DE69205070T2

DE69205070T2 - Lebendige Mikroorganismen enthaltender Joghurt.

Info

Publication number: DE69205070T2
Application number: DE69205070T
Authority: DE
Inventors: Herbert Hottinger; Olivier Mignot; Beat Mollet
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-05-21
Publication date: 1996-02-29
Anticipated expiration: 2012-05-22
Also published as: DZ1584A1; AU659154B2; CA2070591A1; FI922680L; BR9202246A; GR3018081T3; JP2620022B2; CN1089214C; IE76149B1; ES2078585T3; NO922289L; CN1068017A; JPH05316948A; MX9202814A; AU1715792A; EP0518096A1; US5382438A; FI108109B; NO922289D0; DK0518096T3

Description

Die Erfindung betrifft einen Joghurt und das Verfahren zu seiner Herstellung sowie eine Lactobacillus bulgaricus-Mutante und ein Verfahren zu ihrer Selektion.
Joghurt erhält man durch Fermentierung von Milch mit einer Kombination von Streptococcus thermophilus- und Lactobacillus bulgaricus-Stämmen und liegt in Form eines Gels vor, das die lebenden Stämme enthält. Es handelt sich um ein frisches Produkt, dessen Haltbarkeit selbst bei Kühlung begrenzt ist. Es wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, um seine Konservierungseigenschaften zu verbessern und insbesondere um die Erhöhung seiner Acidität, mit anderen Worten seine Nachsäuerung, und das Auftreten eines bitteren Geschmacks zu verringern, die seine organoleptischen Eigenschaften beeinträchtigen.
Die JP-A-85256341 schlägt die Herstellung eines süßen Joghurts unter Verwendung eines gemischten Ferments vor, in dem die Anzahl von Zellen/ml von L.bulgaricus und S.thermophilus in einem bevorzugten Verhältnis von 1:100 stehen. Wenn die Verringerung der relativen Anzahl von L. bulgaricus-Zellen eine Verringerung der Nachsäuerung des Joghurts während der gekühlten Lagerung gestatten kann, kann sie jedoch auch eine Verringerung des typischen organoleptischen Joghurtcharakters des Produkts mit sich bringen, der auf das symbiotische Arbeiten der beiden Mikroorganismen zurückzuführen ist.
Die US 4425366 beschreibt die Herstellung eines Joghurts mit langer Haltbarkeit mit Hilfe einer Kombination von L.bulgaricus- und S.thermophilus-Stämmen, bei der der L.bulgaricus-Stamm eine geringe proteolytische Aktivität besitzt. Diese Schrift schlägt jedoch auch die Verwendung einer relativen Anzahl von L.bulgaricus-Zellen von etwa 1:100 vor.
Die US 4734361 beschreibt die Selektion eines L.bulgaricus- Stammes, der gegenüber niedrigen Temperaturen empfindlich ist, mit anderen Worten, eine geringe Aktivität bei einer Konservierungstemperatur von 10ºC besitzt, wobei er gleichzeitig eine gute Aktivität bei einer Fermentierungstemperatur von 43ºC hat. Der so selektierte Stamm FERM BP-1041 wurde vom Stamm ATCC 11842 abgeleitet.
Die JP-A-90053437 beschreibt die Herstellung eines Joghurts, in dem in Kombination mit einem S.thermophilus-Stamm ein L.bulgaricus-Stamm verwendet wird, der wegen seiner Unfähigkeit (künstliche Mutante SBT-0218) oder seiner herabgesetzten Fähigkeit (natürliche Mutante SBT-0220), Lactose zu fermentieren, gewählt wurde. Der Ausgangsmilch muß hierbei Glucose zugesetzt werden.
WO 90/05459 schlägt die Konstruktion eines gegenüber niedrigen Temperaturen oder niedrigen pH-Werten empfindlichen L.bulgaricus durch selektive Mutation auf E.coli eines beta- Galactosidasegens vor, das L.bulgaricus entnommen wurde und dazu bestimmt ist, wieder in L.bulgaricus eingebaut zu werden.
Ziel der Erfindung ist es, die Herstellung eines Joghurts zu ermöglichen, dessen organoleptische Eigenschaften bei der Aufbewahrung nicht beeinträchtigt werden und der gleichzeitig einen herkömmlichen typischen Charakter besitzt, der auf die symbiotische Arbeit der beiden Mikroorganismen S.thermophilus und L.bulgaricus zurückzuführen ist. Ziel der Erfindung ist es ferner, ein reproduzierbares und sicheres Verfahren zum Selektieren einer L.bulgaricus-Mutante zu schaffen, die, in Kombination mit wenigstens einem S.thermophilus-Stamm verwendet, die Herstellung eines solchen Joghurts gestattet.
Zu diesem Zweck weist der erfindungsgemäße Joghurt auf:
- 20-20 Gew.-% Trockenmasse einer Tier- und/oder Pflanzenmilch,
- von 10&sup6;-10¹&sup0; Zellen/ml einer Mutante von Lactobacillus bulgaricus, in deren DNA ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des beta-Galactosidasegens umfaßt, und
- von 10&sup6;-10¹&sup0; Zellen/ml Streptococcus thermophilus.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Joghurts fermentiert man ferner eine Milch mit einer Kombination aus wenigstens einem Streptococcus thermophilus-Stamm und einer Lactobacillus bulgaricus-Mutante, in deren DNA ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des beta- Galactosidasegens umfaßt.
Die erfindungsgemäße Lactobacillus bulgaricus-Mutante besitzt also eine DNA, in der ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des beta-Galactosidasegens umfaßt.
In dem erfindunsgemäßen Verfahren zum Selektieren einer L.bulgaricus-Mutante
