DE69737853T2

DE69737853T2 - Herstellung von L(+)-Lactat

Info

Publication number: DE69737853T2
Application number: DE69737853T
Authority: DE
Inventors: Luciane Lapierre; Jacques Edouard Germond; David Vers-chez-les Blanc Pridmore; Beat Mollet; Michèle Delley
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1997-05-03
Filing date: 1997-05-03
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2017-05-04
Also published as: ATE365805T1; JPH10313884A; CA2230435A1; EP0875579B1; RU2202610C2; ZA983697B; US6258587B1; AU753558B2; NO981774L; KR19980086644A; NZ330351A; AR015376A1; NO324916B1; AU6373698A; CA2230435C; DE69737853D1; ID20238A; MY131830A; EP0875579A1; DK0875579T3

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind genetisch rekombinierte Bakterienstämme sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Stämme.
STAND DER TECHNIK:
Die Fermentation ist ein Abbau einer Kohlenstoffquelle, bei dem der endgültige Wasserstoffakzeptor eine organische Verbindung ist. Auf dem Weg der Milchfermentation erzeugen manche Bakterienstämme eine racemische Mischung der beiden Isomerformen des Lactats, das D(–)-Lactat und das L(+)-Lactat zur Regenerierung von NAD⁺ durch Reduktion des Pyruvats durch zwei spezifische NAD-abhängige Lactat-Dehydrogenasen.
Es ist bekannt, dass manche Personen eine Intoleranz gegenüber der Reduktion der Lactose aufweisen. Diese schlechte Verdauung der Lactose ist häufig auf das Fehlen einer ausreichenden Menge an β-Galactosidase im Dünndarm zurückzuführen. Verschiedene Studien (Kolars et al, N Engl J MEd, 310: 1–3, 1984; Marteau et al., Br J Nutr. 64, 71–79, 1990, und Arrigoni et al., Am J Clin Nutr. 60: 926–929; 1994) haben ergeben, dass diese Personen die in Joghurt enthaltene Lactose besser verdauen und tolerieren, als die in Milch enthaltene Lactose. Diese bessere Verdauung und diese bessere Toleranz gegenüber Lactose sind insbesondere auf die Aktivität der β-Galactosidase der im Joghurt enthaltenen Bakterien bei dem Darmdurchgang zurückzuführen.
Ferner ist bekannt, dass D(–)-Lactat bei Kindern zu Azidoseproblemen führen kann. Aus diesen Gründen empfiehlt die Weltgesundheitsorganisation (F.A.O/O.M.S, 1967; 1974), dass D(–)-Lactat nicht allein oder in racemischer Mischung mit L(+)-Lactat der Kindernahrung zugesetzt wird. Außerdem ist es bei Erwachsenen vorzuziehen, dass die Grenze des Verzehrs von D(–)-Lactat pro Tag 100 mg/kg des menschlichen Körpers nicht überschreitet.
Zur Zeit sind Bakterienstämme bekannt, die genetisch so rekombiniert sind, dass sie nur noch L(+)-Lactat erzeugen.
So beschreiben T. Bhowmik et al. (Appl. Microbiol Biotechnol, 432–439, 1994) eine Technik zur Isolierung und Inaktivierung, durch gerichtete Mutagenese, des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens des Stamms Lactobacillus helveticus CNRZ32 und insbesondere des Stamms Lactobacillus helveticus CNRZ32(pSUW104), der nur noch L(+)-Lactat produziert. Dieser Stamm wird durch Elektroporation des Integrationsvektors pSUW104 erhalten, der den Vektor pSA3 und das interne Fragment SalI-SphI von 0,6 kb des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens von Lactobacillus helveticus umfasst.
Gegenwärtig kennt man jedoch keine Bakterienstämme mit den Fähigkeiten des Überlebens im Darm, des Haftens an den Darmzellen und zur Immunmodulation, die genetisch so rekombiniert wurden, dass sie nur mehr L(+)-Lactat produzieren. Nun wäre es für die Herstellung von Nahrungsmittelzusammensetzungen sehr interessant, derartige Bakterienstämme zur Verfügung zu haben, die die Fähigkeit besitzen, im Darmtrakt am Leben zu bleiben, diese für die menschliche Gesundheit günstigen Eigenschaften besitzen und nurmehr L(+)- Lactat produzieren, so dass die durch D(–)-Lactat erzeugten schädlichen Wirkungen vermieden werden.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diese Anforderungen zu erfüllen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Zu diesem Zweck betrifft die vorliegende Erfindung einen Bakterienstamm mit den Fähigkeiten des Überlebens im Darm, des Haftens an den menschlichen Darmzellen und zur Immunmodulation, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm von Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus oder Lactobacillus gallinarum handelt und dass er genetisch so rekombiniert ist, dass er nurmehr L(+)-Lactat erzeugt, indem das für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierende Gen inaktiviert ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner der Stamm CNCM-I-1851 und der Stamm CNCM-I-1852.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Stamms und die Verwendung eines solchen Bakterienstamms, der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde, bei der Herstellung von Nahrungsmittelzusammensetzungen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der folgenden Beschreibung verwendet man den Ausdruck "konjugativer Vektor" zur Bezeichnung eines DNA-Vektors, der durch Konjugation zwischen zwei Stämmen von verschiedenen Milchbakterienarten transferierbar ist.
