DE69012134T2

DE69012134T2 - Fuer lipase kodierende dns und lipasemodulator.

Info

Publication number: DE69012134T2
Application number: DE69012134T
Authority: DE
Inventors: Steen Jorgensen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1989-07-07
Filing date: 1990-07-05
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2010-07-06
Also published as: DK0487541T3; CA2063590A1; DK336889D0; AU6041990A; FI920038A0; EP0487541A1; KR927003820A; ATE110776T1; WO1991000908A1; EP0487541B1; AU635054B2; JPH04506455A; IE68938B1; IE902468A1; DE69012134D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die für eine Lipase kodiert, eine DNA-Sequenz, deren Produkt die Bildung der Lipase beeinflußt, Expressionsvektoren und Wirtszellen, die diese Sequenzen umfassen, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Kultivieren der Wirtszellen.

Hintergrund der Erfindung

Lipasen sind Enzyme, die die Hydrolyse der Esterbindungen in Triglyceriden katalysieren, was zur Bildung von Diglyceriden, Monoglyceriden, Glycerin und freien Fettsäuren führt. Einige Lipasen katalysieren auch Reaktionen unter Beteiligung von Esterbindungen, wie die Synthese von Esterbindungen oder Umesterungsreaktionen. Lipasen werden von einer Vielzahl verschiedener Organismen gebildet. Insbesondere mikrobielle Lipasen sind von erheblicher praktischer Bedeutung für eine Reihe von Zwecken, bei denen die Lipolyse von Fetten erwünscht ist, z. B. in der Nahrungsmittelindustrie und in Detergenzien.
Eine spezielle Lipase, von der festgestellt wurde, daß sie besonders vorteilhaft für die Verwendung in einem Detergens zur Entfernung von Fettflecken oder Verschmutzungen aus Geweben ist, ist eine Lipase, die von Stämmen von Pseudomonas cepacia gebildet wird. In EP 214 761 (Novo Industri A/S) wird diese Lipase als eine Lipase beschrieben, die bei einer Temperatur unterhalb 60ºC aktiv ist, was von Bedeutung ist, da die meisten heutigen Gewebe bei Temperaturen unterhalb 60ºC gewaschen werden.
Eine weitere wichtige Pseudomonas cepacia-Lipase für die Verwendung als Detergensadditiv ist die Lipase, die in WO 89/01032 (Novo Industri A/S) als eine hinsichtlich der Position nicht spezifische Lipase beschrieben wird, d. h. eine Lipase, die imstande ist, mit allen drei Fettacylgruppen eines Triglycerids zu reagieren.
Um die Herstellung von Pseudomonas cepacia-Lipase zu erleichtern, könnte es von Vorteil sein, rekombinante DNA-Techniken einzusetzen, z. B. um die Lipase-Expression durch Einführung eines stärkeren Promotors, von dem die DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, exprimiert wird, oder durch Einführung wirksamerer Ribosom-Bindungsstellen oder für ein Signalpeptid kodierender Sequenzen zu optimieren oder um einen Wirtsorganismus für die Herstellung des Enzyms zu wählen, der leichter kultiviert werden kann (im Hinblick darauf, daß es sich um einen Standard-Produktionsorganismus, wie E. coli, B. subtilis oder dergl. handelt) oder der zu höheren Lipase-Ausbeuten führt. Wie nachstehend erläutert wird, führen derartige Ansätze manchmal nicht zu den erwarteten Ergebnissen, z. B. in Fällen, bei denen ein oder mehrere Gene zusätzlich zu dem Strukturgen, das für das fragliche Protein kodiert, eine gewisse Rolle bei der Herstellung des Genprodukts spielen (Beispiele für derartige Gene sind das Bacillus sac- Gen (M. Honjo et al., Journal of Biotechnology, Bd. 6 (1987), S. 191-204) und das iep-Gen (T. Tanaka, M. Kawata, Journal of Bacteriology, Bd. 170 (1988), S. 3593-3600) sowie Gene, die für die Bildung von Klebsiella-Pullulanase und E. coli-Hämolysin erforderlich sind).
Die Klonierung eines Lipase-Gens aus einer anderen Pseudomonas-Spezies, nämlich Pseudomonas fragi, ist z. B. aus S. Aoyama et al., FEBS Letters Bd. 242/1 (Dezember 1988), S. 36-40, und W. Kugimiya et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 141/1 (26. November 1986), S. 185-190, bekannt. Die von P. fragi gebildete Lipase unterscheidet sich jedoch von der von P. cepacia gebildeten Lipase in ihrer Aminosäuresequenz, und in diesen Veröffentlichungen gibt es keinen Hinweis darauf, daß ein oder mehrere zusätzliche Gene erforderlich sein können, um eine nennenswerte Lipasebildung in einem Wirtsorganismus zu erzielen.
EP 331 376 beschreibt eine rekombinante DNA, die für eine Pseudomonas cepacia-Lipase kodiert, sowie ein Protein, das an der Bildung der Lipase beteiligt ist. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins ist in Fig. 3B gezeigt. Es gibt jedoch keinen Hinweis darauf, daß das Gen, das für dieses Protein kodiert, auch in einem heterologen Wirtsorganismus seine Funktion erfüllen kann.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat ein Gen isoliert und kloniert, das für eine Pseudomonas cepacia-Lipase kodiert, und ein Gen identifiziert, dessen Expression wichtig ist, um die Bildung der Lipase mit nennenswerter Ausbeute zu erzielen.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Aspekt ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz, wie sie in den beigefügten Figuren 1A-C gezeigt ist, die für einen Faktor kodiert, der in trans als Modulator der Bildung einer Pseudomonas cepacia-Lipase wirkt, oder eine Modifizierung der DNA-Sequenz, die für ein funktionelles Analogon des P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktors kodiert, umfaßt, wobei der P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktor oder das funktionelle Analogon davon imstande sind, die Lipasebildung zu modulieren, wenn P. cepacia-Lipase unter Verwendung von Expressionssignalen exprimiert wird, die heterolog gegenüber Pseudomonas sind, und/oder wenn P. cepacia-Lipase in einer heterologen Wirtszelle exprimiert wird.
Im Verlauf der Forschungen, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine Region stromabwärts von der DNA-Sequenz, die für die Lipase kodiert (wie sie auf dem Chromosom von P. cepacia vorliegt), eine ausgeprägte vorteilhafte Wirkung auf die Bildung der Lipase ausübt. Es wurde experimentell bestätigt (u.a. durch Insertion dieser Region auf einem anderem Plasmid als demjenigen, das die DNA-Sequenz, die für die Lipase kodiert, trug), daß die Region nicht lediglich eine Stelle auf der DNA-Sequenz (wie einen Promotor, Terminator, Verstärker oder dergl.) darstellt, die für die Lipase-Expression erforderlich ist, sondern daß die Region ein Gen einschließt, das für einen Faktor kodiert, der imstande ist, die Bildung der Lipase zu beeinflussen, selbst wenn die DNA-Sequenzen, die für die beiden Produkte kodieren, nicht auf dem gleichen Vektor angeordnet sind. Bei dem Lipase-Modulierungsfaktor kann es sich um ein RNA-Molekül oder ein Polypeptid handeln, mit größter Wahrscheinlichkeit handelt es sich jedoch um ein Polypeptid (vgl. das nachstehende Beispiel 3).
In den nachstehenden Ausführungen wird die DNA-Sequenz, die für den Lipase-Modulierungsfaktor kodiert, normalerweise als "lim-Gen" bezeichnet, während der Modulierungsfaktor üblicherweise als "Lim-Faktor" bezeichnet wird.
Es ist überraschenderweise festgestellt worden, daß die Expression des lim-Gens eine vorteilhafte Wirkung auf die Lipasebildung ausübt, selbst wenn die Lipase unter Verwendung von Expressionssignalen exprimiert wird, die heterolog gegenüber denjenigen von Pseudomonas sind (z. B. ein Promotor, eine Ribosom-Bindungsstelle oder eine für ein Signalpeptid kodierende Region aus einem Bacillus-α-Amylase-Gen) oder wenn der Wirtsorganismus nicht Pseudomonas ist. Der Lim-Faktor wirkt also nicht auf die Initiation der Transkription oder Translation. Die genaue Funktion des Lim-Faktors muß jedoch noch aufgeklärt werden.