- führt man ein Screening eines L.bulgaricus-Mutterstammes auf einer X-Gal-Platte durch, um Kolonien zu isolieren, die eine beta-Galactosidasemangelmutation zeigen,
- unterzieht man diese Mutantenkolonien einem Stabilitätstest in einem Medium, das Lactose als einzige Energiequelle enthält,
- baut man die Chromosomen-DNA der stabilen Mutanten enzymatisch mit Hilfe von Restriktionenzymen ab und führt einen Nachweistest auf Fragmente durch, die einen Bereich umfassen, der das beta-Galactosidasegen aufweist, und
- wählt eine Mutante aus, die eine DNA aufweist, bei der ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des beta- Galactosidasegens umfaßt.
Man hat nämlich festgestellt, daß es möglich ist, auf diese Weise einen Joghurt zu schaffen, bei dem die Nachsäuerung und das Auftreten eines bitteren Geschmacks bei der Aufbewahrung beträchtlich reduziert sind und dessen organoleptische Eigenschaften den herkömmlichen typischen Charakter des Joghurts besitzen, der auf die symbiotische Arbeit der beiden Mikroorganismen S.thermophilus und L.bulgaricus zurückzuführen ist.
Man hat insbesondere festgestellt, daß die erfindungsgemäße L.bulgaricus-Mutante die überraschende Eigenschaft besitzt, nur eine geringe Nachsäuerung bei der Aufbewahrung zu verursachen, wobei sie gleichzeitig bei der Fermentation aktiv in Symbiose mit S.thermophilus arbeitet, wobei die jeweiligen Anzahlen von Zellen dieser beiden Mikroorganismen insbesondere in einem relativ ausgeglichenem Verhältnis, insbesondere in einem Verhältnis von etwa 1:20 bis 1:1, stehen können, und zwar sowohl bei Beginn der Inkubation als auch im erhaltenen Joghurt.
Bei zwei bevorzugten Ausführungsformen des Joghurts, seines Herstellungsverfahrens, der Mutante und ihres Selektionsverfahrens umfaßt dieses fehlende DNA-Fragment entweder nur einen Teil des beta-Galactosidasegens oder umfaßt wenigstens einen Teil des beta-Galactosidasegens und erstreckt sich wenigstens stromab von diesem Gen über wenigstens 1,0 kb.
Die erste dieser bevorzugten Ausführungsformen ist insbesondere zur Verwendung in Ländern mit gemäßigtem oder relativ kühlem Klima bestimmt. Die zweite dieser bevorzugten Ausführungsformen ist insbesondere für eine Verwendung in Ländern mit relativ warmem Klima bestimmt.
Die erste bevorzugte Ausführungsform ist ebenfalls in Ländern mit relativ warmem Klima verwendbar, sofern man über geeignete Kühlmittel, insbesondere eine Kühlkette, verfügt. Ebenso kann die zweite bevorzugte Ausführungsform auch in Ländern mit relativ kaltem Klima ohne Verwendung von besonderen Kühleinrichtungen verwendet werden, indem man insbesondere auf eine Kühlkette verzichtet.
Im Rahmen dieser ersten bevorzugten Ausführungsform ist die L.bulgaricus-Mutante offensichtlich nicht in der Lage, die Lactose allein zu fermentieren, in einer Milch in Symbiose mit S.thermophilus kultiviert, ist sie jedoch in der Lage, diese Milch praktisch ebenso wie der Mutterstamm, von dem er stammt, anzusäuern. Die Beigabe von geringen Mengen Glucose gestattet die Modulierung der Geschwindigkeit dieser Ansäuerung und das Nachsäuerungsniveau bei Konservierung.
Im Rahmen dieser zweiten bevorzugten Ausführungsform ist die L.bulgaricus-Mutante offensichtlich nicht in der Lage, allein die Lactose zu fermentieren, und, in einer Milch in Symbiose mit S.thermophilus kultiviert, säuert sie diese Milch mit einer weniger hohen Geschwindigkeit und bis zu einem weniger hohen pH-Wert an als der Mutterstamm, von dem sie stammt. Die Beigabe einer geringen Menge Glucose gestattet eine leichte Beschleunigung der Geschwindigkeit dieser Ansäuerung und eine leichte Senkung des erreichten pHs, praktisch ohne Nachsäuerungsprobleme zu stellen.
Im Rahmen jeder dieser beiden bevorzugten Ausführungsformen ist es möglich, eine relativ hohe Anzahl lebender Zellen jedes der Mikroorganismen in den erhaltenen Joghurts aufrechtzuerhalten.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Joghurts kann man als Rohstoff eine frische oder rekonstituierte pasteurisierte Tier- und/oder Pflanzenmilch in Form von entrahmter Milch, teilentrahmter Milch oder Vollmilch mit einem Trockenmassegehalt von 10-20 % verwenden. Man beimpft diese Milch vorzugsweise mit 0,2-5, vorzugsweise 0,5-3 Vol.-% einer Kultur, die 10&sup6;-10¹&sup0;, vorzugsweise 10&sup8;- 10&sup9;, Zellen/ml dieser Lactobacillus bulgaricus-Mutante und 1- 5 Vol.-%, vorzugsweise 2-4 Vol.-%, einer Kultur enthält, die 10&sup6;-10¹&sup0;, vorzugsweise 10&sup8;-10&sup9;, Zellen/ml Streptococcus thermophilus enthält.
Man kann die Milch während 2,5-15 h bei 35-48ºC fermentieren. Der bei dieser Fermentierung oder Ansäuerung erreichte pH- Wert kann etwa 4,3-4,8 bei der ersten Ausführungsform betragen, und zwar bei derjenigen, bei der dieses fehlende DNA- Fragment von L.bulgaricus nur wenigstens einen Teil des beta- Galactosidasegens umfaßt. Dieser pH-Wert kann durch Versetzen der Ausgangsmilch mit etwa 0,2-2 Gew.-% Glucose um etwa 0,1- 0,5 Einheiten gesenkt werden.
