES (4-(2- hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit); MTP (mikro-titre plaka); ND (yapilmadi): OD (optik yogunluk); PCR (polimeraz zincir reaksiyonu); ppm (milyonda parça); 08 (yeterli miktar); rpm (dakikadaki devir sayisi); AAPF (süksinil-AIa-AIa-Pro-Phe-p-nitroanilid); TNBSA (2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit); hacim/hacim (hacim ila hacim); ag/hacim (agirlik ila hacim).

Serin Proteazi BspAl02518 B. akibai C-M2-3 susu (Dupont Kültür Koleksiyonu) çesitli endüstriyel uygulamalarda kullanisli enzimler için bir potansiyel kaynak olarak seçilmistir. Baci'llus sp. C-M2-3 susunun tüm genomu sentez teknolojisi ile ILLUMINA® dizileme kullanilarak dizilenmistir. Genom dizileme ve dizi verilerinin birlestirilmesi BaseClear (Leiden, The Netherlands) tarafindan gerçeklestirilmistir. Contig'ler BioXpr (Namur, Belgium) tarafindan serhlenmistir. B. akibai C-M-2-3'te bu yolla tanimlanan genleri biri diger bakterilerin serin proteazlarina homoloji gösteren bir serin proteazini sifreler.

BspA102518n'nin nükleotid dizisi SEQ ID NO: 1 olarak izah edilir: Tarafindan sifrelenen preproenzimin amino asit dizisi BspA102518n tarafindan sifrelenen preproenzimin aminoasit dizisi SEQ ID NO: 2 olarak izah edilir: MKMKHSRLLLTLV!VTSFVTP$MTSA3"31;;;;;_;Ö;n :'Ai Lp~i5L`ÜNL 1;;.;;1 l .-.CI SL.' - i..'.-'i.-`_.'“..4i-L:AI..“II'._`.'_ - _;._'*._f_..'. ,EML-H., -- ..1.._A_[..-.- .~. . ...tl [. H i.. - L N-ucunda, preproenzim SignaIP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 26 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 2'de kalin ve ita/ik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidi dizisinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 71 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 2'de ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin, BspAl02518'in (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEQ ID NO: 3'te gösterilir.

Serin Proteazi BspU02193 B. akibai' GICC 2089392 susu (Dupont Kültür Koleksiyonu) çesitli endüstriyel uygulamalarda kullanisli enzimler için bir potansiyel kaynak olarak seçilmistir. Bacillus sp. GICC 2089392 susunun tüm genomu sentez teknolojisi ile ILLUMINA® dizileme kullanilarak dizilenmistir. Genom dizileme ve dizi verilerinin birlestirilmesi BaseCIear (Leiden, The Netherlands) tarafindan gerçeklestirilmistir. Contig'ler BioXpr (Namur, Belgium) tarafindan serhlenmistir. B. akibai GICC 2089392'de bu yolla tanimlanan genleri biri diger bakterilerin serin proteazlarina homoloji gösteren serin proteazini sifreler.

BspU02193n'nin nükleotid dizisi SEQ ID NO: 4'te gösterilir. 1 1 i i `i' i i i i 1 BspU02193n tarafindan sifrelenen preproenzimin amino asit dizisi SEQ ID NO: 5'te izah edilir: MSKMKFTSLLLGLWAFVFVFSTLSVSAH .-._.-.._ . _ : -_. ...'.,; ` _ '. ..;: ;L- N-ucunda, preproenzim SignaIP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 28 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEO ID NO: 5'te kalin ve ita/ik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidi dizisinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 69 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEO ID NO: 5'te ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin, BspU02193'ün (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEQ ID NO: 6 olarak izah edilir: BspAI02518 proteazi B. subtili's aprE promotöründen, B. subtili's aprE sinyal peptidi dizisinden ve bir BPN' sonlandiricisindan olusan bir ekspresyon kaseti kullanilarak B. subtilis içinde üretilmistir. BspAI02518 ekspresyon kaseti pHYT kopyalama mekik vektörüne klonlanmistir ve bir uygun B. subtili's susuna transforme edilmistir. pHYT vektörü BstEII ve EcoRl yerleri kullanilarak tetrasiklin direnç geninden sonra bir sonlandirici (sonlandirici dizi: SEO ID NO: 7 olarak izah edilen GGTTACCTTG CCGCCGGGCG TTTTTTATGC ATCGATGGAA) ekleme ile pHY türetilmistir. pHY300PLK içindeki HindIII yeri ayrica BamHI ve Hindi" yerlerine klonlanmis bir baglayici (baglayici dizi: SEQ ID NO: 8 olarak izah edildigi üzere GGATCCTGAC TGCCTGAGCT T) kullanilarak da uzaklastirilmistir. BspAI02518 proteazinin ekspresyonu için pHYT vektörünün (pHYT- BspAI02518'in) bir haritasi Sekil 1'de gösterilir. ppm tetrasiklin içeren TSB (sivi besi yeri) içinde 16 saat boyunca 15 mL'Iik Falcon tüpler içinde kültürlenmistir. Bu pre-kültürün 300 pl'si 25 ppm tetrasiklin ile takviye edilmis 30 mL'Iik kültivasyon vasati ile doldurulmus bir 500 mL'Iik flaska eklenmistir.

Kültivasyon vasati majör nitrojen kaynagi olarak üre, ana karbon kaynagi olarak glikoz içeren ve güçlü hücre büyümesi için %1 soyton ile takviye edilmis, MOPs tamponu temelli bir zenginlestirilmis yari-tanimlanmis vasattir. Flasklar 180 rpm'de sabit rotasyonel karistirma ile 32°C'de 2 gün boyunca inkübe edilmistir. Kültürler konik tüpler içinde 20 dk boyunca 14500 rpm'de sentrifügasyon ile hasat edilmistir.

BspU02193 proteazi B. subtilis aprE promotöründen, B. subtili's aprE sinyal peptidi ve bir BPN' sonlandiricisindan olusan bir ekspresyon kaseti kullanilarak B. subtili's içinde üretilmistir. BspU02193 ekspresyon kaseti bir pBN-temelli kopyalama mekik bir uygun B. subtilis susuna transforme edilmistir. BspU02193 proteazinin ekspresyonu için pBN vektörünün (pBN- BspU02193'ün) bir haritasi Sekil 2`de gösterilir. ppm tetrasiklin içeren TSB (sivi besi yeri) içinde 16 saat boyunca 15 mL'Iik Falcon tüpler içinde kültürlenmistir. Bu pre-kültürün 300 ul'si 10 ppm neomisin ile takviye edilmis 30 mL'lik kültivasyon vasati ile doldurulmus bir 500 mL'Iik flaska eklenmistir.

