CN118369414A - 包含蛋白酶的自动盘碟洗涤组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含表面活性剂和蛋白酶的织物和家庭护理组合物。

Description

包含蛋白酶的自动盘碟洗涤组合物

技术领域

本发明属于自动盘碟洗涤组合物的领域。

背景技术

蛋白酶(“protease”，也被称为“proteinase”)是具有分解其他蛋白质的能力的酶。蛋白酶具有进行蛋白水解的能力，其通过将形成蛋白质的肽或多肽链中的氨基酸连接在一起的肽键水解而开始蛋白质分解代谢。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。存在许多熟知的测量蛋白水解活性的方法(Kalisz，“MicrobialProteinases”，出自：Fiechter(编辑)，Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology，1988年)。例如，可通过分析相应的蛋白酶水解商业底物的能力的比较测定来探知蛋白水解活性。用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和天青角蛋白(Keratin Azure)(Sigma-Aldrich K8500)。利用这些底物的比色测定在本领域中是熟知的(参见例如，WO 99/34011和美国专利号6,376,450，两者均以引用方式并入本文)。

丝氨酸蛋白酶是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶(ECNo.3.4.21)。丝氨酸蛋白酶包括具有宽泛范围的特异性和生物学功能的不同种类的酶，这些酶基于它们的结构进一步分为胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶样。原型枯草杆菌蛋白酶(EC No.3.4.21.62)最初得自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。枯草杆菌蛋白酶及其同系物是MEROPS分类方案的S8肽酶家族的成员(Rawlings,N.D.等人，2016年，Twenty years of the MEROPS database of proteolytic enzymes,theirsubstrates and inhibitors，Nucleic Acids Res，第44卷：D343-D350)。S8家族的成员在其氨基酸序列中具有Asp、His和Ser顺序的催化三联体。尽管已经开发出许多有用的变体蛋白酶用于清洁应用，但是仍然需要改善的蛋白酶变体。

还需要改善的蛋白酶变体，其在氧化环境中具有改善的稳定性，包括在变体的产生期间、在包含变体的组合物的储存期间以及在使用期间(例如，在洗涤浴中)，尤其是当变体与漂白剂组合使用时。

还需要提供一种可提供良好清洁并具有良好稳定性的自动盘碟洗涤剂组合物。

此外，仍需要提供包括隔室的水溶性单位剂量小袋形式的自动盘碟洗涤组合物，其中该隔室包含粉末组分和凝胶组分两者，并且其中该组合物包含表面活性剂和蛋白酶，并且其中该组合物具有良好的清洁性能、良好的蛋白酶性能和良好的稳定性。

发明内容

本发明涉及包含表面活性剂和蛋白酶的自动盘碟洗涤组合物，

其中该自动盘碟洗涤组合物是包括隔室的水溶性单位剂量小袋的形式，其中该隔室包含粉末组分和凝胶组分两者，

其中该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶变体，该枯草杆菌蛋白酶变体相对于SEQ ID NO:1包含：

(i)位置122处的突变；和

(ii)位置126、127、128、211和212处的一个或多个突变。

具体实施方式

自动盘碟洗涤组合物

该自动盘碟洗涤组合物包含表面活性剂和蛋白酶。

该自动盘碟洗涤组合物是包括隔室的水溶性单位剂量小袋的形式，其中该隔室包含粉末组分和凝胶组分两者。

优选地，该组合物是包括两个或更多个隔室，优选地三个或更多个隔室的多隔室小袋的形式。这些隔室中的至少一个隔室包含粉末组分和凝胶组分两者。

蛋白酶可存在于凝胶组分中。

该组合物可包含漂白剂，其中该漂白剂存在于粉末组分中。

本发明的组合物非常适于以多隔室包装的形式存在，更具体地以包含具有不同物理形式的组合物的隔室的多隔室包装的形式存在，例如一个隔室包含固体形式的组合物并且另一个隔室包含液体形式的组合物。该组合物优选地被水溶性膜诸如聚乙烯醇包封。特别优选的是被封装在聚乙烯醇膜中的单位剂型的组合物，该聚乙烯醇膜具有小于100μm、优选地为20μm至90μm的厚度。本发明的洗涤剂组合物的重量为约8克至约25克，优选地为约10克至约20克。该重量范围与盘碟洗涤机的分配器十分契合。虽然该范围相当于少量洗涤剂，但洗涤剂也以提供上文提及的全部有益效果的方式配制。

该组合物优选地不含磷酸盐。所谓“不含磷酸盐”在本文中被理解为该组合物包含按该组合物的重量计少于1％、优选地少于0.1％的磷酸盐。

该组合物通常是洗涤剂组合物。术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”用于提及旨在以洗涤介质形式用于清洁有污垢或脏污物体的组合物。在一些实施方案中，本公开的洗涤剂包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及此外一种或多种表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如，助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂(bluingagent)、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶稳定剂、钙、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在一些情况下，助洗剂盐为硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选地带有比磷酸盐(例如，三聚磷酸钠)更多的硅酸盐(例如，偏硅酸钠)。一些实施方案涉及不含任何磷酸盐(例如，磷酸盐或磷酸盐助洗剂)的清洁组合物或洗涤剂组合物。

术语“附属材料”是指包含在清洁组合物中的除本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或者重组多肽或其活性片段之外的任何液体、固体或气体材料。在一些实施方案中，本公开的清洁组合物包含一种或多种清洁附属材料。通常根据清洁组合物的特定类型和形式(例如，液体、颗粒、粉末、条、糊剂、喷雾、片剂、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁附属材料。优选地，每种清洁附属材料与组合物中使用的蛋白酶相容。

短语“基本上不含硼的组合物”或“基本上不含硼的洗涤剂”分别指含有可能来自其他组合物或洗涤剂组分的痕量(例如，小于约1000ppm(1mg/kg或升等于1ppm)、小于约100ppm、小于约50ppm、小于约10ppm或小于约5ppm或小于约1ppm)的硼的组合物或洗涤剂。

术语“漂白”是指持续足够长的时间和/或在适当的pH和/或温度条件下处理材料(例如，织物、衣物、纸浆等)或表面以实现材料的增亮(即，增白)和/或清洁。适用于漂白的化学品的示例包括但不限于例如ClO₂、H₂O₂、过酸、NO₂等。漂白剂也包括酶促漂白剂，诸如过水解酶(perhydrolase)和芳基酯酶。另一个实施方案涉及一种包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及诸如例如WO2005/056782、WO2007/106293、WO 2008/063400、WO2008/106214和WO2008/106215中所述的一种或多种过水解酶的组合物。

术语蛋白酶(例如，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，或者重组多肽或其活性片段)的“洗涤性能”是指本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体对洗涤的贡献，与没有向组合物添加本文所述的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的洗涤剂相比，这种贡献向洗涤剂提供附加的清洁性能。在相关洗涤条件下对洗涤性能进行比较。在一些测试系统中，可以使得仿效对于特定市场细分(例如，自动盘碟洗涤、盘碟清洁、餐具清洁等)中的家庭应用而言典型的条件的方式来控制其他相关因素，诸如洗涤剂组合物、泡沫浓度、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度。

本文使用短语“相关洗涤条件”来指示在手动盘碟洗涤剂、自动盘碟洗涤剂或衣物洗涤剂市场细分中实际家庭使用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂的类型和水硬度。

术语“盘碟洗涤”是指家庭和工业盘碟洗涤两者并且涉及自动盘碟洗涤(例如，在盘碟洗涤机中)。

术语“消毒”是指从表面去除污染物以及抑制或杀灭物品表面上的微生物。

本文清洁组合物的术语“致密”形式最好通过密度来反映，并且就组成而言通过无机填料盐的量来反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐大量存在，通常为总组合物的约17重量％至约35重量％。相比之下，在致密组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施方案中，填料盐以不超过组合物的约10重量％或更优选地约5重量％的量存在。在一些实施方案中，无机填料盐选自碱金属和碱土金属的硫酸盐和氯盐。在一些实施方案中，填料盐为硫酸钠。

凝胶组分

凝胶组分在本文中也可被称为凝胶、凝胶样相或凝胶相。

凝胶组分优选地是无水的。所谓无水意指包含小于10重量％或小于8重量％或小于6重量％或小于4重量％或小于2重量％或小于1重量％的水，或不包含有意添加的水。

凝胶组分通常包含酶，通常包含蛋白酶，并且如果存在的话，还通常包含淀粉酶。

凝胶组分可包含选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、半纤维素酶、纤维素酶、过水解酶或氧化还原酶以及它们的组合的酶。

通常，凝胶组分应理解为意指具有内部结构化网络的组合物/相。这种内部结构化(空间)网络是通过将固体但分散的物质与长的或高度支化的颗粒和/或胶凝剂分散在至少一种液体(该至少一种液体在20℃下是液体)中而形成的。此类凝胶相表现为热致可逆的。

该凝胶相可例如是能够流动的或尺寸上稳定的。然而，根据本发明，凝胶样相优选地在室温下是尺寸上稳定的。在制备中，使凝胶形成剂，优选地黄原胶、明胶或聚乙烯醇和/或它们的衍生物与溶剂，优选地有机溶剂，优选地一种或多种多元醇接触。这得到能够流动的混合物，其可被制成期望的形状。在一段时间之后，获得凝胶相，其保持预定形状，即是尺寸上稳定的。该时间(凝固时间)优选地是15分钟或更少，优选地是10分钟或更少，特别优选地是5分钟或更少。同时，该至少一种凝胶相屈服于压力，但不会因此变形，而是在压力停止之后回到初始状态。该至少一种凝胶相优选地是弹性的，特别是线性弹性的。

该至少一种凝胶相优选地是成型主体。成型主体是将其自身稳定在其压印形状中的单一主体。该尺寸上稳定的主体由模制材料(例如，组合物)通过以目标方式将该模制材料制成预定形状而形成，例如通过将液体组合物倒入铸模中并随后固化该液体组合物，例如在溶胶-凝胶法的范围内。对该至少一种凝胶相的制剂提出某些最低要求。因此，如上所述，凝胶相必须在尽可能短的时间内凝固。长的凝固时间将导致长的产生时间并因此导致高成本。根据本发明，凝固时间意指在制备期间该至少一种凝胶相从自由流动状态变为在室温下不自由流动的尺寸上稳定的状态的时间段。低于室温，通常是20℃的温度。

该至少一种凝胶相优选地是固体凝胶相。在这种情况下，它是耐切割的。除了进行切割外，其可例如在凝固之后用刀切割，而不被进一步破坏。

此外，该至少一种凝胶相优选地是半透明的(半透明的)或透明的，从而产生良好的光学压痕。凝胶相(无染料)的透射率优选地在100％和20％之间，在100％和30％之间，特别是在100％和40％之间的范围内。为了测量透光率(透射率)，在20℃下以水作为参照物测定在600nm下的透射率(％)。为此，将组合物倒入所提供的11mm圆形比色杯中，并在室温下储存12小时之后，在LICO 300颜色测量系统中根据长度进行测量。

该至少一种凝胶相的水含量低。为了本发明的目的，低水含量意指少量水可用于制备该至少一种凝胶相。凝胶相中的水的比例特别是20重量％或更少，优选地15重量％或更少，特别是12重量％或更少，特别是在10重量％和5重量％之间。以重量％表示的数据基于凝胶相的总重量。这具有以下优点：少量水与PVOH的组合可具有形成结构或形成凝胶的效果。

根据优选的实施方案，该至少一种凝胶相基本上是无水的。这意味着凝胶相优选地基本上不含水。“基本上不含”在此意指在凝胶相中可存在少量的水。该水可例如通过溶剂或作为结晶水或由于该相的成分彼此反应而引入到该相中。然而，作为用于制备凝胶相的溶剂，优选的是仅少量的水，特别是没有水。在该实施方案中，凝胶相中的水的比例为4.9重量％或更少，4重量％或更少，优选地2重量％或更少，特别是1重量％或更少，特别是0.5重量％或更少，特别是0.1重量％或0.05重量％或更少。重量百分比基于凝胶相的总重量。

凝胶组分通常包含凝胶形成剂，优选地选自明胶、黄原胶和/或聚乙烯醇，特别是明胶或聚乙烯醇，特别优选地聚乙烯醇，在每种情况下基于凝胶样相的总重量，其量为4重量％至40重量％，特别是6重量％至30重量％，特别优选地7重量％至24重量％，非常特别优选地8重量％至22重量％，特别是例如14重量％至20重量％。

优选地，该至少一种凝胶相特别优选地包含PVOH(聚乙烯醇)和/或其衍生物。聚乙烯醇是通常通过聚醋酸乙烯酯的水解制备成白色至淡黄色粉末的热塑性塑料。聚乙烯醇(PVOH)对几乎所有的无水有机化合物都有抗性。

优选的是摩尔质量为30,000g/mol至60,000g/mol的聚乙烯醇。

为了本发明的目的，优选的PVOH衍生物是聚乙烯醇与其他单体的共聚物，特别是与阴离子单体的共聚物。合适的阴离子单体优选地为乙烯基乙酸、丙烯酸烷基酯、马来酸以及它们的衍生物，特别是马来酸单烷基酯(特别是马来酸单甲酯)、马来酸二烷基酯(特别是马来酸二甲酯)、马来酸酐、富马酸以及它们的衍生物，特别是富马酸单烷基酯(特别是富马酸单甲酯)、富马酸二烷基酯(特别是富马酸二甲酯)、富马酸酐、衣康酸以及它们的衍生物，特别是衣康酸二烷基酯、衣康酸二甲酯、衣康酸酐、柠康酸(甲基马来酸)以及它们的衍生物、柠康酸单烷基酯(特别是柠康酸甲酯)、柠康酸二烷基酯(柠康酸二甲酯)、柠康酸酐、中康酸、(甲基富马酸)以及它们的衍生物、中康酸单烷基酯、中康酸二烷基酯、中康酸酐、戊烯二酸以及它们的衍生物、戊烯二酸单烷基酯、戊烯二酸二烷基酯、戊烯二酸酐、乙烯基磺酸、烷基磺酸、亚乙基磺酸、2-丙烯酰胺基-1-甲基丙烷磺酸、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸、2-甲基丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸、2-磺乙基丙烯酸酯以及它们的组合，以及上述单体的碱金属盐或酯。特别优选的PVOH衍生物选自聚乙烯醇与单体的共聚物，特别是选自由马来酸单烷基酯(特别是马来酸单甲酯)、马来酸二烷基酯(特别是马来酸二甲酯)、马来酸酐以及它们的组合，以及上述单体的碱金属盐或酯组成的组。对于聚乙烯醇本身给出的值适用于合适的分子量。为了本发明的目的，优选的是该至少一种凝胶相包含聚乙烯醇和/或其衍生物，优选地按重量计其水解度优选地为70摩尔％至100摩尔％，特别是80摩尔％至90摩尔％，特别优选地81摩尔％至89摩尔％，并且特别是82摩尔％至88摩尔％的聚乙烯醇。

特别优选的是作为聚合度在约100至2500(约4000g/mol至100,000g/mol的摩尔质量)的范围内并且水解度为80摩尔％至99摩尔％，优选地85摩尔％至90摩尔％，特别是87摩尔％至89摩尔％，例如88摩尔％的白色至淡黄色粉末或颗粒的聚乙烯醇，其因此仍然含有残余含量的乙酰基基团。

适用于该至少一种凝胶相的具有上述性质的PVOH粉末例如由Kuraray以商品名或销售。还合适的是例如得自Kuraray的AQ4104。特别合适的是Mowiol C30、品质，特别是品质3-83、3-88、6-88、4-85，并且特别优选地4-88，非常特别优选地Poval 4-88S2，以及得自Kuraray的4-88。