Bei der zweiten Ausführungsform, und zwar derjenigen, bei der dieses fehlende DNA-Fragment von L.bulgaricus wenigstens einen Teil des beta-Galactosidasegens umfaßt und sich wenigstens stromab von diesem Gen über wenigstens 1,0 kb erstreckt, kann der bei dieser Fermentierung oder Ansäuerung erreichte pH-Wert etwa 4,5-5,0 betragen. Dieser pH-Wert kann durch Versetzen der Ausgangsmilch mit etwa 0,2-2 Gew.-% Glucose um etwa 0,05-0,3 Einheiten gesenkt werden.
Man kann so einen Joghurt erhalten, der Anzahlen von Zellen/ml von der L.bulgaricus-Mutante bzw. von der S.thermophilus-Mutante enthält, die mit den Anzahlen von Zellen/ml vergleichbar sind, wie sie die für die Inkubation benutzten Kulturen aufweisen. Die Verhältnisse zwischen diesen jeweiligen Anzahlen liegen vorzugsweise zwischen 1:20 und 1:7, ja sogar zwischen 1:20 und 1:4 im Fall dieser ersten Ausführungsform und zwischen etwa 1:10 und 1:4, ja sogar zwischen 1:10 und 1:1 im Fall der zweiten Ausführungsform.
Dieser Joghurt besitzt damit organoleptischen Eigenschaften, die den typischen Charakter eines herkömmlichen Joghurts bieten, der durch die Verwendung von L.bulgaricus und S.thermophilus in Symbiose zurückzuführen ist. Er kann mehrere Wochen ohne Kühlung und im Fall der zweiten Ausführungsform sogar bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, ohne daß das pH um mehr als etwa 0,05-0,5 Einheiten fällt, ohne daß ein bitterer Geschmack auftritt und ohne daß die Anzahl von lebenden Zellen, die er enthält, erhebliche Änderungen zeigt.
Zur Durchführung des Verfahrens zum Selektieren einer L.bulgaricus-Mutante gemäß der Erfindung wählt man als Mutterstamm vorzugsweise einen handelsüblichen Stamm, der also alle für die Herstellung eines guten herkömmlichen handelsübeta-lichen Joghurts erforderlichen Eigenschaften besitzt.
Mit einem solchen Mutterstamm kann man ein Screening auf einer X-Gal-Platte durchführen, wie es beispielsweise von B. Mollet et al, Journal of Bacteriology 172, 5670-5676 (1990) unter Bezugnahme auf J.H. Miller (1972) beschrieben wird. Man kann diese Mutantenkolonien einem Stabilitätstest unterziehen, indem man sie in einem Medium, das Lactose als einzige Energiequelle enthält, wie beispielsweise Kuhmilch, kultiviert, um die Mutanten zu entfernen, die von selbst in den ursprünglichen beta-Galactosidase-plus-Zustand zurückzukehren.
Man kann die Chromosomen-DNA der stabilen Mutanten beispielsweise auf die von M. Delley et al, Appl. Environ. Microbiol. 56, 1967-70 (1990), beschriebene Weise extrahieren. Man kann die DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen wie beispielsweise BamHI, EcoRI, HindIII, SalI und TagI abbauen.
Man unterzieht die abgebaute DNA einem Nachweistest auf Fragmente, die in einem Bereich liegen, der das beta- Galactosidasegen aufweist. Zu diesem Zweck kann man die auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragmente auf Agarosegel trennen, sie auf eine Übertragungsmembran zum Screening von Genen durch Hybridisierung aufbringen und eine Hybridisierung mit einer das beta-Galacdosidasegen tragenden DNA-Sonde beispielsweise mit dem Southern Blot durchführen (E. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517, 1975). Als DNA-Sonde kann man ein Fragment SalI-BamHI des Plasmids pMZ2 verwenden (B. Mollet et al, J. Bacteriol. 172, 5670-5676, 1990), wobei man dieses Fragment, das eine Länge von 4,3 kb besitzt und das gesamte beta-Galactosidasegen besitzt, beispielsweise mit ³²P markieren kann.
Zur Durchführung dieses Nachweistests kann man beispielsweise auch die PCR-Methode mit spezifischen Primern anwenden (PCR ist die Abkürzung des englischen Ausdruckes "Polymerase Chain Reaction"; vgl. Saiki et al, Science 230, 1350-1354, 1985, und Saiki et al, Science 239, 487-491, 1988).
Man kann nun eine Mutante selektionieren, die eine DNA besitzt, in der ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des beta-Galactosidasegens umfaßt. Man hat nämlich festgestellt, daß derartige Mutanten eines handelsüblichen Mutterstamms auf vorteilhafte Weise in Symbiose mit S.thermophilus zur Herstellung der vorliegenden Joghurts verwendet werden können.
Man hat insbesondere festgestellt, daß derartige Mutanten mit einer DNA, in der ein Fragment fehlt, das nur einen Teil des beta-Galactosidasegens umfaßt und das eine Länge besitzen kann, die zwischen einigen Basenpaaren und fast der ganzen Länge des beta-Galactosidasegens liegt, sich besonders gut für die Herstellung eines Joghurts mit langer Haltbarkeit unter Kühlung in Ländern mit gemäßigtem oder relativ kaltem Klima eignen. Von verschiedenen selektionierten Mutanten dieses Typs wurde beispielsweise eine nach dem Budapester Abkommen am 29.03.1991 in der "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 7524 Paris Cedex 15, Frankreich, hinterlegt, wo ihr die Nummer CNCM I-1068 zugeteilt wurde.
Im nachstehenden werden Einzelheiten der Morphologie und der Eigenschaften dieses Stamms CNCM I-1068 aufgeführt:

