DE69033242T2

DE69033242T2 - Saf-polypeptid, gen, promotor und verwendung für expression in streptomyces

Info

Publication number: DE69033242T2
Application number: DE69033242T
Authority: DE
Inventors: Tomas Garcia; Jose Gil; Juan Martin; Antonio Ortega
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1989-05-19
Filing date: 1990-05-18
Publication date: 1999-12-02
Anticipated expiration: 2010-05-19
Also published as: CA2033069A1; IL113307A0; LV10491B; CA2033069C; AU638022B2; EP0429600A1; LV10491A; EP0429600B1; IL113307A; ES2134760T3; US5118617A; JP2926661B2; IL94422A; WO1990014426A3; JPH04501855A; JPH11235190A; JP3131192B2; AU5721790A; DE69033242D1; ATE183234T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie. Insbesondere betrifft sie ein neues Polypeptid, das die Produktion extrazellulärer Enzyme erhöht, die für das Polypeptid kodierende DNA, einen rekombinanten Vektor, der die DNA beinhaltet, und einen Wirtsorganismus, der mit dem rekombinanten Vektor transformiert ist, der die DNA enthält, die für das Polypeptid kodiert. Außerdem betrifft die Erfindung die Promotorsequenz des Gens, das das neue Polypeptid kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem Streptomyces-Expressionssysteme und Verfahren zur Expression fremder DNA-Sequenzen in Streptomyces und zur Sezernierung von Polypeptiden und Proteinen, für die diese fremden DNA-Sequenzen kodieren, in das umgebende Medium.

Hintergrund der Erfindung

Streptomyces sind bekannte Produzenten einer Vielzahl extrazellulärer Enzyme, einschließlich Proteasen, Phosphatasen, Xylanasen, Cellulasen, Amylasen, Lipasen und Nukleasen. Außerdem erzeugen Mitglieder des Stammes Streptomvces eine große Zahl an Antibiotika, Pigmenten und anderen Sekundärmetaboliten und haben ein kompliziertes Differenzierungsmuster, das zur Sporenbildung führt. In Standkulturen von Streptomvces stimmen gewöhnlich die Produktion extrazellulärer Enzyme und das Einsetzen der Antibiotikaproduktion und der Pigmentbiosynthese und die Sporulation überein. Alle diese Prozesse werden durch Nährstoffbedingungen reprimiert, die hohe Wachstumsraten begünstigen, und werden durch Verarmen an P-, C- oder N-Quellen dereprimiert. Wahrscheinlich sind Enzymsekretion, Bildung von Sekundärmetaboliten und Differenzierung völlig unabhängig, reagieren aber auf ähnliche Auslösemechanismen.
Mehrere Streptomyces-Gene, die extrazelluläre Enzyme kodieren, sind kloniert. Dazu gehören die Agarase aus Streptomyces coelicolor, die Endoglycosidase H aus Streptomyces plicatus, die Xylanase aus Streptomyces lividans, die Alpha- Amylase aus Streptomyces hygroscopicus, die Cellulase aus Strep. spA2, die Beta-Galactosidase aus Strep. lividans und die Betalactamasen aus Strep. cacaoi, badius und fradiae.
Die Regulationsmechanismen, die die Expression dieser Gene steuern, sind jedoch tatsächlich unbekannt. Zusätzlich zu spezifischen Regulationsmechanismen, wie der Induktion der Amylase durch Dextrine oder Maltotriose und der Kohlenstoff- Metabolit-Regulation von Amylase oder Agarase, treten vermutlich allgemeine Mechanismen der Derepression mehrerer zellulärer Enzyme auf, da die gleichzeitige Produktion mehrerer Polymersubstrat-abbauender Enzyme in Streptomyces auf eine Nährstoffabnahme hin beobachtet wurde. Diese in trans wirkenden Regulationsgene wurden in Bacillus subtilis (J. Bacteriol. 169 : 324-333, 1987), Bacillus natto (J. Bacteriol. 166 : 20-28, 1986) und Bacillus licheniformis gefunden.
Positive Regulationsgene, die die Enzymsynthese und/oder -sekretion beeinflussen, können kloniert werden, indem man nach erhöhter Sekretion extrazellulärer Enzyme in einem schlechten Sekretionsstamm, wie S. lividans, sucht.
Systeme zur Expression von Fremd-DNA-Sequenzen in Streoptomyces sind bereits beispielsweise in EP 148552 und WO 88/07079 beschrieben. Diese Systeme verwenden die endogenen Promotoren extrazellulärer, durch Streptomyces produzierter Enzyme.

Ziele der Erfindung

Ein hauptsächliches Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung der Klonierung und Charakterisierung eines neu isolierten Gens, nachstehend als saf (Sekundärstoffwechsel-Aktivierungs-Faktor) bezeichnet, das ein neues Aminosäuren-Polypeptid kodiert (nachstehend als SAF-Polypeptid bezeichnet). Das SAF-Polypeptid moduliert direkt oder indirekt die Expression der Gene für extrazelluläre Enzyme in Streptomyces, indem es mit der Kontrollregion der Strukturgene für die extrazellulären Enzyme interagiert.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft DNA-Einheiten oder -Fragmente, die Nukleotidsequenzen umfassen, die bei der Expression das vorstehend beschriebene SAF-Polypeptid kodieren.
Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft die Klonierungsvehikel (Vektoren), die die vorstehend beschriebene DNA enthalten.
Ein vierter Aspekt der Erfindung betrifft Wirtsorganismen oder Zellen, die mit den vorstehend beschriebenen Klonierungsvehikeln transformiert sind, wodurch eine erhöhte Produktion extrazellulärer Enzyme oder eines gewünschten heterologen Polypeptids erfolgt.
Ein fünfter Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung extrazellulärer Enzyme oder eines gewünschten Polypeptids durch Züchten eines erfindungsgemäßen transfor mierten Wirtsorganismus und Gewinnen des Produktes aus der Kulturbrühe.
Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft den Promotor des saf-Gens.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Herstellung von Klonierungsvehikeln (Vektoren), die den Promotor des saf-Gens in funktioneller Verbindung zum Sekretionssignal-Bereich eines endogenen extrazellulären Enzyms enthalten, wobei beide in funktioneller Verbindung zu einer fremden DNA-Sequenz stehen, sowie Wirtsorganismen oder -zellen, die mit diesen Klonierungsvehikeln transformiert sind, wodurch die Expression und Sekretion des fremden Polypeptids, das durch die fremde DNA-Sequenz kodiert wird, erfolgt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das Einbringen dieses Klonierungsvehikels, der die fremde DNA-Sequenz enthält, in die chromosomale DNA von Streptomyces. In einer bevorzugten Ausführungsform wird auch ein Expressionsvektor, der das saf-Gen enthält, in diesen transformierten Organismus eingebracht.
Diese und andere Ziele der Erfindung werden in der anschließenden Beschreibung eingehender beschrieben.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein DNA-Fragment von Streptomyces griseus ATCC 10137 wurde isoliert, das ein Gen saf (Sekundärstoffwechsel-Aktivierungs-Faktor) kodiert, das an einem allgemeinen Regulationsmechanismus für mindestens fünf extrazelluläre Exnzyme in S. lividans und S. coelicolor beteiligt ist. Das saf-Gen ist in allen getesteten Streptomyces zugegen, was nahelegt, daß dieses Gen eine wichtige Rolle im Stoffwechsel besitzen muß. Tatsächlich wurde ein DNA-Fragment mit einem ähnlichen Gen wie saf von uns aus Streptomyces griseus IMRU 3570, dem Candicidin-Produzentenstamm, kloniert. Bei einigen Streptomyces, z. B. S. lividans und S. lactamdurans, legt das Hybridisierungsmuster nahe, daß das saf-Gen in mehreren Kopien in der chromosomalen DNA vorliegt.
Dies ist das erste Beispiel für ein Gen, das an der Produktion extrazellulärer Enzyme und der Sporulierung in Streptomyces beteiligt ist.
Das saf-Gen kodiert ein Polypeptid von 113 Aminosäuren (das SAF-Polypeptid). In vitro-Transkriptions- und -Translationsstudien in E. coli zeigten, daß ein Protein der richtigen Größe, etwa 15000 Dalton, gebildet wird. Das SAF-Polypeptid hat eine starke positive Ladung (18 positiv geladene Aminosäuren) und zeigt keine Zusammensetzung, die für ein Leader-Peptid oder ein Transmembranprotein typisch ist, und daher scheint eine direkte Wirkung auf die Proteinexkretion unwahrscheinlich zu sein. Das positiv geladene Protein kann leicht mit DNA interagieren. Tatsächlich wird eine DNA-Bindungsdomäne, die für mehrere Reglationsproteine typisch ist (Ann. Rev. Biochem. 53: 293-321, 1984), im SAF-Polypeptid beobachtet. Es wurde unerwarteterweise gefunden, daß der saf- Promotor stärker als der natürliche Promotor extrazellulärer Enzyme ist. Beispielsweise exprimiert das Amylasegen viel größere Mengen Amylase, wenn der saf-Promotor anstelle des natürlichen Amylasepromotors eingesetzt wird. So kann der saf-Promotor zur Verstärkung der Expression jeglichen endogenen Polypeptids oder Proteins anstelle des natürlichen Promotors des Proteins eingesetzt werden.
Das SAF-Polypeptid hat pleiotrope Wirkung, d. h. eine Wirkung, die mehr als einen Weg beeinflußt, auf extrazelluläre Enzyme, die Pigmentproduktion und die Differenzierung. Erfindungsgemäß wird eine erhöhte Produktion endogener (extrazellulärer) Proteine erzielt.
Im weitesten Sinne können das saf-Gen und das entsprechende Polypeptid zur Steigerung der Expression in Streptomyces von ausgewählten heterologen Proteinen verwendet werden, indem das für das gewünschte Protein oder einen Teil davon kodierende Gen in eine geeignete Spaltstelle des für ein extrazelluläres Enzym kodierenden Gens, dessen Expression durch SAF verstärkt wird, eingebracht wird, ein Streptomyces-Wirt, der das saf-Gen trägt, mit dem rekombinanten Gen transformiert wird und die transformierten Bakterien gezüchtet werden, so daß sie das ausgewählte Protein oder einen Teil davon ausscheiden. Vorzugsweise wird die heterologe DNA unter der Kontrolle des saf-Promotors in die chromosomale DNA eingebracht (integriert), und ein die DNA, die das SAF-Polypeptid kodiert, enthaltender Expressionsvektor wird gleichzeitig eingebracht. Der Expressionsvektor muß nicht in die chromosomale DNA integriert werden.
Pleiotrope Gene, die die Biosynthese von Antibiotika und die Differenzierung in Streptomyces beeinflussen, sind beschrieben. Ein Gen afsB, das die Produktion des A-Faktors, von Actinorhodin und Prodigiosin in Streptomyces coelicolor und Streptomyces lividans positiv reguliert, wurde aus S. coelicolor A3(2) kloniert (Horinouchi et al., J. Bakteriol. 155: 1238-1248, 1983).
Das saf-Gen unterscheidet sich von afsB, und sie haben tatsächlich entgegengesetzte Wirkungen auf die Produktion von Actinorhodin. Sie haben gemeinsam, daß sie eine für DNA-bindende Proteine typische Aminosäuresequenz haben. Sowohl das afsB- als auch das saf-Gen haben Promotoren ohne -10- und - 35-Konsensussequenz und sind von potentiellen Translationsregulationssequenzen und durch starke Stem-und-Loop-Strukturen begrenzt, die als Transkriptionsterminatoren wirken können (Horinouchi et al., J. Bacteriol. 168: 257-269, 1986). Wenn die Transkription eine sehr stabile Schleife bildet, ist die Bindung der Ribosomen ausgeschlossen. Es wurde gefunden, daß solche abschwächenden Mechanismen der Kontrolle der Genexpression die Kontrolle der Antibiotikaresistenzgene in Streptomyces modulieren (Horinouchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7079-7083, 1980). Da das saf-Gen als "Master-"gen angesehen werden kann, das eine Vielzahl von Genen für die Enzymausscheidung anschaltet, ist seine Expression wahrscheinlich in der Zelle strikt reguliert. Die durch das saf-Gen stimulierten Enzyme sind alle am Abbau komplexer Polymere beteiligt, und daher spekulieren wir, daß dieses Gen ein Teil eines Gesamt-Regulationssystems ist, das an der Suche nach alternativen Nährstoffquellen beteiligt ist, wie es auch für Bacillus vorgeschlagen wurde (Henner et al., J. Bacteriol. 170: 296-300, 1988).

