DE68929370T2

DE68929370T2 - Verfahren zur Selektion und zur stabilen Einschleusung rekombinanter DNA in Milchsäurebakterien

Info

Publication number: DE68929370T2
Application number: DE1989629370
Authority: DE
Inventors: Willem Meindert De Vos
Original assignee: NL I VOOR ZUIVELONDERZOEK EDE
Current assignee: NL I VOOR ZUIVELONDERZOEK EDE
Priority date: 1988-06-15
Filing date: 1989-06-06
Publication date: 2002-09-12
Anticipated expiration: 2009-06-07
Also published as: NL8801529A; DE68929370D1; EP0355036A1; EP0355036B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion von Milchsäurebakterien, die eine rekombinante DNA enthalten, während diese DNA mit Hilfe eines in Nahrungsmitteln akzeptablen Markers stabil gehalten wird.
Die Entwicklung verschiedener Wirt/Vektor-Systeme ermöglicht es, rekombinante DNA-Techniken bei der Verbesserung der Eigenschaften von Milchsäurebakterien anzuwenden, die in einer großen Anzahl von industriellen Molkereifermentationen und anderen Nahrungsmittelfermentationen (siehe FEMS Microbiol. Rev. 46 (1987), 281-325, FEMS Microbiol. Letters 44 (1987), 173-177) verwendet werden. Eine Anzahl von Verbesserungen, in denen homologe und heterologe Gene verwendet worden sind, sind bereits beschrieben worden (siehe EP-A 01,574,414, EPA-A-0,228,726, Niederländische Patentanmeldung 87.01378). Für diese Techniken sind Selektionsmarker unerlässlich, die verwendet werden, um das Bakterium zu selektieren, das in der gewünschten Weise modifiziert worden ist. In vielen Fällen ist es außerdem notwendig, einen Selektionsdruck auf das erhaltene genetisch modifizierte Bakterium auszuüben, um zu vermeiden, dass die gewünschten Modifikationen verloren gehen. Das Letztere trifft insbesondere, allerdings nicht ausschließlich, zu, wenn die rekombinante DNA ein Bestandteil eines rekombinanten Plasmids ist, das eine autonome Replikation in dem verwendeten Milchsäurebakterium durchlaufen kann.
Die internationale Patentanmeldung WO 85/03945 beschreibt ein Verfahren für die Selektion von S.lactis (Lactococcus lactis susp. lactis), der eine rekombinante DNA enthält, worin dieser S.lactis, dem ein oder zwei Proteinasen fehlen, mit einem DNA- Fragment, das das BclIB-Fragment von pLP712 enthält, transformiert wird. Dieses Fragment, das viele Gene des Lactosemetabolismus - in jedem Fall die Gene für Faktor III, Enzym II und Phospho- β-Galactosidase - enthält, weist eine Größe von etwa 12 kb auf.
Allerdings beschreibt die WO 85/03945 keine praktische Lösung für die Verwendung des Lactosemetabolismus als Marker. Stattdessen wird ein rekombinantes Plasmid (pGKV500), das Erythromycinresistenz überträgt und einen Prt&spplus;-Phänotyp codiert, als Marker verwendet. Allerdings kann der Prt&spplus;-Phänotyp nicht als geeigneter Marker für die Selektion von Transformanden auf Agar verwendet werden.
Die Verwendung von Genen, die für den Lactosemetabolismus (insbesondere der lactosespezifische Faktor III und Phosphor- β- Galactosidase) als auxotropher Marker für die Transformation von S.sanguis unerlässlich sind, ist in J. M. Inamine et al. Journal of Bacteriology, Vol. 167, No. 3, Seiten 855-862. beschrieben. Allerdings ist S.sanguis nicht für die Verwendung in Nahrungsmitteln geeignet. Des Weiteren sind die Lac-Gene durch Rekombination in die chromosomale DNA von S.sanguis integriert; das einzusetzende Gen ist nicht im Chromosom von S.sanguis enthalten. Daher ist nach dieser Referenz der Marker eingeführt, jedoch nicht das Gen oder die rekombinante DNA, die auf stabile Weise erhalten bleiben soll.
Ein idealer Selektionsmarker erfüllt unter anderem folgende Kriterien: (i) er schafft die Möglichkeit einer einfachen und dominanten Selektion; (ii) er ist aus einer gut definierten, bevorzugt homogenen DNA zusammengesetzt; (iii) er bietet die Möglichkeit, in industriellem Maßstab verwendet werden zu können und (iv) wenn er im Milchsäurebakterium für zum Beispiel den menschlichen Verbrauch verwendet werden soll, dann soll er vollständig nahrungsmittelsicher sein.
Bisher sind nur Antibiotika-resistente Marker, die bloß das erste der oben angegebenen Kriterien erfüllen, in Milchsäurebakterien verwendet worden. Hauptnachteile bei der Verwendung dieser Marker sind die hohen Kosten und die Tatsache, dass ein oder mehr Antibiotika immer in dem Medium vorhanden sein müssen, worin die Bakterien gezüchtet werden, und das macht eine direkte Anwendung in der Nahrungsmittelindustrie unmöglich.
Daher gibt es einen starken Bedarf hinsichtlich sogenannter nahrungsmittelsicherer Selektionsmarker, die bei der Konstruktion von genetisch modifizierten Milchsäurebakterien verwendet werden können und daher in industriellen Prozessen anwendbar sind.
Einige nahrungsmittelsichere Selektionsmarker, die in Milchsäurebakterien verwendet werden konnten, wie die Bakteriophagen- Resistenz, Bacteriocin-Resistenz und die Fähigkeit, Proteinase zu produzieren, beschrieben worden. Allerdings sind diese Marker für die Anwendung in industriellen Prozessen ungeeignet, weil Bacteriophagen unter praktischen Bedingungen unerwünscht sind, die Zugabe von Bakteriocinen eine kostspielige Sache, die nicht immer legal erlaubt ist, ist und Proteinase-produzierende Milchsäurebakterien nicht immer auf einfache Weise erkannt werden können und außerdem schnell durch Mutanten, die keine Proteinase produzieren, überwachsen werden.