聚乙烯醇的水溶解度可通过用醛(缩醛化)或酮(缩酮化)后处理来测定。用糖或多糖或它们的混合物的醛或酮基团进行缩醛化或缩酮化的聚乙烯醇已被证明是特别优选的和特别有利的，因为它们在冷水中具有极好的溶解度。聚乙烯醇和淀粉的反应产物可极其有利地使用。此外，水中溶解度可通过与Ni或Cu盐络合或通过用重铬酸盐、硼酸、硼砂处理而改变，并因此以目标方式调节至期望值。

根据优选的实施方案，不将至少一种或多种酶，优选地本发明的蛋白酶变体作为液体酶制剂引入凝胶相，特别是引入到具有凝胶形成剂的凝胶相。特别优选的是不将液体酶-酶制剂引入到凝胶相中，其中凝胶形成剂选自明胶、黄原胶和/或聚乙烯醇，特别是明胶或聚乙烯醇，特别优选地聚乙烯醇。将液体酶制剂引入到仍被制剂加热的凝胶相中，特别是在制备含PVOH的凝胶相中，是在高温下进行的，这导致液体酶制剂中酶的稳定性显著降低。稳定性的降低意味着与起始制剂相比，酶的活性显著降低。这种稳定性的降低可例如通过测定残余酶活性或通过比较对应酶的纯化性能(特别是根据IHF标准)来测量。特别优选地将酶作为颗粒掺入到凝胶相中。

PVOH特别适用于制备满足上述要求的凝胶相。因此特别优选的是至少一种凝胶相，该至少一种凝胶相是除至少一种酶，特别是至少一种酶颗粒，优选地选自由蛋白酶和/或淀粉酶、PVOH和至少一种多元醇组成的组之外的。特别优选地，该至少一种凝胶相包含至少一种淀粉酶颗粒和/或至少一种蛋白酶颗粒、PVOH和至少一种多元醇。

根据本发明，该至少一种凝胶相优选地包含至少一种酶，优选地至少一种酶颗粒，优选地至少一种淀粉酶颗粒和/或至少一种蛋白酶颗粒，特别是至少一种蛋白酶颗粒、PVOH和/或它们的衍生物，其比例为约4重量％至40重量％，特别是6重量％至30重量％，优选地7重量％至24重量％，特别优选地在8重量％和22重量％之间。显著更低比例的PVOH不会导致稳定凝胶相的形成。这些值在每种情况下基于凝胶相的总重量。

由此制备的这些凝胶相具有特别高的熔点，是尺寸上稳定的(甚至在40℃下)，并且甚至在储存期间也不会改变它们的形状，或仅轻微改变它们的形状。特别地，它们在与颗粒状混合物的成分的直接负相互作用方面也具有较小的反应性。

特别地，PVOH还可毫无困难地产生具有很少或没有水含量的凝胶相。当使用PVOH作为用于该至少一种凝胶相的聚合物时，在110℃至120℃下产生低粘度熔体，其因此可以特别容易地加工；特别地，凝胶相可快速且准确地引入到水溶性涂层中，而不会发生粘附或不准确地计量。此外，这些凝胶相特别好地附着到水溶性涂层上，特别是如果它同样由PVOH产生的话。

这在光学上也是有利的。由于具有PVOH的至少一种凝胶相的快速凝固，凝胶相的进一步加工可以特别快速地进行。此外，所产生的凝胶相的良好溶解度特别有利于清洁剂的总体溶解度。此外，具有如此短的凝固时间的凝胶相是有利的，因为在其上计量加入的至少一种包含颗粒状混合物，特别是粉末的固相不会沉到尚未完全凝固或太软的凝胶中。这导致视觉上令人不悦的洗涤剂部分。

特别地，在根据本发明的具有至少一个固相的多相一次性部分的情况下，重要的是该至少一种凝胶相是尺寸上稳定的，使得在该固相与该凝胶相之间可以发生尽可能少的相互作用。如果该至少一种凝胶相除PVOH之外还包含明胶，则制剂中凝胶相的韧性令人惊讶地增加。

本发明进一步优选地提供了清洁剂，优选地盘碟洗涤剂，特别是自动盘碟洗涤剂，其是除该至少一种酶，优选地该至少一种酶颗粒，至少一种有机溶剂，特别是选自1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甘油、1,1,1-三羟甲基丙烷、三乙二醇、二丙二醇、聚乙二醇和/或它们的混合物之外的。

该至少一种凝胶相优选地包含至少一种多元醇。除产生能够流动的凝胶相之外，该至少一种多元醇还使得可在15分钟或更短，特别是10分钟或更短的短凝固时间内制备尺寸上稳定的不能够流动的凝胶相。用于本发明的目的的多元醇是其中两个、三个或更多个氢原子被OH基团替代的烃。OH基团在每种情况下键合到不同的碳原子。碳原子不具有两个OH基团。这不同于其中烃中仅一个氢原子被OH基团替代的(简单)醇。具有两个OH基团的多元醇被称为链烷二醇，并且具有三个OH基团的多元醇被称为链烷三醇。多元醇因此符合通式[KWj(OH)X]，其中KW表示直链或支链的、饱和或不饱和的、取代或未取代的烃。取代可例如用-SH基团或-NH基团进行。优选地，kW是直链或支链的、饱和或不饱和的、未取代的烃。KW包含至少两个碳原子。多元醇包含2个、3个或更多个OH基团(x＝2、3、4)，仅一个OH基团键合到KW的每个C原子。KW特别优选地包含2个至10个，即2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碳原子。特别可使用x＝2、3或4的多元醇(例如，x＝4的季戊四醇)。优选地，x＝2(链烷二醇)和/或x＝3(链烷三醇)。

特别优选地，该至少一种凝胶相包含至少一种链烷三醇和/或至少一种链烷二醇，特别是至少一种C3至C10链烷三醇和/或至少一种C3至C10链烷二醇，优选地至少一种C3至Cs链烷三醇和/或至少一种C3至Cs链烷二醇，特别是至少一种C3至C6链烷三醇和/或至少一种C3至C5链烷二醇作为多元醇。其优选地包含链烷三醇和链烷二醇作为至少一种多元醇。在一个优选的实施方案中，该至少一种凝胶相因此包含至少一种聚合物，特别是PVOH或具有明胶的PVOH，以及至少一种链烷二醇和至少一种链烷三醇，特别是链烷三醇和链烷二醇。同样优选的是包含至少一种聚合物、PVOH或具有明胶的PVOH以及C3至Cs链烷二醇和C3至Cs链烷三醇的凝胶相。进一步优选的是包含至少一种聚合物，特别是PVOH或具有明胶的PVOH以及C3至Cs链烷二醇和C3至C6链烷三醇的凝胶相。根据本发明，多元醇不包含任何衍生物，诸如其醚、酯等。

已发现，当对应的三醇(链烷三醇)与对应的二醇(链烷二醇)混合时，可实现特别短的凝固时间。此外，所获得的凝胶相是透明的并且具有提供吸引人的可视压痕的光泽表面。

优选地，自动盘碟洗涤组合物在凝胶样相中包含至少一种有机溶剂，其量基于凝胶样相的总重量为30重量％至90重量％，特别是40重量％至85重量％，特别优选地50重量％至80重量％。

在根据本发明的凝胶相中使用的多元醇的量优选地为至少45重量％，特别是55重量％或更多。基于凝胶相的总重量，此处优选的量范围为45重量％至85重量％，特别是50重量％至80重量％。

优选的是C3至C6链烷三醇甘油和/或2-乙基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(也被称为1,1,1-三羟甲基丙烷)和/或2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(TRIS，三羟甲基氨基乙烷)和/或1,3,5-戊三醇。特别优选的是C3至C6链烷三醇甘油和/或2-乙基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(也被称为1,1-三羟甲基丙烷)。C3至C5链烷二醇是例如1,5-戊二醇、3-甲基-1,5-戊二醇、1,4-丁二醇、1,3-丙二醇和/或1,2-丙二醇，优选地1,3-丙二醇和/或1,2-丙二醇。已令人惊奇地发现，二醇的链长，并且特别是OH基团的位置对凝胶相的透明度有影响。二醇的OH基团因此优选地不排列在直接相邻的碳原子上。特别地，在二醇的两个OH基团之间存在三个或四个碳原子，特别优选地3个。

二醇1,3-丙二醇是特别优选的。已令人惊奇地发现，使用包含甘油和1,3-丙二醇和/或1,2-丙二醇，特别是甘油和1,3-丙二醇的混合物获得了特别好的结果。

根据本发明，平均摩尔质量为200g/mol至600g/mol的聚乙二醇优选地另外用于该至少一种凝胶相中。与聚乙烯醇组合使用平均摩尔质量在约200g/mol和约600g/mol之间，优选地在300g/mol和500g/mol之间，特别优选地在350g/mol和450g/mol之间，例如约400g/mol的聚乙二醇(INCI:PEG400)。

合适的聚乙二醇具有300g/mol至500g/mol，特别是350g/mol至450g/mol的平均摩尔质量。

此外，该至少一种凝胶相优选地包含另外的阴离子聚合物，特别是聚羧酸酯。这些可用作助洗剂和/或增稠聚合物。根据本发明，该至少一种凝胶相还可包含具有助洗剂性质的阴离子聚合物或共聚物。这优选地是聚羧酸酯。所使用的聚羧酸酯优选地是共聚聚丙烯酸酯，优选地磺基聚合物，优选地共聚聚磺酸酯，优选地疏水改性的共聚聚磺酸酯。共聚物可具有两种、三种、四种或更多种不同的单体单元。除含有磺酸基团的单体之外，优选的共聚聚磺酸还含有至少一种来自不饱和羧酸组的单体。

蛋白酶

在一个实施方案中，本公开提供了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含一个或多个氨基酸取代，如下文所详述。在一些实施方案中，当与具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶进行比较时，本文提供的变体展示出一种或多种改善的性质，诸如改善的清洁性能，或改善的稳定性，或改善的清洁性能和改善的稳定性两者。本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体可用于制备清洁组合物(例如，自动盘碟洗涤组合物)。此外，本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体还可用于使用此类变体或包含此类枯草杆菌蛋白酶变体的组合物的清洁方法(例如，盘碟洗涤方法)中。

除非本文另外指明，否则本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可通过用于分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质和DNA测序、重组DNA领域以及工业酶使用和开发的多种技术来制备和使用。未定义的术语和缩写应被赋予其在本领域中使用的普通含义。除非本文另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本领域的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。本文提供的任何定义应在本说明书的上下文中作为整体来解释。如本文所用，单数“一个”、“一种”和“该”包括复数，除非上下文清楚地指明并非如此。除非另外指明，否则核酸序列以5'至3'取向从左到右书写；并且氨基酸序列以氨基至羧基取向从左到右书写。本文使用的每一数值范围包括落入此类更宽数值范围内的每一更窄数值范围，如同此类更窄数值范围在本文中明确写出一样。

如本文中结合数值所用，术语“约”是指该数值的+/-0.5的范围，除非该术语在上下文中另外特别定义。例如，短语“约6的pH值”是指5.5至6.5的pH值，除非该pH值另外特别定义。

本文所述的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸取代的命名使用以下项中的一者或多者：位置；位置：氨基酸取代；或起始氨基酸：位置：氨基酸取代。提及“位置”(例如，5、8、17、22等)涵盖可存在于此类位置处的任何起始氨基酸，以及可存在于此类位置处的任何取代。提及“位置：氨基酸取代”(例如，1S/T/G、3G、17T等)涵盖可存在于这种位置处的任何起始氨基酸和可取代这种起始氨基酸的一个或多个氨基酸。提及位置可以若干形式列举，例如，位置003也可被称为位置03或3。提及起始或取代的氨基酸可进一步表示为被斜杠(“/”)分开的若干起始或取代的氨基酸。例如，D275S/K表示位置275被丝氨酸(S)或赖氨酸(K)取代，并且P/S197K表示位置197处的起始氨基酸脯氨酸(P)或丝氨酸(S)被赖氨酸(K)取代。提及X作为一位置中的氨基酸是指所述位置处的任何氨基酸。

给定氨基酸序列中氨基酸残基的位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列对应来编号。即，SEQ ID NO:1的氨基酸序列用作氨基酸残基位置编号的参考序列。例如，使用本文所述的对比算法将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行对比，并且通过参考对应氨基酸残基的数字位置方便地对给定氨基酸序列中与SEQ ID NO:1中的氨基酸残基对比(优选地，最佳对比)的每个氨基酸残基进行编号。诸如例如本文所述的序列对比算法将鉴定当与查询序列(有时也被称为“参考序列”)进行比较时在目标序列中发生插入或缺失的位置。与其他枯草杆菌蛋白酶氨基酸序列的序列对比可使用氨基酸对比来确定，例如，如提交于2018年11月28日的PCT申请号PCT/US2018/062768的图1中所提供的，该申请要求提交于2017年11月29日的名称为“Highly StableSubtilisin Enzymes”的美国临时申请号62/591,976的优先权。

术语“蛋白酶”(“protease”和“proteinase”)是指具有分解蛋白质和肽的能力的酶。蛋白酶具有通过将形成蛋白质的肽或多肽链中的氨基酸连接在一起的肽键水解来进行蛋白水解的能力。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。存在许多熟知的用于测量蛋白水解活性的方法。例如，可通过分析相应的蛋白酶水解合适底物的能力的比较测定来探知蛋白水解活性。用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和天青角蛋白(Keratin Azure)(Sigma-Aldrich K8500)。利用这些底物的比色测定在本领域中是熟知的(参见例如，WO99/34011和US 6,376,450)pNA肽基测定(参见例如，DelMar等人，Anal Biochem，第99卷：第316-320页，1979年)也可用于测定活性酶浓度。该测定测量当酶水解可溶性合成底物(诸如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA))时释放对硝基苯胺的速率。从水解反应产生黄色的速率在分光光度计上在405nm或410nm处测量，并且与活性酶浓度成比例。此外，280纳米(nm)处的吸光度测量可用于测定经纯化蛋白质样品中的总蛋白质浓度。对底物的活性除以蛋白质浓度得到酶比活性。

如本文所用，“芽孢杆菌属”包括本领域的技术人员已知的“芽孢杆菌(Bacillus)”属内的所有物质，包括但不限于：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经认识到，芽孢杆菌属继续发生分类学重组。因此，预期该属包括已被重新分类的物质，包括但不限于这样的生物体：嗜热脂肪芽孢杆菌，其现在被命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(B.stearothermophilus)”，或多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)，其现在是“多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”。抗性内生孢子在胁迫环境条件下的产生被认为是芽孢杆菌(Bacillus)属的限定特征，尽管这一特性也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、无氧芽胞杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽胞杆菌属(Filobacillus)、纤细芽胞杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽胞杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热芽胞杆菌属(Thermobacillus)、尿素芽胞杆菌属(Ureibacillus)和枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)。

“吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶”包括得自或衍生自吉氏芽孢杆菌来源的任何枯草杆菌蛋白酶。在一个实施方案中，本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体可衍生自吉氏芽孢杆菌进化支枯草杆菌蛋白酶，诸如在WO 2015/089447中描述的那些，以及在WO2016/205755中描述的那些。其他吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶包括美国专利申请公开号20090275493及其变体、国际专利申请公开号WO2016/087403及其变体以及美国专利号7,449,187及其变体中描述的那些。在其他实施方案中，吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶包括具有与SEQ ID NO:1或2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的那些多肽。

术语“载体”是指用于将核酸引入或转移到靶细胞或组织中的核酸构建体。载体通常用于将外源DNA引入到细胞或组织中。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如，病毒载体)、粘粒、表达载体、穿梭载体等。载体通常包括复制起点、多克隆位点和选择性标记。将载体插入到靶细胞的过程通常被称为转化。在一些实施方案中，本发明包括包含编码丝氨酸蛋白酶多肽(例如，前体或成熟丝氨酸蛋白酶多肽)的DNA序列的载体，该DNA序列可操作地连接至能够实现DNA序列在合适宿主中的表达以及重组多肽链的折叠和易位的合适前序列(例如，分泌性序列、信号肽序列等)。

