DE69005143T2

DE69005143T2 - Verfahren zur Herstellung von Mevalonsäure.

Info

Publication number: DE69005143T2
Application number: DE90102748T
Authority: DE
Inventors: Hiromu Sugiyama; Haruyuki Yamashita
Original assignee: Asahi Denka Kogyo KK
Current assignee: Adeka Corp
Priority date: 1989-02-14
Filing date: 1990-02-12
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2010-02-13
Also published as: DE69005143D1; EP0383248A1; DK0383248T3; JP2763782B2; EP0383248B1; ATE98698T1; US5100789A; JPH02215389A; ES2049355T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von Mevalonsäure. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zum wirtschaftlichen Herstellen von Mevalonsäure mit hoher Aus beute.
Es ist bekannt, daß Mevalonsäure in Form einer Säure und in Form eines Lactons existiert, die leicht ineinander umgewandelt werden können. Soweit nicht anders angegeben, umfaßt der Begriff "Mevalonsäure" hier beide dieser Formen.
Mevalonsäure, die von Wright et al. das erste Mal isoliert wurde [siehe Journal of the American Chemical Society, 78, 5273-5275 (1956)], ist als wichtiges Zwischenprodukt bei der Synthese verschiedener Isoprenoide, wie Cholesterin, bekannt.
Weiterhin spielt Mevalonsäure eine wichtige Rolle im Metabolismus in Organismen. Beispielsweise fördert sie das Wachstum verschiedener Mikroorganismen, Tiere und/oder Pflanzen. Daher wird sie als Wachstumspromoter für Mikroorganismen, Tiere und Pflanzen verwendet. Weiterhin wird Mevalonsäure als eine Vorstufe für, beispielsweise Pyrethroid-Agrochemikalien, Ubichinon, Dolichol und fettlösliche Vitamine verwendet.
Es ist bevorzugt, natürliche (R-Form) Mevalonsäure für diese Zwecke zu verwenden. Natürliche Mevalonsäure ist jedoch kaum verfügbar. Daher wird bisher synthetische, racemische Mevalonsäure verwendet.
Ein bekanntes Verfahren für die Herstellung natürlicher Mevalonsäure umfaßt die Verwendung eines Mikroorganismus, wie Saccharomycopsis fibuligera, und somit das Anhäufen von Mevalonsäure in einem Medium mit einer Ausbeute von höchstens 12 mg/ml (siehe offengelegtes japanisches Patent Nr. 216484/1988, Nr. 216485/1988, Nr. 216486/1988 und Nr. 216487/1988). Es wird jedoch gefordert, ein Verfahren bereitzustellen, wodurch Mevalonsäure mit einer höheren Ausbeute wirksamer angehäuft werden kann.
Es ist auch gefordert, ein Verfahren hierfür zu entwickeln, worin preiswerte Kulturmaterialien verwendet werden, da diese bekannten Verfahren teure Materialien wie Malzextrakt und Fleischextrakt erfordern.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Herstellung von Mevalonsäure mit einer hohen Ausbeute unter Verwendung preiswerter Kulturmaterialien zur Verfügung zu stellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die vorstehende Aufgabe durch Bereitstellen eines Verfahrens für die Herstellung von Mevalonsäure durch Kultivieren eines Mevalonsäure-produzierenden Mikroorganismus in einem Medium gelöst, worin das Medium (A) 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile, von Kasein abstammendes Pepton, wobei das Pepton einen Aminostickstoffgehalt in dem gesamten Stickstoffgehalt von 20 bis 40 Gew.-% aufweist, und (B) 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile Maisquellwasser als organische Stickstoffquellen enthält.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Herstellung von Mevalonsäure kann Mevalonsäure wirtschaftlich mit einer hohen Ausbeute erhalten werden.
Als das von Kasein abstammende Pepton [A], das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendein Pepton verwendet werden, solange es von verschiedenen Kaseinen abstammt.
Beispielsweise können solche verwendet werden, die durch Hydrolisieren von Calciumkaseinat oder Natriumkaseninat, hergestellt aus Kuhmilch oder Ziegenmilch mit verschiedenen von Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen abstammenden Proteasen, wie Pepsin, Trypsin, Pankreatin oder Bromelain, einer Säure oder einer Base hergestellt sind.
Das vorstehend genannte Pepton wird erhalten durch Bewirken der Hydrolyse auf solche Weise, daß der Aminostickstoffgehalt in dem gesamten Stickstoffgehalt auf 20 bis 40 Gew.-%, vorzugsweise 25 bis 35 Gew.-%, eingestellt wird.
Wenn der Gehalt des Aminostickstoffs die oben spezifizierte Obergrenze übersteigt, würde das erhaltene Pepton häufig eine große Menge von Unreinheiten, gebildet als Nebenprodukt der Hydrolyse, enthalten. In diesem Fall würde die Ausbeute der Mevalonsäure erniedrigt. Wenn der Gehalt des Aminostickstoffs kleiner ist als die oben spezifizierte Untergrenze, würde die Ausbeute der Mevalonsäure andererseits auch erniedrigt. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß das erhaltene Pepton für Mikroorganismen weniger verfügbar ist.
Das Medium enthält das von Kasein abstammende Pepton [A] in einer Menge von 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile.
Wenn der Gehalt des von Kasein abstammenden Peptons [A] kleiner ist als die oben spezifizierte Untergrenze, kann die Ausbeute der Mevalonsäure nicht erhöht werden. Wenn er andererseits die vorstehend genannte Obergrenze übersteigt, würde die übermäßig große Menge der Zellen einen Sauerstoffmangel verursachen. In diesem Fall kann die Ausbeute der Mevalonsäure nicht erhöht werden.
Beispiele der Maisquellflüssigkeit [B], die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind wie folgt:
(1) Eine Eintauchflüssigkeit, erhalten durch Eintauchen von wenigstens frischen und/oder trockenen Körnern von sogenanntem Mais, d.h. einer Pflanze, die der Gattung Zea (Graminales, Gramineae) angehört, in warmes Wasser bei 30 bis 70ºC, vorzugsweise 40 bis 50ºC, mindestens 24 Stunden lang, vorzugsweise mindestens 48 Stunden lang.
(2) Ein Kulturmedium, erhalten durch Eintauchen mindestens frischer und/oder getrockneter Körner des oben genannten Mais in warmes oder heißes Wasser bei 30ºC oder mehr, vorzugsweise 50ºC oder mehr, für 5 Min oder 24 h, vorzugsweise 1 bis 12 h, und dann Kultivieren von einem oder mehreren Milchsäurebakterien, die beispielsweise der Gattung Streptokokkus, Lactobazillus, Pediokokkus, Bifidobakterium oder Leukonostoc angehören, auf herkömmliche Weise bei 20 bis 45ºC, vorzugsweise 30 bis 37ºC, für 3 bis 96 h, vorzugsweise 6 bis 48 h.
Das Medium enthält diese Kornquellflüssigkeit [B] in einer Menge von 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile.
Wenn der Gehalt der Maisquellflüssigkeit kleiner ist als die oben spezifizierte Untergrenze, kann die Ausbeute der Mevalonsäure nicht erhöht werden. Wenn er die oben spezifizierte Obergrenze andererseits übersteigt, würde die übermäßig große Menge von Zellen einen Sauerstoffmangel verursachen. In diesem Fall kann die Ausbeute der Mevalonsäure nicht erhöht werden.
In der vorliegenden Erfindung kann Mevalonsäure wirksamer hergestellt werden durch Regulieren der Gesamtmenge des von Kasein abstammenden Peptons [A] und der Maisquellflüssigkeit [B] auf vorzugsweise 0,2 bis 11 Gew.-%, insbesondere 0,4 bis 5 Gew.-%.
In der vorliegenden Erfindung kann das Medium, in dem der Mevalonsäure-produzierende Mikroorganismus kultiviert wird, dieselbe Zusammensetzung haben, wie bekannte, mit der Maßgabe, daß zumindest das oben genannte, von Kasein abstammende Pepton [A] und die Maisquellflüssigkeit [B] darin enthalten sind. Beispielsweise kann ein Medium verwendet werden, das 5 bis 15 Gew.-% einer Kohlenstoffquelle, wie Glukose oder Saccharose, 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile des von Kasein abstammenden Peptons, 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile, der Maisquellflüssigkeit und Wasser (Ausgleich) umfaßt.
Dieses Medium kann weiterhin beispielsweise andere organische Stickstoffquellen, oberflächenaktive Stoffe, wie nicht-ionische oberflächenaktive Stoffe, die fähig sind, die Zellwand des Mikroorganismus aufzuschließen, Phosphate und anorganische Salze, wie Kaliumsalze, Magnesiumsalze und Calciumsalze, enthalten. Die Menge jeder dieser Additive kann vorzugsweise von 0,01 bis 5 Gew.-% reichen.
Weiterhin kann das Medium synthetische Polymere und Silikonschaumverhütungsmittel enthalten.
Der Mevalonsäure-produzierende Mikroorganismus, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendein Mikroorganismus sein, solange er im wesentlichen Mevalonsäure produzieren kann. Beispielsweise können vorzugsweise solche, die in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 216487/1988 beschrieben sind, wie zu Saccharomycopsis fibuligera gehörende Stämme, vorzugsweise verwendet werden, um dadurch Mevalonsäure wirksam herzustellen.
Die Methode zum Kultivieren des Mevalonsäure-produzierenden Mikroorganismus in dem Medium in der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, aber es kann irgendeine bekannte Kulturmethode verwendet werden. Beispielsweise kann vorzugsweise ein Verfahren, das in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 216484/1988 beschrieben ist, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus bei 20 bis 40ºC, vorzugsweise 25 bis 35ºC, unter Schütteln oder Belüften und Rühren bei 100 bis 500 rpm, vorzugsweise 200 bis 400 rpm, und mit einer Belüftungsrate von 0,2 bis 1,5 vvm (Volumen der Luft/Volumen des Kulturmediums/min), vorzugsweise 0,5 bis 1,0 vvm, umfaßt, verwendet werden, um dadurch den Mikroorganismus wirksam zu kultivieren.
Es ist weiterhin bevorzugt, den Mikroorganismus für eine bestimmte Zeit unter Schütteln und/oder Belüften und Rühren zu kultivieren, ein Medium, das eine Kohlenstoffquelle enthält, dem Kulturmedium einmal oder mehrere Male zuzufügen und das Kultivieren weiter fortzusetzen, um somit Mevalonsäure wirksam herzustellen.
Die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Mevalonsäure kann auf bekannte Weise gereinigt werden. Beispielsweise kann die Reinigung wie folgt durchgeführt werden. Nach Abschluß der Kultivierung werden die Zellen aus dem Kulturmedium mit einer bekannten Methode, wie Zentrifugation oder Filtration durch eine organische synthetische Membran, wie ein Membranfilter, entfernt. Als nächstes wird das Kulturmedium mit einem herkömmlichen Verfahren gereinigt, beispielsweise Reinigung unter Verwendung einer Umkehrosmosemembran, Kieselgel, eines Ionenaustauschharzes oder eines porösen Polymerharzes, Lösungsmittelextraktion unter Verwendung von Ethylacetat oder Methylethylketon, Destillation unter vermindertem Druck, molekulare Destillation oder Kristallisation.
Um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, sind die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele angegeben.
In den folgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen wurde Mevalonsäure mit der folgenden Methode bestimmt.