In der folgenden Beschreibung verwendet man ferner den Ausdruck "Bakterienstamm mit der Fähigkeit zur Immunmodulation" zur Bezeichnung eines Milchbakterienstamms, der eine günstige Wirkung auf das Immunsystem hat, insbesondere die Eigenschaft, die Phagozytose der Makrophagen zu erhöhen.
Gegenstand der Erfindung ist also ein Bakterienstamm mit den Fähigkeiten des Überlebens im Darm, des Haftens an den menschlichen Darmzellen und zur Immunmodulation, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm von Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus oder Lactobacillus gallinarum handelt und dass er genetisch so rekombiniert ist, dass er nurmehr L(+)-Lactat erzeugt, indem das für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierende Gen inaktiviert ist.
Man hat insbesondere zwei Stämme von Lactobacillus johnsonii isoliert, die genetisch so rekombiniert wurden, dass sie nurmehr L(+)-Lactat erzeugen. Diese Stämme wurden am 20.02.1997 gemäß dem Budapester Vertrag bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, INSTITUT PASTEUR, 25, rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS CEDEX 15 hinterlegt, wo ihnen die Hinterlegungsnummern CNCM I-1851 bzw. CNCM I-1852 zugeteilt wurde.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Stamms, bei dem man die Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens aus einem Wirtsbakterienstamm isoliert, der die Fähigkeiten des Überlebens im Darm, des Haftens an den menschlichen Darmzellen und zur Immunmodulation besitzt, wobei es sich um einen Stamm von Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus oder von Lactobacillus gallinarum handelt, man eine gerichtete Mutagenese auf dieser Sequenz so durchführt, dass man eine modifizierte Sequenz erhält, man diese modifizierte Sequenz in einen konjugativen Vektor integriert, man den konjugativen Vektor durch Konjunktion in den Wirtsbakterienstamm transferiert und man dann diejenigen Wirtsbakterien selektiert, in denen die für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierende Sequenz durch homologe Rekombination mit der modifizierten Sequenz ersetzt wurde.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man die Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens des Wirtsbakterienstamms beispielsweise durch PCR, durch Klonierung oder durch Komplementierung isolieren.
Man kann eine gerichtete Mutagenese auf dieser Sequenz so durchführen, dass man eine modifizierte Sequenz erhält, und zwar gemäß der Methode Gene Splicing Overlap Extension (Molecular Biotechnology, R.M. Horton, 1995, 3, 93–99), die darin besteht, dass man eine Gensequenz erzeugt, in der beispielsweise ein oder mehrere Nucleotide eingeführt oder deletiert sind.
Zum Integrieren der modifizierten Sequenz in einen konjugativen Vektor eines Spenderbakterienstamms für den Wirtsbakterienstamm kann man beispielsweise einen Spenderbakterienstamm selektieren, der einen konjugativen Vektor enthält, der nicht die Fähigkeit besitzt, sich in dem Wirtsbakterienstamm zu replizieren, kann man ein Konstrukt der modifizierten Sequenz durch Ligation in einem ersten Vektor herstellen, der nicht in der Lage ist, sich in dem Spenderstamm für die Wirtsbakterie zu vermehren, kann man dieses Konstrukt in den Spenderbakterienstamm einführen und kann dann diejenigen Spenderbakterien selektieren, in denen sich der erste Vektor und der konjugative Vektor rekombiniert haben.
Man transferiert also durch Konjugation den konjugativen Vektor, der die modifizierte Sequenz enthält, in den Wirtsbakterienstamm.
Dann selektiert man die Wirtsbakterien, in denen die für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierende Sequenz durch homologe Rekombination durch die modifizierte Sequenz ersetzt wurde.
