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DE69132422T3 - Xylanaseproduktion - Google Patents

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DE69132422T3
DE69132422T3 DE69132422T DE69132422T DE69132422T3 DE 69132422 T3 DE69132422 T3 DE 69132422T3 DE 69132422 T DE69132422 T DE 69132422T DE 69132422 T DE69132422 T DE 69132422T DE 69132422 T3 DE69132422 T3 DE 69132422T3
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DE
Germany
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xylanase
cell
gene
plasmid
awamori
Prior art date
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Application number
DE69132422T
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DE69132422D1 (de
DE69132422T2 (de
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F. Robert VAN GORCOM
G. Johanna HESSING
Jan Maat
Martinus Roza
Maria Johannes VERBAKEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zenbury International Ltd Ireland
Original Assignee
Kerry Group Services International Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=19857272&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69132422(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Kerry Group Services International Ltd filed Critical Kerry Group Services International Ltd
Publication of DE69132422D1 publication Critical patent/DE69132422D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69132422T2 publication Critical patent/DE69132422T2/de
Publication of DE69132422T3 publication Critical patent/DE69132422T3/de
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
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Description

  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie. Die Erfindung betrifft insbesondere ein rekombinantes DNA-Material, umfassend eine Nucleotidsequenz, die Xylanase von Aspergillus niger Var. awamori mit brotverbessernder Aktivität kodiert, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, welche die Nucleotidsequenz von 1 und äquivalente Nucleotidsequenzen umfaßt, so daß
    • – die äquivalente Nucleotidsequenz entweder einer Nucleotidsequenz entspricht, welche die Aminosäuresequenz von 1 oder die reife Form kodiert.
  • Eine transformierte Zelle, die solches rekombinantes DNA-Material umfaßt, wird ebenfalls vom Umfang der Erfindung umfaßt. Dies gilt auch für eine transformierte Zelle, die sich zur Verwendung in einem Verfahren eignet, worin ein cellulose- und/oder hemicelulosehaltiges Rohmaterial in einer funktionellen Weise, die an sich für die nichttransformierte Wirtszelle bekannt ist, verwendet wird, wobei die Zelle bei Expression der rekombinanten DNA, welche die Xylanase kodiert polyfunktionell wird und anschließend mindestens die reife Form der Xylanase mit brotverbessernder Wirkung ausscheidet, wodurch die Zersetzung von Xylan möglich wird.
  • Ein Verfahren zur Herstellung einer Xylanase umfassend eine Aminosäuresequenz nach 1, welches die Kultivierung einer Zelle gemäß der Erfindung in einem geeigneten Nährmedium und gegebenenfalls die Isolierung des resultierenden Enzyms umfaßt, stellt ebenfalls eine Ausführungsform der Erfindung dar. Brotverbesserungszusammensetzungen umfassend die Zelle gemäß der Erfindung werden ebenfalls als Teil der Erfindung beansprucht. Die neuen Produkte führen auch zu verbes serten Verfahren zur Herstellung eines Backprodukts durch Backen einer Mehlzusammensetzung, das Verwendung der Brotverbesserungszusammensetzung gemäß der Erfindung umfaßt, und verbesserte Prozesse zur Verarbeitung eines cellulosehaltigen Materials, um Bier, Papier, Stärke, Gluten etc. herzustellen, oder zur Zersetzung von cellulose- und/oder hemicellulosehaltigem Abfall, und die Erfindung ist auf eine Zelle gerichtet, die eine bestimmte Funktion in einem Verfahren besitzt, welche die rekombinante DNA enthält, die wenigstens ein Enzym kodiert. Die Erfindung betrifft insbesondere eine Zelle mit einer Funktion auf dem Gebiet der Nahrungsmittelverarbeitung und auch Zellen mit einer Funktion in Verfahren, in denen ein cellulosehaltiges Rohmaterial eingesetzt wird, wie z. B. Verfahren zur Herstellung von Bier, Papier, Stärke, Gluten etc., und Verfahren zur Zersetzung von cellulosehaltigem Abfall wie z. B. landwirtschaftlicher Abfall, Abfall aus Papierfabriken etc.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung Zellen mit einer Funktion im Fermentationsprozeß, konkreter Zellen mit einer Funktion im Verfahren zur Herstellung von Backprodukten.
  • Die erfindungsgemäße Zelle ist dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle für das Verfahren, in dem sie eine Funktion besitzt, bei Expression der rekombinanten DNA der Erfindung, polyfunktionell wird. Beispielsweise wird im Falle eines Fermentationsverfahrens, wie z. B. der Herstellung von Brot, Hefe als Zelle mit einer speziellen Funktion in diesem Verfahren eingesetzt. Eine Hefezelle gemäß der Erfindung weist nicht nur ihre normale Funktion auf, d. h. eine Funktion, welche eine Hefe, der die rekombinante DNA fehlt, ebenfalls ausüben kann, sondern hat in diesem Verfahren der Brotherstellung auch noch eine weitere Funktion. Ein Beispiel einer solchen zusätzlichen Funktion ist die Expression und Ausscheidung mindestens der reifen Form der Xylanase.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine Zelle mit einer Funktion bei der Herstellung von Backprodukten. Zellen, die rekombinaten DNA, kodierend für Enzyme, die aus der Gruppe von Enzymen mit amylolytischer und/oder hemicellulolytischer und/oder cellulolytischer Aktivität ausgewählt sind, enthalten, sind geeignet.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Xylanase durch eine polyfunktionelle Zelle wie oben beschrieben, umfassend die Kultivierung einer solchen polyfunktionellen Zelle in einem geeigneten Nährmedium und gegebenenfalls Isolierung der resultierenden Enzymform. In einem solchen Verfahren ist das Enzym vorzugsweise aus der Gruppe von Enzymen mit amylolytischer und/oder hemicellulolytischer und/oder cellulolytischer Aktivität ausgewählt. Ein geeignetes Medium zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung kann aus dem Medium bestehen, in dem das Verfahren, für welches die Zelle polyfunktionell ist, durchgeführt wird. Bei dem Verfahren zur Herstellung eines Backprodukts kann das Medium beispielsweise der Teig sein, der gebacken werden soll. Natürlich können auch die anderen üblichen Medien zur Kultivierung von Zellen eingesetzt werden. Die Wahl der Medien wird davon abhängen, ob das Enzym in situ eingesetzt werden soll oder isoliert werden muß. In einigen Fällen wird es ausreichen, das Medium zu verwenden, welches das Enzym enthält, und in anderen Fällen wird das Enzym aus dem Medium zu isolieren sein.
  • Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer solchen polyfunktionellen Zelle, z. B. in den oben beschriebenen Verfahren, wie Nahrungsmittelverarbeitung und Verfahren, die ein cellulosehaltiges Rohmaterial verwenden, vorzugsweise in einem Verfahren zur Herstellung eines Backprodukts.
  • Mehl, Hefe, Wasser und Salz sind die Grundbestandteile von Brot und anderen Backprodukten. Über Jahrhunderte hinweg wurden Materialien, die eine posi tive Wirkung auf die Handhabbarkeit des Teiges oder die Qualität des Backprodukts besitzen, bei der Herstellung von Brot und ähnlichen Backprodukten, aus Gründen der Bequemlichkeit im folgenden als "Brotherstellung" bezeichnet, zugesetzt. Diese Additive, als "Brotverbesserer" bezeichnet, enthalten Enzyme aus Malz oder mikrobiellen Ursprungs, welche eine wichtige Rolle in den verschiedenen Stadien der Brotherstellung spielen, nämlich der Herstellung des geschlagenen Brotteiges, der Fermentation, dem Backen und der Lagerung des Brotprodukts.
  • Eines der relevanten Charakteristika von Brot welches durch Zusatz spezieller Enzyme beeinflusst wird, ist das sogenannte Brotvolumen. Zum Erhalt eines hohen Brotvolumens in der Praxis werden Zusammensetzungen, die cellulolytische, hemicellulolytische und/oder amylolytische Enzyme enthalten, zugesetzt. Die im Handel erhältlichen Zusammensetzungen mikrobiellen Ursprungs, meistens von einem Pilz von einer der Gattungen Aspergillus und Trichoderma stammend, sind im wesentlichen ungereinigte komplexe Mischungen unterschiedlicher Enzymaktivitäten, wodurch nicht genau bekannt ist, welche Enzyme in der Zusammensetzung vorliegen und welche eine brotverbessernde Wirkung aufweisen. Dieses fehlende Wissen verhindert eine weitere Brotverbesserung und verhindert insbesondere die Steuerung der verschiedenen Teigverarbeitungs- und Broteigenschaften, wie z. B. das Brotvolumen.
  • Eine weitere Untersuchung des Verfahrens zur Herstellung von Backprodukten führte zu der Entdeckung, daß neben α-Amylase mindestens ein Xylanase-Enzym für das Brotvolumen ebenfalls von Bedeutung ist. Eine Xylanase ist ein Enzym, welches die Zersetzung von Xylanen, die im Pentoseanteil von Stärke"Tailings" vorkommen, katalysiert. Der Begriff "Tailings" betrifft einen Anteil von, z. B., Weizenstärke, der aus wasserunlöslicher Hemicellulose (Pentosane und Arabinoxylane) und beschädigter Stärke besteht. Dieser Anteil wird als Zwischen- oder Oberschicht des Stärkepellets während der Zentrifugation einer Teigsuspension gebildet, welche durch Waschen des Teigs, um den Glutenanteil zu entfernen, erhalten wurde.
  • In der Literatur wurden bereits verschiedene Xylanasen, einschließlich Xylanasen der Bakterienspezies Bacillus pumilus (Panbangred et al., Mol. Gen. Genet. 192, 335–341, 1983, und Fukusaki et al., FEBS Lett. 171, 197–201, 1984), Bacillus subtilis (Paice et al., Arch. Microbiol. 144, 201–206, 1986) und Bacillus circulans (Yang et al., Nucl. Acids Res. 16, 7187, 1988), der Hefe Aureobasidium (Leathers, Biotech. Lett. 10, 775–780, 1988) und des Pilzes Aspergillus niger (Fournier et al., Biotechnology and Bioengineering 27, 539–546, 1985), beschrieben.
  • Aus der europäischen Patentanmeldung EP-A-0338452 ist bekannt, daß die Eigenschaften von Teig und die Qualität von Brot verbessert werden können durch die Zugabe verschiedener Enzymzusammensetzungen zum Teig, einschließlich einer Enzymzusammensetzung, die Hemicellulose abbauende Aktivität oder Xylanase-Aktivität aufweist, wobei deren Ursprung nicht weiter spezifiziert ist. Eine solche hemicellulolytische Enzymzusammensetzung ist eine relativ undefinierte Enzymmischung, die verschiedene hemicellulolytische Enzyme mit unterschiedlichen Wirkungen auf die Teig- und Broteigenschaften enthalten kann. Die Anwesenheit von Xylanasen mit brotverbessernder Wirkung in kleinerem oder größerem Umfang ist das zufällige Ergebnis der Art und Weise, auf welche die Enzymzusammensetzung, die als Brotverbesserer dienen soll, erhalten wurde. Eine kontrollierte weitere Optimierung von Brotverbesserern war jedoch nicht möglich aufgrund des Fehlens des erforderlichen Wissens und geeigneter rekombinanter DNA-Konstrukte, kodierend für eine Xylanase mit brotverbessernder Wirkung, welche zu einer hohen Produktion einer solchen Xylanase eingesetzt werden konnten.
  • Für den Zweck dieser Erfindung soll "brotverbessernde Wirkung" im allgemeinen eine günstige Wirkung auf irgendeine Eigenschaft des hergestellten Backprodukts (einschließlich Brot) oder den Teig, aus dem das Back- oder Brotprodukt hergestellt wird, bedeuten und soll insbesondere eine günstige Wirkung auf das Brotvolumen bedeuten.
  • Die Forschung, auf welcher die Erfindung beruht, wurde auf die Identifizierung und Klonierung eines Gens (xylA), kodierend für ein Enzym, Xylanase mit brotverbessernder Wirkung, das von einem Pilz der Spezies Aspergillus niger Var. awamori stammt, ausgedehnt sowie auf die Transformation unterschiedlicher Spezies von Wirtszellen in solcher Weise, daß das Gen in diesen Wirtszellen exprimiert wird oder exprimiert werden kann. Die Erfindung umfaßt rekombinantes DNA-Material wie in den Ansprüchen definiert.
  • Der Begriff "reifende Form" bezieht sich auf die verschiedenen Formen, in denen das Enzym nach der Expression des assoziierten Gens auftreten kann, nämlich sowohl auf die natürlich vorkommenden als auch die nicht natürlich vorkommende Präpro-Form und auf die endgültige reife Form des Enzyms, die nach der Abspaltung eines "Leader"-Peptids resultiert.
  • Die Erfindung betrifft rekombinantes DNA-Material, umfassend DNA mit einer Nucleotidsequenz, die eine Xylanase mit einer Aminosäuresequenz wie in 1 gezeigt kodiert, und insbesondere rekombinantes DNA-Material, umfassend DNA mit einer Nucleotidsequenz, die eine reifende Form von Xylanase kodiert, wie in 1 gezeigt. Die Erfindung betrifft auch rekombinantes DNA-Material, umfassend DNA mit einer Nucleotidsequenz, die eine reifende Form von Xylanase, wie oben definiert, mit einer zu der Nucleotidsequenz von 1 äquivalenten Nucleotidsequenz mit Deletionen, Insertionen oder Änderungen im Vergleich zu der Nucleotidsequenz von 1 kodiert, so daß die Nucleotidsequenz mit Deletionen, Insertionen oder Änderungen entweder der Aminosäuresequenz wie in 1 gezeigt oder der reifen Xylanase wie in 1 gezeigt entspricht.
  • Darüber hinaus kann die rekombinante DNA viele andere Informationstypen enthalten, wie z. B. regulatorische Sequenzen (insbesondere einen Transkriptionspromotor) und einen Vektoranteil, der gewöhnlich mit einem oder mehreren Markergen(en) versehen ist. Diese anderen Informationstypen werden oft mit dem ausgewählten Wirt in Zusammenhang stehen. So werden beispielsweise der Vektor, die Markergene und die regulatorischen Sequenzen in Abhängigkeit von dem ausgewählten Wirt gewählt werden.
  • Die rekombinante DNA kann auch andere Gene enthalten, die im ausgewählten Wirt exprimiert werden sollen. Ein solches Gen kann vorteilhafterweise wenigstens ein weiteres Enzym kodieren, wobei das weitere Enzym amylolytische und/oder hemicellulolytische und/oder cellulolytische Aktivität aufweist.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zelle, welche genetisches Material enthält, das sich von erfindungsgemäßem rekombinantem DNA-Material wie oben definiert ableitet, und insbesondere eine solche Zelle, die zur Expression von wenigstens der reifenden Form von Xylanase, kodiert von diesem rekombinanten DNA-Material, in der Lage ist. Bevorzugt ist eine solche Zelle, die auch eine polyfunktionelle Zelle gemäß der Erfindung ist, und insbesondere eine solche polyfunktionelle Zelle, welche zur Expression des rekombinanten DNA-Materials, das für eine reifende Form der Xylanase wie oben definiert kodiert, unter Bedingungen, die im Rohmaterial während der Herstellung eines Backprodukts vorliegen, in der Lage ist.
  • Sowohl eine polyfunktionelle Zelle, enthaltend rekombinante DNA, die wenigstens ein Enzym gemäß der Erfindung kodiert, als auch eine Zelle, enthaltend rekombinantes DNA-Material, gemäß der Erfindung kodiert (sowie die Kombination davon) kann entweder eine Zelle sein, welche selbst das direkte Resultat einer Genmanipulation ist, oder eine Zelle, die in irgendeiner Weise von einer Zelle abstammt, welche durch eine solche Genmanipulation transformiert wurde. Die Erfindung erstreckt sich ferner sowohl auf lebende Zellen, als auch auf Zellen, die nicht mehr leben.
