DE69107783T2

DE69107783T2 - Verfahren zur Zubereitung eines Aroma-Produkts, das Alpha-Acetomilchsäure enthält.

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Publication number: DE69107783T2
Application number: DE69107783T
Authority: DE
Inventors: Sing Boen Tjan; Schie Bartholomeus Josef Van; Walter Maurits M Verhue; Cornelis Theodorus Verrips
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1990-08-13
Filing date: 1991-08-09
Publication date: 1995-06-29
Anticipated expiration: 2011-08-10
Also published as: CA2048977A1; CA2048977C; EP0483888A3; EP0483888A2; DE69107783D1; AU8174191A; ATE118986T1; AU646681B2; EP0483888B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verfahren zur Herstellung eines Aromaprodukts, das eine hohe Konzentration an α-Acetomilchsäure enthält, dadurch daß mindestens ein Nahrungsmittelbestandteil einer Milchsäurebakterienmasse unterworfen wird.
Diacetyl ist ein wichtiger Aromastoff für Molkereiprodukte, wie Hüttenkäse, Butter und Buttermilch. Auch in Joghurt werden kleine Mengen an Diacetyl benötigt, um ein ausgeglichenes Aroma zu erreichen. Diacetyl ist auch für Margarinen und Aufstriche mit niedrigem Fettgehalt im allgemeinen und für Backprodukte ein wichtiger Aromastoff. Bei der Herstellung der letzteren ist es vorteilhaft, den Diacetyl-Vorläufer α- Acetomilchsäure anstelle von Diacetyl selbst beizufügen, weil Diacetyl während des Back- oder Bratvorgangs aus dem Vorläufer gebildet wird. Der Zusatz von α-Acetomilchsäure anstelle von Diacetyl zu Nahrungsmitteln hat den zusätzlichen Vorteil, daß α-Acetomilchsäure wesentlich weniger flüchtig ist als Diacetyl, und somit der aromatisierende Effekt länger aufrechterhalten werden kann, vorausgesetzt, daß die α- Acetomilchsäure stabil gehalten werden kann.
Die Molkereiindustrie verwendet hauptsächlich zwei Spezies von Milchsäurebakterien, um Diacetyl in ihren Produkten zu erhalten. Diese sind Leuconostoc cremoris und besonders Lactococcus lactis subspezies lactis biovar. diacetilactis (im folgenden auch als L. diacetilactis) abgekürzt. Die Biosynthese von Diacetyl durch die letztere Spezies ist im Detail studiert worden. Man stimmt allgemein überein, daß Zitronensäure, die in Milch zu etwa 0,15% (Gew./Vol.) vorhanden ist, der Milchbestandteil ist, aus dem Diacetyl hergestellt wird. Brenztraubensäure kann jedoch ebenfalls als der Vorläufer dienen (T. M. Cogan, J. Diary Research 51 (1984) 597). Von dortan divergieren die Meinungen bezüglich des exakten Wegs, auf welchem Diacetyl hergestellt wird. Zwei Wege zur Herstellung von Diacetyl sind beschrieben worden; diese Wege sind in Figur 1 illustriert. Der erste Weg bringt die Vereinigung von Acetaldehyd-TPP und Acetyl-CoA unmittelbar zu Diacetyl mit sich. Der zweite Weg betrifft die Bildung des Diacetyl-Vorläufers α-Acetomilchsäure durch Vereinigung von Brenztraubensäure und Acetaldehyd-TPP. Der Diacetyl-Vorläufer kann nachträglich durch oxidative Decarboxvlierung, die durch physikalische Mittel, wie Erwärmen oder Rühren in der Gegenwart von Luft oder Sauerstoff, vorzugsweise bei niedrigem pH, erreicht werden kann, in Diacetyl überführt werden.
Eine besondere Kultur wird in der Literatur (H.A. Veringa et al., Milchwissenschaft 31 (1976) 658) beschrieben, die fähig ist, eine relativ hohe Konzentration an Diacetyl/α- Acetomilchsäure herzustellen. Wir haben diese Kultur (die mehrere Stämme enthält) untersucht und Stämme ausgewählt, und wir bestimmten die Enzymaktivitäten dieser Stämme, die mit der α-Acetomilchsäureproduktion zusammenhängen. Wir fanden, daß die Konzentration des Enzyms α-Acetolactat-Decarboxylase in einem isolierten L. diacetilactis-stamm aus einer von Veringa et al. beschriebenen Kultur, welches für die Decarboxylierung von α-Acetomilchsäure zu Acetoin verantwortlich ist, geringer ist als in anderen Stämmen von L. diacetilactis, wodurch höhere Konzentrationen an α-Acetomilchsäure aufgebaut werden. Höchstwahrscheinlich gilt dies auch für andere ertragreiche Stämme. Ein zur Herstellung hoher Mengen von α-Acetomilchsäure fähiger Stamm, der aus der kommerziell erhältlichen Flora- Danica-IBA-Kultur des "Christian Hansen Laboratorium", Dänemark, isoliert wurde und dem der Name SD803 gegeben wurde, wurde in eine Kultur einverleibt, die dazu verwendet wurde, ein Fermentations/Sprühtrocknungsverfahren zu entwickeln, in dem das sprühgetrocknete Pulver α-Acetomilchsäure enthält. Einer der anderen Stämme wurde von McKay erhalten und in L.L. McKay & K.A. Baldwin, J. Dairy Sci. 57 (1974) 181, beschrieben und ist ein Mutant, der seine Fähigkeit, Brenztraubensäure in Milchsäure umzuwandeln, verloren hat. Diese Umwandlung und anschließende Sekretion von Milchsäure ist vom energetischen Standpunkt essentiell für den Organismus. Beruhend auf früheren Arbeiten hatten wir erwartet, daß dieser Mutant eine höhere Menge an α-Acetomilchsäure produzieren würde, wenn er auf einer geeigneten Kohlenstoffquelle gezüchtet wird, weil die alternative Route, Brenztraubensäure umzuwandeln, blockiert ist. Tatsächlich fanden wir eine erhöhte Konzentration an intrazellulärer Brenztraubensäure. Dies führte jedoch nicht zu einer erhöhten Produktion von α- Acetomilchsäure. Stattdessen wurde eine erhöhte Konzentration an Ethanol gefunden.