Des Weiteren gibt es die Möglichkeit, sogenannte auxotrophe Mutanten zu verwenden, die, im Gegensatz zu den sogenannten prototrophen Wildtypstämmen, nicht in der Lage sind, in einem Medium ohne Ergänzung von Nährstoffen optimal zu wachsen. Die genetische Information für die Synthese dieser Näherstoff(e) kann durch rekombinante DNA-Techniken erhalten werden und kann zusammen mit oder ohne einem Replikon, jedoch bevorzugt zusammen mit (einem) Gen(en), die Anlass zur Synthese von gewünschten Proteinen und/oder Eigenschaften als Mittel zum Aufrechterhalten eines Selektionsdrucks auf das genetisch modifizierte Bakterium geben, verwendet werden.
Da die meisten Milchsäurebakterien vom Wildtyp immer eine große Anzahl von Nährstoffen für das optimale Wachstum benötigen, ist es nicht einfach, diese auxotrophen Milchsäurebakterienmutanten zu isolieren. In industriellen Prozessen werden Medien verwendet, in denen Milchsäurebakterien optimal wachsen und die daher immer sehr reich an vielen Nährstoffen sind, was einen direkten Selektionsdruck in einem beträchtlichen Ausmaß verhindert. Es wird eine Lösung zu vergleichbaren Problemen in Bacillus aufgezeigt, wobei ein Wirt verwendet wird, der defizient in einem Element der Synthese oder Aufrechterhaltung der Zellhülle, in diesem Fall D-Alanin, in Kombination mit einem extrachromosomalen Element, das in der Lage ist, dieses Erfordernis zu unterdrücken, wobei es in diesem Fall für die D,L-Alaninracemase (EP- A-0,185,512) codiert, ist. Es stellt sich allerdings hier die Frage nach der Bedeutsamkeit von D-Alanin für die Integrität der Zellhülle der Milchsäurebakterien, ob die Milchsäurebakterin eine D,L-Alaninracemase haben, ob Mutanten erhalten werden können, die in der Synthese von D,L-Alaninracemase gestört sind und/oder ob die Autosynthese von D-Alanin für das Wachstum auf den komplexen Medien, die für die Kultivierung von Milchsäurebakterien verwendet werden, notwendig ist.
Ein Beispiel für einen auxotrohen Marker, auf den diese Einschränkungen nicht zutreffen, ist die Fähigkeit, Lactose zu fermentieren. Da die Lactose der einzige fermentierbare Zucker ist, der in Milch oder Medien, die aus Milch abgeleitet sind, vorhanden ist, sind Milchsäurebakterien, die die Fähigkeit verloren haben, Lactose als Energiequelle (sogenannte lactosedefiziente, lac&supmin;-Mutanten) zu verwenden, nicht in der Lage, in diesen Medien zu wachsen. Alle in der Molkereiindustrie verwendeten Milchsäurebakterien besitzen daher die Fähigkeit, Lactose zu fermentieren.
Die Art und Weise, in der diese Lactosefermentation stattfindet, ist bereits in einer Vielzahl von Fällen beschrieben worden. Insbesondere die Art und Weise, in der die mesophilen Milchsäurebakterien Streptococcus lactis und Streptococcus cremoris (kürzlich umbenannt in Lactococcus lactis susp. lactis und Lactococcus lactis susp. cremoris, Syst. Appl. Microbiol. 6 (1985 183-195) die Lactose unter Bildung von Lactat zu fermentieren ist bereits gut untersucht und in Fig. 1 dargestellt. Daraus ist abzuleiten, dass die Lactosefermentierung in diesen Milchsäurebakterien ein komplexer Prozeß ist, in dem mindestens 19 verschiedene, durch Enzyme katalysierte Reaktionen beteiligt sind.
Die genetische Forschung hat gezeigt, dass in dieser Gruppe von Milchsäurebakterien die Gene, die für die Enzyme, die in der Lactosefermentierung involviert sind, codieren, in vielen Fällen teilweise auf dem Bakterienchromosom und teilweise auf extrachromosomaler Plasmid-DNA angesiedelt sind. Wenn das Plasmid, das für Gene codiert, die bei der Lactosefermentation (sogenanntes Lactoseplasmid) beteiligt sind, aus diesem Stamm verlorengegangen ist, ist das Bakterium nicht länger in der Lage, Lactose zu fermentieren. Diese lac&supmin;-Mutanten können auf einfache Weise hergestellt werden, indem plasmidheilende Verfahren verwendet werden, und sie können auf einfache Weise von einem lac&spplus;-Stamm unterschieden werden (J. Bacteriol. 154 (1983) 1-9; Appl. Microbiol. 23 (1972) 1090-1096).
Lactoseplasmide können von lac&spplus;- bis lac&supmin;-Stämmen mit Hilfe verschiedener genetischer Methoden, wie die Konjugation, Transduktion, Protoplastenfusion und Transformation (Ant. von Leewenhoek 49 (1983), 257-282; Appl. Environ. Microbiol. 48 (1984), 252- 259) übertragen werden. Bei der Plasmidübertragung mit Hilfe der Transduktion gibt es die Möglichkeit, dass ein Lactoseplasmit vollständig oder teilweise in die chromosomale DNA des Empfänger-Milchsäurebakteriums (Appl. Microbiol., 36 (1978), 360-367) integriert wird.
Es hat sich gezeigt, dass in L.lactis C2 die Gene, die für die lactosespezifischen Enzyme, Enzym II, Faktor II, und P-β- Galactosidase (P-β-Gal), die sogenannten Lactose-Gene, codieren, auf einer etwa 50 kb Plasmid-DNA liegen (J. Bacteriol. 102 (1970), 804-809; Appl. Environ. Microbiol. 35 (1978), 592-600). Des Weiteren gibt es Hinweise darauf, dass in L. lactis-Stämmen, die Tagatose-Gene, die für die Enzyme des Tagatose-6P- Stoffwechsels, nämlich Galactose-6-P-Isomerase, Tagatose-6-P- Kinase und Tagatose-1,6-diP-Aldolase, ebenfalls auf einer Lactose-Plasmid-DNA (J. Bateriol. 153 (1983) 76-83) lokalisiert sind. Es ist bemerkenswert, dass die Enzyme, die durch die Lactose- und Tagatose-Gene codiert werden, für das Milchsäurebakterium nicht unerlässlich sind, weil die Fermentation von anderen Zuckern als Lactose (und manchmal Galactose), wie Glucose, als Möglichkeit verbleibt. Die L. lactis-Gene, die für die P-β-Gal und Tagatose-1,6-diF-Aldolase codieren, sind in Escherichia coli (J. Gen. Microbiol. 132 (1986, 331-340; FEMS Microbiol. Letters 33 (1986), 97-84) kloniert worden, während nur das P-β-Gal-Gen ebenfalls in L. lactis (EP-A-0,228.726) kloniert und exprimiert worden ist.
