JPH04506455A

JPH04506455A - リパーゼおよびリパーゼモジュレーターをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH04506455A
Application number: JP2510266A
Authority: JP
Inventors: イェールゲンセン，ステーン　トロエルス
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1989-07-07
Filing date: 1990-07-05
Publication date: 1992-11-12
Also published as: DE69012134T2; EP0487541B1; DE69012134D1; DK336889D0; IE68938B1; FI920038A0; AU6041990A; WO1991000908A1; IE902468A1; EP0487541A1; DK0487541T3; ATE110776T1; CA2063590A1; AU635054B2; KR927003820A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２４、第一および／または第二のＤＮＡ構築物がさらにプソイドモナスのものと異なる発現シグナルを含む請求の範囲第２１項〜第２３項のいずれか１に記載の宿主細胞。

２５、請求の範囲第５項〜第１０項のいずれか１に記載のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。

２６、第一のＤＮＡ構築物を有する複製可能な発現ベクターおよび請求の範囲第１１項に記載の複製可能な発現ベクターで形質転換された請求の範囲第２１項に記載の宿主細胞。

２７、プソイドモナスセパシアリパーゼをコードするＤＮＡ配列がさらにプソイドモナスのものと異なる発現シグナルを含む請求の範囲第２６項に記載の宿主細胞。

２８、請求の範囲第１３項〜第２０項のいずれか１に記載の複製可能な発現ベクターで形質転換された請求の範囲第２１項に記載の宿主細胞。

２９、その染色体中に組込まれた第一のＤＮＡ構築物を有しそして請求の範囲第１１項に記載の複製可能な発現ベクターを含む請求の範囲第２１項に記載の宿主細胞。

３０、その染色体中に組込まれた第二のＤＮＡ構築物を有しそして第一のＤＮＡ構築物を含む複製可能な発現ベクター３１、プソイドモナスセパシアリパーゼをコードするＤＮＡ配列およびリパーゼモジュレーティングファクターをコードするＤＮＡ配列が各々別のプロモーターから発現するようにその染色体中に組込まれた第一および第二のＤＮＡ構築物を有する請求の範囲第２１項に記載の宿主細胞。

３２、細菌、酵母またはフィラメント状真菌である請求の範囲第２１項〜第３１項のいずれか１に記載の宿主細胞。

３３、ダラム陽性菌である請求の範囲第３２項に記載の宿主細胞。

３４、ダラム陽性菌が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、バチルスリチ、ｚニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）　、バチルスプレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）　、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａ−ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　、バチルスアル力ロフイルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）　、バチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉ−１１ｕｓ　ａｓｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉ−１１ｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）　、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒ−ｃｕｌａｎｓ）またはストレプトミセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）もしくはストレプトミセスムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｕｒｉｎｕｓ）からなる群から選択される請求の範囲第３３項に記載の宿主細胞。

３５、グラム陰性菌たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である請求の範囲第３２項記載の宿主細胞。

３６、リパーゼまたは類似物質の生産を助成する条件下で請求の範囲第２１項〜第３５項のいずれか１に記載の宿主細胞を培養し、そして培地からリパーゼまたは類似物質を回収することからなるプソイドモナスセパシアリパーゼまたはその誘導体の生産方法。

明　細　書リパーゼおよびリパーゼモジュレータ−をコードするＤＮＡ発明の分野本発明は、リパーゼをコードするＤＮＡ配列、その生成物がリパーゼの生産に影響を与えるＤＮＡ配列、発現ベクターおよびこれら配列を含む宿主細胞および宿主細胞を培養することによるリパーゼ生産方法に関する。

発明の背景リパーゼは、トリグリセリドにおけるエステル結合の加水分解を触媒化し、その結果ジグリセリド、モノグリセリド、グリセリンおよび遊離脂肪酸を形成する酵素である。幾つがのりパーゼはまたエステル結合に関する別の反応たとえばエステル結合の合成またはエステル交換反応を触媒化する。リパーゼは様々な異なる生物により生産される。特に微生物リパーゼは、たとえば食品工業および洗剤において脂肪の脂肪分解が望まれている様々な目的に対しかなり実際的に有用である。

繊維から脂肪性のしみまたは土壌を除くために洗剤に含まれるのに特に有利であることが見出された特定リパーゼの１つは、プソイドモナスセパシア（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｗｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ）の菌株により生産されるリパーゼである。

ヨーロッパ特許第２１４７６１号（ノボインダストリイエ−／ニス）には、このリパーゼが６０°Ｃ未満の温度で活性であるリパーゼとして記載されており、このことはほとんどの現代の繊維が６０℃未満の温度で洗浄されるので重要である。

洗剤添加物として使用される別の重要なプソイドモナスセパシアリパーゼは、国際特許出＠　（ＷＯ）第８９１０１０３２号（ノボインダストリイエ−／ニス）に位置非特異的リパーゼ、すなわちトリグリセリドの３つの脂肪アシル基のすべてと反応しうるちのとして記載されているものである。

プソイドモナスセパシアリパーゼ生産を促進するために、たとえば酵素をコードするＤＮＡ配列が発現されているものからより強力なプロモーターを導入するかもしくはより効率的なリポソーム結合部位またはシグナルペプチドをコードする配列を導入することによりリパーゼ発現を適正化するために、または培養がより簡単な酵素生産のための宿主生物（たとえば大腸菌、枯草菌等のような一般的生産生物であるという点で）であるかまたはより高いリパーゼ収率をもたらす宿主生物を選択するために、組換ＤＮＡ技術を使用することが有利なこともある。以下に記載したように、このようなアプローチは、たとえば問題となるタンパク質をコードする構造遺伝子に加えて１つ以上の遺伝子が遺伝子生産物の製造に幾らか役割を果している場合に、期待した結果が得られない場合がある（このような遺伝子の例は、バチルス属（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕｓ）ｓａｃ　（ホンジョー、エム、　Ｈｏｎｊｏ、Ｍ、ら（１９８７）、ジャーナルオンバイオテクノロジイＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１９１−２０４）および１ｅｐ（タナカ、テ４　、　Ｔａｎａｋａ、Ｔ、カワタ、エム、Ｋａｗａｔａ＋Ｍ、　（１９８８）、ジャーナルオンパクテリオロジイＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａｃ　ｔｅｒ　ｉｏ　ｌｏｇｙ　、　１７０　：　３５９３−３６００）遺伝子、およびタレブシーラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）プルラナーゼおよび大腸菌溶血素の生産に必要な遺伝子である）。