如本文在将核酸序列引入到细胞的上下文中所用，术语“引入”是指适用于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。此类引入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、电穿孔、缀合和转导。转化是指细胞的基因改变，这由遗传物质(例如，DNA)的摄入、任选的基因组掺入和表达产生。

术语“表达”是指衍生自本公开的核酸分子的正义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可以指mRNA翻译成多肽。因此，术语“表达”包括涉及“产生多肽”的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、分泌等。

短语“表达盒”或“表达载体”是指重组或合成产生的用于在靶细胞中表达所关注核酸(例如，外源核酸或转基因)的核酸构建体或载体。所关注核酸通常表达所关注蛋白质。表达载体或表达盒通常包含驱动或促进外源核酸表达的启动子核苷酸序列。表达载体或表达盒通常还包括允许特定核酸在靶细胞中转录的其他特定核酸元件。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。一些表达载体具有在宿主细胞或宿主细胞基因组中掺入和表达异源DNA片段的能力。许多原核和真核表达载体可商购获得。从掺入到表达载体中的核酸序列中选择用于表达蛋白质的合适表达载体在本领域的技术人员的知识范围内。

如本文所用，当将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸与另一核酸序列“可操作地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接至核苷酸编码序列。如果定位核糖体结合位点以便促进编码序列的翻译，则其可以可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处进行连接来完成连接。如果此类位点不存在，则可根据常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头。

术语“基因”是指多核苷酸(例如，DNA片段)，其编码多肽并包括编码区之前和之后的区域。在一些情况下，基因包括各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

当用于指细胞时，术语“重组”通常表示该细胞已经通过引入外源核酸序列而被修饰或者该细胞衍生自经如此修饰的细胞。例如，重组细胞可包含在天然(非重组)形式的细胞中未以相同形式发现的基因，或重组细胞可包含已被修饰并重新引入到细胞中的天然基因(在原生形式的细胞中发现)。重组细胞可包含已被修饰但未从细胞中去除核酸的细胞内源核酸；此类修饰包括通过基因置换、位点特异性突变和本领域的普通技术人员已知的相关技术获得的那些修饰。重组DNA技术包括用于在体外产生重组DNA并将重组DNA转移到细胞中的技术，重组DNA可在细胞中表达或增殖，从而产生重组多肽。多核苷酸或核酸的“重组”(“Recombination”和“recombining”)通常是指组装或组合两个或更多个核酸或多核苷酸链或片段以产生新的多核苷酸或核酸。

如果核酸或多核苷酸在其天然状态下或通过本领域技术人员已知的方法操作时能够被转录和/或翻译以产生多肽或其片段，则认为其“编码”多肽。这种核酸的反义链也被认为编码该序列。

术语“宿主菌株”和“宿主细胞”是指包含所关注DNA序列的表达载体的合适宿主。

“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中互换使用。按照IUPAC-IUB生物化学命名联合委员会(JCBN)定义的用于氨基酸的单字母代码和3字母代码在整个公开中使用。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个氨基酸。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一个核苷酸序列编码。

术语“前序列”或“前肽序列”是指信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的氨基酸序列，其对于蛋白酶的正确折叠和分泌是必需的；它们有时被称为分子内伴侣。原序列或前肽序列的切割产生了成熟的活性蛋白酶。细菌丝氨酸蛋白酶通常表达为酶原。经修饰的前肽的示例提供于例如WO 2016/205710中。

术语“信号序列”和“信号肽”是指可参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或直接转运的氨基酸残基序列。信号序列通常位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源或外源的。信号序列通常不存在于成熟蛋白质中。在蛋白质被转运之后，信号序列通常被信号肽酶从蛋白质上切割下来。

术语蛋白质、多肽或肽的“成熟”形式是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或肽的功能形式。

术语蛋白质或肽的“前体”形式是指具有可操作地连接至蛋白质的氨基末端或羰基末端的前序列的蛋白质的成熟形式。前体还可具有可操作地连接至前序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可具有参与翻译后活性的附加的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。

关于多肽的术语“野生型”是指在一个或多个氨基酸位置处不包括人工取代、插入或缺失的天然存在的多肽。相似地，关于多核苷酸的术语“野生型”是指在一个或多个核苷酸处不包括人工取代、插入或缺失的天然存在的多核苷酸。然而，编码野生型多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型多肽或亲本多肽的任何多核苷酸。

关于多肽的术语“亲本”包括提及天然存在的或野生型多肽或其中已经在一个或多个氨基酸位置处进行了人工取代、插入或缺失的天然存在的多肽。关于多肽的术语“亲本”还包括具有蛋白酶活性的任何多肽，其作为起始多肽用于改变，诸如取代、添加和/或缺失，以产生与起始多肽相比具有一个或多个改变的变体。即，亲本或参考多肽不限于天然存在的野生型多肽，并且涵盖任何野生型、亲本或参考多肽。相似地，关于多核苷酸的术语“亲本”可指天然存在的多核苷酸或在一个或多个核苷酸处包括人工取代、插入或缺失的多核苷酸。关于多核苷酸的术语“亲本”还包括编码具有蛋白酶活性的多肽的任何多核苷酸，该多肽作为起始多核苷酸用于改变以产生与起始多核苷酸相比具有修饰(诸如取代、添加和/或缺失)的变体蛋白酶。即，编码野生型、亲本或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本或参考多肽的任何多核苷酸。在一些实施方案中，亲本多肽包括吉氏芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶。在一些实施方案中，本文的亲本多肽包含具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列的多肽。

术语“天然存在的”是指例如在自然界中发现的序列和包含在其中的残基(例如，多肽序列和包含在其中的氨基酸或者核苷酸序列和包含在其中的核苷酸)。相反地，术语“非天然存在的”是指例如未在自然界中发现的序列和包含在其中的残基(例如，多肽序列和包含在其中的氨基酸或者核苷酸序列和包含在其中的核酸)。

如本文关于氨基酸残基位置所用，“对应于”(“corresponding to”或“corresponds to”或“corresponds”)是指蛋白质或肽中所枚举位置处的氨基酸残基，或与蛋白质或肽中所枚举残基类似、同源或等效的氨基酸残基。如本文所用，“对应的区域”通常是指相关蛋白质或参考蛋白质中的类似位置。

术语“衍生自”和“得自”不仅指由所考虑的微生物的菌株产生或可产生的蛋白质，还指由从这种菌株分离的DNA序列编码并在含有这种DNA序列的宿主生物中产生的蛋白质。另外，该术语是指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码的蛋白质，并且其具有所考虑的蛋白质的鉴定特性。举例来说，“衍生自芽孢杆菌的蛋白酶”是指由芽孢杆菌天然产生的具有蛋白水解活性的那些酶，以及类似由芽孢杆菌来源产生但通过使用基因工程技术由用编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的其他宿主细胞产生的那些丝氨酸蛋白酶。

在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”是指两个序列中的核苷酸或氨基酸在进行对比以获得最大对应性时是相同的，如使用下文所述并且本领域中已知的序列比较或分析算法所测量的。

短语“％同一性”或“百分比同一性”或“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可使用本领域中已知的标准技术来测定。可通过对比序列以直接比较序列信息，例如通过使用诸如BLAST、MUSCLE或CLUSTAL的程序来确定所关注序列所共有的氨基酸百分比同一性。BLAST算法描述于例如以下中：Altschul等人，J Mol Biol，第215卷：第403-410页，1990年；以及Karlin等人，Proc Natl Acad Sci USA，第90卷：第5873-5787页，1993年。氨基酸序列百分比同一性值(％)通过匹配的相同残基的数量除以“参考”序列的残基总数来确定，包括由用于最佳/最大对比的程序所产生的任何空位。BLAST算法将“参考”序列称为“查询”序列。

如本文所用，“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构上具有明显相似度的蛋白质。蛋白质同源性可以指当对比蛋白质时线性氨基酸序列的相似度。同源性可通过氨基酸序列对比来确定，例如使用诸如BLAST、MUSCLE或CLUSTAL的程序。可使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST进行蛋白质序列的同源搜索，阈值(E值截止值)为0.001。(Altschul等人，“Gapped BLAST and PSI BLAST anew generation of proteindatabase search programs”，Nucleic Acids Res，Set1，第25卷第17期：第3389-3402页，1997年)。BLAST程序使用若干搜索参数，其中大多数被设定为默认值。NCBI BLAST算法发现在生物学相似度方面最相关的序列，但不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人，Nucleic Acids Res，第25卷：第3389-3402页，1997年；以及Schaffer等人，NucleicAcids Res，第29卷：第2994-3005页，2001年)。用于核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字词阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；并且空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；并且空位延伸＝1。使用该信息，可将蛋白质序列分组和/或从其建立系统发育树。可将氨基酸序列输入到诸如Vector NTI Advancesuite的程序中，并且可使用邻接(NJ)法创建导引树(Saitou和Nei，Mol Biol Evol，第4卷：第406-425页，1987年)。可使用针对序列距离的Kimura校正并忽略具有空位的位置来计算树构造。诸如AlignX的程序可在系统发育树上显示的分子名称之后的括号中显示所计算的距离值。

理解分子之间的同源性可揭示分子的进化历史以及关于它们的功能的信息；如果新测序的蛋白质与已经表征的蛋白质同源，则存在新蛋白质的生物化学功能的强烈指示。如果两个分子衍生自共同的祖先，则称它们是同源的。同源分子或同系物可分成两类，旁系同源物和直向同源物。旁系同源物是存在于一种物质中的同源物。旁系同源物通常在它们的详细生物化学功能方面不同。直向同源物是存在于不同物质中并且具有非常相似或相同功能的同源物。蛋白质超级族是可推断出共同祖先的最大蛋白质分组(进化支)。通常该共同祖先基于序列对比和机制相似度。超级族通常含有若干蛋白质家族，其在家族内显示序列相似度。术语“蛋白质大家族”通常用于基于MEROPS蛋白酶分类系统的蛋白酶超级族。如本文所用，术语“枯草杆菌蛋白酶”包括如以下文献中所述的S8丝氨酸蛋白酶家族的任何成员：MEROPS-The Peptidase Data base(Rawlings,N.D.等人，2016年，Twenty years ofthe MEROPS database of proteolytic enzymes,their substrates and inhibitors，Nucleic Acids Res，第44卷：D343-D350)。

LUSTAL W算法是序列对比算法的算法的另一个示例(参见Thompson等人，NucleicAcids Res，第22卷：第4673-4680页，1994年)。CLUSTAL W算法的默认参数包括：空位开放罚分＝10.0；空位延伸罚分＝0.05；蛋白质权重矩阵＝BLOSUM系列；DNA权重矩阵＝IUB；延迟差异序列％＝40；空位分离距离＝8；DNA转换权重＝0.50；列表亲水性残基＝GPSNDQEKR；使用负矩阵＝关；切换残基特异性罚分＝开；切换亲水性罚分＝开；并且切换端空位分离罚分＝关。在CLUSTAL算法中，包括在任一末端处发生的缺失。例如，在500个氨基酸的多肽的任一末端处(或在多肽内)具有五个氨基酸缺失的变体相对于“参考”多肽将具有99％的序列百分比同一性(495/500相同残基×100)。这种变体将被与多肽具有“至少99％序列同一性”的变体所涵盖。

当与其他组分(包括但不限于，例如，其他蛋白质、核酸、细胞等)至少部分或完全分离时，核酸或多核苷酸是“分离的”。相似地，当与其他组分(包括但不限于，例如，其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，多肽、蛋白质或肽是“分离的”。按摩尔计，分离的物质比组合物中的其他物质更丰富。例如，分离的物质可占存在的所有大分子物质的至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％(按摩尔计)。优选地，将所关注物质纯化至基本均质性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物物质)。可使用本领域中熟知的多种技术来测定纯度和均质性，诸如分别对核酸或蛋白质样品进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后进行染色观察。如果需要，可使用高分辨率技术，诸如高效液相色谱法(HPLC)或类似方法来纯化该物质。

应用于核酸或多肽的术语“经纯化的”通常表示如通过本领域中熟知的分析技术所测定的，基本上不含其他组分的核酸或多肽(例如，经纯化的多肽或多核苷酸形成电泳凝胶中的离散带、色谱洗脱液和/或经受密度梯度离心法的培养基)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“经纯化的”。经纯化的核酸或多肽为至少约50％纯，通常至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％纯或更大的纯度(例如，按摩尔计的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后分子的浓度存在实质增加时，组合物富含该分子。术语“富含”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。

术语“清洁活性”是指在蛋白水解、水解、清洁或本公开的其他过程期间普遍存在的条件下，由丝氨酸蛋白酶多肽、变体或参考枯草杆菌蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶或参考枯草杆菌蛋白酶的清洁性能可通过使用用于清洁物品或表面上的一种或多种酶敏感污渍(例如，由食品、草、血液、油墨、奶、油和/或卵蛋白产生的污渍)的各种测定来确定。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参考枯草杆菌蛋白酶的清洁性能可通过使物品或表面上的污渍经受标准洗涤条件并通过使用各种色谱、分光光度或其他定量方法评估污渍被去除的程度来确定。示例性清洁测定和方法是本领域中已知的，并且包括但不限于WO99/34011和US 6,605,458中描述的那些，以及下面提供的实施例中包括的那些清洁测定和方法。

本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参考枯草杆菌蛋白酶的术语“有效量”是指在特定清洁组合物中实现期望水平的酶活性的蛋白酶的量。此类有效量容易地由本领域的普通技术人员进行探知，并且基于许多因素，诸如所用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成，以及需要液体还是干燥(例如，颗粒状、片剂、条状)的组合物等。

本文公开了一种或多种可用于清洁应用和清洁方法以及多种工业应用的枯草杆菌蛋白酶变体。本文还公开了一种或多种分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在清洁应用中是有用的，并且可掺入到在清洁对其有需要的物品或表面的方法中是有用的清洁组合物中。

蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶变体，该枯草杆菌蛋白酶变体相对于SEQ ID NO:1包含：

(i)位置122处的突变；和

(ii)位置126、127、128、211和212处的一个或多个突变，

并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％同一性。

优选地，该变体包含：

(i)位置M122L处的突变；和

(ii)位置126、127、128、211和212处的一个或多个突变。

优选地，该变体包含位置126、127、128、211和212处的两个或更多个突变，优选地包含位置126、127、128、211和212处的三个或更多个突变，优选地包含位置126、127、128、211和212处的四个或更多个突变，优选地包含位置126、127、128、211和212处的五个突变。

优选地，该变体包含选自X126A、X127E、X128G、X211Q和X212Q的一个或多个突变，优选地选自X126A、X127E、X128G、X211Q和X212Q的两个或更多个突变，优选地选自X126A、X127E、X128G、X211Q和X212Q的三个或更多个突变，优选地选自X126A、X127E、X128G、X211Q和X212Q的四个或更多个突变，优选地选自X126A、X127E、X128G、X211Q和X212Q的五个突变。

优选地，该变体包含突变X122L、X126A、X127E、X128G、X211Q和X212Q。

优选地，该变体包含选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的一个或多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的两个或更多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的三个或更多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的四个或更多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的五个突变。

优选地，该变体包含突变M122L、S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q。

在另一个实施方案中，提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其中该变体包含以下取代：i)选自由S039E、S099R、S126A、D127E和F128G组成的组的至少一个、两个、三个、四个或五个取代，和ii)选自由N74D、T114L、M122L、M122I、N198A、M211Q、N212Q和N242D组成的组的一个或多个附加的取代，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列对应来编号，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

在另一个实施方案中，提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其中该变体包含氨基酸取代X039E-X099R-X126A-X127E-X128G，并且还包含选自由74、114、122、198、211、212和242组成的组的一个、两个、三个或更多个位置处的一个或多个附加的取代，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列对应来编号。在本文的一些实施方案中，提及取代X039E、X099R、X126A、X127E和X128G包括S039E、S099R、S126A、D127E和F128G。