Morphologie:

- Mikroorganismus grampositiv, katalasenegativ und fakultativ anaerob.
- Gerade Bazillen ohne Geißeln oder Bildung von Sporen.

Fermentierung der Zucker:

- Säureproduktion aus:
- D-Glucose
- D-Fructose
- D-Mannose

Andere:

- keine Säureproduktion aus Lactose (kein funktionelles beta-Galactosidaseenzym).
Man hat insbesondere auch festgestellt, daß derartige Mutanten, die eine DNA besitzen, in der ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des beta-Galactosidasegens umfaßt und sich wenigstens stromab von diesem Gen über wenigstens 1,0 kb erstreckt, sich besonders gut zur Herstellung eines Joghurts mit langer Haltbarkeit unter Kühlung in Ländern mit relativ warmem Klima eignen. Von den verschiedenen selektionierten Mutanten dieses Typs wurde beispielsweise eine nach dem Budapester Abkommen am 29.03.91 in der "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 7524 Paris Cedex 15, Frankreich, hinterlegt, wo ihr die Nummer CNCM I-1067 zugeteilt wurde.
Einzelheiten der Morphologie und der Eigenschaften dieses Stamms CNCM I-1067 sind im nachstehenden angeführt:

Morphologie:

Fermentation der Zucker:

- Säureproduktion aus:
D-Glucose
- D-Fructose
- D-Mannose

Andere:

- Keine Säureproduktion aus Lactose (kein funktionelles beta-Galactosidaseenzym).
Die nachstehenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der erfindungsgemäßen Produkte und Verfahren. Die Prozentsätze beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht.

Beispiel 1

Man sterilisiert 5 Liter Kulturmedium MRS bei 121 ºC während 15 min. Man beimpft sie mit 5 Vol.-% einer aktiven Kultur des Stammes Lactobacillus bulgaricus CNCM I-1068, die etwa 10&sup9; Zellen/ml enthält. Man inkubiert bei 41 ºC während 8 h und erhält ein Ferment, das 4,5-10&sup8; Zellen/ml enthält.
Man sterilisiert bei 121 ºC während 15 min 5 Liter rekonstituierte Magermilch mit 10 % Trockenmasse, der man 0,1 % Hefeextrakt beigegeben hat. Man beimpft sie mit 2 % einer handelsüblichen eindickenden aktiven Kultur von Streptococcus thermophilus, die etwa 10&sup9; Zellen/ml enthält. Man inkubiert bei 41 ºC während 4 h und erhält ein Ferment, das 4,5.10&sup8; Zellen/ml enthält.
Man beimpft anschließend eine mit 2,5 % Pulvermagermilch angereicherte Vollmilchmenge mit 3,7 % Fett, die 30 min bei 90 ºC pasteurisiert wurde, mit 2 Vol.-% des Ferments L.bulgaricus I-1068 und 3 Vol.-% des eindickenden Ferments S.thermophilus. Man rührt die beimpfte Milch, verteilt sie in Töpfe und inkubiert sie 4 h bei 41ºC.
Man erhält einen Joghurt, der eine gute feste und glatte Textur besitzt sowie einen süßen angenehmen Geschmack, wie er für diese Art Produkt typisch ist. Dieser Joghurt hat einen pH-Wert von 4,53 und enthält 4,6.10&sup7; Zellen/ml L.bulgaricus I-1068 und 6,8.10&sup8; Zellen/ml S.thermophilus.
Man unterzieht diesen Joghurt einem Lagerungstest bei 4 ºC und bei 12 ºC. In diesem Test mißt man das pH und kostet das Produkt nach 1, 7, 14 und 24 d (Tage) Lagerung. Die Ergebetanisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt.

Beispiel 2

Man geht wie in Beispiel 1 vor, verwendet jedoch den Stamm L.bulgaricus CNCM I-1067 anstelle des Stamms CNCM I-1068.
Das erhaltene L.bulgaricus-Ferment enthält 5,2.10&sup8; Zellen/ml.
Man enthält einen Joghurt mit einem pH von 4,55 nach 8h30 Inkubation bei 41ºC. Er enthält 5,6.10&sup7; Zellen/ml L.bulgaricus CNCM I-1067 und 5,5.10&sup8; Zellen/ml S.thermophilus. Er besitzt eine gute Textur und einen angenehmen Geschmack die mit denen des Joghurts von Beispiel 1 vergleichbar sind.
Man unterzieht diesen Joghurt dem in Beispiel 1 beschriebenen Lagerungstest. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.