別のプソイドモナス種、プソイドモナスフラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ）からのリパーゼ遺伝子のクローニングは、たとえばニス、アオヤ？　（Ｓ、　Ａｏｙａａ＋ａ）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２４２（１）、１９８８年１２月、　ｐｐ、３６−４０およびダブルユ、クギミャ（１１ＪｕｇｉＩＩＩｉｙａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１４１（１）　＋　１９８６年１１月２６日、　ｐｐ、１８５−１９０から公知である。しかしながらプソイドモナスフラギにより作られるリパーゼはそのアミノ酸配列の点でプソイドモナスセパシアと異なり、これらの文献には、宿主生物における著しいリパーゼ生産を達成するために１つ以上の追加の遺伝子が必要であるという示唆はない。

ヨーロッパ特許第３３１３７６号には、プソイドモナスセパシアリパーゼをコードする組換え体ＤＮＡならびにリパーゼ生産に関与するタンパク質についての記載がある。しかしながら、このタンパク質をコードする遺伝子もまた異なった宿主生物において機能的であるという示唆はない。

発明の概要本発明者はプソイドモナスセパシアリパーゼをコードする遺伝子を単離およびクローン化し、そしてその発現ががなりの収率でのリパーゼ生産の達成に重要である遺伝子を同定した。

したがって、第一の見地において、本発明はプソイドモナスセパシアリパーゼ生産のモジュレータ−として途中で作用するファクターをコードするか、またはプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターの機能的８４以物質をコードするＤＮＡ配列からなり、その際前記プソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターまたはその機能的類似物質がプソイドモナスセパシアリパーゼがプソイドモナス属と異なる発現シグナルを用いて発現されるかおよび／またはプソイドモナスセパシアリパーゼが異なる宿主細胞中で発現された場合リパーゼ生産をモジュレータしうるものであるＤＮＡ構築物に関する。

本発明を導びく研究過程において、驚くべきことにリパーゼをコードするＤＮＡ配列の下流領域（プソイドモナスセパシアの染色体上に存在）はリパーゼの生産において著しく有益な効果を有することがわかった。領域はリパーゼ発現に必要なりＮＡ配列上の部位Ｃたとえばプロモーター、ターミネータ−、エンハンサ− 等）を単に提供するだけでなく２つの生産物をコードするＤＮＡ配列が同じベクター上に位置しない場合でさえリパーゼの生産に影響を与えうるファクターをコードする遺伝子を含むということが実験的に確立された（とりわけ、リパーゼをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドよりむしろ別のプラスミド上へこの領域を挿入することによる）。リパーゼモジュレーティングファクターはＲＮＡ分子またはポリペプチドでよいが、しかし最も好ましくはポリペプチドである（たとえば、以下の例３参照）。

以下において、リパーゼモジュレーティングファクターをコードするＤＮＡ配列は通常“Ｉｉｍ”遺伝子として言及され、一方モシュレーティングファクターは通常“Ｌｉｍ”ファクターとして言及される。

驚くべきことに、１３ｍ遺伝子はリパーゼがプソイドモナス属のものと異なる発現シグナル（たとえばバチルス属α−アミラーゼ遺伝子からのプロモーター、リポソーム結合部位およびシグナルペプチド−コード領域）を用いて発現されるかまたは宿主生物がプソイドモナス属ではない場合でさえリパーゼ生産において有益な効果を示すことが見出された。それゆえ、Ｌｉｍファクターは転写または翻訳のいずれの開始にも作用しない。しかしながらＬｉｍファクターの正しい機能はいまだに明らかにされていない。

用語“機能的類似物質”とは、プソイドモナスセパシアＬｉｍファクターのものと類似のリパーゼ生産モジュレーティング機能を有しプソイドモナスセパシアとは別の生物から由来するファクターを示すか、または天然配列において１つ以上のアミノ酸の追加、置換、挿入または欠失を行なった結果ＤＮＡ配列を修飾することにより作られたプソイドモナスセパシアＬｉｍファクターの誘導体であるファクターを示すものと理解される。しかしながら天然配列のこのような修飾があまりに広範囲にわたり過ぎてＬｉｍファクターのモジュレーティング機能が他の点で失なわれてしまうべきでないということが信じられる理由がある。これとは別に、機能的類似物質は相同ポリペプチド（すなわち、ある特定条件〔たとえば、５ＸＳＳＣ中で予備浸漬し、２０％ホルムアミド、５Ｘデンハード溶液、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８および５０１１ｇ変性超音波処理した仔牛胸腺ＤＮＡの溶液中〜４゜°Ｃにて１時間予備ハイブリッド化し、続いて１０（ＩＡＴＰを補給した同じ溶液中〜４０°Ｃにて１８時間ハイブリッド化する〕下にＬｉｍファクターをコードするＤＮＡと同じプローブへハイブリッド化するＤＮＡ配列によりコードされるもの）、またはＬｉｍファクターを生ずる抗体もしくはこれに対向する抗体と反応するものである。用語“Ｌｉｍファクター”が以下の記述で使用される場合、これはこのような機能的類似物質ならびに天然のプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターを含むことが暗に意図される。