在另一个实施方案中，提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其中该变体包含选自一个或多个取代(选自X039E、X099R、X126A、X127E和X128G)的氨基酸取代，并且还包含选自由以下项组成的组的一个或多个附加的取代：X74D、X114L、X122L、X122I、X198A、X211Q、X212Q和X242D，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列对应来编号。

在另一个实施方案中，提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其中该变体包含选自一个或多个取代(选自S039E、S099R、S126A、D127E和F128G)的氨基酸取代，并且还包含选自由N74D、T114L、M122L、M122I、N198A、M211Q、N212Q和N242D组成的组的一个或多个附加的取代，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列对应来编号。

在另一个实施方案中，提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其中该变体包含i)选自由S039E、N74D、S099R、N242D组成的组的两个或更多个氨基酸取代，和ii)选自由T114L、M122L、M122I、S126A、F128G、N198A、M211Q、N212Q组成的组的一个或多个附加的取代，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列对应来编号。

在另一个实施方案中，提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其中该变体包含选自由以下项组成的组的一组取代：S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211Q-N242D、S039E-N074D-S099R-M122L-S126A-D127E-F128G-N198A-M211Q-N212Q、S039E-N074D-S099R-M122L-S126A-D127E-F128G-N198A-M211Q-N212Q-N242D、S039E-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G-M211Q-N212Q-N242D、S039E-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G-N198A-M211Q-N212Q-N242D、S039E-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G-N198G、S039E-N074D-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-S099R-T114L-M122L-S126A-D127E-F128G-N198A-M211Q-N212Q、S039E-N074D-S099R-T114L-M122L-S126A-D127E-F128G-N198A-M211Q-N212Q-N242D、S039E-N074D-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-M211E、S039E-N074D-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-M211E-N242D、S039E-N074D-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-M211Q、S039E-N074D-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-M211Q-N212Q-N242D、S039E-N074D-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-N198A-M211Q-N212Q、S039E-N074D-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-N198A-M211Q-N212Q-N242D、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-N198G-M211Q-N212Q、S039E-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-M211E、S039E-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-M211E-N212Q、S039E-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-M211E-N242D、S039E-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-M211Q、S039E-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-M211Q-N212Q-N242D、S039E-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-M211Q-N242D和S039E-S099R-T114L-S126A-D127E-F128G-N242D，其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列对应来编号。

另一个实施方案涉及本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，条件是一个或多个取代是非天然存在的。更进一步的实施方案涉及本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体(i)是吉氏芽孢杆菌BG46枯草杆菌蛋白酶；(ii)是分离的；(iii)具有蛋白水解活性；或(iv)包含(i)至(iii)的组合。另一个实施方案涉及本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体衍生自亲本或参考多肽，该亲本或参考多肽具有：(i)与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性；或(ii)与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的100％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，亲本包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。更进一步的实施方案涉及本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含氨基酸序列，该氨基酸序列具有：(i)与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；(ii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；(iii)与SEQID NO:1或2的氨基酸序列的96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，本文提供的枯草杆菌蛋白酶亲本或变体分子还包含选自以下项的至少一个、两个、三个或更多个附加的取代：X012E/L/V、X021V、X025R、X037E、X039T、X041F、X043V、X044P、X060D、X078D、X079L、X084A、X087E、X097D、X099E、X101G、X012L、X107E、X115D、X117I、X118N、X122L、X127P、X142G、X145S、X149S、X154D、X156A、X160S、X167D、X174A、X175N、X176E、X177E/I/V、X185E、X188A、X200E、X205D、X208N、X209N、X211L/N/S、X212D/H/N、X222S、X228I、X230E/H、X236D、X247N、X250D和X253D/P。可与本文提供的变体组合的此类一个、两个、三个或更多个取代的组合的示例包括但不限于X253D-X256E、X025R-X117I-X118N、X044P-X175N-X208N-X230H、X041F-X078D-X084A、X101G-X174A、X021V-X177I、X021V-X142G-X188A、X021V-X122L-X222S、X012L-X021V-X122L-X222S、X021V-X122L-X253D、X021V-X177V-X228I、X021V-X039T-X122L-X177E、X021V-X079L-X087E-X209N-X222S、X021V-X122L-X222S-X247N、X021V-X122L、X039E-X074D-X087E、X039E-X074D-X087E-X253D、X021V-X039E-X074D-X087E-X253D、X039E-X074D-X087E-X122L-X253D、X021V-X039E-X074D-X087E-X122L-X253D、X097D-X099E、X122L-X145S-X156A、X211N-X212D、X211L-X212D、X127P-X211L-X212D和X012L-X122L-X222S。

本公开包括在表面暴露的氨基酸处具有一个或多个修饰的枯草杆菌蛋白酶变体。酶变体中的表面改性可通过具有洗涤性能的最低性能指数、酶在洗涤剂组合物中的稳定性和酶的热稳定性，同时具有与亲本枯草杆菌蛋白酶相比改善的这些特性中的至少一种而用于洗涤剂组合物中。在一些实施方案中，表面改性改变了该位置处氨基酸的疏水性和/或电荷。疏水性可使用本领域中已知的技术来测定，诸如White和Wimley(White,S.H.和Wimley,W.C，1999年，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，第28卷：第319-365页。如本文所用，“表面性质”可用于指静电荷，以及蛋白质表面所表现出的诸如疏水性和亲水性的性质。

在甚至更进一步的实施方案中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在与参考或亲本枯草杆菌蛋白酶进行比较时具有一种或多种改善的性质；其中该改善的性质选自在洗涤剂中改善的清洁性能、改善的稳定性；以及它们的组合。

在氧化、螯合剂、变性剂、表面活性剂、热和/或pH稳定的蛋白酶的上下文中，术语“增强的稳定性”或“改善的稳定性”是指与参考蛋白酶例如野生型蛋白酶或亲本蛋白酶相比，随时间推移保持更高的蛋白水解活性。自溶已被确认为液体洗涤剂中枯草杆菌蛋白酶活性损失的一种模式。(Stoner等人，2004年，Protease autolysis in heavy-duty liquiddetergent formulations:effects of thermodynamic stabilizers and proteaseinhibitors，Enzyme and Microbial Technology，第34卷：第114-125页)。

关于蛋白酶变体的术语“热稳定的(‘thermally stable’和‘thermostable’)”和“热稳定性”是指在蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间普遍存在的条件(或“应激条件”)下暴露于改变的温度给定时间段之后，与亲本或参考蛋白酶相比保留更大量的残余活性的蛋白酶。残余活性是与样品的初始活性相比在测试之后剩余的活性的量，并且可以百分比报告，例如％剩余活性。“改变的温度”涵盖升高或降低的温度。在一些实施方案中，本文提供的变体蛋白酶在暴露于40℃至80℃的温度给定时间段之后保留至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％蛋白水解活性，该给定时间段例如至少约5分钟、至少约20分钟、至少约60分钟、约90分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟、约360分钟、约420分钟、约480分钟、约540分钟、约600分钟、约660分钟、约720分钟、约780分钟、约840分钟、约900分钟、约960分钟、约1020分钟、约1080分钟、约1140分钟或约1200分钟。

本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体可用于产生各种组合物，诸如酶组合物和清洁或洗涤剂组合物。酶组合物包含如本文所提供的枯草杆菌蛋白酶变体。酶组合物可以是任何形式，诸如颗粒、液体制剂或酶浆。

酶颗粒可通过例如旋转雾化、湿法制粒、干法制粒、喷雾干燥、圆盘制粒、挤出、锅包衣、滚圆、转鼓制粒、流化床附聚、高剪切制粒、流化床喷涂、结晶、沉淀、乳液凝胶化、旋转圆盘雾化和其他浇铸方法以及造粒方法来制备。颗粒的芯可以是颗粒本身或分层颗粒的内核。

芯可包含一种或多种水溶性或分散性试剂，包括但不限于硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵、柠檬酸、糖(例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、颗粒状蔗糖、麦芽糖糊精和果糖)、增塑剂(例如，多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二甲酯)、纤维材料(例如，纤维素和纤维素衍生物诸如羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、磷酸盐、钙、蛋白酶抑制剂以及它们的组合。合适的分散性试剂包括但不限于粘土、蔗糖小丸(糖和淀粉的组合；例如，淀粉-蔗糖小丸-ASNP)、滑石、硅酸盐、羧甲基纤维素、淀粉以及它们的组合。

在一些实施方案中，芯主要包含硫酸钠。在一些实施方案中，芯基本上由硫酸钠组成。在具体实施方案中，芯仅由硫酸钠组成。

在一些实施方案中，芯包含如本文所提供的枯草杆菌蛋白酶变体。在其他实施方案中，除蛋白酶之外，芯还包含一种或多种酶。在其他实施方案中，芯是惰性的并且不包含酶。

在一些实施方案中，芯是酶粉末，包括含有酶的UFC。酶粉末可被喷雾干燥，并且可任选地与本文列出的水溶性或分散性试剂中的任一者混合。酶可以是或可包括待稳定的蛋白酶，在这种情况下，酶粉末还应包括稳定剂。

在一些实施方案中，芯被至少一个涂层涂覆。在具体实施方案中，芯被至少两个涂层涂覆。在另一个具体实施方案中，芯被至少三个涂层涂覆。用于涂层中的材料可适用于清洁组合物和/或洗涤剂组合物中(参见例如，US20100124586、WO9932595和US5324649)。

在一些实施方案中，涂层包含以下材料中的一种或多种：无机盐(例如，硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)、柠檬酸、糖(例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖)、增塑剂(例如，多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二甲酯)、纤维材料(例如，纤维素和纤维素衍生物诸如羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、粘土、蔗糖小丸(糖和淀粉的组合)、硅酸盐、羧甲基纤维素、磷酸盐、淀粉(例如，玉米淀粉)、脂肪、油(例如，菜籽油和石蜡油)、脂质、烯类聚合物、乙烯共聚物、聚乙烯醇(PVA)、增塑剂(例如，多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯和水)、抗团聚剂(例如，滑石、粘土、无定形二氧化硅和二氧化钛)、消泡剂(诸如FOAMBLAST和EROL)和滑石。US20100124586、WO9932595和US5324649详述了用于涂层的合适组分。

在一些实施方案中，涂层包含糖(例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、颗粒状蔗糖、麦芽糖糊精和果糖)。在一些实施方案中，涂层包含聚合物诸如聚乙烯醇(PVA)。适合掺入到多层颗粒的涂层中的PVA包括具有低至高粘度的部分水解、完全水解和中度水解的PVA。在一些实施方案中，涂层包含无机盐，诸如硫酸钠。

在一些实施方案中，至少一个涂层是酶涂层。在一些实施方案中，芯被至少两个酶层涂覆。在另一个实施方案中，芯被至少三个或更多个酶层涂覆。

在一些实施方案中，酶是如本文所提供的枯草杆菌蛋白酶变体与一种或多种附加的酶的组合，该一种或多种附加的酶选自由以下项组成的组：酰基转移酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、分散酶、内切葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、氨基己糖苷酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪分解酶、脂氧合酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、PET酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、另外的蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶和木糖苷酶；以及它们的组合或混合物。通常，至少一个酶涂层包含至少一种蛋白酶。

上述酶列表仅是示例，并不意味着是排他性的。任何酶都可用于本文所述的颗粒中，包括细菌、真菌、酵母来源的野生型、重组和变体酶，以及酸性、中性或碱性酶。

另一个实施方案涉及一种清洁表面的方法，其中该方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的如本文所提供的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或如本文所提供的含有一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物接触。在一些实施方案中，需要清洁的表面或物品在表面上包含蛋白质性污渍。在一些实施方案中，需要清洁的表面或物品包括蛋白质性污渍或法式烤布蕾(crème )污渍，或BMI污渍或蛋污渍或烤芝士污渍。术语“污渍”包括物品的表面上的任何类型的垢，诸如硬表面物品(例如，盘碟)或纺织物。在一些实施方案中，污渍是蛋白质性污渍。如本文所用，“蛋白质性污渍”是含有蛋白质的污渍或垢。

另一个实施方案涉及一种清洁蛋白质性污渍的方法，该方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的如本文所提供的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或如本文所提供的含有一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物接触。

另一个实施方案涉及一种清洁法式烤布蕾污渍的方法，该方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的如本文所提供的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或如本文所提供的含有一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物接触。

另一个实施方案涉及一种清洁蛋污渍或蛋黄污渍的方法，该方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的如本文所提供的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或含有一种或多种此类枯草杆菌蛋白酶变体的组合物接触。

另一个实施方案涉及一种清洁烤芝士污渍的方法，该方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的如本文所提供的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或含有一种或多种此类枯草杆菌蛋白酶变体的组合物接触。

另一个实施方案涉及一种清洁BMI污渍的方法，该方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的如本文所提供的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或如含有一种或多种此类枯草杆菌蛋白酶变体的组合物接触。

在更进一步的实施方案中，本文所述的方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2进行比较时，本文所述的清洁法式烤布蕾污渍的方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有≥1.1的法式烤布蕾污渍清洁PI。在另一个实施方案中，在与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2进行比较时，本文所述的清洁法式烤布蕾污渍的方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有≥1.1的法式烤布蕾污渍清洁PI，其中所述变体的法式烤布蕾污渍清洁性能根据实施例2中所述的法式烤布蕾测定来测量。另一个实施方案涉及本文所述的清洁法式烤布蕾污渍的方法，条件是所述方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶包含一个或多个非天然存在的取代。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2进行比较时，本文所述的清洁烤芝士污渍的方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有≥1.1的烤芝士污渍清洁PI。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2进行比较时，本文所述的清洁烤芝士污渍的方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有≥1.1的烤芝士污渍清洁PI，其中变体的烤芝士污渍清洁性能根据实施例2中所述的烤芝士测定来测量。另一个实施方案涉及本文所述的清洁烤芝士污渍的方法，条件是所述方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶包含一个或多个非天然存在的取代。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2进行比较时，本文所述的清洁蛋黄污渍的方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有≥1.1的蛋黄污渍清洁PI。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2进行比较时，本文所述的清洁蛋黄污渍的方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有≥1.1的蛋黄污渍清洁PI，其中变体的蛋黄污渍清洁性能根据实施例2中所述的蛋黄测定来测量。另一个实施方案涉及本文所述的清洁蛋黄污渍的方法，条件是所述方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶包含一个或多个非天然存在的取代。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2进行比较时，本文所述的清洁BMI污渍的方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有≥1.1的BMI污渍清洁PI。在另一个实施方案中，在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2进行比较时，本文所述的清洁BMI污渍的方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有≥1.1的BMI污渍清洁PI，其中变体的BMI污渍清洁性能根据实施例2中所述的BMI测定来测量。另一个实施方案涉及本文所述的清洁BMI污渍的方法，条件是所述方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶包含一个或多个非天然存在的取代。在另一个实施方案中，本文所述的方法中使用的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体：(i)是分离的；(ii)具有蛋白水解活性；或(iii)包含(i)和(ii)的组合。

在另一个实施方案中，本文提供的变体包含一种或多种变体，该一种或多种变体具有选自由表5中列出的那些组成的组的氨基酸取代，与具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的亲本枯草杆菌蛋白酶相比，在清洁测定(包括衣物洗涤和盘碟测定，诸如BMI、蛋、法式烤布蕾和/或烤芝士测定)中的一者或多者中具有≥1.1的PI，或者在EDTA稳定性测定中具有比亲本或参考枯草杆菌蛋白酶更高的残余活性。

本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可受到各种改变，诸如一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代(保守的或非保守的)，包括此类改变基本上不改变变体的酶活性的情况。相似地，本发明的核酸也可受到各种改变，诸如一个或多个密码子中一个或多个核苷酸的一个或多个取代，使得特定密码子编码相同或不同的氨基酸，从而导致沉默变型(例如，当编码的氨基酸不被核苷酸突变改变时)或非沉默变型；序列中一个或多个核苷酸(或密码子)的一个或多个缺失；序列中一个或多个核苷酸(或密码子)的一个或多个添加或插入；和/或序列中的一个或多个核苷酸(或密码子)的切割或一个或多个截短。与由原始核酸序列编码的多肽酶相比，核酸序列中的许多此类改变可能基本上不改变所得编码的多肽酶的酶活性。本文所述的核酸序列还可被修饰以包括一个或多个密码子，该一个或多个密码子在表达系统(例如，细菌表达系统)中提供最佳表达，而如果需要，所述一个或多个密码子仍然编码相同的氨基酸。