  • Im Prinzip kennt die Erfindung keine speziellen Beschränkungen hinsichtlich der Art der Zellen, wobei solche Zellen, die zur Expression einer reifenden Form von Xylanase fungalen Ursprungs in der Lage sind, bevorzugt sind. Die Zellen werden jedoch vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Pilzzellen, Hefezellen und Pflanzenzellen ausgewählt.
  • Bevorzugte Beispiele von hervorragend geeigneten Wirtszellen sind
    • (a) Pilzzellen von einer der Gattungen Aspergillus und Trichoderma, insbesondere Pilzzellen von einer der Spezies Aspergillus niger Var. niger, Aspergillus niger Var. awamori, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reisei und Trichoderma viride;
    • (b) Hefezellen von einer der Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula und Pichia, insbesondere Hefezellen von einer der Spezies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Hansenula polymorpha und Pichia pastoris;
    • (c) Pflanzenzellen einer Pflanzengattung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Weizen, Gerste, Hafer, Mais, Erbse, Kartoffel und Tabak, wie z. B. Pflanzenzellen von einer der Spezies Solanum tuberosum und Nicotiana tabacum; und
    • (d) Bakterienzellen von einer der Bakteriengattungen Bacillus, Lactobacillus und Streptococcus, wie z. B. Bakterien der Spezies Bacillus subtilis.
  • Zellen gemäß der Erfindung wie oben definiert (polyfunktionelle und/oder einfach rekombinante DNA enthaltend, die für eine reifende Form der Xylanase wie oben definiert kodiert) können als Mittel zur Vervielfältigung der rekombinanten DNA oder als Mittel zur Herstellung wenigstens eines Enzyms, das von der rekombinanten DNA kodiert wird, z. B. der reifenden Form von Xylanase, von Bedeutung sein.
  • Im Falle von Enzymprodukten ist es möglich, die Zelle einzusetzen, um Enzym zu produzieren, und entweder das Enzym aus dem Kulturmedium zu isolieren oder das Medium, welches das Enzym enthält, nach Entfernung der Zellen als solches zu verwenden, oder im Falle der polyfunktionellen Zellen die Zellen selbst zu verwenden, um das Enzym in situ in dem Verfahren zu produzieren, für das sie polyfunktionell sind.
  • Eine direkte Verwendung der Zellen selbst ist beispielsweise möglich, wenn der Wirtsstamm ohne Bedenken bei der Herstellung von Nahrungsmitteln eingesetzt werden kann, wie das bei verschiedenen Pilz-, Hefe-, Pflanzen- und Bakterienspezies der Fall ist. In Verbindung mit Brotherstellung können die Hefestämme, welche gemäß der vorliegenden Erfindung genetisch manipuliert sind, beispielsweise direkt eingesetzt werden.
  • Teilweise in Abhängigkeit vom gewählten Wirt wird das für Xylanase kodierende Gen entweder mit oder ohne in diesem Gen vorliegende(n) Introns eingesetzt werden, entweder mit seinen eigenen Transkriptionsterminationssignalen oder aus einem anderen Gen stammenden und entweder mit seiner eigenen Leader-Sequenz oder mit einer Signalsequenz, die von einem anderen Gen stammt. Zur Transformation von Hefe, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe), ist es bevorzugt, daß die Introns entfernt werden und daß die eigene Leader-Sequenz durch eine Signalsequenz ersetzt wird, die für Hefe geeignet ist, wie z. B. die Signalsequenz des Invertase-Gens, was ein korrektes Processing und Ausscheiden des reifen Proteins sicherstellt.
  • Die Entfernung von Introns ist nach Transformation von Bakterien, wie z. B. Bacillus subtilis, erforderlich. In diesem Fall kann z. B. die α-Amylase-Signalsequenz als Signalsequenz eingesetzt werden.
  • Geeignete Transformationsverfahren und geeignete Expressionsvektoren, die beispielsweise mit einem geeigneten Transkriptionspromotor, geeigneten Transkriptionsterminationssignalen und geeigneten Markergenen zur Selektion transformierter Zellen versehen sind, sind bereits für viele Organismen, einschließlich verschiedener Bakterien-, Hefe-, Pilz- und Pflanzenspezies, bekannt. Für Hefe sei beispielsweise auf Tajima et al., Yeast 1, 67–77, 1985 verwiesen, welche die Expression eines fremden Gens unter der Kontrolle des durch Galactose induzierbaren GAL7-Promotors in Hefe zeigen, und für Bacillus subtilis beispielsweise auf EP-A-0 157 441 , welche ein Plasmid pMS48, enthaltend den SPO2-Promotor als Expressionsvektor beschreibt. Für andere Möglichkeiten in diesen und anderen Organismen wird auf die allgemeine Literatur verwiesen.
  • Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung besteht aus einem Verfahren zur Herstellung einer reifenden Form einer Xylanase von Aspergillus-Ursprung, umfassend das Kultivieren einer polyfunktionellen Zelle gemäß der Erfindung, die zur Expression einer reifenden Form von Xylanase in der Lage ist und/oder einer Zelle, die zur Expression des rekombinanten DNA-Materials gemäß der Erfindung in der Lage ist, in einem geeigneten Nährmedium und gegebenenfalls das Isolieren der resultierenden reifenden Form von Xylanase. Der Begriff "Isolieren der resultierenden reifenden Form von Xylanase" umfaßt auch eine partielle Reinigung, bei der eine Enzymzusammensetzung gewonnen wird, welche die relevante Xylanase umfaßt.
  • Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind eine Brotverbesserungszusammensetzung umfassend eine transformierte Zelle gemäß der Erfindung, die eine polyfunktionelle Zelle gemäß der Erfindung sein kann. Die polyfunktionelle Zelle enthält rekombinantes DNA-Material, das für eine reifende Form der Xylanase, insbesondere die reife Xylanase, kodiert und ferner ein Gen enthält, das mindestens für ein weiteres Enzym kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Enzymen mit amylolytischer und/oder hemicellulolytischer und/oder cellulolytischer Aktivität, zusätzlich zu einer reifenden Form der Xylanase, insbesondere der reifen Xylanase.
  • Die Erfindung wird nun mit Hilfe einer ausführlichen Beschreibung der Identifizierung, Klonierung und Expression einer als Brotverbesserer geeigneten Xylanase erläutert werden. Bei der in den Beispielen beschriebenen experimentellen Arbeit wird der Pilzstamm Aspergillus niger Var. awamori CBS 115.52 (ATCC 11358) als Quelle für die Xylanase verwendet. Nach Untersuchungen, die von den Erfindern durchgeführt wurden, ist dieser Stamm nach Induktion mit Weizenkleie in der Lage, eine Xylanase mit brotverbessernden Eigenschaften zu produzieren, während das Kulturmedium eine α-Amylase-Aktivität, eine niedrige Glucanase-Aktivität und eine niedrige Protease-Aktivität unter diesen Induktionsbedingungen aufweist. Die Menge an Xylanase, die von dem Wildtypstamm produziert wird, ist jedoch zur Verwendung in einem kommerziellen Verfahren zu niedrig. Aus diesem Grund stellt die Erfindung auch Genmanipulationen bereit, welche eine biotechnische Produktion der Xylanase im kommerziellen Maßstab ermöglichen.
  • Die durchgeführte experimentelle Arbeit umfaßt die Isolierung des Gens, das für ein Xylanase-Enzym kodiert, (das xylA-Gen) aus einer Genbank von chromosomaler Aspergillus niger Var. awamori-DNA, erstellt in einem λ-Vektor. Für diese Isolierung wurde eine Sonde mit einer Zusammensetzung, die sich von der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten reifen Proteins, wie durch die Erfinder bestimmt, ableitet, hergestellt. Mit Hilfe dieser Sonde wurde eine Anzahl von λ-Klonen isoliert, welche möglicherweise das Gen enthielten. Ein DNA-Fragment aus diesen positiven λ-Klonen wurde subkloniert. Anschließend wurde die DNA-Sequenz eines Teils des klonierten chromosomalen DNA-Fragments bestimmt. Mit Hilfe dieser Ergebnisse und derjenigen einer mRNA-Analyse wurde die Länge des xylA-Gens, die Länge der mRNA und die Anwesenheit und Position eines Introns bestimmt. Aus den Daten konnte abgeleitet werden, daß das xylA-Gen für ein Protein von 211 Aminosäuren (eine Prä(pro)-Form) kodiert, worin dem reifen Protein von 184 Aminosäuren ein "Leader"-Peptid von 27 Resten vorangeht.
  • Drei Expressionsvektoren, enthaltend das Xylanase-Gen einschließlich des xylA-Terminators, wurden konstruiert. In einem dieser Vektoren gehen dem xylA-Gen seine eigenen Expressionssignale voran. In dem zweiten Vektor wurden die xylA-Expressionssignale (bis zu dem ATG-Codon) durch die konstitutiven Expressionssignale des Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (gpdA)-Gens von Aspergillus nidulans (siehe Punt et al., Gene 69, 49–57, 1988) ersetzt, während in dem dritten Vektor die induzierbaren Expressionssignale des Glucoamylase (glaA)-Gens von Aspergillus niger Var. niger dem xylA-Gen vorangehen. Alle Expressionsvektoren enthalten das Acetamidase (amdS)-Gen von Aspergillus nidulans als Selektionsmarker, wie von K. Wernars, "DNA mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus nidulans", Doktorarbeit, Landbouw Hogeschool Wageningen 1986, beschrieben. Mit Hilfe dieses Selektionsmarkers können Transformanten erhalten werden, worin der Vektor, und folglich auch das xylA-Gen, in großer Kopienzahl in dem Genom integriert ist.
  • Transformanten mit mehreren Kopien wurden durch Transformation der Aspergillus-Stämme A. niger Var. awamori und A. niger Var. niger N402 mit den obengenannten Expressionsvektoren erhalten. In Schüttelkolbenexperimenten wurde. die Produktion von Xylanase gemessen nach Kultivierung der resultierenden Transformanten in verschiedenen Medien. Die Ergebnisse (maximale Produktionsniveaus) sind in der unten angegebenen Tabelle A aufgeführt, worin die Xylanase-Aktivitat in 103 Einheiten (E) pro ml ausgedrückt ist. Eine Einheit ist definiert als diejenige Menge an Enzym, welche pro Minute eine Menge reduzierender Gruppen aus Xylan freisetzt, die 1 mg Xylose äquivalent ist. Tabelle A Überblick über die maximalen Xylanase-Produktionsniveaus in Schüttel kolbenexperimenten nach Kultivierung in verschiedenen Medien
    Stamm Promotor Xylan-reiches Medium Stärkekleie
    A. niger
    Var. awamori xyl A Ek. 15 0 0 14
    A. niger
    Var. niger N402 xyl A Ek. 5 n. b. n. b. 4
    A. niger
    Var. awamori xyl A Mk. 59 78
    A. niger
    Var. niger N402 xyl A Mk. n. b. 120
    A. niger
    Var. niger AB4.1 xyl A Mk. 36 140
    A. niger
    Var. awamori gpdA Mk. 20 32
    A. niger
    Var. niger N402 gpdA Mk. 11 12
    A. niger
    Var. awamori glaA Mk. 71 45
    A. niger
    Var. niger N402 glaA Mk. 54 72
    • Ek.: Einzelkopie-Wildtypstamm
    • Mk.: Mehrfachkopie-Transformanten
    • n. b: nicht bestimmt
  • Nach Induktion mit Xylan produzieren die "xylA"-Mehrfachkopie-Transformanten mit xylA-Promotor von A. niger Var. awamori und A. niger Var. niger N402 wesentlich mehr Xylanase als die Wildtypstämme A. niger Var. awamori und A. niger Var. niger. Daraus und aus den Daten, die bei der Molekularanalyse des Gens erhalten wurden, kann geschlossen werden, daß das klonierte Gen für eine funktionelle Xylanase kodiert. Ferner ist aus dem Obenstehenden ersichtlich, daß die Mehrfachkopie-Transformanten zur Überproduktion des aktiven Enzyms imstande sind. Bei Backtests weist diese Enzymzusammensetzung ebenfalls die gewünschten Eigenschaften auf.
  • Mehrfachkopie-Transformanten der Wirtsstämme mit dem heterologen gpdA- oder glaA-Promotor sind ebenfalls zu einer erhöhten Produktion von aktiver Xylanase in der Lage. In reichem Medium produzieren die "gpdA"-Transformanten eine deutlich größere Menge an Xylanase als der A. niger Var. awamori-Wildtypstamm. Jedoch sind die bei den durchgeführten Tests beobachteten Produktionsniveaus wesentlich niedriger als das Niveau, welches bei den Tests mit "xylA"-Mehrfachkopie-Transformanten erhalten wurde. Nach Induktion mit Stärke sind die Produktionsniveaus von "glaA"-Mehrfachkopie-Transformanten vergleichbar mit denjenigen von "xylA"-Mehrfachkopie-Transformanten in Xylan-Medium.
  • In Medium mit Weizenkleie produzieren die besten "xylA"-Mehrfachkopie-Transformanten von A. niger Var. awamori wesentlich mehr Xylanase als dies in Xylan-Medium der Fall ist. In diesem Medium erreichen die besten "xylA"-Transformanten von A. niger Var. niger N402 ein sehr hohes Xylanase-Produktionsniveau. Die am meisten produzierenden "gpdA"-Mehrfachkopie-Transformanten von sowohl A. niger Var. awamori als auch von A. niger Var. niger N402 in Kleie produzieren ebensoviel Xylanase wie in reichem Medium. In Medium mit Weizenkleie ist die Produktion durch "glaA"-Transformanten von A. niger Var. awamori niedriger als in Stärke. In diesem Medium produzieren jedoch die "glaA"-Transformanten von A. niger Var. niger N402 mehr als in Stärke.
  • Die durch Aspergillus niger Var. niger N402-Transformanten erreichte Produktion ist höher als diejenige von Aspergillus niger Var. awamori-Transformanten. Das Produktionsniveau der A. niger Var. awamori-Transformanten kann jedoch weiter erhöht werden durch Verwendung geeigneter Mutantenstämme von A. niger Var. awamori, wie z. B. A. niger Var. awamori #40, welcher eindeutig mehr Xylanase als der Wildtypstamm produziert. Die Mutante A. niger Var. awamori #40 wurde mittels Mutagenese von A. niger Var. awamori-Sporen und Selektion hinsichtlich Xylanase-Produktion erhalten. In Kleie-Medium produzierte die „xylA"-Transformante A. niger Var. awamori #40 190.000 E Xylanase, welches eine beträchtliche Zunahme gegenüber der am besten produzierenden A. niger Var. awamori-Transformante darstellt.
  • Weitere Experimente betrefffen die Isolierung und Verwendung der so produzierten Xylanase als. Brotverbesserer (siehe Beispiel II) und Expressionsexperimente in einem Hefestamm und einem Bakterium (Beispiele III bzw. IV). Demgegenüber demonstriert Beispiel V die Verwendung einer polyfunktionellen Hefe gemäß der Erfindung bei der Herstellung von Brot, wodurch diese Hefe während der Fermentation von magerem Brotteig Xylanase produziert.