発明の詳細な記載ＬｉｍファクターをコードするＤＮＡ配列を含む本発明ＤＮＡ構築物は、たとえば標準的技術にしたがって（サムプルツクＳａｍｂｒｏｏｋ　ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバ−、１９８２）　、プソイドモナスセパシアのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリィを調製しそして合成オリゴヌクレオチドを用いたハイブリッド形成によりＬｉｍファクターの全部または一部をコードするＤＮＡｃＤＮＡオリジンからなる。

ＬｉｍファクターをコードするＤＮＡ配列は、リパーゼ生産プソイドモナスセパシア菌株から得られるいずれかのものである。このような菌株の例は、ヨーロッパ特許第２１４７６１号に記載された発明と関連して寄託番号ＤＳＭ　３３３３ −３３３７およびＤＳＭ　３４０１にてドイチェザムラングフォンミクロオルガニスメンに寄託されたもの、ならびに国際特許出願（ＷＯ）第８９１０１０３２号に記載の発明と関連して寄託番号ＤＳＭ　３９５９にてドイチェザムラングフォンミクロオルガニスメンに寄託された菌株でよい。しかしながら、ｌｉｍ遺伝子と等価なりＮＡ配列もまた別のリパーゼ生産微生物から由来するものとみなされる。このような遺伝子は、上述のようなＬｉｍファクターをコードするＤＮＡへハイブリッド化するプローブを用いてハイブリッド化することによりスクリーニングされるかまたはＬｉｍファクターと同じ抗体との遺伝子生産物の反応性により選択されるかまたばＩｉｍ遺伝子ではなくリパーゼ遺伝子を含む菌株へリパーゼ生産を授与する能力についてスクリーニングすることにより同定される。

Ｌｉｍファクターをコードする本発明ＤＮＡ構築物はまた確立された標準的方法により、たとえばニス、エル、ビューケージ（Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびエム、エイチ、カルーサーズ（Ｍ、）１．ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）＋　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２１１９８１ｊｐり、１８５９−１８６９に記載されたホスホアミダイト法またはマセッスら（Ｍａｔｔｈｅｓ　ｅｔ　ａｌ）　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３，１９８４．ｐｐ８０１−８０５により記載された方法により合成的に調製されうる。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドはたとえば自動ＤＮＡ合成機中で合成され、精製され、連結されそして適当なベクター中でクローン化される。

最後に、ＤＮＡ構築物は、標準的技術を用いて、合成、ゲノムまたはｃＤＮＡオリジンの断片を連結する（適当に）ことにより調製される混合した合成およびゲノム、混合した合成およびｃＤＮＡまたは混合したゲノムおよびｃＤＮＡオリジンからなってもよ（、その断片は全ＤＮＡ構築物の様々な部分に相当する。

Ｌｉｍファクターをコードする好ましいＤＮＡ構築物はプソイドモナスセパシアの染色体から由来するＤＮＡ配列からなるもの、特にＤＮＡ配列が〜３３ｋＤリパーゼをコードする配列のプソイドモナスセパシア染色体下流に位置するものである。Ｌｉｍファクターをコードする特に好ましいＤＮＡ構築物は、これに添付した第１図Ａ−Ｃに示したＤＮＡ配列または上述のようなプソイドモナスセパシアＬｉｍファクターの機能的類似物質をコードするその修飾物である。

ＤＮＡ配列の適当な修飾の例は、Ｌｉｍファクターの別の配列を起こさないがしかしＤＮＡ構築物を導入する宿主生物のコドン使用に相当するヌクレオチド置換であるかまたは異なった配列を起こしそのため多分具なった構造ではあるがしかしリパーゼまたはＬｉｍファクターのいずれかの特性を損なわないヌクレオチド置換である。可能性のある修飾の別の例は、１つ以上のヌクレオチドの配列への挿入、１つ以上のヌクレオチドの配列のいずれかの端部への追加および配列のいずれかの端部または配列内における１つ以上のヌクレオチドの欠失である。

幾つかの目的のために、プソイドモナスセパシアリパーゼをコードするＤＮＡ配列をＬｉｍファクターをコードするＤＮＡ配列と同じＤＮＡ構築物上に提供することが便利である。すなわち、本発明はさらに、プソイドモナスセパシアリパーゼをコードする第一のＤＮＡ配列またはその誘導体およびプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターをコードする第二のＤＮＡ配列とからなるＤＮＡ構築物に関する。

この関係において、用語“誘導物”とは、天然リパーゼをコードするＤＮＡ配列を適当に修飾しその結果天然タンパク質のＣ末端およびＮ末端のいずれかまたは両方ともへ１個以上のアミノ酸を追加したり、天然アミノ酸配列における異なった部位の１つまたは多数個所で１個以上のアミノ酸を置換したり、アミノ酸配列において天然タンパク質のいずれかまたは両方の端部における１個以上のアミノ酸を欠失したり、または天然アミノ酸配列において１つ以上の部位に１つ以上のアミノ酸を挿入したりすることにより天然リパーゼから誘導される脂肪分解活性を有するタンパク質を示すことを意図するものである。

プソイドモナスセパシアリパーゼをコードする好ましいＤＮＡ構築物は、天然にプソイドモナスセパシアの染色体上に存在する〜３３ｋＯのリパーゼをコードするプソイドモナスセパシア、口ＳＭ　３９５９から由来するＤＮＡ配列からなるものである。リパーゼをコードする特に好ましいＤＮＡ構築物は、リパーゼをコードするＤＮＡ配列がこれに添付された第２図Ａ−Ｃに示されたものまたは上述のようなプソイドモナスセパシアリパーゼの誘導体をコードするその修飾物である。