Der Ausdruck "funktionelles Analogon" ist so zu verstehen, daß er einen Faktor bezeichnet, der eine ähnliche, die Lipasebildung modulierende Funktion wie der P. cepacia-Lim-Faktor hat und der aus einem anderen Organismus als P. cepacia abgeleitet ist oder bei dem es sich um ein Derivat des P. cepacia-Lim-Faktors handelt, das durch Modifizierung der DNA-Sequenz in einer Weise, die zur Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren in der nativen Sequenz führt, gebildet wird. Es gibt jedoch Gründe dafür, anzunehmen, daß derartige Modifizierungen der nativen Sequenz nicht zu umfangreich sein sollten, da die Modulierungsfunktion des Lim-Faktors andernfalls verlorengeht. Daneben kann es sich bei dem funktionellen Analogon um ein homologes Polypeptid handeln (d. h. ein Polypeptid, das von einer DNA kodiert wird, die unter bestimmten festgelegten Bedingungen [z. B. vorheriges Tränken in 5 x SSC und Vorhybridisierung für 1 Stunde bei etwa 40ºC in einer Lösung mit 20 % Formamid, 5 x Denhardt-Lösung, 50 millimolar Natriumphosphat, pH-Wert: 6,8, und 50 ug denaturierter, beschallter Kalbsthymus-DNA, gefolgt von einer Hybridisierung in der gleichen Lösung, die mit 100 mikromolar ATP angereichert ist, für 18 Stunden bei ungefähr 40ºC] mit der gleichen Sonde hybridisiert wie die DNA, die für den Lim-Faktor kodiert,) oder um ein Polypeptid, das mit Antikörpern reagiert, die gegen den Lim-Faktor erzeugt wurden oder gerichtet sind. Wenn der Ausdruck "Lim-Faktor" in der nachstehenden Beschreibung verwendet wird, dann soll dies implizit sowohl derartige funktionelle Analoga als auch den nativen P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktor einschließen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt, das die DNA-Sequenz umfaßt, die für den Lim-Faktor kodiert, kann genomischen Ursprungs oder cDNA-Ursprungs sein; z. B. kann es durch Herstellung einer genomischen oder einer cDNA-Bibliothek von P. cepacia und Absuchen auf DNA-Sequenzen, die für den gesamten Lim-Faktor oder einen Teil davon kodieren, durch Hybridisierung unter Verwendung synthetischer Oligonucleotid-Sonden gemäß Standardtechniken (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) erhalten werden.
Bei der DNA-Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert, kann es sich um eine beliebige Sequenz handeln, die aus einem Lipase bildenden P. cepacia-Stamm erhalten wurde. Beispiele für derartige Stämme sind die Stämme, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen im Zusammenhang mit der Erfindung, die in EP 214 761 beschrieben ist, unter den Hinterlegungsnummern DSM 3333-3337 und DSM 3401 hinterlegt wurden, sowie um den Stamm, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen im Zusammenhang mit der Erfindung, die in WO 89/01032 beschrieben ist, unter der Hinterlegungsnummer DSM 3959 hinterlegt wurde. Es wird jedoch in Betracht gezogen, daß eine DNA-Sequenz, die zu dem lim-Gen äquivalent ist, auch aus anderen Lipasen bildenden Organismen abgeleitet werden kann. Ein derartiges Gen kann durch Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die an DNA hybridisieren, die für den Lim-Faktor kodiert, wie sie vorstehend beschrieben wurden, abgesucht oder durch Reaktivität des Genprodukts gegenüber den gleichen Antikörpern wie der Lim-Faktor ausgewählt oder durch Absuchen auf die Fähigkeit, eine Lipasebildung in Stämmen zu ermöglichen, die das Lipase-Gen, nicht jedoch das lim-Gen enthalten, identifiziert werden.
Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt, das für den Lim-Faktor kodiert, kann auch synthetisch nach eingeführten Standardverfahren hergestellt werden, z. B. nach der Phosphoamidit-Methode, die von S. L. Beaucage und M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, Bd. 22 (1981), S. 1859-1869, beschrieben wird, oder nach der Methode, die von Matthes et al., EMBO Journal, Bd. 3 (1984), S. 801-805, beschrieben wird. Gemäß der Phosphoamidit- Methode werden Oligonucleotide z. B. in einem DNA-Syntheseautomaten synthetisiert, gereinigt, ligiert und in einen geeigneten Vektor kloniert.
Schließlich kann das DNA-Konstrukt teilweise synthetischen und teilweise genomischen Ursprungs, teilweise synthetischen und teilweise cDNA- Ursprungs oder teilweise genomischen und teilweise cDNA-Ursprungs sein, wobei es gemäß Standardtechniken durch Ligation von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (was geeignet ist) hergestellt wird und die Fragmente verschiedenen Teilen des gesamten DNA-Konstrukts entsprechen.
Bei bevorzugten DNA-Konstrukten, die für den Lim-Faktor kodieren, handelt es sich um DNA-Konstrukte, die eine DNA-Sequenz umfassen, die aus dem Chromosom von P. cepacia abgeleitet ist, und insbesondere um diejenigen DNA-Konstrukte, bei denen die DNA-Sequenz sich auf dem P. cepacia- Chromosom stromabwärts von der Sequenz, die für eine Lipase von ungefähr 33 kD kodiert, befindet.
Beispiele für geeignete Modifizierungen der DNA-Sequenz sind Nucleotidsubstitutionen, die nicht zu einer anderen Sequenz des Lim-Faktors führen, die jedoch der Codonnutzung des Wirtsorganismus entsprechen, in den das DNA-Konstrukt eingeführt wird, oder Nucleotidsubstitutionen, die zu einer unterschiedlichen Sequenz und daher möglicherweise zu einer unterschiedlichen Struktur führen, ohne jedoch die Eigenschaften der Lipase oder des Lim-Faktors zu beeinträchtigen. Weitere Beispiele für mögliche Modifizierungen sind die Insertion eines oder mehrerer Nucleotide in die Sequenz, die Addition eines oder mehrerer Nucleotide an einem der Enden der Sequenz und die Deletion eines oder mehrerer Nucleotide von einem der Enden der Sequenz oder innerhalb der Sequenz.
In einigen Fällen kann es zweckmäßig sein, eine DNA-Sequenz, die für eine Pseudomonas cepacia-Lipase kodiert, auf dem gleichen DNA-Konstrukt bereitzustellen wie die DNA-Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft also ferner ein DNA-Konstrukt, das eine erste DNA-Sequenz, die für eine P. cepacia-Lipase oder ein Derivat davon kodiert, und eine zweite DNA-Sequenz, die für den P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktor kodiert, umfaßt.
In diesem Zusammenhang soll der Ausdruck "Derivat" ein Protein mit einer lipolytischen Aktivität bezeichnen, das von der nativen Lipase durch geeignete Modifizierung der DNA-Sequenz, die für die native Lipase kodiert, abgeleitet ist, was zu einer Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an den C-Terminus und/oder den N-Terminus des nativen Proteins, einer Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder einer Anzahl verschiedener Stellen der nativen Aminosäuresequenz, einer Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren an einem oder beiden Enden des nativen Proteins oder an einer oder mehreren Stellen der Aminosäuresequenz oder einer Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen der nativen Aminosäuresequenz führt. Derartige Modifizierungen von DNA, die für native Proteine kodiert, sind bekannt und werden in diesem Fachgebiet allgemein angewandt.
Bei den bevorzugten DNA-Konstrukten, die für die P. cepacia-Lipase kodieren, handelt es sich um diejenigen Konstrukte, die eine DNA-Sequenz, die von P. cepacia DSM 3959 abgeleitet ist, für eine Lipase von ungefähr 33 kD kodiert und in der Natur auf dem Chromosom von P. cepacia vorhanden ist, umfassen. Bei einem besonders bevorzugten DNA-Konstrukt, das für die Lipase kodiert, handelt es sich um das DNA-Konstrukt, bei dem die DNA-Sequenz, die für die Lipase kodiert, der in den beigefügten Figuren 2A-C gezeigten Sequenz oder einer Modifizierung davon, die für ein Derivat der vorstehend definierten P. cepacia-Lipase kodiert, entspricht.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts befindet sich die Lipase-DNA-Sequenz stromaufwärts von der Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert, und gemäß einer weiteren Ausführungsform befindet sich die für die Lipase kodierende DNA-Sequenz stromabwärts von der Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert. In jedem Fall können die DNA-Sequenzen relativ zueinander auf eine solche Weise angeordnet sein, daß sie vom gleichen Promotor unter Bedingungen, die die Expression der Lipase und des Lim-Faktors erlauben, transkribiert werden, wenn das DNA-Konstrukt in einer Wirtszelle vorhanden ist. Gemäß einer speziellen Ausführungsform können die erste DNA-Sequenz, die für die Lipase kodiert, und/oder die zweite DNA-Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert, ferner Expressionssignale (z. B. einen Promotor, eine Ribosom-Bindungsstelle und/oder eine für ein Signalpeptid kodierende Sequenz) umfassen, die heterolog gegenüber denjenigen von Pseudomonas sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen replizierbaren Expressionsvektor, der eine inserierte DNA-Sequenz trägt, die für den Lim-Faktor oder ein funktionelles Analogon davon kodiert, wie es vorstehend beschrieben wurde.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen replizierbaren Expressionsvektor, der eine erste inserierte DNA-Sequenz, die für die P. cepacia-Lipase oder ein Derivat davon (wie vorstehend beschrieben) kodiert, und eine zweite DNA-Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert (wie vorstehend beschrieben), trägt. In diesem Fall können die erste und die zweite DNA-Sequenz vom gleichen Promotor exprimiert werden, wobei dies jedoch nicht erforderlich ist. Wenn die erste und die zweite DNA-Sequenz vom gleichen Promotor exprimiert werden, dann kann sich die Lipase-kodierende Sequenz stromabwärts oder stromaufwärts von der Lim-kodierenden Sequenz befinden, ohne die Modulierung der Lipasebildung durch den Lim-Faktor zu beeinträchtigen.