本文描述了一种或多种分离的、非天然存在的或重组的多核苷酸，该多核苷酸包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或重组多肽或其活性片段的核酸序列。本文所述的一种或多种核酸序列可用于重组产生(例如，表达)本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，通常通过表达包含编码本文所述的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或其片段的序列的质粒表达载体。一个实施方案提供了编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中该变体为具有蛋白水解活性的成熟形式。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与同源前肽序列重组表达。在其他实施方案中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与异源前肽序列(例如，来自迟缓芽孢杆菌(B.lentus)的前肽序列(SEQ ID NO:5))重组表达。

可通过使用任何合适的合成、操纵和/或分离技术或它们的组合来产生本文所述的一种或多种核酸序列。例如，本文所述的一种或多种多核苷酸可使用标准核酸合成技术产生，诸如本领域的技术人员熟知的固相合成技术。在此类技术中，通常合成多达50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(例如，通过酶促或化学连接方法)以形成基本上任何期望的连续核酸序列。本文所述的该一种或多种多核苷酸的合成也可通过本领域中已知的任何合适的方法来促进，包括但不限于使用经典亚磷酰胺方法的化学合成(参见例如，Beaucage等人，Tetrahedron Letters，第22卷：第1859-1869页，1981年)，或描述于Matthes等人，EMBO J.，第3卷：第801-805页，1984年中的方法，如通常在自动化合成方法中实践的。本文所述的一种或多种多核苷酸也可通过使用自动DNA合成仪来产生。定制的核酸可从多种商业来源订购(例如，ATUM(DNA 2.0)，Newark，CA，USA；Life Tech(GeneArt)，Carlsbad，CA，USA；GenScript，Ontario，Canada；Base Clear B.V.，Leiden，Netherlands；IntegratedDNA Technologies，Skokie，IL，USA；Ginkgo Bioworks(Gen9)，Boston，MA，USA；和TwistBioscience，San Francisco，CA，USA)。用于合成核酸的其他技术和相关原理描述于例如Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.，第53卷：第323页，1984年，以及Itakura等人，Science，第198卷：第1056页，1984年。

可用于修饰核酸的重组DNA技术在本领域中是熟知的，诸如例如限制性内切核酸酶消化、连接、逆转录和cDNA产生以及聚合酶链反应(例如，PCR)。还可通过使用一种或多种寡核苷酸探针筛选cDNA文库来获得本文所述的一种或多种多核苷酸，该寡核苷酸探针可杂交或PCR扩增编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或其重组多肽或活性片段的多核苷酸。用于筛选和分离cDNA克隆的方法和PCR扩增方法是本领域的技术人员熟知的，并且描述于本领域的技术人员已知的标准参考文献中。本文所述的一种或多种多核苷酸可通过改变天然存在的多核苷酸主链(例如，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参考枯草杆菌蛋白酶的多核苷酸主链)获得，该改变通过例如已知的诱变方法(例如，定点诱变、位点饱和诱变和体外重组)进行。本领域中已知适用于产生编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的本文所述的经修饰的多核苷酸的多种方法，包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化，以及各种其他重组方法。

另一个实施方案涉及一种或多种载体，该一种或多种载体包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体(例如，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸)；表达载体或表达盒，这些表达载体或表达盒包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸序列；分离的、基本上纯的或重组的DNA构建体，该分离的、基本上纯的或重组的DNA构建体包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸序列；分离的或重组的细胞，这些分离的或重组的细胞包含本文所述的一种或多种多核苷酸序列；和组合物，这些组合物包含一种或多种这种载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或它们的任何组合或混合物。

一些实施方案涉及包含本文所述的一种或多种载体(例如，表达载体或DNA构建体)的一种或多种重组细胞，该一种或多种载体包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸序列。用此类至少一种载体转化或转染一些此类重组细胞，尽管其他方法是可用的并且是本领域中已知的。此类细胞通常被称为宿主细胞。一些此类细胞包括细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌细胞，诸如枯草芽孢杆菌细胞。其他实施方案涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。

在一些实施方案中，本文所述的一种或多种载体是表达载体或表达盒，其包含可操作地连接至有效基因表达所需的一个或多个附加的核酸片段的本文所述的一个或多个多核苷酸序列(例如，可操作地连接至本文所述的一个或多个多核苷酸序列的启动子)。载体可包括转录终止子和/或选择基因(例如，抗生素抗性基因)，其使得能够通过在含抗微生物剂的培养基中生长来连续培养维持质粒感染的宿主细胞。

表达载体可衍生自质粒或病毒DNA，或者在另选的实施方案中，含有两者的元件。示例性载体包括但不限于pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood和Cutting[编辑]，第3章，Molecular Biological Methods for Bacillus，John Wiley&Sons，1990年；用于枯草芽孢杆菌的合适的复制质粒包括在第92页中列出的那些)。(还可参见Perego，“Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis”；Sonenshein等人[编辑]；“Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry,Physiology and Molecular Genetics”，American Society forMicrobiology，Washington,D.C.，1993年，第615-624页)；和p2JM103BBI)。

为了在细胞中表达和产生所关注蛋白质(例如，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体)，在适用于表达变体的条件下，将一种或多种表达载体转化到细胞中，该一种或多种表达载体包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸的一个或多个拷贝，并且在一些情况下包含多个拷贝。在一些实施方案中，将编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列(以及载体中包含的其他序列)整合进宿主细胞的基因组，而在其他实施方案中，包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列的质粒载体在细胞内保持为自主染色体外元件。一些实施方案提供了整合进宿主细胞基因组的染色体外核酸元件以及引入的核苷酸序列两者。本文所述的载体可用于产生本文所述的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施方案中，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体存在于整合载体上，该整合载体使得能够将编码变体的多核苷酸整合并任选地扩增进宿主染色体。用于整合的位点的示例为本领域的技术人员所熟知的。在一些实施方案中，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸的转录通过作为亲本枯草杆菌蛋白酶的野生型启动子的启动子来实现。在一些其他实施方案中，启动子对于本文所述的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体是异源的，但在宿主细胞中是功能性的。用于细菌宿主细胞的示例性启动子包括但不限于amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子；嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因的启动子；解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因；枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因；克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因；短小芽孢杆菌木糖苷酶基因；苏云金芽孢杆菌cryIIIA；和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因。附加的启动子包括但不限于A4启动子以及噬菌体λPR或PL启动子和大肠杆菌(E.coli)lac、trp或tac启动子。

本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中产生。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可在革兰氏阳性细菌中产生。在一些实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌、链霉菌(Streptomyces spp.)、埃希氏菌(Escherichia spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)、木霉(Trichoderma spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、棒状杆菌(Corynebacterium spp.)、酵母(Saccharomyces spp.)或毕赤酵母(Pichia spp.)。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体由芽孢杆菌宿主细胞产生。芽孢杆菌宿主细胞的示例可用于产生本文所述的该一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，包括但不限于地衣芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(B.pumilis)、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施方案中，枯草芽孢杆菌宿主细胞用于产生本文所述的变体。USPN 5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述了可用于产生本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的各种芽孢杆菌宿主菌株，但也可使用其他合适的菌株。

可用于产生本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的若干细菌菌株包括非重组(即，野生型)芽孢杆菌菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施方案中，宿主菌株是重组菌株，其中编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸已被引入到宿主中。在一些实施方案中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，特别是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110和PEP 211菌株(参见例如，Hoch等人，Genetics，第73卷：第215-228页，1973年)；还可参见US4,450,235；US 4,302,544和EP 0134048)。使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞在本领域中是熟知的(参见例如，Palva等人，Gene，第19卷：第81-87页，1982年)；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.，第165卷：第796-804页，1986年；以及Wang等人，Gene，第69卷：第39-47页，1988年)。

在一些实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞是在以下基因中的至少一者中包含突变或缺失的芽孢杆菌：degU、degS、degR和degQ。在一些实施方案中，突变位于degU基因中，并且在一些实施方案中，突变是degU(Hy)32(参见例如，Msadek等人，J.Bacteriol.，第172卷：第824-834页，1990年；以及Olmos等人，Mol.Gen.Genet.，第253卷：第562-567页，1997年)。在一些实施方案中，芽孢杆菌宿主包含scoC4中的突变或缺失(参见例如，Caldwell等人，J.Bacteriol.，第183卷：第7329-7340页，2001年)；spoIIE(参见例如，Arigoni等人，Mol.Microbiol.，第31卷：第1407-1415页，1999年)；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如，Perego等人，Mol.Microbiol.，第5卷：第173-185页，1991年)。实际上，预期在opp操纵子中引起与oppA基因中的突变相同的表型的任何突变将用于本文所述的改变的芽孢杆菌菌株的一些实施方案中。在一些实施方案中，这些突变单独发生，而在其他实施方案中，存在突变的组合。在一些实施方案中，可用于产生本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的改变的芽孢杆菌宿主细胞菌株是已经在上述基因中的一种或多种基因中包含突变的芽孢杆菌宿主菌株。此外，包含内源性蛋白酶基因的突变和/或缺失的芽孢杆菌宿主细胞也可使用。在一些实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如，US2005/0202535)。

使用本领域中已知的任何合适的方法，用编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种核酸序列转化宿主细胞。利用质粒DNA构建体或载体将核酸(例如，DNA)引入到芽孢杆菌细胞或大肠杆菌细胞中并将此类质粒DNA构建体或载体转化到此类细胞中的方法为人们所熟知。在一些实施方案中，随后从大肠杆菌细胞分离质粒并转化到芽孢杆菌细胞中。然而，使用介入微生物(诸如大肠杆菌)不是必需的，并且在一些实施方案中，将DNA构建体或载体直接引入到芽孢杆菌宿主中。

将本文所述的一种或多种核酸序列引入到芽孢杆菌细胞中的示例性方法描述于例如以下中：Ferrari等人，“Genetics”，Harwood等人[编辑]，Bacillus，PlenumPublishing Corp.，1989年，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.，第157卷：第718-726页，1984年；Hoch等人，J.Bacteriol.，第93卷：第1925-1937页，1967年；Mann等人，CurrentMicrobiol.，第13卷：第131-135页，1986年；Holubova，Folia Microbiol.，第30卷：第97页，1985年；Chang等人，Mol.Gen.Genet.，第168卷：第11-115页，1979年；Vorobjeva等人，FEMSMicrobiol.Lett.，第7卷：第261-263页，1980年；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.，第51卷：第634页，1986年；Fisher等人，Arch.Microbiol.，第139卷：第213-217页，1981年；以及McDonald，J.Gen.Microbiol.，第130卷：第203页，1984年)。实际上，诸如转化(包括原生质体转化和转染)、转导和原生质体融合的方法为人们所熟知的，并且适用于本文。转化芽孢杆菌细胞的本领域中已知的方法包括诸如质粒标记拯救转化的方法，其涉及携带部分同源驻留质粒的感受态细胞对供体质粒的摄取(参见Contente等人，Plasmid，第2卷：第555-571页，1979年；Haima等人，Mol.Gen.Genet.，第223卷：第185-191页，1990年；Weinrauch等人，J.Bacteriol.，第154卷：第1077-1087页，1983年；以及Weinrauch等人，J.Bacteriol.，第169卷：第1205-1211页，1987年)。在该方法中，引入的供体质粒在模拟染色体转化的过程中与驻留“辅助”质粒的同源区域重组。

除常用方法之外，在一些实施方案中，用包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸的DNA构建体或载体直接转化宿主细胞(即，在引入到宿主细胞中之前，不使用中间细胞来扩增或加工DNA构建体或载体)。将本文所述的DNA构建体或载体引入到宿主细胞中包括本领域中已知的将核酸序列(例如，DNA序列)引入宿主细胞而不插入到宿主基因组中的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA和脂质体。在另外的实施方案中，DNA构建体或载体与质粒共转化，而不被插入到质粒中。在另一个实施方案中，通过本领域中已知的方法从改变的芽孢杆菌菌株中缺失选择性标记(参见Stahl等人，J.Bacteriol.，第158卷：第411-418页，1984年；以及Palmeros等人，Gene，第247卷：第255-264页，2000年)。

在一些实施方案中，转化的细胞在常规营养培养基中培养。合适的特定培养条件，诸如温度、pH等是本领域的技术人员已知的，并且在科学文献中进行了充分描述。一些实施方案提供了包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或核酸序列的培养物(例如，细胞培养物)。

在一些实施方案中，在允许变体表达的条件下，在合适的营养培养基中培养用编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种多核苷酸序列转化的宿主细胞，之后从培养物中回收所得变体。在一些实施方案中，通过常规方法从培养基中回收由细胞产生的变体，该常规方法包括但不限于例如通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞、通过盐(例如，硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白质组分，以及色谱纯化(例如，离子交换、凝胶过滤、亲和等)。

在一些实施方案中，由重组宿主细胞产生的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体被分泌到培养基中。编码纯化促进结构域的核酸序列可用于促进变体的纯化。包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列的载体或DNA构建体还可包含编码纯化促进结构域的核酸序列，以促进变体的纯化(参见例如，Kroll等人，DNA Cell Biol.，第12卷：第441-453页，1993年)。此类纯化促进结构域包括但不限于，例如允许在固定化金属上纯化的金属螯合肽(诸如组氨酸-色氨酸模块)，(参见Porath，Protein Expr.Purif.，第3卷：第263-281页，1992年)；允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域；和在FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的结构域。在纯化结构域与异源蛋白质之间包含可切割的接头序列诸如因子XA或肠激酶(例如，购自Invitrogen，San Diego，CA的序列)也可用于促进纯化。

多种方法可用于测定本文所述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体在宿主细胞中的产生水平。此类方法包括但不限于，例如利用对蛋白酶具有特异性的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。这些和其他测定在本领域中是熟知的(参见例如，Maddox等人，J.Exp.Med.，第158卷：第1211，1983年)。

一些其他实施方案提供了用于制备或产生本文所述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体的方法。成熟枯草杆菌蛋白酶变体不包括信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞中制备或产生本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，该重组细菌宿主细胞诸如例如芽孢杆菌细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞)。其他实施方案提供了一种产生本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，其中该方法包括在有利于产生变体的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸序列。一些此类方法还包括从培养物中回收变体。

进一步的实施方案提供了产生本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，其中该方法包括：(a)将包含编码变体的核酸的重组表达载体引入到细胞群(例如，细菌细胞，诸如枯草芽孢杆菌细胞)中；以及(b)在有利于产生由表达载体编码的变体的条件下在培养基中培养细胞。一些此类方法还包括：(c)从细胞或培养基中分离变体。

另一个实施方案涉及一种改善枯草杆菌蛋白酶的清洁性能或稳定性的方法，该方法包括修饰枯草杆菌蛋白酶以包含一个或多个取代或取代的组合，如本文所提供的。

除非另有说明，否则本文提供的所有组分或组合物水平均涉及那个组分或组合物的活性物质水平，并且不包括可能存在于可商购获得来源中的杂质，例如残余溶剂或副产物。酶组分重量基于总活性蛋白。除非另外指明，否则所有百分比和比率均按重量计算。除非另外指明，否则所有百分比和比率均基于总组合物计算。本文所述的组合物包括清洁组合物，诸如洗涤剂组合物。在举例说明的洗涤剂组合物中，酶水平以纯酶占总组合物的重量来表示，并且除非另外指明，否则洗涤剂成分以总组合物的重量来表示。

在一个实施方案中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于清洁应用，诸如例如但不限于清洁盘碟或餐具物品、织物、医疗器械和具有硬质表面的物品(例如，桌子、桌面、墙壁、家具物品、地板和天花板的硬质表面)。在其他实施方案中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于消毒应用，诸如例如但不限于消毒自动洗碗机或洗衣机。

