DE69330920T2

DE69330920T2 - Integrative Genexpression in Mikroorganismen mit Nahrungsmittelqualität

Info

Publication number: DE69330920T2
Application number: DE69330920T
Authority: DE
Inventors: Jan Knol; Olivier Marciset; Beat Mollet
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1992-04-07
Filing date: 1993-03-31
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2013-04-01
Also published as: EP0965641A3; DE69330920D1; AU3670993A; DK0564965T3; ATE207123T1; EP0965641A2; EP0564965A2; US5491079A; MX9302042A; EP0564965B1; JP2634365B2; AU665626B2; NZ247338A; EP0569604A1; BR9301468A; CA2093152C; CA2093152A1; EP0564965A3; JPH0654692A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nahrungsmittel-geeignetes Gen-Integrations- und Expressionssystem in Mikroorganismen, insbesondere in Streptococcus thermophilus oder in Lactobacillus bulgaricus. Die Erhaltung bzw. stabile Einschleusung und Expression irgendeines homologen und/oder heterologen Gens wird indirekt selektiert, indem die Zellen einfach in ihrem natürlichen Lebensraum, insbesondere Milch, wachsen bzw. wachsen gelassen werden.
Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) ist ein sehr wichtiger Mikroorganismus für die Fermentation von Nahrungsmitteln. Er wird vorwiegend bei der Fermentation von Milchprodukten verwendet, wobei er insbesondere als Starterkultur, oftmals in Kombination mit anderen homo- oder heterofermentativen Bakterien, bei der Yoghurt- und Käseherstellung verwendet wird. Erst vot kurzem erfolgte ein Fortschritt in der Genetik dieses Organismus. Mehrere Genübertragungs-Techniken, wie Konjugation [1, 2], Transfektion [3] und Transformation [4,5] wurden für diese Art beschrieben. Dies ermöglichte bislang die Untersuchung und Verwendung bereits vorhandener bakterieller Plasmide als Klonierungsvektoren [3,5] und ebenso als einen Anfangspunkt beim Entwerfen neuer Vektorsysteme [6]. Obwohl sehr wenig über transkriptionelle und translationelle Kontrollregionen in S. thermophilus [7] bekannt ist, wurde die Expression einiger heterologer, auf Plasmide überbrachter und darauf erhaltener Gene beschrieben [8]. Die Expressionsstärken (expression levels) sind jedoch nicht vorhersehbar und oftmals geringfügig oder nicht erfassbar [7].
Plasmide werden nicht a priori stabil segregiert und können unter nicht-selektiven Wachstumsbedingungen verloren gehen. Dies trifft insbesondere bei Plasmidsystemen zu, die gentechnisch hergestellt werden und heterologe DNA aufweisen. Eine zum Sicherstellen der Plasmid-Erhaltung angewendete Selektion verwendet in den meisten Fällen Marker-Gene, welche Antibiotika-Resistenz weitergeben. Ein derartiges Selektionssystem kann nicht bei der Nahrungsmittel-Herstellung angewendet werden, obgleich es bei Experimenten im Labormaßstab zweckmäßig ist. Bislang wurde kein Nahrungsmittel-geeignetes Genübertragungs-System für S. thermophilus beschrieben.
Die EP 0 355 036 A1 offenbart ein Verfahren zur Selektion und Erhaltung von rekombinanter DNA in Milchsäure-Bakterien. Das Milchsäure-Bakterium wird in dem Verfahren mit einem DNA-Fragment transformiert, das als Marker fehlende Enzyme codiert. Die ausgewählten Selektionsmarker machen die Verwendung von Antibiotika-Resistenz-Markern unnötig, wobei sie gleichzeitig für Nahrungsmittel geeignet und verwendbar sind.
Eine erste erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Integration eines Fremdgens in die chromosomale DNA eines Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus, insbesondere in die chromosomale DNA von Streptococcus thermophilus oder von Lactobacillus bulgaricus, derart dass die Erhaltung und Expression des Gens durch indirekte Selektion beim Wachstum der Zellen in ihrem Standardmedium, insbesondere Milch, sichergestellt wird.
Eine zweite erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Integrationsverfahrens, das Nahrungsmittel geeignet ist (wobei das zu integrierende Gen nicht in Betracht gezogen wird).
Eine dritte erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Integrationsverfahrens, bei dem ein direktes Selektieren nach der Funktion des zu integrierenden und zu exprimierenden Fremdgens bei jeglichem Schritt des Konstruktionsverfahrens nicht erforderlich ist.
Eine vierte erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines gentechnisch modifizierten, durch ein derartiges Verfahren erhaltenen Mikroorganismus.
Eine fünfte erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Donor-Plasmids zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.
Eine sechste erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Fermentationsverfahrens, in dem ein Nahrungsmittel-geeignetes Substrat mit einem derartigen gentechnisch modifizierten Mikroorganismus fermentiert wird.
Eine siebte erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines durch ein derartiges Fermentationsverfahren erhaltenen Nahrungsmittelprodukts oder Nahrungsmittelzusatzes bzw. Nahrungsergänzungsmittels.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Integration eines Fremdgens ohne Promotor in ein Operon vor mindestens einem essentiellen Cistron auf der DNA eines Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus bereitgestellt, welches umfasst,
- Transformieren eines Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus-Stammes mit einem Donor-Plasmid, welches in dem Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus-Stamm nicht repliziert, und welches das Fremdgen als einen funktionellen Teil des Operons vor dem essentiellen Ciströn trägt,
- Isolieren von Transformanten mit Plasmid-Genom-Kointegraten, und
- Auflösen der Kointegrate aufgrund eines -Selektionsdrucks auf eine korrekte Funktionsfähigkeit des essentiellen Cistrons beim Wachstum in Standardmedium, so dass das Genom des aufgelösten, Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus-Stammes das Donor-Plasmid nicht beinhaltet und eine korrekte Expression des Fremdgens als ein funktioneller Teil dieses Operons erreicht wird.
Vorzugsweise ist der Mikroorganismus ein Milchsäure-Bakterium, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus und Bifidobacterium und den Nahrungsmittel-geeigneten Stämmen der Gattungen Proprionibacterium und Staphylococcus.
Vorzugsweise ist der Mikroorganismus Streptococcus thermophilus oder Lactobacillus bulgaricus.
Auch ist das Plasmid vorzugsweise von einem Plasmid abgeleitet, welches das gesamte oder einen Teil des Operons trägt.
Weiterhin ist das Donor-Plasmid vorzugsweise in einem anderen Wirtssystem als der Mikroorganismus zur Selbstreplikation befähigt und weist weiter einen selektierbaren Gen- Marker auf, der in dem Mikroorganismus und sowie in dem anderen Wirtssystem funktionell ist. Das andere Wirtssystem kann beispielsweise E. coli sein.