Eine Aromazusammensetzung, die α-Acetomilchsäure und Diacetyl enthält, ist in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 247 646 beschrieben. Die Zusammensetzung kann 0,05% oder mehr α- Acetomilchsäure enthalten. Sie kann durch Fermentation eines pasteurisierten oder sterilisierten Milchprodukts mit einer ausgewählten Streptococcus diacetilactis enthaltenden Kultur hergestellt werden, die nun als Lactococcus lactis subspezies lactis biovar. diacetilactis bekannt ist, hergestellt werden, wobei Maßnahmen ergriffen werden, die Umwandlung von α- Acetomilchsäure in Diacetyl herabzusetzen. Solche Maßnahmen sind pH-Regulation, Verwendung eines Milchprodukts als Fermentationsmedium und Zusatz von Zitronensäure, Oxalessigsäure und/oder Brenztraubensäure. Dieses Dokument beschreibt somit ein Verfahren zur Herstellung einer Trockenaromazusammensetzung, die α-Acetomilchsäure enthält, aber der Gehalt des Produkts an α-Acetomilchsäure ist noch ziemlich niedrig. Infolgedessen kann ihr Einsatz einer derartigen Aromazusammensetzung die Zugabe einer derart großen Menge der Trockenaromakomponente erfordern, daß sein Einsatz für einige Produkte zu teuer wird oder daß das Trägermaterial, das in dieser Zusammensetzung vorhanden ist, die Funktionalität solcher Produkte beeintrachtigt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Aromaprodukts, das eine hohe Konzentration an α- Acetomilchsäure enthält, bereit, indem mindestens ein Nahrungsmittelbestandteil einer Milchsäurebakterienmasse unterworfen wird, welches umfaßt, daß eine hinreichende Menge dieses mindestens einen Nahrungsmittelbestandteils Milchsäurebakterien, welche sich nicht mehr in ihrer logarithmischen Wachstumsphase befinden, oder einem Zellextrakt oder einem Zell-Lysat von Milchsäurebakterien unterworfen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Milchsäurebakterien von ihren Kulturmedium abgetrennt worden.
Einem weiteren Aspekt der Erfindung zufolge wird der Nahrungsmittelbestandteil aus der Gruppe, bestehend aus Zitronensäure, Milchsäure und Brenztraubensäure und Mischungen davon, ausgewählt. Wenn Brenztraubensäure eingesetzt wird, wird letztere vorzugsweise aus einer Kultur mindestens eines Bakteriums der Gattung Propionibacteriuin, vorzugsweise der Spezies Propionibacterium freudenreichii erhalten. Vorzugsweise wird ein Medium verwendet, welches dadurch erhältlich ist, daß man mindestens ein Bakterium der Gattung Propionibacterium in einem anaeroben Nährmedium zur Herstellung von Biomasse kultiviert und anschließend die Kultur aerob in einem Milchsäure enthaltenden Medium fortführt, bis eine Brenztraubensäure-Konzentration von mindestens 3 g/l, vorzugsweise von mindestens 5 g/l und besonders vorteilhaft mindestens 10 g/l, erreicht ist.
Einem weiteren Aspect der Erfindung zufolge werden die Milchsäurebakterien aus der Gruppe, bestehend aus den Gattungen Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc und Pediococcus, ausgewählt, vorzugsweise aus den Spezien Liactococcus lactis, besonders vorteilhaft aus Lactococcus lactis subspecies lactis. Besonders bevorzugt ist der Einsatz eines Bakteriums von Lactococcus lactis subspecies lactis biovar. diacetilactis, besonders Lactococcus lactis subspecies lactis biovar. diacetilactis Stamm SD803.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Aromaprodukt, das α-Acetomilchsäure neben weiteren Nahrungsmittel-Fermentationsprodukten enthält und das mindestens 0,1 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 0,2 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 0,4 Gew.-%, α-Acetomilchsäure umfaßt. Vorzugsweise ist das Aromaprodukt trocken und umfaßt mindestens 0,2 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 1 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 2 Gew.-%, α-Acetomilchsäure.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft aromatisierte Nahrungsmittel, die ein derartiges Aromaprodukt oder ein Aromaprodukt, das, wie oben beschrieben gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde, umfassen, und ein Verfahren zur Herstellung derartiger aromatisierter Nahrungsmittel, in dem das Aromaprodukt mit vorgetrockneten Nahrungsmitteln, z.B. Trockenmolke, Magermilchpulver, Weizenmehl oder einem Polysaccharid vermischt wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neues und verbessertes Verfahren zur Herstellung des Diacetyl-Vorläufers α-Acetomilchsäure in hohen Konzentrationen und nahezu reiner Form bereitgestellt.
Das Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Aromaprodukts umfaßt, daß ein Nahrungsmittelbestandteil Milchsäurebakterien unterworfen wird, die sich nicht mehr in ihrer logarithmischen Wachtumsphase befinden.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß die Herstellung von α-Acetomilchsäure nicht auf bestimmte ausgewählte Stämme von L. diacetilactis beschränkt ist, sondern daß dieses Produkt durch die Spezies im allgemeinen erhalten werden kann. Ferner können andere Milchsäurebakterien, z.B. Lactococcus lactis subspecies lactis, Lactococcus lactis subspecies cremoris, Lactobacillus casei, Leuconostoc creinoris etc. verwendet werden, um das gleiche Produkt zu erhalten.