  • Erläuterung der Figuren
  • 1 zeigt die DNA-Sequenz von einem Teil eines etwa 2,1 kb langen PstI-PstI-Fragments von Aspergillus niger Var. awamori, das in dem Plasmid pAW14B vorliegt, welches Fragment ein für eine Xylanase kodierendes Gen enthält, als das xylA-Gen bezeichnet. Das Translationsstartcodon und das Stopcodon sind doppelt unterstrichen. Das 49-bp-Intron ist unterstrichen. Der Anfang des reifen Proteins ist angezeigt. Die Aminosäuresequenz des Proteins (sowohl der Prä(pro)-Form als auch des reifen Proteins) ist, unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes, ebenfalls in 1 angegeben.
  • 2 zeigt die Restriktionskarte des Bereichs der genomischen DNA von A. niger Var. awamori, der das xylA-Gen umfaßt, in die Phagen λ-1 und λ-14 kloniert. Die verwendeten Abkürzungen stehen für: S: SalI; E: EcoRI; H: HindIII; P: PstI; B: BamHI; S#: SalI-Stelle, von dem Polylinker von λ-EMBL3 stammend; D: Sau3A. Der massive Balken zeigt ein PstI*-BamHI-Fragment von 1,2 kb an, das mit Xyl06 hybridisiert.
  • 3 zeigt das Plasmid pAW14B, erhalten durch eine Insertion eines A. niger Var. awamori-SalI-Fragments von 5,3 kb in pUC19.
  • 4 zeigt das Plasmid pAW14S, enthaltend das xylA-Gen mit seinem eigenen Promotor und amdS als Selektionsmarker.
  • 5 zeigt das Plasmid pAW14B-2, enthaltend eine Translationsfusion des xylA-Gens mit dem A. nidulans-gpdA-Promotor.
  • 6 zeigt das Plasmid pAW14S-2, enthaltend eine Translationsfusion des xylA-Gens mit dem Aspergillus nidulans-gpdA-Promotor und amdS als Selektionsmarker.
  • 7 zeigt das Plasmid pAW14S-3, enthaltend eine Translationsfusion des xylA-Gens mit dem Aspergillus niger-glaA-Promotor und amdS als Selektionsmarker.
  • 8 zeigt die Nucleotidsequenzen des DNA-Fragments BAK1 und der synthetischen Oligonucleotide, aus denen dieses Fragment aufgebaut ist.
  • 9 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pBAK1.
  • 10 zeigt die Nucleotidsequenzen des DNA-Fragments BAK2 und der synthetischen Oligonucleotide, aus denen dieses Fragment aufgebaut ist.
  • 11 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pBAK21.
  • 12 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR2901.
  • 13 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR2904.
  • 14 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR2921.
  • 15 zeigt die Nucleotidsequenzen des DNA-Fragments BAK4 und der synthetischen Oligonucleotide, aus denen dieses Fragment aufgebaut ist.
  • 16 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR2950.
  • 17 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR2951.
  • 18 zeigt die Nucleotidsequenz des in vitro amplifizierten S. cerevisiae-PGK-Promotors. In der doppelsträngigen Sequenz sind die Primer in Fettdruck dargestellt, das ATG-Startcodon befindet sich vor einem schattierten Hintergrund und die Restriktionsstellen EcoRI, BglII, BspMI und HindIII sind angezeigt.
  • 19 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR2918.
  • 20 zeigt die Nucleotidsequenzen des DNA-Fragments BAK5 und der synthetischen Oligonucleotide, aus denen dieses Fragment aufgebaut ist.
  • 21 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR2920.
  • 22 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR2922.
  • 23 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pUR2923.
  • BEISPIEL I
  • Klonierung und Charakterisierung des Xylanase-Gens (xylA) von Aspergillus niger Var. awamori
  • 1.1 Isolierung des Aspergillus niger Var. awamori xylA-Gens
  • Zur Isolierung des xylA-Gens aus chromosomaler DNA von Aspergillus niger Var. awamori wurden verschiedene Sonden, bestehend aus Mischungen von Oligonucleotiden, synthetisiert (Tabelle B). Die Zusammensetzung dieser Mischungen wurde aus der N-terminalen Aminosäuresequenz von gereinigtem Xylanase-Protein abgeleitet. Tabelle B Sonden, die von der N-terminalen Aminosäuresequenz des Xylanase-Proteins abgeleitet sind N-terminale Aminosäuresequenz des Xylanase-Proteins:
    Figure 00170001
    • X = A, G, C oder T
  • Xyl01: Eine Mischung von 256 Oligonucleotiden mit einer Länge von 23 Desoxynucleotiden, deren Sequenz komplementär zu demjenigen Teil des kodierenden Stranges ist, welcher für die Aminosäuren 5–12 kodiert.
  • Xyl04: Ein Oligonucleotid mit einer Länge von 47 Desoxynucleotiden, dessen Sequenz komplementär zu demjenigen Teil des kodierenden Stranges ist, welcher für die Aminosäuren 2–17 kodiert.
  • Xyl05: Eine Mischung von 144 Oligonucleotiden mit einer Länge von 23 Desoxynucleotiden, deren Sequenz komplementär zu demjenigen Teil des kodierenden Stranges ist, welcher für die Aminosäuren 10–17 kodiert.
  • Xyl06: Eine Mischung von 256 Oligonucleotiden mit einer Länge von 47 Desoxynucleotiden, deren Sequenz komplementär zu demjenigen Teil des kodierenden Stranges ist, welcher für die Aminosäuren 2–17 kodiert.
  • In Xyl05 und Xyl06 sind nicht alle Basen, welche möglicherweise auftreten können, an der dritten Position der Codons eingeführt, um nicht mehr als 256 Oligonucleotide in der Mischung zu erhalten.
  • Mit Hilfe von Southern-Blot-Analyse wurde festgestellt, daß bei Verdauungen von chromosomaler DNA – unter stringenten Bedingungen – nur eine Bande mit den eingesetzten Sonden hybridisiert. Bei dem EcoRI-, SalI- und BamHI-Verdau von Aspergillus niger Var. awamori-DNA hybridisiert eine Bande von 4,4, 5,3 bzw. 9,5 kb mit sowohl Xyl01, Xyl04 als auch Xyl06. Mit Xyl05 wurde kein klares Signal bei 41°C gefunden. Auf Grundlage dieses Ergebnisses wurde eine λ-Genbank von Aspergillus niger Var. awamori-DNA bei 65°C mit der Oligonucleotidmischung Xyl06 als Sonde hybridisiert. Von den 65.000 getesteten Plaques (entsprechend 32mal dem Genom) hybridisierten drei Plaques (λ-1, λ-14 und λ-63) mit dieser Sonde. Nach Hybridisierung von Verdauungen von λ-1- und λ-14-DNA mit Xyl06 wurde eine hybridisierende Bande von > 10 kb in dem EcoRI-Verdau von λ-1 gefunden. Die Größe der hybridisierenden Bande in dem λ-14-und dem chromosomalen EcoRI-Verdau betrug 4,4 kb. Bei dem SalI-Verdau von λ-1 hybridisiert eine 4,6-kb-Bande; bei dem SalI-Verdau von λ-14 ist dies, wie bei chromosomaler DNA, eine 5,3-kb-Bande. Ein 1,2-kb-PstI-BamHI-Fragment (2) hybridisiert auch mit Xyl06. Auf Grundlage der Restriktionsmuster mit verschiedenen Enzymen und Kreuzhybridisierung von λ-1- und λ-14-Verdauungen mit dem 5,3-kb-SalI-Fragment von λ-14 wurde bestätigt, daß diese λ's überlappende Fragmente des Genoms von Aspergillus niger Var. awamori enthielten. Ebenfalls bestätigte die homologe Hybridisierung von induzierter Gesamt-RNA mit λ-1, λ-14 bzw. dem 5,3-kb-SalI-Fragment von λ-14 die Anwesenheit von xylA-Sequenzen auf diesen λ's. Eine Hybridisierung wurde bei einer Xylan-induzierten mRNA von etwa 1 kb festgestellt. Deren Größe entspricht derjenigen des mRNA-Moleküls, welches mit Xyl06 hybridisiert.
  • 1.2 Subklonierung des A. niger Var. awamori-xylA-Gens
  • Die mit Xyl06 hybridisierenden SalI-Fragmente von λ-1 (4,6 kb) bzw. λ-14 (5,3 kb) wurden in beiden Orientierungen in die SalI-Stelle von pUC19 kloniert, was das Plasmid pAW1 (A und B) bzw. das Plasmid pAW14 (A und B, siehe 3) ergab. Das PstI-BamHI-Fragment von 1,2 kb, welches mit Xyl06 hybridisiert, und das benachbarte BamHI-PstI-Fragment von 1,0 kb aus pAW14A bzw. pAW1A wurden in M13mp18 und M13mp19, gespalten mit BamHI und PstI, subkloniert, was zu den m18/m19AW-Vektoren von Tabelle C führte. Tabelle C Einzelsträngige Subklone von λ-1- und λ-14-Fragmenten
    Fragment Resultierende Vektoren
    pAW1A BamHI-PstI* (1,2 kb) m18AW1A-1/m19AW1A-1
    pAW14A BamHI-PstI* (1,2 kb) m18AW14A-1/m19AW14A-1
    pAW1A PstI-BamHI (1,0 kb) m18AW1A-2/m19AW1A-2
    pAW14A PstI-BamHI (1,0 kb) m18AW14A-2/m19AW14A-2
  • 1.3 Bestimmung der Transkriptionsrichtung des xylA-Gens
  • Die Transkriptionsrichtung des xylA-Gens wurde im wesentlichen mittels Spot-Blot-Hybridisierung von ss-DNA von m18AW14A-1 bzw. m19AW14A-1 mit Xyl06 bestimmt. Es wurde festgestellt, daß ss-DNA von m19AW14A-1 (5'*PstI-BamHI3') mit dieser Sonde hybridisiert. Nachdem die Sequenz von Xyl06 gleich derjenigen des nicht-kodierenden Stranges ist, enthält m19AW14A-1 den kodierenden Strang. Auf dieser Grundlage wurde die in 2 gezeigte Transkriptionsrichtung bestimmt. Diese Richtung wird durch die Ergebnisse eines Primerverlängerungsexperiments bestätigt.
  • 1.4 Identifizierung des xylA-Gens
  • Die DNA-Sequenz eines Teils des Promotorbereichs wurde durch Sequenzanalyse von pAW14 mit Xyl06 als Primer (5'-Abschnitt des Gens) bestimmt. In diesem Bereich wurde ein Primer Xyl11 mit der Sequenz 5'-GCA TAT GAT TAA GCT GC-3' ausgewählt, womit die DNA-Sequenz des komplementären Stranges von m18AW14A-1 und m18AW1A-1 bestimmt wurde. Die Ergebnisse zeigten, daß diese Vektoren eine DNA-Sequenz enthielten, welche mit derjenigen von Xyl06 im wesentlichen identisch war, während die von der Basenpaarsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des reifen Xylanase-Proteins identisch war. Somit war die Klonierung von mindestens dem 5'-Ende des xylA-Gens erwiesen. Die Anwesenheit des vollständigen xylA-Gens in den Vektoren pAW14 und pAW1 schien auf Grundlage der Position am 5'-Ende des Gens auf den SalI-Fragmenten (2) und der Größe der xylA-mRNA (etwa 1 kb) plausibel.
  • 1.5 Sequenzanalyse
  • Die Basensequenz des xylA-Gens wurde in beiden Richtungen sowohl in dem m13AW14- als auch in dem m13AW1-Subklon mit Hilfe des Sanger-Didesoxy-Verfahrens (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5453–5467, 1977) bestimmt. Die Sequenz um die stromabwärts der PstI*-Stelle gelegene BamHI-Stelle herum (2) wurde durch Sequenzanalyse von doppelsträngiger pAW14- und pAW1-DNA bestimmt. Kompressionen werden durch Verwendung von dITP an Stelle von dGTP aufgeklärt. Bei den unabhängigen Klonen λ-1 und λ–14 ist eine identische xylA-Sequenz bestätigt. Die vollständige (kodierende) Sequenz des Prä(pro)-Xylanase-Gens ist in 1 dargestellt. Dem reifen Xylanase-Protein geht ein Leader-Peptid von 27 Aminosäuren voraus. Zwischen den Alaninresten an den Positionen 16 und 17 ist wahrscheinlich eine Spaltstelle für die Signalpeptidase vorhanden. Aus der Länge des Leader-Peptids kann geschlossen werden, daß eine zweite Prozessierungsstelle im Protein vorhanden ist. Die Spaltung der Bande zwischen Arg (27) und Ser (28) findet möglicherweise durch eine KEX2-ähnliche Protease statt.
  • 1.6 Lokalisierung des Introns
  • In dem xylA-Gen wurde ein Intron von 49 oder 76 bp (231–279 oder 231–306, siehe 1) auf Grundlage der Anwesenheit von Sequenzen vorausgesagt, die "Donor"- und "Akzeptor"-Stellen von Introns in Aspergilli entsprechen. Ein definitiver Beweis der Abwesenheit eines 76-bp-Introns wurde erhalten durch Isolierung eines Xylanase-Peptids mit der Sequenz Tyr-Ser-Ala-Ser-Gly... Dieses Peptid kann nur in dem Protein ab Position 302 lokalisiert sein (siehe 1).
  • 1.7 Bestimmung des 3'-Endes des xylA-Gens
  • Die Position des Stopcodons des xylA-Gens (Position 683 in 1) wurde aus DNA-Sequenzdaten abgeleitet. Dieses Stopcodon wurde bestätigt, da die Aminosäuresequenz eines Peptids identisch ist mit der C-terminalen Amino säuresequenz, die von DNA-Sequenzdaten abgeleitet wurde (Position 641–682 in 1).
  • 1.8 Beurteilung von DNA- und Proteindaten
  • Auf Grundlage der obigen Daten ist das Gen, welches für eine Xylanase von Aspergillus niger Var. awamori kodiert, auf einem 5,3-kb-SalI-Fragment kloniert. Die DNA-Sequenz des Gens, die Position des Introns und die Länge der mRNA wurden bestimmt. Die festgestellte N-terminale Aminosäuresequenz des reifen Proteins wurde durch die DNA-Sequenz vollständig bestätigt. Auf Grundlage der obigen Daten kann geschlossen werden, daß das xylA-Gen für ein Protein von 211 Aminosäuren kodiert und daß die ersten 27 Aminosäuren posttranslational entfernt werden. Die aus der DNA-Sequenz des xylA-Gens abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt einen hohen Grad an Homologie zu der Aminosäuresequenz von Xylanasen von Bacillus pumilus (201 Aminosäuren) und Bacillus circulans (213 Aminosäuren, einschließlich Signal).
  • 2. Expressionsvektoren
  • Drei Expressionsvektoren wurden konstruiert, die das genomische xylA-Gen vom Translationsstart bis einschließlich des xylA-Terminators enthielten. Diese Vektoren wurden von pAW14B abgeleitet (3).
  • 2.1 Vektor pAW14S mit einem Aspergillus niger Var. awamori-xylA-Promotor
  • Der Vektor pAW14S (4) umfaßt ein chromosomales 5,3-kb-DNA-Fragment von Aspergillus niger Var. awamori, auf dem sich das xylA-Gen mit seinen eigenen Expressionssignalen befindet. Ferner ist ein 5,3-kb-Fragment von Aspergillus nidulans, auf dem das Acetamidase (amdS)-Gen lokalisiert ist, auf diesem Plasmid vorhanden. In pAW14S weisen das amdS- und das xylA-Gen die gleiche Transkriptionsrichtung auf.