[Bestimmung von Mevalonsäure]

1,0 ml einer Probe wurde in einem Reagenzglas gesammelt und durch Zufügen von 5 oder 6 Tropfen 50 % (W/W) Phosphorsäure angesäuert.
Als nächstes wurde 1 g wasserfreies Na&sub2;SO&sub4; zugefügt. 2,0 ml Ethylacetat wurden weiterhin zugefügt, und das erhaltene Gemisch wurde 30 s gerührt.
Das Gemisch wurde in einem Rotator mit einem Radius von 14 cm bei 2500 rpm zentrifugiert. Die obere Ethylacetatphase wurde in ein anderes Reagenzglas A eingeführt und zur Trockenheit verdampft.
Der unteren wäßrigen Phase wurden 2,0 ml Ethylacetat zugefügt, wonach 30 s gerührt wurde.
Das Gemisch wurde ähnlich zentrifugiert. Die obere Ethylacetatphase wurde in das Reagenzglas A eingeführt und zur Trockenheit verdampft.
Dasselbe Verfahren wurde wiederholt, um insgesamt 6 ml der getrockneten Ethylacetatphase zu ergeben.
Dieses trockene Produkt wurde in 1 ml Isopropanol, enthaltend 10 mg/ml γ-Valerolacton (ein Produkt von Aldrich Chemical Co.) als Bezugselement, aufgelöst und einer Hochdruckflüssigchromatographie ausgesetzt. Die Hochdruckflüssigchromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Säule: Nucleosil 5 N (CH&sub3;)&sub2; (ein Produkt von M. Nagel., Bundesrepublik Deutschland), 4,6 x 250 mm, 40ºC.
Mobile Phase: n-Hexan/Isopropanol (9/1), 2,0 ml/min.
Detektor: Differentialrefraktometer
Injektion: 5ul.