In einer bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Operon das lac-Operon und das essentielle Cistron ist das lacZ-Gen. Bei dieser Ausführungsform kann das Donor- Plasmid erhalten werden, indem die Wildtyp-Sequenz des lac-Operons zur Erzeugung einer NdeI-Restriktionsstelle zwischen dem lacS- und dem lacZ-Gen modifiziert und das Fremdgen in die erzeugte NdeI-Stelle inseriert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch ein Transformieren des Mikroorganismus durch Elektroporation umfassen.
Das erfindungsgemäße Prinzip beruht darauf, daß ein Fremdgen in ein vitales Operon des Genoms eines Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus, insbesondere beispielsweise S. thermophilus, derart integriert wird, dass die korrekte Funktionsfähigkeit, d. h. Transkription und Translation, des Operons bewahrt bleibt und dass das heterologe Gen als ein ergänzender bzw. integrativer, funkioneller Teil des Operons vorliegt. Zum Sicherstellen einer korrekten Expression des integrierten Gens sollte es vor ein essentielles Gen (Cistron) des selben Operons gesetzt werden. Folglich stellt der Selektionsdruck auf das essentielle Gen während des Zellwachstums unter normalen Bedingungen im Standardmedium, beispielsweise in Milch, die genetische Erhaltung und Expression des integrierten Gens sicher. Je nachdem welches Operon als Trägersystem gewählt wird, können verschiedene Expressionsstärken und/oder Regulationsmöglichkeiten angenommen werden.
Die vorliegende Erfindung weist beispielsweise die folgenden Vorteile gegenüber beschriebenen Gentransfer-Systemen in Nahrungsmittel-geeigneten Mikrooiganismen, insbesondere in S. thermophilus, auf:
- Sie ist homogen und Nahrungsmittel geeignet (wobei das zu exprimierende Fremdgen nicht in Betracht gezogen wird).
- Die Integration eines Gens in das Genom ist stabil. Sie folgt der strikten Kopiezahl-Steuerung des Wirtszellgenoms.
- Die Expression des Gens wird durch ein Wirtszellen-eigenes Promotor-System gesteuert.
- Jegliches Fremdgen von homogenem, heterogenem oder synthetischem Ursprung, oder von einer Kombination davon, kann exprimiert werden, ohne daß der Bedarf nach einer direkten Selektion, einem beobachtbaren Phänotyp oder einer Anpassung des Wachstumsmediums besteht.
Eine Selektion auf Erhaltung und Expression des Gens erfolgt indirekt beim Wachstum der Zellen in ihrem Standardmedium, beispielsweise in einem Medium auf Milchbasis, insbesondere in Milch, Milch-Permeat oder Molke.
Hierbei sei angemerkt, dass der Ausdruck "Fremdgen" in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen durchwegs die Bedeutung eines homologen, heterologen oder künstlichen DNA-Abschnitts hat, der ein nutzbares Produkt, wie beispielsweise ein Enzym, codiert.
In einem Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus, insbesondere beispielsweise in S. thermophilus, können zum Erreichen einer integrativen Genexpression die folgenden Schritte unternommen werden:
- Entwerfen eines Donor-Plasmids. Zum direkten Selektieren auf Integrationsereignisse in S. thermophilus sollte das Donorplasmid nicht selbst replizieren können. Es sollte einen selektierbaren Genmarker aufweisen, der in S. thermophilus funktionell ist, und einen DNA-Abschnitt enthalten, der homolog zu dem S. thermophilus- Genom ist. Vorzugsweise kann das Donor-Plasmid für eine zweckmäßige, gentechnische Herstellung und Plasmidproliferation in einem anderen Wirtssystem als in S. thermophilus, beispielsweise in E. coli, replizieren.
- Integrations-Targeting. Eine Integration des Donor-Plasmids erfolgt über eine Rekombination zwischen homologen DNA-Abschnitten des Donor-Plasmids und dem Genom von S. thermophilus. Das Donor-Plasmid, welches das zu integrierende Gen trägt, muss derart ausgelegt bzw. hergestellt sein, dass eine korrekte Integration des Gens in das Operon sichergestellt wird. Bei einer Integration wird zwischen dem Genom und dem Donor-Plasmid eine genetische Konfiguration, die als Kointegrat bezeichnet wird, ausgebildet.
- Optimierung des Transformationsverfahrens für S. thermophilus. Die Transformationshäufigkeit (d. h. die Anzahl der Transformanten pro ug eingesetzter Plasmid- DNA) muss angemessen hoch sein, um erfassbare Integrationsereignisse zu erhalten. Die bislang beschriebenen Transformationsverfahren waren zum Erfassen von Integrationsereignissen nicht ausreichend. Deshalb wurde das Verfahren für S. thermophilus durch die Verwendung der Elektroporationstechnik optimiert.
Genom-Integration. Eine Integration von Genen, oder Teilen davon, aus Donor- Plasmiden in das Genom von S. thermophilus wurde bislang noch nicht beschrieben. Durch das optimierte Transformationsprotokoll können 1-10 Integranten pro 1 ug eingesetzter Plasmid-DNA reproduzierbar isoliert werden. Jedes Integrationsereignis führt zur Bildung eines Kointegrats.
- Auflösung der Kointegrate. Bei Auslösung des Plasmid-basierenden Selektionssystems weist ein Wirtszellen-eigenes Rekombinationssystem die Neigung auf, die Kointegrat-Struktur aufzulösen und folglich das Vektor-Grundgerüst bzw. -Rückgrat des Donor-Plasmids zu eliminieren. Von E. coli stammende DNA-Sequenzen und Antibiotika- Resistenz-Marker gehen verloren. Zum Auswählen der gewünschten Endkonstruktion unter den verschiedenen, möglichen Auflösungs-Endprodukten, müssen einzelne Abkömmlinge der Transformanten unter Verwendung von DNA-Hybridisierungstechniken [9] (Beispiel 1) durchgemustert werden, oder sie können unter Verwendung eines in geeigneter Weise entworfenen Wirtsstammes zur Integration direkt selektiert werden (Beispiel 2).
Die Durchführbarkeit des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde gezeigt, indem ein von dem Lactococcus lactis-Plasmid pNZ12 [10] abgeleitetes Chloramphenicol-Acetyltransferase-(cat)-Gen ohne Promotor in das lac-Operon von S. thermophilus zwischen den zwei Genen lacS und lacZ [11-13] integriert wurde. In Fig. 1 wird der Genaufbau des modifizierten Operons gezeigt, das nun das ursprüngliche lac-Operon auf dem S. thermophilus-Genom ersetzt. Eine Untersuchung von unabhängigen Kulturen nach Wachstum in Milch über mehr als 100 Generationen (ohne Selektion auf Chloramphenicol) zeigt, dass das cat-Gen dauerhaft erhalten bleibt. Weiterhin vurde gezeigt, daß eine Expression und Regulation des cat-Gens parallel zu der des β-Galaktosidase-(lacZ)-Gens verläuft, was für das Wachstum von S. thermophilus in Milch vital ist.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Bakterien und Plasmide