Alternativ dazu können die DNA-Sequenzen, die für die Lipase bzw. das Lim-Polypeptid kodieren, jeweils von einem getrennten Promotor exprimiert werden, selbst wenn sie vom gleichen Vektor getragen werden.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform umfassen die erste DNA-Sequenz, die für die Lipase kodiert, und/oder die zweite DNA-Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert, Expressionssignale (z. B. einen Promotor, eine Ribosom-Bindungsstelle und/oder eine für ein Signalpeptid kodierende Sequenz), die heterolog gegenüber denjenigen vom Pseudomonas sind.
Bei dem replizierbaren Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz trägt, die für die Lipase und/oder den Lim-Faktor kodiert, kann es sich um einen beliebigen Vektor handeln, der zur autonomen Replikation in einem gegebenen Wirtsorganismus imstande ist, typischerweise ein Plasmid oder ein Bacteriophage. In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, die für die Lipase und/oder den Lim-Faktor kodiert, funktionell mit einer geeigneten Promotorsequenz verknüpft sein. Bei dem Promotor kann es sich um eine beliebige DNA-Sequenz handeln, die eine transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle zeigt, und sie kann aus Genen abgeleitet sein, die für Proteine kodieren, die in bezug auf den Wirtsorganismus homolog oder heterolog sind, z. B. ein Promotor, der heterolog gegenüber Pseudomonas ist. Der Promotor ist vorzugsweise von einem Gen abgeleitet, das für ein Protein kodiert, das homolog gegenüber dem Wirtsorganismus ist. Beispiele geeigneter Promotoren sind lac von E. coli, dagA von Streptomyces coelicolor und amyL von Bacillus licheniformis.
Der erfindungsgemäße replizierbare Expressionsvektor umfaßt eine DNA- Sequenz, die dem Vektor eine Replikation in der Wirtszelle ermöglicht. Beispiele für derartige Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110 und pIJ702.
Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. ein Gen, das eine Antibiotikaresistenz verleiht, wie eine Ampicillln-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclin-Resistenz, oder die dal-Gene von B. subtilis oder B. licheniformis.
Die Verfahren, die zur Ligation der DNA-Sequenzen, die für die Lipase und/oder den Lim-Faktor kodieren, und des Promotors sowie zur Insertion in geeignete Vektoren, die die Informationen enthalten, die für die Replikation in der Wirtszelle erforderlich sind, angewandt werden, sind dem Fachmann bekannt (vgl. z. B. Sambrook et al., a.a.O.). Es ist darauf hinzuweisen, daß der Vektor konstruiert werden kann, indem zuerst ein DNA- Konstrukt hergestellt wird, das die gesamte DNA-Sequenz, die für die Lipase und für den Lim-Faktor kodiert, enthält, und dieses Konstrukt sodann in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert wird, oder indem getrennte DNA-Konstrukte hergestellt werden, die DNA-Sequenzen umfassen, die für die Lipase bzw. den Lim-Faktor kodieren, oder indem sequentiell DNA-Fragmente, die genetische Informationen für einzelne Elemente (wie die Lipase oder den Lim-Faktor) enthalten, inseriert und anschließend nach jedem Schritt ligiert werden. Es ist in diesem Zusammenhang ferner darauf hinzuweisen, daß die DNA-Sequenz, die für die Lipase kodiert, genomischen Ursprungs sein kann, während die Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert, synthetisch hergestellt werden kann, und umgekehrt, wie es vorstehend beschrieben wurde.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, die entweder zwei getrennte DNA-Konstrukte, die eine DNA-Sequenz, die fur P. cepacia-Lipase kodiert, und eine DNA-Sequenz, die für den Lim-Faktor, wie er vorstehend definiert wurde, kodiert, umfassen, oder ein DNA-Konstrukt, das beide DNA-Sequenzen im gleichen Fragment umfaßt, enthält; in jedem Fall können die DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom integriert sein, was einen Vorteil darstellen kann, da die DNA-Sequenzen mit größerer Wahrscheinlichkeit stabil in der Wirtszelle erhalten werden. Die Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann gemäß herkömmlichen Verfahren, z. B. durch homologe Rekombination, durchgeführt werden. Die beiden DNA-Sequenzen können in das Wirtschromosom in einer solchen Weise integriert werden, daß sie jeweils von einem getrennten Promotor exprimiert werden. Gemäß einer speziellen Ausführungsform können die DNA-Sequenz, die für die Lipase kodiert, und/oder die DNA-Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert, ferner Expressionssignale (z. B. einen Promotor, eine Ribosom-Bindungsstelle und/oder eine für ein Signalpeptid kodierende Sequenz) enthalten, die gegenüber denjenigen von Pseudomonas heterolog sind.
Alternativ kann die Wirtszelle mit einem replizierbaren Expressionsvektor transformiert werden, der beide DNA-Sequenzen enthält, oder mit zwei Vektoren, die die DNA-Sequenz, die für die Lipase kodiert, und die DNA-Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert, enthalten.
Als eine weitere Alternative kann die DNA-Sequenz, die für die Lipase kodiert, in das Wirtschromosom integriert werden, und die DNA-Sequenz, die für den Lim-Faktor kodiert, kann von einem replizierbaren Expressionsvektor getragen werden (wie vorstehend beschrieben), oder umgekehrt.
Bei der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Wirtszelle kann es sich um ein beliebiges geeignetes Bakterium, eine beliebige geeignete Hefe oder einen beliebigen geeigneten filamentösen Pilz handeln, die bei der Kultivierung große Mengen von P. cepacia-Lipase bilden. Beispiele für geeignete Bakterien sind grampositive Bakterien, wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gramnegative Bakterien, wie E. coli. Die Transformation der Bakterien kann z. B. durch Protoplastentransformation oder unter Verwendung kompetenter Zellen in einer als solches bekannten Weise erfolgen.
Der Hefeorganismus wird in günstiger Weise unter Spezies von Saccharomyces ausgewählt, z. B. Saccharomyces cerevisiae. Der filamentöse Pilz gehört in vorteilhafter Weise zu einer Spezies von Aspergillus, z. B. Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger. Pilzzellen können nach einem Verfahren transformiert werden, das eine Protoplastenbildung und die Transformation der Protoplasten bei anschließender Regenerierung der Zellwand in einer als solches bekannten Weise beinhaltet. Die Verwendung von Aspergillus als Wirtsorganismus wird z. B. in EP 238 023 beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von P. cepacia-Lipase oder einem Derivat davon, wobei das Verfahren die Kultivierung einer Wirtszelle, wie sie vorstehend beschrieben wurde, unter Bedingungen, die zur Bildung der Lipase oder des Analogons davon führen (unter Einschluß von Bedingungen, die die Expression des Lim-Faktor sicherstellen), und die Gewinnung der Lipase oder des Analogons aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium umfaßt.
Bei dem für die Kultivierung der Zellen verwendete Medium kann es sich um ein beliebiges herkömmliches Medium, das sich zum Züchten von Bakterien eignet, handeln. Die Lipase kann aus dem Medium nach herkömmlichen Verfahren unter Einschluß der Abtrennung der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, der Fällung proteinhaltiger Komponenten aus dem Überstand oder dem Filtrat nach gegebenenfalls erfolgtem Aufbrechen der Zellen mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt von einer Reinigung nach einer Reihe von chromatographischen Verfahren, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergl., erfolgen.
Die Erfindung wird weiter durch die nachstehenden Beispiele, die jedoch in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung beschränken sollen, mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung erläutert, worin
Fig. 1 A-C die DNA-Sequenz des P. cepacia-lim-Gens zeigt, wobei die abgeleitete Aminosäuresequenz darunter im üblichen Drei-Buchstaben-Code gezeigt ist,
Fig. 2 A-C die DNA-Sequenz zeigt, die für die P. cepacia-Lipase von ungefähr 33 kD kodiert, wobei die abgeleitete Aminosäuresequenz darunter im üblichen Drei-Buchstaben-Code gezeigt ist,
Fig. 3 schematisch die Konstruktion des Plasmids pSJ518 zeigt,
Fig. 4 schematisch die Konstruktion des Plasmids pSJ910 zeigt,
Fig. 5 schematisch die Konstruktion des Plasmids pSJ485 zeigt,
Fig. 6 A-B schematisch die Konstruktion der Plasmide pSJ622 und pSJ624 zeigt,
Fig. 7 schematisch die Konstruktion des Plasmids pSJ424 zeigt,
Fig. 8 schematisch die Konstruktion der Plasmide pSJ494 und 90g zeigt,
Fig. 9 schematisch die Konstruktion des Plasmids pSJ729 zeigt,
Fig. 10 schematisch die Konstruktion des Plasmids pSJ416 zeigt,
Fig. 11 schematisch die Konstruktion des Plasmids pSJ600 zeigt,
Fig. 12 schematisch die Konstruktion des Plasmids pSJ671 zeigt, und
Fig. 13 A-B schematisch die Konstruktion des Plasmids pSJ669 zeigt.