Kültivasyon vasati majör nitrojen kaynagi olarak üre, ana karbon kaynagi olarak glikoz içeren ve güçlü hücre büyümesi için %1 soyton ile takviye edilmis, MOPs tamponu temelli bir zenginlestirilmis yari-tanimlanmis vasattir. Flasklar 180 rpm'de sabit rotasyonel karistirma ile 32°C'de 2 gün boyunca inkübe edilmistir. Kültürler konik tüpler içinde 20 dk boyunca 14500 rpm'de sentrifügasyon ile hasat edilmistir.

Protein boyasiz lmager Criterion yöntemi ile kantifiye edilmistir. Bu yöntem boyasiz pre-kast PAGE jellerden yararlanmaya dayanir, burada her bir bandin yogunlugu söz konusu protein içinde bulunan triptofan rezidülerinin miktarina baglidir. PAGE için CRITERIONTIVI TGX (Tris-Glisin uzatilmis) STAlN-FREETM prekast jeller essiz trihalo bilesikleri içerir. Bu, proteinlerin Gel DocT'V' EZ görüntüleme sistemi ile çabuk flüoresan saptanmasina olanak saglar. Trihalo bilesikleri, jeller içindeki Gel Doc EZ görüntüleyici tarafindan kolaylikla saptanabilen flüoresans üretecek sekilde bir UV-indüklü reaksiyonda triptofan rezidüleri ile reaksiyona girer. Analizde kullanilan reaktifler asagidakileri içerir: Konsantre (10X) Laemmli Örnek Tamponu (Kem-En-Tec, Katalog No: 42556); 18 veya 26-kuyucuklu Criterion TGX Boyasiz Prekast jeller (Bio-Rad, Protein Standards" (Bio-Red, Katalog No: 161- 0363). Analiz asagidaki sekilde gerçeklestirilmistir: Proteazi inaktive etmek ve kendi kendine hidrolize önlemek için 25 pl protein örnegi ve 25 pl 0,5 M HCI buz üzerinde bir 96 kuyucukIu-PCR plakasina eklenmistir. Asit protein karisiminin 50 ul'si 96 kuyucuklu-PCR plakasi içinde 0.385 mg DTT içeren 50 uL örnek tamponuna eklenmistir. Plaka Bio-Rad firmasindan Microseal makinesine yerlestirilmistir. Bundan sonra, bölme yürütme tamponu ile doldurulmustur ve jel kaseti ayarlanmistir. Akabinde belirteçler ile birlikte her bir örnegin 20 pL'si her bir cebe yüklenmistir. 200 V'da 55 dk boyunca elektroforez baslatilmistir. Elektroforezi takiben, jel bir Görüntüleyici'ye transfer edilmistir ve Image Lab yazilimi her bir bandin yogunlugunun hesaplanmasi için kullanilmistir. Standart örnegin protein miktari ve triptofan örnegini bilinerek, bir kalibrasyon egrisi yapilabilir. Deneysel örnegin miktari bant yogunlugunun ve triptofan sayilarinin protein konsantrasyonuna uyarlamasi ile belirlenmistir. Bu protein kantifikasyon yöntemi müteakip örneklerde tarif edilen hazirlamak amaciyla kullanilmistir.

Izole edilmis BspAI02518 ve BspU2193 proteazlarinin örnekleri bunu takiben tarif edildigi üzere LC-MS/MS ile analiz edilmistir. N- ve C-ucu belirlenmesi dâhil olmak Üzere dizi konfirmasyonu için preparasyonda, BspAI02518 proteazinin ve BspU2193 proteazinin bir örnegi bir 10 kDa'luk spin-filtre içinde bir dizi kimyasal muameleye tabi tutulmustur. Örnekler üre ve DTT/Iyodoasetamid muamelesi ile denatüre edilmistir ve indirgenmistir/alkillenmistir. Bir guanidinasyon adimi lizin yan Zincirlerini asetilasyondan korumak amaciyla Iizinleri homoarjininlere dönüstürmek için gerçeklestirilmistir. Sülfo- NHS-Asetat (Sülfosüksinimidil Asetat) kullanilan asetilasyon reaksiyonu yalnizca proteinin N-ucu rezidüsünü modifiye eder. Örnekler akabinde aglag %40 180 su: aglag karistirilmistir. Elde edilen peptitler, peptitlerin izotopik paterninden asikâr olacagi üzere, natif 16O'yu muhafaza edecek olan Karboksil ucu disinda 18O'nun ve 16O'nun karisimlarini içerecektir. Proteinin N-ucundan köken alan peptit asetilenmis tek peptit olarak görülecektir. Elde edilen peptitler bir nano-LC sistemi akabinde LTQ Orbitrap (Thermo Fisher) yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanilarak ayrilmistir ve analiz edilmistir. Amino asit dizilerine peptitlerin MS/MS fragman spektrumlarindan çikarim yapilmistir. Bu analize göre, izole edilmis proteinin N-ucunun tahmin edilen matür diziden pozisyon 1'deki A ile basladigi konfirme edilmistir. Matür proteinin dizisinin 269 amino asitten olusan, SEQ ID NO: 3'te listelenen diziye karsilik geldigi belirlenmistir. Bu analize göre, izole edilmis BspU2193 proteininin N-ucunun SEQ ID NO: 84'te listelenen tahmin edilen matür diziden pozisyon 2'deki O ile basladigi konfirme edilmistir.