S. thermophilus ST11, ein Starter-Stamm für die Joghurt-Herstellung, stammt aus der Sammlung der Anmelderin. Er wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 29.03.93 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de 1'Institut Pasteur, 25 nie de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankreich hinterlegt, wobei er die Nummer I-1292 erhielt. Bei den verwendeten E. coli-Stämmen handelt es sich um BZ234 (Sammlung des Biozenter, Universität Basel, Schweiz) und JM108 [14]. Bei den Plasmiden handelt es sich um: pVA838 [15], pNZ12 [10], pGEM-SZf (Promega, USA), pUC-838-1 (pUC18 [14] mit dem 1,7 kb-HindIll-AvaI-Fragment mit dem Erythromycin-Resistenzgen (Emr) von pVA838, das glatte bzw. stumpfe Enden aufweist und in die einzige SmaI-Stelle inseriert ist), pGEMS-838-2 (pGEM-SZf, welches das identische 1,7 kb-Fragment von pVA838 wie pUC-838-1 aufweist, das glatte Enden aufweist und in die einzige EcoRV-Stelle inseriert ist), pDP211 (pUC 19 [14] mit dem 7,0 kb-PstI-Fragment, welches das lacZ-Gen von S. thermophilus ST11 aufweist, das in die einzige PstI-Stelle kloniert ist (ähnliche Konstruktion wie pRH116 [11])), pDP222 (pDP211 mit dem lacZ-internen 1,3 kb--Fragment, das deletiert ist durch Schneiden mit Bglil und nachfolgende Religation), pDP228 (pUCl9 mit dem 2,4 kb-PstI-SpeI-Fragment von pDP211, das in seine einzigen PstI- und SpeI-Stellen kloniert ist) und pDP301 (pKK223-3 [Pharmacia, Inc., USA] mit dem 4,2 kb-EcoRI-Fragment, welches das lacS-Gen von ST11 aufweist, das in die einzige EcoRI-Stelle kloniert ist (identische. Konstruktion wie pEKS8 [12])) (Fig. 2). Das Plasmid pUC-838-1 wurde über B. Suri, Ciba-Geigy Ltd., Schweiz, bezogen und die Plasmide pGEMS-838-2, pDP211, pDP222, pDP228 und pDP301 wurden über D. Pridmore, Nestec Ltd., Schweiz, bezogen.

Medien

S. thermophilus wurde in HJL (3% Trypton, 1% Hefe-Extrakt, 0,5% KH&sub2;P0&sub4;, 0,5% Rindfleisch-Extrakt und 1% Lactose), M17-Nährlösung (Difco Laboratories) und MSK (9% rekonstituiertes Magermilch-Pulver mit 0,1% Hefe-Extrakt ergänzt) wachsen gelassen. Wenn angegeben, wurden die Medien mit 1% Glucose, 1% Lactose oder 1% Saccharose ergänzt. E. coli-Stämme wurden in LB (0,5% NaCl, 1% Trypton, 1% Hefe-Extrakt) wachsen gelassen. Durch Zugabe von 1,5% Agar wurden die Medien zum Plattieren verfestigt. Erythromycin, Chloramphenicol, Ampicillin, X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) und IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) wurden wie angegeben individuell zugegeben. DNA-Präparation

1) Plasmid-DNA aus E. coli.

Plasmid-DNA aus E. coli wurde isoliert und wurde nach Bedarf gemäß Maniatis et al. [16] an CsCI-Gradienten gereinigt.

2) Genomische DNA aus S. thermophilus.