Man hat gefunden, daß die Behandlung eines Nahrungsmittelbestandteils mit Bakterien, die sich nicht mehr in ihrer logarithmischen Wachstumsphase befinden, einen höheren Gehalt an α-Acetomilchsäure zur Folge hat als die Behandlung einer aktiv heranwachsenden Kultur dieser Bakterien. Milchsäurebakterien, die sich nicht mehr in ihrer logarithmischen Wachstumsphase befinden, d.h. die die stationäre Phase erreicht haben, sind Bakterien, welche sich in einem Stadium befinden, in dem die Umwandlung von Brenztraubensäure zu Milchsäure und der anschließende Austritt von Milchsäure aus dem Cytoplasma in das Medium nicht mehr ausreicht, genügend Energie zum Zellwachstum zu erzeugen, und auch nicht mehr ausreicht, NADH zu regenerieren. Die Bakterien, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, befinden sich in der stationären Phase, nachdem sie in einem geeigneten Medium vorkultiviert worden sind, um eine gewünschte Biomasse zu erhalten.
Vorzugsweise sind die Milchsäurebakterien von ihrem Kulturmedium abgetrennt worden. Abtrennung der Bakterien oder der Bakterienmasse vom Kulturmedium kann neben anderen Methoden durch Zentrifugation oder (Membran)Filtration und nachfolgendes Waschen der Bakterien mit einer wäßrigen Flüssigkeit erreicht werden. Einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens zufolge werden Zell- Lysate oder zellfreie Extrakte anstelle der ganzen lebenden Zellen verwendet, um das Substrat in Produkt umzuwandeln.
Unter Zell-Lysaten wird das Produkt verstanden, das nach Zerstörung der Bakterienzellen durch eine beliebige geeignete physikalische Methode, z.B. Homogenisierung, erhalten wird. Ein zellfreier Extrakt wird durch Entfernung aller partikulärer Bestandteile aus einem Lysat, z.B. durch Zentrifugation, mit dem Zweck erhalten, nur die löslichen Zellbestandteile zu erhalten.
Der Einsatz von Zell-Lysaten oder zellfreien Extrakten anstelle der ganzen Zellen ist aus zwei Gründen bevorzugt: 1) Die Geschwindigkeit der Umwandlung des Substrats in Produkt ist wesentlich höher, höchstwahrscheinlich, weil die Permeabilität der Zellmembranen für die relevanten Substrate geschwindigkeitsbegrenzend ist; 2) die Umwandlung von Brenztraubensäure in α-Acetomilchsäure verläuft nahezu quantitativ, was mit lebenden Zellen nicht erreicht werden kann.
Ein Nahrungsmittelbestandteil soll so aufgefaßt werden, daß er jeden beliebigen Bestandteil von Lebensmitteln, z.B. Magermilch, Quark oder Molke, oder aus derartigen Materialien durch die Wirkung von Milchsäurebakterien hergestellte Bestandteile einschließt. Weitere Nahrungsmittel oder Abkömmlinge davon, z.B. Fleisch- oder Pflanzenextrakte, können ebenfalls eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß sie ein oder mehrere Substrate enthalten, die zur Herstellung von α-Acetomilchsäure erforderlich sind. Der Nahrungsmittelbestandteil ist vorzugsweise von einem Milchprodukt abgeleitet und umfaßt Inhaltsstoffe, die im Stoffwechselschema, wie es in Figur 1 abgebildet ist, vorkommen. Diese Inhaltsstoffe schließen Zitronensäure, Milchsäure und Brenztraubensäure ein. Besonders bevorzugt ist der Nahrungsmittelbestandteil Brenztraubensäure, wahlweise zusammen mit Milchsäure und/oder Zitronensäure. In der Technik sind die Begriffe "Brenztraubensäure" und "Pyruvat" gewöhnlich austauschbar. Welche Verbindung in einem bestimmten Produkt vorliegt, hängt vom pH-Wert ab. Daher sollen die organischen Säuren, die in der vorliegenden Anmeldung erwähnt werden, einschließlich Brenztraubensäure, Milchsäure, Zitronensäure und α-Acetomilchsäure, so verstanden werden, daß sie sowohl die freien Säuren als auch ihre ernährungsmäßig zulässigen Salze, z.B. die Natrium- und Kaliumsalze, einschließen. Wenn der Begriff Pyruvat etc. verwendet wird, bedeutet er nicht notwendigerweise das Salz, sondern kann auch für die entsprechende Säure stehen.
Es ist ferner gefunden worden, daß Brenztraubensäure, ein bevorzugtes Substrat für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von α-Acetomilchsäure, in einem verbesserten Fermentationsverfahren hergestellt werden kann, wobei ein Bakterium der Gattung Propionibacterium (eine Übersicht über die Gattung Propionibacteriuin findet sich in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 1986, Seite 1346) verwendet wird. Vorzugsweise ist der Organismus von der Spezies Propionibacterium freudenreichii und besonders von der Subspezies shermani.
Eine Brenztraubensäurelösung kann hergestellt werden, indem man mindestens einen Vertreter der Gattung Propionibacterium unter aneroben Bedingungen in einem Nährmedium, z.B. Molke oder angereicherter Molke, die Lactose als Substrat enthält, kultiviert, um ausreichend Biomasse, vorzugsweise Biomasse mit einer optischen Dichte von mindestens 5 bei 660 nm, herzustellen, und die Kultur aerob mit Milchsäure als Substrat fortsetzt, bis eine ausreichend hohe Brenztraubensäurekonzentration erreicht ist. Die aerobe Fermentation kann auch unter Kreislaufführung der Zellen durchgeführt werden, wobei kontinuierlich das verbrauchte Medium entfernt und frisches Medium nachgefüllt wird. Dieses Verfahren ergab ein Medium, das für den Einsatz in einem erf indungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von α-Acetomilchsäure geeignet ist, wobei das Medium mindestens 3 g/l, vorzugsweise mindestens 5 g/l, besonders bevorzugt mindestens 10 g/l, Brenztraubensäure enthält.