Islenmis matür enzimin, ilave karakterizasyon için saflastirilmis ve kullanilmis olan (268 amino asitlik) BspU2193'ün, amino asit dizisi SEQ lD NO: 84 olarak izah edilir: BspAIO substratinin hidrolizini ölçme ile test edilmistir. DMC analizi için kullanilan reaktif çözeltileri asagidakilerdir: 100 mM sodyum karbonat tamponu, pH 9,5, içinde ag/hacim Reaktif A: Deiyonize su içinde 1000 mL'Iik bir nihai hacme ulasacak sekilde15 mL 4 N NaOH içinde 45,4 9 NagB407.. Proteaz süpernatantlari seyreltme çözeltisi içinde seyreltilmistir: 5 dk boyunca hidroliz sirasinda bir lineer yanit saglayacak sekilde arzu edilen konsantrasyona kadar 10 mM NaCl, 0,1 mM CaCIg, doldurulmustur bunu 5 pl seyreltilmis proteaz süpernatanti eklenmesi izlemistir.

Akabinde, Reaktif A içindeki 100 uL TNBSA yavas karistirma ile eklenmistir. Aktivite RT'de kinetik modda bir SpectraMax plaka okuyucu kullanilarak 5 dk boyunca 405 nm'de ölçülmüstür. Herhangi bir proteaz içermeyen bir kör çözeltinin absorbansi her bir örnek okumasindan çikartilmistir. Aktivite mOD/dk olarak ifade edilmistir. BspAI02518 için proteaz aktivite egrisi Sekil 3'te gösterilir ve BspU02193 için proteaz aktivite egrisi Sekil 4'te gösterilir. DMC analizinde BspAI02518 proteazinin spesifik aktivitesinin 46 mOD/min/ppm oldugu bulunmustur (burada ppm analizdeki proteazin nihai konsantrasyonudur). DMC analizinde BspU02193 proteazinin spesifik aktivitesinin123 mOD/dk/ppm oldugu bulunmustur. GG36 ve BPN' proteazlarinin spesifik aktivitelerinin, ayni analiz kosullari altinda, sirasiyla 54 ve 23 mOD/dk/ppm oldugu bulunmustur. içeren bir 50 mM'Iik asetat/Bis-Tris/HEPES/CHES tamponu içindeki bir azo-kazein substrati kullanilarak çalisilmistir. 4 ila 12 arasindaki pH'in etkisi 1 pH birimlik artislarla ölçülmüstür. Bir Protaxyme AK tableti (Megazyme, Ireland) 1,9 mL uygun tampon ile birlikte bir cam test tüpüne eklenmistir bunu manyetik karistirici ile donatilmis bir sicaklik kontrollü su banyosu içinde 5 dk boyunca 40°C'de yumusak hidrasyon izlemistir. Yeni hazirlanmis (analiz için bir uygun konsantrasyona kadar deiyonize su içinde seyreltilmis) proteazin bir 100 ul'lik örnegi önceden-hidratlanmis substrata eklenmistir ve reaksiyon 40°C'de 10 dk boyunca gerçeklestirilmistir. Reaksiyonu durdurmak için, 10 mL bir ag/hacim %2'Iik Tris tamponu, pH 12, eklenmistir ve çözelti hemen bir Whatman No. 1 filtreden filtrelenmistir. Süpernatant toplanmistir ve 590 nm'de absorbans reaksiyonunun ürününü kantifiye etmek amaciyla Süpernatant için ölçülmüstür. Bir yalnizca-tampon kontrolünden elde edilen absorbans her bir örnek okumasindan çikartilmistir ve elde edilen degerler, optimal pH`taki aktiviteyi %100 olarak tanimlama ile, bagil aktivitenin yüzdelerine dönüstürülmüstür. Bu analizin aktiviteyi idame ettirdigi belirlenmistir. 50 mM CaCI2 içeren bir 50 mM'Iik asetat/Bis-Tris/HEPES/CHES tamponu içindeki bir azo-kazein substrati kullanilarak ölçülmüstür. Aktivite 10°C'Iik artislar ile 30°C ila 80°C arasindaki sicakliklarda ölçülmüstür. Bir Protaxyme AK tableti (Megazyme, Ireland) 1,9 mL uygun tampon ile birlikte bir cam test tüpüne eklenmistir bunu manyetik karistirici ile donatilmis bir sicaklik kontrollü su banyosu içinde 5 dk boyunca ayarlanmis sicakliklarda yumusak hidrasyon izlemistir. Yeni hazirlanmis (analiz için bir uygun konsantrasyona kadar deiyonize su içinde seyreltilmis) proteazin bir 100 pl'lik örnegi önceden-hidratlanmis substrata eklenmistir ve reaksiyon 40°C`de 10 dk boyunca gerçeklestirilmistir. Reaksiyonu sonlandirmak için, 10 mL bir ag/hacim %2'Iik Tris tamponu, pH 12, eklenmistir ve çözelti hemen bir Whatman No. 1 filtreden filtrelenmistir. Süpernatant toplanmistir ve 590 nm'de absorbans reaksiyonunun ürününü kantifiye etmek amaciyla bu Süpernatant için ölçülmüstür. Bir yalnizca-tampon kontrolünden elde edilen absorbans her bir örnek okumasindan çikartilmistir ve elde edilen degerler, optimal sicakliktaki aktiviteyi %100 olarak tanimlama ile, bagil aktivitenin yüzdelerine dönüstürülmüstür. Bu analizin kosullari altinda, BspAl02518'in -65°C olan sicaklik araligi boyunca 2%50'Iik aktiviteyi idame ettirdigi belirlenmistir ve belirlenmistir. için BMI (pamuk üzerindeki kan/süt/mürekkep) mikro-numunelik kumas parçalari üzerinde (EMPA-116, Center for Testmaterials, The Netherlands) ve bulasik temelli uygulamalar için yumurta sarisi (eski ve karbon siyahi boya ile renklendirilmis poliakril kumas üzerindeki yumurta sarisi) mikro-numunelik kumas parçalari üzerinde (FAS-38, Center for Testmaterials, The Netherlands) test edilmistir. (MTP üzerine takmak için) önceden-delinmis numunelik kumas parçalari içeren MTP'Ier (Coming 3641) durulanmistir ve enzimin eklenmesinden önce deterjan ile doldurulmustur. Ticari deterjanlar var olan enzim aktivitesini ortadan kaldirmak için isi ile inaktive edilmistir ve Tablo 6-1'de tarif edildigi üzere dozlanmistir.