  • 2.2 Vektor pAW14S-2 mit einem Aspergillus nidulans-gpdA-Promotor
  • Das Plasmid pAW14S-2 (6) unterscheidet sich von pAW14S darin, daß das Aspergillus niger Var. awamori-Fragment, das stromaufwärts des ATG-Codons des xylA-Gens liegt, durch die konstitutiven Expressionssignale (bis zu dem ATG-Triplett) des Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (gpdA)-Gens von Aspergillus nidulans ersetzt ist. In dem Plasmid weisen das amdS- und das xylA-Gen die gleiche Orientierung auf. Die richtige Verbindung zwischen dem gpdA-Promotor und dem ATG-Codon des xylA-Gens wurde mit Hilfe eines synthetischen DNA-Fragments erhalten. Bei der Konstruktion wurde das Plasmid pAW14B-2, worin der amdS-Selektionsmarker fehlt, ebenfalls erhalten (5).
  • 2.3 Vektor pAW14S-3 mit einem Aspergillus niger Var. niger-glaA-Promotor
  • Der Vektor pAW14S-3 (7) umfaßt die induzierbaren Expressionssignale des Glucoamylase (glaA)-Gens von Aspergillus niger Var. niger bis zu dem ATG-Codon, gefolgt von Aspergillus niger Var. awamori-Sequenzen, die am ATG-Triplett des xylA-Gens beginnen. Darüber hinaus umfaßt dieses Plasmid auch das Aspergillus nidulans-amdS-Gen als Selektionsmarker. Das amdS-Gen und das xylA-Gen weisen die gleiche Orientierung auf.
  • Mit Hilfe des amdS-Selektionsmarkers können Transformanten mit den drei obengenannten Plasmiden erhalten werden, worin der Vektor, und folglich auch das (gegebenenfalls hybride) xylA-Gen, in großer Kopienzahl in das Genom integriert wurde, um die Produktion des Xylanase-Proteins zu erhöhen.
  • 3. Transformation von Aspergillus
  • Die Transformationsfrequenz von Aspergillus niger Var. awamori variierte von 0,03 bis 0,23 (AW) Transformanten pro μg Vektor-DNA. Insgesamt resultierte dies in fünf AW14S (xylA-Promotor)-, vierzig AW14S-2 (gpdA-Promotor)- und acht AW14S-3 (glaA-Promotor)-Transformanten. Bei der fortgesetzten Untersuchung erwies es sich, daß verschiedene Transformanten ein abweichendes Wachstumsverhalten aufwiesen. Eine davon, AW14S #1, ergab richtig sporulierende (AW14S #1A) und schlecht sporulierende (AW14S #1B) Kolonien.
  • Die Transformation von Aspergillus niger Var. niger N402 lief effizienter ab als diejenige von Aspergillus niger Var. awamori. Bei pAW14S, pAW14S-2 und pAW14S-3 wurden 0,3, 0,3 bzw. 1 (AB) Transformante(n) pro μg DNA gefunden. Zwanzig pAB14S (xylA-Promotor)-, dreißig pAB14S-2 (gpdA-Promotor)- und sechzehn pAB14S-3 (glaA-Promotor)-Transformanten wurden ausgestrichen.
  • Eine Cotransformation von Aspergillus niger Var. niger pyrG AB4.1 mit pAW14S und dem Aspergillus niger Var. niger pyrG-Gen in pAB4.1 ergab 0,2 Transformanten pro μg pAW14S-DNA, wenn beide Marker selektioniert wurden. Nach der ersten Selektion auf amdS wurden zwei Transformanten pro μg DNA gefunden, während die Frequenz bei der ersten Selektion für pyrG etwa 20 μg pAW14S-DNA war. Es sah so aus, daß etwa 30% der Cotransformanten (AB4.1-14S) beide Marker besaßen. Sechs davon wurden weiter analysiert.
  • 4. Analyse von Mehrfachkopie-Transformanten
  • 4.1 Analyse von A. niger Var. awamori-"xylA"-Transformanten (AW14S) nach Kultivierung in einem Medium mit Xylan als Induktor
  • Nach der Kultivierung von AW14S-Transformanten mit Xylan als Induktor war das in dem Medium nach 10 Tagen erhaltene Xylanase-Produktionsniveau signifikant höher als mit dem Wildtypstamm Aspergillus niger Var. awamori. Nach Lagerung der Medien bei 4°C ist das Enzym vollkommen stabil. Die Produktionsniveaus in Xylan-Medium sind in der folgenden Tabelle D aufgeführt. Tabelle D Xylanase-Produktionsniveaus (in 103 E/ml) von AW14S-Transformanten nach unterschiedlichen Kulturperioden in Xylan-Medium bei 25°C
    Nr. 3 Tage 10 Tage
    1A 28 58
    2 21 56
    3 20 31
    4 25 58
    5 8 22
    Wt 5 13
  • 4.2 Analyse von Aspergillus niger Var. niger N402-"xylA"-(Co)transformanten (AB4.1-14S) nach Kultivierung in Medium mit Xylan als Induktor
  • Die Xylanase-Aktivität des Wirtsstammes Aspergillus niger Var. niger pyrG AB4.1 und von sieben AB14S-1-Pyr+-Cotransformanten wurde in Xylan-Medium nach 48 bzw. 72 Stunden Kultivierung bestimmt (siehe Tabelle E). Aspergillus niger Var. niger AB4.1 produziert wenig Xylanase (etwa 5.000 E). Für vier von sieben Cotransformanten wurde eine hohe Xylanase-Aktivität von etwa 30.000 E gefunden. Die anderen Cotransformanten produzierten etwas weniger Xylanase. Tabelle E Xylanase-Produktionsniveaus (in 103 E/ml) von AB4.1-14S- und AB14S-Transformanten nach unterschiedlichen Kulturperioden in Xylan-Medium bei 25°C
    AB4.1-14S 48 Stunden 72 Stunden
    #1 36 36
    #6 31 20
    #12 29 23
    #23 10 6
    #42 15 10
    #44 21 30
    #45 pyrG 22 18
    AW.Wt 3 7
    N402 3 5
    AB4.1 4 5
  • 4.3 Charakterisierung des überproduzierten Xylanase-Enzyms
  • Aus der stark erhöhten Xylanase-Aktivität im Medium von Mehrfachkopie-"xylA"-Transformanten von Aspergillus niger Var. awamori und Aspergillus niger Var. niger N402 läßt sich schließen, daß das klonierte Gen für Xylanase aus Aspergillus niger Var. awamori kodiert und daß die Transformanten zur Überproduktion von aktiver Xylanase imstande sind. Die Anwesenheit des gewünschten Produkts wurde durch proteinchemische Analyse des Mediums von AW14S #1A gezeigt. Ein dominierendes Protein war im Medium vorhanden. Der isoelektrische Punkt (pI) und die N-terminale Aminosäuresequenz dieser Hauptkomponente waren identisch mit denjenigen von gereinigter Xylanase aus Wildtyp-Aspergillus niger Var. awamori. Der gefundene pI-Wert entsprach dem Wert, der für das reife Protein von 184 Aminosäuren berechnet wurde, für das die Zusammensetzung von der DNA-Sequenz abgeleitet worden war. Bei Backtests erwies sich die produzierte Xylanase auch als im Besitz der gewünschten Eigenschaften.
  • 4.4 Analyse von "gpdA"-Transformanten von A. niger Var. awamori (AW14S-2) und A. niger. Var. niger (AB14S-2) nach Kultivierung in reichem Medium
  • Sechs AW14S-2-Transformanten wurden in reichem Medium kultiviert (Tabelle F). Nach zwei bis drei Tagen wurde eine Xylanase-Aktivität, die von 15.000 bis 20.000 E variierte, im Medium von drei Transformanten gefunden, während die anderen drei weniger als die Hälfte dieser Aktivität produzierten. Der Wildtyp-Stamm produziert keine Xylanase in reichem Medium. Darüber hinaus wurden 10 AB14S-2-Transformanten getestet. Drei davon produzierten etwa 11.000 E Xylanase nach 40 h, welches Niveau für wenigstens bis zu 72 Stunden aufrechterhalten wurde. Die anderen fünf produzierten weniger Xylanase-Enzym, während die Aktivität in dem Medium von #21B innerhalb von 24 Stunden von 9.000 auf 0 E fiel.
  • Es wurde gezeigt, daß das Produktionsmaximum der am besten produzierenden AW14S-2- und AB14S-2-Transformanten im allgemeinen reproduzierbar ist. Das Maximum wird jedoch nicht erreicht, wenn das Myzel in großen Globuli wächst, während ein höheres Maximum (19.000 statt 11.000 E) in einer von zwei parallelen Kulturen von AB14S-2 #5 gefunden wurde. Die Produktionsniveaus sind in Tabelle F aufgelistet.
  • Die Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, aktive Xylanase mit Hilfe einer Translationsfusion des gpdA-Promotors und des xylA-Gens zu produzieren. Die Produktion durch sowohl AW14S-2- als auch AB14S-2-Transformanten, reguliert durch den gpdA-Promotor in reichem Medium, ist jedoch geringer als die Xylanase-Produktion von "xylA"-Transformanten in Medium mit Xylan. Tabelle F Xylanase-Produktionsniveaus (in 103 E/ml) von AW14S-2- und AB14S-2-Transformanten nach unterschiedlichen Kulturperioden in reichem Medium bei 25°C
    AW14S-2 24 h 48 h 72 h
    #1 < 1 3 > 3
    #4 1 2 2
    #10 11 15 13
    #22Δ * 4 20 20
    #36 3 7 7
    #39 * 10 16 12
    AB14S-2 24 h 40 h 48 h 66 h 72 h
    #2 4 4 9
    #5Δ 3 11 11 11 12
    doppelt 15 16 19
    #7Δ 1 5 5 5 4
    #8 4 3 4
    #11 < 1 < 1 1 1 0
    #14 2 2 3
    #16Δ 3 10 10 11 10
    #17Δ 3 10 11 10 10
    #18 1 5 8 10 8
    #21B 4 8 9 00
  • Δ bei Wiederholung der Kultur gefundene Maxima; eine von zwei parallelen Kulturen von AB14S-2 #5 ergab ein höheres Maximum. In reichem Medium produzieren A. niger Var. awamori und die Transformante AW14S #4 keine Xylanase.
  • 4.5 Analyse von "glaA"-Transformanten von Aspergillus niger Var. awamori (AW14S-3) und Aspergillus niger Var. niger (AB14S-3) nach Kultivierung in Medium mit Stärke als Induktor
  • Einige AW14S-3-Transformanten und der Aspergillus niger Var. awamori-Wildtypstamm wurden in Stärke-Medium kultiviert (Tabelle G). Eine Xylanase-Aktivität von 67.000 E/ml wurde in dem Medium einer Transformante nach 90 Stunden Kultivierung gefunden, während zwei andere Transformanten bis zu 36.000 E/ml produzierten. Das Produktionsmaximum von sechs analysierten AB14S-3-Transformanten liegt einen Tag früher als dasjenige von AW14S-3-Transformanten. Nach 63 Stunden Kultivierung wurde eine Aktivität von 51.000 E/ml in dem Medium einer Transformante gefunden, zwei andere produzierten etwa 43.000 E/ml. Die Ergebnisse zeigen, daß die Translationsfusion zwischen dem glaA-Promotor und dem xylA-Gen in der richtigen Art und Weise vorgenommen ist. Sowohl AW14S-3- als auch AB14S-3-Transformanten produzieren im wesentlichen genausoviel Xylanase-Enzym in Stärke-Medium, reguliert durch den glaA-Promotor, als "xylA"-Transformanten in Medium mit Xylan. Tabelle G Xylanase-Produktionsniveaus (in 103 E/ml) der "glaA"-Transformanten AW14S-3 und AB14S-3 nach unterschiedlichen Kulturperioden (Stunden) in Stärke-Medium bei 25°C
    40 Stunden 63 Stunden 90 Stunden
    AW14S-3
    #1 37 37
    #2 4 14 15
    #4 8 31 36
    #7 16 49 67
    AB14S-3
    #4 23 51 29
    #5 19 37 21
    #7 23 44 18
    #8 17 28 32
    #14 21 43 19
    #16 6 21 10
  • 4.6 Analyse von "xylA"-Transformanten nach Kultivierung in Medium mit Weizenkleie
  • Aus den Ergebnissen (Tabellen H und I) ist ersichtlich, daß das Produktionsniveau, welches für AW14S #4 bei Kultivierung in Medium mit Weizenkleie beobachtet wird, höher ist als dasjenige in Xylan-Medium. Ein hohes Produktionsniveau wurde mit AB4.1-1.4S (#1 und #44)- und AB14S (#5 und #14)-Transformanten erhalten. Die mit diesen Transformanten erhaltene Xylanase-Aktivität wurde als so hoch wie 140.000 E/ml bestimmt. Dies bedeutet eine beträchtliche Erhöhung gegenüber der Produktion in Xylan-Medium (30.000 E/ml). Es scheint ferner, daß das Produktionsniveau dieser Aspergillus niger Var. niger-Transformanten auch nach Verlängerung der Kultivierungsperiode aufrechterhalten wird, wie dies früher bei Aspergillus niger Var. awamori-"xylA"-Transformanten in Xylan-Medium gefunden wurde.
  • 4.7 Analyse von "gpdA"-Transformanten nach Kultivierung in Medium mit Weizenkleie
  • AW14S-2 #22 und #39 produzierten bis zu 28.000 E/ml Xylanase. Die Transformanten AB14S-2 #5 und #17 produzierten relativ wenig Xylanase (Aktivität bis zu 15.000 E/ml) mit Weizenkleie, wie auch in reichem Medium gefunden wurde. Die Produktionsniveaus sind in den Tabellen H und I aufgelistet.
  • 4.8 Analyse von "glaA"-Transformanten nach Kultivierung in Medium mit Weizenkleie
  • Die getesteten AW14S-3 (#1 und #7)-Transformanten produzierten bis zu 25.000 bzw. 45.000 E/ml Xylanase in Medium mit Weizenkleie, welches für beide etwa 60–65% der in Stärke gefundenen Werte darstellt (Tabelle I). Mit AB14S-3 (#4 und #14)-Transformanten wurde jedoch eine höhere Produktion mit Weizenkleie als in Stärke festgestellt. Die bestimmten Produktionsniveaus sind 1,5 mal höher als in Stärke. Eine Produktion von 72.000 E/ml wurde mit AB14S-3 erhalten. Ein Wert von 66.000 E/ml wurde mit AB14S-3 #14 gefunden (Tabelle I). Tabelle H Xylanase-Produktionsniveaus (in 103 E/ml) einiger AW- und AB-"xylA"- und "gpdA"-Transformanten nach verschiedenen Kultivierungsperioden in kleiehaltigem Medium bei 25°C
    40 h 63 h 4 Tage 7 Tage 12 Tage
    Aw Wt 1 2 16 17
    AW14S #4 8 20 27 61 80
    AB14S #14 6 74 114 126 122
    AB4.1-14S #1 17 87 123 135 145
    AW14S-2 #22 17 22 22 34 33
    AW14S-2 #39 18 22 21 24 20
    AB14S-2 #5 13 15 11 8 8
    AB14S-2 #17 9 13 11 7 7
    Tabelle I Xylanase-Produktionsniveaus (in 103 E/ml) von AW- und AB-Transformanten nach unterschiedlichen Kulturperioden in Weizenkleie-Medium bei 25°C
    2 Tage 3 Tage 4 Tage 7 Tage 9 Tage 14 Tage
    Aw Wt 2 8 10 11
    N402 Wt 4 2 1
    AW14S
    #1A 18 39 51
    #4 34 67 76 76
    AB14S
    #5 45 80 100 111 109 118
    #14 45 77 79 100 92
    AB4.1-14S
    #1 95 90 73
    #44 121 144 148 145
    AW14S-2
    #22 22 29 29
    #39 17 26 28
    AB14S-2
    #5 15 14 12 -
    #17 10 11 9 -
    AW14-S-3
    #1 18 26 25
    #7 37 45 45 41
    AB14S-3
    #4 72 54 44 23 17
    #14 64 66 69 55 55 55
  • 4.9 Beurteilung der Ergebnisse
  • Die in Tabelle A zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß Mehrfachkopie-Transformanten von Aspergillus niger Var. awamori (AW14S) und Aspergillus niger Var. niger (AB14S) nach Induktion ihres eigenen xylA-Promotors mit Xylan bzw. Weizenkleie als Induktor zur Überproduktion von aktiver Xylanase imstande sind. Die Expression von Xylanase durch Mehrfachkopie-Transformanten von Aspergillus niger Var. awamori und Aspergillus niger Var. niger N402 mit dem xylA-Gen unter der Kontrolle des gpdA-Promotors (AW14S-2 bzw. AB14S-2) und dem glaA-Promotor (AW14S-3 bzw. AB14S-3) zeigt an, daß Xylanase in einem breiten Spektrum von Substraten produziert werden kann. Die Variabilität in den Produktivitäten zwischen den verschiedenen Transformanten kann das Ergebnis von Unterschieden in der Kopienzahl und/oder Unterschieden in der Integrationsstelle in das Genom sein. Natürlich könnten auch die Testbedingungen eine signifikante Auswirkung auf die Xylanase-Produktion haben. Zur Optimierung der Produktion werden jedoch Stämme bevorzugt werden, die eine relativ hohe Produktivität zeigen.