Die Zellen wurden über Nacht bei 42ºC unter Anaerobiose (Anaerobic Systems, BBL GasPak, Becton Dickinson & Co.) in 15 ml mit 1% Glucose ergänzter HJL-Nährlösung bzw. Nährbouillon wachsen gelassen. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation geerntet und einmal in 1M NaCl gewaschen. Die genomische DNA wurde, wie bei Delley et al. [17] beschrieben, isoliert und bei 4ºC gelagert.
Transformationsverfahren für S. thermophilus ST11
Bei den zum Optimieren der Transformation für S. thermophilus ST11 verwendeten Plasmiden handelt es sich um pVA838 und pNZ12. Beide replizieren sowohl in E. coli, als auch in S. thermophilus, und ihre Antibiotika-Resistenz-Marker, Erythromycin beziehungsweise Chloramphenicol, sind in beiden Wirtssystemen für eine-geeignete Selektion funktionell. Als Transformationsverfahren wurde die Elektroporation verwendet. Die folgenden Parameter wurden berücksichtigt und optimiert: Wachstum der Wirtszellen, Vorbereitung der Zellen, Elektropulsationsparameter, Pufferzusammensetzung für Pulsation, Expression und Ausplattierung transformierter Zellen. Das optimierte Verfahren wird nachstehend beschrieben.
S. thermophilus ST11 wurde in einem mit Glucose ergänztem HJL-Medium bei 42ºC über Nacht wachsen gelassen. Am nächsten Tag wurden 33 ml eines identischen, frischen Mediums mit 700 ul der Übernachtkultur angeimpft und bei 42ºC für 1-3 Generationen (maximale OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,3) wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5 min bei 2000 g) geerntet, einmal mit 5 mM KPO&sub4;-Puffer (pH 7) gewaschen, vorsichtig in frisch hergestelltem, eiskaltem EPM auf eine exakte OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,9 resuspendiert (EPM: 0,3 M Raffinose, 5 mM KP0&sub4;-Puffer (pH 6,1), 0,5 mM MgCl&sub2;), und bei 0ºC auf Eis aufdewahrt. 200 ul der Zellsuspension wurden in eine vorgekühlte (0ºC), 1 ug Plasmid-DNA enthaltende 0,2 cm- Elektroporationsküvette zugegeben, gemischt, und mittels der Gene-pulser-Vorrichtung (Gene pulser apparatus, BioRad Laboratories, USA) bei 25 uF, 400 2 und 2,05 kV elektroporiert. Unmittelbar nach der Pulsation wurde 1 ml 1,2-fach konzentriertes M17, das mit Saccharose ergänzt war, in die Küvette zugegeben, mit den Zellen vermischt, in ein steriles Röhrchen überführt und während 4 Stunden bei 42ºC inkubiert. Anschließend wurden 4 ml geschmolzener Weichagar (M17 mit Saccharose und 0,6% Agar ergänzt) zu der Kultur zugegeben und das Gemisch wurde auf einer M17-Agarplatte ausplattiert, welche Saccharose und 2,5 ug/ml Erythromycin (für Plasmid pVA838) oder 2,5 ug/ml Chloramphenicol (für Plasmid pNZ12) enthält. Die Platte wurde bei 42ºC während 2-3 Tagen unter anaeroben Bedingungen (BBL GasPak, Becton Dickinson & Co.) inkubiert.

DNA-DNA-Hybridisierung

Genomische DNA von S. thermophilus wurde mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert und auf GeneScreen-Membranen überführt. Southernblot-Hybridisierungen wurden nach der Beschreibung von Southern [9] durchgeführt. DNA-Sonden wurden durch das Random-Priming-Verfahren 32P-markiert [16]. Alternativ konnte ein nicht-radioaktives, Verstärkte-Chemilumineszenz (enhanced chemiluminescence)- Markierungs-Verfahren für die DNA-Sonden (ECL-System, Amersham) verwendet werden. Hybridisierung und Waschen der Blots wurde unter stringenten Bedingungen durchgeführt.

Andere DNA-Manipulationen

Agarosegelelektrophorese, Restriktionsenzym-Digestionen bzw. -Verdauungen, Ligationen, Behandlungen mit alkalischer Phosphatase und Transformation von E.coli-Stämmen wurden nach Standardverfahren [16] durchgeführt. Synthetische Oligonucleotide wurden von D. Pridmore (Nestec Ltd., Schweiz) mit einem Applied Biosystems 380B-DNA-Synthesegerät hergestellt und auf Nap-10-Gelfiltrationssäulen von Pharmacia LKB gereinigt. PCR wurde gemäß Saiki et al. [18, 19] durchgeführt.