Es ist in L. lactis NCDO 712 gezeigt worden, dass die plasmidlokalisierten Gene des Lactosemetabolismus wahrscheinlich auf einem etwa 12 kb Restriktionsfragment (sogenanntes BclIB- Fragment), das aus dem größten 56,5 kb Plasmid pLP712 stammt (J. Bacteriol. 154 (1983), 1-9) liegt. Die gleichen Gene liegen auf einem Deletionsderivat von pLP712, das Lactose-Miniplasmid pMG820, das trotzdem noch eine Größe von 23,7 kb aufweist (J. Gen. Microbiol. 132 (1986), 331-340).
Durch Einführen eines Plasmidvektors, der das 12 kb BclIB Restriktionsfragment, das die pLP712 Lactose-Gene enthält, umfasst, in einen L. lactis Stamm, aus dem das Lactoseplasmid entfernt worden war, konnte die Fähigkeit, Lactose zu fermentieren, wahrscheinlich wieder hergestellt werden. Diese Methode ist möglicherweise in der EP-A-0,157,441 beschrieben, obwohl es kein echtes Beispiel für die Umsetzung gibt. Ein Problem in diesem Zusammenhang ist die Größe des BclIB-Fragments, das nicht nur die drei Lactose-Gene, sondern wahrscheinlich ebenfalls drei Tagatose-Gene enthält. Da ein Klonierungsfaktor, der den Selektionsmarker enthält, vorzugsweise so klein wie möglich wegen der Manipulationsfähigkeit und Kopienzahl sein soll, ist die Verwendung dieses BclIB-Fragments in der Praxis wohl eher unwahrscheinlich.
Die Verwendung von Milchsäurebakterien mit Lactosedefizienz, in denen, im Unterschied zu den vorher erwähnten Mutanten, nur ein oder zwei Lactose-Gene mutiert sind und welches kleine, gut definierte DNA-Fragmente aufnehmen kann, sollte daher bevorzugt sein.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung stellt nun ein Verfahren zur Selektion von Milchsäurebakterien zur Verfügung, die rekombinante DNA enthalten, wobei die DNA mit Hilfe eines Markers, der in Nahrungsmitteln für den menschlichen Verkehr akzeptabel ist, stabil gehalten wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Milchsäurebakterium, dem ein oder zwei Enzyme fehlen, die für die Lactosefermentation unerlässlich sind und aus Enzym II, Faktor III, p-β- Galactosidase, Gal-6-P-Isomerase, Tagatose-6-P-Kinase und/oder Tagatose-1,6-diP-Aldolase gewählt ist, mit einem DNA-Fragment als Marker transformiert wird, das
- ein oder mehr Gene enthält, die mindestens für das eine oder die beiden Enzyme, die in dem Milchsäurebakterium fehlen, codieren und
- eine Größe aufweist, die höchstens den Genen entspricht, die für die Phospho-β-Galactosidase und Enzym III codieren und ebenfalls ein oder mehr Strukturgene enthält, die für eine verbesserte oder neue Eigenschaft des Milchsäurebakteriums codieren.
Zwei Komponenten sind in dieser Erfindung wesentlich: Das Milchsäurebakterium mit Lactosedefizienz und das DNA-Fragment, das für ein oder zwei der vorgenannten Enzyme aus dem Lactosemetabolismus codiert.
Das Milchsäurebakterium mit Lactosedefizienz ist nicht in der Lage, Lactose zu fermentieren, weil dem Milchsäurebakterium entweder vollständig ein oder 2 der vorgenannten Enzyme, die für die Lactosefermentierung wesentlich sind, fehlen oder das vorgenannte Enzym oder Enzyme mit der Einschränkung, dass das Enzym oder die Enzyme eine unzureichende enzymatische Aktivität zur Umwandlung von Lactose in der erforderlichen Rate hat bzw. haben, enthält. Es ist zusätzlich erwünscht, dass, außer dem Unvermögen, Lactose zu fermentieren, sich das Milchsäurebakterium nicht von anderen Milchsäurebakterien, die in der industriellen Fermentation verwendet werden, unterscheidet. Die Natur der genetischen Defizienz kann eine Deletion, Insertion oder Punktmutation in der DNA sein, die für ein Enzym codiert, das im Lactosemetabolismus beteiligt ist. Bevorzugt sind bei der Defizienz die Lactose- oder Tagatose-Gene beteiligt. Insbesondere sind die Faktor III oder P-β-Gal-Gene sehr geeignet, weil es bekannt ist, dass diese für relativ kleine, biologisch gut charakterisierte, intrazelluläre, lösliche Enzyme codieren.
Diese Defizienz kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, wie durch herkömmliche Zufallsmutagenese mit Hilfe der Bestrahlung mit Ultraviolettlicht oder Behandlung mit mutagenen Substanzen, wie Ethylmethansulfonat oder Nitrosoguanidin. Lactosedefiziente Mutanten können ebenfalls durch Transposonmutagenese hergestellt werden. Eine stellengerichtete Mutagenese mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken kann zusammen mit den beschriebenen Transformationssystemen angewandt werden. In diesem Zusammenhang besteht die Möglichkeit, das Wildtypgen durch das modifizierte Lactosegen durch Integration in die DNA des Milchsäurebakteriums zu ersetzen. Wenn das zu mutierende Lactosegen auf einem Plasmid lokalisiert ist, gibt es die Möglichkeit, das Wildtypgen durch das modifizierte Lactosegen in vitro zu ersetzen und das in dieser Weise mutierte Lactoseplasmid in ein Milchsäurebakterium wieder einzuführen. Bevorzugt wird diese Manipulation mit einem kleinen Lactoseplasmid durchgeführt. Das Lactoseminiplasmid pMG820 ist für diesen Zweck sehr geeignet. Es ist außerdem möglich, ein Lactoseplasmid, entweder vor oder nach der Mutagenese, in die chromosomale DNA des Milchsäurebakteriums unter Ausnutzung der Transduktion zu integrieren. Diese Technik ermöglicht es ebenfalls, integrierte Lactosegene von einem Milchsäurebakterienstamm zum anderen zu übertragen.