Materialien und Methoden

Bakterienstämme:

E. coli HW1 ist ein lacIq, z M15-Derivat des Stamms 803, der von Wood (1966) beschrieben wird.
E. coli NM539 wird in Frischauf et al., 1983, beschrieben, und wurde von Promega erhalten.
Pseudomonas cepacia SB10 (DSM 3959) wird in WO 89/01032 beschrieben.
Bacillus subtilis DN1885 ist ein amyE, amyR2, Spo&spplus;, Pro&spplus;-Derivat von B. subtilis 168.
Bacillus licheniformis ATCC 9789.
Streptomyces lividans TK24 wird in Hopwood et al. (1983) beschrieben.

Phagen:

Lambda EMBL4 wird in Frischauf et al. (1983) beschrieben. Er wurde von Promega erhalten.

Plasmide:

pUC18 und pUC19 werden in Yanisch-Perron et al. (1985) beschrieben.
pACYC177 wird in Chang und Cohen (1978) beschrieben.
pIJ702 wird in Katz et al. (1983) beschrieben.
pIJ4642 ist ein E. coli-Klonierungsvektor, der eine positive Selektion auf Inserts erlaubt. Er ähnelt pIJ666 (Kieser und Melton, Gene, Bd. 65 (1988), S. 83-91), weist jedoch nützlichere Stellen für die Klonierung auf. Er wurde von T. Kieser erhalten.
pDN1528 ist ein Derivat des B. subtilis-Plasmids pUB110 (Gryczan et al., 1978) und trägt ein 2,3 kb umfassendes HindIII-SphI-Fragment, das das α-Amylase-Gen des B. licheniformis-Stamms DN52, eines Amylase-überproduzierenden Derivats von ATCC 9789, das durch herkömmliche Mutageneseverfahren hergestellt wurde, enthält.
pPL1131 ist ein von pUB110 abgeleitetes Plasmid, das den Amylase-Promotor und die für das Signalpeptid kodierende Region von pDN1528, gefolgt von einem synthetischen Linker, enthält.
pIJ2002 ist ein pUC18-Derivat, das das dagA (Agarase)-Gen von S. coelicolor A3 (2) enthält. Es wird in Buttner et al. (1987) beschrieben und wurde von M. Bibb erhalten.

Allgemeine Methoden:

DNA-Standardmanipulationen wurden im wesentlichen durchgeführt, wie es in Maniatis et al. (1982) beschrieben wird.
Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase, T4-Polynucleotid-Kinase, DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Exonuclease III wurden von New England Biolabs erhalten und verwendet, wie es von der Bezugsfirma empfohlen wurde. Nuclease S1 und das Restriktionsenzym HindII wurden von Boehringer Mannheim erhalten und verwendet, wie es von der Bezugsfirma empfohlen wurde. Hühnereiweißlysozym wurde von Sigma erhalten.
Die Herstellung von Plasmiden aus allen Stämmen wurde nach der Methode durchgeführt, die von Kieser (1984) beschrieben wurde.
Lambda-DNA wurde in vitro unter Verwendung des "Packagene-Extrakts" von Promega verpackt.
Die DNA-Sequenzierung wurde nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) unter Verwendung von ³&sup5;SdATP (DuPont NEN NEG034H, > 1000 Ci/mMol) als radioaktiver Markierung und unter Verwendung denaturierter Plasmid-DNAs als Matrizen durchgeführt. Die Sequenzierung wurde entweder durchgeführt, wie es Hattori und Sakaki (1986) beschrieben wird, und zwar unter Verwendung des Klenow-Fragments, oder mittels von Sequenase , wie es in der Broschüre von der Bezugsfirma (United States Biochemical Corporation) beschrieben wird. Bei den Primern handelte es sich entweder um die M13-Sequenzier- und reversen Sequenzier-Primer von New England Biolabs oder Oligonucleotide (17-21-Mere), die komplementär zu Regionen der klonierten Pseudomonas-DNA waren und vom Erfinder der vorliegenden Anmeldung hergestellt wurden.

Transformation von E. coli:

Zellen von E. coli wurden kompetent gemacht und transformiert, wie es von Mandel und Higa (1970) beschrieben wird.

Transformation von B. subtilis:

Kompetente Zellen wurden hergestellt und transformiert, wie es von Yasbin et al. (1975) beschrieben wird.

Transformation von B. licheniformis:

Plasmide wurden in B. licheniformis durch Polyethylenglykol-vermittelte Protoplastentransformation eingeführt, wie es von Akamatzu (1984) beschrieben wird.

Transformation von S. lividans:

Transformation und weitere Verfahren für Streptomyces entsprachen denjenigen, die in Hopwood et al. (1985) beschrieben sind.

Oligonucleotidsynthese:

Die Synthese wurde mit einem DNA-Syntheseautomaten unter Anwendung der Phosphoamidit-Methode durchgeführt, wie es von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters, Bd. 22 (1981), S. 1859-1869, beschrieben wird. Rohe Oligonucleotide wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt.

Herstellung von Phagen-DNA:

Phage lambda-DNA wurde aus flüssigen Kulturen in kleinem Maßstab hergestellt, wie es in Maniatis et al. (1982) beschrieben ist.

Exo III-Deletionen:

Unidirektionale Deletionen wurden unter Verwendung von Exonuclease III durchgeführt, wie es von Henikoff (1984) beschrieben wird.