另一个实施方案涉及一种包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。在一些实施方案中，该组合物是清洁组合物。在其他实施方案中，该组合物是洗涤剂组合物。在其他实施方案中，该组合物选自衣物洗涤剂组合物、自动盘碟洗涤(ADW)组合物、手工(手动)盘碟洗涤剂组合物、硬质表面清洁组合物、眼镜清洁组合物、医疗器械清洁组合物、消毒剂(例如，恶臭或微生物)组合物和个人护理清洁组合物。在其他实施方案中，该组合物是衣物洗涤剂组合物、ADW组合物或手工(手动)盘碟洗涤剂组合物。甚至更进一步的实施方案涉及织物清洁组合物，而其他实施方案涉及非织物清洁组合物。在一些实施方案中，该清洁组合物不含硼。在其他实施方案中，该清洁组合物不含磷酸盐。在其他实施方案中，该组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及赋形剂、附属材料和/或附加的酶中的一者或多者。

蛋白酶稳定剂

如先前所述(WO199813458、WO2011036153、US20140228274)，肽醛可用作洗涤剂制剂中的蛋白酶稳定剂。肽醛稳定剂的示例为肽醛、酮或卤代甲基酮，并且可以用例如脲基、氨基甲酸根或脲部分进行“N-封端”，或者用例如羰基、脲基、oxiamide、硫脲基、二硫代草酰胺或硫代草酰胺部分进行“双N-封端”(EP2358857B1)。这些抑制剂与蛋白酶的摩尔比可以为0.1:1至100:1，例如0.5:1至50:1、1:1至25:1或2:1至10:1。蛋白酶稳定剂的其他示例为二苯甲酮或苯甲酸苯胺衍生物，其可能含有羧基基团(US 7,968,508 B2)。这些稳定剂与蛋白酶的摩尔比优选地在1:1至1000:1，特别是1:1至500:1，尤其优选地1:1至100:1，最尤其优选地1:1至20:1的范围内。

络合剂体系

出于本发明的目的，“络合剂”是能够结合多价离子诸如钙、镁、铅、铜、锌、镉、汞、锰、铁、铝和其他阳离子多价离子以形成水溶性络合物的化合物。所述络合剂对于Ca2+具有至少3的对数稳定常数([log K])。该稳定常数log K在25℃的温度下、在离子强度为0.1的溶液中测定。

本发明的组合物优选地包含按组合物的重量计10％至50％的络合剂体系。络合剂体系包含选自由以下组成的组的一种或多种络合剂：甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、柠檬酸、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、羧甲基菊粉、L-天冬氨酸N,N-二乙酸四钠盐(ASDA)以及它们的混合物。优选地，络合剂体系包含按组合物的重量计至少10％的MGDA。络合剂体系可以另外包含选自由以下组成的组的络合剂：柠檬酸、(GLDA)、(IDS)、羧甲基菊粉、L-天冬氨酸N,N-二乙酸四钠盐(ASDA)以及它们的混合物优选地，络合剂体系包含按组合物的重量计至少10％的MGDA和按组合物的重量计至少10％的柠檬酸。出于本发明的目的，当提及络合剂时，术语“酸”包括酸及其盐。

在一个优选的实施方案中，所述组合物包含按组合物的重量计至少15％，更优选地20％至40％的MGDA，更优选MGDA的三钠盐。包含这种高含量MGDA的组合物在硬水中以及在长时间和/或热循环中表现良好。

本发明的络合剂体系还可包含柠檬酸。

聚合物分散剂

聚合物分散剂可以按所述组合物的重量计约0.1％至约20％、优选地0.2％至约15％、更优选地0.3至％的任意合适的量使用。

聚合物分散剂能够在自动盘碟洗涤过程中混悬钙或碳酸钙。

在25℃下，聚合物分散剂具有介于30至250mg Ca/g聚合物分散剂、优选地介于35至200mg Ca/g聚合物分散剂、更优选地40至150mg Ca/g聚合物分散剂范围内的钙结合能力。为了确定聚合物是否为本发明意义上的聚合物分散剂，根据以下说明进行以下钙结合能力测定：

钙结合能力测试方法

本文提及的钙结合能力经由滴定、使用pH/离子计诸如Meettler ToledoSevenMulti^TM台式计和PerfectION^TM复合钙离子电极来测定。为了测量结合能力，将适用于烧杯或洗涤仪罐的加热搅拌装置设定为25℃，并且根据制造商说明书校准具有仪表的离子电极。电极校准的标准浓度应包括测试浓度，并且应在25℃下测量。通过将3.67g CaCl₂-2H₂O添加到1L去离子水中来制备1000mg/g Ca的原液，然后进行稀释以制备三种各100mL的工作溶液，分别包含100mg/g、10mg/g和1mg/g浓度的钙。将100mg Ca/g工作溶液用作在25℃下进行的滴定期间的初始浓度。通过向每种工作溶液中添加2.5g/L NaCl来调节每种工作溶液的离子强度。将100mL的100mg Ca/g工作溶液加热并搅拌，直至其达到25℃。在溶液达到25℃时，使用离子电极进行钙离子浓度的初始读数。然后将测试聚合物逐渐地添加到钙工作溶液中(以0.01g/L的间隔)，并且在每次增量添加后搅拌5分钟之后再测量。当溶液达到1mg/g钙时，停止滴定。使用剩余的两种钙浓度工作溶液重复滴定过程。测试聚合物的结合能力被计算为相对于所添加的测试聚合物的克/L所测量的钙浓度的线性斜率。

当溶解于pH大于6的水性溶液中时，聚合物分散剂优选地具有净负电荷。

聚合物分散剂还可具有磺化羧酸酯或酰胺，以在较低pH下增加负电荷，并且改善它们在硬水中的分散性质。优选的聚合物分散剂是磺化/羧化聚合物，即包含磺化单体和羧化单体两者的聚合物。

优选地，所述聚合物分散剂为多元羧酸的磺化衍生物，并且可包含两种、三种、四种或更多种不同的单体单元。优选的共聚物包含：

至少一个衍生自具有通式(III)的羧酸单体的结构单元：

其中R₁至R₃独立地选自氢、甲基、具有2至12个碳原子的直链或支链的饱和烷基基团、具有2至12个碳原子的直链或支链的单不饱和或多不饱和的烯基基团、如前述被-NH2或-OH或者-COOH或者COOR₄取代的烷基或烯基基团，其中R₄选自氢、碱金属或具有2至12个碳的直链或支链的、饱和或不饱和的烷基或烯基基团；

优选的羧酸单体包括下列中的一种或多种：丙烯酸、马来酸、马来酸酐、衣康酸、柠康酸、2-苯基丙烯酸、肉桂酸、巴豆酸、富马酸、甲基丙烯酸、2-乙基丙烯酸、亚甲基丙二酸或山梨酸。丙烯酸和甲基丙烯酸是更优选的。

任选地，一个或多个衍生自至少一种具有通式(IV)的非离子单体的结构单元：

其中R₅至R₇独立地选自氢、甲基、苯基或含有1至6个碳原子的羟烷基基团，并且可以是环状结构的一部分，X为选自-CH₂-、-COO-、-CONH-或-CONR₈-的任选地存在的间隔基团，并且R₈选自具有1至22个碳原子的直链或支链的饱和烷基基团或具有6至22个碳原子的不饱和、优选芳族的基团。

优选的非离子单体包括下列中的一种或多种：丁烯、异丁烯、戊烯、2-甲基戊-1-烯、3-甲基戊-1-烯、2,4,4-三甲基戊-1-烯、2,4,4-三甲基戊-2-烯、环戊烯、甲基环戊烯、2-甲基-3-甲基-环戊烯、己烯、2,3-二甲基己-1-烯、2,4-二甲基己-1-烯、2,5-二甲基己-1-烯、3,5-二甲基己-1-烯、4,4-二甲基己-1-烯、环己烯、甲基环己烯、环庚烯、具有10个或更多个碳原子的α-烯烃诸如癸-1-烯、十二碳-1-烯、十六碳-1-烯、十八碳-1-烯和二十二碳-1-烯，优选的芳族单体为苯乙烯、α-甲基苯乙烯、3-甲基苯乙烯、4-十二烷基苯乙烯、2-乙基-4-苄基苯乙烯、4-环己基苯乙烯、4-丙基苯乙烯、1-乙烯基萘、2-乙烯基萘；优选的羧酸酯单体为(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯、(甲基)丙烯酸戊酯、(甲基)丙烯酸己酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸辛酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯和(甲基)丙烯酸二十二烷基酯；优选的酰胺为N-甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-2-乙基己基丙烯酰胺、N-辛基丙烯酰胺、N-月桂基丙烯酰胺、N-硬脂基丙烯酰胺、N-二十二烷基丙烯酰胺。

以及至少一个衍生自至少一种具有通式(V)和(VI)的磺酸单体的结构单元：

其中R₇为包含至少一个sp2键的基团，A为O、N、P、S、酰胺基或酯键，B为单环或多环芳族基团或脂族基团，每个t独立地为0或1，并且M+为阳离子。在一个方面，R₇为C2至C6烯烃。在另一方面，R7为乙烯、丁烯或丙烯。

优选的磺化单体包括下列中的一种或多种：1-丙烯酰胺-1-丙磺酸、2-丙烯酰胺-2-丙磺酸、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸、2-甲基丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸、3-甲基丙烯酰胺-2-羟基-丙磺酸、烯丙基磺酸、甲基烯丙基磺酸、烯丙氧基苯磺酸、甲基烯丙氧基苯磺酸、2-羟基-3-(2-丙烯氧基)丙磺酸、2-甲基-2-丙烯-1-磺酸、苯乙烯磺酸、乙烯基磺酸、3-磺基丙基、甲基丙烯酸3-磺基丙酯、磺基甲基丙烯酰胺、磺基甲基甲基丙烯酰胺、以及所述酸的混合物或它们的水溶性盐。

优选地，该聚合物包含以下含量的单体：按该聚合物的重量计约40％至约90％、优选地约60％至约90％的一种或多种羧酸单体；按该聚合物的重量计约5％至约50％、优选地约10％至约40％的一种或多种磺酸单体；以及任选地按该聚合物的重量计约1％至约30％、优选地约2％至约20％的一种或多种非离子单体。特别优选的聚合物包含按该聚合物的重量计约70％至约80％的至少一种羧酸单体，以及按该聚合物的重量计约20％至约30％的至少一种磺酸单体。

在该聚合物中，羧酸基团或磺酸基团中的全部或一些可以中和形式存在，即，一些或全部酸基团中的羧酸基团和/或磺酸基团的酸性氢原子可用金属离子、优选地碱金属离子并且具体地用钠离子替代。

羧酸优选地为(甲基)丙烯酸。磺酸单体优选地为2-丙烯酰胺-2-丙磺酸(AMPS)。

优选的可商购获得的聚合物包括：由Alco Chemical提供的Alcosperse240、Aquatreat AR 540和Aquatreat MPS；由Rohm&Haas提供的Acumer3100、Acumer 2000、Acusol 587G和Acusol 588G；由BF Goodrich提供的Goodrich K-798、K-775和K-797；以及由ISP technologies Inc提供的ACP 1042。特别优选的聚合物是由Rohm&Haas提供的Acusol 587G和Acusol588G。

合适的聚合物分散剂包括低分子量的阴离子羧酸聚合物。它们可以是重均分子量小于或等于约200000g/mol或者小于或等于约75000g/mol或者小于或等于约50000g/mol或者约3000g/mol至约50000g/mol、优选地约5000g/mol至约45000g/mol的均聚物或共聚物。聚合物分散剂可以是聚丙烯酸酯的低分子量均聚物，其平均分子量为1000至20000，具体地2000至10000，并且具体地优选3000至5000。

聚合物分散剂可以是分子量小于70000的丙烯酸与甲基丙烯酸的共聚物、丙烯酸和/或甲基丙烯酸与马来酸的共聚物、以及丙烯酸和/或甲基丙烯酸与富马酸的共聚物。其分子量在2,000g/mol至80,000g/mol并且更优选地20,000g/mol至50,000g/mol并且具体地30,000g/mol至40,000g/mol的范围内，并且(甲基)丙烯酸酯与马来酸酯或延胡索酸酯片段的比率为30:1至1:2。

聚合物分散剂可以是分子量为3000至100000或者4000至20000的丙烯酰胺和丙烯酸酯的共聚物，并且也可使用按聚合物分散剂的重量计小于50％或者小于20％的丙烯酰胺含量。另选地，此类聚合物分散剂可具有按所述聚合物的重量计4000至20000的分子量和0％至15％的丙烯酰胺含量。

适用于本文的聚合物分散剂还包括衣康酸均聚物和共聚物。

另选地，聚合物分散剂可选自由烷氧基化聚亚烷基亚胺、烷氧基化聚羧酸酯、聚乙二醇、苯乙烯共聚物、硫酸纤维素酯、羧化多糖、两亲性接枝共聚物以及它们的混合物组成的组。

漂白体系

本发明的组合物优选地包含漂白体系，该漂白体系包含高含量的漂白剂，优选过碳酸盐与漂白活化剂或漂白催化剂或两者的组合。优选地，所述漂白活化剂为TAED，并且所述漂白催化剂为锰漂白催化剂。

漂白剂

本发明的组合物优选地包含按所述组合物的重量计约10％至约20％、更优选地约12％至约18％的漂白剂，优选过碳酸盐。

由于该变体的改善的稳定性，该组合物可包含更有效和更具侵蚀性的漂白剂(例如，可使用高含量的漂白催化剂)。较不稳定的漂白剂(例如，具有较少涂层的过碳酸盐颗粒)也可用于组合物中。

无机漂白剂和有机漂白剂适用于本文。无机漂白剂包括过氧化氢合物盐，诸如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐。无机过氧化氢合物盐通常为碱金属盐。无机过氧化氢合物盐可作为结晶固体包含在内，而无需另外的保护。另选地，盐可为经涂覆的。合适的涂料包含硫酸钠、碳酸钠、硅酸钠以及它们的混合物。所述涂料可作为混合物施加到表面或依次施加成层。

碱金属过碳酸盐、具体地过碳酸钠是优选用于本文的漂白剂。过碳酸盐最优选地以涂覆形式掺入到产品中，这提供了产品内的稳定性。

过氧单过硫酸钾是可用于本文的另一种无机过氧化氢合物盐。

典型的有机漂白剂是有机过氧酸，尤其是十二烷二过氧酸、十四烷二过氧酸和十六烷二过氧酸。单过壬二酸和二过壬二酸、单过十三烷二酸和二过十三烷二酸也适用于本文。二酰基和四酰基过氧化物例如过氧化二苯甲酰和过氧化二月桂酰是可用于本发明上下文的其他有机过氧化物。

其他典型的有机漂白剂包括过氧酸，具体示例是烷基过氧酸和芳基过氧酸。优选的代表是(a)过氧苯甲酸及其环取代的衍生物，诸如烷基过氧苯甲酸，以及过氧-α-萘甲酸和单过邻苯二甲酸镁，(b)脂族或取代的脂族过氧酸，诸如过氧月桂酸、过氧硬脂酸、ε-邻苯二甲酰亚胺过氧己酸[邻苯二甲酰亚氨基过氧己酸(PAP)]、邻羧基苯甲酰胺基过氧己酸、N-壬烯酰胺基过己二酸和N-壬烯酰胺基过琥珀酸盐，以及(c)脂族和芳脂族过氧二羧酸，诸如1,12-二过氧羧酸、1,9-二过氧壬二酸、二过氧癸二酸、二过氧十三烷二酸、二过氧邻苯二甲酸、2-癸基二过氧丁烷-1,4-二酸、N,N-对苯二甲酰二(6-氨基过己酸)。