Es ist für die Anwendungen wünschenswert, dass das Milchsäurebakterium mit Lactosedefizienz eine stabile Mutante ist, worin eine Rückmutation in den lactoseproduzierenden Phänotyp nur mit einer sehr geringen Häufigkeit vorkommt.
Bevorzugt wird ein Lactococcus oder Lactobacillus als Milchsäurebakterium verwendet. Es ist bekannt, dass Bakterien dieser Art für die Anwendung in verschiedenen industriellen Fermentationen geeignet sind und dass sie nach der Weise wie in Fig. 1 Lactose fermentieren. Des Weiteren können rekombinante DNA-Techniken in diesen Milchsäurebakterien verwendet werden. Insbesondere ist Lactococcus lactis sehr geeignet, was auf die Verwendung dieses Milchsäurebakteriums in einer großen Anzahl von Molkereifermentationen, worin die Lactose der einzige fermentierbare Zucker ist, zurückgeht.
Das DNA-Fragment, das als Marker in den Milchsäurebakterien mit Lactosedefizienz verwendet wird, muss für ein oder zwei der obengenannten Enzyme codieren, die eine unzureichende Aktivität in dem Milchsäurebakterium aufweisen oder dort nicht vorkommen. Dieses bedeutet, dass das DNA-Fragment die Strukturinformation für dieses eine oder die beiden Enzyme und ebenfalls möglicherweise Expressionssignale enthalten muss, die notwendig sind, eine Expression in der Weise zu erreichen, dass eine Wildtypfermentation von Lactose möglich ist. Dieses DNA-Fragment kann erhalten werden, indem das Milchsäurebakterium mit Lactosedefizienz unter Anwendung eines Wirts/Vektors und Expressionssystemen, die für Milchsäurebakterien und andere Bakterien entwickelt sind, komplementiert wird. Ein spezielles Beispiel dafür ist in der EP-A-0,228,726 gezeigt, dass die schrittweise Klonierung und Expression in L. lactis des pMG820-codierten P-β-Gal-Gens beschreibt.
Die Lactosedefizienz des verwendeten Milchsäurebakteriums bestimmt die Zahl und die Art der Gene, die für das eine oder die beiden vorgenannten Enzyme codieren und nicht im Milchsäurebakterium vorhanden sind und für die Lactosefermentation unerlässlich sind. Bevorzugt werden Lactose- und Tagatosegene verwendet. Insbesondere können die Gene, die für P-β-Gal und Faktor III codieren, verwendet werden, die eine kleine Größe aufweisen und auf geeigneten Restriktionsfragmenten isoliert werden können und in der Lage sind, diejenigen L. lactis-Mutanten zu komplementieren, die eine Defizienz in der Synthese dieser Enzyme aufweisen.
Dieses DNA-Fragment kann ebenfalls für eine oder mehr Funktionen codieren, die dem Milchsäurebakterium eine verbesserte oder neue Eigenschaft(en) verleiht(en). Beispiele dafür sind Strukturgene, die Expressions- und Regulationssignale enthalten, die für Proteinasen und Peptidasen codieren, die es dem Milchsäurebakterium ermöglichen, das Protein in Peptide und/oder Aminosäure abzubauen oder für Bakteriophagen resistente Mechanismen oder für Enzyme, die den Abbau von Citrat beeinflussen oder für Enzyme, die an der Bakteriocinproduktion und/oder Bakteriocinimmunität beteiligt sind oder für heterologe Proteine, wie die Lactosehydrolysierende β-Galactosidase, die stärkespaltende α-Amylase oder das milchgerinnende Chymosin, die durch die Milchsäurebakterien sezerniert werden können oder nicht, codieren.
Zusätzlich kann das DNA-Fragment ein Replikon enthalten, das in Milchsäurebakterien funktional ist und das das DNA-Fragment, falls es in Kreisform vorliegt, als extrachromosomales Plasmid über die Nachkommenschaft der verwendeten Milchsäurebakterien verteilt. Dieses DNA-Fragment kann dann direkt oder nach einigen Verbesserungen, die dem Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet bekannt sind, wie Klonieren, Exprimieren oder ein Sekretionsvektor, verwendet werden. Beispiele für ohne Weiteres verwendbare Replikons sind solche, die aus dem L. lactis-Plasmid pSH71 oder dem konjugativen Plasmid pAMβ1, die mit einer hohen oder einer niedrigen Kopienzahl in vielen Milchsäurebakterien replizieren können, stammen.
Im alternativen Fall, wo das DNA-Fragment kein funktionales Replikon enthält, kann eine Vererbung nur erreicht werden, wenn das DNA-Fragment vollständig oder teilweise in ein Replikon (entweder ein Plasmid oder die chromosomale DNA) integriert ist, das bereits in den transformierten Milchsäurebakterien vorhanden ist. Das Auftreten dieser wird im Allgemeinen erhöht, wenn das DNA-Fragment ebenfalls DNA-Sequenzen aufweist, die mit Teilen des bereits vorhandenen Replikons homolog sind. Die Integration in das Bakterienchromosom bietet ebenfalls die Möglichkeit, die integrierte DNA zu amplifizieren. Die Selektion dafür kann in einer einfachen Weise durchgeführt werden, wenn das als Marker verwendete DNA-Fragment, beispielsweise durch die Gegenwart schwacher Expressionssignale, nur zu einer Wildtypexpression der DNA, die für die Lactosefermentation unerlässlichen komplementären Enzyme codiert, nach der Amplifikation in eine große Anzahl von Kopien führten kann.
Die Kombination des Milchsäurebakteriums und des DNA-Fragments sollte schließlich in einer Weise gewählt sein, dass eine wirkliche Selektion und Stabilisierung des DNA-Fragments durchgeführt werden, wenn Lactose als einziger fermentierbarer Zucker in dem zu verwendenden Kulturmedium vorhanden ist.