  • 5. Materialien und Methoden
  • 5.1 Stämme und Plasmide
  • In den Experimenten wurden die folgenden Stämme und Plasmide verwendet:
    • – Aspergillus niger Var. awamori-Stamm CBS 115.52, ATCC 11358;
    • – Aspergillus niger Var. niger-Stamm N402, eine cspA1-Mutante (kurze Conidiophoren) von Aspergillus niger Var. niger, ATCC 9029, CBS 120.49;
    • – Aspergillus niger Var. niger AB4.1, eine pyrG-Mutante von Aspergillus niger Var. niger N402, beschrieben von Van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206, 71–75, 1987;
    • – Escherichia coli-Stamm JM109 (hinsichtlich der Plasmidisolierung siehe Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103–119, 1985);
    • – Escherichia coli-Stamm NM539 (zur Konstruktion und Amplifizierung der Lambda-Genbank);
    • – Plasmid pGW325, enthaltend das amdS-Gen von Aspergillus nidulans, siehe K. Wernars, "DNA-mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus nidulans", Doktorarbeit, Agricultural University of Wageningen, 1986;
    • – Plasmid pAB4.1, enthaltend das pyrG-Gen von Aspergillus niger Var. niger N402, siehe Van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206, 71–75, 1987;
    • – Plasmid pAN52-1, beschrieben von Punt et al., Gene 56, 117–124, 1987; und Plasmid pAN52-6, beschrieben von P. J. Punt, J. Biotechn., in Druck;
    • – Vektor λ-EMBL3 (zur Konstruktion einer Aspergillus niger Var. awamori-Genbank), erhältlich von Promega Biotec.
  • Ein Escherichia coli-JM109-Stamm, enthaltend das Plasmid pAW14B, wurde bei dem Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) von Baarn, Niederlande, unter der Nummer CBS 237.90 am 31. Mai 1990 hinterlegt.
  • 5.2 Aspergillus-Transformation
  • Aspergillus niger Var. awamori-Protoplasten wurden aus Myzel mit Hilfe von Novozym 234 (NOVO) hergestellt. Die Ausbeute an Protoplasten betrug 1–5 × 107/g Myzel und die Überlebensfähigkeit betrug 3–8%. Mittels Transformation wurden 3–8 × 105 lebensfähige Protoplasten mit 5, 10 oder 20 mg Plasmid-DNA, welche zweimal einer CsCl-Reinigung unterzogen worden waren, inkubiert. Transformierte Protoplasten wurden auf osmotisch stabilisierten Selektionsplatten (Acetamid als Stickstoffquelle) ausplattiert und bei 25°C inkubiert. Nach 6–10 Tagen waren Kolonien sichtbar. Die Transformation von Aspergillus niger Var. niger N402 bzw. A. niger Var. niger AB4.1 wurde im Prinzip wie oben beschrieben durchgeführt. Im Falle von Aspergillus niger Var. niger-pyrG AB4.1 wurde jedoch Uridin dem Medium zugesetzt. Bei der Cotransformation von A. niger Var. niger AB4.1 wurde pAW14S- und pAB4.1-DNA in einem Gewichtsverhältnis von 4:1 gemischt; Transformanten wurden auf Acetamid-Platten mit Uridin (amdS-Selektion), ohne Uridin (amdS- und pyrG-Selektion) bzw. auf Minimalmedium-Platten mit Nitrat (pyrG-Selektion) selektioniert. Nach 4–5 Tagen wurden Kolonien sichtbar. (Co)transformanten wurden zweimal auf Acetamid-Platten ausgestrichen. Um große Mengen an Sporen zu erhalten, wurden Sporen von dem zweiten Ausstrich auf Platten mit reichem Medium ausgestrichen und 5–6 Tage lang bei 25–28°C inkubiert. Die resultierenden Sporen wurden als Suspension (108–109 Sporen/ml) aufbewahrt oder an Silicagel adsorbiert, so daß die Sporen für einen langen Zeitraum aufbewahrt werden können.
  • 5.3 Konstruktion einer A. niger Var. awamori-Genbank
  • Chromosomale DNA wurde aus Myzel von Aspergillus niger Var. awamori isoliert. Die hochmolekulare DNA wurde mit Sau3Al partiell gespalten, anschließend folgte die Isolierung von Fragmenten von 13–17 kb nach Elektrophorese auf einem 0,4%igen Agarosegel. Von diesen Fragmenten wurden 0,4 mg mit 1,2 mg λ-EMBL3-DNA ligiert, welche mit BamHI und EcoRI gespalten worden war. Die Ligierungsmischung wurde mit Hilfe eines in vitro-Verpackungssystems (Amersham) mit Phagenhüllen versehen. Durch Transduktion von E. coli NM539 wurde eine Genbank von etwa 154.000 Plaques erhalten. Diese repräsentierten etwa 75 × das Genom von A. niger Var. awamori. 65.000 Plaques wurden auf Nitrocellulosefilter überführt (in doppelter Ausführung).
  • 5.4 Hybridisierungsexperimente
  • Southern-Blot-Analyse: Die Hybridisierung von Verdauungen chromosomaler A. niger Var. awamori-DNA mit den radioaktiv markierten Oligonucleotidmischungen Xyl04 und Xyl06 (47-mere) wurde in 6 × SSC bei 68°C, 62°C bzw. 56°C durchgeführt; für Xyl01 und Xyl05 (23-mere) wurde eine Hybridisierungstemperatur von 41°C angewandt. Die gewählte Hybridisierungstemperatur lag mindestens 5°C unter der berechneten Schmelztemperatur. Bluts wurden bei der Hybridisierungstemperatur mit 5 × bzw. 3 × SSC gewaschen. Die Hybridisierung erfolgte bei 68°C in 6 × SSC, wobei die letzten Waschschritte bei derselben Temperatur mit 2 × bzw. 0,4 × SSC durchgeführt wurden.
  • Northern-Blot-Analyse: Nicht-induzierte Gesamt-RNA von A. niger Var. awamori wurde aus Myzel von Kulturen aus reichem Medium isoliert (nach 3 Tagen Kultivierung bei 25°C). Die induzierte RNA stammte aus Kulturen, in denen 1% Xylan oder 4% Weizenkleie als Induktor verwendet wurden. Myzel wurde aus den zuletzt genannten Kulturen nach unterschiedlichen Kulturperioden gewonnen. Nach 3 bzw. 6 Tagen wurde Myzel aus Medium mit Weizenkleie isoliert. Myzel aus Xylan-Medium wurde nach 6 bzw. 11 Tagen Kultivierung gewonnen. Die Hybridisierungsbedingungen waren mit denjenigen bei der Southern-Blot-Analyse identisch.
  • 5.5 Kultivierungsbedingungen
  • Medien: Xylan-Medium enthält 1% Xylan, 0,67% Hefeextrakt mit Aminosäuren (Difco) und 0,1% Casaminosäuren. Medium mit Weizenkleie besteht aus 4 g Weizenkleie in 50 ml Leitungswasser, wozu 50 ml einer Salzlösung (pH 5,0) bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (NH4)2SO4, 0,15% KH2PO4, 0,025% MgSO4 und 0,025% KCl zugegeben werden. Reiches Medium für Expressionstests ist Minimalmedium (0,05% MgSO4, 0,6% NaNO3, 0,05% KCl, 0,15% KH2PO4 und Spurenelemente) mit 1% Glucose, 0,2% Trypticase (BBL), 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Casaminosäuren und Vitamin. Stärke-Medium enthält 5% Stärke und 0,1% Glucose in Minimalmedium. Die Medien wurden 30 Min. lang bei 120°C sterilisiert. Medium (100 ml in einem 500-ml-Kolben) wurde mit 2 × 105 Sporen/ml angeimpft, gefolgt von Kultivierung in einem Luft-Inkubator (300 UpM) bei 25°C für unterschiedliche Zeiträume. Kulturen mit Weizenkleie als Induktor (Tabelle I) wurden mit 4 × 105 Sporen/ml angeimpft.
  • 5.6 Bestimmung von Xylanase-Aktivität in Medium von Aspergillus-Kulturen
  • Die Xylanase-Aktivität wurde bestimmt durch Feststellung der Bildung von reduzierenden Zuckern. Verfahren: Eine (verdünnte) Mediumprobe wurde zu 125 μl 2%igem Xylan (Sigma) in 0,5 M Natriumacetat, pH 5,0, bei 40°C zugegeben, gefolgt von Inkubation der Reaktionsmischung für 30 Min. bei 40°C. Die Reaktion wurde unmittelbar mit 0,5 ml 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure (DNS)-Reagens gestoppt, gefolgt von Auffüllen des Volumens mit Wasser bis zu 1 ml. Die Reaktionsmischung wurde 5 Min. lang bei 100°C erwärmt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die OD wurde bei 534 nm gegen eine Blindprobe bestimmt. Die Xylanase-Aktivitätsbestimmung einer Probe wurde mindestens zweimal durchgeführt. 0,5 M Natriumacetat, pH 5,0, wurde zur Verdünnung der Medien eingesetzt.
  • 5.7. Selektion von Transformanten
  • Bei der Analyse der vielen Transformanten wurden die Wirtsstämme und etwa 6 Transformanten aus einer Serie in reichem oder selektivem Medium kultiviert, dem folgte die Bestimmung des Xylanase-Produktionsniveaus. Zwei Transformanten aus jeder Serie, mit der höchsten Xylanase-Produktion, wurden erneut im gleichen Medium analysiert. Darüber hinaus wurde das Produktionsniveau dieser Transformanten in Medium mit Weizenkleie bestimmt.
  • 5.8 Konstruktion von Expressionsvektoren
  • pAW14S (mit dem Aspergillus niger Var. niger-xylA-Promotor): Der Expressionsvektor pAW14S (4) wurde konstruiert durch Insertion eines 5,0-kb-EcoRI-Fragments des Plasmids pGW325, auf dem sich das Aspergillus nidulans-amdS-Gen befindet, in die EcoRI-Stelle des Polylinkers von pAW14B (3). In pAW14S besitzen das amdS- und xylA-Gen dieselbe Transkriptionsrichtung.
  • pAW14S-2 (mit dem A. nidulans-gpdA-Promotor): das lineare 1,8-kb-Stul-NcoI-Fragment von pAN52-1, auf dem sich der A. nidulans-gpdA-Promotor (bis zu dem ATG-Triplett) befindet, wurde mit dem 7,2-kb-NcoI*-SmaI-Fragment von pAW14B, erhalten durch partielle Verdauung mit NcoI und vollständige Verdauung mit SmaI, ligiert. Die Transformation von E. coli JM109 führte zu der Isolierung des Plasmids pAW14B-1 (9,0 kb). Das 7,2-kb-NruI*-NcoI*-Fragment von pAW14B-1, erhalten durch partielle Verdauung mit NcoI und vollständige Verdauung mit NruI, wurde mit einem synthetischen Fragment (79 bp, Nucleotide Nr. 1–78 des kodierenden Stranges und Nucleotide Nr. 4–78 des Matrizenstranges), bestehend aus xylA-Sequenzen ab dem ATG-Triplett, ligiert, was pAW14B-2 (5) ergab. Das 5,0-kb-EcoRI-Fragment von pGW325 (Aspergillus nidulans-amdS-Gen) wurde in die nur einmal vorkommende EcoRI-Stelle von pAW14B-2 eingeführt, was pAW14S-2 ergab (6). Das amdS- und das xylA-Gen weisen die gleiche Orientierung in diesem Plasmid auf. Die Verbindung des gpdA-Promotors mit dem ATG-Codon des xylA-Gens sowie die Sequenz des synthetischen Fragments wurde mittels DNA-Sequenzanalyse verifiziert.
  • pAW14S-3 (mit dem glaA-Promotor von A. niger Var. niger N402): pAN52-6 wurde partiell mit Xmnl gespalten (3 Stellen). Das lineare 7,5-kb-Fragment, auf dem sich der glaA-Promotor von A. niger Var. niger N402 befindet, wurde isoliert. Nach der Spaltung dieses Fragments mit BssHII wurde ein 7,35-kb-BssHII-XmnI-Fragment mit einem synthetischen DNA-Fragment (etwa 150 bp) ligiert, welches enthielt das 3'-Ende des glaA-Promotors bis zu dem ATG-Triplett, gefolgt von dem xylA-Gen von dem ATG-Triplett bis zu der im Gen gelegenen NruI-Stelle mit einem BssHII-Terminus dahinter. Das so erhaltene Plasmid pAN52-6.URL wurde nach Auffüllen der NcoI-Stelle mit NcoI und mit NruI gespalten. Die DNA-Sequenz des synthetischen Fragments in pAN52-6.URL wurde überprüft. Der glaA-Promotor wurde durch Ligierung des 2,5 kb langen "aufgefüllten NcoI"-NruI-Fragments von pAN52-6.URL mit dem etwa 10 kb langen NruI-Fragment von pAW14S vor das xylA-Gen plaziert. Die Insertion dieses Fragments in der richtigen Orientierung ergab pAW14S-3 (7).
  • BEISPIEL II
  • Backtests
  • Die brotverbessernde Wirkung der Xylanase, welche nach Isolierung aus der Fermentationsbouillon erhalten worden war, wurde getestet durch Messen der Volumenerhöhung von belgischen Brötchen, die nach Zusatz von zunehmenden Mengen an Enzym und Teig gebacken wurden. Die Xylanase wurde wie folgt isoliert.
  • Die Aspergillus niger Var. awamori-Transformante AW14S.1A wurde 7 Tage lang in einem Medium mit 4% Weizenkleie in einem Fermenter kultiviert, der ein Betriebsvolumen von 8 l besaß. Die Xylanase-Produktion betrug etwa 85.000 E/ml. Die Pilzzellen wurden mittels Filtration durch ein Gazetuch entnommen. Ammoniumsulfat wurde dann unter Rühren bis zu 50 Gewichtsprozent 6 Liter Filtrat zugesetzt. Das Präzipitat wurde in einem Sorvall GSA-Rotor 20 Min. lang mit 10.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 500 ml destilliertem Wasser suspendiert und dann erneut mit 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann durch Ultrafiltration mit Hilfe einer Amicon PM10-Ultrafiltrationsmembrane auf ein Volumen von 60 ml konzentriert. Zur Entfernung des Ammoniumsulfats wurde die Ultrafiltration nach Verdünnung mit destilliertem Wasser auf 300 bzw. 600 ml zweimal wiederholt. Das schließlich erhaltene Material, das in einem Volumen von 50 ml vorlag, wurde dann gefriergetrocknet. Die Ausbeute betrug 4,8 g mit einer spezifischen Aktivität von 60.000 E/mg (56% über alle Schritte). Zur Verwendung in Backtests wurde die Xylanase mit Stärke auf eine Konzentration von 240 E/mg gemischt.