本発明ＤＮＡ構築物の一実施態様において、リパーゼＤＮＡ配列はＬｉｍファクターをコードする配列の上流に位置してもよく、他の実施態様においてリパーゼをコードするＤＮＡ配列はＬｉｍファクターをコードする配列の下流に位置してもよい。いずれの場合でも、ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ構築物が宿主細胞に存在する場合リパーゼおよびＬｉｍファクターの発現を許す条件下でこれらが同じプロモーターから転写されるように互いに関連して位置する。好ましい実施態様において、リパーゼをコードする第一のＤＮＡ配列および／またはＬｉｍファクターをコードする第二のＤＮＡ配列は、さらにプソイドモナス属のものと異なる発現シグナル（たとえば、プロモーター、リポソーム結合部位および／またはシグナルペプチド−コード配列）を含む。

別の見地において、本発明は上述したようにＬｉｍファクターまたはその機能的類似物質をコードする挿入されたＤＮＡ配列を有する複製可能な発現ベクターに関する。

さらに別の実施１！様において、本発明は、プソイドモナスセパシアリパーゼをコードする第一の挿入されたＤＮＡ配列またはその誘導体（上記のように）およびＬｉｍファクターをコードする第二のＤＮＡ配列（上記のように）を有する複製可能な発現ベクターに関する。この場合、第一および第二のＤＮＡ配列は、必ずしも要求されないが同じプロモーターから発現されうる。第一および第二のＤＮＡ配列が同じプロモーターから発現する場合、リパーゼコード配列は、Ｌｉｍファクターにより影響されるリパーゼ生産の調節に悪影響を及ぼすことな（Ｌｉｍコード配列の上流または下流に位置する。

これに代わって、各々リパーゼおよびＬｉｍ−ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、同じベクターに保持されている場合でさえも、各々別々のプロモーターから発現されうる。

特に好ましい実施態様において、リパーゼをコードする第一のＤＮＡ配列および／またはＬｉｍファクターをコードする第二のＤＮＡ配列はさらにプソイドモナス属のものと異なる発現シグナル（たとえば、プロモーター、リポソーム結合部位および／またはシグナルペプチド−コード配列）を含んでもよい。

リパーゼおよび／またはＬｉｍファクターをコードするＤＮＡ配列を有する複製可能な発現ベクターは、与えられた宿主生物一般的にプラスミドまたはバクテリオファージ中で自律的に複製可能ないずれのベクターでもよい。ベクターにおいて、リパーゼおよび／またはＬｉｍファクターをコードするＤＮＡ配列は適当なプロモーター配列に操作可能に接続している。プロモーターは宿主細胞中で転写活性を示すいずれのＤＮＡ配列でもよく、宿主生物と同じかまたは異なるいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から由来するもの、たとえばプソイドモナス属と異なるプロモーターである。プロモーターは宿主生物と同じタンパク質をコードする遺伝子から由来するのが好ましい。適当なプロモーターの例は、大腸菌のｌａｃ、ストレブトミセスコエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｓ＋ｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のｄａｇ　Ａおよびバチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉ−１１ｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙ　Ｌである。

本発明の複製可能な発現ベクターはさらに宿主細胞中でベクターを複製しうるＤＮＡ配列からなる。このような配列の例は、プラスミドｐＵｃ　１９．　ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ　１１０およびｐｌＪ　７０２の複製オリジンである。

ベクターはまた、選択可能なマーカーたとえばその生成物が抗生物質耐性たとえばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子または枯草菌もしくはバチルスリチェニホルミスからのｄａｌ遺伝子を含んでもよい。

各々リパーゼおよび／またはＬｉｍファクターとプロモーターをコードするＤＮＡ配列を連結し、そしてこれらを宿主細胞中での複製に必要な情報を含む適当なベクターへ挿入するために使用される手段は、当業者によく知られている（たとえば、サムプルツクら、前掲）。ベクターは、最初にリパーゼおよびＬｉｍファクターをコードする全ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を調製し次いでこの構築物を適当な発現ベクターへ挿入するか、またはリパーゼもしくはＬｉｍファクターをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を別々に調製するか、または個々の要素（たとえばリパーゼまたはＬｉｍファクター）についての遺伝情報を含むＤＮＡ断片を逐次挿入し続いて各工程の後で連結することにより構築されることは理解されるであろう、さらに、この関係で、上述のようにリパーゼをコードするＤＮＡ配列がゲノムオリジンからなり一方Ｌｉｍファクターをコードする配列が合成的に調製されるかまたはその逆でもよいことは理解されるであろう。さらに別の見地において、本発明は、上述したようにプソイドモナスセパシアリパーゼをコードするＤＮＡ配列およびＬｉｍファクターをコードするＤＮＡ配列をそれぞれ含む２つの異なるＤＮＡ構築物のいずれか、または同じ断片上に両方のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を含む宿主細胞に関する；いずれの場合にも、ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ配列が細胞中で安定に維持されやすいという利点を有する宿主染色体中に組込まれる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組込みは、常法たとえば相同組換えにしたがって実施される。２つのＤＮＡ配列はこれらが各々別のプロモーターから発現されるように宿主染色体に組込まれる。好ましい実施Ｂ様において、リパーゼをコードするＤＮＡ配列および／またはＬｉｍファクターをコードするＤＮＡ配列はさらにプソイドモナス属のものと異なる発現シグナル（たとえば、プロモーター、リポソーム結合部位および／またはシグナルペプチド−コード配列）を含む。

これに代わり、宿主細胞は、両方のＤＮＡ配列を含む複製可能な発現ベクター、またはそれぞれリパーゼをコードするＤＮＡ配列とＬｉｍファクターをコードするＤＮＡ配列を含む２つのベクターで形質転換される。

別の変法として、リパーゼをコードするＤＮＡ配列を宿主染色体に組込み、そしてＬｉｍファクターをコードするＤＮＡ配列を複製可能な発現ベクター（上述したように）に保持するか、またはその逆でもよい。