Im Prinzip kann das erfindungsgemäße Verfahen zur Herstellung von α-Acetomilchsäure unter Einsatz aller möglichen Milchsäurebakterien oder deren Lysate oder zellfreien Extrakte durchgeführt werden. Die Milchsäurebakterien können aus den Gattungen Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc und Pediococcus ausgewählt werden. Vorzugsweise wird eine Spezies aus der Gattung Lactococcus oder Leuconostoc verwendet. Besonders bevorzugt ist die ausgewählte Spezies eine Lactococcus-Spezies, insbesondere die Spezies Lactococcus lactis, wovon vorzugsweise Lactococcus lactis subspecies lactis verwendet wird, und besonders bevorzugt die biovar. diacetilactis davon.
Unter Lactococcus lactis subspecies lactis biovar. diacetilactis sollen alle taxonomischen Klassen, z.B. Lactococcus lactis subspecies diacetilactis, Lactococcus diacetilactis und Streptococcus diacetilactis, verstanden werden.
Besonders brauchbare Ergebnisse werden beim Einsatz des Lactococcus lactis subspecies lactis biovar. diacetilactis Stamms SD803 erzielt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann durchgeführt werden, indem eine praktisch homogene Mischung von Nahrungsmittelbestandteilen, Milchsäurebakterienmasse und Medium verwendet wird. Manchmal ist es jedoch bevorzugt, besonders für eine kontinuierliche Verfahrensweise, eine immobilisierte Bakterienmasse zu verwenden. Der zellfreie Extrakt oder das Lysat der Milchsäurebakterien kann z.B. auf einen festen Träger aufgesetzt werden. Das bedeutet, daß die Bakterienmasse auf einer geeigneten Matrix immobilisiert oder in eine geeignete Matrix, z.B. Alginate, eingeschlossen, oder in einer geeigneten Vorrichtung eingeschlossen wird, z. B. einen Hohlfaserreaktor. Eine weitere brauchbare Ausführungsform ist der Einsatz einer verdichteten Schicht eines Bakterienlysats, wohingegen es ebenfalls vorteilhaft sein kann, ein Doppelmembransystem einzusetzen, in dem die Membranen sowohl für die Substrat- als auch für die Produktmoleküle, z. B. Brenztraubensäure, Zitronensäure und α-Acetomilchsäure, durchlässig und undurchlässig für die Bakterienfragmente sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt eine Mischung, die eine hohe Konzentration an α-Acetomilchsäure enthält. Die Konzentration an α-Acetomilchsäure ist wesentlich höher als die Konzentration, welche durch Einsatz des Verfahrens laut EP-A-0 247 646 erreicht werden kann: Die höchste offenbarte Konzentration im Fermentationsprodukt ist 575 mg/kg (sh. Beispiel VIII), wohingegen die höchste offenbarte Konzentration im getrockneten Produkt 1280 mg/kg beträgt (sh. Beispiel III).
Der α-Acetomilchsäuregehalt in einem Fermentationsprodukt, das in einem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, kann mindestens 0,1 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 0,2 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 0,4 Gew.-%, vor dem Trocknen betragen. Vorzugsweise wird das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens anschließend getrocknet, z.B. durch Gefriertrocknung oder Sprühtrocknung, vorzugsweise unter Einsatz gemäßigter Temperaturen. Ein derartiges getrocknetes Produkt kann mindestens 0,2 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 1 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 2 Gew.-%, α-Acetomilchsäure enthalten.
Die Erfindung betrifft auch Aromaprodukte, die neben weiteren Nahrungsmittel-Fermentationsprodukten mindestens 0,4 Gew.-% α- Acetomilchsäure und insbesondere mindestens 2 Gew.-% α- Acetomilchsäure nach dem Trocknen enthalten.
Das Produkt α-Acetomilchsäure, welches in nahezu reiner Form durch die Anwendung des Verfahrens dieser Erfindung erhalten wird, kann entweder als Lösung oder als getrocknetes Pulver eingesetzt werden, oder es kann, um alle Arten von Produkten zu aromatisieren, auf andere trockene Zutaten unter solchen Bedingungen aufgesprüht werden, daß der Verlust an α-Acetomilchsäure minimiert wird.
Die Erfindung schließt aromatisierte Nahrungsmittel mit ein.
Derartige aromatisierte Nahrungsmittel werden vorzugsweise dadurch hergestellt, daß dasα-acetomilchsäurehaltige Aromaprodukt dem vorgetrockneten Nahrungsmittel, z.B. Molkepulver, Magermilchpulver, Weizenmehl oder Polysacchariden, zugesetzt wird. Die α-Acetomilchsäure, die in derartig aromatisierten Nahrungsmittel enthalten ist, ist überraschend stabil, und diese Nahrungsmittel können zu Fertigprodukten weiter verarbeitet werden, in denen Diacetyl ein erwünschtes Aroma bildet. Fertigprodukte, die erfindungsgemäß aromatisiert werden können, umfassen einen weiten Bereich von Nahrungsmitteln, z.B. Butter, Buttersubstitute und andere Aufstriche, Backmaterialien, z.B. Kuchenmischungen, Mehl, Backfette etc. Vorzugsweise wird das α-acetomilchsäurehaltige Aromaprodukt in einer derartigen Menge eingesetzt, daß das aromatisierte Nahrungsmittel eine Konzentration an α-Acetomilchsäure zwischen ca. 1 und ca. 100 mg/kg aufweist.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele illustriert.