  • 600 ml Wasser, 20 g Salz, 20 g Zucker (Sucrose), 50 g Hefe (Koningsgist von Gist Brocades) und 0, 50, 100 oder 200 mg/kg Xylanase (240 E/mg) wurden zu 1000 g Weizenmehl Banket Extra (von Wessanen) zugegeben. Die Teigspezies wurden in einem Eberhardt-Kneter 10 Min. lang bei einer Teigtemperatur von 24°C geknetet. Nach 20 Min. Fermentation bei 28°C wurde der Teig geschlagen, in kleine Teigportionen von etwa 50 g aufgeteilt und erneut in einer Treibkammer 60 Min. lang bei 35°C bis 38°C fermentiert. Die Teigportionen wurden dann 20 Min. lang bei 230°C gebacken. Die spezifischen Volumina (in ml/g) wurden bestimmt, indem das Volumen (in ml), mit Hilfe des Samenverdrängungsverfahrens bestimmt, durch das Gewicht (in g) geteilt wurde.
  • Für ein Mittel von 10 Brötchen wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
    Enzymniveau 0 50 ppm 100 ppm 200 ppm
    spezifisches Volumen 6,8 7,9 8,7 8,9
  • Die gleichen Trends lassen sich feststellen, wenn darüber hinaus andere brotverbessernde Bestandteile wie Vitamin C, Fett, Emulgatoren und α-Amylase zugesetzt werden. Andere Eigenschaften wie Teigverarbeitung und Krumenstruktur werden durch Zugabe des Xylanase-Enzyms ebenfalls positiv beeinflußt.
  • BEISPIEL III
  • Herstellung von Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase durch Saccharomyces cerevisiae
  • Als Beispiel der heterologen Produktion von Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase durch Mikroorganismen wurden Expressionsvektoren zur Expression der Xylanase in Saccharomyces cerevisiae, reguliert durch den induzierbaren GAL7-Promotor (Nogi und Fukasawa, 1983), konstruiert. Der GAL7-Promotor bewirkt die Produktion von Enzym unter Induktionsbedingungen: Wachstum auf Medium mit Galactose als einziger Kohlenstoffquelle (Hopper und Rowe, 1978). Die Verwendung dieses Promotors zur induzierten Produktion heterologer Proteine wurde bereits beschrieben (Tajima et al., 1985). Das für Xylanase kodierende Pilzgen wurde zuerst durch Entfernung des Introns (nicht-kodierende Sequenz) mit Hilfe eines synthetischen DNA-Fragments zur Expression in Saccharomyces cerevisiae geeignet gemacht. Dieselbe Technik wurde zur Bereitstellung einer korrekten Verbindung des Xylanase-Gens mit dem GAL7-Promotor von Saccharomyces cerevisiae eingesetzt. Fakultativ wurde auch eine Signalsequenz von Saccharomyces cerevisiae, die Invertase-Signalsequenz, eingeführt, um die Ausscheidung des Pilzenzyms Xylanase durch die Hefe Saccharomyces cerevisiae zu realisieren. Es wurden sowohl autonom replizierende Vektoren als auch (Mehrfachkopie)-Integrationsvektoren zur Produktion der Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase durch die Hefe Saccharomyces cerevisiae eingesetzt. Alle Klonierungsverfahren wurden in dem E. coli-Stamm JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985) und alle Verfahren und Techniken gemäß Maniatis et al. (1982) durchgeführt.
  • Konstruktion des Vektors pUR2901
  • Die Konstruktion des ersten Zwischenprodukts betraf die korrekte Entfernung des Introns aus dem Xylanase-Gen, d. h., ohne Veränderung oder Störung der kodierenden Sequenz. Die in 8 dargestellten synthetischen DNA-Oligonucleotide (BAK 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 23 und 24) wurden verschmolzen und miteinander ligiert, was das Fragment BAK1 ergab. Das Fragment BAK1 mißt 205 bp und umfaßt das SacI-KpnI-Xylanase-Fragment (bp 185–bp 427), aus dem das Intron entfernt wurde. Die synthetischen DNA-Oligonucleotide wurden auf solche Weise gestaltet, daß nach Entfernung des Introns eine korrekte Verbindung mit den Fragmenten hergestellt ist, so daß der offene Leserahmen (kodierend für Xylanase) nicht gestört ist. Zur Vereinfachung der weiteren Konstruktion wurde die SacI-Stelle in eine XhoI-Stelle geändert. Auf der 5'-Seite wurde das Fragment mit einer EcoRI-Stelle versehen. Die Ligierungsmischung wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und EcoRI verdaut und das richtige 205-bp-Fragment mit Hilfe von Agarosegelelektrophorese zur Abtrennung des Fragments und Gelelution zur Isolierung des Fragments aus dem Agarosegel isoliert. Das KpnI-EcoRI-BAK1-Fragment wurde in die KpnI- und die EcoRI-Stelle des Vektors pTZ19R (erhalten von Pharmacia) kloniert, was pBAK1 ergab (siehe 9). Das inserierte Fragment in dem konstruierten Plasmid pBAK1 wurde mittels Sequenzanalyse überprüft.
  • Die weiteren Konstruktionen betrafen die Realisierung einer korrekten Verbindung des Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase-Gens mit dem Saccharomyces cerevisiae-GAL7-Promotor. Für diesen Zweck wurden die in 10 dargestellten synthetischen DNA-Oligonucleotide (BAK13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27 und 28) verschmolzen und ligiert, was Fragment BAK2 ergab. Das Fragment BAK2 mißt 202 bp und umfaßt den synthetischen Übergang von der SacI-Stelle des GAL7-Promotors über die Invertase-Signalsequenz zu dem reifen Xylanase-Gen bis zur SacI (bp 185)-Stelle. Zur Vereinfachung der weiteren Konstruktion wurde die SacI-Stelle auf gleiche Weise wie bei der Konstruktion von pBAK1 in eine XhoI-Stelle geändert. Eine zusätzliche EcoRI-Stelle wurde auf der 5'-Seite des Fragments bereitgestellt. Die Ligierungsmischung wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und das richtige 202-bp-BAK2-Fragment isoliert. Das Plasmid pBAK1 wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und das BAK2-Fragment mit den gleichen Termini wurde in die Vektorfragmente kloniert, was das Plasmid pBAK21 ergab (siehe 11). Das inserierte BAK2-Fragment wurde mittels Sequenzanalyse überprüft. Bei dem Plasmid pBAK21 wurde die Verbindung der Fragmente BAK1 und BAK2 mit der XhoI-Stelle auf solche Weise bewirkt, daß der für Xylanase kodierende offene Leserahmen korrekt wiederhergestellt wurde. Das Plasmid pBAK21 enthält daher den Saccharomyces cerevisiae-GAL7-Promotorübergang ab der SacI-Stelle, die Saccharomyces cerevisiae-Invertase-Signalsequenz (einschließlich eines ATG-Startcodons) und die Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase (kodierend. für reife Xylanase), woraus das Pilz-Intron (nicht-kodierende Sequenz) korrekt bis zu der KpnI-Stelle (dem 5'-Abschnitt des Xylanase-Gens) entfernt wurde.
  • Das Plasmid pAW14B wurde mit KpnI und BamHI verdaut und das 327-bp-KpnI – BamHI-Fragment, enthaltend den 3'-Abschnitt des Xylanase-Gens, wurde isoliert. Das Plasmid pBAK21 wurde ebenfalls mit KpnI und BamHI verdaut und das Vektorfragment isoliert. Das isolierte 327-bp-Fragment und das Vektorfragment wurden miteinander ligiert, was das Plasmid pUR2901 ergab (siehe 12). Das Plasmid pUR2901 wurde mittels Restriktionsenzymanalyse überprüft. Das Plasmid pUR2901 enthält die S. cerevisiae-GAL7-Promotor-Fusionsstelle an der SacI-Stelle, die S. cerevisiae-Invertase-Signalsequenz (einschließlich eines ATG-Startcodons) und das vollständige Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase-Gen (kodierend für die reife Xylanase), aus dem das Pilz-Intron (nicht-kodierende Sequenz) korrekt entfernt wurde.
  • Konstruktion des S. cerevisiae-Expressionsvektors pUR2904
  • Die Konstruktion des Expressionsvektors pUR2904 begann mit dem Plasmid pUR2740. Das Plasmid pUR2740 ist ein Derivat von pUR2730 (Overbeeke, 1987), das zur Produktion von α-Galactosidase in S. cerevisiae verwendet wurde. Das Plasmid pUR2740 unterscheidet sich nicht wesentlich von pUR2730, einige überflüssige Sequenzen im nicht-funktionellen Anteil des Vektors wurden entfernt. Das Plasmid pUR2740 ist ein E. coli/S. cerevisiae-Shuttlevektor. Es wurde der 2-μm-Replikationsursprung verwendet und das S. cerevisiae-LEU2d-Gen diente als Selektionsgen für die Replikation in S. cerevisiae. Das Plasmid pUR2740 wurde mit SacI und HindIII verdaut und das Vektorfragment wurde isoliert. Als Ergebnis dieser Verdauung wurde das α-Galactosidase-Gen entfernt. Das Plasmid pUR2901 wurde ebenfalls mit SacI und HindIII verdaut und das 730-bp-Fragment, umfassend die S. cerevisiae-GAL7-Promotor-Fusionsstelle an der SacI-Stelle, die S. cerevisiae-Invertase-Signalsequenz (einschließlich eines ATG-Startcodons) und das vollständige A. niger Var. awamori-Xylanase-Gen (kodierend für reife Xylanase), wurde isoliert. Das pUR2740-Vektorfragment und das 730-bp-Fragment von pUR2901 wurden miteinander ligiert, was pUR2904 ergab (siehe 13). Das Plasmid pUR2904 wurde mittels Restriktionsenzymanalyse überprüft. Das Plasmid pUR2904 ist der Expressionsvektor für die Produktion der Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase durch die Hefe Saccharomyces cerevisiae. Das Plasmid pUR2904 ist ein E. coli/S. cerevisiae-Shuttlevektor. Es enthält die für Xylanase kodierende DNA-Sequenz mit der damit fusionierten Invertase-Signalsequenz; die Invertase-Signalsequenz wird für die Ausscheidung der Xylanase sorgen. Die DNA-Sequenz in pUR2904 kodiert für genau dieselbe Xylanase wie der A. niger Var. awamori-Wildtypstamm. Während der Ausscheidung wird das resultierende Fusionsprotein im Prinzip einer Prozessierung durch die Saccharomyces cerevisiae-Signalpeptidase unterliegen, was zu ausgeschiedenem reifem Xylanase-Enzym führt. Die Expression der Xylanase wird durch den Galactose-induzierbaren Saccharomyces cerevisiae-GAL7-Promotor reguliert.
  • Analyse der Produktion von A. niger Var. awamori-Xylanase durch S. cerevisiae
  • Hefezellen des Saccharcmyces-Stammes SU10 (α, leu2, ura3, his3, cir+; hinterlegt bei dem Centraalbureau voor Schimmelcultures, P. O. Box 273, 3740 AG Baarn, Niederlande, unter der Nummer CBS 323.87) wurden mit dem Plasmid pUR2904 nach dem Sphäroplasten-Verfahren (Beggs, 1978) transformiert. Die resultierenden leu+-transformierten Hefezellen wurden hinsichtlich der Anwesenheit von Xylanase analysiert. Die Hefezellen wurden zweimal über Nacht auf MM-Medium (0,67% Hefe-Stickstoff-Base w/o Aminosäuren, 2% Glucose), ergänzt mit Uracil und Histidin, gezüchtet. Anschließend wurden die Hefezellen in ein zehnfach größeres Volumen von YPG-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, 5% Galactose) überführt und gezüchtet, bis die Hefezellen die stationäre Phase erreicht hatten. Die Hefezellen wurden unter mechanischer Bewegung bei 30°C kultiviert. Die Hefezellen wurden von dem Medium mittels Zentrifugation abgetrennt. Das Medium wurde hinsichtlich der Anwesenheit der Xylanase mit dem Enzym-Assay wie in Beispiel I beschrieben analysiert. Das Expressionsniveau der Xylanase betrug etwa 10.000 Einheiten in 1 ml Medium. Mit Hilfe isoelektrischer Fokussierung (siehe Beispiel I) wurde gezeigt, daß die von Saccharomyces cerevisiae produzierte Xylanase identisch ist mit der Xylanase, welche vom Wildtyp Aspergillus niger Var. awamori produziert wird. Die Funktionalität der von Saccharomyces cerevisiae produzierten und ausgeschiedenen Xylanase wurde in Backtests gezeigt, die wie in Beispiel II beschrieben durchgeführt wurden. Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, daß die Hefe Saccharomyces cerevisiae in der Lage ist, Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase effizient zu produzieren und auszuscheiden.
  • Konstruktion des S. cerevisiae-Expressionsvektors pUR2921 (Mehrfachkopie-Integration)
  • Die Expression des Xylanase-Gens von Aspergillus niger Var. awamori in Saccharomyces cerevisiae wurde auch mit Hilfe eines integrationsfähigen Vektorsystems untersucht. Für diesen Zweck wurde das Hochkopie-Integrationssystem eingesetzt (Lopes, 1989)
  • Die Konstruktion des Expressionsvektors pUR2921 begann mit dem Plasmid pUR2778. Das Plasmid pUR2778 ist ein mehrfach integrationsfähiges Plasmid, welches sich in den ribosomalen DNA-Locus von S. cerevisiae integriert. Es wurde zur stabilen Mehrfachkopie-Integration der α-Galactosidase-Expressionskassette in S. cerevisiae eingesetzt. Es enthält auch Vektorsequenzen zur Replikation und Selektion in E. und das S. cerevisiae-LEU2d-Gen als Selektionsgen für Hefe. Das Plasmid pUR2778 ist ein Derivat von pMIRY2 (Lopes, 1989), aus dem das SmaI-BglII-Fragment, enthaltend die Spirodella oligorhiza-DNA, entfernt und das BamHI-HindIII-Fragment, enthaltend einen Teil der rDNA-Sequenzen, durch das BglII-HindIII-Fragment von pUR2730 (Overbeeke, 1987), enthaltend die α-Galactosidase-Expressionskassette, ersetzt wurde. Das Plasmid pUR2778 wurde mit SacI und HindIII verdaut und das Vektorfragment aus einem Agarosegel isoliert. Als Ergebnis dieser Verdauung wurde die für α-Galactosidase kodierende Sequenz, einschließlich der Invertase-Signalsequenz, entfernt. Dieses Vektorfragment wurde mit dem 730-bp-SacI-HindIII-Fragment von pUR2901, welches auch zur Konstruktion von pUR2904 eingesetzt wurde, ligiert, was das Plasmid pUR2921 ergab (siehe 14). Das 730-bp-SacI-HindIII-Fragment von pUR2901 umfaßt die S. cerevisiae-GAL7-Promotor-Fusionsstelle an der SacI-Stelle, die S. cerevisiae-Invertase-Signalsequenz (einschließlich des ATG-Startcodons) und das vollständige A. niger Var. awamori-Xylanase-Gen (kodierend für reife Xylanase), aus dem das Pilz-Intron (nicht-kodierende Sequenz) korrekt entfernt wurde. Das Plasmid pUR2921 wurde mittels Restriktionsenzymanalyse überprüft. Das Plasmid pUR2921 ist ein Expressionsvektor zur Produktion der Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase durch die Hefe Saccharomyces cerevisiae. Das Plasmid pUR2921 enthält Sequenzen des ribosomalen DNA-Locus der chromosomalen S. cerevisiae-DNA. Nachdem er keinerlei Hefe-Replikationsursprünge enthält, wird der Vektor nach Transformation in S. cerevisiae an dem ribosomalen DNA-Locus integrieren. Wenn das Plasmid pUR2921 in einen S. cerevisiae-leu2-Stamm transformiert wird, werden unter selektiven Bedingungen aufgrund der niedrigen Expression des LEU2-Marker-Gens des Plasmids pUR2921 mehrfache Kopien des Vektors integrieren. Als Ergebnis dieses Prozesses wird die Xylanase-Expressionskassette in mehrfachen Kopien im Hefechromosom vorliegen. Nachdem die Xylanase-Expressionskassette genau dieselbe ist wie in dem Plasmid pUR2904 wird dieser S. cerevisiae-Stamm das reife Xylanase-Enzym auf dieselbe Weise ausscheiden wie der S. cerevisiae-Stamm mit dem Plasmid pUR2904.