Agir is sivi (HDL) çamasir deterjanlari bir su banyosu içinde 95°C'de 4 saat boyunca isitma ile inaktive edilmistir. Agir is kuru (HDD) çamasir deterjanlari bir ag/hacim HDD hem de HDL deterjanlarini 4 saat boyunca isittiktan sonra. proteaz aktivitesinin var olmadigi belirlenmistir.

Var olan deterjan proteazlarinin inaktivasyonunu takiben, test proteazlarinin aktivitesi bir sük-AAPF-pNA (AAPF) substrati kullanilarak analiz edilmistir. AAPF hidroliz analizi için kullanilan reaktif çözeltileri asagidakilerdir: %0.005 TWEEN®-80 içeren 100 mM içeren ve DMSO içindeki 160 mM sük-AAPF-pNA (sük-AAPF-pNA stok çözeltisi) (Sigma: S-7388). Bir substrat çalisma çözeltisi hazirlamak için, 1 ml sük-AAPF-pNA stok çözeltisi 100 ml Tris/Ca tamponuna eklenmistir ve iyice karistirilmistir. Bir enzim örnegi 1 mg/ sük-AAPF-pNA çalisma çözeltisi içeren bir MTP plakasina (Greiner 781101) eklenmistir ve RT'de kinetik madde bir SpectraMax okuyucu kullanilarak 3 dk boyunca 405 nm'de aktivite için analiz edilmistir. Proteaz aktivitesi mOD~dk-1 olarak ifade edilmistir.

Tablo 6-1'de tarif edilen Nihai Deterjan Yikama konsantrasyonlari (g/L) ile yikama çözeltileri yapilmistir ve temizleme performans analizinde kullanilmistir.

Tablo 6-1. Temizleme Performans Analizleri için Deterjan Kosullari Deterjan Sertlik Deterjan* Tip Yikama Kons. Kons. Tampon pH OMO color HDD 5.3 250 2 mM NaCOs 10,6 Kirkland OMO K & K HDL 2.8 250 5 mM Na HEPES 8,2 Kirkland pH'i ayarlamak için GSM-B 9 ADW 3 374 tamponlanmamis 1 M sitrat *Deterjan kaynaklari: Kirkland Ultra HDD ve HDL (Sun Products) 2012`de Amerika Birlesik Devletleri'ndeki lokal süpermarketten satin alinmistir. OMO color HDD ve OMO Klein & Krachtig (Unilever) 2013'te Hollanda'daki lokal süpermarketlerden satin alinmistir. GSM-B WFK Testgewebe GmbH, Germany, firmasindan satin alinmistir.

Tablo 6-2. GSM-B pH 10,5 Fosfatsiz ADW Deterjan Içerik Maddeleri Bilesen Agirlik %'si Sodyum sitrat dehidrat 30,0 Maleik asit/akrilik asit kopolimeri sodyum tuzu (SOKALAN® CP5; 12 O Sodyum disilikat: Protil A (Cognis) 25,0 Lineer yagli alkol etoksilat 2,0 Sodyum karbonat anhidroz tamamlanir Enzimin alikotlari çamasir analizi için bir 0,04 ila 10 ppm'lik nihai enzim konsantrasyonu ile 200 uL'lik bir nihai hacme ulasacak sekilde bir deterjan-doldurulmus mikro- numunelik kumas parçasi plakasina eklenmistir. HDL veya HDD deterjanlari ile çamasir temizleme analizleri 25°C'de 15 dk boyunca gerçeklestirilmis iken, otomatik bulasik (ADW) analizleri 40°C'de 30 dk boyunca gerçeklestirilmistir. edilmistir ve absorbans SpectraMax plaka okuyucu kullanilarak EMPA-116 numunelik kumas parçalari için 600 nm'de veya FAS-38 numunelik kumas parçalari için 405 nm'de okunmustur. Bir yalnizca tampon kontrolünden elde edilen absorbans çikartilmistir ve (HDL ve HDD deterjanlari için) 405 nm'de elde edilen OD degerleri proteaz konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak grafik hâline getirilmistir. Veriler Langmuir denklemi kullanilarak uydurulmustur. Çesitli deterjanlarda BspAI02518'in temizleme performansi Sekil 5A-50'de gösterilirken, çesitli deterjanlarda BspUO2193'ün temizleme performansi Sekil 6A-B'de gösterilir.

Homolog Proteazlarin Tanimlanmasi BspAI matür formlarinin amino asit dizileri NCBI artiksiz protein veri tabanina karsi bir BLAST aramasina arastirma sorgu dizileri olarak sirasiyla SEQ ID NO: 3 ve SEO ID NO: 6 kullanilarak varsayilan degerlere ayarlanmis arama parametreleri ile Genome Quest Patent veri tabanina karsi çalistirilmistir. Arama sonuçlarinin alt-kümeleri BspAI02518 için Tablolar kümesi için özdeslik yüzdesi (PID) ikili hizalamada hizalanmis rezidülerin sayisina bölünmüs özdes rezidülerin sayisi olarak tanimlanmistir. "Dizi Uzunlugu" etiketli kolon listelenmis Erisim N0.'Iari ile iliskilendirilmis protein dizilerinin (amino asitler cinsinden) uzunlugunu ifade ederken, "Hizalanmis Uzunluk" etiketli kolon PID hesaplamasi için kullanilan hizalanmis protein dizisinin (amino asitler cinsinden) uzunlugunu ifade eder.

Tablo 7-1. NCBI Artiksiz Protein Veri Tabani'ndaki Kayitlari ile BspAI02518 tarafindan Paylasilan Dizi Özdesligi (PID) Erisim No. PID Organizma DiZi Hizalama Uzunlugu Uzunlugu 825-6] Erisim No. PID Organizma DiZi “ Hizalarria Uzunlugu Uzunlugu stearothermophilus Tablo 7-2. Genome Quest Veri Tabani'ndaki Kayitlari ile BspAl02518 tarafindan Paylasilan Dizi Özdesligi (PID) Dizi Hizalama Uzunlugu Uzunlugu 685 B. Ientus 268 267 Patent - SEQ DE10064983 Organizma B. clausi'i Baci/lus sp. B18-1 Baci/Ius Sp.

Baci/Ius sp.

B. subti/is Bacillus sp.

Bacillus sp.

Bacillus sp.