Beispiel 1

5 ml eines Mediums, umfassend 10 Gew.-% Glukose, 0,5 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile, von Kasein abstammendes Pepton (Aminostickstoffgehalt: 31 Gew.-%), 1,0 Gew.-% (0,5 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile) Maisquellflüssigkeit (Eintauchflüssigkeit, 5ºC, 50 h, enthaltend 50 Gew.-% Feuchtigkeit), 0,1 Gew.-% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05 Gew.-% MgSO&sub4; . 7H&sub2;O, 1,0 Gew.-% CaCO&sub3; und Wasser (Ausgleich), wurden in ein Reagenzglas eingeführt [24 (Durchmesser) x 200 mm] und bei 121ºC 15 min sterilisiert.
Eine Platindrahtöse voll Saccharomycopsis fibuligera IFO 0107 (IFO bedeutet ein Stamm, konserviert im Institut für Fermentation, Osaka), wurde in das oben genannte Medium eingeimpft und darin bei 28ºC und 300 rpm unter Schütteln kultiviert.
Am dritten und vierten Tag der Kultivierung wurden dem Medium 0,5 g-Mengen einer 50 Gew.-% wäßrigen Lösung von Glukose zugefügt, und die Kultivierung wurde bis zum 12. Tag fortgesetzt.
Die Menge der so hergestellten Mevalonsäure in dem Kulturmedium, bestimmt gemäß der oben beschriebenen Methode, betrug 14,1 mg/ml.

Vergleichsbeispiele 1 bis 5

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das von Kasein abstammende Pepton durch die in Tabelle 1 aufgeführten ersetzt wurde. Dann wurde die Menge der hergestellten Mevalonsäure in dem Kulturmedium ähnlich bestimmt. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 1 Peptonquelle Mevalonsäure (mg/ml) Vergl.bsp. Tiergewebe Gelatine Reis Baumwollsamen Sojaprotein Bemerkung: Jedes Pepton ist ein Produkt von Oriental Yeast Co., Ltd.

Vergleichsbeispiel 6

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 1,0 Gew.-% Maisquellflüssigkeit durch 0,25 Gew.-% Hefeextrakt (ein Produkt von Difco Laboratories, Inc.) ersetzt wurde. Somit wurden in dem Medium 12,1 mg/ml Mevalonsäure hergestellt.

Vergleichsbeispiele 7 und 8

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß kein Maisquellwasser eingesetzt wurde, während nicht 0,5 Gew.-%, sondern 1,0 Gew.-% von Kasein abstammendes Pepton verwendet wurde (Vergleichsbeispiel 7); oder mit der Ausnahme, daß kein von Kasein abstammendes Pepton verwendet wurde, während nicht 1,0 Gew.-%, sondern 2,0 Gew.-% Maisquellflüssigkeit verwendet wurden (Vergleichsbeispie1 8). Als Ergebnis wurden 0,7 mg/ml (Vergleichsbeispiel 7) und 11,4 mg/ml (Vergleichsbeispiel 8) Mevalonsäure hergestellt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Mevalonsäure durch Kultivieren eines Mevalonsäure-produzierenden Mikroorganismus in einem Medium, wobei das Medium (A) 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile, von Kasein abstammendes Pepton, wobei das Pepton einen Aminostickstoffgehalt in dem gesamten Stickstoffgehalt von 20 bis 40 Gew.-% aufweist, und (B) 0,01 bis 10 Gew.-%, bezogen auf trockene Bestandteile, Maisquellwasser als organische Stickstoffquellen enthält.

2. Verfahren zur Herstellung von Mevalonsäure nach Anspruch 1, worin die Gesamtmenge des von Kasein abstammenden Peptons (A) und des Kornquellwassers (B) auf 0,2 bis 11 Gew.-% eingestellt ist.