Man kann beispielsweise auf einem gewisse Antibiotika enthaltenden Medium die Wirtsbakterien selektieren, die den konjugativen Vektor in ihr Genom integriert haben. Diese Bakterien können nämlich infolge der Integration des konjugativen Vektors in ihr Genom die in der Sequenz dieses Vektors enthaltenen Antibiotika-Resistenzgene exprimieren.
Schließlich selektiert man die Wirtsbakterien, in denen die DNA-Sequenzen des konjugativen Vektors, mit Ausnahme der modifizierten Sequenz, aus dem Genom entfernt wurden.
Zu diesem Zweck kann man beispielsweise eine erste Selektion auf einem Antibiotika enthaltenden Medium so durchführen, dass man die für diese Antibiotika empfindlichen Bakterien selektiert, d.h. die wilden Bakterien und die genetisch transformierten Bakterien, die nurmehr das Fragment der modifizierten Sequenz des Gens enthalten.
Dann kann man beispielsweise einen enzymatischen Farbtest in Gegenwart von D-Lactat-Dehydrogenase, Tetrazoliumsalz und Diaphorase so durchführen, dass die wilden Bakterien von den genetisch transformierten Bakterien gemäß der Erfindung differenziert werden. Dieser enzymatische Test gestattet den Nachweis, dass die Bakterien, die kein D(–)-Lactat erzeugen, das D(–)-Lactat nicht oxidieren können, wenn man dem Medium das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase zusetzt, infolgedessen wird auch das Tetrazoliumsalz in dem Medium nicht durch das Enzym Diaphorase reduziert, da kein oxidiertes D-Lacat vorhanden ist, und diese Bakterien bleiben farblos.
Man kann nun beispielsweise eine PCR der Genomsequenzen der erfindungsgemäßen genetisch rekombinierten Wirtsbakterie vornehmen, indem man für den Wirtsbakterienstamm spezifische Primer verwendet und dann kann man eine Verdauung des PCR-Produkts in Gegenwart von spezifischen Restriktionsenzymen vornehmen und die Größe der auf diese Weise erzeugten Fragmente mit denjenigen vergleichen, die nach Verdauung mit denselben Restriktionsenzymen aus dem Genom einer wilden Wirtsbakterie erhalten wurden.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung eines solchen Bakterienstamms, der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde, für die Herstellung von Nahrungsmittel zusammensetzungen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Bakterienstämme sowie diese genetisch rekombinierten Bakterienstämme werden im Nachstehenden ausführlicher mit Hilfe von biochemischen und molekularen Analysen gekennzeichnet, wobei man sich auf die beiliegende Zeichnung bezieht. In dieser zeigen:
1 eine Darstellung des Vektors pLL83, der das Produkt der Ligation zwischen dem von der Firma Promega, MADISON, WI – USA, vertriebenen Vektor pGEMT und der modifizierten Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens ist,
2 eine Darstellung des Vektors pMD14, der aus dem Vektor pBlueScript SK+ von Escherichia coli konstruiert wurde (Stratagene, LA YOLLA, CA – USA) und der das Chloramphenicol-Resistenzgen (cat) des Vektors pNZ12 enthält (Gasson et al., J. Bacteriol., 154, 1–9, 1983) und die Region 5' stromauf der Sequenz des Erythromycin-Resistenzgens des Vektors pAMβ1 (Clewell et al., J. Bacteriol., 33, 426–428, 1974), die aus dem Plasmid pUC-838 (Mollet et al., J. Bacteriol., 175, 4315–4324, 1993) isoliert wurde,
3 eine Darstellung des Vektors pLL88, der das Produkt der Ligation des Fragments des Vektors pLL83, das die modifizierte Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens umfasst, in den Vektor pMD14 ist,
4 die Darstellung des Vektors pLL91, der die Sequenz des Vektors pLL88 und diejenige des Vektors pAMβ1 umfasst (Clewell et al., J. Bacteriol., 33, 426–428, 1974).
I. Isolierung der Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens von Lactobacillus johnsonii La1:
Man lässt Lactobacillus johnsonii La1 auf einem MRS-Medium während der Nacht bei 37°C wachsen. Dann überträgt man die Kultur in ein ein MRS-Medium enthaltendes Rohr und lässt sie bis zu einer DO₆₀₀ von etwa 1 wachsen.
Man isoliert das Genom von Lactobacillus johnsonii La1 gemäß der Methode, die in dem Artikel "DNA probe for Lactobacillus delbrueckii" (B. Mollet et al., Aplied and Environment Microbiology, June 1990, Band 56(6), S. 1967–1970) beschrieben wird.