Vergleichsbeispiel i)

Zum Vergleich geht man auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise vor, indem man die beiden Mutanten I-1067 und I-1068 durch ihren Mutterstamm ersetzt,einen Stamm, der industriell zur Joghurtherstellung verwendet wird.
Man erhält einen Vergleichsjoghurt (i) mit einem pH von 4,53 nach 3h30 Inkubation bei 41ºC. Er enthält 2,9.10&sup7; Zellen/ml L.bulgaricus und 4,9.10&sup8; Zellen/ml S.thermophilus. Er besitzt eine gute Textur und einen süßen angenehmen Geschmack.
Man unterzieht diesen Vergleichsjoghurt (i) dem in Beispiel 1 beschriebenen Lagerungstest. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Lagerungszeit Lagerung bei pH Geschmack gut, süß gut, arom. leicht sauer leicht bitter sehr sauer, bitter
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Joghurts der Beispiele 1 und 2 sehr lagerungsstabil sind, wobei ihre Nachsäuerung viel weniger schnell als die des Vergleichsjoghurts ist. Die Nachsäuerung des Joghurts von Beispiel 2 ist noch geringer als die des Joghurts von Beispiel 1. Im Gegensatz zu dem, was bei dem Vergleichsjoghurt geschieht, stellt man kein Auftreten eines auch nur geringen bitteren Geschmacks bei den Joghurts der Beispiele 1 und 2 fest.

Beispiele 3-6

Man geht auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 vor, jedoch mit der Ausnahme, daß man der Milch in Beispiel 3 0,5 % Glucose und in Beispiel 4 1 % Glucose beigibt, bevor man sie pasteurisiert.
Ferner geht man wie in Beispiel 2 vor, jedoch mit der Ausnahme, daß man der Milch in Beispiel 5 0,5 % Glucose und in Beispiel 6 1 % Glucose beigibt.
Die beimpfte Milch wird bei 41ºC während 3h40 bis zu einem pH von 4,55 in Beispiel 3, während 3h40 bis zu einem pH von 4,53 in Beispiel 4 und während 8 h bis zu einem pH von 4,63 in den Beispielen 5 und 6 inkubiert.
Die auf diese Weise erhaltenen Joghurts besitzen eine gute Textur und einen angenehmen Geschmack. Ihre jeweiligen Gehalte an L.bulgaricus und S.thermophilus, ausgedrückt in Anzahl aktiver Zellen/ml, sind 4,7.10&sup7; (I-1068) und 6,4.10&sup8;, 7.10&sup7; (I-1068) und 9,0.10&sup8;, 7,8.10&sup7; (I-1067) und 7,5.10&sup8; sowie 7,9.10&sup7; (I-1067) und 5,7.10&sup8; in den Beispielen 4, 5, 6 bzw. 7.
Man unterwirft alle diese Joghurts dem in Beispiel 1 beschriebenen Lagerungstest und erhält die in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse: Tabelle 2 Lagerungszeit Lagerung bei gut, süß gut, arom. gut, sauer
Diese Ergebnisse zeigen, daß man den Grad der Nachsäuerung des Joghurts modulieren kann, indem man der Milch Glucose beigibt, wenn die verwendete L.bulgaricus-Mutante von dem Typ ist, in dem dieses fehlende DNA-Fragment nur einen Teil des beta-Galactosidasegens umfaßt (Beispiele 3 und 4, L.bulgaricus CNCM I-1068). Aufgrund dieser mehr oder weniger stark herabgesetzten Nachsäuerung ist eine solche Mutante insbesondere dazu bestimmt, zur Herstellung von Joghurts in Ländern mit gemäßigtem oder relativ kaltem Klima verwendet zu werden.
Dagegen ändert man den Grad der Nachsäuerung des Joghurts kaum, indem man der Milch Glucose beigibt, wenn die verwendete L.bulgaricus-Mutante von dem Typ ist, in dem dieses fehlende DNA-Fragment wenigstens einen Teil des beta- Galactosidasegens umfaßt und sich wenigstens stromab von diesem Gen über wenigstens 1,0 kb erstreckt (Beispiele 5 und 6, L.bulgaricus CNCM I-1067). Diese Tatsache, daß die Glucose auf die Nachsäuerung keinen Einfluß hat, gestattet die Verwendung einer Mutanten diesen Typs beispielsweise für die Herstellung von aromatisierten gezuckerten Joghurts. Die ihrerseits selbst bei 12 ºC sehr geringe Nachsäuerung macht eine solche Mutante außerdem insbesondere für die Verwendung zur Herstellung von Joghurts in Ländern mit relativ warmem Klima geeignet.

Beispiel 7

Man stellt zwei ähnliche Fermente wie in Beispiel 2 her, deren eines 4,3.10&sup8; Zellen/ml L.bulgaricus CNCM I-1067 und deren anderes 6.10&sup8; Zellen/ml faserbildenden S.thermophilus enthält.
Eine 30 min bei 90 ºC pasteurisierte teilentrahmte Milch, die 2,8 % Fett enthält und durch 5 % Pulvermagermilch angereichert ist, beimpft man mit 2 Vol.-% des Ferments L.bulgaricus und 3,5 Vol.-% des Ferments eindickender S.thermophilus. Nach Inkubation während 8 h bei 41 ºC kühlt man und rührt den erhaltenen Joghurt, bevor man ihn in Töpfe verteilt. Man erhält einen Joghurt vom gerührten Typ mit einem pH von 4,62, einer guten cremigen Textur und einem angenehmen Geschmack, der 6,4.10&sup7; Zellen/ml L.bulgaricus CNCM-1067 und 4,5.10&sup8; Zellen/ml faserbildenden S.thermophilus enthält.
Man unterzieht diesen Joghurt dem in Beispiel 1 beschriebenen Lagerungstest. Die Ergebnisse des Tests sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.