B. Ientus B. halodurans B. pseudofirmus FA30- Bacil/us sp. NKS-21 Baci/Ius sp.

B. Ientus B. alcalophi/us B. clausi'i B. clausii' KSM-K16 B. lentus B. Clausi'i' KSM-K16 Baci/Ius sp. DSM Uzunlugu Hizalama Uzunlugu Patent - SEQ W09402618 W09402618 EP2100948 W09402618 Organizma 14390 64.2 B. aloalophi'lus 64.2 B. nova/i's 63.8 B. Ientus 63.8 B. novali's B. a/calophilus; PBQZ 63.4 B. novalis Uzunlugu Hizalama Uzunlugu Tablo 7-3. NCBI Artiksiz Protein Veri Tabanindaki Kayitlar ile BspU02193 Erisim No.

AG878407 P29600 Organizma B. marmarensi's DSM21297 B. pseudofi'rmus OF4 B. halodurans C-125 B. clausii Bacillus sp. JB99 Bacillus sp.; AprM Bacillus sp.; AprN B. Iehensis B. c/ausi'i KSM-K16 B. alcalophilus B. subti/is Bacillus sp.; SprC B. gibsonii B. Ientus tarafindan Paylasilan Dizi Özdesligi (PID) Uzunlugu Hizalama Uzunlugu Erisim No. PID Organizma DiZi “ Hizalarria Uzunlugu Uzunlugu 825-6] stearothermophilus Tablo 7-4. Genome Quest Veri Tabanindaki Kayitlar ile BspU02193 tarafindan Paylasilan Dizi Özdesligi (PID) Patent - SEQ PID Organizma Dizi Hizalama Uzunlugu Uzunlugu Patent - SEQ W09402618 E P2100948 PID Organizma B. pseudofirmus FA30- 66.1 01 65.7 Bacillus sp. 65.7 B. subtilis 65.7 Bacillus sp. NKS-21 65.2 Bacillus sp. 65.0 Bacillus 64.8 Bacillus sp. 64.8 B. clausi'i' 64.8 Bacillus sp; B18-1 64.4 B. ha/odurans 64.0 B. lentus 64.3 Bacillus 64.3 B. gibsonii DSM 14391 63.5 Bacillus sp.

Bacillus sp. DSM 62.4 14392 Bacillus sp. strain 62.4 Zi344 61.8 Synthetic 61.7 B. novali's 61 .7 B. alcalophi/us; PBQ2 Uzunlugu Hizalama Uzunlugu Patent - SEQ PID Organizma Dizi Hizalama Uzunlugu Uzunlugu BspAI matür formlarinin amino asit dizisi Tablolar 7-1 ila 7-4 arasinda listelenen çok sayida proteazin amino asit dizileri ile varsayilan parametreler ile CLUSTALW yazilimi hizalanmistir. Sekil 7A-F CLUSTAL W (1.83) çok sayida dizi hizalamasini gösterir.

BspAI matür formlarinin amino asit dizileri için bir filogenetik agaç Tablolar 7-1 ila 74 arasinda listelenen çok sayida proteazin amino asit dizileri kullanilarak insa edilmistir. Diziler Vector NTI Advance program çiftine girilmistir ve bir Kilavuz Agaç Komsu Birlestirme (NJ) yöntemi kullanilarak olusturulmustur (Saitou ve Nei, Mol Biol Evol, 4:406-425, 1987). NJ yöntemi analiz edilecek olan dizilerin tüm çiftleri arasindaki mesafelerin bir matriksi üzerinde çalisir. Mesafeler diziler arasindaki iraksama derecesi ile iliskilendirilir. Kilavuz Agaç diziler hizalandiktan sonra hesaplanmistir. Agaç yapimi asagidaki parametreler kullanilarak hesaplanmistir: Dizi mesafesi için Kimura düzeltmesi ve bosluklari olan pozisyonlari yok sayma. AIian Sekil 8'de gösterilen agaç Üzerinde gösterilen molekül adindan sonra parantez içinde hesaplanan mesafe degerlerini gösterir.

Ilave Bacillus spp. Serin Proteazlarinin Tanimlanmasi Ilave subtilisinler ilave Bacillus türlerinin genomlarini dizileme ile tanimlanmistir. B. akibai ATCC No. 43226 DSMZ'den (Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) elde edilmistir. B. clarkii susu Dupont Kültür Koleksiyonu'ndan elde edilmistir. Genom dizileme, birlestirme ve anotasyon esasen homolog proteinler sifrelemistir.

Serine Proteazi Bakn00315 Bakn00315n'nin nükleotid dizisi SEQ ID NO: 9 olarak izah edilir:.

Bakn00315n tarafindan sifrelenen preproenzimin amino asit dizisi SEQ ID NO: 10 olarak izah edilir ve NCBI Artiksiz Protein Veri Tabani Subat 2014'e GAE36608 Erisim Numarasi altinda kaydedilir:MRVLKGNKLTGLLLGFILVF'SFAFLSLSVSAK N-ucunda, preproenzim SignalP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 31 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 10'da kalin ve ita/ik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidi dizisinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir. Diger serin proteazlari gibi, enzim 73 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 10'da ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog pro-matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin, Bakn00315'in (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEQ ID NO: 11 olarak izah edilir: Serin Proteazi BcIO4009 BCIO4009n'nin nükleotid dizisi SEQ ID NO: 12 olarak izah edilir: izah edilir: WICFIVGFLMFTFTFSAVSA N-ucunda, preproenzim SignalP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 26 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEO ID NO: 13'te kalin ve italik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidi dizisinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir. Diger serin proteazlari gibi, enzim 69 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEO lD NO: 13'te ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog pro-matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin, Bcl04009'un (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEO ID NO: 14 olarak izah edilir: Serin Proteazi SWT66_254731 olarak izah edilir: MICFIWFLWTFTFSAVSA N-ucunda, preproenzim SignalP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 26 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEO ID NO: 16'da kalin ve ita/ik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 69 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 16'da ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir. ifade edilir, (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEQ ID NO: 17 olarak izah edilir: matür formlarinin amino asit dizilerinin B. amy/oliquefaciens'ten, B. /entus'tan, B. /icheniformis'ten, Bacillus sp. LG12'den ve B. pseudofi'rmus'tan (sirasiyla NCBI Erisim No.'lari. CAA elde edilen subtilisinlerin matür formlarinin dizileri ile bir hizalamasi Sekil 9A-B'de gösterilir. Diziler varsayilan parametreler ile CLUSTALW yazilimi (Thompson et al., Nucleic Acids Tablo 8-1 'deki subtilisinlerin matür formlarinin amino asit dizileri için bir filogenetik agaç insa edilmistir. Diziler Vector NTI Advance program çiftine girilmistir ve bir Kilavuz Agaç Komsu Birlestirme (NJ) yöntemi kullanilarak olusturulmustur (Saitou ve Nei, Mol Biol hesaplanmistir: Dizi mesafesi için Kimura düzeltmesi ve bosluklari olan pozisyonlari yok sayma. Alian Sekil 10'da gösterilen agaç üzerinde gösterilen molekül adindan sonra parantez içinde hesaplanan mesafe degerlerini gösterir.