Man isoliert nun die Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens von Lactobacillus johnsonii La1 durch PCR, indem man als spezifische Primer die im Nachstehenden beschriebenen Sequenzen SEQ ID NR:1 und SEQ ID NR:2 verwendet, die Sequenzen von konservierten Regionen des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens von Lactobacillus helveticus sind (Eur. J. Biochem., Cloning and overexpression of Lactobacillus helveticus D-lactate deshydrogenase gene in Escherichia coli, Kochhar et al., 208:799–805, 1992).
Man erhält auf diese Weise ein Fragment von 890 pb, das man in den von der Firma Promega, MADISON, WI – USA, vertriebenen Vektor pGEMT kloniert und das man dann sequenziert. Zur Isolierung der vollständigen Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens von Lactobacillus johnsonii La1 nimmt man nun einen Southern blot mit verschiedenen Restriktionsenzymen und unter Verwendung der oben durch PCR erhaltenen Sequenz als Sonde vor.
Man isoliert auf diese Weise eine Nucleotidsequenz von 3 kb, die zwei entgegengesetzt gerichtete offene Leserahmen umfasst.
Man stellt eine hohe Homologie zwischen einem der offenen Leserahmen und der Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens von Lactobacillus helveticus fest. Die Sequenz dieses offenen Leserahmens besitzt eine Länge von 1014 Nucleotiden, die 85 % Homologie mit der Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase von Lactobacillus helveticus codierenden Gens und 81 % Homologie mit derjenigen von Lactobacillus bulgaricus besitzen (FBES Lett., Bernard et al., 1991, 290, 61–64). Diese Sequenz codiert für ein Polypeptid von 338 Aminosäuren.
II. Mutagenese, die auf die für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierende Sequenz von Lactobacillus johnsonii La1 gerichtet ist:
Man nimmt eine gerichtete Mutagenese der auf diese Weise isolierten Sequenz nach der Methode Gene Splicing Overlap Extension (Molecular Biotechnology, R.M. Horton, 1995, 3, 93–99) vor. Man nimmt an dieser Sequenz durch PCR eine Deletion von 11 Nucleotiden und eine Insertion von 3 Nucleotiden in der Mitte vor. Diese Sequenzmodifikationen haben zur Folge, dass eine Restriktionsstelle DraI erscheint und eine Restriktionsstelle EcoRV beseitigt wird. Man verwendet diese Restriktionsstellenmodifikationen als Marker, um das Vorhandensein der modifizierten Sequenz des für D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens von Lactobacillus johnsonii La1 in den verschiedenen Vektoren nachzuweisen, die in der weiteren Konstruktion sowie bei der Selektion der Mutanten verwendet werden, die nur die modifizierte Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens integriert haben.
Die auf diese Weise modifizierte Sequenz des Gens codiert für ein Polypeptid von 181 Aminosäuren anstelle eines Polypeptids von 338 Aminosäuren.
III. Klonierung der modifizierten Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens von Lactobacillus johnsonii La1 in einen Vektor pGEMT von Escherichia coli:
Man kloniert die modifizierte Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens in den Vektor pGEMT von Escherichia coli.
Zu diesem Zweck ligiert man die modifizierte Sequenz des Gens in diesen das Ampicillin-Resistenzgen enthaltenden Vektor pGEMT.
Man führt dann diese Ligationsmischung in Escherichia coli XL1-Blue durch Elektroporation ein und selektiert die positiven Klone in Gegenwart von X-gal und IPTG (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manuel, 2. Ausgabe, 1989). Man bezeichnet den auf diese Weise erhaltenen Vektor, wie er in 1 dargestellt ist, mit pLL83.
Dann reinigt man den Vektor pLL83 nach der Methode der alkalischen Lyse (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manuel, 2. Ausgabe, 1989).
Man isoliert nun aus dem auf diese Weise gereinigten Vektor pLL83 das Fragment, das die modifizierte Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens umfasst. Zu diesem Zweck nimmt man eine Verdauung mit dem Restrikti onsenzym SphI auf Höhe der Restriktionsstelle SphI auf dem Vektor pLL83 vor. Dann lässt man das Enzym T4-Polymerase auf Höhe dieses Schnitts so reagieren, dass Nucleotide hinzugefügt werden und ein glatter Schnitt erhalten wird. Dann nimmt man eine Verdauung mit dem Restriktionsenzym SpeI vor.