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 Restriktionskarten chromosomaler DNA-Fragmente von S. ariseus-ATCC-10137-Klonen in der BglII-Stelle von pIJ702, die die genetische Determinante für die Überproduktion der alkalischen Phosphatase tragen.
Fig. 2 Southern-Hybridisierungsanalyse auf Homologie zwischen dem 1 kb großen BglII-Fragment von pULAD3 und genomischer DNA anderer Streptomyces-Spezies. (A) DNA- Fragmente, die durch BamHI-Spaltung genomischer DNAs erhalten wurden (Spur 2 bis 7). (B) Hydridisierung der in Bild A gezeigten DNAs mit dem 1 kb großen DNA-Fragment als Sonde. Spuren: 1, HindIII-Spaltung von DNA, die Fragmente mit 23, 9,59, 6,68, 4,29, 2,28, 1,94 und 0,58 kb ergibt; 2, S. lactamdurans; 3, S. acrimycini; 4, S. coelicolor 1157; 5, S. griseus 2212; 6, S. griseus 3570; 7, S. lividans 1326.
Fig. 3 Tests auf Petrischalen der Protease- (A), Amylase- (B) und Lipase- (C) Aktivitäten von S. lividans, die mit pIJ702 transformiert waren (links) und S. lividans, die mit pULAD3 transformiert waren (rechts).
Fig. 4 Gendosiswirkung auf die Expression des saf-Gens. Produktion der Protease (A) und der Amylase (B) durch S. lividans, transformiert mit pIJ702 (links), S. lividans, transformiert mit pULAD3 (Mitte) und S. lividans, transformiert mit pULAD30 (rechts).
Fig. 5 Abgrenzung des saf-Gens. Das 1 kb große BglII-Fragment von pULAD3 wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Die Produktion extrazellulärer Enzyme wurde für alle Plasmidkonstruktionen auf festen Mediumplatten gemessen, wie in der Beschreibung angegeben: -, Wildtypproduzent; ++, +++ und ++++ zeigen verschiedene Überproduktionsraten an. Kurze offene Pfeile zeigen die Stelle und Richtung der Transkription des Tyrosinasegens (mel) im Plasmid pIJ702. Ausgefüllte Kreise ( →) zeigen den mel-Gen- Promotor; offene Kreise (º→) zeigen eine mutmaßliche Promotoraktivität im Uhrzeigensinn in pIJ702 und offene Quadrate ( →) zeigen den saf-Promotor. Die Transkriptionsrichtung ist durch Pfeile gezeigt. Der ORF1 entspricht dem offenen Leserahmen von saf, der aus den Nukleotidsequenzdaten abgeleitet wurde (s. Fig. 6).
Fig. 6 Nukelotidsequenz des 1 kb großen BglII-Fragments von pULAD3 und abgeleitete Aminosäuresequenz des saf- Genproduktes. Das zweite mutmaßliche ATG-Initiationscodon ist unterstrichen. Invertierte komplementäre Repeat-Sequenzen sind durch aufeinanderzulaufende Pfeile dargestellt. Die Wellenlinie zeigt die Aminosäuresequenz, die DNA-bindenden Domänen bekannter DNA-bindender Proteine ähnelt. Die relevanten Restriktionsstellen sind gezeigt. Die Nukleotide sind ausgehend von der BglII-Stelle numeriert (Zahlen auf der rechten Seite).
Fig. 7 Vergleich einer Region aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz des saf-Genproduktes mit DNA-bindenden Domänen in bekannten DNA-bindenden Proteinen. Die Daten stammen von Pabo und Sauer (Pabo et al., Ann. Rev. Biochem. 53: 293-321, 1984) und Horinouchi und Beppu (Horinouchi et al., Genetics of Industrial Microorganisms, S. 41, Pliva, Zagreb, Jugoslavien, 1986).
Fig. 8 Nukleotidsequenz-Repeats "stromaufwärts und stromabwärts" des saf-Gens.
Fig. 9 Wiederholte Gruppen von Nukleotiden im saf-Gen.
Fig. 10 Plasmid pIJ2921.
Fig. 11 Die Fig. 11A und B zeigen die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Amylasegens von S. griseus. Man nimmt an, daß die BstEII-Schnittstelle die optimale Stelle zur Fusion eines fremden Gens ist.
Fig. 12 Die zur Klonierung des α-Amylasegens von S. griseus IMRU 3570 verwendete Strategie unter Verwendung des Plasmids pIJ699.
Fig. 13 Eine Reihe von Schaubildern zeigen die α-Amylaseproduktion in Petrischalen durch verschiedene Plasmide im Zeitverlauf und in verschiedenen Medien:
(Δ) mm + Stärke (1%) + Thio
( ) mm 1 mM P + Stärke (1%) + Thio
( ) mm ohne Phosphat + Stärke (1%) + Thio
( ) mm + Stärke (1%) + Thio + IPTG
Das Bild unten rechts zeigt die Werte für die Produktion von Plasmid pULVDIO verglichen mit pULTV1, S. lividans und pULTV100 (s. Fig. 6a) in den besten Produktionsmedien. (X)
S. lividans (pIJ699) in mm ohne Phosphat + 1% Stärke + Thio: ( ) pULTV1 in den vorherigen Medien; (-) pULTV100 in den vorherigen Medien und (Δ) pULVDIO in mm 1 mM P + 1% Stärke + Thio.
Fig. 14 Eine schematische Darstellung der Konstruktion einer rekombinanten Streptomyces-Zelle, die ein chromosomales Gen enthält, das ein Fusionsprotein produziert, das das CRF-Molekül umfaßt, und Plasmide, die die für das SAF-Polypeptid kodierende DNA enthalten.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die hier beschriebenen Arbeiten wurden unter Verwendung der folgenden Materialien und Verfahren durchgeführt.
Bakterienstämme und Plasmide. Die in dieser Studie verwendeten Streptomyces- und E. coli-Stämme sind in der Tabelle 1 aufgelistet. Plasmide und Phagen befinden sind in Tabelle 2.
Medien und Kulturbedingungen. Streptomyces-Stämme wurden in R2YE, Minimalmedium (mm), TSB (Difco) oder YEME, angereichert mit 34% Saccharose und 5 mM MgCl&sub2;, gezüchtet (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, GB, 1985). Streptomyces-Stämme wurden in Kolben mit drei Schikanen bei 28ºC in einem Rotationsschüttler unter Schütteln bei 220 U/min gezüchtet.
E. coli-Stämme wurden in Luria-Brühe (LB) (Miller et al., Experiments in Molecular Genetics, S. 433, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 1972) oder Luria-Agar (LA) bei 37ºC gezüchtet.