EXPERIMENTELLER TEIL

Verwendete Bakterienstämme und Plasmide

Die E.coli-Stämme JM83 (Gene 19 (1982) 259-268) wurde für die routinemäßige Subklonierung mit den pUC-Vektoren verwendet. Desweiteren wurde E.coli JM103 (Nucl. Acids Res. 9 (1981), 309-321) für die M13-Klonierung und E.coli MC1061 (j. Mol. Biol. 138 (1980) 179-207) für die Klonierung mit den Vektoren pAT153 und pNZ12 verwendet. Der Stamm MG1363 ist ein plasmidfreier Stamm von L.lactis NCDO 712 (J> Bacteriol. 154/1873 1.8). Der Stamm MG1820 ist ein Derivat von MG1363, das das Lactoseminiplasmid pMG820 enthält (J. Gen. Microbiol. 132 (1986) 331-340). Beide L.lactis-Stämme stammen von M. J. Gasson, AFRC Institute of Food Research, Norwich, U.K. L.lactis Y2-5 ist eine Mutante mit Faktor III-Defizienz, die durch Ethylmethansulfonatmutagenese des Stamms YP2 erhalten wird. L.lactis YP2 ist ein lactosekonstitutives Derivat von L.lactis C2, worin die plasmidcodierten Gene, die für den Lactosemetabolismus codieren, in die chromosomale DNA mit Hilfe der Transduktion integriert sind (J. Bacteriol. 149 (1982) 420-427, J. Dairy Sc. 67 (1984), 950-959). L.lactis Y2-5 stammt von L. L. McKay, University of Minnesota, St. Paul, USA.
Die E.coli-Plasmidvektoren pUC7 und pUC18/19 haben eine Größe von etwa 2,7 kb und kodieren für die Ampicillinresistenz (ApR) (Gene 19 (1982), 259-268; Gene 33 (1985), 103-119). Der E.coli- Vektor pAT 153 (Nature 283 (1980) 216-218) weist etwa 3,7 kb auf und codiert für ApR und ebenfalls für die Tetracyclinresistenz (TcR). Die M13-Vektoren Mp10 und Mp11 sind bereits beschrieben worden (Nucl. Acids Res. 9 (1981), 309-321).
Der L.lactis-Plasmidvektor pIL253 (Biochimie 70 (1988), Teile 3 und 4) hat eine Größe von etwa 4,8 kb, codiert für die Erythromycinresistenz (Emr) und ist ein Derivat des Konjugatplasmids pAMβ1 mit hoher Kopienzahl (Appl. Environ. Microbiol. 52 (1986) 394-399) und stammt von A. Chopin, INRA, Youy-en-Josas, Frankreich. Die Konstruktion des 4,3 kb-Plasmidvektors pNZ12, der unter anderem in E.coli und Milchsäurebakterien repliziert und für eine Resistenz gegenüber Chloramphenicol (CmR) und Kanamycin (KmR) codiert, besitzt, wie bereits beschrieben wurde, pNZ32 (7,5 kab) und pNZ367 (8,3 kb), die beide das L.lactis pMG820 P- β-Gal, das in pNZ12 kloniert ist, enthalten (EP-A-0,228,726).

Manipulation von E. coli, S. lactis und DNA

Alle Manipulationen mit E.coli und von DNA wurden in vitro nach Standardverfahren (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982) und/oder nach Beschreibung der Hersteller der Restriktionsenzyme und anderer DNA-modifizierender Enzyme (Bethesda Research Laboratories and Boehringer) durchgeführt. Spezielle Techniken für L.lactis, wie die Kultivierung und Medien, Plasmidisolation und Protoplastentransformation sind in (Appl. Environ. Microbiol. 48 (1984), 252-259); EP-A-0,228,726) beschrieben worden. Das M17-Medium (Difco), das mit 0,5% Lactose (LM17) oder 0,5% Glucose (GM17) ergänzt war, wurde zur Züchtung von L.lactis routinemäßig verwendet. In den Stabilitätsexperimenten mit L.lactis wurden ebenfalls ein Molkepermeatmedium (WP), das aus 5% ultrafiltrierter und getrockneter Molke, die 1,9% β-Glycerophosphate, 0,05% Hefeextrakt und 0,05% Caseinhydrolysat enthält, zusammengesetzt ist, verwendet. Dieses WP- Medium, das in der Molkereiindustrie verwendet werden kann, enthält Lactose als einzigen fermentierbaren Zucker. Der Lactoseindikator Agar (LIA), der Elliker-Bouillon, Lactose und den pH- Indikator Bromcresolpurpur enthält, wurde für die Selektion von lac&spplus; und lac&supmin;-Kolonien nach der Beschreibung in (Appl. Microbiol. 23 (1972), 1090-1096) verwendet. Es wurden vollständige Zellen von L.lactis, die im M17-Medium, das 40 mM D,L-Threonin enthielt, vorkultiviert waren, mit Hilfe eines Genimpulselektroporators in einem Elektroporationspuffer, der aus 25% Saccharose, 1 M MgCl&sub2; und 5mN Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 bestand, im Wesentlichen nach den Anweisungen des Vertreibers (Biorad) mit einem einzelnen elektrischen Impuls von 6250 V/cm und einer Kapazität von 25 uF transformiert.

Bestimmung der DNA-Nucleotidsequenz und DNA-Synthese

Es wurden geeignete Restriktionsfragmente mit Hilfe des in JM 103 klonierten M13-Vektors kloniert (Nucl. Acids Res. 9 (1981, 309-321) und die Nukleotidsequenz wurde mit der Didesoxykettenterminationsmethode (Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), 5463- 5467) bestimmt. Es wurden die DNA-Oligonukleotide, die als Primer für die DNA-Sequenzbestimmung oder für die Konstruktion von Mutationen verwendet werden sollen, nach der Phosphoramiditmethode mit Hilfe eines DNA-Cyclonsynthesegeräts nach den Anweisungen des Herstellers (New Brunswick Scientific) synthetisiert.

Proteinanalyse

Es wurden die Proteine mit Hilfe der SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (Nature 227 (1970), 680-685) analysiert, wonach dann die entsprechenden Stellen mit Coomassieblau getrocknet wurden. Die Bestimmung des NH&sub2;-Terminus des geblotteten Proteins wurde mit Hilfe eines Gasphasensequenziergeräts (Applied Biosystems) nach der Beschreibung in (Eur. J. Biochem. 152 (1986) 9-19) durchgeführt. Das Immunblotten wurde mit Hilfe von Kaninchenantikörpern in Kombination mit Peroxidasemarkierten Anti-Kaninchenantikörpern von der Ziege nach der Beschreibung der Lieferfirma (Bethesda Research Laboratories) durchgeführt. Die Aktivität des P-β-Gal wurde nach der Beschreibung in (J. Gen. Microbiol. 132 (1986), 331-340) bestimmt.