Vergleichsbeispiel ii)

Man geht auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise vor, jedoch mit der Ausnahme, daß man ein L.bulgaricus-Ferment nicht mit dem Stamm CNCM I-1067, sondern mit einem der Stämme des Patents US 4425366 herstellt, die eine geringe proteolytische Aktivität aufweisen.
Man beimpft anschließend unter denselben Bedingungen dieselbe Milch wie in Beispiel 7. Nach 8h30 Inkubation bei 41ºC erhält man ebenfalls einen Joghurt vom gerührten Typ der ein pH von 4,63 eine cremige Textur und einen angenehmen Geschmack besitzt und 1,6.10&sup7; Zellen/ml L.bulgaricus und 2,6.10&sup8; Zellen/ml S.thermophilus enthält.
Man unterzieht diesen Vergleichsjoghurt dem in Beispiel 1 beschriebenen Lagerungstest und erhält die in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführten Ergebnisse. Tabelle 3 Lagerungszeit Lagerung bei pH Geschmack Vergleich ii) gut, süß leicht, arom. leicht sauer
Diese Ergebnisse zeigen, daß der Stamm CNCM I-1067 vorteilhafterweise einen der Stämme der US 4425366 in der Herstellung eines Joghurts mit langer Haltbarkeit ersetzen kann, da er bei einer vergleichbaren Nachsäuerung die Herstellung eines aromatischeren Joghurts gestattet, der eine höhere relative Anzahl von Zellen L.bulgaricus enthält.

Beispiele 8 - 11 (Selektion)

Auf die oben beschriebene Weise wendet man das erfindungsgemäße Verfahren zum Selektieren einer L.bulgaricus-Mutanten aus vier verschiedenen handelsüblichen Mutterstämmen an, von denen zwei texturierende, und zwar faserbildende Eigenschaften besitzen. Man selektioniert auf diese Weise verschiedene Mutanten, die eine DNA besitzen, in der ein Fragment fehlt, das nur einen Teil des beta-Galactosidasegens umfaßt.
Von diesen vier Mutanten wurden als Beispiel vier, und zwar eine für jeden Mutterstamm, nach dem Budapester Vertrag am 02.04.92 in der "Collection Nationale de Cultures de Microrganismes" (CNCM), Institut Pasteur, 18 rue du Dr Roux, 7524 Paris Cedex 15, Frankreich, hinterlegt, wo ihnen die Nummern CNCM I-1191, I-1193, I-1196 und I-1198 zugeteilt wurden.
Es folgen Einzelheiten der Morphologie und der Eigenschaften dieser Stämme:

Morphologie:

- Mikroorganismen grampositiv, katalasenegativ, fakultativ anaerob.
- Gerade Bazillen ohne Geißeln, keine Bildung von Sporen. Fermentation der Zucker: - Säureproduktion aus: D-Glucose D-Fructose D-Mannose Trehalose

Andere:

- Keine Säureproduktion aus Lactose (kein funktionelles beta-Galactosidaseenzym).
- Die Stämme CNCM I-1196 und I-1198 besitzen texturierende Eigenschaften (Produktion von Polysacchariden).

Beispiele 8 und 9 (Herstellung von Joghurts)

Man stellt zwei Fermente her, die jeweils etwa 10&sup8; Zellen/ml eines der Stämme L.bulgaricus CNCM I-1191 und I-1193 enthalten, sowie einen Stamm, der etwa 10&sup9; Zellen/ml einer handelsüblichen Streptococcus thermophilus-Kultur enthält.
Man stellt zwei Mengen von 40 l Frischmilch mit 3,7 % Fett her, die mit 1,5 % Pulvermagermilch versetzt ist und 3 min bei 98 ºC pasteurisiert wurde. Man beimpft jede der beiden Mengen mit 2 Vol.-% eines der beiden Fermente L.bulgaricus CNCM I-1191 und I-1193 und inkubiert bei 40 ºC während 9 h bzw. 4 h 15 min.
Man erhält Joghurts, die eine feste und glatte Textur, einen süßen und typischen Geschmack, ein pH von 4,65 und jeweils Gehalte an einer Anzahl von Zellen von L.bulgaricus und S.thermophilus pro ml von 4,5.10&sup6; (I-1191) und 2,2.10&sup8; sowie 2,4.10&sup7; (I-1193) und 5,5.10&sup8; haben.
Man unterzieht diese Joghurts dem in Beispiel 1 beschriebenen Lagerungstest. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 aufgeführt.