Beispiel 1

Integration des cat-Gens in das lac-Operon

Das lac-Operon von S. thermophilus befindet sich auf dem Bakteriengenom und besteht aus zwei Genen, dem Lactose-Permease (lacS)-Gen und dem β-Galaktosidase (lacZ)-Gen. Sie sind durch lediglich drei bp getrennt [12]. Beabsichtigt wird, ein "fremdes" Gen derart in dieses Operon zwischen dem lacS- und dem lacZ-Gen einzufügen, daß eine identische Beabstandung, d. h. 3 bp, zwischen jedem der 3 Gene vorliegt, und folglich die Eigenschaften des Operons zu bewahren. Ein Selektionsdruck auf die Expression des lacZ-Gens stellt die Expression der beiden anderen Gene sicher. Weiterhin werden durch den Wirt vermittelte spontane Deletionen oder Umordnungen in oder an dem "fremden" Gen-Locus in den meisten Fällen die korrekte Funktionsfähigkeit des Operons beeinflussen, und folglich durch die Selektion auf die lacZ- Aktivität eliminiert werden.
Das Chloramphenicol-Acetyltransferase (cat)-Gen wurde als ein Modell-Gen für eine Integration ausgewählt. Eine integrative Genexpression dieses Gens sollte den Wirtszellen, d. h. S. thermophilus, gegenüber dem Antibiotikum Chloramphenicol Resistenz verleihen, was während der verschiedenen experimentellen Schritte einfach getestet und verfolgt werden kann. Weiterhin gibt es zweckmäßige Assays zur quantitativen Bestimmung des Gehalts an exprimierter Chloramphenicol-Acetyltransferase [20].
Zur Herstellung der geeigneten genetischen Konstruktionen wurde ein Teil des lac-Operons, das die Verbindungsregion (junction region) des lacS- und lacZ-Gens enthält, isoliert und in E. coli kloniert. Durch in vitro-Mutagenese, unter Verwendung der PCR-Technik wurde eine NdeI- Restriktionsstelle eingeführt, welche die Sequenz CA/TATG direkt vor dem lacZ-Gen erkennt, wobei sie mit dessen ATG-Startcodon überlappt (Fig. 3a). Die Beabstandung der zwei Gene verbleibt intakt und die Sequenzveränderungen lagen innerhalb des Abstandsbereichs und beeinflussten nicht die Primärsequenz der Gene. Anschließend wurde das cat-Gen des Lc. lactis- Plasmids pNZ12 mit Primern durch PCR amplifiziert, wobei eine NdeI-Stelle eingeführt wurde, am Anfang, überlappend mit dem ATG-Startcodon, und am Ende des Gens, unmittelbar nach dem TAA-Stoppcodon angeordnet. Das amplifizierte cat-Gen wurde an dessen neuen NdeI- Stellen in die neu geschaffene NdeI-Stelle zwischen dem lacS- und dem lacZ-Gen inseriert, wobei folglich die gewünschte neue Operon-Struktur erzeugt wird, die nun aus drei perfekt angeordneten Genen besteht (Fig. 3b).
Plasmide, welche die Konstruktion mit dem integrierten cat-Gen enthalten, wurden in S. thermophilus transformiert. Da die Plasmide in diesem Wirtssystem nicht autonom replizieren können, konnten sie als Plasmide nicht erhalten bzw. stabil eingeschleust werden, und wurden verworfen bzw. scheiterten. Bei geeigneter Selektion konnten jedoch seltene Integrationsereignisse von Plasmiden in das Wirtszellgenom beobachtet und isoliert werden, in welchem sie erhalten und passiv repliziert wurden. Eine Selektion von Integrationsereignissen basierte auf dem plasmidkodierten Erythromycin-Resistenzgen und führte zu der Isolierung von Kointegraten zwischen dem Bakteriengenom und den Plasmiden, die durch ein einziges Rekombinationsereignis gebildet wurden (Fig. 4a). Eine geeignete Auflösung der Kointegrate bei Auslösung bzw. Freisetzung des Erythromycin-Selektionsdrucks (zweites Rekombinationsereignis) führt zu einem perfekten Austausch der ursprünglichen lac-Region durch die, auf dem Donor-Plasmid eingeführte (Fig. 4b). Expressionsstärke und -stabilität des integrierten cat-Gens können direkt untersucht werden.

Konstruktion der Donor-Plasmide

i) pBM20, pBM26 und pBM33

Das PstI-SpeI-Fragment von pDP222 mit dem gestutzten bzw. verkürzten lacZ-Gen wurde in den, an seinen einzigen PstI- und SpeI-Stellen liriearisierten Vektor pGEMS-838-2, ligiert und in E. coli BZ234 transformiert. Die Zellen wurden auf LB-Platten, die mit 1 mg/ml Erythromycin ergänzt wurden, ausplattiert und bei 37ºC über Nacht wachsen gelassen. Einzelne Kolonien wurden isoliert und in LB; das mit 100 ug/ml Ampicillin ergänzt wurde, wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde extrahiert und durch Restriktionsstellen-Kartierung untersucht. Plasmide, die das korrekte Fragment aufwiesen, wurden identifiziert und als pBM20 bezeichnet (Fig. 5). Zur Verkürzung des Vektor-Grundgerüsts und zur Eliminierung des Ampicillin-Resistenzgens wurde pBM20 mit FspI (das an den Stellen 1617 und 2843 im pGEMS schneidet [Promega, USA]) digeriert bzw. verdaut, religiert und in BZ234 transformiert. Die Selektion erfolgte auf identischen LB-Erythromycin-Platten, wie vorstehend beschrieben. Plasmide mit der korrekten 1,2 kb FspI-Deletion wurden identifiziert und als pBM26 bezeichnet.
Alternativ wurde der Vektor pUC-838-1, wie vorstehend beschrieben, mit FspI verdaut, religiert und in BZ234 transformiert. Der entstandene, als pBM31 bezeichnete Vektor wurde an seiner einzigen EcoRI-Stelle linearisiert, durch eine Auffüll-Reaktion (filling-in reaction) [16] mit glatten Enden versehen, Iigiert und in BZ234 transformiert. Der neue, als pBM32 bezeichnete Vektor wurde an seiner einzigen PstI- und BamHI-Stelle linearisiert, und wurde an das durch Agarosegelelektrophorese gereinigte 1,55 kb-PstI-Balll-Fragment aus pBM20 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in BZ234 transformiert, die Zellen ausplattiert und auf LB- Erythromycin (1 mg/ml)-Agarplatten wachsen gelassen. Der Plasmidgehalt von einzelnen Kolonien wurde untersucht, die korrekten Klone wurden identifiziert und als pBM33 (Fig. 5) bezeichnet.