Parallel dazu nimmt man eine Verdauung auf einem Vektor vor, der nicht in der Lage ist, sich in dem Spenderbakterienstamm, Lactobacillus lactis und in dem Wirtsbakterienstamm, Lactobacillus johnsonii, zu replizieren. Man nimmt diese Verdauung auf Höhe einer Restriktionsstelle vor und lässt dann das Enzym T4-Polymerase auf Höhe dieses Schnitts reagieren, so dass Nucleotide hinzugefügt werden und man einen glatten Schnitt erhält. Schließlich nimmt man eine Verdauung mit dem Restriktionsenzym SpeI vor. Man kann insbesondere den in 2 beschriebenen Vektor pMD14 zur Herstellung dieses Konstrukts verwenden. Man kann an diesem Vektor pMD14 eine Verdauung mit dem Restriktionsenzym EcoRI vornehmen und dann das Enzym T4-Polymerase reagieren lassen und schließlich eine Verdauung mit dem Restriktionsenzym SpeI vornehmen.
Man führt nun das Fragment des Vektors pLL83, das die modifizierte Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens umfasst, in den Vektor pMD14 ein.
Man führt nun die Ligationsmischung in Escherichia coli XL1-Blue durch Elektroporation ein.
Dann bringt man etwa 100 auf diese Weise konstruierte Kolonien von Escherichia coli X11-Blue auf Mikrofiltrationsplatten auf, transferiert sie so auf eine Nitrocellulosemembran und lysiert sie in situ und nimmt eine Hybridisie rung mit einem internen Fragment des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens von Lactobacillus johnsonii La1 vor.
Man selektiert auf diese Weise 3 positive Klone, die den in 3 beschriebenen Vektor pLL88 enthalten. Die Sequenzierung des Vektors pLL88 bringt den Nachweis dafür, dass dieser die modifizierte Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens von Lactobacillus johnsonii La1, die an diese Sequenz angrenzenden Regionen von pGEMT und den Vektor pMD14 umfasst.
IV. Einführung des Vektors pLL88 in den Stamm Lactococcus lactis MG1363 (pAMβ1):
Man führt den Vektor pLL88 in den Stamm Lactococcus lactis MG1363 (pAMβ1) durch Elektroporation ein.
Man bringt dann die auf diese Weise hergestellten Transformanten auf ein Medium Agar GM17, das 12 μg/ml Chloramphenicol enthält, und inkubiert es bei 30°C während einer ganzen Nacht. Der Vektor pLL88 kann sich in den grampositiven Bakterien nicht replizieren. Man selektiert auf diese Weise auf diesem Chloramphenicol enthaltenden Medium alle Bakterien Lactococcus lactis MG1363 (pAMβ1), die den das Chlor amphenicol-Resistenzgen umfassenden Vektor pLL88 in den in 5 beschriebenen konjugativen Vektor pAMβ1 durch homologe Region integriert haben. Man bezeichnet nun dieses Konstrukt, das die Sequenz des Vektors pLL88 und diejenige des Vektors pAMβ1 umfasst, den Vektor pLL91, der in 4 beschrieben ist.
V. Konjugationsbedingungen:
Man kultiviert Lactococcus lactis MG1363, der den Vektor pLL91 enthält, auf einem Medium GM17 und 12 μg/ml Chloramphenicol und Lactobacillus johnsonii La1 auf MRS-Medium.
Man beimpft mit 0,2 % der auf diese Weise hergestellten Kultur von Lactobacillus johnsonii La1 ein Teströhrchen, das ein frisches MRS-Medium enthält, und lässt während 5 h bei 37°C inkubieren.
Man zentrifugiert dann die Kultur von Lactococcus lactis MG1363 und diejenige von Lactobacillus johnsonii La1 mit 3000 rpm während 5 min und transferiert jeden Rückstand in 10 ml LCMG-Medium (Efthymiou et al., An antigenic analysis of lactobacillus acidophilus J., Infect. Dis., 1962, 110; 258–267), das 10 g Trypticase, 5 g Hefeextrakt, 3 g Tryptose, 3 g K₂HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 2 g Ammoniumcitrat, 5 ml an Mineralsalzen angereichte Lösung, 1 g Tween 80, 1 g Natriumacetat, 20 g Glucose und 0,2 g Cystein enthält.
Dann mischt man 1 ml der auf diese Weise hergestellten Kultur des Spenderstamms Lactococcus lactis MG1363 mit 10 ml Kultur des auf diese Weise hergestellten Empfängerstamms Lactobacillus johnsonii La1 und zentrifugiert die Mischung.