SWT66_254731 subtilisininin temizleme performansi SWT66_254731 subtilisininin temizleme performansi Örnek 6'da tarif edildigi üzere çamasir temelli uygulamalar için BMI (pamuk üzerindeki kan/süt/mürekkep) mikro- numunelik kumas parçalari üzerinde (EMPA-116, Center for Testmaterials, The Netherlands) ve bulasik temelli uygulamalar için yumurta sarisi (eski ve karbon siyahi boya ile renklendirilmis poliakril kumas üzerindeki yumurta sarisi) mikro-numunelik kumas parçalari üzerinde (FAS-38, Center for Testmaterials, The Netherlands) test edilmistir. (MTP üzerine takmak için) önceden-delinmis numunelik kumas parçalari içeren MTP'Ier (Coming 3641). ADW analizleri için ya durulanmistir ya da durulanmamistir ve enzimin eklenmesinden önce deterjan ile doldurulmustur. Bir mikro- numunelik kumas parçasi HHD'de ve 2 mikro-numunelik kumas parçasi HD analizlerinde kullanilmistir. SWT66_254731 subtilisininin çesitli deterjanlar içindeki temizleme performansi Sekiller 11A-11F'de gösterilir.

Ilave B. akibai Serin Proteazlarinin Tanimlanmasi Ilave subtilisinler ilave B. akibai' türlerinin genomlarini dizileme ile tanimlanmistir. B.

DETPh35_2828044 Dupont Kültür Koleksiyonu'ndan elde edilmistir. Genom dizileme, birlestirme ve anotasyon esasen Örnek 1'de tarif edildigi sekildedir. Tüm genomlar Serin Proteazi ACB102_ 19 olarak izah edilir: N-ucunda, preproenzim SignaIP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 29 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 19'da kalin ve ita/ik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 68 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEO ID NO: 19'da ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin, ACBlOZ'nin, (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEQ ID NO: 20 olarak izah edilir: N-ucunda, preproenzim SignalP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 29 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 22'de kalin ve italik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 68 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 22'de ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin, COG104'ün, (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEQ ID NO: 23 olarak izah edilir: N-ucunda, preproenzim SignaIP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 29 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu (SEQ ID NO: 25'te kalin ve italik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 68 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEO ID NO: 25'te ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin, ACB83'ün, (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEO ID NO: 26 olarak izah edilir: Serin Proteazi ACBQO N-ucunda, preproenzim SignaIP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 29 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 28'de kalin ve ita/ik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 68 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 28'de ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin, ACBQO'in, (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEQ ID NO:29 olarak izah edilir: ACBB2_2683104.n tarafindan sifrelenen preproenzimin amino asit dizisi SEQ ID NO: 31 olarak izah edilir: N-ucunda, preproenzim SignalP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 31 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 31'de kalin ve itaIik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 69 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 31'de ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin ACB82'nin, (269 amino asitlik), amino asit dizisi, SEQ ID NO: 32 olarak izah edilir: ACBBQ_2715301.n tarafindan sifrelenen preproenzimin amino asit dizisi SEQ ID NO: 34 olarak izah edilir: N-ucunda, preproenzim SignalP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 31 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEO ID NO: 34'te kalin ve italik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 75 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEO ID NO: 34'te ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin, ACB89'un, (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEQ ID NO: 35 olarak izah edilir: ACBQ2_2732966.n tarafindan sifrelenen preproenzimin amino asit dizisi SEQ ID NO: 37 olarak izah edilir: N-ucunda, preproenzim SignalP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2953-5371, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 31 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 37'de kalin ve italik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 69 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 37'de ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

Tam olarak islenmis matür enzimin, ACBQZ'nin, (269 amino asitlik), amino asit dizisi SEQ ID NO: 38 olarak izah edilir: Serin Proteazi DETPh35 DETPh35_2828044.n tarafindan sifrelenen preproenzimin amino asit dizisi SEQ ID NO: 40 olarak izah edilir: 1`i l'IH “UZUN!IMEI/'fa` HK.”!ÂÄ'I'Vl'il'l1Kmi"'i7.1301\*`I'\\(.il`JIIIUv\l"'I\"Il$\\(.i H_i\'5ll S'Illl ShQN VSI..\(_I'IS.\\4I`5 \ l `lXQIRQRI_HDI \ l PLUS N-ucunda, preproenzim SignaIP-NN (Emanuelsson et al., Nature Protocols, 2:953-971, 2007) kullanilarak belirlendigi üzere 31 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEQ ID NO: 40'ta kalin ve ita/ik olarak yazilmis) bir sinyal peptidine sahiptir. Bir sinyal peptidinin varligi bu serin proteazinin bir salgilanmis enzim oldugunu gösterir.

Diger serin proteazlari gibi, enzim 71 amino asitlik bir tahmin edilen uzunlugu olan (SEO ID NO: 40'ta ita/ik yazilmis) bir pro-diziye sahiptir. Pro-dizi tahmini homolog serin matür birlesme yeri bilgisine dayandirilmistir.

BspAI, Bakn00315 (SEO ID NO: 11), Bol, ACB102 (SEO ID NO: 20), COG, ACBQO (SEO ID NO: DETPh35 (SEO ID NO: 41) subtilisinlerinin matür formlarinin amino asit dizilerinin B. amy/oliquefaciens'ten, B. Ientus'tan, B. Iicheniformis'ten, BaciI/us sp. LG12'den ve B.