  • Analyse der Produktion von A. niger Var. awamori-Xylanase durch S. cerevisiae
  • Hefezellen des Saccharomyces-Stammes SU50 (YT6-2-1, a, leu2, his4, can1, cir°; Erhart und Hollenberg, 1981) wurden nach dem Sphäroplasten-Verfahren mit dem Plasmid pUR2921, linearisiert mit HpaI, transformiert. Die resultierenden leu+-transformierten Hefezellen wurden hinsichtlich Xylanase-Produktion analysiert wie für die SU10-Hefezellen beschrieben, die mit dem Plasmid pUR2904 transformiert wurden. Für diese Hefezellen wurde das MM-Medium nur mit Histidin ergänzt. Das Expressionsniveau betrug etwa 60.000 Einheiten, ausgeschieden in 1 ml Medium.
  • Referenzen
    • Beggs, J. D. (1978), Nature 275: 104–109.
    • Erhart, Hollenberg (1981), Curr. Genet. 3: 83–89.
    • Hopper, J. E. und Rowe, L. B. (1978), J. Biol. Chem. 253: 7566–7569.
    • Lopes, T. S., Klootwijk, J., Veenstra, A. E., van der Aar, P. C., van Heerikhuizen, H., Raué, H. A. und Planta, R. J. (1989), Gene 79: 199–206.
    • Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrook, J. (1982), Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory.
    • Nogi, Y. und Fukasawa, T. (1983), Nucleic Acids Res. 11: 8555–8568.
    • Overbeeke, N., Fellinger, A. J. und Hughes, S. G. (1987), PCT International. WO 87/07641 .
    • Tajima, M., Nogi, Y. und Fukasawa, T. (1985), Yeast 1: 67–77.
    • Yanisch-Perron, C., Viera, J. und Messing, J. (1985), Gene 33: 103–119.
  • BEISPIEL IV
  • Produktion von Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase durch Bacillus subtilis
  • Als Beispiel der heterologen Produktion von Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase durch einen prokaryotischen Mikroorganismus wurden Expressionsvektoren zur Produktion von Xylanase durch Bacillus subtilis konstruiert. Verschiedene Vektorsysteme, Promotoren und Signalsequenzen sind für die Produktion heterologer Proteine bekannt. Für dieses Beispiel wurde der SP02-Promotor und eine α-Amylase-Signalsequenz zur Expression des Xylanase-Enzyms verwendet. Diese Vorgehensweise war erfolgreich zur Expression der Pflanzen-α-Galactosidase in B. subtilis (Overbeeke et al., 1990).
  • Zur Konstruktion eines Vektors für die Expression von Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase durch Bacillus subtilis wurden zur Expression von Xylanase in Saccharomyces cerevisiae konstruierte Plasmide (siehe Beispiel III), in welchen das Intron (nicht-kodierte Sequenz) des Xylanase-Gens korrekt entfernt war, als Ausgangspunkt verwendet. Die Entfernung des Introns ist essentiell, da ein prokaryotischer Mikroorganismus wie Bacillus subtilis im Gegensatz zu dem Eukaryoten Aspergillus niger Var. awamori nicht in der Lage ist, Introns durch ein als Splicing bezeichnetes Verfahren zu entfernen.
  • Konstruktion des Vektors pUR2950
  • Die in 15 gezeigten synthetischen DNA-Oligonucleotide (BAK 15, 18, 26, 27, 41 und 42) wurden verschmolzen und miteinander ligiert, was das Fragment BAK4 ergab. Das Fragment BAK4 mißt 107 bp und umfaßt die DNA-Sequenz, die für reife Xylanase kodiert, bis zu der SacI-Stelle (bp 185 in 1). Zur Vereinfachung der weiteren Konstruktion wurde die SacI-Stelle in eine XhoI-Stelle geändert, ohne die abgeleitete Aminosäuresequenz zu verändern. Darüber hinaus wurde das erste Codon der reifen Xylanase, kodierend für Alanin, verändert, um eine korrekte Verbindung der reifen Xylanase mit der α-Amylase-Signalsequenz in der weiteren Konstruktion zu erhalten. Das Codon GCT wurde zu GCC, ebenfalls für Alanin kodierend, abgeändert. So wurde eine SacII-Stelle auf der 5'-Seite des BAK4-Fragments geschaffen. Angrenzend an diese SacII-Stelle wurde das BAK4-Fragment mit einer EcoRI-Stelle versehen. Die Ligierungsmischung wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und das 107-bp-EcoRI-XhoI-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das Plasmid pUR2901 (siehe Beispiel III) wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und das BAK4-Fragment wurde in das Vektorfragment mit den gleichen Restriktionsenzymtermini kloniert, was pUR2950 ergab (siehe 16). Das inserierte Fragment BAK4 in pUR2950 wurde mittels Sequenzanalyse überprüft. In dem Plasmid pUR2950 wurde die Verbindung der Fragmente BAK4 und BAK1 mit Hilfe der XhoI-Stelle auf solche Weise durchgeführt, daß der offene Leserahmen, kodierend für den 5'-Abschnitt von Xylanase, korrekt wiederhergestellt wurde. Darüber hinaus wurde, wie in Beispiel III beschrieben, das Intron des Xylanase-Gens korrekt entfernt. Dementsprechend enthält das Plasmid pUR2950 die DNA-Sequenz ab dem ersten Alanin-Codon von reifer Xylanase, worin eine SacII-Stelle an dieser Stelle erzeugt wurde, und das Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase-Gen, kodierend für reife Xylanase, aus dem das Pilz-Intron (nicht-kodierende Sequenz) korrekt entfernt wurde.
  • Konstruktion des B. subtilis-Expressionsvektors pUR2951
  • Das Plasmid pUR2601 (Overbeeke, 1990) wurde als Ausgangspunkt für die Konstruktion verwendet, in der das in pUR2950 vorliegende reife Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase-Gen mit der α-Amylase-Signalsequenz zur Ausscheidung des zu produzierenden Enzyms fusioniert wurde, wobei dieses Fusionsgen durch den SP02-Promotor reguliert wird. Das Plasmid pUR2601 wurde mit SacII und HindIII verdaut und das Vektorfragment mit dem SPO2-Promotor und der α-Amylase-Signalsequenz wurde isoliert. Das SacII-HindIII-Fragment von pUR2950 mit dem reifen Xylanase-Gen wurde isoliert und mit dem pUR2601-Vektorfragment ligiert, was das Plasmid pUR2951 ergab (17). In dem Plasmid pUR2951 wurde die α-Amylase-Signalsequenz in genau der richtigen Weise mit dem reifen Xylanase-Gen fusioniert. Mit der Ligierungsmischung wurde der Bacillus subtilis-Stamm DB104 (Kawamuri und Doi, 1984) unter Verwendung des Protoplasten/PEG-Verfahrens (Chang und Cohen, 1979) mit Kanamycin zur Selektion transformiert. Das Plasmid pUR2951 wurde mittels Restriktionsenzymanalyse überprüft.
  • Analyse der Produktion von A. niger Var. awamori-Xylanase durch B. subtilis
  • Nachdem der DB104-Stamm etwas restliche Protease-Aktivität aufweist, ist eine Fermentation von DB104 mit pUR2951 unter kontrollierten Bedingungen erforderlich, um eine Proteolyse des ausgeschiedenen Enzyms zu vermeiden. Die von Overbeeke et al. (1990) zur Produktion von Pflanzen-α-Galactosidase durch B. subtilis beschriebene Vorgehensweise kann als Ausgangspunkt zur Produktion von Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase durch Bacillus subtilis verwendet werden. Bei dieser Fermentation wird den Glucose- und Ammoniumniveaus während der Fermentation spezielle Aufmerksamkeit geschenkt.
  • Referenzen
    • Chang, S., und Cohen, S. N. (1979), Mol. Gen. Genet. 182: 77–81.
    • Kawamura, F., und Doi, R. H. (1984), J. Bacteriol. 160: 442–444.
    • Overbeeke, N., Termorshuizen, G. H. M., Giuseppin, M. L. F., Underwood, D. R., und Verrips, C. T. (1990), Appl. Environ. Microbiol. 56: 1429–1434.
  • BEISPIEL V
  • Produktion von Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase durch Saccharomyces cerevisiae während der Fermentation von magerem Brotteig
  • Als Beispiel der direkten Verwendung von Zellen, welche die Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase in Nahrungsmitteln produzieren, wurde ein Saccharomyces cerevisiae-Stamm, welcher die Xylanase während der Fermentation von magerem Brotteig produziert, konstruiert. Für diesen Zweck muß der S. cerevisiae-Stamm die Xylanase unter Bedingungen ausscheiden, die während der Fermentation von Weizenteig vorliegen. Magerem Weizenteig wird kein Zucker zugesetzt und deshalb sind die Hauptkohlenstoffquellen für die fermentierende Bäckerhefe Glucose und Maltose. Das Xylanase-Gen sollte deshalb durch einen Promotor reguliert werden, welcher durch Glucoserepression nicht beeinflußt wird. Promotoren der Gene des glycolytischen Stoffwechselwegs (GAPDH, PGK, ADH1, PYK, etc.) der Hefe sind für diesen Zweck sehr geeignet. Nur als Beispiel wurde der Promotor des Phosphoglyceratkinase (PGK)-Gens von Saccharomyces cerevisiae eingesetzt. Dieser Promotor wird zur Expression zahlreicher heterologer Proteine, beispielsweise der Produktion von Humaninterferon-Alpha (Tuite et al., 1982), durch S. cerevisiae eingesetzt.
  • Die bevorzugte Weise, um die Expression eines Enzyms während der Brotherstellung zu erreichen, ist die Verwendung eines integrationsfähigen Vektors (Einzelkopie- oder Mehrfachkopie-Integration), obwohl autonom replizierende Vektoren ebenfalls eingesetzt werden können.
  • Der GAL7-Promotor aus dem Plasmid pUR2921, zur Expression der Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase in Saccharomyces cerevisiae verwendet (siehe Beispiel III), wurde durch den PGK-Promotor ersetzt. S. cerevisiae-Stämme, die mit diesem neuen Vektor transformiert wurden und das Xylanase-Enzym in glucosehaltigen Kulturmedien ausscheiden, könnten zur Brotherstellung verwendet werden. Die Zugabe dieser Hefe zu Teig vor dem Mischen führt zur Ausscheidung des Xylanase-Enzyms während der Brotherstellung und übt somit die positive Wirkung dieses brotverbessernden Enzyms aus, was zu einem erhöhten spezifischen Volumen des Brotes führt.
  • Konstruktion des Plasmids pUR2918
  • Zur Fusion der Saccharomyces cerevisiae-PGK-Promotorsequenzen mit dem Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase-Gen waren mehrere Vorgehensweisen möglich, unter anderen die Schaffung einer geeigneten Restriktionsendonukleasestelle am Ende des Promotors mit Hilfe von stellengerichteter Mutagenese, welche ein DNA-Molekül ergeben konnte, das beispielsweise mit der SacI-Stelle zwischen dem GAL7-Promotor und der Invertase-Signalsequenz von pUR2904, demjenigen Plasmid, welches zur Expression der reifen Xylanase durch Saccharomyces cerevisiae eingesetzt wurde, fusioniert werden konnte. Ein weiterer Weg zur Schaffung geeigneter Restriktionsstellen am Ende eines DNA-Moleküls ist mit Hilfe einer in vitro-Amplifizierungstechnik von DNA, die als Polymerasekettenreaktion bekannt ist. Diese PCR-Technik wurde zur Erzeugung eines DNA-Moleküls eingesetzt, das alle wichtigen Sequenzen des Saccharomyces cerevisiae-Phosphoglyceratkinase-Promotors bis zu dem ATG-Startcodon enthält, mit einer EcoRI- und einer BglII-Stelle an seinem 5'-Ende und einer BspMI-Erkennungssequenz und einer HindIII-Stelle (siehe 18) 3' des ATG-Startcodons. Die zur Amplifizierung verwendeten Primer waren PGP01: 5'-GGA ATT CAG ATC TTG AAT TGA TGT TAC CCT CAT AAA GCA CGT G-3' und PGP02: 5'-CCC AAG CTT ACC TGC TGC GCA TTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG ATA ATT ACT TCC-3'. Matrizen-DNA war pUR2801, ein Hefe-Expressionsvektor mit dem vollständigen Saccharomyces cerevisiae-PGK-Promotor. Die Reaktionsmischung (Gesamtvolumen 100 μl) setzte sich wie folgt zusammen: etwa 1 ng pUR2801, gespalten mit SalI, 100 pMol PGP01 und 100 pMol PGP02, 1 E Amplitaq-Polymerase (Perkin Elmer), 0,2 mMol/l eines jeden dNTP: dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1,5 mMol/l MgCl2, 50 mMol/l KCl, 10 mMol/l Tris HCl, pH 8,3 (bei 25°C), 0,001% (Gew./Vol.) Gelatine. Nach 2 Minuten Inkubation bei 95°C wurden 25 Zyklen der folgenden Temperaturschritte durchgeführt: 1 Min. bei 95°C, 1:45 Min. bei 52°C, 2 Min. bei 72°C. Nach diesen Zyklen wurde die Reaktionsmischung 5 Min. lang bei 72°C gehalten, bevor sie auf 4°C abgekühlt wurde. Alle Temperaturzyklen wurden in einem Perkin Elmer-DNA-Thermocycler durchgeführt. 60 μl wurden aus der Reaktionsmischung mit Ethanol gefällt und anschließend die Bande von etwa 600 bp aus einem Agarosegel isoliert. Die isolierte DNA wurde dann mit EcoRI und HindIII gespalten und wiederum aus einem Agarosegel isoliert. Dieses DNA-Fragment beginnt mit einem kohäsiven EcoRI-Ende, gefolgt von einer BglII-Stelle und der Sequenz von Position –568, bezogen auf das ATG-Codon, bis zu dem ATG-Codon des Saccharomyces cerevisiae-Phosphoglyceratkinase-Promotors. Dem ATG-Codon folgt eine BspMI-Stelle und eine kohäsive HindIII-Stelle. Das Mehrzweckklonierungsplasmid pTZ19R (erhalten von Pharmacia) wurde mit EcoRI und HindIII gespalten und mit dem PGK-Promotorfragment ligiert, was pUR2918 ergab (siehe 19). Das Plasmid wurde mittels Sequenzanalyse überprüft.