Enzymtests auf Platten. Alkalische-Phosphatase- (AP-) Tests für Streptomyces wurden in PRMM-Medium (mm) ohne Glucose und mit einer geringeren Menge [1 mM] Phosphat, angereichert mit 30 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-toluidin (XP) durchgeführt. AP-produzierende Kolonien waren blau, und diejenigen, die keine AP produzieren konnten, waren weiß. Für E. coli wurde B-XP-Medium verwendet (das pro Liter enthielt: 10 g Bactopepton, 12 g Trisma-Base, 10 g NaCl, 20 g Difco-Agar, pH-Wert 7,5, und 40 ug/ml XP).
Die Amylaseaktivität von Streptomyces-Kolonien wurde auf mm (ohne Glucose), angereichert mit 1% Stärke, getestet. Nach 3tägigem Wachstum wurden die Platten Ioddampf ausgesetzt. Aufgehellte Zonen um die Kolonien entstanden aufgrund des Stärkeabbaus. Die Lipaseaktivität wurde durch Züchten von Streptomyces in mm, angereichert mit 2% (Gew./Vol.) Olivenöl, 0,5% (Gew./Vol.) Tween 80 und 0,5% (Gew./Vol.) Tween 20, gemessen. Nach 3-tägigem Wachstum wurden die Platten mit 1 mM CaCl&sub2; überschichtet. Die Lipaseproduktion wurden als Niederschlag des Ca²&spplus;-Fettsäure-Komplexes beobachtet (Odera et al., Ferment. Technol. 64: 363-371, 1986). Die Proteaseaktivität wurden in mm (ohne Glucose), angereichert mit 0,5% Casein und 10 mM CaCl&sub2;, getestet. Die Enzymaktivität wurde als aufgehellte Zonen um die Kolonien bestimmt.
Die Agaraseaktivität von S. coelicolor wurde in mm ohne Glucose durch Überschichten der Platten mit Grams lodlösung getestet. Die Betagalactosidase-Aktivität wurde als blaue Farbe der auf mm ohne Glucose und angereichert mit X-Gal (36 ug/ml) und IPTG (10 ug/ml) wachsenden Kolonien beobachtet.
DNA-Isolation. Gesamt-DNA aus Streptomyces wurde hergestellt, wie von Hopwood et al. (Hopwood et al., A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, GB, 1985) beschrieben. Plasmid-DNA aus Streptomyces und E. coli wurde nach dem Verfahren von Kieser (Kieser et al., Plasmid 12: 19- 36, 1984) isoliert.
Klonierungsverfahren. Zehn ug chromosomale DNA von S. griseus ATCC 10137 und 0,5 ug pIJ702 wurden mit BglII vollständig gespalten und 12 Std. bei 14ºC unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch wurde direkt für die Transformation eingesetzt. Die Subklonierung der DNA- Fragmente erfolgte durch Spaltung von 1-2 ug Plasmid-DNA mit (einem) geeigneten Restriktionsenzym(en), und die Reaktionsprodukte wurden durch Gelelektrophorese in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMPA) aufgetrennt. Die erforderlichen DNA-Banden wurden unter Verwendung des Verfahrens unter Zu hilfenahme von CTAB (Langridge et al., Anal. Biochem. 103: 264-271, 1980) extrahiert.
Transformationsverfahren. Streptomyces-Stämme wurden transformiert, wie von Hopwood et al. (Hopwood et al., A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, GB, 1985) beschrieben. Nach der Transformation wurden Protoplasten auf R2YE-Medium plattiert und 15-20 Std. bei 30ºC regenerieren gelassen. Dann wurde 1 ml einer wäßrigen Thiostrepton-Lösung (300 ug/ml) über die Platten gegossen, 1 oder 2 Std. getrocknet und weitere 2 oder 3 Tage inkubiert. Die Transformanten wurden auf PRMM-Medium mit Thiostrepton (50 ug/ml) und XP (30 ug/ml) replikaplattiert.
Die Transformation von E. coli erfolgte gemäß Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110-2114, 1972). Die Transformanten wurden auf Platten mit Ampicillin (200 ug/ml) selektiert. Falls erforderlich, wurden X-Gal (36 ug/ml) und IPTG (10 ug/ml) zu den LA-Platten gegeben.
Hybridisierungsstudien. Die Übertragung der DNA von Agarosegelen auf Nitrocellulosefilter und die Hybridisierungen wurden durchgeführt, wie von Hopwood et al. (A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, GB, 1985) beschrieben. Das 7,2 kb große BglII-Fragment aus dem Plasmid pULAD1 und das 1 kb große BglII-Fragment aus dem Plasmid pULAD3 wurden als Sonden verwendet. Die Hybridisierungen erfolgten bei 70ºC für 24 Std. Die Filter wurden zweimal 30 min in 2 g SSC, 0,1% SDS, und dann wiederum zweimal für 30 min in 0,2 g SSC, 0,1% SDS bei 70ºC gewaschen.
Nukleotidsequenzanalyse. Die Nukleotidsequenz wurde durch das Kettenabbruchverfahren von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977) bestimmt. Die DNA- Fragmente wurden in M13mp10 und M13mp11 subkloniert, so daß Insertionen in jeder Orientierung erhalten wurden. Die Ligationsgemische wurden in kompetente E. coli-JM103-Zellen transfiziert, und die weißen Plaques wurden zur Selektion der Insertionen durchmustert. Die Sequenzierung wurde in beiden Strängen unter Verwendung des Kits von Amersham International plc. (GB) und des Sequenase-Kits (United States Biochemical Corporation, USA) durchgeführt. Alle Fragmente wurden unter Verwendung von dGTP sequenziert, aber dITP wurde, falls erforderlich, anstelle von dGTP eingesetzt. Die Reaktionsgemische wurden auf 6%igen oder 8%igen Polyacrylamid-Sequenzgelen aufgetrennt, die zur Autoradiographie mit Roentgenfilm exponiert wurden.
Klonierung der Promotoren. Fragmente mit Transkriptionsinitiations-Aktivität wurden selektiert, indem das Mehrfachkopie-Promotorsondenplasmid pIJ486 (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203 : 468-478, 1986) verwendet wurde. Kanamycin- (Km-) resistente Transformanten wurden durch Replikaplattierung der Kolonien auf mm mit 15 ug/ml Km isoliert.
In-vitro-Transkription/Translation. Die Plasmide pULAD300 und pUC19 wurden unter Verwendung des durch prokaryotische DNA gesteuerten Translationskits von Amersham International plc. transkribiert und translatiert. L-(³&sup5;S)- Methionin wurde als radioaktive Markierung verwendet. 12,5%ige Polyacrylamidgele, die Natriumdodecylsulfat enthielten, wurden zur Analyse der markierten Proteine verwendet.