AAC elde edilen subtilisinlerin matür formlarinin dizileri ile bir hizalamasi Sekil 12'de gösterilir. Diziler varsayilan parametreler ile Vector NTI Advance® Yazilimi'nin (Life Technologies) Alian modülü kullanilarak hizalanmistir.

BII_CAJ7073 Bps_ADC49 7 ACB102 9 COG104 AC883 11 ACBQO 12 BCIO4009 14 ACB82 ACB89 2345678 63 60 63 66 68 16 ACBQ2 10 99. 99 17 DETPh35 10 99.

Tablo 10-1'deki subtilisinlerin matür formlarinin amino asit dizileri için bir filogenetik agaç insa edilmistir. Diziler Vector NTI Advance program çiftine girilmistir ve bir Kilavuz Agaç Komsu Birlestirme (NJ) yöntemi kullanilarak olusturulmustur (Saitou and Nei, Mol hesaplanmistir: Dizi mesafesi için Kimura düzeltmesi ve bosluklari olan pozisyonlari yok sayma. AIian Sekil 13'te gösterilen agaç üzerinde gösterilen molekül adindan sonra parantez içinde hesaplanan mesafe degerlerini gösterir.

B. akibai/clarkii-kladi subtilisinlerin essiz özellikleri Bir yapi temelli hizalama (Sekil 14) yapisal benzerlikleri aramak için Molecular Operating Environment (MOE) yazilimdaki (Chemical Computing Group, Montreal, Quebec, Canada) "hizala (align)“ seçenegi kullanilarak gerçeklestirilmistir. BspAIO, BclO, ACBSZ (SEQ ID NO: 32), ACBBQ (SEQ ID NO: 35), ACBQZ (SEQ ID NO: 38) ve DETPh35 (SEO ID NO: 41) subtilisinlerinin matür formlarinin amino asit dizileri B. amy/oliquefacien'ten BPN' subtilisini (pdb kaydi 2STI), B. licheniformis'ten Carlsberg (pdb kaydi 3UNX), B. fantus subtilisini (pdb kaydi 1JEA) ve subtilisin LG12'nin tescilli Basvurusu) ile hizalanmistir. Hizalama geleneksel dizi hizalamasina bir ilave kilavuz olarak korunmus yapisal motiflere uygulanir. Bu hizalama MOE'nin 2012.10 dagiliminda bulunan standart program varsayilanlari kullanilarak gerçeklestirilmistir.

DETPh35 subtitlisin dizilerinin yapisal hizalamasi, bu B. akibaiVc/arkii-kladi dizilerin üç korunmus amino asidin bir segmentine sahip olduguna gösterir: diger subtilisin enzimlerine kiyasla bu subtilisinler için essiz olan (bundan sonra "DRN motifi" olarak ifade edilen) (BspAl rezidüler 95- 97'de Asp-Arg-Asn (DRN). DRN motifinin her iki yaninda çogu Bacillus subtilisini boyunca hayli korunmus amino asitler yer alir. Her iki yaninda her alan korunmus rezidüler N-ucunda KVL'dir ve C-ucunda GG/SG'dir. DRN yerine, ticari BPN' ve B. sahiptir.

B. akibai/clarki'i-kladi subtilisin dizisi DRN motif VKVLDRNGR1G, burada R1, G veya 8 (SEQ ID NO: 42) arasindan seçilir, VKVLDRNGGG (SEQ lD NO: 43) veya VKVLDRNGSG (SEQ ID NO: 44) olarak tanimlanabilir. B. akibai/clarki'i-kladi subtilisin dizisi DRN motif ilaveten D, V olarak tanimlanabilir. SEQ SEO ID NO: 3 dizi numaralandirmasina göredir.

Sekil 15, katalitik triadin ve DRN motifinin B. /entus subtilisini (pdb kaydi 1JEA) proteazinin üç-boyutlu yapisi üzerinde modellendigi üzere B. akibai/clarkii'-kladi subtilisin proteazinda nerede konumlandirildigini gösterir. Bu yapisal hizalamada, karakteristik katalitik triad rezidüleri Asp32'nin, Hisö2'nin ve Ser215'in subtilisin-benzeri proteazlarin esit sekilde karakteristik "oksianyon deligi ni olusturan Asn153 boyunca korundugu görülür. Hizalamada, ayrica ticari subtilisinler Carlsberg'e ve (BPN`)'ye ve tescilli subtilisin LG12'ye kiyasla B. akibai/clarkii-kladi dizilerin 156. ve 157. rezidüleri arasinda B. /entus subtilisininde gözlemlenen bir ortak silinme tahminini de bulduk.

Hizalamada, ayrica ticari ve tescilli subtilisin proteazlarinin aksine B. akibai/clarki'i-kladi dizilerin bir DRN motifi içerdigini de bulduk. B. aki'bai/clarki'i-kladi dizilerin D95R96N97 tarafindan olusturulan substrat baglama yerine giren bir siki kivrim içinde konumlandirilir. Bu motifin B. akibai/c/arkii-kladi subtilisinlerin substrat ile bir yararli sekilde etkilesimini modüle edebilmesi beklenir.

B. akibai/clarki'i-kladi subtilisini-benzeri proteazlarin herhangi bir kristalografik yapisi yoktur. Bunun yerine, Sekil 15, DRN motifinin B. akibai/c/arkiiikladi subtilisini benzeri proteazlarin performansindaki potansiyel önemini göstermek için bir destekleyici olarak B. Ientus subtilisininin yapisini kullanir. Toplam ana zincir katlanmasinin sematik temsili açik gri renkte gösterilir. Ayrica, siyah çubuklar olarak, katalitik triad rezidüleri Asp32'nin, HisöZ'nin ve Ser215'in yan zincirlerinin lokasyonu da gösterilir. DRN motifindeki rezidüler homolog pozisyonlarda B. /entus yapisi üzerinde modellenmistir.

Bu rezidülerin substrat baglama rezidüleri 99-102'ye giren ve ayrica substrat baglama yerinin öndeki kösesini de olusturan ve böylece substrat baglamayi modüle etmek için bir pozisyona giren kivrimi belirledigi görülebilir.