Analyse der Lipase

Die Lipase wurde bei einer bei konstantem pH-Wert arbeitenden Methode ("ph-stat method") unter Verwendung von Tributyrin als Substrat vermessen. 1 LU (Lipase-Einheit) entspricht der Menge an Enzym, die 1 uMol titrierbare Buttersäure pro Minute unter den folgenden Bedingungen freisetzt:
Temperatur: 30,0ºC
pH-Wert: 7,0
Emulgator: Gummi arabicum, 1 g/l
Substrat: Tributyrin, 50 ml/l

Medien:

TY: Trypticase 20 g/l
Hefeextrakt 5 g/l
FeCl&sub2; 4H&sub2;O 6 mg/l
MnCl&sub2;.4H&sub2;O 1 mg/l
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 15 mg/l
pH-Wert: 7,3
BPX: Kartoffelstärke 100 g/l
Gerstenmehl 50 g/l
BAN 5000 SKB 0,1 g/l
Natriumcaseinat 10 g/l
Sojabohnenmehl 20 g/l
Na&sub2;HPO&sub4;, 12 H&sub2;O 9 g/l
Pluronic 0,1 g/l
LB-Agar: Bactotrypton 10 g/l
Bacto-Hefeextrakt 5 g/l
NaCl 10 g/l
Bactoagar 15 g/l
auf einen pH-Wert von 7,5 mit NaOH eingestellt

LB-Agar mit Tributyrin:

Zu 350 ml geschmolzenem LB-Agar werden 3,5 ml Tributyrin und 0,35 g Gummi arabicum gegeben, das Gemisch wird unter Verwendung eines Ultra- Turrax-Emulgators emulgiert und anschließend autoklaviert.

Nilblau-Indikatorplatten:

Die Bodenschicht bestand aus 15 ml LB-Agar.
Die obere Schicht enthielt ein Gemisch aus 3 ml Weichagar (LB mit 0,6 % Agar), 300 ul Olivenölemulsion und 20 ul einer 5 %-igen Nilblau-Lösung (mit Wasser aufgefüllt und steril filtriert).

Olivenölemulsion:

Olivenöl 10 ml
Gummi arabicum 1 g
entionisiertes Wasser 90 ml
Gemischt unter Verwendung eines Ultra-Turrax-Emulgators.

Puffer:

TE-Puffer: 10 millimolar Tris, pH-Wert: 8,
1 millimolar EDTA, pH-Wert: 8.
Phagen-Puffer: 0,01 m NaCl
0,01 m MgCl&sub2;
0,01 m Tris HCl, pH-Wert: 7,0
Ligationspuffer: 0,066 m Tris HCl, pH-Wert: 7,5,
0,01 m MgCl&sub2;, 25 ug/ml Gelatine,
0,001 m ATP, 0,01 m DTT.

Beispiel 1

Klonierung des Pseudomonas cepacia-Lipase-Gens

A) Herstellung von chromosomaler DNA aus Pseudomonas cepacia SB10

Ein Pellet von gefrorenen Zellen aus einer 3 ml-TY-Kultur wurde in 1 ml TE-Puffer mit einem Gehalt an 1 mg/ml Lysozym resuspendiert. 0,1 ml EDTA (0,5 m, pH-Wert: 8,0) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC unter leichtem Schütteln inkubiert. 5 ul 20 % SDS wurden zugegeben, und die Lösung wurde wiederholt mit Phenol (Portionen von 300 ul) extrahiert, bis keine Grenzfläche mehr vorhanden war. Der Überstand wurde anschließend einmal mit CFCl&sub3; (300 ul) extrahiert. Zu 900 ul Überstand wurden 90 ul 3 m Natriumacetat und 500 ul Isopropanol gegeben. Nach 5 bis 10 Minuten wurde die ausgefällte DNA auf eine Animpfschleife aus Kunststoff gewonnen, mit 70 und 96 % EtOH gewaschen und in 500 ul TE resuspendiert. Die Lösung von chromosomaler DNA (chrDNA) wurde bei -20ºC gehalten.

B) Teilweises Schneiden und Fraktionierung von chrDNA aus P. cepacia

80 ug chrDNA aus P. cepacia SB10 (hergestellt, wie es im vorstehenden Abschnitt A beschrieben wurde) wurden mit 5 Einheiten Sau3A 5 Minuten bei 37ºC in 400 ul des von der Bezugsfirma empfohlenen Puffers verdaut und 10 Minuten auf 70ºC erwärmt. Die gesamte Probe wurde anschließend auf ein präparatives Agarosegel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurden die Gelsegmente, die DNA-Fragmente von 9 bis 23 kb enthielten, ausgeschnitten. Die Fragmente der chromosomalen DNA wurden in der Flüssigkeit, die sich nach dem Einfrieren/Auftauen der Gelsegmente bildete, aufgefangen, 2 mal mit Phenol und einmal mit CHCl&sub3; extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TE-Puffer gelöst.

C) Konstruktion einer P. cepacia-DNA-Bibliothek im Phagen lambda

2 ug Lambda-EMBL4-DNA wurden vollständig mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI verdaut, 2 mal mit Phenol und einmal mit CHCl&sub3; extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 10 ul TE resuspendiert. Die Suspension wurde mit 2,5 ug größenfraktionierter chrDNA (in 50 ul TE) gemischt, mit Ethanol gefällt, in 10 ul Ligationspuffer resuspendiert, mit 100 Einheiten T4-DNA-Ligase versetzt, und die Ligation wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur und anschließend 16 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Die ligierte DNA wurde dann in Lambda-Phagenpartikel unten Verwendung des Packagene -Extrakts von Promega gepackt, in 500 ul Phagenpuffer verdünnt, und 50 ul CHCl&sub3; wurden zugegeben. Dieses Gemisch wurde zur Herstellung einer amplifizierten Phagenstammlösung wie folgt verwendet: Gepackte Phagenpartikel wurden mit einem gleichen Volumen an einer frischen, über Nacht in TY + 0,4 % Maltose + 20 millimolar MgSO&sub4; gezüchteten Kultur von E. coli NM539 gemischt; man ließ sie 20 Minuten bei 37ºC adsorbieren und plattierte auf frische LB-Platten in 4 ml LB-Weichagar (0,6 %) mit einem Gehalt an 20 millimolar MgSO&sub4;. Nach 16-stündiger Inkubation bei 37ºC wurde die teilweise lysierte obere Schicht, die etwa 2500 Plaques enthielt, abgeschabt und in ein 40 ml fassendes Zentrifugenröhrchen, das 5 ml Phagenpuffer enthielt, gegeben. Die Phagen wurden 2 Stunden eluiert. Der Überstand nach der Zentrifugation bei 5000 U/min für 5 Minuten in einem Sorvall SS34-Rotor wurde als amplifizierte Stammlösung aufbewahrt und zum Absuchen verwendet.

D) Isolierung eines rekombinanten Lambda-Phagen, der ein Lipase-Gen trägt

Etwa 200 000 Phagen aus der amplifizierten Bibliothek wurden an NM539 adsorbiert und auf 20 LB-Platten in Weichagar mit einem Gehalt an 1 % Glycerintributyrat-Emulsion plattiert, was zu einer vollständigen Lyse auf jeder Platte führte. 170 klare Plaques (die Tributyrin hydrolysierten) wurden in der trüben Tributyrinemulsion identifiziert, und eine Anzahl wurde erneut isoliert. 35 Plaques wurden auf Nilblau-Indikatorplatten ausgestrichen, und 10 davon ergaben eine positive Reaktion, d. h. eine starke Blaufärbung. Phagen-DNA wurde aus drei dieser Plaques isoliert, und es wurde auf der Basis von Untersuchungen durch Restriktionsenzymverdau festgestellt, daß sie identisch waren.