Man entfernt den Überstand und bringt den auf diese Weise konzentrierten Rückstand auf PEG-Agar-Medium-Platten (Takemoto et al., Agric. Biol. Chem., 1989, 53:3333–3334), die 5 g PEG6000, 15 g Agar, 1000 ml zuckerfreie LCMG-Lösung, 100 ml Zuckerlösung und 10 ml Mineralsalzlösung enthalten. Man ordnet diese Platten bei Raumtemperatur an, bis der Rückstand trocken ist, und bedeckt sie dann mit 10 ml 7 % Agar enthaltendem Medium LCMG.
Man inkubiert nun diese Platten eine ganze Nacht bei 37°C, bevor der Agar, der die Bakterienzellen, die gewachsen sind, enthält, zerschnitten wird und dieser Agar in 10 ml LCMG-Medium enthaltende Röhrchen eingebracht wird.
Man mischt nun diese Röhrchen kräftig und verdünnt die auf diese Weise hergestellten Kulturen in TS-Medium, das 1 g/l Trypton und 8,5 g/l NaCl enthält.
Man bringt nun die verdünnten Kulturen auf MRS-Agar-Medium-Platten auf, die 100 μg/ml Phosphomycin und 14 μg/ml Chloramphenicol enthalten, und lässt bei 37°C während 48 h unter anaeroben Bedingungen inkubieren.
VI. Konjugation und Integration des Vektors pLL91 in Lactobacillus johnsonii La1:
Man nimmt die Konjugation von Lactococcus lactis MG1363, der den Vektor pLL91 enthält, mit Lactobacillus johnsonii La1 vor. Diese Konjugation hat eine Frequenz zwischen 1·10^–5 und 3·10^-7 Transformanten/Empfängerzellen.
Man selektiert nun 6 gegen Chloramphenicol und gegen Phosphomycin resistente Kolonien von Lactobacillus johnsonii La1, die man nun bei 37°C auf einem MRS-Medium kultiviert, bevor sie einige Stunden bei 45°C transferiert werden, so dass diejenigen Bakterien Lactobacillus johnsonii La1 selektiert werden, die den Vektor pLL91 in ihr Genom integriert haben, durch homologe Region auf Höhe der für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Sequenz. Der in dem Vektor pLL91 enthaltende Vektor pAMβ1 ist nämlich nicht in der Lage, sich bei einer Temperatur über 42°C zu replizieren. Auf diese Weise haben alle Bakterien Lactoba cillus johnsonii La1, die für Chloramphenicol resistent sind und bei 45°C wachsen können, den Vektor pLL91 in ihr Genom durch homologe Region auf Höhe der für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Sequenz integriert.
Auf diese Weise erhält man die Integration des Vektors pLL91 in das Genom von Lactobacillus johnsonii La1 durch einfaches Crossing-Over auf Höhe der Endregion 5' der Sequenz des für D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens oder auf Höhe der Endregion 3' der Sequenz dieses Gens.
VII. Überprüfung der Integration der modifizierten Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens auf der chromosomalen DNA von Lactobacillus johnsonii La1:
Man überprüft durch PCR die Integration des Vektors pLL91 in das Genom von Lactobacillus johnsonii La1.
Zu diesem Zweck verwendet man spezifische Primer des Genoms Lactobacillus johnsonii La1, die als Sequenzen die im Nachstehenden beschriebenen Sequenz SEQ ID NR:3 und SEQ ID NR:4 haben, sowie spezifische Primer des Vektors pLL91, die zur Sequenz die im Nachstehenden beschriebenen Sequenzen SEQ ID NR:5 und SEQ ID NR:6 haben. Dann verdaut man die auf diese Weise durch PCR amplifizierten Fragmente mit dem Restriktionsenzym EcoRV, dessen Restriktionsstelle in der ursprünglichen Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens liegt, und mit dem Restriktionsenzym DraI, dessen Restriktionsstelle in der modifizierten Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens liegt, so dass aufgezeigt wird, dass die Integration durch einfaches Crossing-Over auf Höhe der Endregion 5' oder auf Höhe der Endregion 3' der ursprünglichen Sequenz des Gens stattgefunden hat. Man selektiert nun eine Bakterie Lacto bacillus johnsonii La1, die genetisch durch Integration der modifizierten Sequenz des Gens in die Endregion 5' der ursprünglichen Sequenz des Gens modifiziert wurde, und eine Bakterie Lactobacillus johnsonii La1, die durch Integration der modifizierten Sequenz des Gens in die Endregion 3' der ursprünglichen Sequenz des Gens genetisch modifiziert wurde.