Beispiele 10 und 11 (Herstellung von Joghurts)

Man stellt zwei Fermente her, die jeweils etwa 10&sup8; Zellen/ml eines der fasernbildenden Stämme L.bulgaricus CNCM I-1196 und I-1198 enthalten, sowie ein Ferment, das etwa 10&sup9; Zellen/ml eines handelsüblichen S.thermophilus-Stammes enthält.
Man stellt zwei Mengen von 20 l Milch mit 1,5 % Fett her, die mit 2,5 % Pulvermagermilch versetzt und pasteurisiert ist. Man beimpft jede der beiden Mengen mit 2 % einer der beiden fasernbildenden L.bulgaricus-Fermente CNCM I-1196 und I-1198 und inkubiert 5 h bei 40ºC.
Man erhält Joghurts, die eine cremige Textur, einen süßen und typischen Geschmack, einen pH von 4,65 und jeweils Gehalte an einer Anzahl von Zellen von L.bulgaricus und S.thermophilus pro ml von 6,0.10&sup6; (I-1196) und 3,5.10&sup8; sowie 1,8.10&sup7; (I- 1198) und 5,0.10&sup7; haben.
Man unterzieht diese Joghurts dem in Beispiel 1 beschriebenen Lagerungstest. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4 Lagerungszeit Lagerung bei pH Geschmack gut, süß gut, arom.
Wenn man diese Ergebnisse miteinander und mit den in Tabelle 1, Beispiel Nr. 1 angeführten Ergebnissen vergleicht, so stellt man fest, daß die Nachsäuerung aller dieser Joghurts sehr ähnlich und viel weniger schnell als die des Vergleichsjoghurts ist (Tabelle 1, Vergleichsbeispiel i). Dies zeigt, daß die Anwendung des erfindungsgemäßen Selektierungsverfahrens gestattet, aus verschiedenen Mutterstämmen, mit anderen Worten, aus einem beliebigen handelsüblichen L.bulgaricus-Stamm, Mutanten, insbesondere Mutanten mit einer DNA, in der ein Fragment fehlt, das nur einen Teil des beta- Galactosidasegens enthält, zu selektieren, die, in Kombination mit einem beliebigen handelsüblichen S.thermophilus- Stamm verwendet, die Herstellung von Joghurts herkömmlichen Charakters gestatten, die praktisch dieselben bemerkenswerten Haltbarkeitseigenschaften besitzen.

Beispiele 12 - 15 (Selektion)

Auf die oben beschriebene Weise führt man das erfindungsgemäße Verfahren zum Selektieren einer L.bulgaricus-Mutante aus vier verschiedenen handelsüblichen Mutterstämmen durch, von denen zwei texturierende, und zwar faserbildende Eigenschaften besitzen. Man selektiert auf diese Weise verschiedene Mutanten mit einer DNA, in der ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des beta-Galactosidasegens enthält und sich wenigstens stromab von diesem Gen über wenigstens 1,0 kb erstreckt.
Von diesen Mutanten wurden vier, und zwar für jeden unterschiedlichen Mutterstamm eine, als Beispiel nach dem Budapester Vertrag am 02.04.92 in der "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (CNCM), Istitut Pasteur, 28 rue de Dr. Roux, 7524 Paris Cedex 15, Frankreich, hinterlegt, wo ihnen die Nummern CNCM I-1192, I-1194, I-1195 und I-1197 zugeteilt wurden.
Es folgen Einzelheiten der Morphologie und der Eigenschaften dieser Stämme:

Morphologie:

- Mikroorganismen grampositiv, katalasenegativ, fakultativ anaerob.
- Gerade Bazillen ohne Geißeln, keine Sporenbildung. Fermentation der Zucker: - Säureproduktion aus D-Glucose D-Fructose D-Mannose Trehalose

Andere:

- Keine Säureproduktion aus Lactose (kein funktionelles beta- Galactosidaseenzym).
- Die Stämme CNCM I-1195 und I-1197 besitzen texturierende Eigenschaften (Erzeugung von Polysacchariden).

Beispiele 12 - 15 (Herstellung von Joghurts)

Man stellt vier Fermente her, die jeweils etwa 10&sup8; Zellen/ml eines der Stämme L.bulgaricus CNCM I-1192, I-1194, I-1195 und I-1197 enthalten, sowie ein Ferment, das etwa 10&sup9; Zellen/ml einer handelsüblichen Streptococcus thermophilus-Kultur enthält.
Man stellt vier Mengen von 40 l Frischmilch mit 3,7 % Fett her, die mit 1,5 % Pulvermagermilch versetzt und 3 min bei 98ºC pasteurisiert ist. Man beimpft jede der vier Mengen mit 2 Vol.-% einer der vier Fermente von L.bulgaricus CNCM I- 1192, I-1194, I-1195 und I-1197 und inkubiert 9 h bei 40 ºC.
Man erhält Joghurts mit einer festen und glatten Textur (I- 1192, I-1194) oder einer cremigen Textur (I-1194, I-1195), mit einem süßen bis sehr süßen und typischen Geschmack, einem pH von 5,60 (I-1192), 4,80 (I-1194), 4,76 (I-1195) bzw. 4,66 (I-1197) und mit jeweiligen Gehalten an einer Zellenanzahl von L.bulgaricus und S.thermophilus pro ml von 9,9.10&sup6; (I- 1192) und 1,1.10&sup8;, 3,5.10&sup6; (I-1194) und 7,9.10&sup7;, 2,3.10&sup6; (I- 1195) und 9,3.10&sup7; sowie 1,7.10&sup7; (I-1197) und 1,7.10&sup8;.
Man unterzieht diese Joghurts dem in Beispiel 1 beschriebenen Lagerungstest. die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5 Lagerungszeit Lagerung bei pH Geschmack gut, süß gut, arom.
Wenn man diese Ergebnisse miteinander sowie mit den in Tabelle 1, Beispiel Nr. 2, aufgeführten Ergebnissen vergleicht, stellt man fest, daß die Nachsäuerung aller dieser Joghurts sehr ähnlich ist und viel weniger schnell als die des Vergleichsjoghurts (Tabelle 1, Vergleichsbeispiel i) und sogar noch geringer als die der Joghurts der Beispiele 1, 8, 9, 10 und 11 ist. Dies zeigt, daß die Durchführung des erfindungsgemäßen Selektionsverfahrens gestattet, aus verschiedenen Mutterstämmen, mit anderen Worten aus einem beliebigen handelsüblichen L.bulgaricus-Stamm, Mutanten, insbesondere Mutanten mit einer DNA, in der ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des beta-Galactosidasegens enthält und sich wenigstens stromab von diesem Gen über wenigstens 1,0 kb erstreckt, zu selektieren, die, in Kombination mit einem beliebigen handelsüblichen S.thermophilus-Stamm verwendet, die Herstellung von Joghurts mit herkömmlichem Charakter gestatten, die praktisch dieselben bemerkenswerten Haltbarkeitseigenschaften besitzen.