本発明方法に使用される宿主細胞は、培養時に多量のプソイドモナスセパシアリパーゼを生産する適当な細菌、酵母またはフィラメント状真菌のいずれかでよい。

適当な細菌の例はダラム陽性菌たとえば枯草菌、バチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスプレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）、バチルスプレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ−ｃｉｅｎｓ）、バチルスコアギユランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）またはストレプトミセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｔａｙｃｅｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ）　もしくはストレプトミセスムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏａ＋ｙｃｅｓ　ｍｕｒｉｎｕｓ）、またはグラム陰性菌たとえば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）である。細菌の形質転換はたとえば、それ自体公知の方法で原形質形質転換によりまたはコンピテント細胞を用いて行なわれる。

酵母生物はサツカロミセスの種たとえばサツカロミセスセレヴイシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択されるのが好ましい、フィラメント状真菌はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒ−ｇｉｌｌｕｓ）の種たとえばアスペルギルスニガーエ（Ａｓｐｅｒｇｉ　１ｌｕｓｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）に属するのが有利である。真菌細胞は、それ自体公知の方法で原形質形成および原形質の形質転換続いて細胞壁の再形成を含む方法により形質転換される。宿主生物としてのアスペルギルス属の使用は、たとえばヨーロッパ特許第２３８０２３号に記載されている。

さらに別の見地において、本発明はプソイドモナスセパシアリパーゼまたはその誘導体の生産方法に関するもので、該方法はリパーゼまたはその類似物質の生産を促す条件（Ｌｉｍファクターの発現を保証する条件を含む）下に上述のように宿主細胞を培養し、細胞および／または培地からリパーゼまたは類似物質を回収することからなる。

細胞を培養するために使用する培地は、細菌の増殖に適する通常の培地のいずれかである。リパーゼは、たとえば必要ならば細胞の分裂後に遠心分離または濾過により培地から細胞を分離し、塩たとえば硫酸アンモニウムを用いて上澄または濾液のタンパク質成分を沈でんさせ、銃いて様々なりロマトグラフ手法たとえばイオン交換クロマトグラフィ、アフイニティクロマトグラフィ等を用いて精製することにより常法にしたがって培地から回収される。

本発明はさらに添付の図面を用いて以下の例により説明されるが、これは本発明範囲をいかなる方法でも限定するものではない。

図において、第１図Ａ−Ｃはプソイドモナスセパシアｌｉｍ遺伝子のＤＮＡ配列を示し、誘導されたアミノ酸配列は通常の三文字コードで以下に示され、第２図Ａ−Ｃは〜３３ｋＤプソイドモナスセパシアリパーゼをコードするＤＮＡ配列を示し、誘導されたアミノ酸配列は通常の三文字コードで以下に示され、第３図はプラスミドｐＳＪ　５１Ｂの構築を図式的に示し、第４図はプラスミドｐｓＪ　９１０の構築を図式的に示し、第５図はプラスミドｐＳＪ　４８５の構築を図式的に示し、第６図Ａ−ＢはプラスミドｐＳＪ　６２２およびｐＳＪ　６２４の構築を図式的に示し、第７図はプラスミドｐＳＪ　４２４の構築を図式的に示し、第８図はプラスミドｐｓＪ　４９４と９０９の構築を図式的に示し、第９図はプラスミドｐＳＪ　７２９の構築を図式的に示し、第１０図はプラスミドｐＳＪ　４１６の構築を図式的に示し、第１１図はプラスミドｐＳＪ　６００の構築を図式的に示し、第１２図はプラスミドｐＳＪ　６７１の構築を図式的に示し、第１３図Ａ−ＢはプラスミドｐＳＪ　６６９の構築を図式的に示す。

材料および方法細菌株大腸菌ＨＷｒ　は、１９６６年ウッド（Ｗｏｏｄ）に記載された菌株８０３のｌａｃ　Ｉ　”、ｚＭ　１５誘導体である。大腸菌ＮＭ　５３９は１９８３９８３年フリシュアラフｒｉｓｃｈａｕｆ　ｅｔ　ａｌ、）により記載され、そしてプロメガ社から入手した。

プソイドモナスセパシアＳＢ　１０．　ＤＳＭ　３９５９は、国際特許出願第８９１０１０３２号に記載されている。

枯草菌ＯＮ　１８８５は枯草菌１６８のａｍｙＥ＋　ａｍｙＲ２，ｓｐｏ”　、　Ｐｒｏ”誘導体である。

バチルスリチェニホルミスＡＴＣＣ９７８９゜ストレプトミセスリビダンスＴＫ　２４は１９８３年ホップウッドら（Ｈｏｐｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、）により記載されている。

ファージ λＥＦＩＢＬ　４は１９８３９８３年フリシュアラフり記載されている。

これはプロメガ社から入手した。

プラスミドｐｕｃ　１８およびｐｏｃ　１９は１９８５年ヤーニッシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）らにより記載されている。

ｐＡＣＹＣ１７７は１９７８年チャン（Ｃｈａｎｇ）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）により記載されている。

ｐｌＪ　７０２は１９８３年カッッ（Ｋａｔｚ）らにより記載されている。

ｐｌＪ　４６４２は挿入に対し陽性の選択性を示す大腸菌クローニングベクターである。これはｐＩＪ６６６（キーザーＫｉｅｓｅｒおよびメルトンＭｅｌｔｏｎ、Ｇｅｎｅ　６５，１９８８．ｐ８３−９１）に似ているがしかしクローニングに関してより有益な部位を有する。これはティ、キーザーＴ、Ｋｉｅｓｅｒから入手された。

ｐＤＮ　１５２８は、通常の突然変異誘発法により作られるＡＴＣＣ９７８９のアミラーゼ過剰生産誘導体である、バチルスリチェニホルミス菌株ＯＮ　５２からのα−アミラーゼ遺伝子を含む２．３ｋｂＨｉｎｄｌＩ［−Ｓｐｈ　Ｉ断片を有するバチルスプラスミド９［ＪＢ　１１０（グリクザンＧｒｙｃｚａｎら、１９７８）の誘導体である。