Arten der Durchführung der Erfindung

Die folgende eingehende Beschreibung veranschaulicht die Erfindung:

Alkalische-Phosphatase-Produktion durch verschiedene Streptomyces

Die alkalische-Phosphatase-Produktion in mehreren festen Medien von zehn verschiedenen Streptomyces-Stämmen (aufgelistet in Tabelle 1) wurde getestet. S. griseus IMRU 3570 und S. griseus ATCC 10137 waren die besten Produzenten in allen getesteten Medien. Das beste feste Medium für die alkalische-Phosphatase-Produktion war PRMM (mit 30 ug/ml XP). In diesem Medium zeigten S. griseus IMRU 3570 und S. griseus ATCC 10137 nach 48stündigem Wachstum eine tiefblaue Färbung. S. lividans 1326 und S. coelicolor JI 2280 waren schlechte alkalische-Phosphatase-Produzenten: nach 90stündigem Wachstum auf PRMM mit XP kann nur eine schwach blaue Färbung beobachtet werden.

Klonierung eines an der Produktion von alkalischer Phosphatase beteiligten Gens

Gesamt-DNA von S. griseus ATCC 10137 wurde mit BglII gespalten, mit BglII-gespaltenem pIJ702 ligiert, und das Ligationsgemisch wurde durch Transformation in S. lividans 1326- Protoplasten eingebracht. Die Transformanten wurden auf PRMM mit Thiostrepton (50 ug/ml) und XP (30 ug/ml) replikaplattiert. Eine tiefblaue Kolonie wurde unter 2800 Melaninnegativen Transformanten von S. lividans gefunden. Die tiefblaue Kolonie enthielt ein pIJ702-Derivat mit einem 7,2 kb großen BglII-Insert trug, das als pULAD1 bezeichnet wurde (Fig. 1).
Das Plasmid pULAU1 war in S. lividans instabil und ergab nach der Retransformation weiße und blaue Kolonien. Alle blauen Kolonien enthielten ursprüngliches pULAD1, und die weißen Kolonien enthielten Deletionsformen von pULAD1, die nicht weiter untersucht wurden. Da die Instabilität auf die Größe des Inserts in einem Plasmid wie pIJ702 zurückzuführen sein kann, das für eine bestimmte Instabilität bekannt ist, wurde das 7,2 kb-Insert in das 5 kb große BglII-Fragment des Plasmids pIJ699 (Kieser et al., Gene 65 : 83-91, 1988) subkloniert. Zwei Plasmide, pULAD100 und pULAD101, mit dem Plasmid in entgegengesetzter Richtung wurden erhalten. Beide Plasmide waren stabil, und das Gen wurde in S. lividans in beiden Orientierungen exprimiert.

Lokalisierung des saf-Gens

Das 7,2 kb große BglII-Fragment wurde mit Sau3AI partiell gespalten und in BglII-gespaltenes pIJ702 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in S. lividans-Protoplasten transformiert, und die Transformanten wurden auf PRMM mit XP replikaplattiert. Die Plasmid-DNA wurde aus mehreren blauen Kolonien isoliert. Vier kleine Plasmide, pULAD2, pULAD3, pULADI6 und pULADI8, die die Determinante für die alkalische-Phosphatase- Produktion trugen, wurden eingehend untersucht; sie waren stabil, wurden in S. lividans-Protoplasten retransformiert und trugen Inserts von 2,4, 1, 2,1 bzw. 1,9 kb (Fig. 1). Das Plasmid pULAD3 hatte das kleinste Insert (1 kb), das mit BglII erhalten werden kann. Nach dem Einbringen in S. lividans erhöhte pULAD3 (Hinterlegungsnummer I-859 am 19.05.89 bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, F75724 Paris Cedex 15, Frankreich) kraft des Budapester Vertrags und der Richtlinie 28 EPÜ) die alkalische-Phosphatase-Produktion wie pULAD1.

Hybridisierung mit chromosomaler DNA von mehreren Streptomyces

Gesamt-DNA von S. griseus ATCC 10137, gespalten mit BamHI oder Bglil, wurde mit dem durch Nick-Translation mit (³²P)-dCTP markierten 7,2 kb großen BglII-Fragment von pULAD1 hybridisiert. Ein 7,2 kb großes BglII-Fragment, das zur Sonde homolog war, lag wie erwartet in S. ariseus ATCC 10137-DNA, die mit Bglil gespalten war, vor. Eine interne BamHI-Stelle befand sich im Fragment, die zu zwei deutlichen Hybridisierungsbanden (von 7,9 kb und 9,4 kb) führte, wenn Gesamt-DNA mit BamHI gespalten wurde.
Um zu untersuchen, ob das gleiche Gen in anderen Streptomyces vorlag, wurde Gesamt-DNA von S. acrimycini, S. coelicolor 1157, S. griseus 2212, 5. griseus 3570, S. lividans 1326 und S. lactamdurans NRRL 3802 mit BamHI gespalten und mit dem 1 kb großen BglI-Fragment von pULAD3 als Sonde hybridisiert. Die Hybridisierung mit einer gemeinsamen 9,5 kb großen Bande wurde in den ersten vier Stämmen der oben genannten Streptomyces beobachtet, wogegen 4 bzw. 5 schwache Hybridisierungsbanden in der DNA von S. lividans und S. lactamdurans beobachtet wurden (Fig. 2). Außerdem wurde eine Hybridisierung auch mit der DNA von S. albus G, S. coelicolor JI 2280, S. clavuligerus NRRL 3585 und S. fradiae ATCC 10475 beobachtet. Es wurden keine weiteren Versuche zur Charakterisierung der Hybridisierungsbanden gemacht.
Fehlende Komplementation von E. coli-pho-Mutanten Es wurde die Komplementation der E. coli-phoA-Mutanten E15 und AW1046 versucht, um zu überprüfen, ob wir das alkalische-Phosphatase-Strukturgen aus S. griseus ATCC 10137 klo niert hatten. Das 7,2 kb große BglII-Fragment aus pULAD1 und das 1 kb große BglII-Fragment aus pULAD3 wurden getrennt in beiden Orientierungen in BamHI-gespaltenes pUC19 subkloniert. Alle diese Plasmidkonstruktionen wurden in E. coli-JM103-Zellen überprüft und dann zur Transformation von E. coli-E15 (Sarthy et al., J. Bacteriol. 145: 288-292, 1981) und E. coli- AW1046 verwendet. In B-XP wurden keine blauen Kolonien gefunden, was andeutet, daß das vollständige Strukturgen für alkalische Phosphatase nicht auf dem 7,2 kb-Fragment von S. griseus vorlag oder daß es in E. coli nicht exprimiert wird. Das Strukturgen für alkalische Phosphatase (phoA) von Bacillus licheniformis (Hullett, F. M., J. Bacteriol. 158: 978-982, 1984) hybridisierte nicht mit dem klonierten 1 kb großen Fragment (Daten nicht gezeigt).
Außerdem wurde die phoB (Regulations-) E. coli-Mutante H2 (Kreuzer et al., Genetics 81: 459-468, 1975) weder durch das 1 kb große BglII-Fragment aus pULAD3 noch das 7,2 kb große BglII-Fragment aus pULAD1 komplementiert.

Überproduktion anderer extrazellulärer Enzyme

Wenn pULAD3 zur Retransformation von S. lividans verwendet wurde, wurde eine eindeutig verzögerte Pigmentierung und Sporulierung beobachtet. Diese pleiotropen Wirkungen veranlaßten uns, die Rolle dieses Gens bei der Proteinsekretion oder der Steuerung der Genexpression zu untersuchen. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurden verschiedene extrazelluläre Enzyme, einschließlich der Amylase, Protease und Lipase, durch S. lividans, die mit pULAD3 transformiert waren, überproduziert. Die β-Galactosidase-Produktion war ebenfalls erhöht, und ihre Produktion begann etwa 24-30 Stunden früher als in untrans formierten S. coelicolor. Aufgrund der pleiotropen Wirkungen des klonierten Gens auf extrazelluläre Enzyme, auf die Pigmentproduktion und die Differenzierung wurde dieses Gen als saf (Sekundärstoffwechsel-Aktivierungs-Faktor) bezeichnet.

Gendosiswirkung

Die Kopienzahl von pIJ702 wird auf 100 bis 200 pro Chromosom geschätzt. Obwohl die genaue Kopienzahl von pULAD3 nicht bestimmt wurde, legt die Intensität der pIJ702- und der pULAD3-Banden eine ähnlich Kopienzahl nahe.
Zur Untersuchung der Gendosiswirkung subklonierten wir das 1 kb große BglII-Fragment aus pULAD3 in die BamHI-Stelle des Plasmids pIJ61 mit niedriger Kopienzahl (3 bis 4 Kopien pro Zelle) (Hopwood et al., A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, GB). Dieses neue Plasmid wurde als pULAD30 bezeichnet. Die Fig. 4 zeigt, daß die Produktion extrazellulärer Enzyme durch S. lividans, die mit pULAD30 transformiert waren, verglichen mit S. lividans, die pULAD3 trugen, eindeutig abnahm. Außerdem zeigten die pULAD30 tragenden S. lividans ein ähnliches Pigmentproduktions- und Sporulationsmuster wie untransformierte S. lividans.