ii) pBM39 und pBM42

Wie in Fig. 6 dargestellt, wurde eine NdeI-Restriktionsstelle zwischen dem lacS- und dem lacZ-Gen erzeugt. Ein ungefähr 900 bp langes, das C-terminale Ende von lacS enthaltendes Fragment wurde mittels PCR aus FspI linearisiertem pDP228 amplifiziert. Die als Primer verwendeten, synthetischen Oligonucleotide waren 5'-GGTTTTCCCAGTCACGAC (Primer 1, der mit Vektor pUC 19 hybridisiert) und 5'-GTCATGTTCATATGTTATTCTCCTTT (Primer 2, der eine NdeI-Stelle einführt). Das amplifizierte Fragment wurde PstI- und NdeI verdaut und an den PstI- und NdeI-verdauten Vektor pGEM-SZf ligiert, in BZ234 transformiert und die Zellen auf Wachstum auf LB-Ampicillin (100 ug/ml) -Platten selektiert. Der Plasmidgehalt von einzelnen Kolonien wurde untersucht, korrekte, das 900 bp-Fragment aufweisende Klone, wurden identifiziert und als pBM37 bezeichnet. Eine zweite PCR wurde mit dem linearisierten pDP228 unter Verwendung der synthetischen Oligonucleotide 5'-AAAGGAGAATAACATATGAACATGAC (Primer3) und 5'-TTGGGAGCTCTCCCTTAACAAAGAGA (Primer 4 mit einer SacI-Stelle neben der BgIII-Stelle) durchgeführt. Das ungefähr 700 bp amplifizierte Fragment wurde mit SacI und NdeI verdaut, und in das SacI- und NdeI-verdaute pBM37 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in BZ234 transformiert und die Zellen wurden auf LB-Ampicillin (100 ug/ml)-Platten wachsen gelassen. Der Plasmidgehalt von einzelnen Kolonien bzw. Einzelkolonien wurde untersucht, und korrekte, das Insert enthaltende Klone wurden identifiziert und als pBM38 bezeichnet.
Das Plasmid pBM38 wurde mit BstEII und DraIII verdaut und das entstandene 650 bp- Fragment, welches die neue Verbindung bzw. Junction (junction) zwischen dem lacS- und dem lacZ-Gen enthält, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert. In ähnlicher Weise wurden pBM33 und pBM26 mit BstEII und DraIII verdaut, und deren größeres, das Vektor-Grundgerüst enthaltendes Fragment wurde isoliert und jeweils an das 650 bp-Fragment von pBM38 ligiert. Die Ligationsgemische wurden in BZ234 transformiert, auf LB-Erythromycin (I mg/ml)-Platten ausplattiert und bei 37ºC inkubiert. Der Plasmidgehalt von einzelnen Kolonien wurde untersucht, und korrekte Klone, welche die inserierte, von pBM38 transferierte NdeI-Stelle aufweisen, wurden identifiziert. Die von pBM33 und pBM26 abstammenden Plasmide wurden als pBM39 beziehungsweise als pBM42 bezeichnet (Fig. 5).

iii) pBM40, pBM43 und pBM45

Das cat-Gen von pNZ12, das zuerst an dessen einziger SaII-Stelle linearisiert wurde, wurde mittels PCR amplifiziert. Die als Primer zur Erzeugung von NdeI-Stellen am Anfang und Ende des cat-Gens verwendeten, synthetischen Oligonucleotide waren 5'-ATATCATATGAACTTTAATAAAATTGAT und 5'-ATTATCATATGTTATAAAAGCCAGTCATTAG. Das ungefähr 670 bp lange, amplifizierte Fragment wurde mit NdeI verdaut und in pBM39 ligiert, das an seiner einzigen NdeI-Stelle linearisiert und mit alkalischer Phosphatase behandelt war. Das Ligationsgemisch wurde in BZ234 transformiert, auf LB-Erythromycin (1 mg/ml)-Platten ausplattiert und bei 37ºC inkubiert. Der Plasmidgehalt einzelner Kolonien wurde untersucht und Klone, die das mit der korrekten Orientierung inserierte NdeI-Fragment aufweisen, d. h. die die cat-Gen-Ablesung in der gleichen Richtung wie lacS und lacZ aufweisen, wurden identifiziert und als pBM40 bezeichnet (Fig. 5).
Das Plasmid pBM40 wurde mit BstEII und DraIII verdaut, und das das cat-Gen enthaltende 1,3 kb-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert. In ähnlicher Weise wurde pBM26 mit BstEII und DraIII verdaut, und das Fragment mit dem Vektor-Grundgerüst wurde isoliert. Die zwei isolierten Fragmente wurden miteinander ligiert, in BZ234 transformiert und die Zellen wurden auf LB-Erythromycin (1 mg/ml)-Platten wachsen gelassen. Der Plasmidgehalt von einzelnen Kolonien wurde untersucht, wobei korrekte Klone identifiziert und als pBM43 bezeichnet wurden (Fig. 5).
Das Plasmid pDP211 wurde mit BgIII verdaut, und das interne 1,3 kb-lacZ-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde in pBM43 ligiert, das zuerst an seiner BgIII-Stelle linearisiert und mit alkalischer Phosphatase behandelt wurde. Das Ligationsgemisch wurde in JM108 transformiert und auf LB-Platten, die mit 1 mg/ml Erythromycin; 40 ug/ml X-Gal und 1 mM IPTG ergänzt waren, ausplattiert. Die Zellen wurden über Nacht bei 37ºC wachsen gelassen. Der Plasmidgehalt von einzelnen, blauen Kolonien (LacZ+; [21]) wurde isoliert und untersucht. Korrekte, das gesamte lacZ-Gen aufweisende Klone, wurden identifiziert und als pBM45 bezeichnet (Fig. 5).

Integration des cat-Gens in das Genom von ST11

ii) Kointegrat-Bildung

Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen, optimierten Transformationsverfahrens wurde Plasmid pBM45 in S. thermophilus ST11 transformiert. Bei einer Selektion auf mit 1% Saccharose und 2,5 ug/ml Erythromycin ergänzten M17-Agarplatten zeigten sich nach 2-3 Tagen unter anaerober Inkubation bei 42ºC ungefähr 1-10 Kolonien pro 1 ug transformiertes Plasmid. Einzelne Kolonien wurden isoliert, auf frischen Agarplatten gereinigt und in M17-Nährlösung, die mit 1% Saccharose und 2,5 ug/ml Erythromycin ergänzt war, wachsen gelassen. Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und ihre genomische DNA wurde wie vorstehend beschrieben extrahiert. Southern Blots von PstI-, ClaI-, NdeI- und PstI-BgIII- verdauter, genomischer DNA wurden durchgeführt. Als markierte DNA-Sonden wurden die Plasmide pBM45, pBM32, beziehungsweise das 670 bp NdeI-Fragment von pBM40 mit dem cat-Gen verwendet. Untersuchung der verschiedenen Southern Blots bestätigte die Kointegrat-Bildung zwischen Plasmid und Bakteriengenom. In allen untersuchten Fällen fand eine durch allgemeine Rekombination vermittelte Plasmid-Integration an homologen DNA-Abschnitten zwischen dem Plasmid und dem Genom statt (Fig. 7).