Beispiel 1

L. diacetilactis Stamm SD803 wurde in M17-Brühe, welche 1% (Gew./Vol.) Lactose enthielt und mit 0,2% (Gew./Vol.) Zitronensäure ergänzt war, kultiviert. Nachdem 18 Stunden lang bei 20ºC kultiviert wurde, wurden die Zellen durch 15minütige Zentrifugation bei 7000 U/min geerntet. Anschließend wurden die Zellen einmal mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in Phosphatpuffer (0,002 Mol/l) bei einem pH-Wert von 7,0 bis zu einer optischen Dichte von 12,0 bei 610 nm aufgenommen. Die Zellen wurden lysiert, indem 5 g der Zellsuspension zusammen mit 3 g säure-gewaschener Glaskügelchen (< 150 Micron) mittels Ultraschall 6 x 1 Minute lang mit zwischenzeitlichem 0,5 minütigen Abkühlen homogenisiert wurden. Es wurde entweder das vollständige Lysat oder das Lysat, das mittels Zentrifugation geklärt worden war, dazu verwendet, 3-¹³C-Pyruvat umzusetzen, welches in einem Reaktionsvolumen von 1 ml enthalten war.
Folgende Reaktionsmischung wurde verwendet:
Thiaminpyrophosphat (300 ug/ml) 300 ul (= 0,25 mMol/l)
Phosphatpuffer (0,2 Mol/l, pH 6,5) 300 ul (=0,06 Mol/l)
MgSO&sub4; (0,15 mMol/l) 10 ul
Extrakt 150 ul
D&sub2;O 100 ul
3-¹³C-Pyruvat (100 ug/ml) 40 ul (=0,036 Mol/l)
H&sub2;O 110 ul
insgesamt 1000 ul
Das 3-¹³C-Pyruvat wurde verwendet, um die Quantifizierung der Reaktionsprodukte (durch ¹³C-NMR) zu erleichtern und hat keine besondere Eigenschaft im Umwandlungsvorgang. Der Proteingehalt von entweder Lysat oder Extrakt wurde im Experiment auf 0,9 mg Protein/ml normiert.
Wie in Figur 2 gezeigt, wurden ca. 30 uMol Pyruvat (83% der zugesetzten Menge Pyruvat) innerhalb 80 Minuten verbraucht und ausschließlich in α-Acetomilchsäure (15 uMol) umgewandelt. Das entspricht 0,21 mMol pro Gramm Protein pro Minute. Bis 3,5 Stunden nach der Inkubation wurde kein Acetoin gefunden.
Das Experiment wurde wiederholt, wobei die Stämme SDC6, NMU71 bzw. DRC3 verwendet, und folgende Ergebnisse erhalten wurden:
Stamm SDC6: Bis 50 Minuten Inkubation wurde das umgewandelte Pyruvat vollständig als α-Acetomilchsäure gefunden. Anschließend nahm die α-Acetomilchsäure ab und Acetoin zu.
Stämme NMU71 und DRC: Wie bei SDC6, geringfügig schnellere Abnahme von α-Acetomilchsäure und Zunahme von Acetoin. Zum Vergleich ergab ein Fermentationsverfahren (wobei ganze Zellen anstelle eines Lysats, der Stamm SD803 und eine identische Konzentration an Pyruvat verwendet wurden) ca. 7 uMol α- Acetomilchsäure nach 2 Stunden. Das entspricht 0,06 mMol pro Gramm Protein pro Minute, wobei die Differenz Milchsäure ist.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 beschriebene Experiment wurde wiederholt, wobei nun anstelle von SD803 L. diacetilactis Stamm DRC3 verwendet wurde. Sowohl das Zell-Lysat als auch der zellfreie Extrakt wurden verwendet. Wie in den Figuren 3A und 3B gezeigt, wurden bei Verwendung des Extrakts innerhalb 60 Minuten etwa 29 uMol und bei Verwendung des Lysats innerhalb 20 Minuten etwa 30 uMol Pyruvat in α-Acetomilchsaure umgewandelt. Zu diesen Zeitpunkten waren noch keine anderen Produkte gebildet. Bei der Fortführung des Experiments begann die Acetoin-Bildung auf Kosten der α-Acetomilchsäure. In einem Vergleich-Fermentationsverfahren unter Verwendung des gleichen Stamms und einer identischen Pyruvat-Konzentration wurde überhaupt keine α-Acetomilchsäure gebildet. Als Reaktionsprodukte konnten nur Milchsäure und Acetoin nachgewiesen werden.