Expression in E. coli und Eingrenzung des Gens

Obwohl Pho-Mutanten von E. coli nicht durch das saf-Gen komplementiert wurden, beobachteten wir, daß das 1 kb große BglII-Insert von pULAD3 bei der Subklonierung in einer Richtung in pUC19 (Plasmid wurde als pULAD300 bezeichnet) in E. exprimiert wurde und beim Wachstum auf festen Medien eine anomale Morphologie verursachte, aber nicht exprimiert wurde, wenn es in umgekehrter Richtung inseriert wurde (Plasmid pULAD301). Das Plasmid pULAD300 enthält den ORF (s. unten) stromabwärts vom lacZ-Promotor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß das saf-Gen in E. coli von dem in pUC19 vorhandenen lacZ-Promotor exprimiert wird.
In-vitro-Transkriptions-/Translationstests in E. coli (mit pULAD300) wurden durchgeführt, und die Reaktionsprodukte wurden auf ein 12,5%iges Polyacrylamidgel aufgetragen. Eine Bande mit einem MG von 15000 war in der Spur, die pULAD300 entsprach, vorhanden und fehlte in der Kontrollspur mit pUC19.
Zur genauen Lokalisierung des saf-Gens wurde entschieden, die Aufspaltung des 1 kb-Fragments des Plasmids pULAD300 fortzusetzen. In diesen Experimenten wurde das Vorliegen einzelner Spaltstellen für Restriktionsenzyme, wie SstI (Nt 216), KpnI (Nt 648) und SalGI (Nt 936), im 1 kb-Fragment untersucht. Die verschiedenen Subfragmente aus dem 1 kb-Insert von pULAD300 wurden in einem ersten Schritt in pIJ2921, ein Derivat von pUC18 mit einem modifizierten Polylinker, der von BglII-Stellen flankiert ist (s. Fig. 10), kloniert und dann mit BglII-kohäsiven Enden gewonnen und in BglII-gespaltenes pIJ702 kloniert. Die Produktion von alkalischer Phosphatase, Amylase und Protease wurde in Streptomyces lividans mit allen Plasmidkonstruktionen untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der Fig. 5 dargestellt, und die folgenden Schlußfolgerungen wurden aus ihrer Interpretierung gezogen:
1. Das 1 kb-Fragment enthält das vollständige saf-Gen, einschließlich seines eigenen Promotors, da es in beiden Orientierungen im Plasmid pIJ702 (Plasmid pULAD3 und pULAD4) in ähnlicher Menge exprimiert wurde.
2. Das saf-Gen scheint auf dem 648 Nukleotide großen BglII- KpnI-Fragment (Plasmide pULAD5 und pULAD6) lokalisiert zu sein.
3. Das Fragment SstI-KpnI (432 Nukleotide) scheint die genetische Determinante für die Überproduktion extrazellulärer Enzyme zu enthalten, scheint aber seine Promotorregion verloren zu haben, da es nur in einer Orientierung exprimiert wurde (Plasmid pULAD10 und pULAD14), aber nicht in der anderen (Plasmid pULAD9 und pULAD13).
4. Das 215 Nukleotide große Fragment BglII-SstI enthält die saf-Gen-Promotorregion.
5. Alle Wirkungen auf extrazelluläre Enzyme und die Differenzierung wurden zusammen behalten oder verloren, was zeigt, daß ein einzelnes Genprodukt für die Wirkung auf alle Enzyme verantwortlich war.
6. Ein überraschender Aspekt war das Fehlen der Expression des SstI-KpnI-Fragments (saf-Gen ohne Promotor) ausgehend vom Tyrosinasepromotor des in pIJ702 vorliegenden mel-Genproduktes, das dennoch in der entgegengesetzten Richtung (im Uhrzeigersinn) exprimiert wurde. Dieser Befund deutete an, daß sich vor dem Gen mel und an der BglII-Klonierungsstelle ein Fragment mit Promotoraktivität befand (Bernan et al., Gene 37: 101-110, 1985). Obwohl dieser Befund nicht veröffentlicht wurde, wurde er gelegentlich von einigen Autoren erwähnt (Gil und Hopwood, Gene 25: 119-132, 1983). Die Möglichkeit eines funktionellen ORF in umgekehrter Richtung (von KpnI → SstI) wurde aus mehreren Gründen verworfen:
A. Dieser ORF wurde bei der Nukleotidsequenzanalyse nicht entdeckt.
B. Wenn ein solcher ORF existierte, wäre eindeutig, daß er einen eigenen Promotor besitzen müßte, da das Fragment BglII-KpnI (Nt 1 bis 648) in beiden Richtungen exprimiert wurde (Plasmide pULAD5 und pULAD6). Dann machte es keinen Sinn, daß das KpnIstI-Fragment, das den Promotor im KpnI-Bereich tragen würde, sich selbst in einer Richtung exprimieren könnte.
C. Die Expression in E. coli fand immer statt, wenn der lacZ- Promotor für den vorgeschlagenen ORF günstig (davor) war, und nie in der umgekehrten Richtung.

Promotoraktivität des DNA-Fragments stromaufwärts von ORF1

Um das Vorliegen eines Promotors im BglII-SstI-Fragment, das aus den vorhergehenden Experimenten geschlossen werden konnte, zu bestätigen, wurde das Fragment in den Sondenvektor für pIJ486- Fragmente (Ward et a., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478, 1986) subkloniert, der das für Aminoglycosidphosphotransferase (neo) kodierende Gen ohne dessen Promotor trägt. Die Expression dieses Gens machte S. lividans resistent gegen Kanamycin und Neomycin. Als das Fragment in pIJ486 (mit dem SstI-Ende neben dem neo-Gen) kloniert wurde, wurde das Plasmid pIJ484::216 erzeugt. Es wurde beobachtet, daß mit pIJ484::216 transformierte S. lividans in mm mit mehr als 100 ug/ml Kanamycin wachsen, während mit pIJ486 transformierte S. lividans nicht in mm mit 5 ug/ml Km wuchsen. Diese Ergebnisse zeigten, daß dieses Fragment Promotoraktivität hatte und den vorgeschlagenen ORF unterstützte.
Andere Überlegungen, die aus der Nukleotidsequenz und dem möglichen ORF abgeleitet wurden, waren u. a.:
1. Das Gen saf war von zwei Regionen mit entgegengesetzten und komplementären repetitiven Sequenzen umgeben, die in der mRNA sehr stabile Bindungen bilden konnten, G = -38,4 kcal, die das Gen saf (Nt 637-697) waren (Fig. 8).
2. Das sequenzierte Fragment enthält einen hohen Prozentsatz an G + C, wie in Streptomyces-Genen üblich.
3. Vor dem saf-Gen, zwischen dem ATG (Nt 219) und den repetitiven, stromaufwärts gelegenen Strukturen gibt es eine sehr interessante Nukleotidregion: Es gibt drei Paare repetitiver Nukleotide (jedes mit 7 Nt) (Fig. 9). Sehr wahrscheinlich spielt diese Region, insbesondere die Promotorzone, eine wichtige Rolle bei der Regulation der saf-Genexpression.
4. Es lohnt sich zu erwähnen, daß das SAF-Protein 18 positive Nettoladungen enthält. Aus hypothetischer Sicht könnte dies das Vorliegen einer viel größeren Affinität für DNA andeuten. Sogar in der abgeleiteten Aminosäuresequenz kann eine sehr ähnliche Region zu den Domänen DNA-bindender Proteine beobachtet werden (Pabo und Sauer, 1984) (Fig. 7).