ｐＰＬ　１１３１はアミラーゼプロモーターとｐＤＮ　１５２８のシグナルペプチド−コード領域とこれに続く合成リンカ−を含むｐＵＢ１１〇−誘導プラスミドである。

ｐＩＪ　２００２はストレプトミセスコエリコーラーＡ３　（２）のｄａｇＡ（アガラーゼ）遺伝子を含むｐＵｃ　１８誘導体であり、エム、ピップ（Ｍ−Ｂｉｂｂ）から得られた。

一般的方法：標準的ＤＮＡ操作は１９８２年にマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らにより記載されたように実質的に行なわれた。

制限酵素、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウフラグメント）、およびエキソヌクレアーゼ■はニューイングランドバイオラボズ社（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手されそして供給元が推奨しているように使用した。ヌクレアーゼＳｌおよび制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩはベーリンガーマンハイム社から人手されそして供給元が推奨しているように使用した。

鶏卵白リゾチームはシグマ社から入手された。

すべての菌株からのプラスミドの調製はキーザー（１９８４）により記載された方法で行なわれた。

λＤＮＡはプロメガ社からパッカジーン（Ｐａｃｋａｇｅｎｅ）抽出物を用いてインビトロでパッケージされた。

ＤＮＡ配列化は、放射性標識物として３’５ｄＡＴＰ（デュポン社ＮＥＮ　ＮＥＧＯ３４Ｈ，＞１０００Ｃｉ／ミリモル）を用いそして鋳型として変性プラスミドＤＮＡを用いてチェインターミネータ−法（サンガーＳａｎｇｅｒら、１９７７）により行なわれた。配列化は、フレノウフラグメントを用いて１９８６年にハラトリおよびササキにより記載されたように実施するか、または供給元（ユナイテッドステーツバイオケミカル社Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からの小冊子に記載されているようにシークエナーゼ５ｅｑｕｅｎａｓｅ登録商標を用いて実施された。

プライマーはニューイングランドバイオラボズ社がらのＭ１３配列化および逆配列プライマーまたは本発明者により調製されたクローン化プソイドモナスＤＮＡの領域に相補的なオリゴヌクレオチド（１７〜２１量体）のいずれがであった。

大腸菌の形質転換：大腸菌の細胞はマンデルＭａｎｄｅｌおよびヒガＨｉ、ｇａ、１９７０により記載されたようにコンピテントにされそして形質転換された。

枯草菌の形質転換ニヤスピンＹａｓｂｉｎら、１９７５により記載されたようにコンピテント細胞を調製し形質転換した。

バチルスリチェニホルミスの形質転換：アカマツＡｋａｍａｔｚｕ（１９８４）により記載されたようにポリエチレングリコール−仲介原形質体形質転換によりプラスミドをバチルスリチェニホルミスヘ導入した。

ストレプトミセスリビダンスの形質転換：ストレプトミセス属に対する形質転換および他の手法はホップウッド）ｌｏｐｗｏｏｄら、１９８５に記載されたようであった。

オリゴヌクレオチド合成：合成は〜ビューケージＢｅａｕｃａｇｅおよびカルサーズＣａｒｕ−ｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．１９８１．ｐｐｌＢ５９〜１８６９により記載されたホスホアミダイト法を用いて自動ＤＮＡ合成機中でファージＤＮＡの調製：ファージλＤＮＡは、マニアティスＭａｎｉａｔｉｓ　ら、１９８２において記載されているように小規模液体培地から調製された。

エキソ■欠失：ヘニコッフＨｅｎ１ｋｏｆｆ、１９８４に記載されているようにエキソヌクレアーゼ■を用いて一方向性欠失を行なった。

リパーゼ分析リパーゼは基質としてトリブチリンを用いてｐＨ−スタット法により測定した。

ＩＬＩＩ（リパーゼユニット）は、以下の条件下に１分間につき滴定可能な酪酸１マイクロモルを遊離する酵素の量である：温度　３０．０℃ ｐＨ７，０乳化剤　アラビアゴム、Ｌｇ／ｌ基　質　トリブチリン、　５０ａｄｉ／／！培地：ＴＹニトリブチカーゼ　２０ｇ／Ｉｔ酵母抽出物　５ｇ／ｌ。

ＦｅＣｊ！　ｚ　・４）１ｚ０　６１１ｇ／　ｉ。

ＭｎＣｊ！　ｚ　・４８ｚＯ１ｍｇ／　ｊ！ＭｇＣｊ！　４・７Ｈｚ０　１５■ ／１９Ｈ７，３ＢＰＸ：　ジャガイモデンプン　１００ｇ／ｌオオムギ粉　５０ｇ／１２ＲＡＮ　５０００　ＳＫＢ　Ｏ，１ｇ／ｌカゼイン酸ナトリウム　１０　ｇ　／　Ｉｌ大豆末　２０　ｇ　／　ｆＮａＺＨＰＯ４，１２８２０９ｇ　／　ｆプルロニック　０．１ｇ／ｆＬＢ寒天：　バクトートリブトン　１０　ｇ　／　ｆｆｉバクト酵母抽出物　５ａｉｌＮａＣ１１０ｇ　／　１バクト寒天　１５ｇ／ｊ！ＮａＯＨでｐＨ７，５まで調節トリブチリンを有するＬＢ寒天：溶かしたＬＢ寒天３５０ｄへトリブチリン３．５　ｄとアラビアゴム０．３５ｇを加え、混合物をウルトラトウルックス（ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘ）乳化剤を用いて乳化し、次いでオートクレーブする。