Beispiel 3

Das in Beispiel 1 beschriebene Experiment wurde wiederholt, wobei nun anstelle von L. diacetilactis ein Stamm von L. lactis subspecies cremoris verwendet wurde.
Wie in Figur 4 gezeigt, wurden innerhalb 30 Minuten etwa 27 uMol Pyruvat hauptsächlich in α-Acetomilchsäure umgewandelt. Zu diesem Zeitpunkt begann die Acetoin-Bildung auf Kosten von α-Acetomilchsäure
In einem Vergleichs-Fermentationsverfahren unter Einsatz des gleichen Stamms und einer identischen Pyruvatkonzentration wurde überhaupt keine α-Acetomilchsäure gebildet. Als Reaktionsprodukt konnte nur Milchsäure nachgewiesen werden.

Beispiel 4

L. Diacetilactis Stamm SD803 wurde in M17-Medium kultiviert, das 1% (Gew./Vol.) Lactose und 0,2% (Gew./Vol.) Zitronensäure enthielt, 7 Stunden lang bei 30ºC kultiviert. Daraufhin wurde soviel 3-¹³C-Pyruvat zugesetzt, daß die Konzentration 45 mMol/l betrug, und die Kultiviertung wurde weitere 3 Stunden fortgesetzt. Mittels ¹³C-NMR wurde eine Konzentration von 7 mMol/l α-Acetomilchsäure gefunden, d. h. eine Ausbeute von etwa 15%.

Beispiel 5

L. diacetilactis Stamm SD803 wurde in M17-Brühe, die 1% (Gew./Vol.) Lactose und 0,2% (Gew./Vol.) Zitronensäure enthielt, 7 Stunden lang bei 30ºC kultiviert. Daraufhin wurde soviel 2,4-¹³C-Citrat zugefügt, daß die Konzentration 20 mMol/l betrug, und die Kultivierung wurde weitere 3 Stunden fortgesetzt. Mittels ¹³C-NMR wurde eine Konzentration von 5 mMol/l α-Acetomilchsäure gefunden, d. h. eine Ausbeute von etwa 50%.
Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Verwendung von Milch anstelle der M17-Brühe erhalten.

Beispiel 6

1. Herstellung eines Zellhomogenisats.

7,5 l einer Kultur von L. diacetilactis wurden 150 l eines Mediums, welches 3 kg Molkepulver, 3 kg Lactose, 1,1 kg Hefeextrakt und 0,15 kg Natriumcitrat enthielt, zugesetzt. Der pH-Wert des Mediums betrug 6,3. Die Kultur wurde dann während 18 Stunden bei 30ºC herangezogen. Der Zellen-Titer betrug danach 1,5 x 10&sup9; pro ml. Die Biomasse wurde mittels einer Tellerzentrifuge des Typs Westfalia SA-1 auf 5 l konzentriert. Der Zellen-Titer betrug danach 4 x 10¹&sup0; pro ml.
Die Biomasse wurde durch vier Durchläufe durch einen APV Gaulin 30 CD Homogenisator bei 800 Bar aufgeschlossen. Die Zahl lebensfähiger Zellen nach dieser Behandlung betrug 8 x 10&sup9; pro ml, was 20% der Zahl der lebensfähigen Zellen vor der Homogenisierung entspricht. Das Homogenisat wurde bei -20ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt.

2. Herstellung von Pyruvat.

100 l eines Mediums, das 3 kg Molkepulver, 2 kg Natriumlactat, 1 kg Hefeextrakt, 0,5 g MnSO&sub4;, 0,66 kg KH&sub2;PO&sub4; und 0,31 kg K&sub2;HPO&sub4; bei einem pH-Wert von 6,4 enthielt, wurden mit 1 l einer Kultur von Propionibacterium freudenreichii subspecies shermani angeimpft. Das Wachstum ging anaerob (Stickstoff im Luftraum des Fermentes) bei 30ºC während 48 Stunden vonstatten. Zu diesem Zeitpunkt war eine OD&sub6;&sub1;&sub0; von 8,0 erreicht, und die wurde Kultur in eine aerobe Phase überführt, indem feinblasig belüftet, und ein Potential an gelöstem Sauerstoff von mindestens 20% der Sauerstoffsättigungskonzentration in der Flüssigkeit beibehalten wurde. Zur gleichen Zeit wurde eine kontinuierliche Zuspeisung von konzentrierter Natriumlactatlösung mit einer Geschwindigkeit von 5 g/l Kulturmedium pro Stunde vorgenommen. Diese Phase dauerte 20 Stunden (Zugabe von 100 g Lactat pro Liter).
Die Biomasse wurde mittels einer Tellerzentrifuge abzentrifugiert. Die Pyruvatkonzentration im Überstand betrug laut HPLC-Bestimmung 22 g/l. Er wurde bei -20ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt.

3. Herstellung von α-Acetomilchsäure.

Zu 40 l einer Pyruvatlösung wurden zugegeben: 4 l eines Zellhomogenisats, 108,4 g MgSO&sub4;.7H&sub2;O (Endkonzentration 10 mMol/l) und 4,1 g Cocarboxylase (Thiaminpyrophosphat, Endkonzentration 0,2 mMol/l). die Reaktion ging bei 30ºC während 3 Stunden vonstatten. Die Reaktionsmischung wurde auf 5ºC abgekühlt und analysiert.