E) Subklonierung in pUC19

1 ug der in Abschnitt D hergestellten Phagen-DNA wurde teilweise mit SalI geschnitten, mit 0,3 ug pUC19, das mit SalI verdaut worden war, gemischt, ligiert, in kompetente E. coli-HW1-Zellen transformiert und auf LB-Platten mit einem Gehalt an 200 ug/ml Ampicillin plattiert. Diese Platten wurden auf LB-Platten mit 200 ug/ml Ampicillin und 1 % Glycerintributyrat-Emulsion repliziert, und von klaren Höfen umgebene Kolonien wurden isoliert. Von einer dieser Kolonien, nämlich SJ150, wurde gezeigt, daß sie ein Plasmid von ungefähr 6 kb enthielt, das als pSJ150 bezeichnet wurde und das für Lipase kodierende Gen und das Lipase-Modulierungsgen (lim-Gen) enthielt.

F) DNA-Sequenzierung

Die Sequenz des größten Teils der klonierten DNA, die in pSJ150 enthalten war, wurde nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode direkt mit doppelsträngigen Matrizen bestimmt, wie es vorstehend unter Materialien und Methoden beschrieben wurde. Die Sequenzen beider Stränge wurden bestimmt, und zwar unter Anwendung einer Kombination aus Subklonieren von Restriktionsfragmenten, Deletionen von beiden Enden der klonierten DNA unter Verwendung von Exonuclease III und synthetischen Oligonucleotidprimern. Dies ermöglichte die Identifizierung der für Lipase kodierenden Sequenz, die in Fig. 2A-C gezeigt ist, und der für den Lipasemodulator kodierenden Sequenz (lim), die in Fig. 1A-C gezeigt ist. In pSJ150 trennt die Sequenz TCG das Lipasemodulator-Startcodon, (ATG) vom Lipase-Stopcodon (TAA).

Beispiel 2

Expression der Pseudomonas cepacia-Lipase

A. Expression der nicht-miodifizierten Lipase in E. coli

(1) lip ohne lim

Das Plasmid pSJ518 wurde durch Subklonieren des 1,5 kb umfassenden HindIII-ClaI-Fragments, das das Lipase-Gen (lip) aus pSJ150 enthielt, in pUC19 konstruiert, wie es in Fig. 3 gezeigt ist. Der Stamm SJ518 (E. coli HW1, enthaltend pSJ518) bildet keinerlei Lipase, wie auf Platten zu erkennen ist, die 1 % Glycerintributyrat enthalten (d. h. keine Höfe um die Kolonien).

(2) lip + lim im gleichen Plasmid

In pSJ150 wird die Lipase sowohl von ihrem eigenen als auch vom pUC19-lac-Promotor exprimiert. Das Plasmid pSJ910, das das gleiche Fragment an klonierter DNA, jedoch in umgekehrter Orientierung in bezug auf den lac-Promotor enthält, wurde konstruiert, wie es in Fig. 4 skizziert ist, und in E. coli HW1 eingeführt, um den Stamm SJ910 zu bilden. Bei Plattierung auf Platten mit einem Gehalt an 1 % Glycerintributyrat waren SJ910 Kolonien von kleineren Höfen als Kolonien von SJ150 umgeben. Dies weist auf das Vorhandensein eines Promotors, der in E. coli aktiv ist, für das lip- und das lim-Gen hin.
Die Region zwischen dem lip- und dem lim-Gen kann verändert werden, ohne die Lipase-Expression zu beeinträchtigen. pSJ150 enthält eine einzige ClaI-Stelle ein Basenpaar nach dem Lipase-Stopcodon. Das Plasmid pSJ485 wurde durch Insertion eines 8 Basenpaare umfassenden BglII-Linkers (New England Biolabs) in diese ClaI-Stelle konstruiert, die unter Verwendung des großen Fragments von DNA-Polymerase I (Klenow-fragment) und dNTPs aufgefüllt worden war, wobei man auf diese Weise eine 10 Basenpaare umfassende Insertion erhielt (Fig. 5). Der Stamm SJ485 (E. coli HW1, enthaltend pSH485) bildete die gleichen Mengen an Lipase wie SJ150.

(3) lip und lim auf getrennten Plasmiden

Das lim-Gen wurde auf einem 1,2 kb umfassenden SphI-Fragment aus pSJ150 ausgeschnitten und in die SphI-Stelle von pUC19 inseriert. Dies führte zu den Plasmiden pSJ377 mit dem lac-Promotor korrekt in Leserichtung des lim-Gens und pSJ378 mit dem lac-Promotor in Rückwärtsrichtung, bezogen auf die Leserichtung des lim-Gens. Aus pSJ377 und pSJ378 konnte das 1,2 kb umfassende Insert + der lac-Promotor als ein 1,5 kb umfassendes PvuII-Fragment ausgeschnitten werden. Dieses Fragment wurde in die HindII-Stelle von pACYC177 inseriert, wobei man pSJ622 (Insert aus pSJ377) und pSJ624 (Insert aus pSJ378) erhielt. Die Konstruktion von pSJ622 und pSJ624 ist in Fig. 6 skizziert.
Die Plasmide pSJ622 und pSJ624 wurden in kompetente SJ518 (der Stamm, der pSJ518 allein mit dem Lipase-Gen enthielt) eingeführt. Es erfolgte eine Selektion auf Ampicillin- und Kanamycin-Resistenz, und die Transformanten wurden auf Platten mit einem Gehalt an Glycerintributyrat repliziert. Große Höfe bildeten sich um Transformanten, die pSJ622 enthielten, jedoch keine um Transformanten, die pSJ624 enthielten, was auf eine Lipasebildung ausgehend vom erstgenannten, nicht jedoch vom letztgenannten Plasmid hinweist.

B. Expression eines modifizierten Lipase-Gens in E. coli

(1) lip ohne lim

pSJ494 ist ein Expressionsplasmid für P. cepacia-Lipase in Bacillus. Es weist den Promotor, die Ribosom-Bindungsstelle und die für ein Signalpeptid kodierende Region aus dem B. licheniformis-α-Amylase-Gen im Rahmen fusioniert mit DNA, die für die reife Lipase kodiert, jedoch nicht das lim-Gen enthält, auf. Die Konstruktion von pSJ494 ist in Figuren 7 und 8 skizziert. Die Sequenz der Fusionsregion lautet wie folgt: α-Amylase-Signalpeptid reife Lipase-Sequenz
Um dieses α-Amylase/Lipase-Fusionsgen in E. coli einzuführen, wurde das Plasmid pSJ909 (Fig. 8) konstruiert. Der Stamm SJ909 (E. coli HW1, enthaltend pSJ909) bildet keinerlei Höfe auf Platten, die Glycerintributyrat enthalten.

(2) lip und lim auf getrennten Plasmiden

Der Stamm SJ909 wurde kompetent gemacht und entweder mit pSJ377 (konstruiert, wie es in Fig. 6 gezeigt ist) oder mit pSJ729, das von pSJ377 durch Deletion von etwa 600 Basenpaaren vom 5'-Terminus des lim- Gens abgeleitet ist (Fig. 9), transformiert. Wenn die Doppeltransformanten auf Platten ausgestrichen wurden, die Glycerintributyrat enthielten, dann bildeten sich bei denjenigen, die pSJ377 (das lim&spplus;-Plasmid) enthielten, klare Höfe um die Kolonien, was auf eine Lipasebildung hinweist, während sich bei denjenigen, die pSJ729 (lim&supmin;) enthielten, keine Höfe bildeten.

C. Expression eines modifizierten Lipase-Gens in B. subtilis

(1) lip ohne lim

Die Plasmide pSJ493 und pSJ495 waren identisch zu pSJ494, das in Abschnitt B.1 beschrieben wurde; sie trugen das Amylase-Lipase-Fusionsgen, nicht jedoch das lim-Gen. Sie wurden in den B. subtilis-Stamm DN1885 eingeführt, und Transformanten wurden 4 Tage bei 37ºC in Schüttelkolben mit einem Gehalt an BPX-Züchtungsmedium bei Zugabe von Oleylalkohol (30 g/l) und Chloramphenicol (12 ug/ml) gezüchtet.
Die Lipase-Aktivität in der Kulturbrühe wurde nach der titrimetrischen LU-Methode (beschrieben in Materialien und Methoden) bestimmt, und sie betrug 1 bis 2 LU/ml. Dieser Wert liegt nicht über dem Hintergrundspiegel, der für den Stamm DN1885 festgestellt wird und zwischen 0 und 5 LU/ml variiert.