ナイルプルー指示薬プレート最下層は１５ａｒｊ！ＬＢ寒天からなる。

最上層は軟寒天（０，６％寒天を有するＬＢ）３ｍ、オリーブ油乳剤３００Ｉおよび５％ナイルブルー溶液（水中で作り滅菌濾過した＞２０ｄの混液を含有した。

オリーブ油孔剤ニオリーブ油　１０ｍアラビアゴム　Ｉｇ脱イオン水　９０ｄウルトラトウルックス乳化剤を用いて混合した。

緩衝液：ＴＥ緩衝液：１０５Ｍｌ−リス、ｐＨ８，１ａ＋ＭＥＤＴ＾、ｐＨ８ファージ緩衝液：　０．０１Ｍ　ＮａＣ１０，０１Ｍ　ＭｇＣｊ！　ｚ０．０１Ｍ　トリス・Ｈｌ、　ｐＨ７，０連結緩衝液：　０．０６６Ｍ　トリス・Ｈ（／！、　ｐＨ７，５０，０１Ｍ　Ｍｇ（／！□、２５眉／Ｍ１．ゼラチン、０．００１Ｍ　ＡＴＰ、０．０１Ｍ　ＤＴＴ例１プソイドモナスセパシアリパーゼ遺伝子のクローニングＡ）プソイドモナスセパシアＳＢ　１０からの染色体ＤＮＡの調製３ＩＩＩＴＹ培地からの凍結細胞のペレットを１■／Ｉ１１リゾチームを含むＴＥ緩衝液１ｍ中に再懸濁した。　ＥＤＴＡ　（０，５Ｍ、ｐＨ８，０）０．１ｍを加え、混合物を緩やかに撹拌しながら３７℃で１５分間インキュベートした。

２０％５Ｄ３５ｄを加え、溶液を界面が存在しなくなるまでフェノール（３００Ｉｌｌずつ）で繰り返し抽出した。次いで上澄をＣＨＣｆ、（３００ｍ）で−回抽出した。上澄９００ｊ１１へ、３Ｍ　Ｎａ−アセテート９０Ｉとイソプロパツール５００ｄを加えた。５〜１０分後、沈でんしたＤＮＡをプラスチック製の接種ループ上に回収し、７０および９６％エタノールで洗浄し、ＴＥ５００ｍ中に再懸濁した。染色体ＤＮＡ　（ｃｈｒ　ＤＮＡ）の溶液を一２０°Ｃに保持した。

Ｂ）プソイドモナスセパシアからのｃｈｒ　ＤＮＡの部分切断および分別プソイドモナスセパシアＳＢ　１０からのｃｈｒ　ＤＮＡ　８０　ｎ　（上記Ａ）で記載のように調製）を、供給元により推奨された緩衝液４００Ｉ中で３７° Ｃにて５分間５ａｕ３Ａ５単位で消化し、７０°Ｃで１０分間加熱し、そして全サンプルを分離用アガロースゲル上に載せた。電気泳動後、９−２３ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルセグメントを切断した。染色体ＤＮＡ断片はゲルセグメントを凍結／解凍後に形成した液体中に回収され、フェノールで２回、ＣＨ（４３で一回抽出し、エタノール沈でんし、そしてＴＥ緩衝液に溶かした。

Ｃ）λフアージ中のプソイドモナスセパシアＤＮＡライブラリィの構築 λＥＭＢＬ４　ＤＮＡ　２　ｇを制限酵素ＢａｍＨＩと５ａｌＩで完全に消化し、フェノールで２回とＣＨＣｌ１ｓで１回抽出し、エタノール沈でんしそしてＴＥ１０１１１中に再懸濁した。懸濁液をサイズ分別化ｃｈｒ　ＤＮＡ　（５０１１１ＴＥ中）２．５ｇと混合し、エタノールで沈でんさせ、連結緩衝液１０ｍ中に再懸濁させ、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ１００単で１６時間連結を実施した。次いで連結したＤＮＡを、プロメガ社製のパフカジーン（Ｐａｃｋａｇｅｎｅ）登録商標抽出剤を用いてλフアージ粒子へ詰め込み、ファージ緩衝液５００Ｉ中に希釈し、ＣＨ（１．５０ｄを加えた。これは拡大したファージストックを次のようにして作るために使用された：詰め込まれたファージ粒子をＴ　Ｙ　＋　０．　４％マルトース＋２０ｍＭＭｇ５Ｏ．中で増殖した大腸菌ＮＭ　５３９の新しく一晩培養したもの同量と混合し、３７°Ｃで２０分間吸着させ、そして２０５Ｍ　Ｍｇ５Ｏａを含む軟ＬＢ寒天（０，６％）４ｄ中に新しいＬＢプレートを薄く塗った。３７°Ｃで１６時間インキュベーション後、約２５００個のプラークを含む部分的に溶けた最上層をファージ緩衝液５ｄを含む４０ｊｄの遠心分離管へこすり取って入れ、ファージを２時間抽出した。ツルバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）　ＳＳ　３４回転機中で５分間５０００ｒｐｍにて遠心分離後上澄を拡大ストックとして保持しそしてスクリーニングのために使用した。

Ｄ）リパーゼ遺伝子を有する組換体λファージの単離拡大ライブラリィからの約２０００００個のファージをＮＭ５３９へ吸着させ、１％グリセロールトリブチレートエマルジョンを含む軟寒天中２０ＬＢプレート上に薄く塗り、その結果各プレート上が全部溶解した。１７０個の透明なプラーク（トリブチリンを加水分解）を濁ったトリブチリン乳剤中で同定し、多数を再度単離した。３５個のプラークをナイルブルー指示薬プレートに筋状に塗り、これらのうち１０個が陽性反応すなわち強い青色着色を示した。これらのファージのうち３つからファージＤＮＡを単離し、これは制限酵素消化に基づいて同一であることがわかった。