4. Analyse.

Die Analyse der Bestandteile der Reaktionsmischung wurde mittels zweier Methoden durchgeführt: HPLC und ¹³C-NMR. Die folgenden Bestandteile wurden mittels HPLC bestimmt: Brenztraubensäure, Milchsäure, Essigsäure, Propionsäure. Acetoin und α-Acetomilchsäure wurden mittels ¹³C-NMR bestimmt. Es versteht sich, daß man mittels ¹³C-NMR nur die molaren Proportionen der Bestandteile bestimmen kann, nicht deren absolute Konzentrationen. Um absolute Konzentrationen zu erhalten, muß ein Bezug zu einer absoluten Konzentration einer Referenzverbindung, die mittels HPLC bestimmt worden ist, hergestellt werden. Die Konzentration von Propionsäure wurde als die Bezugsgröße verwendet. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: mMol/l g/l Brenztraubensäure Milchsäure Essigsäure Propionsäure Acetoin α-Acetomilchsäure
Weil die Ausgangskonzentration von Brenztraubensäure 25 mMol/l (22 g/l) betrug und 2 Mol Brenztraubensäure erforderlich sind, um 1 Mol α-Acetomilchsäure herzustellen, betrug die Ausbeute an α-Acetomilchsäure 32,4%.

Beispiel 7

Herstellung von Brenztraubensäure, die als Substrat für die Herstellung von α-Acetomilchsäure geeignet ist.
Das folgende Beispiel wurde sowohl mit einem Stamm von Propionibacterium freudenreichii (ATCC 9617) und mit einem Stamm von Propionibacteriuin freudenreichii subspecies shermani (VBCPr 02-01) durchgeführt.
Aus einer Stichkultur wurde eine Impfkultur hergestellt, indem der Mikroorganismus in einem verschlossenen 250 ml-Kolben ohne Bewegung vier Tage lang bei 30ºC (Wasserbad) unter anaeroben Bedingungen kultiviert wurde. Das Kulturmedium für diese Wachstumsphase war MRS-Brühe (250 ml) von Merck, Darmstadt BRD. Die Hauptkultur wurde gestartet, indem die 4 Tage- Impfkultur in einen 15 Liter-Fermenter (von Applicon, Schiedam, NL) mit einem Arbeitsvolumen von 10 l geimpft wurde, wobei unter anaeroben Bedingungen bei 300 U/min gerührt wurde. Während dieser anaeroben Phase wurde das Kulturmedium mit 0,5 l/min Stickstoff feinblasig belüftet. Das Kulturmedium war wie folgt:
MnSO&sub4; 0, 05 g/l
MgSO&sub4; 0,1 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 2,0 g/l
Hefeextrakt (PTK) 10 g/l (von Ohly, BRD)
Trypticase-Pepton 10 g/l (von Hy-cas, USA)
Glucose 30 g/l (von Avebe, Veendam, NL)
Der pH-Wert des Kulturmediums wurde vor der Sterilisation (durch Zugabe von Phosphorsäure, 85%, von Merck, Darmstadt, BRD) auf 4,0 abgesenkt um eine Maillard-Reaktion während der Sterilisation zu vermeiden. Nach der Sterilisation des Kulturmediums wurden 1,0 ml/l "Egli"-Mikro-Nährstoffe und 1,5 ml/l "MEM"-Vitaminlösung (von Sigma) zugesetzt. Die Zusammen-Setzung der "Egli"-Lösung war wie folgt:
Egli-Mikro-Nährstofflösung:
Destilliertes Wasser 1000 ml Ammoniumchlorid 7,63 g
KH&sub2;PO&sub4; 2,81 g MgSO&sub4;.7H O 0,59 g
und 10 ml einer Mikronährstofflösung, die aus einer wässrigen Lösung mit folgenden Inhaltstoffen bestand:
CaCl&sub2; 5,50 g/l FeSO&sub4; 3,75 g/l
MnSO&sub4; 1,40 g/l ZnSO&sub4; 2,20 g/l
CuSO&sub4; 0,40 g/l CoCl&sub2; 0,45 g/l
NaMoO4 0,26 g/l H&sub3;BO&sub4; 0,40 g/l
KI 0,26 g/l Na-EDTA 30,0 g/l
Die Kultur wurde chargenweise 42 Stunden lang bei 30ºC im Fermenter unter anaeroben Bedingung wachsen lassen. Der pH- Wert wurde durch automatisierte Zugabe von Natriumhydroxidlösung (4 Mol/l) bei 6,5 gehalten.
Die Analyse ergab, daß während der anaeroben Fermentation Propionsäure und Essigsäure die Hauptstoffwechselprodukte waren. Eine kleine Menge Bernsteinsäure wurde hergestellt.
Nach 42 Stunden wurden Parallelversuche mit und ohne Wechsel auf aerobe Bedingungen durchgeführt.
Unter anaeroben Bedingungen wurde die Stickstoffbelüftung fortgesetzt. Zur Erzielung aerober Bedingungen wurde die Belüftung mit Stickstoff abgebrochen. Aerobe Bedingungen wurden durch feinblasige Belüftung mit Luft (0,5-2,0 l/min) aufrechterhalten, und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 700- 1000 U/min erhöht.
Während der anschließenden Fermentation wurden dem Kulturmedium zu drei Zeitpunkten 300 ml Natriumlactatlösung zugesetzt (Natriumlactat 60%ig, von CCA biochem, Gorinchem, NL).
Während der aeroben Fermentation war das Hauptstoffwechselprodukt Brenztraubensäure. Es wurden wenig oder keine Propionsäure oder Essigsäure gebildet. Die Konzentrationen der Mediumbestandteile für den ATCC Stamm sind in Figur 5 gezeigt und in der folgenden Tabelle aufgeführt. Tabelle Ergebnisse der analysierten Proben von P. freudenreichii Aerobe und anaerobe Fermentation (sh. Figur 5) anaerob aerob Zeit (h) Essigsäure (g/l) Propionsäure (g/l) Bernsteinsäure (g/l) Brenztraubensäure (g/l)
Die Brenztraubensäurekonzentration wurde mittels HPLC bestimmt (Bio-Rad, Modell 1755, mit HPX 87 H Animex Säule). Die HPLC- Proben wurden durch einen Millipore-Mikrofilter (0,45 um) gepreßt, um die Biomasse vollständig zu entfernen, und das Filtrat wurde mit HPLC-Eluierungsmittel (0,005 molare H&sub2;SO&sub4;) 20fach verdünnt. Brenztraubensäure hat eine Retentionszeit von 9,8 Minuten, wodurch sie unterscheidbar von Glucose (8,9 Minuten) und Bernsteinsäure (11,7) ist. Die übrigen Bestandteile wurden mittels ähnlicher Methoden bestimmt.
Beide Stämme lieferten unter aeroben Bedingungen eine Endkonzentration an Brenztraubensäure von 24 g/l.
Das oben erwähnte Beispiel wurde mit chargenweiser Zugabe von Substrat und einer Kultur von P. freudenreichii subspecies shermani wiederholt. Die erreichte Endkonzentration an Brenztraubensäure betrug 20 g/l. Es wird angenommen, daß die chargenweise Zugabe aufgrund einer zu hohen Zugabegeschwindigkeit von Lactat eine niedrigere Brenztraubensäurekonzentration zur Folge hatte.