BEISPIELE

Beispiel I

Identifikation, Charakterisierung und Klonierung der S.lactis pMG820-codierten Lactosegene.

Das 4,4 kb XhoI-Fragment des L.lactis-Lactoseminiplasmids pMG820 enthält das P-β-Gal-Gen (J. Gen. Microbiol. 132 (1986), 331-340; siehe Fig. 2A). Die DNA-Sequenz dieses Gens und etwa 2 kb aufwärts der DNA sind bestimmt worden und in Fig. 2B gezeigt. Zusätzlich zu einem offenen Leseraster in der Position, die für das P-β-Gal-Gen erwartet wird, gibt es zwei offene Leseraster in diesem Stromaufwärtsbereich. Die folgenden Experimente unterstützen die Folgerung, dass das erste offene Leseraster (129- 448) für die Faktor III-Lactose codiert, das zweite offene Leseraster (450-2158) für die Enzym II-Lactose codiert und das dritte offene Leseraster (2262-3669) für die P-β-Gal codiert:
(i) Die NH&sub2;-Termini des gereinigten Faktor III und P-β-Gal entsprechen denjenigen, die von der DNA-Sequenz des ersten und letzten offenen Leserasters stammen;
(ii) Bei der Klonierung in E.coli gibt ein DNA-Fragment, das das erste offene Leseraster enthält, Anlass zur Synthese eines Proteins mit einem Molekulargewicht der Untereinheit von etwa 10 kD, die mit Anti-Faktor III-Antikörpern reagiert;
(iii) Bei der Klonierung in E.coli gibt ein DNA-Fragment, das das dritte offene Leseraster enthält, Anlass zur Synthese eines etwa 60 kD Proteins, das P-β-Gal-Aktivität aufweist;
(iv) Bei der Analyse in einem sogenannten Hydrophobizitätsdiagramm (J. Mol. Biol. 157 (1982), 105-132) gibt die Aminosäuresequenz, die von der DNA-Sequenz des zweiten offenen Leserasters stammt, Transmembrandomänen, die für ein integrales Membranprotein, wie Enzym II, erwartet werden;
(v) Die Nukleotidsequenz der DNA in allen drei offenen Leserastern und ebenfalls die abgeleitetes Aminosäuresequenz zeigen einen hohen Homologiegrad mit derjenigen von Faktor III, Enzym II und P-β-Gal von Staphylococcus aureus (J. Biol. Chem 262 (1987), 16444-16449).
Die Lactosegene werden von einer möglichen Intercistronregion von 231 Nukleotiden gefolgt, wonach ein neues offenes Leseraster von nicht weniger als 700 Nukleotiden bei Position 3959 beginnt, die wahrscheinlich für das 50 kG Protein X codieren, dessen Existenz kürzlich gezeigt wurde (J. Gen. Microbiol. 132 (1986), 331-340) und das wahrscheinlich eine Rolle bei der Expression der Lactosegene spielt.

Beispiel II

Komplementierung von L.lactis Y2-5 mit einem DNA-Fragment, das das pMG820 Faktor III-Gen enthält.
Das Plasmid pMG820 wurde mit dem Restriktionsenyzm BstEII geschnitten, wonach die hergestellten Restriktionsfragmente mit Klenow-Polymerase stumpf geschnitten wurden. Ein etwa 4 kb Fragment, das das vollständige Faktor III-Gen und Bereiche stromaufwärts enthielt, wurde isoliert und in die HindII-Stelle des E.coli-Vektors pUC7 kloniert. Das erhaltene Plasmid pNZ301 wurde als Quelle für die Isolierung des Faktor III-Gens mit so wenig wie möglich flankierenden DNA-Sequenzen verwendet. Dieses wurde durchgeführt, indem das Faktor III-Gen als 0,4 kb NcoI-XmnI- Fragment (siehe Fig. 2B) isoliert wurde, und nach dem Annealen desselben mit T4-Polymerase, dieses in die HindII-Stelle des E.coli-Vektors pUC7 kloniert wurde. Das Faktor III-Gen wurde aus dem erhaltenen Plasmid pNZ302 als BamHI-Fragment isoliert und in die BamHI-Stelle des E.coli-Vektors pUC18 kloniert. Es wurden zwei Orientierungen erhalten, die mit pNZ303 und pNZ304 bezeichnet wurden. Das Faktor III-Gen wurde aus pNZ303 als ein 0,4 kb XbaI-EcoRI-Fragment isoliert und mit dem 4,8 kb XbaI-EcoRI- Fragment des L.lactis-Vektors pIL253 (Fig. 3) ligiert. Das Faktor III-Gen (0,4 kb), das das XbaI-EcoRI-Fragment enthielt, wurde in ähnlicher Weise aus dem pNZ304 isoliert und mit dem 4,8 kb XbaI-EcoRI-Fragment von pIL253 ligiert. Beide Ligierungsmischungen wurden in L.lactis Y2-5 transformiert. Es wurden aus der Transformation mit der Ligierungsmischung, die pNZ303-DNA enthielt und der Transformation mit der Ligierungsmischung, die pNZ304-DNA enthielt, EmR-Kolonien erhalten, die die gewünschten Plasmide mit einer Größe von 5, 2 kb, pNZ305 bzw. pNZ306 zu enthalten schienen, deren Restriktionskarte in Fig. 3 gezeigt ist. Allerdings schien nur das pNZ305 die Lactosedefizienz des Wirts Y2-5 zu komplementieren. Die Erklärung dafür liegt in der Tatsache, dass das isolierte Faktor III-Gen nicht seinen eigenen Promoter enthält und sich deswegen auf einen externen Promoter verlassen muss, der in der richtigen Orientierung vor dem Gen kloniert sein kann und bereits im Vektorbereich im Konstrukt pNZ305 vorhanden ist. Im Ergebnis ist der L.lactis, der pNZ305 enthält, in der Lage, im Gel Kolonien auf Lactoseindikatoragar und ein Wildtyp-Wachstum auf Medien, die Lactose als einzigen Zucker enthalten, zu bilden.
Der L.lactis Y2-5, der das pNZ305 enthält, ist beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures (Central Office for Mould Coultures) in Barn am 13. Juni 1988 unter der Nr. CBS 416.88 hinterlegt worden.