Man überprüft dann die Integration des Vektors pLL91 in das Genom von Lactobacillus johnsonii La1, indem man einen Southern blot des Genoms dieser beiden im Vorstehenden selektierten genetisch modifizierten Bakterien Lactobacillus johnsonii La1 vornimmt. Zu diesem Zweck verdaut man die Genom-DNA dieser beiden Bakterien mit verschiedenen Restriktionsenzymen, deren Restriktionsstellen in dem Genom auf dem Vektor pLL91 und auf der modifizierten Sequenz des für D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens liegen. Als Hybridisierungssonde verwendet man ein Fragment der ursprünglichen Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens.
Auf diese Weise stellt man fest, dass die Genomfragmente, der beiden genetisch modifizierten Bakterien Lactobacillus johnsonii La1, die nach Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten wurden, von einer anderen Größe sind als diejenigen, die nach Verdauung des Genoms der wilden Bakterie Lactobacillus johnsonii La1 mit denselben Restriktionsenzymen erhalten werden.
VIII. Auflösung der Integration:
Die Auflösung der Integration findet durch Freisetzung des Wirkstoffs pLL91 aus dem Genom statt. Man erhält den Verlust des Vektors pLL91 entweder durch einfaches Crossing- Over zwischen der Endregion 5' der ursprünglichen Sequenz des für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens und derjenigen der modifizierten Sequenz dieses Gens oder durch einfaches Crossing-Over zwischen der Endregion 3' der ursprünglichen Sequenz der für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens und derjenigen der modifizierten Sequenz dieses Gens.
Man nimmt die Auflösung der Integration bei 37°C vor, was eine für den Vektor zulässige Temperatur ist, so dass die Freisetzung des Vektors pLL91 aus dem Genom begünstigt wird.
Man nimmt einen enzymatischen Farbtest in Gegenwart von D-Lactat-Dehydrogenase, Tetrazoliumsalz und Diaphorase so vor, dass die wilden Bakterien von den erfindungsgemäßen genetisch transformierten Bakterien differenziert werden. Dieser enzymatische Test gestattet den Nachweis, dass die Bakterien, die kein D(–)-Lactat erzeugen, D(–)-Lactat nicht oxidieren können, wenn man dem Medium das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase zusetzt, infolgedessen wird das Tetrazoliumsalz in dem Medium, da oxidiertes D-Lactat fehlt, auch nicht durch das Enzym Diaphorase reduziert, und diese Bakterien bleiben farblos.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Verwendung eines erfindungsgemäßen Bakterienstamms für die Herstellung von Nahrungsmittelzusammensetzungen. Die Prozentsätze beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.
Beispiel 1
Man stellt Joghurt aus dem Stamm Lactobacillus johnsonii CNCM I-1851 her, der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde.
Zu diesem Zweck stellt man 500 ml Magermilch aus einem auf 9 % rekonstituierten Pulver her, setzt 0,1 % Hefeextrakt zu und sterilisiert im Autoklav bei 121°C während 15 min. Dann lässt man auf 40°C abkühlen, bevor 10 Vol.-% einer aktiven Kultur des Stamms Lactobacillus johnsonii CNCM I-1851, die 5·10⁸ Mikroorganismen/cm³ enthält, eingearbeitet wird.
Man lässt diese Zubereitung während 4 h bei 40°C inkubieren, so dass ein Starter gebildet wird, der etwa 2,5·10⁸ Mikroorganismen/cm³ enthält.
Parallel dazu stellt man gemäß der oben beschriebenen Methode einen Starter her, der etwa 5·10⁸ verdickenden Streptococcus thermophilus/cm³ enthält.
Man pasteurisiert eine Mischung, die 1,5 % Fett, 3 % Magermilchpulver enthält, während 30 min bei 90°C. Dann setzt man dieser Mischung 1 % Vorteig von Lactobacillus johnsonii CNCM I-1851 und 3 % Vorteig von Streptococcus thermophilus zu.
Man mischt dann diese Zubereitung und lässt sie bei 40°C während 4 h 20 inkubieren, so dass man eine Zubereitung mit einem pH von 4,6 erhält.
Man erhält auf diese Weise Joghurt mit angenehmer Textur, dessen Konzentration an Lactobacillus johnsonii CNCM I-1851 1·10⁸ Zellen/cm³ und diejenige von Streptococcus thermophilus 1·10⁸ Zellen/cm³ beträgt.
Beispiel 2
Man geht auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 vor, wobei man jedoch den auf diese Weise hergestellten Joghurt mit sterilem destilliertem Wasser auf 50 % verdünnt, so dass man diese Zubereitung zur parenteralen Ernährung im Krankenhausbereich verwenden kann.