(2) lip und lim auf dem gleichen Plasmid

Das Plasmid pSJ416 enthält das gleiche Amylase-Lipase-Fusionsgen wie pSJ493-495, dem Lipase-Gen folgt jedoch unmittelbar stromabwärts das lim- Gen in exakt der gleichen Weise wie auf pSJ150 (die Konstruktion von pSJ416 ist in Fig. 10 skizziert).
Bei Einführung dieses Plasmids in B. subtilis DN1885 und Züchten von Transformanten in Schüttelkolben, wie es vorstehend beschrieben wurde, erreichte die Ausbeute 40 LU/ml in 4 Tagen.

D. Expression eines modifizierten Lipase-Gens in B. licheniformis

(1) lip ohne lim

Das Plasmid pSJ488 enthält das gleiche Amylase-Lipase-Fusionsgen wie pSJ493, jedoch auf dem Bacillus-Vektor pPL1131, der seinem Wirtsstamm eine Kanamycinresistenz verleiht (Fig. 11). Dieses Plasmid wurde in den B. licheniformis-Stamm ATCC 9789 durch Protoplastentransformation eingeführt, und die Transformanten wurden auf Platten mit einem Gehalt an Glycerintributyrat ausgestrichen. Die Höfe, die sich um die Transformanten bildeten, waren sehr klein, und zwar von ungefähr der gleichen Größe wie diejenigen, die sich um den nicht-transformierten Stamm bildeten.

(2) lip und lim auf dei gleichen Plasmid

Das Plasmid pSJ600 enthält das gleiche Amylase-Lipase-Fusionsgen wie pSJ488, dem Lipase-Gen folgte jedoch unmittelbar stromabwärts das lim-Gen in exakt der gleichen Weise wie auf pSJ150 (die Konstruktion von pSJ600 ist in Fig. 11 skizziert). Bei Einführung dieses Plasmids in B. licheniformis ATCC 9789 durch Protoplastentransformation und Ausstreichen der Transformanten auf Platten mit einem Gehalt an Glycerintributyrat bildeten sich ausgeprägte Höfe um die Kolonien, was auf eine Lipasebildung hinweist.

E. Expression eines modifizierten Lipase-Gens in S. lividans

(1) lip ohne lim-Expression

Das Plasmid pSJ604 wurde durch Isolieren eines 880 bp umfassenden HindIII-AvaII-Fragments aus dem Plasmid pIJ2002 konstruiert, das den dagA-Promotor und einen Teil der für ein Signalpeptid kodierenden Sequenz trägt (vgl. Fig. 2 in Buttner et al., 1987). An dieses Fragment wurden zwei komplementäre, phosphorylierte und anellierte Oligonucleotide der nachstehenden Sequenz addiert:
Dieses Gemisch wurde mit pUC19 ligiert, das zuvor mit HindIII und SalI verdaut worden war, wobei man das Plasmid pSJ604 erhielt.
Das Plasmid pSJ671 ist ein E. coli-S. lividans-Shuttleplasmid, das eine Fusion im Rahmen zwischen dem Promotor, der Ribosom-Bindungsstelle und der für ein Signalpeptid kodierenden Region des S. coelicolor-Agarase-Gens (dagA, Buttner et al., 1987) und der für die reife Lipase kodierenden DNA trägt. Das lim-Gen ist auf dem Plasmid vorhanden, jedoch in einer solchen Position, daß es von keinem bekannten Promotor transkribiert wird. Die Konstruktion von pSJ671 ist in Fig. 12 skizziert, und die Sequenz der Fusionsregion lautet wie folgt: Agarase-Signalpeptid reife lipA-Sequenz
Bei Einführung von pSJ671 in S. lividans TK24 durch Protoplastentransformation und Ausstreichen der erhaltenen Transformanten auf Platten mit einem Gehalt an Glycerintributyrat bildeten sich sehr kleine Höfe um die Kolonien, was auf eine geringe oder keine Lipasebildung hinweist.

(2) lip und lim auf dei gleichen Plasmid

pSJ669 ist ähnlich zu pSJ671, mit der Ausnahme, daß pSJ669 das lim- Gen unmittelbar stromabwärts von dem Lipase-Gen in exakt der gleichen Weise wie pSJ150 enthält (die Konstruktion von pSJ669 ist in Fig. 13 skizziert).
Bei Einführung von pSJ669 in S. lividans TK24, wie es vorstehend beschrieben wurde, und Ausstreichen der Transformanten auf Platten mit Glycerintributyrat bildeten sich sehr große Höfe im Vergleich mit denjenigen vom pSJ671 um die Kolonien.

F. Einfluß eines modifizierten lim-Gens

pSJ377, das in Fig. 6 gezeigt ist, enthält das lim-Gen, das vom lacZ- Promotor exprimiert wird. Dieses Plasmid wurde mit ClaI verdaut, und Deletionen um die ClaI-Stelle wurden mit ExoIII erzeugt. Ein derartiges Deletionsplasmid ist pSJ721, bei dem 15 Basenpaare deletiert wurden, was zu einem Fusionsprotein führte, das von den 9 N-terminalen Codons des pUC19- lacZ-Gens plus 8 C-terminalen Codons des lip-Gens, das mit dem lim-Gen fusioniert ist, dem nur die ersten beiden Codons fehlen, abgeleitet ist. Die Sequenz der Fusionsregion lautet wie folgt: LacZ Start lip C-terminaler Teil : lim ab dem 3. Codon
Das Fusionskonstrukt plus der lac-Promotor wurden aus pSJ721 als ein 1,5 kb umfassendes PvuII-fragment ausgeschnitten und in die HindII-Stelle von pACYC177 inseriert, wobei man pSJ812 erhielt, und zwar in der gleichen Weise wie bei der Konstruktion von pSJ622, die in Fig. 6 gezeigt ist.
pSJ812 wurde in kompetente SJ518 (der Stamm, der pSJ518 nur mit dem Lipase-Gen enthält) eingeführt. Es erfolgte eine Selektion auf Ampicillin- und Kanamycin-Resistenz, und die Transformanten wurden auf Platten mit einem Gehalt an Glycerintributyrat repliziert. Die Höfe, die sich um die Transformanten bildeten, waren ungefähr von der gleichen Größe wie diejenigen, die sich um die Transformanten von SJ518 mit pSJ622 bildeten, die das nicht-modifizierte lim-Gen exprimierten.

Beispiel 3

Expression und Identifizierung des von lim kodierten Polypeptids

Das lim-Gen wurde aus pSJ150 als ein 1,17 kb umfassendes ClaI-SphI- Fragment ausgeschnitten und in die NdeI-Stelle des Plasmids pJW2 (Wang et al., 1990) inseriert, nachdem stumpfe Enden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I erzeugt worden waren. Rekombinante Plasmide wurden erhalten, bei denen das lim-Gen in einer der beiden möglichen Orientierungen inseriert war. pCBE3 und pCBE4 enthalten beide das lim-Gen in der korrekten Orientierung für die Transkription ausgehend von den temperaturinduzierbaren lambda-pR- und pL-Promotoren auf pJW2, während pCBE2 das lim-Gen in umgekehrter Orientierung enthält. Die Plasmide wurden in E. coli JA221 (Clarke und Carbon, 1978) eingeführt, und die Transkription von den pL- und pR-Promotoren wurde durch Erhöhung der Temperatur der Kulturen auf 42ºC induziert. Proteine, die bei der Induktion gebildet wurden, wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese von Zellen, die aus den induzierten Kulturen gewonnen wurden, identifiziert. Dies erlaubte die Identifizierung eines Proteins mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 34 000, das in induzierten Kulturen von Transformanten, die pCBE3 und pCBE4 trugen, nicht jedoch in induzierten Kulturen von Transformanten, die pCBE2 trugen, oder in nicht-induzierten Kulturen gefunden wurde.