Beispiel III

Selektion von S.lactis Y2-5-Transformanten, die pNZ305 enthalten, ohne die Verwendung von Antibiotika.
S.lactis Y2-5 wurde mit 1 ug pIL253, pNZ305 oder ohne DNA transformiert, und die lactoseproduzierenden und/oder erythromycinresistenten Kolonien wurden selektiert. Das in Tabelle 1 gezeigte Ergebnis zeigt, dass vergleichbare Mengen an lac&spplus; EmR und EmR- Transformanten mit pNZ305-DNA erhalten wurden, allerdings nicht mit der Vektor pIL253-DNA. Es hat sich ebenfalls herausgestellt, dass eine direkte Selektion von Transformanten, die pNZ305-DNA enthielten, auf LIA ohne ein Antibiotikum möglich war. Der Hintergrund der lactoseproduzierenden Revertanten (etwa 4 · 102 ohne DNA oder pIL253-DNA) zeigt keine großen Probleme in diesem Zusammenhang, weil von den 6 · 102 lac&spplus;-Transformanten, die mit pNZ305-DNA erhalten wurden, 20% sich als EmR herausstellten. Es hat sich gezeigt, dass diese lac&spplus;-Transformanten erwartungsgemäß die pNZ305-Plasmid-DNA enthielten. Daher ist eine Selektion der lac&spplus;-Tranformanten auf Lactoseindikatoragar, gefolgt von einem einfachen Plasmidscreening angebracht, um S.lactis Y2-5- Transformanten zu erhalten, die das rekombinante Plasmid pNZ305 enthalten, das unter anderem für Faktor III codiert, ohne dass antibiotikaresistente Marker verwendet werden.

Beispiel IV

Stabilität von S.lactis Y2-5, der pNZ305 enthält.

Eine Übernachtkultur wurde von einer isolierten Kolonie von S.lactis Y2-5, der pNZ305 enthielt, in LM17-Medium, das 5 ug/ml Em enthielt, hergestellt. Durch eine 1000-fache Verdünnung davon wurden 10 ml Kulturen auf LM17, WP und GLM 17 hergestellt. Diese wurden bei 30ºC inkubiert und auf 1.000 alle 10-14 Stunden in frischem Medium der gleichen Zusammensetzung verdünnt.
Die Menge der lac&spplus;- und lac&supmin;-und ebenfalls der lac&spplus;-EmR-Zellen wurde regulär durch Ausplattieren auf LIA, das kein oder 5 ug/ml Em enthielt oder durch Ausstreichen von lac&spplus;- oder lac&supmin;-Kolonien auf LTA, das 5 ug/ml Em enthielt, bestimmt. Das Ergebnis nach 50 oder 100 Generationen Wachstums in den verschiedenen Medien zeigt, wie in Fig. 2 zu ersehen ist, dass das pNZ305 unter nichtselektiven Bedingungen (Glucose als Zucker) nicht selektiv ist. Das Plasmid ist allerdings während des Wachstums unter selektiven Bedingungen (Lactose als Zucker) stabilisiert, sowohl in LM17-Bouillon und dem in der Industrie verwendeten Medium WP. Es hat sich herausgestellt, dass alle lac&spplus;-Zellen des weiteren EmR waren, woraus geschlossen werden konnte, dass keine Genumwandlung vom chromosomal mutierten Faktor III-Gen in die plasmidlokalisierte homologe Kopie auftrat, was zu einem lack- Phänotyp und einem Plasmidverlust unter nichtselektiven Bedingungen führen würde.
Schließlich ist ersichtlich, dass die gesamte Plasmid-DNA im Chromosom integriert ist, wenn der pNZ305 enthaltende Stamm S.lactis Y2-5 für 50 Generationen auf einem LM17-Medium kultiviert wird. Hybridisierungsexperimente haben gezeigt, dass in diesem Fall eine Amplifikation bis zu mehr als 25 Kopien der gesamten Plasmid-DNA erreicht wird.

Beispiel V

Konstruktion eines defizienten pMG820 P-β-Gal-Gens.

Es wurde ein etwa 4,6 kb ClaI(ClaC)-Fragment aus pMG820-DNA isoliert und in den E.coli-Vektor PAT 153 kloniert. Von den beiden Orientierungen wurden die pNZ310 und pNZ311 erhalten. Es hat sich herausgestellt, dass das pNZ310 die höchste spezifische P- β-Gal-Aktivität hatte, weil in diesem Konstrukt das P-β-Gal-Gen unter der Kontrolle des anti-tet-Promotors des Vektors ist. Es wurde pNZ310-DNA isoliert und mit ApaI, eine nur einmal vorkommende Stelle im P-β-Gal-Strukturgen (siehe Fig. 4) verdaut. In diese linearisierte pNZ310-DNA wurde ein 21 bp synthetisches DNA-Fragment (s-DNA) kloniert, das aus einer Doppelstrang-DNA bestand, worin die Basensequenz der einzelnen Stränge wie folgt war: 5'-CGGGATCCGTCGACTAGGGCC-3' und 3'-CCGGGCCCTAGGCAGCTGATC- 5'. Diese s-DNA ist so gewählt, dass die ApaI-Stellen das Fragment flankieren, und im Ergebnis kann es immer durch Verdauung mit dem Enzym entfernt werden, so dass es die einmaligen SmaI-, SalI- und BamHI-Restriktionsstellen enthält und es schließlich das Leseraster des P-β-Gal-Gens mit einem TAG-Stop-Codon unterbricht. Das erhaltene Plasmid pNZ325 zeigt keine P-β-Gal- Aktivität in E.coli und enthält die erwarteten neuen SmaI-, SalI- und BamHI-Stellen. Zusätzlich kann ein aktives P-β-Gal-Gen durch Verdauen von pNZ325 mit ApaI erhalten werden, wonach MC1061 mit der gereinigten linearen pNZ325-DNA transformiert wird. Hieraus wird ersichtlich, dass, beginnend von der entsprechenden Nukleotidsequenz der Lactosegene, es einfach ist, in vitro ein inaktiviertes Lactosegen mit stellengerichteter Mutaginese zu erhalten.