  • Konstruktion des Plasmids pUR2920
  • Zur Fusion des PGK-Promotors von pUR2918 mit dem Xylanase-Gen wurden die in 20 gezeigten synthetischen DNA-Oligonucleotide (BAK14, 15, 18, 19, 20, 21, 51, 52 und 53) verschmolzen und miteinander ligiert, was zu dem Fragment BAK5 führte. Die Oligonucleotide BAK51 und BAK53 waren nicht phosphoryliert, um eine Selbstligierung des resultierenden Fragments zu vermeiden, und das Fragment wurde anschließend aus einem Agarosegel isoliert. Das Fragment BAK5 mißt 169 bp und umfaßt die Invertase-Signalsequenz und das reife Xylanase-Gen bis zu der XhoI-Stelle für eine korrekte Fusion mit dem Fragment BAK1 (siehe Beispiel III). Es unterscheidet sich von dem früher genannten Fragment BAK2 (Beispiel III) an beiden Enden. Am 5'-Ende enthält es ein kohäsives Ende unmittelbar vor dem zweiten Codon der Invertase-Signalsequenz, um eine exakte Fusion mit der PGK-Promotorsequenz in pUR2918 zu ergeben. An der 3'-Seite der XhoI-Stelle enthält es ein zusätzliches kohäsives HindIII-Ende. Das Plasmid pUR2918 wird mit BspMI und HindIII geschnitten und mit dem Fragment BAK5 ligiert, was das Plasmid pUR2920 ergibt (siehe 21). Das inserierte Fragment BAK5 wurde mittels Sequenzanalyse überprüft.. Das Plasmid pUR2920 enthält den Saccharomyces cerevisiae-Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor von Nucleotid-568, bezogen auf das ATG-Startcodon, bis zu dem ATG-Startcodon, die Saccharomyces cerevisiae-Invertase-Signalsequenz in korrekter Fusion mit diesem ATG-Codon und das Aspergillus niger Var. awamori-Xylanase-Gen bis zu der SacI-Stelle. Zur Vereinfachung der weiteren Konstruktion wurde die SacI-Stelle wie in Beispiel III beschrieben in eine XhoI-Stelle geändert.
  • Konstruktion der Plasmide pUR2922 und pUR2923
  • Der episomale Expressionsvektor pUR2904 auf 2-Micron-Basis (siehe Beispiel III) wurde zur Konstruktion eines Plasmidvektors für die Expression des Xylanase-Gens, reguliert durch den PGK-Promotor, in S. cerevisiae eingesetzt. Das Plasmid pUR2920 wurde mit BglII und XhoI gespalten und das 735-bp-Fragment, enthaltend den PGK-Promotor, die Invertase-Signalsequenz und das Xylanase-Gen bis zu der XhoI-Stelle, wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das Plasmid pUR2904 wurde ebenfalls mit BglII und XhoI gespalten und das große Vektorfragment isoliert. Als Ergebnis dieser Verdauung wurden der GAL7-Promotor und die Invertase-Signalsequenz entfernt. Dieser pUR2904-Vektor wurde mit dem BglII-XhoI-Fragment von pUR2920 ligiert, was pUR2922 ergab (siehe 22). Plasmid pUR2922 unterscheidet sich von dem Saccharomyces cerevisiae-Expressionsvektor pUR2904 (Beispiel III), da es den Saccharomyces cerevisiae-Phosphoglyceratkinase-Promotor anstelle des GAL7-Promotors vor der Invertase-Signalsequenz enthält.
  • Zur Konstruktion eines Mehrfachkopie-Integrationsvektors mit der PGK-Xylanase-Expressionskassette diente das Plasmid pUR2792 als Ausgangspunkt. Das Plasmid pUR2792 ist ein Derivat von pMIRY2 (Lopes, 1989). Es enthält einen BglII-HindIII-Polylinker anstelle des BglII-HindIII-Abschnitts, welcher die S. oligorhiza-DNA enthält, und der Abschnitt zwischen der BalI-Stelle in der pAT153-Sequenz und der HindIII-Stelle in der rDNA-Sequenz wurde deletiert. Das Plasmid pUR2792 wurde mit BglII und HindIII gespalten und die Vektorbande aus einem Agarosegel isoliert. Das BglII-HindIII-Fragment, enthaltend die PGK-kontrollierte Xylanase-Expressionskassette, wurde aus dem Plasmid pUR2922 isoliert und mit dem pUR2792-Vektor ligiert, welcher mit BglII-HindIII gespalten worden war. Das resultierende Plasmid pUR2923 (siehe 23) ist ein Saccharomyces cerevisiae-Mehrfachkopie-Integrationsplasmid, welches den Saccharomyces cerevisiae-Phosphoglyceratkinase-Promotor bis zu dem ATG-Startcodon, die Saccharomyces cerevisiae-Invertase-Signalsequenz mit diesem Promotor fusioniert und das reife Xylanase-Gen von Aspergillus niger Var. awamori im Leserahmen mit der Invertase-Signalsequenz fusioniert enthält. Das Intron (nicht-kodierende Sequenz) wurde aus dem Xylanase-Gen korrekt entfernt.
  • Hefezellen des Saccharomyces cerevisiae-Stammes SU50 wurden nach dem Sphäroplasten-Verfahren mit dem Plasmid pUR2923, mit HpaI linearisiert, transformiert (siehe Beispiel III). Die resultierenden leu+-transformierten Hefezellen wurden hinsichtlich Xylanase-Produktion analysiert wie für die SU50-Hefezellen mit dem Plasmid pUR2921 beschrieben, mit einer Änderung, der Verwendung vom YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, 2% Glucose) anstelle von YPG im letzten Kulturschritt. Das Expressionsniveau betrug etwa 10.000 Einheiten, ausgeschieden in 1 ml Medium.
  • Produktion von Xylanase durch pUR2923-enthaltende Hefe in Teig
  • Saccharomyces cerevisiae-SU50-Zellen, enthaltend das in mehrfacher Kopie in das Hefechromosom integrierte Plasmid pUR2923, wurden in einem Backtest wie im folgendem beschrieben eingesetzt. Die Erhöhung des Brotvolumens durch die Zugabe von Xylanase wird durch eine enzymatische Veränderung der Stärke-Tailings verursacht, wodurch der Teig in der Lage ist, die gasbildende Aktivität der Hefe in dem Teig stärker zu nutzen. Eine Hefe mit einem hohen Gasbildungsvermögen ist deshalb erforderlich, um den vollen Nutzen aus der Zugabe des Xylanase-Enzyms zu ziehen. Nachdem der SU50-Stamm ein Laborstamm ist, besitzt er keine guten Gasbildungseigenschaften. Für einen Backversuch mit dem Xylanase-erzeugenden SU50-Hefestamm ist somit die Ergänzung mit einem gut gasbildenden Hefestamm erforderlich.
  • Der im folgenden beschriebene Backtest basierte auf dem 10-Gramm-Mikrolaib-Test (Shogren und Finney, 1984). Die Formulierung des Teigs war 10 g Weizen mehl (Columbus: MENEBA, Niederlande); 0,15 g NaCl; 5,9 ml Wasser; 0,2 g Preßhefe (Koningsgist; Gist-Brocades, Niederlande). Ergänzungen dieser Formulierung (Xylanase-produzierende und -nicht-produzierende Hefe, Xylanase-Enzym) wurden unmittelbar vor dem Mischen des Teiges in Wasser gelöst. Das Mischen geschah 5 Min. lang in einem 10-g-Mixograph von National Manufacturing Co. Lincoln, NE. Nach dem Mischen wurde der Teig 80 Min. lang bei 30°C unter zweimaligem Auswalzen, einmal Auswalzen bei 40 Min. und einmal bei 80 Min., fermentiert. Die zum Auswalzen verwendeten Ausziehwalzen hatten einen Abstand von 2,0 mm. Nach der Fermentation wurde der Teig geformt und vor dem Backen 70 Min. lang bei 30°C imprägniert. Das Backen fand 12 Min. lang bei 240°C statt. Nach dem Wiegen wurde das Volumen der Laibe mit Hilfe der Zwergrapssamenverdrängung gemessen.
  • Ergänzungen zum Teig waren: Saccharomyces cerevisiae SU50 mit pUR2923 (Xylanase-produzierende Hefe), Saccharomyces cerevisiae SU50 (Ausgangsstamm) und gereinigtes Xylanase-Enzym. Die verwendeten SU50-Hefestämme wurden zuerst auf selektiven Medien gezüchtet: YNB w. o. Aminosäuren (Difco) und 20 g/l Glucose, ergänzt mit 60 mg/l Leucin (nur SU50-Ausgangsstamm) und 20 mg/l Histidin. Diese Kulturen wurden 40 Stunden lang bei 30°C gezüchtet und dann 5 ml verwendet, um 45 ml YPD (siehe oben) anzuimpfen, und 16 Stunden lang bei 30°C gezüchtet. Hefezellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, einmal mit frischem YPD gewaschen und erneut zentrifugiert. Unterschiedliche Mengen des (nassen) Pellets wurden unmittelbar vor dem Mischen des Teiges in 5,9 ml Wasser resuspendiert. Die Menge an zugesetzter gereinigter Xylanase, falls eingesetzt, betrug 5 μl einer Lösung von 40 E/μl (200 E). Die Wirkung der verschiedenen Ergänzungen auf das spezifische Volumen (S. V.) des Brots ist in der folgenden Tabelle dargestellt:
    Ergänzung S. V. (ml/g)
    keine 3,31
    keine 3,40
    5 mg SU50 3,40
    15 mg SU50 3,39
    50 mg SU50 3,66
    5 mg SU50; 200 E Xylanase 3,78
    15 mg SU50; 200 E Xylanase 3,97
    50 mg SU50; 200 E Xylanase 4,01
    5 mg SU50:pUR2923 3,88
    15 mg SU50:pUR2923 4,03
    50 mg SU50:pUR2923 4,31
  • Aus den in dieser Tabelle dargestellten Ergebnissen ist ersichtlich, daß der Hefestamm, welcher die Xylanase produziert (SU50:pUR2923), auf das spezifische Volumen des Brots eine positive Wirkung ausübt, vergleichbar mit derjenigen der Zugabe von gereinigtem Xylanase-Enzym. Der Ausgangsstamm, bei Zugabe in äquivalenten Mengen, hebt diese Wirkung nicht auf. Natürlich wird diese Wirkung durch die Mischung einer Bäckerhefe mit gutem Gasbildungsvermögen und einer gentechnisch manipulierten Laborhefe erzielt. Dieselbe positive Wirkung kann jedoch erhalten werden, wenn eine Bäckerhefe mit gutem Gasbildungsvermögen in vergleichbarer Weise manipuliert wird, um die Pilz-Xylanase zu produzieren. Ferner können diese Hefestämme manipuliert werden, um andere Enzyme mit brotverbessernden Eigenschaften (α-Amylasen, Hemicellulasen etc.) zu produzieren.
  • Referenzen
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Claims (22)

  1. Ein rekombinantes DNA-Material, umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine Xylanase fungalen Ursprungs mit brotverbessernder Wirkung kodiert, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, welche die Nucleotidsequenz von 1 und äquivalente Nucleotidsequenzen umfaßt, so daß – die äquivalente Nucleotidsequenz entweder einer Nucleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz von 1 kodiert, oder der reifen Form entspricht.
  2. Ein rekombinantes DNA-Material gemäß dem vorhergehenden Anspruch, umfassend DNA mit einer Nucleotidsequenz, die die reife Form von Xylanase kodiert.
  3. Ein rekombinantes DNA-Material gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner wenigstens ein anderes Enzym kodiert, wobei das andere Enzym amylolytische und/oder hemicellulolytische und/oder cellulolytische Aktivität besitzt.
  4. Eine transformierte Zelle, die rekombinantes DNA-Material gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–3 enthält, wobei die Zelle in der Lage ist, die von dem rekombinanten DNA-Material kodierte Xylanase zu exprimieren, und die Zelle in der Lage ist, wenigstens die von dem rekombinanten DNA-Material kodierte reife Form von Xylanase auszuscheiden.
  5. Eine transformierte Zelle gemäß Anspruch 4, die bei einem Verfahren geeignet ist, bei dem ein cellulose- und/oder hemicellulosehaltiges Rohmaterial in einer funktionellen Weise, die an sich für die nichttransformierte Wirtszelle bekannt ist, verwendet wird, wobei die Zelle bei der Expression der rekombinanten DNA, welche die Xylanase kodiert, für das Verfahren polyfunktionell wird und anschließend wenigstens die reife Form der Xylanase mit brotverbessernder Wirkung ausscheidet, wodurch die Zersetzung von Xylan möglich wird.
  6. Eine Zelle gemäß Anspruch 5, wobei das Verfahren, für das die nichttransformierte Zelle funktionell und die transformierte Zelle polyfunktionell ist, auf dem Gebiet der Nahrungsmittelverarbeitung und -produktion liegt.
  7. Eine transformierte Zelle gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei das Verfahren, für das die Zelle polyfunktionell ist, auf die Fermentation bezogen ist und die Zelle eine Hefezelle ist.
  8. Eine transformierte Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 5–7, wobei die Zelle eine Hefezelle ist und das Verfahren, für das die Zelle polyfunktionell ist, auf die Herstellung von Backwaren bezogen ist.
  9. Eine transformierte Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 4–6, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Bakterienzelle, einer Pilzzelle, einer Hefezelle und einer Pflanzenzelle.
  10. Eine Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 9, wobei die Zelle eine Pilzzelle ist, ausgewählt aus den Gattungen Aspergillus und Trichoderma.
  11. Eine Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 10, wobei die Zelle eine Pilzzelle ist, ausgewählt aus den Arten Aspergillus niger Var. awamori, Aspergillus niger Var. niger, Aspergillus nidulans und Aspergillus oryzae.
  12. Eine Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 9, wobei die Zelle eine Bakterienzelle ist, ausgewählt aus den Gattungen Bacillus, Lactobacillus und Streptococcus.
  13. Eine Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 4–9, wobei die Zelle ausgewählt ist aus Hefezellen der Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula und Pichia.
  14. Eine Zeile gemäß Anspruch 13, wobei die Zelle ausgewählt ist aus Hefezellen der Arten Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Hansenula polymorpha und Pichia pastoris.
  15. Ein Verfahren zur Herstellung einer Xylanase, wobei die Xylanase eine Aminosäuresequenz enthält, die aus 1 ausgewählt ist, umfassend: – Kultivieren einer Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 4–14 in einem geeigneten Nährmedium und – gegebenenfalls Isolieren des resultierenden Enzyms.
  16. Eine Brotverbesserungszusammensetzung, die eine Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 4–8, 13 und 14 enthält.
  17. Ein Verfahren zur Herstellung eines Backprodukts durch Backen einer Mehlzusammensetzung, umfassend die Verwendung der Brotverbesserungszusammensetzung gemäß Anspruch 16.
  18. Das Verfahren zur Verarbeitung eines cellulosehaltigen Rohmaterials, um Bier, Papier, Stärke, Gluten herzustellen oder um cellulose- und/oder hemicellulosehaltigen Abfall zu zersetzen, umfassend das Inkontaktbringen des Materials mit einer Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 5–14.
  19. Das Verfahren nach Anspruch 18, bei dem die Xylanase, die verwendet wird, eine reife Form ist.
  20. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 18–19, bei dem das cellulosehaltige Material landwirtschaftlicher Abfall ist, der mit der Xylanase in Kontakt gebracht wird.
  21. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 18–20, bei dem das cellulosehaltige Material Abfall aus Papierfabriken ist.
  22. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 18–21, welches das Inkontaktbringen des Materials mit einer Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 5–14 umfaßt, so daß sie eine Xylanase in situ ausscheidet.
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