ii) Auflösung von Kointegraten

Übernachtkulturen gereinigter, von pBM45-Integrationen stammende Kointegrate aufweisender ST11-Stämme wurden durch Animpfen von 40 ml frischem, 1% Lactose und kein Erythromycin enthaltendem M17 mit 100 ul der Kultur subkultiviert und bei 42ºC inkubiert. Nachdem die Sättigung des Zellwachstums erreicht wurde, wurde eine Subkultivierung der Kulturen in gleicher Weise wiederholt und die Zellen wurden wiederum bis zur Sättigung bei 42ºC wachsen gelassen. Dieses Subkultivierungsverfahren wurde insgesamt 15 Mal wiederholt und anschließend wurden die Zellen verdünnt, auf M17-Platten verteilt und bei 42ºC inkubiert. Einzelne Kolonien wurden am nächsten Tag auf neue M17-Platten, mit 5 ug/ml Erythromycin und ohne Erythromycin, überführt und über Nacht bei 42ºC inkubiert. Zellen aus Erythromycinsensitiven Kolonien wurden auf M17-Nährlösung überführt, bei 42ºC wachsen gelassen und die genomische DNA wurde daraus wie zuvor beschrieben extrahiert. Die genomische DNA wurde mit PstI, NdeI und PstI-BgIII verdaut, über Agarosegelelektrophorese Größen-fraktioniert und auf GeneScreen-Hybridisierungs-Membranen überführt. DNA-DNA-Hybridisierungen wurden nach Southern [9] unter Verwendung von entweder pBM32, pBM45 oder dem 670 bp NdeI mit dem cat-Gen als DNA-Sonde durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten, dass eine Auflösung der Kointegrate zu einem kompletten Verlust des Plasmid-Grundgerüsts, einschließlich seines Erythromycin-Resistenzgens, und einer Kopie der homolog wiederholten DNA-Sequenz führt. Folglich wurde in Abhängigkeit der Stelle des zweiten Rekombinationsereignisses das lac- Operon entweder in seiner urprünglichen Wildtyp-Konfiguration wiederhergestellt oder durch die eingeführte, neue Operon-Struktur ersetzt (Fig. 7).
Ein wie vorstehend beschrieben isolierter und identifizierter Stamm, der die neue Operon- Struktur, d. h. das zwischen dem lacS- und dem lacZ-Gen integrierte cat-Gen, enthält, wird in der vorliegenden Beschreibung durchwegs als STI1-Cat bezeichnet und wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 02.04.92 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de 1'Institut Pasteur, 25 rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 1 S. Frankreich, hinterlegt, wobei er die Nummer I-1190 erhielt.

Stabilität des integrierten Gens

80 ul einer Übernachtkultur des Stammes ST11-Cat, der in einem mit 1% Lactose ergänzten M17-Medium wachsen gelassen wurde, wurde zum Animpfen von 80 ml sterilisiertem MSK verwendet und bei 42ºC inkubiert. Nachdem die Sättigung des Zellwachstums erreicht wurde, wurde die Subkultivation der Kultur aufeinanderfolgend 1 S Mal wiederholt, wobei stets 80 ul der homogenisierten Milchkultur in 80 ml frisches MSK-Medium überführt und die Zellen bei 42ºC wachsen gelassen wurden. Nach diesen Überführungen, die insgesamt ungefähr 1 SO Wachstumsgenerationen entsprechen, wurden die Zellen auf M17-Agarplatten, die mit 1% Lactose ergänzt waren, ausplattiert und bei 42ºC inkubiert. 300 einzelne Kolonien wurden auf M 17-Agarplatten, die mit S ug/ml Chloramphenicol ergänzt waren, aufgebracht und bei 42ºC inkubiert. Alle untersuchten Kolonien konnten auf Chloramphenicol-Platten wachsen und vererbten somit dauerhaft das cat-Gen.

Aktivität des integrierten cat-Gens

ST11 und der Stamm ST11-Cat wurden in MSK über Nacht bei 42ºC wachsen gelassen. Am nächsten Tag wurden 100 ul von jeder Kultur in 50 ml MSK und in 50 ml mit IO ug/ml Chloramphenicol ergänztes MSK überführt und bei 42ºC inkubiert. Nach 24 h wuchsen beide Stämme; STII und STII-Cat, in MSK und führten zur Koagulation der Milch, wobei lediglich der Stamm ST11-Cat in MSK mit Chlorarnphenicol wachsen und die Koagulation der Milch bewirken konnte. Sogar nach einer verlängerten, dreitägigen Inkubation bei 42ºC konnte ST11 nicht wachsen. Die Ergebnisse sind in Tafel I zusammengefasst. Tafel I
ST11 und ST11-Cat wurden in 30 ml M17-Nährlösung, die mit 1% Lactose, 1% Saccharose oder 1% Glucose mit oder ohne Zusatz von O,S% Galaktose ergänzt ist, wachsen gelassen. Die Zellen wurden bis zur mid-log-Phase wachsen gelassen, durch Zentrifügation geerntet, zweimal mit TE (SO mM TrisHCl pH 7, 8, 2 mM EDTA) gewaschen, und in 1 ml TE resuspendiert. Die Zelisuspensionen wurden auf Eis aufbewahrt und Extrakte wurden durch Zerkleinern der Zellen mit Glas-Kügelchen (425-600 um) auf einer Vortex-Vorrichtung während 1 Stunde bei 4ºC [22] gewonnen. Zelibruchstücke und Glas-Kügelchen wurden durch Zentrifugation (13000 g während 15 min bei 4ºC) präzipitiert und die zelifreien Überstände wurden zur Bestimmung der spezifischen Chloramphenicol-Acetyltransferase-Aktivitäten gemäß dem von W.V. Shaw beschriebenen Assay [20] verwendet. Die Ergebnisse sind in Tafel 11 dargestellt. Die Enzymaktivitäten werden als Einheiten pro mg Gesamtprotein angegeben. TAFEL II
Referenzschriften
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Legenden zu den Figuren

Fig. 1

Genaufbau des lac-Operons in S. thermophilus. a) stellt das lac-Operon vom Wildtyp ST11 und b) dasjenige von STI1-Cat dar. lacS und lacZ bezeichnen die Lactose-Permease beziehungsweise β-Galäctosidase codierenden Gene. Promotor und Terminator werden angegeben.