ÜBERSCHRIFTEN

Fig. 1: Schema, womit Lactose durch L.lactis fermentiert wird, um Lactat zu bilden (nach FEMS Microbiol. Rev. 46 (1987)-231; Ant. von Leeuwenhoek 49 81983/, 209-224; Biochimie 70 (1988), Teile 3 und 4).
Fig. 2A: Restriktionskarte von pMG820, die die Position der Lactosegene zeigt.
Fig. 2B: Nukleotidsequenz von den Genen, die in Fig. 2A gezeigt sind.
Fig. 3: Restriktionskarten von pNZ305 und pNZ306, die aus dem Vektor pIL253 und dem L.lactis-Faktor III-Gen zusammengesetzt sind. MCS bedeutet die multiple Klonierungsstelle von pIL253, die aus folgenden Stellen nacheinander zusammengesetzt ist: ClaI, XbaI, XhoI, SacI, XhoI, XbaI, ClaI, HindIII, PstI, SalI, BamHI, SmaI, EcoRI. Die MC5 von pNZ305 und pNZ306 (nicht gezeigt) stammt meistens von pUC18 und ist aus ClaI-XbaI-BamHI- SmaI-KpnI-SacI-EcoRI-Stellen zusammengesetzt, wobei das Faktor III-Gen in die einzige BamHI-Stelle in den angegebenen Orientierungen eingesetzt ist.
Fig. 4: Restriktionskarte von pNZ310 und pNZ325. s-DNA entspricht einem synthetischen 21 bp DNA-Fragment, das die ApaI- SmaI-BamHI-SalI-ApaI-Stellen und das TAG-Stopcodon, die vorher im Text beschrieben wurden, enthält. TABELLE 1
Tabelle 1: Transformation von S.lactis Y2-5 gefolgt von der Selektion auf dem Gel, wobei dze lac&spplus;- und lac&spplus;EmR-Tranformanten auf LIA kein oder 5 ug/ml Em und die EmR-Tranformanten auf GM17 Agar 5 ug/ml Em-Transformanten auf LIA, das kein oder 5 ug/ml enthielt, enthielten. TABELLE 2
Tabelle 2: Stabilität von S.lactis Y2-5, der pNZ305 enthielt und für 50 oder 100 Generationen auf einem Medium, das Lactose (LM17, WP) oder Glucose (GM17) enthielt, wachsen gelassen wurde.

Claims

1. Verfahren zur Selektion von Milchsäurebakterien, die rekombinante DNA enthalten, wobei die DNA mit Hilfe eines Markers, der in Nahrungsmitteln für den menschlichen Verzehr akzeptabel ist, stabilisiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass ein Milchsäurebakterium, dem ein oder zwei für die Lactosefermentation unerlässliche Enzyme fehlen, die aus Enzym II, Faktor III, p-β-Galactosidase, Gal-P-Isomerase, Tagatose- 6-P-Kinase und/oder Tagatose-1,6-diP-Aldolase gewählt sind, mit einem DNA- Fragment transformiert wird, das als Marker

- ein oder mehrere Gene enthält, die mindestens für das eine oder die zwei Enzyme, die im Milchsäurebakterium fehlen, codieren und

- eine Größe aufweist, die höchstens den Genen entspricht, die für Phospho-β-Galactosidase und Enzym III codieren und ebenfalls ein oder mehr Strukturgene enthält, die für eine verbesserte oder neue Eigenschaft des Milchsäurebakteriums codieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Milchsäurebakterium zum Lactococcus oder Lactobacillus gehört.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Milchsäurebakterium Lactococcus lactis ist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Bakterium ein Ergebnis einer Deletion, einer Insertion oder einer Punktmutation in den Lactogenen ist, die sich auf der chromosomalen DNA befinden und defizient in der Synthese von einem oder zwei der Enzyme Enzym II, Faktor III, p-β-Galactosidase, Gal-6-P- Isomerase, Tagatose-6-P-Kinase und/oder Tagatose-I,6-diP- Aldolase sind.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Milchsäurebakterium ein Ergebnis einer Deletion, einer Insertion oder einer Punktmutation in den Lactosegenen ist, die sich auf Plasmid-DNA befinden und defizient in der Synthese von einem oder zwei der Enzyme Enzym II, Faktor III, p-β-Galactosidase, Gal-6-P- Isomerase, Tagatose-6-P-Kinase und/oder Tagatose-1, 6-diP- Aldolase sind.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Milchsäurebakterium in der Synthese eines lactosespezifischen Faktors III defizient ist und das DNA-Fragment mindestens für diesen Faktor III codiert.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Milchsäurebakterium in der Synthese einer Phospho-β-Galactosidase defizient ist und das DNA- Fragment mindestens für diese Phospho-β-Galactosidase codiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Fragment ebenfalls für die Herstellung von proteolytischen Enzymen, wie (die) Proteinase(n) oder Peptidase(n), codiert, für die Unempfindlichkeit gegenüber Bakteriophagen codiert, gegen die Zersetzung von Citrat codiert, für die Bakteriocinproduktion und/oder Bakteriocinimmunität codiert oder für β-Galactosidase, α-Amylase, Chymosin oder Pepsin codiert.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Fragment ebenfalls ein Replikon enthält, das im verwendeten Milchsäurebakterium funktional ist.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Fragment ebenfalls eine DNA- Sequenz enthält, die zu der DNA des verwendeten Milchsäurebakteriums homolog ist und im Ergebnis das gesamte DNA- Fragment oder wesentliche Teile davon in der DNA dieses Milchsäurebakteriums integriert und möglicherweise amplifiziert ist oder sind.

11. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das als Marker verwendete DNA-Fragment von DNA aus einem Milchsäurebakterium abgeleitet ist.

12. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das DNA-Fragment in Form eines Klonierungs-, Expressions- , Sekretions- oder Integrationsvektors vorliegt.

13. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin weiterhin die Milchsäurebakterien in einem Medium, das Lactose als im Wesentlichen den einzigen fermentierbaren Zucker im Kulturmedium enthält, gezüchtet/gehalten werden.

14. L.lactis Y2-5, der FNZ305 enthält und im Central Bureau for Schimmelcultures in Baarn, Niederlande unter der Nummer CBS 416.88 hinterlegt ist.