Legenden zu den Figuren

Figur 1 beschreibt die zwei altenativen Schemata der Diacetylherstellung.
Figur 2 gibt die Umwandlung von Brenztraubensäure mittels eines zellfreien Extrakts an.
- - - gibt die Brenztraubensäurekonzentration an
+ + + gibt die α-Acetomilchsäurekonzentration an
Figur 3A gibt die Umwandlung von Brenztraubensäure mittels eines zellfreien Extrakts von L. diacetilactis Stamm DRC3 an.
Figur 3B gibt die Umwandlung von Brenztraubensäure mittels eines Zell-Lysats von L. diacetilactis Stamm DRC3 an.
Figur 4 gibt die Umwandlung von Brenztraubensäure mittels eines zellfreien Extrakts von L. lactis subspezies cremoris an.
Figur 5 gibt die Konzentration der Metaboliten Glucose, Brenztraubensäure, Propionsäure und Essigsäure in einer zweistufigen aneroben/aeroben Fermentation an.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Aromaprodukts, das eine hohe Konzentration an α-Acetomilchsäure enthält, indem mindestens ein Nahrungsmittelbestandteil einer Milchsäurebakterienmasse unterworfen wird, welches umfaßt, daß eine hinreichende Menge dieses mindestens einen Nahrungsmittelbestandteils Milchsäurebakterien, welche sich nicht mehr in ihrer logarithmischen Wachstumsphase befinden, oder einem Zellextrakt oder Zell-Lysat der Milchsäurebakterien unterworfen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Milchsäurebakterien von ihrem Kulturmedium abgetrennt wurden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Nahrungsmittelbestandteil aus Zitronensäure, Milchsäure und Brenztraubensäure und Mischungen davon ausgewählt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin Brenztraubensäure aus einer Kultur von mindestens einem Bakterium der Gattung Propionibacterium, vorzugsweise der Spezies Propionibacterium freudenreichii, gewonnen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin ein Medium verwendet wird, welches dadurch erhältlich ist, daß man mindestens ein Bakterium der Gattung Propionibacterium in einem anaeroben Nährmedium kultiviert, um Biomasse herzustellen, und anschließend die Kultur aerob in einem milchsäurehaltigen Medium fortführt, bis eine Pyruvatkonzentration von mindestens 3 g/l, vorzugsweise mindestens 5 g/l, und besonders bevorzugt von mindestens 10 g/l, erreicht ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Milchsäurebakterien aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc und Pediococcus, vorzugsweise aus den Spezies Lactococcus lactis, besonders bevorzugt aus Lactococcus lactis, subspecies lactis ausgewählt sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin ein Bakterium von Lactococcus lactis subspecies lactis biovar. diacetilactis, vorzugsweise Lactococcus lactis subspecies lactis biovar. diacetilactis Stamm SD803, verwendet wird.

8. Aromaprodukt, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, das neben anderen Nahrungsmittelfermentationsprodukten α-Acetomilchsäure enthält und mindestens 0.2 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 0,4 Gew.-%, α- Acetomilchsäure enthält.

9. Aromaprodukt nach Anspruch 8, worin das Produkt trocken ist und mindestens 0,2 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 1 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 2 Gew.-%, α-Acetomilchsäure umfaßt.

10. Aromatisierte Nahrungsmittel, die ein Aromaprodukt nach Anspruch 8 oder 9, oder ein Aromaprodukt, das nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7 erhalten wurde, umfassen.

11. Verfahren zur Herstellung eines aromatisierten Nahrungsmittels nach Anspruch 10, worin das Aromaprodukt mit einem vorgetrockneten Nahrungsmittel, z .B. Molkepulver, Magermilchpulver, Weizenmehl oder einem Polysaccharid, vermischt wird.