漂白活化剂

漂白活化剂通常是能在60℃和更低的温度下在清洁过程中增强漂白作用的有机过酸前体。适用于本文的漂白活化剂包括在过水解条件下提供优选地具有1至12个碳原子、具体地2至10个碳原子的脂族过氧羧酸和/或任选取代的过苯甲酸的化合物。合适的物质具有指定碳原子数的O-酰基和/或N-酰基基团和/或任选取代的苯甲酰基基团。优选的是聚酰化亚烷基二胺、具体地四乙酰基乙二胺(TAED)，酰化三嗪衍生物、具体地1,5-二乙酰基-2,4-二氧代六氢-1,3,5-三嗪(DADHT)，酰化甘脲、具体地四乙酰基甘脲(TAGU)，N-酰基酰亚胺、具体地N-壬酰基琥珀酰亚胺(NOSI)，酰化酚磺酸盐、具体地正壬酰基或异壬酰基氧基苯磺酸盐(正-或异-NOBS)、癸酰氧基苯甲酸(DOBA)，羧酸酐具体地邻苯二甲酸酐，酰化多元醇、具体地甘油三乙酸酯、乙二醇二乙酸酯和2,5-二乙酰氧基-2,5-二氢呋喃，以及乙酰柠檬酸三乙酯(TEAC)。如果存在的话，本发明的组合物包含按所述组合物的重量计0.01％至5％、优选地0.2％至2％的漂白活化剂，优选TAED。

漂白催化剂

本文的组合物优选地包含漂白催化剂，优选含金属的漂白催化剂。更优选地，该含金属的漂白催化剂是含过渡金属的漂白催化剂，尤其是含锰或钴的漂白催化剂。

优选用于本文的漂白催化剂包括锰三氮杂环壬烷及相关络合物；Co、Cu、Mn和Fe联吡啶胺及相关络合物；以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物。可用于本文的特别优选的漂白催化剂是1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me-TACN)和1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me/Me-TACN)。可用于本文的特别优选的组合物包含1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me-TACN)和/或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me/Me-TACN)。

优选地，本发明的组合物包含按组合物的重量计0.001％至0.5％、更优选地0.002％至0.1％、更优选地0.005％至0.075％的漂白催化剂。优选地，所述漂白催化剂为锰漂白催化剂。

无机助洗剂

本发明的组合物优选地包含无机助洗剂。合适的无机助洗剂选自由碳酸盐、硅酸盐以及它们的混合物组成的组。特别优选用于本文的是碳酸钠。优选地，本发明的组合物包含按该组合物的重量计5％至60％，更优选地10％至50％，并且尤其是15％至45％的碳酸钠。

表面活性剂

适用于本文的表面活性剂包括非离子表面活性剂，优选地，该组合物不含任何其他表面活性剂。传统上，非离子表面活性剂已在自动盘碟洗涤中被用于表面改性目的，具体地用于片材，以避免成膜和斑染并改善光泽度。据发现，非离子表面活性剂还可有助于防止污垢再沉积。

优选地，本发明的组合物包含非离子表面活性剂或非离子表面活性剂体系，更优选地，该非离子表面活性剂或非离子表面活性剂体系具有介于40℃和70℃之间、优选地介于45℃和65℃之间的相转化温度，如在蒸馏水中以1％的浓度测得。所谓“非离子表面活性剂体系”在本文中是指两种或更多种非离子表面活性剂的混合物。优选用于本文的是非离子表面活性剂体系。与单一非离子表面活性剂相比，非离子表面活性剂体系似乎具有改善的清洁和修整性质以及在产品中更好的稳定性。

相转化温度是这样的温度，在低于该温度时，表面活性剂或其混合物作为油溶胀的胶束优先分配到水相中，并且在高于该温度时，则作为水溶胀的反相胶束优先分配到油相中。相转化温度可通过识别在哪个温度下发生浑浊而目视确定。

非离子表面活性剂或体系的相转化温度可如下测定：制备在蒸馏水中包含按该溶液的重量计1％的对应表面活性剂或混合物的溶液。在相转化温度分析之前轻轻搅拌溶液，以确保该过程在化学平衡下发生。通过在75mm密封玻璃试管中浸入溶液，在热稳定浴中获取相转化温度。为了确保不存在渗漏，在相转化温度测量之前和之后称量试管的重量。温度以小于1℃/分钟的速率逐渐升高，直到温度达到低于预估的相转化温度几度。相转化温度在第一浊度标志下目视确定。

合适的非离子表面活性剂包括：i)乙氧基化非离子表面活性剂，其通过具有6至20个碳原子的一羟基链烷醇或烷基酚与优选每摩尔醇或烷基酚至少12摩尔、尤其优选至少16摩尔并且还更优选至少20摩尔的环氧乙烷的反应制备；ii)具有6至20个碳原子和至少一个乙氧基和丙氧基基团的醇烷氧基化表面活性剂。优选可用于本文的是表面活性剂i)和ii)的混合物。

其他合适的非离子表面活性剂是由下式表示的环氧封端的聚(烷氧基化)醇：

R1O[CH2CH(CH3)O]x[CH2CH2O]y[CH2CH(OH)R2] (I)

其中R1为具有4至18个碳原子的直链或支链的脂族烃基；R2为具有2至26个碳原子的直链或支链的脂族烃基；x是具有0.5至1.5、更优选地约1的平均值的整数；并且y是具有至少15、更优选地至少20的值的整数。

优选地，式I的表面活性剂在末端环氧化物单元[CH2CH(OH)R2]中具有至少约10个碳原子。根据本发明，式I的合适表面活性剂是Olin Corporation的SLF-18B非离子表面活性剂，例如1994年10月13日由Olin Corporation公布的WO 94/22800中所述。

酶

其他蛋白酶

除本发明的蛋白酶之外，本发明的组合物还可包含蛋白酶。两种或更多种蛋白酶的混合物可有助于在较宽的温度、循环持续时间和/或底物范围内增强清洁，并且提供优异的光泽有益效果，尤其是当与抗再沉积剂和/或磺化聚合物结合使用时。

与本发明的变体蛋白酶组合使用的合适蛋白酶包括金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶包括中性或碱性微生物丝氨酸蛋白酶，诸如枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)。合适的蛋白酶包括动物源、植物源或微生物源的那些。在一个方面，此类合适的蛋白酶可为微生物源。合适的蛋白酶包括前述合适蛋白酶的经化学修饰或基因修饰的突变体。在一个方面，合适的蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶，诸如碱性微生物蛋白酶或/和胰蛋白酶型蛋白酶。合适的中性或碱性蛋白酶的示例包括：

(a)枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)，尤其是WO2004067737、WO2015091989、WO2015091990、WO2015024739、WO2015143360、US 6,312,936 B1、US 5,679,630、US 4,760,025、WO03/055974、WO03/054185、WO03/054184、WO2017/215925、DE102006022216A1、WO2015089447、WO2015089441、WO2016066756、WO2016066757、WO2016069557、WO2016069563、WO2016069569、WO2016174234、WO2017/089093、WO2020/156419、WO2016/183509中所述的衍生自芽孢杆菌(诸如芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌和秋叶氏芽孢杆菌(B.akibaii))的那些。具体地，突变S9R、A15T、V66A、A188P、V199I、N212D、Q239R、N255D、X9E、X200L、X256E、X9R、X19L、X60D(Savinase编号系统)；来自短小芽孢杆菌(B.pumilus)的枯草杆菌蛋白酶(诸如DE102006022224A1、WO2020/221578、WO2020/221579、WO2020/221580中所述的枯草杆菌蛋白酶)包括包含选自9、130、133、144、224、252、271(BPN'编号系统)的位置中的至少一个或多个位置中的氨基酸取代的变体。

(b)胰蛋白酶型或胰凝乳蛋白酶型蛋白酶，诸如胰蛋白酶(例如源自猪或牛的胰蛋白酶)，包括WO 89/06270中所述的镰孢菌蛋白酶和WO 05/052161和WO 05/052146中所述的来源于纤维单胞菌属(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶。

(c)金属蛋白酶，尤其是WO07/044993A2中所述的来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)；WO2014194032、WO2014194054和WO2014194117中所述的来源于芽孢杆菌(Bacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、热放线菌(Thermoactinomyces)、地表地芽孢杆菌(Geobacillus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、长形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus)或链霉菌属(Streptomyces spp.)；WO2015193488中所述的来源于Kribella alluminosa；以及WO2016075078中所述的来源于链霉菌(Streptomyces)和溶杆菌(Lysobacter)的那些。

(d)与在WO92/17577(Novozymes A/S)中所述的来自芽孢杆菌属TY145,NCIMB40339的枯草杆菌酶具有至少90％的同一性的蛋白酶，包括WO2015024739和WO2016066757中所述的该芽孢杆菌TY145枯草杆菌酶的变体。

用于本发明的组合物的尤其优选的另外的蛋白酶是亲本蛋白酶的变体，其中亲本蛋白酶表现出与SEQ ID NO:2具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％、甚至更优选地至少99％并且尤其是100％同一性，并且变体相对于SEQ ID NO:2包含在以下位置中的一个或多个位置或者两个或更多个位置或者三个或更多个位置中的取代：

S3V、S9R、A13V、A15T、G20*、L21F、I35V、N60D、V66A、N74D、S85N/R、S97SE、S97AD、S97D/G、S99G/M/D/E、S101A、V102E/I、G116V/R、S126F/L、P127Q、S128A、S154D、G157S、Y161A、R164S、A188P、V199I、Q200C/E/I/K/T/V/W/L、Y203W、N212D、M216S/F、A222V、Q239R/F、T249R、N255D和L256E/N/Q/D

优选的蛋白酶包括与SEQ ID NO:2具有至少90％、优选地至少95％同一性的那些蛋白酶，这些蛋白酶包含以下突变：

S9R+A13V+A15T+l35V+N60D+Q239F；或

S9R+A15T+G20*+L21F+N60D+Q239N；或

S9R+A15T+V66A+S97G+A222V+Q239R+N255D；或

S9R+A15T+V66A+N74D+Q239R；或

S9R+A15T+V66A+N212D+Q239R；或

S99SE；或

S99AD；或

N74D+S85R+G116R+S126L+P127Q+S128A；或

N74D+S85R+G116R +S126L+P127Q+S128A+S182D+V238R；或

G116V+S126L+P127Q+S128A；或

S99M+G116V+S126L+P127Q+S128A。

合适的可商购获得的附加蛋白酶包括以如下商品名由Novozymes A/S(Denmark)出售的那些： LiquanaseSavinase BlazeExceed、Pro、Uno、Excel、Key、和Het

以商品名PurafectPurafect和Purafect由Dupont出售的那些；以商品名和由SolvayEnzymes出售的那些；以及可从Henkel/Kemira获得的那些，即BLAP(序列示于US US 5,352,604的图29中，具有下列突变S99D+S101 R+S103A+V104I+G159S，下文称为BLAP)、BLAP R(具有S3T+V4I+V199M+V205I+L217D的BLAP)、BLAP X(具有S3T+V4I+V205I的BLAP)和BLAP F49(具有S3T+V4I+A194P+V199M+V205I+L217D的BLAP)；并且可任选地包含至少一个另外的突变101E/D、S156D、L262；来自Kao的KAP(带有突变A230V+S256G+S259N的嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)和来自BASF的Pro、C Bright。

对于本文中与本发明的变体蛋白酶组合使用尤其优选的是选自由以下项组成的组的商业蛋白酶：Everlase、SavinaseSavinase BlazeBlaze和BlazeBLAP以及BLAP变体。

本发明产品中蛋白酶的优选含量包括约0.05mg至约10mg、更优选地约0.5mg至约7mg并且特别是约1mg至约6mg活性蛋白酶/g组合物。

淀粉酶

优选地，本发明的组合物可包含淀粉酶。合适的α-淀粉酶包括源自细菌或真菌的那些。包括经化学修饰或基因修饰的突变体(变体)。优选的碱性α-淀粉酶来源于芽孢杆菌(Bacillus)的菌株，诸如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其他芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，诸如芽孢杆菌属NCBI 12289、NCBI 12512、NCBI 12513、DSM 9375(USP 7,153,818)DSM 12368、DSMZ号12649、KSM AP1378(WO 97/00324)、KSM K36或KSM K38(EP 1,022,334)。优选的淀粉酶包括：

合适的淀粉酶是亲本α-淀粉酶的重组的非天然存在的变体，该变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:5具有95％同一性并且相对于SEQ ID NO:5在位置51和125处具有氨基酸取代。变体α-淀粉酶可相对于SEQ ID NO:5具有氨基酸取代T51V和S125R。变体α-淀粉酶还可相对于SEQ ID NO:5在位置172、227或231处具有氨基酸取代。变体α-淀粉酶还可相对于SEQ IDNO:5具有氨基酸取代N172Q、N227R或F231L。

一种合适的淀粉酶是亲本α-淀粉酶的重组的非天然存在的变体，该变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:5具有95％同一性并且具有氨基酸取代：

(a)T51V+S125R+F231L；

(b)T51V+S125R+N172Q+N227R；

(c)N029Q+T051V+T244I+S253L+K268R+K319R+S418A；或

(d)E415G。

其他优选的淀粉酶包括：

(a)在WO 96/23873、WO00/60060、WO06/002643和WO2017/192657中所述的变体，尤其是相对于WO06/002643中如SEQ ID NO.12所列的AA560酶在以下位置中带有一个或多个取代的变体：

26、30、33、82、37、106、118、128、133、149、150、160、178、182、186、193、202、214、231、246、256、257、258、269、270、272、283、295、296、298、299、303、304、305、311、314、315、318、319、339、345、361、378、383、419、421、437、441、444、445、446、447、450、461、471、482、484，这些变体优选地还包含D183*和G184*缺失。

(b)表现出与WO06/002643中的SEQ ID No.4具有至少90％同一性的变体，来自芽孢杆菌属SP722的野生型酶，特别是在第183和184位具有缺失的变体，以及WO2000/60060、WO2011/100410和WO2013/003659中描述的变体，所述文献以引用方式并入本文。

(c)表现出与来自芽孢杆菌属707的野生型酶(US 6,093,562中的SEQ ID NO:7)具有至少95％同一性的变体，特别是包含以下突变中的一个或多个突变的那些：M202、M208、S255、R172和/或M261。优选地，所述淀粉酶包含M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、M202W、S255N和/或R172Q中的一者或多者。尤其优选的是包含M202L或M202T突变的那些。

(d)在WO 09/149130中描述的变体，优选表现出与WO 09/149130中的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2(来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus Stearophermophilus)的野生型酶或其截短型式)至少90％的同一性的那些。

(e)表现出与WO2016091688中的SEQ ID NO:1具有至少89％同一性的变体，特别是在位置H183+G184处包含缺失并且还在第405位、第421位、第422位和/或第428位处包含一个或多个突变的那些。

(f)表现出与来自解凝乳类芽孢杆菌YK9的“PcuAmylα-淀粉酶”(WO2014099523中的SEQ ID NO:3)具有至少60％的氨基酸序列同一性的变体。

(g)表现出与来自噬细胞菌属(Cytophaga sp.)的“CspAmy2淀粉酶”(WO2014164777中的SEQ ID NO:1)具有至少60％的氨基酸序列同一性的变体。

(h)表现出与来自枯草芽孢杆菌的AmyE(WO2009149271中的SEQ ID NO:1)具有至少85％同一性的变体。

(i)表现出与来自芽孢杆菌属KSM-K38的野生型淀粉酶(登录号AB051102)具有至少90％同一性的变体。

(j)表现出与来自芽孢杆菌属的AAI10的成熟氨基酸序列(WO2016180748中的SEQID NO:7)具有至少90％、优选地至少95％、优选地至少98％同一性的变体。

(k)表现出与脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus sp.)淀粉酶的成熟氨基酸序列(WO2016180748中的SEQ ID NO:8)具有至少80％同一性的变体。