Nukleotidsequenz des saf-Gens

Die Nukleotidsequenz des gesamten 1 kb-BglII-Inserts von pULAD3 wurde unter Verwendung des Plasmids pULAD300 als Ausgangsmaterial bestimmt. Da M13mp10 und M13mp11 keine KpnI- Stelle haben, wurden die Fragmente mit KpnI-Enden zuerst in pUCl9 subkloniert und dann als EcoRI-HindIII-Fragmente gewonnen und in mp10 und mp11, die mit EcoRI und HindIII gespalten waren, eingebracht. Die vollständige Nukleotidsequenz der aktiven Region zeigt einen ORF von 339 Nukleotiden, der das putative SAF-Polypeptid kodiert (Fig. 6). Es gibt nur einen möglichen offenen Leserahmen im BglII-KpnI-Fragment, der mit einem ATG-Initiationscodon bei Nt 183 beginnt und mit einem TGA-Stopcodon bei Nt 524 endet (ORF1 in den Fig. 5 und 6). Da das SstI-KpnI-Insert, das im Plasmid pULAD14 enthalten ist, eine geringere Aktivität zeigte als Plasmide, die auch die stromaufwärts der SstI-Stelle gelegene Region enthalten (pULAD3, pULAD4, pULAD6), ist sehr wahrscheinlich, daß das ATG (Nt 219), das auch im gleichen Leserahmen mit dem mutmaßlichen saf-Leserahmen ist, als das Initiationscodon in pULADIO und pULADI4 wirken kann. Es sind keine alternativen Initiationstripletts möglich, da ein TGA-Terminationscodon stromaufwärts des ersten ATG liegt. Ein langer "inverted repeat"-Bereich, der eine sehr stabile "Stem-und-Loop"-Struktur bilden kann (G = -53,6 kcal), befindet sich stromaufwärts des saf-Gens von Nt 90 bis Nt 135. Eine weitere, gekoppelte "inverted repeat"-Sequenz wurde stromabwärts des Terminationstripletts von ORF1 beobachtet, die sich von Nukleotid 637 bis 697 erstreckte (G = -38,4 kcal).
Das saf-Gen hat einen hohen G + C-Gehalt (76,3%) und deutliche Gene (Hopwood et al., Regulation of Gene Expression 25 Years On, Cambridge University Press, S. 251-276, 1986).

Promotoraktivität des DNA-Fragments stromaufwärts des ORF1

Da Plasmide ohne das BglII- stI-Fragment (von Nt 1 bis Nt 216) nur in einer Orientierung exprimiert wurden (Plasmide pULAD10 und pULAD14), aber nicht in der entgegengesetzten (Plasmide pULAD9 und pULAD13), war es wahrscheinlich, daß der ORF1-Promotor sich in diesem Fragment befand. Das Vorliegen einer Transkriptionsinitiationssequenz in diesem Bereich wurde bestätigt, indem dieses Fragment in das Promotor-Sonden-Plasmid pIJ486 (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468- 478, 1986) subkloniert wurde, das ein Aminoglycosidphosphotransferase-Gen (neo) ohne Promotor trug. Die Expression dieses Gens verleiht S. lividans Kanamycin- und Neomycin-Resistenz. Das BglII-SstI-Fragment wurde in pIJ486 subkloniert (das SstI-Ende neben dem neo-Gen) (das Plasmid wurde als pIJ486::216 bezeichnet). Die mit pIJ486::216 transformierten S. lividans konnten auf mm mit mehr als 100 ug/ml Km wachsen, wogegen S. lividans, die pIJ486 trugen, nicht auf mm mit 5 ug/ml Km wachsen. Dieses Ergebnis zeigt, daß das BglII-SstI- Fragment Promotoraktivität besitzt. Es wurden jedoch keine typischen -10- und -35-"Konsensus"regionen durch Nukleotidhomologie mit anderen Streptomyces-Promotoren identifiziert (Hopwood et al., Regulation of Gene Expression 25 Years On, Cambridge University Press, S. 251-276, 1986).

Klonierung des Amylasegens

Die definitive Sequenz des Amylasegens (amv) von S. griseus IMRU 3570 wurde jetzt aufgeklärt. Die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Amylasegens von S. griseus erscheint in der Fig. 11. Das Protein mit dem "Leader"-Peptid hat 566 Aminosäuren (von Nukleotid 318 bis 2155, jeweils einschließlich), was einem PM von 59713 D entspricht. Das Plasmid pULTV1, das das gesamte Amylasegen enthält, wurde konstruiert, indem die DNA von S. griseus IMRU 3570 mit Sau3A gespalten wurde und die Fraktionen mit 3 bis 9 kb isoliert und mit BglII-gespaltenem pIJ699 ligiert wurden. Nach dem Screening auf α-Amylaseaktivität wurde das Plasmid pULTVl selektiert, das das gesamte α-Amylasegen enthielt. Die Konstruktion von pULTV1 ist in Fig. 12 dargestellt. Ein anderer Weg, ein Plasmid mit dem gesamten α-Amylasegen zu erhalten, ist, es aus kleineren Fragmenten zu konstruieren. Unter den durch Klonieren der gesamten S. griseus-DNA-Bank erhaltenen Plasmiden sind solche mit einem partiellen Gen, das am 5'-Ende beginnt, und solche mit partiellen Genen, die am 3'- Ende beginnen. Von den ersteren kann ein 1,3 kb großes BamHI- SacI-Fragment erhalten werden, das das 5'-Ende des Gens enthält, und von letzteren kann ein 1, 2 kb großes SacI-SalI- Fragment gewonnen werden, das das 3'-Ende des Gens enthält. Beide können dann mit pIJ2921 verbunden werden, das mit SalI- BamHI behandelt ist, um ein Plasmid mit dem intakten nativen α-Amylasegen zu erhalten (pULTV200).

Überragende Stärke des saf-Promotors

Um die Expression des amy-Gens unter der Kontrolle verschiedener Promotoren zu testen, wurde die Amylaseproduktion durch S. lividans JI66 getestet. Das amv-Gen wurde unter die Kontrolle verschiedener Promotoren gestellt, und die Amylaseproduktion wurde mit der verglichen, die unter Verwendung des nativen Promotors produziert wurde (Pamy). Die getesteten Promotoren waren die vom saf-Gen (Psaf), vom Kmr-Gen (Pneo), vom PABA-Synthetasegen (Ppab) und vom E. coli-β-Galactosidasegen (Plac). Das das α-Amylasegen ohne Promotor enthaltende Plasmid pULTV220 wurde durch Ligation des aus pULTV200 gewonnenen EcoRI-BglII-Fragments mit dem mit EcoRI-BamHI gespaltenen pUCIS erhalten. Das ECORI-HindIII-Fragment von pULTV220 wurde direkt mit den Promotoren des saf-, pab- oder Kmr-Gens ligiert, so daß die Plasmide pULVDIO, pULVAl bzw. pULTV80 erhalten wurden. pULTV150, das den lac-Promotor enthält, wurde direkt durch HindIII-Spaltung von pULTV220 und Ligation mit dem 5 kb großen HindIII-Fragment von pIJ699 erhalten.
Die Produktionsstudien der erhaltenen Plasmide wurden in Schalen mit mm + Stärke (1%) + Thiostrepton, mm (1 mM P) + Stärke (1%) + Thiostrepton, mm ohne Phosphat + Stärke + Thiostrepton und mm + Stärke (1%) + Thiostrepton + IPTG durchgeführt. pIJ699, pULTV100 (s. Fig. 6a) und pULTV1 wurden als Kontrollen verwendet. Die relative Messung der Amylaseproduktion wurde als die Fläche der erhaltenen ringförmigen Corona um jede Kolonie betrachtet, die beim Färben des Wachstumsmediums mit I&sub2; erhalten wurde.
Die Produktionskurven der verschiedenen Konstruktionen sind in Fig. 13 dargestellt. Außer in den Kontrollen wurde die höchste Produktion in mm (1 mM P) + Stärke + Thiostrepton erzielt. Es ist offensichtlich, wie der Produktionspeak mit pULVDIO (das den saf-Gen-Promotor enthält) erhalten wurde (1482 mm² verglichen mit 1335 mm² beim zweitstärksten Produzenten pULTV150, das den Plac-Promotor trägt, nach 114 Std. Inkubation).
In der Fig. 13 (Bild unten rechts) sind die Produktionswerte von pULVDIO verglichen mit den Kontrollen unter den bisher bekannten besten Bedingungen für jeden Konstruktionstyp dargestellt. Der Anstieg in der pULVDIO-Produktion verglichen mit pULTVl (nativ) ist recht erheblich: 1482 mm² im Gegensatz zu 1105 mm².
Somit kann der saf-Gen-Promotor als Ersatz für andere native Promotoren verwendet werden, um die Expression verschiedener endogener Streptomyces-Polypeptide und -Proteine zu verbessern. Wenn eine fremde DNA inseriert wird, wird ebenso erwartet, daß der saf-Gen-Promotor ähnlich überragende Ergebnisse wie die mit Amylase gezeigten liefert.