Claims

1. Joghurt, der aufweist

- 10-20 Gew.-% Trockenmasse einer Tier- und/oder Pflanzenmilch,

- von 10&sup6;-10¹&sup0; Zellen/ml einer Mutante von Lactobacillus bulgaricus, in deren DNA ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des β-Galactosidasegens umfaßt, und

- von 10&sup6;-10¹&sup0; Zellen/ml Streptococcus thermophilus.

2. Joghurt nach Anspruch 1, bei dem das bei der L.bulgaricus-Mutante fehlende DNA-Fragment nur einen Teil des β- Galactosidasegens umfaßt.

3. Joghurt nach Anspruch 1, bei dem das bei der L.bulgaricus-Mutante fehlende DNA-Fragment wenigstens einen Teil des β-Galactosidasegens umfaßt und sich wenigstens stromab von dem genannten Gen über wenigstens 1,0 kb erstreckt.

4. Joghurt nach Anspruch 1, bei dem die genannte Mutante einer der Lactobacilius bulgaricus-Stämme CNCM I-1067, I-1068, I-1191, I-1192, I-1193, I-1194, I-1195, I-1196, I-1197 und I-1198 ist.

5. Verfahren zur Herstellung eines Joghurts, bei dem man eine Milch mit einer Kombination aus wenigstens einem Streptococcus thermophilus-Stamm und einer Lactobacillus bulgaricus-Mutante fermentiert, in deren DNA ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des β-Galactosidasegens umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei der man die genannte Milch mit 0,2-5 Vol.-% einer Kultur beimpft, die 10&sup6; - 10¹&sup0; Zellen/ml der genannten Lactobacillus bulgaricus-Mutante enthält, und 1-5 Vol.-% einer Kultur, die 10&sup6;-10¹&sup0; Zellen/ml Streptococcus thermophilus enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem man eine Tier- und/oder Pflanzenmilch fermentiert, die 10-20 Gew.-% Trockenmasse aufweist, und zwar während 2,5-15 h bei 35-48 ºC.

8. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die genannte L.bulgaricus-Mutante eine DNA aufweist, bei der ein Fragment fehlt, das nur einen Teil des β-Galactosidasegens umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die genannte L.bulgaricus-Mutante eine DNA aufweist, bei der ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des β- Galactosidasegens umfaßt und sich wenigstens stromab von dem genannten Gen über wenigstens 1,0 kb erstreckt.

10. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die genannte Mutante einer der Lactobacillus bulgaricus-Stämme CNCM I-1067, I-1068, I-1191, I-1192, I-1193, I-1194, I-1195, I-1196, I-1197 und I-1198 ist.

11. Lactobacillus bulgaricus-Mutante, die eine DNA aufweist, bei der ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des β-Galactosidasegens umfaßt.

12. Mutante nach Anspruch 11, bei der das genannte fehlende DNA-Fragment nur einen Teil des β-Galactosidasegens umfaßt.

13. Mutante nach Anspruch 11, bei der das genannte fehlende DNA-Fragment wenigstens einen Teil des β-Galactosidasegens umfaßt und sich wenigstens stromab von dem Gen über wenigstens 1,0 kb erstreckt.

14. Mutante nach Anspruch 11, die ausgewählt ist unter den Lactobacillus bulgaricus-Stämmen CNCM I-1067, I-1068, I-1191, I-1192, I-1193, I-1194, I-1195, I-1196, I-1197 und I-1198.

15. Verfahren zum Selektieren einer Lactobacillus-bulgaricus- Mutante, bei dem man

- ein Screening eines L.bulgaricus-Mutterstammes auf einer X-gal Platte durchführt, um Kolonien zu isolieren, die eine β-Galactosidasemangelmutation zeigen,

- die mutanten Kolonien einem Stabilitätstest in einem Medium unterzieht, das Lactose als einzige Energiequelle enthält,

- die Chromosomen-DNA der stabilen Mutanten enzymatisch mit Hilfe von Restriktionsenzymen abbaut und einen Nachweistest auf Fragmente durchführt, die einen Bereich umfassen, der das β-Galactosidasegen aufweist, und

- eine Mutante auswählt, die eine DNA aufweist, bei der ein Fragment fehlt, das wenigstens einen Teil des β-Galactosidasegens umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem man eine Mutante selektiert, die eine DNA aufweist, bei der das fehlende Fragment wenigstens einen Teil des β-Galactosidasegens umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem man eine Mutante selektiert, die eine DNA aufweist, deren fehlendes Fragment wenigstens einen Teil des β-Galactosidasegens umfaßt und sich wenigstens stromab von diesem Gen über wenigstens 1,0 kb erstreckt.