Beispiel 3
Man stellt fermentierte Milch ausgehend von dem Stamm Lactobacillus johnsonii CNCM I-1852 her, der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde.
Zu diesem Zweck erhitzt man während 15 min 1 l Milch auf 120°C, so dass sie denaturiert wird.
Dann kühlt man sie auf 37°C und beimpft sie mit 5 % v/v Lactobacillus johnsonii CNCM I-1852, der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde.
Man lässt die auf diese Weise hergestellte Zubereitung während 18 bis 24 h bei Umgebungstemperatur inkubieren, bis ihr Aziditätsgrad den Wert von 1 % erreicht.
Schließlich verpackt man die auf diese Weise hergestellte fermentierte Milch in Flaschen, die man bei gekühlter Temperatur lagert.
Beispiel 4
Man stellt einen Frischkäse ausgehend von dem Stamm Lactobacillus johnsonii CNCM I-1852 her, der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde.
Zu diesem Zweck erhitzt man 1 l Milch während 15 min auf 72°C und lässt sie dann auf 19°C abkühlen.
Man beimpft dann mit 0,5 % v/v einer Bakterienmischung, die einen Lactococcus lactis cremoris, einen Lactococcus lactis deacetylactis und den Stamm Lactobacillus johnsonii CNCM I-1852 enthält.
Man lässt bei etwa 20°C inkubieren, bis der pH-Wert der Milch 4,6 beträgt.
Dann gießt man die auf diese Weise koagulierte Milch in Nylonsäcke, so dass der Wasserüberschuss abläuft, der in dem auf diese Weise hergestellten Frischkäse enthalten ist.
Dann mischt man den Frischkäse mit einem Antimykotikum, wie Kaliumsorbat, zur Verhütung von Schimmel.
Schließlich homogenisiert man ihn, indem man ihn langsam so mischt, dass man einen Frischkäse mit glatter Textur erhält.
Der auf diese Weise hergestellte Frischkäse wird in kleine Becher verpackt, die bei 4–5°C während 4 bis 5 Wochen gelagert werden können. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Bakterienstamm mit den Fähigkeiten des Überlebens im Darm, des Haftens an den menschlichen Darmzellen und zur Immunmodulation, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm von Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus oder Lachtobacillus gallinarum handelt und dass er genetisch so rekombiniert ist, dass er nur mehr L(+)-Lactat erzeugt, indem das für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierende Gen inaktiviert ist.
Stamm nach Anspruch 1, der bei der CNCM unter der Nummer I-1851 hinterlegt ist.
Stamm nach Anspruch 1, der bei der CNCM unter der Nummer I-1852 hinterlegt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Stamms nach Anspruch 1, bei dem: – man die Sequenz des für die D-Lactat-Dehydrogenase codierenden Gens aus einem Wirtsbakterienstamm isoliert, der die Fähigkeiten des Überlebens im Darm, des Haftens an den menschlichen Darmzellen und zur Immunmodulation besitzt, – man eine gerichtete Mutagenese auf dieser Sequenz so durchführt, dass man eine modifizierte Sequenz erhält, – man diese modifizierte Sequenz in einen konjugativen Vektor integriert, – man den konjugativen Vektor durch Konjunktion in den Wirtsbakterienstamm transferiert, – und man dann diejenigen Wirtsbakterien selektiert, in denen die für das Enzym D-Lactat-Dehydrogenase codierende Sequenz durch homologe Rekombination mit der modifizierten Sequenz ersetzt wurde.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem man, um die modifizierte Sequenz in einen konjugativen Vektor zu integrieren, – einen Spenderbakterienstamm selektiert, der einen konjugativen Vektor enthält, der nicht die Fähigkeit besitzt, sich in dem Wirtsbakterienstamm zu replizieren, – man ein Konstrukt der modifizierten Sequenz durch Ligation in einem ersten Vektor herstellt, der nicht in der Lage ist, sich in dem Spenderstamm zu vermehren, – man dieses Konstrukt in den Spenderbakterienstamm einführt, – und man dann diejenigen Spenderbakterien selektiert, in denen sich der erste Vektor und der konjugative Vektor rekombiniert haben.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem man die Wirtsbakterien selektiert, in denen die DNA-Sequenzen des konjugativen Vektors mit Ausnahme der modifizierten Sequenz aus dem Genom entfernt wurden.
Verwendung eines Bakterienstamms, der mit Hilfe des Verfahrens nach einem der Ansprüche 4 bis 6 erhalten wurde, bei der Herstellung einer Nahrungsmittelszusammensetzung.