Expression eines fremden Polypeptids oder Proteins

Zur Expression eines fremden Polypeptids oder Proteins wird die fremde DNA vorzugsweise an einer geeigneten Erken nungsstelle eines endogenen Gens, vorzugsweise eines für ein extrazelluläres Enzym kodierenden Gens, inseriert, um die Sekretion des fremden Polypeptids oder Proteins zu gewährleisten. Wenn das Gen das Amylasegen ist, ist die BstEII-Stelle eine geeignete Erkennungsstelle (s. Fig. 11). Die fremde DNA wird vorzugsweise so inseriert, daß die Sekretionssignale des Gens für das extrazelluläre Enzym so weit wie möglich beibehalten werden. Diese Signale befinden sich zwar hauptsächlich in der Leader-Sequenz, aber es gibt bezüglich des Amylasegens Hinweise, daß der Carboxyterminus ebenfalls für die Sekretion wichtig ist. So kann es am besten sein, ein Fusionsprotein durch Insertion der Fremd-DNA in die endogene DNA herzustellen anstatt den transkribierten Teil der endogenen DNA zu entfernen und durch die Fremd-DNA zu ersetzen.
Bekanntlich reguliert das saf-Gen die Produktion extrazellulärer Enzyme in der chromosomalen DNA. Vermutlich gibt es Erkennungsstellen in der chromosomalen DNA, die das SAF- Polypeptid erkennen und die Verstärkung der Produktion extrazellulärer Enzyme verursachen. Die Kombination des saf-Gens mit dem Amylasegen auf einem Plasmid führt nicht zur erhöhten Produktion von Amylase. Somit ist bevorzugt, das Fremdprotein in funktioneller Verbindung zur Sekretionssignalsequenz eines endogenen extrazellulären Enzyms, das durch SAF regulierbar ist, und vorzugsweise weiter in funktioneller Verbindung zum saf-Promotor (in Abwesenheit des nativen Promotors) in die chromosomale DNA anstatt in ein Plasmid einzusetzen. Auf diese Weise wird die Produktion des fremden Polypeptids oder Proteins durch das native SAF weiter verstärkt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das saf-Gen mittels eines Plasmids in die gleichen Organismen inseriert, in denen die fremde DNA in die chromosomale DNA eingebracht wurde. Dies gewährleistet die verstärkte Sekretion des fremden Polypeptids oder Proteins. DNA-Fragmente können in die chromosomale DNA von Streptomyces mittels irgendeines bekannten Bakteriophagenvektors für Streptomyces, wie ΦC31 oder R4, kloniert werden (Chater et al., "Gene Cloning in Streptomyces" in Gene Cloning in Organisms Other Than E. coli, herausg. von P. H. Hofschneider et al., Springer-Verlag, Berlin, 1982, Seiten 87-95.
Das Diagramm der Fig. 14 zeigt die bevorzugte Technik, um die Sekretion eines fremden Proteins, in diesem Fall CRF, aus Streptomyces zu erhalten. KC 400 ist ein Φ31-Derivat, dem die Anheftungsstelle fehlt (att) und das das C&spplus;-Gen hat. Siehe Chater, K. F., et al. "Mutational cloning in Streptomyces and the isolation of antibiotic production genes", Gene 26: 67-78 (1983). Das C&spplus;-Gen kodiert den zur Aufrechterhaltung des lysogenen Zustands notwendigen Repressor. Die att-Stelle im Wildtyp-Phagen steuert die Anheftung des Phagen an die Wirtszell-DNA und steuert die Loslösung davon. Ohne att- Stelle kann der Phage nicht in das Wirtschromosom integriert werden, wenn nicht ein homologes DNA-Fragment einkloniert wird. Jedes endogene Gen im Wirtsstamm kann für diesen Zweck verwendet werden und wird somit in Fig. 14 als Gen "X" bezeichnet. Der Phage Φ31-KC 400 wird durch bekannte Techniken (s. Hopwood, D. A., et al., "Genetic manipulation of tretomyces. A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Norwich, GB (1985)) verändert, um das homologe Genfragment (Gen X) sowie ein Gen zu inserieren, das den saf-Promotor und das endogene α-Amylasegen enthält, wobei das Gen für CRF in funktioneller Verbindung und im Leserahmen mit dem α-Amylasegen ist. Nach Infektion eines Streptomyces-Wirtsstammes, vorzugsweise S. coelicolor A3(2) (erhältlich von der Sammlung am John Innes Institute, Norwich, GB), durch diesen Phagen wird die gesamte Phagen-DNA, beginnend mit dem homologen Gen X, vorzugsweise unter Verwendung der Rekombination vom Campbell- Typ in die chromosomale DNA der Wirtszelle inseriert. Wie angedeutet, liegen alle speziellen Techniken, um dies zu erreichen, in den Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns, so daß diese Insertion ohne übermäßiges Experimentieren erfolgen kann.
Die Zellen mit dem inserierten chromosomalen Gen werden dann so behandelt, daß sie das Plasmid pULAD3 aufnehmen. Diese Zellen exprimieren das SAF-Polypeptid, das wiederum die Sekretion der "α-Amylase" durch das chromosomale Gen verstärkt. Die Anwesenheit des saf-Promotors auf diesem Gen verstärkt die Sekretion der "α-Amylase" weiter. An die sezernierte "α-Amylase" ist das CRF-Molekül fusioniert, das durch geeignete enzymatische Spaltung leicht abgetrennt werden kann.
Das α-Amylasegen von Streptomyces diente als spezielles Beispiel. Es ist aber selbstverständlich, daß zum Zweck der Verstärkung der Expression durch Verwendung des saf-Promotors das Gen jedes verwendeten, von Streptomyces produzierten Polypeptids oder Proteins durch Entfernen des nativen Promotors und Einsetzen des saf-Promotors modifiziert werden kann. Ebenso kann das fremde Polypeptid oder Protein in jedes endogene Gen eingebracht werden. Vorzugsweise wird jedoch das ausgewählte endogene Gen eines sein, das das Protein durch die Zellwand und in das Kulturmedium exprimiert, in welchem Fall es wichtig ist, die Sekretionssignalsequenz beizubehalten. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn das zur Insertion des Fremdgens ausgewählte Gen eines ist, das durch SAF reguliert ist, und die Insertion in die chromosomale DNA erfolgt, vorzugsweise mit gleichzeitiger Insertion eines Plasmids, das das saf-Gen enthält.
CRF wurde speziell erwähnt. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die fremde DNA-Sequenz eine nicht von Streptomyces stammende DNA-Sequenz sein kann, die ein Protein oder Polypeptid, insbesondere mit eukaryotischem oder viralem Ursprung, kodiert. Beispiele für diese eukaryotischen und viralen DNA-Sequenzen sind Sequenzen, die menschliche und tierische Leukozyt-Interferone (IFN-α), Fibroblasten-Interferone (IFN-β) und Immun-Interferone (IFN-γ), menschliches Insulin, menschliche und tierische Wachstums- und andere Hormone, wie Corticotropin-Releasing-Faktor (CRF), menschliches Serumalbumin und verschiedene menschliche Blutfaktoren und Plasminogenaktivatoren, sowohl Gewebe- als auch Urokinase-, Hepatitis-B-Virus-Nukleocapsid- und -Oberflächenantigene, FMD-Virusantigene und andere menschliche, tierische und virale Polypeptide und Proteine kodieren.
Der saf-Promotor ist zwar bevorzugt, aber die Produktion des fremden Polypeptids oder Proteins wird weiter verstärkt, indem die Wirtszelle mit einem Expressionsvektor transformiert wird, der das saf-Gen enthält. Dieser Expressionsvektor kann in der Plasmid-DNA der Zelle vorliegen. So kann der endogene oder ein anderer Promotor verwendet werden und die Sekretion des fremden Polypeptids oder Proteins immer noch erhalten werden.
Die vorstehende Beschreibung spezifischer Ausführungsformen enthüllt die allgemeine Natur der Erfindung so vollständig, daß andere durch Anwendung gegenwärtigen Wissens diese spezifischen Ausführungsformen leicht modifizieren und/oder an verschiedene Anwendungen anpassen können, ohne von generischen Konzept abzuweichen, und daher sollen solche Anpasungen und Modifikationen als in der Bedeutung und im Spektrum von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsformen verstanden werden. Es ist selbstverständlich, daß die Ausdrücke und die Terminologie hier zum Zweck der Beschreibung und nicht der Einschränkung dienen. Tabelle I. Bakterienstämme
JI: Collection of microorganisms of the John Innes Institute. Coleny Lane, Norwich NR4 UH, Großbritannien.
ATCC: American Type Culture Collection.
IMRU: Waksmans Institute of Microbiology, Rutgers University, New Brunswick, N. J., USA.
NRRL: Northern Regional Research Laboratories, Peoria, ILL: USA.
CGSC E. coli Genetic Stock Center Tabelle 2. Plasmide and Phagen

In den Tabellen 1 and 2 zitierte Literaturstellen

1. Hoffman, C. S., and A. wright. 1985. Fusions of secreted proteins to alkaline phosphatase: an approach for studying protein secretion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5107-5111.
2. Messing, J., R. Crea, and P. H. Seeburg. 1981. A system for shotgun DNA sequencing. Nuci. Acids. Res. 9: 309-321.
3. Katz, E., C. J. Thompson, and D. A. Hopwood. 1983. Cloning and expression of the tyrosinase gene from streptomyces antibioticus in Streptomyces lividans. J. Gen. Microbiol. 129: 2703-2714.
4. Kieser, T., and R. E. Melton. 1988. Plasmid pIJ699, a multicopy positive-selection vector for Streptomyces. Gene 65: 83-91.
5. Hopwood, D. A., M. J., Bibb, K. F. Chater, T. Kieser, C. J. Bruton, H. M. Kieser, D. J. Lydiate, C. P., Smith, J. M. Ward, and H. Schrempf. 1985. Genetic manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, U. K.
6. Ward, J. M., G. R. Janssen, T. Kieser, M. J. Bibb, M. J. Buttner, and M. J. Bibb. 1986. Construction and characterization of a series of multicopy promoterprobe plasmid vectors for Streptotyces using the aminoglycoside phosphotransferase gene from Tn5 as indicator. Mol. Gen. Genet. 203: 468-478.
7. Yanisch-Perron, C., J. Vieira, and J. Messing. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and hast strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and PUC19 vectors. GENE 33: 103-119.
8. Messing, J. 1983. New M13 Vectors for Cloning. Methods Enzymol. 101: 20-78.