Druckschriften

T. Akamatzu, J. Sekiguchi (1984). An improved method of protoplast regeneration for Bacillus species and its application to protoplast fusion and transformation. Agric. Biol. Chem., Bd. 48, S. 651-655.
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A. C. Y. Chang, S. N. Cohen (1978). Construction and Amplification of Amplifiable Multicopy DNA Cloning Vehicles Derived from the p15A Cryptic Miniplasmid. J. Bacteriol., Bd. 134, S. 1141-1156.
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Claims

1. DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz, die in den beigefügten Figg. 1 A-C gezeigt ist und für einen Faktor kodiert, der in trans als Modulator der Bildung einer Pseudomonas cepacia-Lipase wirkt, oder eine Modifizierung der DNA-Sequenz, die für ein funktionelles Analogon des P. cepacia- Lipase-Modulierungsfaktors kodiert, umfaßt, wobei der P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktor oder das funktionelle Analogon davon imstande sind, die Lipasebildung zu modulieren, wenn P. cepacia-Lipase unter Verwendung von Expressionssignalen exprimiert wird, die heterolog gegenüber Pseudomonas sind, und/oder wenn P. cepacia-Lipase in einer heterologen Wirtszelle exprimiert wird.

2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin die DNA-Sequenz aus dem Chromosom von P. cepacia stammt.

3. DNA-Konstrukt nach Anspruch 2, worin sich die DNA-Sequenz auf dem P. cepacia-Chromosom stromabwärts von einer DNA- Sequenz befindet, die für eine Lipase von ca. 33 kD kodiert.

4. DNA-Konstrukt, das eine erste DNA-Sequenz, die für eine P. cepacia-Lipase oder ein Derivat davon kodiert, und eine zweite DNA-Sequenz, die für einen P. cepacia-Lipase- Modulierungsfaktor, wie er in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert wurde, kodiert, umfaßt.

5. DNA-Konstrukt nach Anspruch 4, worin die erste DNA-Sequenz für eine Lipase von ca. 33 kD kodiert.

6. DNA-Konstrukt nach Anspruch 4, wobei es sich bei der DNA- Sequenz um die in den beigefügten Figg. 2 A-C gezeigte DNA-Sequenz oder eine Modifizierung davon handelt, die für ein Derivat der P. cepacia-Lipase kodiert.

7. DNA-Konstrukt nach Anspruch 4, wobei die für die P. cepacia-Lipase kodierende DNA-Sequenz sich stromaufwärts von der DNA-Sequenz, die für P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktor kodiert, befindet.

8. DNA-Konstrukt nach Anspruch 4, wobei sich die DNA-Sequenz, die für die P. cepacia-Lipase kodiert, stromabwärts von der DNA-Sequenz, die für den P. cepacia-Lipase- Modulierungsfaktor kodiert, befindet.

9. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die erste und/oder zweite DNA-Sequenz ferner Expressionssignale umfaßt, die gegenüber denen von Pseudomonas heterolog sind.

10. Replizierbarer Expressionsvektor, der eine inserierte DNA-Sequenz trägt, die in den beigefügten Figg. 1 A-C gezeigt ist und für einen Faktor kodiert, der in trans als Modulator der Bildung einer P. cepacia-Lipase wirkt, oder eine Modifizierung dieser DNA-Sequenz, die für ein funktionelles Analogon des P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktors kodiert, wobei der P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktor oder das funktionelle Analogon davon imstande sind, die Lipasebildung zu modulieren, wenn die P. cepacia-Lipase unter Verwendung von Expressionssignalen exprimiert wird, die heterolog gegenüber Pseudomonas sind und/oder wenn die P. cepacia-Lipase in einer heterologen Wirtszelle exprimiert wird.

11. Vektor nach Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz der Definition in Anspruch 2 oder 3 entspricht.

12. Replizierbarer Expressionsvektor, der eine erste inserierte DNA-Sequenz, die für eine P. cepacia-Lipase oder ein Derivat davon kodiert, und eine zweite inserierte DNA-Sequenz, die für einen P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktor, wie er in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, kodiert, trägt.

13. Vektor nach Anspruch 12, wobei die erste DNA-Sequenz für eine Lipase von ca. 33 kD kodiert.

14. Vektor nach Anspruch 13, wobei es sich bei der DNA-Sequenz um die DNA-Sequenz, die in den beigefügten Figg. 2 A-B gezeigt ist, oder eine Modifizierung davon, die für ein Derivat der P. cepacia-Lipase kodiert, handelt.

15. Vektor nach Anspruch 12, worin die erste und die zweite DNA-Sequenz vom gleichen Promotor exprimiert werden.

16. Vektor nach Anspruch 15, wobei sich die erste DNA-Sequenz, die für die P. cepacia-Lipase kodiert, stromaufwärts von der zweiten DNA-Sequenz, die für den P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktor kodiert, befindet.

17. Vektor nach Anspruch 15, wobei sich die erste DNA-Sequenz, die für die P. cepacia-Lipase kodiert, stromabwärts von der zweiten DNA-Sequenz, die für den P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktor kodiert, befindet.

18. Vektor nach Anspruch 12, worin die erste DNA-Sequenz, die für die P. cepacia-Lipase kodiert, und die zweite DNA-Sequenz, die für den P. cepacia-Lipase-Modulierungsfaktor kodiert, jeweils von getrennten Promotoren exprimiert werden.

19. Vektor nach einem der Ansprüche 12 bis 18, worin die erste und/oder die zweite DNA-Sequenz ferner Expressionssignale umfaßt, die gegenüber denjenigen vom Pseudomonas heterolog sind.

20. Wirtszelle, enthaltend ein erstes DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die für eine P. cepacia-Lipase oder ein Derivat davon kodiert, und ein zweites DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

21. Wirtszelle nach Anspruch 20, worin die erste DNA für eine Lipase von ca. 33 kD kodiert.

22. Wirtszelle nach Anspruch 21, wobei es sich bei der DNA- Sequenz des DNA-Konstrukts um die Sequenz, die in den beigefügten Figg. 2 A-B gezeigt ist, oder eine Modifizierung davon, die für ein Derivat der P. cepacia-Lipase kodiert, handelt.

23. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 20 bis 22, worin das erste und/oder das zweite DNA-Konstrukt ferner Expressionssignale umfaßt, die gegenüber denjenigen vom Pseudomonas heterolog sind.

24. Wirtszelle, enthaltend ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 9.

25. Wirtszelle nach Anspruch 20, die mit einem replizierbaren Expressionsvektor, der das erste DNA-Konstrukt trägt, und mit einem replizierbaren Expressionsvektor nach Anspruch 10 transformiert ist.

26. Wirtszelle nach Anspruch 25, wobei die DNA-Sequenz, die für die P. cepacia-Lipase kodiert, ferner Expressionssignale umfaßt, die gegenüber denjenigen vom Pseudomonas heterolog sind.

27. Wirtszelle nach Anspruch 20, die mit einem replizierbaren Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 12 bis 19 transformiert ist.

28. Wirtszelle nach Anspruch 20, die das erste DNA-Konstrukt integriert in ihr Chromosom trägt und die einen replizierbaren Expressionsvektor nach Anspruch 10 enthält.

29. Wirtszelle nach Anspruch 20, die das zweite DNA-Konstrukt integriert in ihr Chromosom trägt und die einen replizierbaren Expressionsvektor enthält, der das erste DNA- Konstrukt enthält.

30. Wirtszelle nach Anspruch 20, die das erste und das zweite DNA-Konstrukt integriert in ihr Chromosom in einer solchen Weise trägt, daß die DNA-Sequenz, die für die P. cepacia-Lipase kodiert, und die DNA-Sequenz, die für den Lipase-Modulierungsfaktor kodiert, jeweils von getrennten Promotoren exprimiert werden.

31. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 22 bis 30, wobei es sich um ein Bakterium handelt.

32. Wirtszelle nach Anspruch 31, wobei es sich um ein gram- positives Bakterium handelt.

33. Wirtszelle nach Anspruch 32, wobei das gram-positive Bakterium unter Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis und Streptomyces lividans ausgewählt ist.

34. Wirtszelle nach Anspruch 31, wobei es sich um ein gram- negatives Bakterium handelt.

35. Verfahren zur Herstellung einer P. cepacia-Lipase oder eines Derivats davon, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 20 bis 34 unter Bedingungen, die für die Bildung der Lipase oder ihres Analogons förderlich sind, und die Gewinnung der Lipase oder ihres Analogons aus dem Kulturmedium umfaßt.