Fig. 2

Karte der Klone, die Teile des lac-Operons aufweisen. Die zum Klonieren verwendeten Restriktionsstellen sind angegeben.

Fig. 3

Schematische Darstellung der genetischen Konstruktion, a) zeigt die Modifikation, die eine NdeI-Restriktionsstelle zwischen dem lacS- und dem lacZ-Gen erzeugt. Sternchen (*) bezeichnen die mutierten Basenpaare. b) zeigt die in vitro-Insertion des cat-Gens in die erzeugte NdeI-Stelle.

Fig. 4

Chromosomale Integration und Auflösung a) stellt das Integrationsereignis eines Plasmids in das Chromosom via homologer Rekombination dar. b) zeigt die Auflösung eines chromosomalen Kointegrats via homologer Rekombination, wobei die modifizierte Kopie des Operons auf dem Chromosom zurückbleibt. Der auf dem Plasmid-Grundgerüst angeordnete Erythromycin- Resistenz-Marker, ery, wird angegeben.

Fig. 5

Karte der konstruierten Plasmide. Die Restriktionsstellen werden angegeben. Eine mit Klammern versehene BgIII-Stelle gibt an, daß sie durch Klonieren in eine BamHI-Stelle des Vektorplasmids verkürzt wurde. Die Orientierung des cat-Gens wird durch einen Pfeil gezeigt.

Fig. 6

Grundzüge der Konstruktion von pBM38. Übergroße Darstellung der für die PCR verwendeten Primer. Die zum Klonieren verwendeten Restriktionsstellen werden angegeben.

Fig. 7

Karte von pBM45-Kointegraten und Auflösungs-Endprodukten. a) zeigt die Restriktionskarte des lac-Operons von ST11, b) diejenigen der beiden möglichen, identifizierten Kointegrate mit pBM45 und c) diejenigen der zwei möglichen, identifizierten Auflösungs-Endprodukte der beiden Kointegraten. Von E. coli stammende Vektor-Plasmid-DNA wird als einfache Linie gezeigt. Restriktionsstellen sind: B, BgIII; C, ClaI; N, NdeI; P, PstI; und 5, SpeI. Sequenzliste
Die nachstehend identifizierten Sequenzen finden sich wie folgt in der Beschreibung:
SEQ ID NO 1: Seite 15, Zeile 4
SEQ ID NO 2: Seite 15, Zeile 5
SEQ ID NO 3: Seite 15, Zeile 14
SEQ ID NO 4: Seite 15, Zeile 15
SEQ ID NO 5: Seite 16, Zeile 4
SEQ ID NO 6: Seite 16, Zeile 5

Claims

1. Verfahren zur Integration eines Fremdgens ohne Promotor in ein Operon vor mindestens einem essentiellen Cistron des Operons auf der DNA eines Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus, welches umfasst,

- Transformieren eines Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus-Stammes mit einem Donor-Plasmid, welches in dem Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus-Stamm nicht repliziert, und welches das Fremdgen als einen funktionellen Teil des Operons vor dem essentiellen Cistron trägt,

- Isolieren von Transformanten mit Plasmid-Genom-Kointegraten, und

- Auflösen der Kointegrate aufgrund eines Selektionsdrucks auf eine korrekte Funktionsfähigkeit des essentiellen Cistrons beim Wachstum in Standardmedium, so dass das Genom des aufgelösten, Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus-Stammes das Donor-Plasmid nicht beinhaltet und ein korrekte Expression des Fremdgens als ein funktioneller Teil dieses Operons erreicht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nahrungsmittel-geeignete Mikroorganismus-Stamm ein Milchsäure-Bakterium ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus und Bifidobacterium und den Nahrungsmittel-geeigneten Stämmen der Gattungen Proprionibacterium und Staphylococcus.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Nahrungsmittel-geeignete Mikroorganismus-Stamm Streptococcus thermophilus oder Lactobacillus bulgaricus ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, welches weiter den Schritt umfasst, Züchten des aufgelösten Nahrungsmittel-geeigneten Mikroorganismus-Stammes in einem Standardmedium, welches ein Medium auf Milchbasis, insbesondere Milch, ein Milch-Permeat oder Molke ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fremdgen homogenen, heterogenen oder synthetischen Ursprungs, oder eine Kombination davon ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Donor-Plasmid von einem Plasmid, welches den gesamten Teil des Operons trägt, abgeleitet ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Donor-Plasmid in einem anderen Wirtssystem als der Mikroorganismus zur Selbstreplikation befähigt ist und weiter einen selektierbaren Gen- Marker aufweist, der in dem Mikroorganismus sowie in dem anderen Wirtssystem funktionell ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei E. coli als das andere Wirtssystem verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das lac-Operon als das Operon verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das lacZ-Gen als essentielles Cistron des lac-Operons verwendet wird.

11. Gentechnisch veränderter, Nahrungsmittel-geeigneter Mikroorganismus, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

12. Nahrungsmittel-Produkt oder Nahrungsergänzungsmittel, das durch Fermentation eines Nahrungsmittel-geeigneten Substrats durch einen Mikroorganismus gemäß Anspruch 11 erhalten wird.