QUANTIFIZIERUNG DES TRÄGERPROTEINS (AMYLASE) IN DEN KULTURBRÜHEN (ÜBERSTÄNDEN) VON KULTUREN VON MIT VERSCHIEDENEN PLASMIDEN TRANSFORMIERTEN Streptomyces lividans

Wir verwendeten drei verschiedene Verfahren zur Bestimmung der Menge an sezerniertem Protein.
1. Spektrodensitometrie der Proteinbanden in SDS-PAGE-Gelen, die mit Silber gefärbt waren, oder von fotografischen Negativen (Filmen) der gleichen Gele unter Verwendung eines Shimadzu-Spektrodensitometers.
2. Analyse der Menge an unterschiedlichen Proteinen unter Verwendung einer HPLC, die mit einer C8-Aquapore-RP-300-Säule (200 · 4,6 nm; Brownlee Labs, USA) ausgerüstet war.
3. Analyse durch HPLC, die mit einer Molekularsieb- (Gelfiltrations-) Säule Protein-PAK-300-SW ausgerüstet war.

ERGEBNISSE

Sporen von S. lividans [pULTV100], S. lividans [pULVD10] und S. lividans [pULTV80] wurden in Lechevalier-Medium + 1% Stärke angeimpft. Maximale Amylaseaktivitäten wurden jeweils bei 36, 60 und 60 Std. Fermentation erhalten. Das Gesamtprotein in der extrazellulären Flüssigkeit (Überstand) wurde mit dem Bradford-Verfahren quantifiziert. 5 ug Protein aus jeder Brühe wurden auf SDS-PAGE aufgetragen und mit Silber gefärbt. 1. Spektrodensitometrie - Die Spektrodensitometrie erfolgte von den Banden in der SDS-PAGE (10% Acrylamid) von Überständen von S. lividans [pULTV100] (5 ug Protein) S. lividans [pULVD10] (5 ug Protein) und S. lividans [pULTV80] (5 ug Protein).
2. HPLC auf der Aquapore-RP-300-Säule - Die Proteine wurden mit 50 mM Essigsäure-Ammoniumacetat-Puffer und einem Methanolgradienten eluiert; 0-20 min 0% Methanol; 30-35 min 100% Methanol; 45 min 0% Methanol. Die Amylase eluiert mit 100% Methanol bei Minute 33-34. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt.
3. HPLC auf Protein-PAK 300 SW - Die Überstände von Kulturbrühen der gleichen Konstruktion wie oben wurden zuvor dialysiert und durch Lyophilisieren eingeengt. Die Proteine wurden mit Essigsäure-Ammoniumacetat-Puffer mit einem Fluß von 0,5 ml/min eluiert. Die Amylase eluiert als Peak mit dem Mittelpunkt bei Minute 21-22. Tabelle;

Claims

1. Weitgehend reines SAF (Sekundärstoffwechsel- Aktivierungsfaktor)-Polypeptid, erhältlich aus Streptomyces, dessen Polypeptid direkt oder indirekt die Expression von Genen für extrazelluläre Enzyme in Streptomyces steuert, indem es mit der Kontrollregion der Strukturgene für die extrazellulären Enzyme wechselwirkt, mit folgender Aminosäuresequenz:

und/oder Fragmente hiervon mit derselben Aktivität.

2. DNA-Sequenz, die ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 codiert.

3. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 und folgende Nucleotidsequenz enthaltend:

4. DNA-Sequenz, die mit einer Nucleotidsequenz nach Anspruch 3 hybridisiert und die für ein Polypeptid mit der Aktivität des SAF-Polypeptids nach Anspruch 1 codiert.

5. Vektor, der eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 enthält.

6. Vektor gemäß Anspruch 5, wobei die DNA-Sequenz durch regulatorische Einheiten flankiert wird.

7. Vektor gemäß Anspruch 6, wobei die regulatorische Einheit stromaufwärts des ATG folgende Nucleotidsequenz aufweist:

8. Streptomyces-Wirtszelle, die mit einem Vektor gemäß Anspruch 5 transformiert wurde.

9. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei eine Wirtszelle gemäß Anspruch 8 kultiviert wird.

10. Vektor, der eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 3 enthält.

11. Vektor gemäß Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz von regulatorischen Einheiten flankiert wird.

12. Vektor nach Anspruch 11, wobei die regulatorische Einheit stromaufwärts des ATG folgende Nucleotidsequenz aufweist:

13. Streptomyces-Wirtszelle, die mit einem Vektor gemäß Anspruch 10 transformiert wurde.

14. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei eine Wirtszelle gemäß Anspruch 13 kultiviert wird.

15. Vektor, der eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 4 enthält.

16. Vektor gemäß Anspruch 15, wobei die DNA-Sequenz von regulatorischen Einheiten flankiert wird.

17. Vektor gemäß Anspruch 16, wobei die regulatorische Einheit stromaufwärts des ATG folgende Nucleotidsequenz aufweist:

18. Streptomyces-Wirtszelle, die mit einem Vektor gemäß Anspruch 15 transformiert wurde.

19. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei eine Wirtszelle gemäß Anspruch 18 kultiviert wird.

20. Plasmid pULAD3 (CNCM I-859).

21. SAF-Promotor des SAF-Gens, das ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 codiert, mit folgender DNA-Sequenz:

22. Klonierungs-Vehikel, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein Polypeptid oder Protein codiert, welches operativ an einen Promotor gemäß Anspruch 21 gebunden ist.

23. Klonierungs-Vehikel gemäß Anspruch 22, wobei es sich bei der DNA-Sequenz um eine endogene Streptomyces-Sequenz handelt.

24. Klonierungs-Vehikel gemäß Anspruch 22, wobei die DNA- Sequenz die gesamte Sequenz oder einen Teil einer Sequenz enthält, die für ein endogenes Streptomyces-Polypeptid oder -Protein codiert, an die im selben Leseraster eine DNA-Sequenz, die für ein nicht-Streptomyces-Polypeptid oder -Protein codiert, fusioniert wurde.

25. Streptomyces-Wirtszelle, die mit einem Klonierungs- Vehikel gemäß Anspruch 22 transformiert wurde.

26. Streptomyces-Wirtszelle, die mit einem Klonierungs- Vehikel gemäß Anspruch 23 transformiert wurde.

27. Streptomyces-Wirtszelle, die mit einem Klonierungs- Vehikel gemäß Anspruch 24 transformiert wurde.

28. Verfahren zur Expression einer fremden DNA-Sequenz in Streptomyces, das die operative Verbindung der fremden DNA-Sequenz mit einer Streptomyces-Expressions- Kontrollsequenz, die den Promotor gemäß Anspruch 21 enthält, beinhaltet.

29. Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die fremde DNA-Sequenz und die Streptomyces-Expressions-Kontrollsequenz in die chromosomale DNA von Streptomyces eingefügt werden.

30. Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei die Wirts-Streptomyces weiterhin ein Plasmid enthält, das fähig ist, ein Polypeptid mit der Aktivität des SAF-Polypeptids gemäß Anspruch 1 zu exprimieren.

31. Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die fremde DNA-Sequenz operativ mit der Streptomyces-Expressions-Kontrollsequenz durch eine DNA-Sequenz verbunden wird, die zumindest für einen Teil der Signalsequenz eines Proteins oder Polypeptids, das von Streptomyces ausgeschieden wird, codiert, wobei die DNA-Sequenz die Signalsequenz, die zusammen mit der fremden DNA-Sequenz unter Kontrolle der Streptomyces-Expressions-Kontrollsequenz exprimiert wird, codiert, um die Sekretion des von der fremden DNA-Sequenz codierten Proteins oder Polypeptids zu gewährleisten.