优选地，淀粉酶是工程化酶，其中易于漂白氧化的氨基酸中的一者或多者已被不太易于氧化的氨基酸取代。具体地，优选的是甲硫氨酸残基被任何其他氨基酸取代。具体地，优选的是最易于氧化的甲硫氨酸被取代。优选地，在等同于WO06/002643中如SEQ IDNO.12所列的AA560中的202的位置中的甲硫氨酸被取代。优选地，该位置处的甲硫氨酸被苏氨酸或亮氨酸、优选亮氨酸取代。

合适的可商购获得的α-淀粉酶包括 TERMAMYL STAINZYME 和(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)、AT9000Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200Wien Austria、OPTISIZE HT PREFERENZ系列(包括PREFERENZ和PREFERENZ)、PURASTAR (DuPont.,Palo Alto,California)和(Kao,14-10NihonbashiKayabacho,1-chome,Chuo-ku Tokyo 103-8210,Japan)。在一个方面，合适的淀粉酶包括 和STAINZYME以及它们的混合物。

优选地，本发明的组合物包含至少0.01mg、优选地约0.05mg至约10mg、更优选地约0.1mg至约6mg、特别是约0.2mg至约5mg活性淀粉酶/g组合物。

优选地，本发明组合物的蛋白酶和/或淀粉酶为颗粒形式，该颗粒包含按该颗粒的重量计大于29％的硫酸钠，并且/或者硫酸钠和活性酶(蛋白酶和/或淀粉酶)的重量比介于3:1和100:1之间，或优选地介于4:1和30:1之间，或更优选地介于5:1和20:1之间。

晶体生长抑制剂

晶体生长抑制剂是可与碳酸钙晶体结合并防止物质(诸如霰石和方解石)进一步生长的材料。

有效的晶体生长抑制剂的示例包括膦酸盐、聚膦酸盐、菊粉衍生物、聚衣康酸均聚物和环状聚羧酸盐。

合适的晶体生长抑制剂可选自HEDP(1-羟基亚乙基1,1-二膦酸)、羧甲基菊粉(CMI)、三羧酸和环状羧酸盐。出于本发明的目的，术语羧酸盐涵盖阴离子形式和质子化羧酸形式两者。

环状羧酸盐包含至少两个，优选三个或优选至少四个羧酸根基团，并且环状结构基于单环或双环烷烃或杂环。合适的环状结构包括环丙烷、环丁烷、环己烷或环戊烷或环庚烷、双环庚烷或双环辛烷和/或四氢呋喃。一种优选的晶体生长抑制剂是环戊烷四羧酸盐。

在环的3D结构的同一侧或“顺式”位置上具有至少75％，优选100％羧酸根基团的环状羧酸盐优选地用于本文中。

优选的是，位于环的同一侧的两个羧酸根基团在直接相邻或“邻位”的位置。

优选的晶体生长抑制剂包括HEDP、三羧酸、四氢呋喃四羧酸(THFTCA)和环戊烷四羧酸(CPTCA)。THFTCA优选地为2c,3t,4t,5c-构型，并且CPTCA为顺式，顺式，顺式，顺式-构型。可用于本文的尤其优选的晶体生长抑制剂是HEDP。

还优选用于本文的是部分脱羧的聚衣康酸均聚物，其优选具有在50摩尔％至90摩尔％范围内的脱羧水平。可用于本文的尤其优选的聚合物为由Itaconix提供的Itaconix

晶体生长抑制剂的量按组合物的重量计优选为约0.01％至约10％，具体地为约0.02％至约5％，并且具体地为0.05％至3％。

金属护理剂

金属护理剂可防止或减少金属(包括铝、不锈钢和有色金属，诸如银和铜)的失泽、腐蚀或氧化。优选地，本发明的组合物包含按产品的重量计0.1％至5％、更优选0.2％至4％并且尤其是0.3％至3％的金属护理剂，优选地，该金属护理剂为苯并三唑(BTA)。

玻璃护理剂

玻璃护理剂可在盘碟洗涤过程期间保护玻璃物品的外观。优选地，本发明的组合物包含按组合物的重量计0.1％至5％、更优选0.2％至4％并且尤其是0.3％至3％的金属护理剂，优选地，该玻璃护理剂为含锌材料，尤其是水锌矿。其他合适的玻璃护理剂为聚乙烯亚胺(PEI)。尤其优选的PEI为由BASF提供的FG。

pH

本发明的自动盘碟洗涤组合物优选具有在20℃下以1％重量/体积水溶液在蒸馏水中测得的约9至约12、更优选约10至小于约11.5并且尤其是约10.5至约11.5的pH。

储备碱度

本发明的自动盘碟洗涤组合物在pH为9.5下优选具有约10至约20、更优选约12至约18的储备碱度，如在20℃下以100克产品在NaOH中测得的。

洗涤条件

存在多种洗涤条件，包括不同的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度以及本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可能暴露于其的洗涤时间长度。低洗涤剂浓度体系涉及含有小于约800ppm洗涤剂组分的洗涤水。中等洗涤剂浓度体系涉及含有约800ppm至约2000ppm洗涤剂组分的洗涤。高洗涤剂浓度体系涉及含有大于约2000ppm洗涤剂组分的洗涤水。在一些实施方案中，本发明的“冷水洗涤”利用适用于在约10℃至约40℃、约20℃至约30℃或约15℃至约25℃，以及在约15℃至约35℃或10℃至40℃的范围内的所有其他组合的温度进行洗涤的“冷水洗涤剂”。

不同的地理位置具有不同的水硬度。硬度是对水中的钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)的量的量度。通常根据格令每加仑(gpg)混合的Ca²⁺/Mg²⁺来描述水硬度。美国大部分的水是硬的，但硬度有所不同。中等硬(60ppm至120ppm)至硬(121ppm至181ppm)的水具有60ppm至181ppm(可通过将ppm除以17.1来将ppm转化成格令每美国加仑)的硬度矿物质。

水	格令每加仑	百万分率
			柔软性	小于1.0	小于17
轻微硬	1.0至3.5	17至60
			中等硬	3.5至7.0	60至120
硬	7.0至10.5	120至180
			非常硬	大于10.5	大于180

本发明的实施方案

以下是本发明的实施方案

1.一种自动盘碟洗涤组合物，所述自动盘碟洗涤组合物包含表面活性剂和蛋白酶，

其中所述自动盘碟洗涤组合物是包括隔室的水溶性单位剂量小袋的形式，其中所述隔室包含粉末组分和凝胶组分两者，

其中所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体相对于SEQ IDNO:1包含：

(i)位置122处的突变；和

(ii)位置126、127、128、211和212处的一个或多个突变，

并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％同一性。

2.根据实施方案1所述的组合物，其中所述组合物是包括两个或更多个隔室，优选地三个或更多个隔室的多隔室小袋的形式。

3.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述蛋白酶存在于所述凝胶组分中。

4.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述组合物包含漂白剂，其中所述漂白剂存在于所述粉末组分中。

5.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述变体包含

(i)位置M122L处的突变；和

(ii)位置126、127、128、211和212处的一个或多个突变。

6.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述变体包含位置126、127、128、211和212处的两个或更多个突变，优选地包含位置126、127、128、211和212处的三个或更多个突变，优选地包含位置126、127、128、211和212处的四个或更多个突变，优选地包含位置126、127、128、211和212处的五个突变。

7.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述变体包含选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的一个或多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的两个或更多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的三个或更多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的四个或更多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的五个突变。

8.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述变体包含突变M122L、S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q。

9.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述变体包含与所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

10.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述变体衍生自与SEQ ID NO:1具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的亲本或参考多肽。

11.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述组合物包含选自由以下项组成的组的锰漂白催化剂：1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me-TACN)、1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me/Me-TACN)以及它们的混合物。

12.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述组合物包含选自以下项的一种或多种其他酶：酰基转移酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、分散酶、内切葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、氨基己糖苷酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪分解酶、脂氧合酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、PET酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、另外的蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶和木糖苷酶；以及它们的组合。

13.根据实施方案12所述的组合物，其中所述一种或多种酶包括选自由以下项组成的组的淀粉酶：AA707、AA560、AAI10、SP722、BspAmy24和CspAmy1，以及它们的变体，以及它们的组合。

14.根据实施方案13所述的组合物，其中所述一种或多种酶包含亲本α-淀粉酶的重组的非天然存在的变体，所述变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:3具有95％同一性并且相对于SEQ ID NO:3在位置51和125处具有氨基酸取代。

实施例

实施例1

BG46枯草杆菌蛋白酶变体的表达

在SEQ ID NO:1中提供了吉氏芽孢杆菌Bgi02446野生型枯草杆菌蛋白酶(BG46)。在该研究中，具有取代S039E、S099R、S126A、D127E和F128G(SEQ ID NO:2)的BG46枯草杆菌蛋白酶变体被用作进一步取代变体的工程化的起点，并且被称为BG46+S039E-S099R-S126A-D127E-F128G。使用DNA片段表达所有BG46枯草杆菌蛋白酶变体，该DNA片段按连续顺序包含：含有枯草芽孢杆菌rrnIp2启动子序列变体(枯草芽孢杆菌rrnIp2启动子和工程化变体更完整地描述于专利申请WO2020112609中)的5'AprE侧翼区(SEQ ID NO:3)；编码aprE信号肽序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)；编码迟缓芽孢杆菌前肽的核苷酸序列(SEQ IDNO:5)；对应于编码成熟BG46枯草杆菌蛋白酶的基因的序列；BPN'终止子(SEQ ID NO:6)；包括卡那霉素抗性基因表达盒的3'AprE侧翼序列(SEQ ID NO:7)。使用标准分子生物学技术组装该DNA片段。表达盒的线性DNA用于转化合适菌株的感受态枯草芽孢杆菌细胞。

将转化混合物铺在含有1.6％脱脂奶和1.8ppm卡那霉素的LA平板上，并在37℃下温育过夜。挑取单个菌落并于37℃下在Luria液体培养基中在抗生素选择下生长。

对于蛋白表达实验，将转化的细胞在96孔微量滴定板(MTP)中在培养基(基于MOPS缓冲液的富集的半限定培养基，以尿素作为主要氮源，以葡萄糖作为主要碳源，补充有1％大豆胨用于稳健的细胞生长，含有抗生素选择)中于32℃、300rpm、80％湿气下在振荡培养箱中生长3天。在离心和过滤之后，将含有所关注蛋白酶的澄清的培养上层清液用于测定。

实施例2

测定

蛋白质测定

通过UHPLC使用Zorbax 300 SB-C3柱和0.1％三氟乙酸(溶液A)和0.07％三氟乙酸的乙腈溶液(溶液B)的线性梯度并在220nm处检测来测定培养上层清液中BG46枯草杆菌蛋白酶变体的浓度。培养上层清液在10mM NaCl、0.1mM CaCl₂、0.005％中稀释，用于上样到柱上。使用经纯化的亲本酶的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。

蛋白酶活性

通过测量AAPF-pNA合成肽底物的水解来测试BG46枯草杆菌蛋白酶变体的蛋白酶活性。

对于AAPF测定，使用的试剂溶液为：100mM Tris pH 8.6、10mM CalCl₂、0.005％(Tris/Ca缓冲液)和160mM处于DMSO中的suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA储备溶液)(Sigma：S-7388)。为了制备工作溶液，将1mL suc-AAPF-pNA储备溶液添加至100mLTris/Ca缓冲液并混合。将酶样品添加至含有1mg/mL suc-AAPF-pNA工作溶液的微量滴定板(MTP)，并且使用SpectraMax读板机在室温(RT)下以动力学模式在405nm处测定3min至5min内的活性。蛋白酶活性以mOD/min表示。

Tris-EDTA中的稳定性测定

通过在应力缓冲液中稀释BG46枯草杆菌蛋白酶变体并且在热温育步骤之前和之后使用上述AAPF测定测量变体的蛋白水解活性来测量本文所述变体的稳定性。选择热温育步骤的温度和持续时间，使得参考蛋白酶显示出约15-30％的残余活性。将样品在384孔热循环仪中在60℃下温育5min。在Tris-EDTA(50mM Tris pH 9；5mM EDTA；0.005％-80)缓冲条件下测量稳定性。通过取应激条件与非应激条件的mOD/min比率并乘以100，将稳定性结果计算为每个酶样品的剩余活性百分比(％)。

实施例3

例示性实施例

凝胶相组合物

固相组合物

	质量％
		柠檬酸盐、钠盐	10-60
磷酸盐	0-10
		MGDA、钠盐	0-50
二硅酸盐、钠盐	5-40
		碳酸钠	10-50
银保护	0.0-1.0
		过碳酸钠	5-20
漂白催化剂	0.02-0.5
		漂白活化剂	1-5
非离子表面活性剂	2.5-10
		聚羧酸酯	4-10
阳离子共聚物	0-0.75
		崩解性	0-1.5
蛋白酶	1.5-5
		淀粉酶	0.5-3
香料	0.05-0.25
		染料溶液	0.0-1
锌盐	0.1-0.3
		硫酸钠	0.0-10
水	0-10
		pH值控制	0-1.5
加工助剂	0-5

固相和凝胶相可根据需要合并。凝胶相的空间构型可通过固相的空间构型和可商购获得的或自设计的模具来预定，该凝胶相在各成分混合之后是液体并且在最多10分钟的凝固时间内是尺寸上稳定的。开口小袋形式的水溶性包装材料可通过深拉含PVOH的膜来生产。可将液体组合物倒入所述开放腔中并在固化之后产生凝胶相，然后可将自由流动固体形式的固相倒入包含聚乙烯醇的小袋中。可将1.0g液体非离子表面活性剂Genapol EC50计量到所得颗粒表面上。非离子表面活性剂的比例可显著增加而不改变其他相。开口小袋可通过施用第二膜并通过热密封来密封。所制备的清洁剂部分的特征可在于吸引人的美学。

本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围两者。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。

Claims (14)

1.一种自动盘碟洗涤组合物，所述自动盘碟洗涤组合物包含表面活性剂和蛋白酶，

其中所述自动盘碟洗涤组合物是包括隔室的水溶性单位剂量小袋的形式，其中所述隔室包含粉末组分和凝胶组分两者，

其中所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体相对于SEQ ID NO:1包含：

(i)位置122处的突变；和

(ii)位置126、127、128、211和212处的一个或多个突变，

并且其中所述变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％同一性。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是包括两个或更多个隔室、优选地三个或更多个隔室的多隔室小袋的形式。

3.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述蛋白酶存在于所述凝胶组分中。

4.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物包含漂白剂，其中所述漂白剂存在于所述粉末组分中。

5.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述变体包含

(i)位置M122L处的突变；和

(ii)位置126、127、128、211和212处的一个或多个突变。

6.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述变体包含位置126、

127、128、211和212处的两个或更多个突变，优选地包含位置126、127、128、211和212处的三个或更多个突变，优选地包含位置126、127、128、211和212处的四个或更多个突变，优选地包含位置126、127、128、211和212处的五个突变。

7.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述变体包含选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的一个或多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的两个或更多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的三个或更多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的四个或更多个突变，优选地选自S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q的五个突变。

8.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述变体包含突变M122L、S126A、D127E、F128G、M211Q和N212Q。

9.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述变体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

10.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述变体衍生自与SEQID NO:1具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、

88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的亲本或参考多肽。

11.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物包含选自由以下项组成的组的锰漂白催化剂：1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me-TACN)、1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me/Me-TACN)以及它们的混合物。

12.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物包含选自以下项的一种或多种其他酶：酰基转移酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、分散酶、内切葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、氨基己糖苷酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪分解酶、脂氧合酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、PET酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、另外的蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶和木糖苷酶；以及它们的组合。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述一种或多种酶包括选自由以下项组成的组的淀粉酶：AA707、AA560、AAI10、SP722、BspAmy24和CspAmy1、以及它们的变体、以及它们的组合。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述一种或多种酶包含亲本α-淀粉酶的重组的非天然存在的变体，所述变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:3具有95％同一性并且相对于SEQID NO:3在位置51和125处具有氨基酸取代。