Claims (14)

ISTEMLER
1. . Bir rekombinant Bacillus akibai/clarkii-kladi subtilisin polipeptidi veya bunun bir aktif fragmani olup, burada rekombinant polipeptit veya bunun aktif fragmani 38'in, 41'in veya 84'ün bir amino asit dizisine en az %72'Iik özdeslige veya SEQ polipeptit veya bunun aktif fragmani SEQ ID NO: 42'nin, 43'ün, 44'ün, 45'in, 46'nin, 47'nin veya 48'in bir amino asit dizisini içerir.
2. . Istem 1'e göre rekombinant polipeptit olup, burada polipeptit bir sürfaktan varliginda proteaz aktivitesine sahiptir ve/veya bir deterjan bilesimi içinde temizleme aktivitesine sahiptir, burada deterjan bilesimi opsiyonel olarak bir otomatik bulasik yikama deterjanidir veya bir çamasir deterjanidir.
3. . Istem 2'ye göre rekombinant polipeptit olup, burada proteaz aktivitesi kazein hidrolizi içerir ve/veya temizleme aktivitesi bir yumurta sarisi substratinin veya kandan, sütten, mürekkepten ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen bir substratin hidrolizini içerir.
4. . Istem 3'e göre rekombinant polipeptit olup, burada polipeptit 8 ila 12'lik bir pH araliginda ve/veya 50°C ila 75°C'Iik bir sicaklik araliginda bunun maksimal proteaz aktivitesinin en az %50'sini muhafaza eder.
5. . Bir sürfaktan ve 1-4 arasindaki istemlerin herhangi birine göre rekombinant polipeptidi içeren bir bilesim olup, burada sürfaktan opsiyonel olarak bir anyonik sürfaktandan, bir katyonik sürfaktandan, bir zwitteriyonik sürfaktandan, bir amfolitik sürfaktandan, bir yari-polar iyonik-olmayan sürfaktandan ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilir.
6. . Istem 5'e göre bilesim olup, burada bilesim, opsiyonel olarak bir çamasir deterjanindan, bir kumas yumusatici deterjandan, bir bulasik yikama deterjanindan ve bir sert-yüzey temizleme deterjanindan olusan gruptan seçilen, bir deterjan bilesimidir.
7. Istem 5'e veya 6'ya göre bilesim olup, burada söz konusu bilesim ilaveten en az bir kalsiyum iyonu ve/veya çinko iyonu; en az bir stabilazör; agirlik olarak yaklasik %0,001 ila yaklasik %1 ,O söz konusu rekombinant polipeptidi; en az bir agaitma ajani, en az bir yardimci içerik maddesi ve/veya açil transferazlardan, alfa-amilazlardan, beta-amilazlardan, alfa-galaktosidazlardan, arabinosidazlardan, aril esterazlardan, beta-galaktosidazlardan, karajenazlardan, katalazlardan, sellobiyohidrolazlardan, selülozlardan, kondroitinazlardan, kütinazlardan, endo-beta-1,4-glukanazlardan, endo-beta- mannanazlardan, esterazlardan, ekzo-mannanazlardan, galaktanazlardan, glukoamilazlardan, hemiselülazlardan, hiyalüronidazlardan, keratinazlardan, mannanazlardan, oksidazlardan, pektat Iiyazlardan, pektin asetil esterazlardan, pektinazlardan, pentozanazlardan, peroksidazlardan, fenoloksidazlardan, fosfatazlardan, fosfolipazlardan, fitazlardan, poligalaktüronazlardan, proteazlardan, pullulanazlardan, redüktazlardan, ramnogalaktüronazlardan, beta-glukanazlardan, tannazlardan, transglutaminazlardan, ksilan asetil- esterazlardan, ksilanazlardan, ksiloglukanazlardan, ksilosidazlardan, metalloproteazlardan, ilave serin protezlarindan ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla ilave enzim veya enzim türevi içerir.
8. Istemler 5-7'den herhangi birine göre bilesim olup, burada söz konusu bilesim fosfatsizdir; fosfat içerir; boratsizdir veya borat içerir.
9. Temizlemenin bir yöntemi olup, bir yüzeyi veya bir esyayi Istemler 1-4'ten herhangi birine göre rekombinant polipeptidi içeren bir bilesim veya Istemler 5- 8'den herhangi birine göre bilesim ile temas ettirmeyi içerir, burada söz konusu esya opsiyonel olarak tabak çanaktir veya kumastir.
10. Bir rekombinant polipeptit üretmek için bir yöntem olup, asagidakileri içerir: bir konak hücreyi Istemler 1-4'ten herhangi birine göre polipeptidi sifreleyen bir polinükleotid içeren bir ekspresyon vektörü ile kalici bir sekilde transforme söz konusu transforme edilmis konak hücreyi söz konusu polipeptidi üretmesi için söz konusu konak hücre için uygun olan kosullar altinda yetistirme ve söz konusu polipeptidi geri-kazanma.
11. Bir polinükleotid olup, asagidaki sekilde olan bir nükleik asit içerir: (i) SEQ ID NO: 3'ten, SEQ ID NO: 6'dan, SEQ ID NO: 11'den, SEQ ID NO: 14'ten ve SEQ ID NO: 17'de olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisine sahip olan bir serin proteazini sifreleyen; asit dizisine en az %70'Iik özdeslige sahip olan ve (b) SEQ ID NO: 42'nin, 43'ün, dizisine sahip olan bir serin proteazini sifreleyen; asit dizisine en az %72'Iik özdeslige sahip olan ve (b) SEQ ID NO: 42'nin, 43'ün, dizisine sahip olan bir serin proteazini sifreleyen; (iv) bir serin proteazini sifreleyen ve SEO ID NO: 1'e, 4'e, 18'e, 21'e, 24'e veya 27'ye en az %70'Iik özdeslige sahip olan; veya (v) bir serin proteazini sifreleyen ve SEO ID NO: 9'a, 12'ye, 15'e, 30'a, 33'e, 36'ya veya 39'e en az %72'Iik özdeslige sahip olan.
12. 12. Bir ekspresyon vektörü olup, Istem 11'e göre polinükleotidi içerir.
13. 13. Bir konak hücre olup, Istem 12'ye göre vektör ile transforme edilir.
14. 14. Bir tekstil, deri veya tüy isleme veya kontakt lens veya yara temizleme bilesimi olup, Istemler 1-4'ten herhangi birine göre polipeptidi içerir.