Ｅ）　ｐｕｃ　１９へのサブクローニング上記Ｄ）で調製されたファージＤＮＡ１ａｇを５ａｉｌで部分的に切断し、ｐＵＣ　１９　ＤＮＡを消化した５ａｌｌＯ．３ｔａｒと混合し、連結し、コンピテント大腸菌ＨＷＩへ形質転換しそしてアンピシリン２０（１＋ｇ／ｄを含むＬＢプレート上に薄く塗った。

これらのプレートをアンピシリン２　０　０　ｎ／ｄｉと１％グリセロールトリブチレート乳剤を有するＬＢプレート上で複製し、透明な輪で囲まれたコロニーを単離した。これらの１つ、５Ｊ１５０は、リパーゼ−コード遺伝子およびリパーゼモジュレーティング（ｌｉｎｅ）遺伝子を含む約６ｋｂのプラスミド、消化されたｐｓＪ１５０を有することがわかった。

Ｆ）ＤＮＡ配列化ｐＳＴ　１５０上に含まれるクローン化ＤＮＡのほとんどの配列は、上述の材料および方法に記載したように、二本鎖鋳型上で直接チェインターミネータ−法により決定された。両方のストランドの配列は、制限断片のサブクローニング、エキソヌクレアーゼ■を用いたクローン化ＤＮＡのいずれかの端部からの欠失、および合成オリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて決定した。これにより第２図Ａ−Ｃに示されたリパーゼコード配列と第１図Ａ−Ｃに示されたリパーゼモジュレータ−（Ｉ　ｆａｒ）コード配列の同定ができた。ｐｓＪ　１５０において、配列ＴＣＧはリパーゼストップコドン（ＴＡＡ）からリパーゼモジュレータ−スタートコドン（ＡＴＧ）を分離する。

例２プソイドモナスセパシアリパーゼの発現Ａ、大腸菌における未修飾リパーゼの発現（１）ｌｉｍを有しないｌｉｐプラスミドｐＳＪ　５１８は、第３図に示すように、ｐＳＪ　１５０からｐＵｃ　ｉ！３ヘリパーゼ（ｌｉｐ）遺伝子を含む１．５ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［Ｉ　−５Ｊ　５１８（ｐｓＪ　５１８を含む大腸菌ｕｈｌ）は１％グリセロールトリブチレートを含むプレート上に示されるよう、にいかなるリパーゼも生産しない（すなわち、コロニーを囲む輪がない）。

（２）同じプラスミドにおけるｌ　ｉｐ＋１１ｎｐＳＪ　１５０において、リパーゼはそれ自体からならびにｐｕＣ１９１ａｃプロモーターから発現される。クローン化したＤＮＡの同じフラグメントをしかしながらｌａｃプロモーターに関して反対方向で有するプラスミドｐｓＪ　９１０は、第４図に略示したように構築され、そして大腸菌ＨＷＩへ導入されて菌株ＳＪ　９１０を形成した。１％グリセロールトリブチレートを含むプレート上に薄く塗ると、ＳＪ　９１０コロニーはＳＪ　１５０のコロニーより小さい輪により囲まれた。これは、ｌｉｐおよびｌｉｍ遺伝子について大腸菌に活性なプロモーターの存在を示す。

ｌｉｐおよびｌｉｍ遺伝子間の領域は、リパーゼ発現に悪影響を与えることなく変化しうる。ｐｓＪ１５０はリパーゼストップコドンの後に単一のＣｌａｌ部位 −塩基対を含む、プラスミドｐＳＪ　４８５は、８塩基対Ｂｇｌｌ［リンカ−にューイングランドバイオラボズ）をＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウフラグメント）とｄＮＴＰの大断片を用いて充てんされたこのＣ１ａ　Ｉ部位へ挿入し、これにより１０塩基対が挿入される（第５図）ことにより構築された。菌株ＳＪ　４８５（ｐＳＪ　４８５を含む大腸菌Ｈ−１）はＳＪ　１５０と同じ量のリパーゼを生産した。

（３）別々のプラスミドにおけるｔｉｐおよび１１ｍ１１ｍ遺伝子はｐＳＪ　１５０から１．２　ｋｂ　Ｓｐｈ　Ｉ断片上で切り取られそしてｐＵｃ　１９のｓｐｈ　Ｉ部位へ挿入された。この結果、Ｊｉｍ遺伝子を正しく読むｌａｃプロモーターを有するプラスミドｐＳＪ　３７７とｌｉｍ遺伝子を逆に読％　１　ａ　ｃプロモーターを有するプラスミドｐＳＪ　３７８となった。ｐＳＪ　３７７およびｐＳＪ　３７８から、１．２ｋｂ挿入部＋ｌａｃプロモーターが１．５　ｋｂＰｖｕ　Ｕ断片として切り取られた。これはｐＡＣＹＣ１７７の旧ｎｄＩＩ部位へ挿入されてｐＳＪ　６２２　（ｐＳＪ　３７７から挿入）およびｐｓ、ｒ　６２４（ｐＳＪ　３７８から挿入）となった。ｐＳＪ　６２２とｐＳＪ　６２４の構築を第６図に概略示す。

プラスミドｐＳＪ　６２２　とｐＳＪ　６２４をコンピテントＳＪ　５１８　（リパーゼ遺伝子だけを有するｐｓ、ｙ　５１８を含む菌株）へ導入し、アンピシリンおよびカナマイシン耐性について選択し、そして形質転換体をグリセロールトリブチレートを含むプレート上で複製した。大きな輪がｐＳＪ　６２２を含む形質転換体の周囲に形成されるがｐＳＪ　６２４を含む形質転換体の周囲にはなく、このことは前者からリパーゼは生産するが後者からはしないことを示す。

Ｂ、大腸菌における修飾したリパーゼ遺伝子の発現（１）ｌｉｍを有しない１ｉｐｐｓ、ｙ　４９４はバチルス属においてプソイドモナスセパシアリパーゼについての発現プラスミドである。これはプロモーター、リポソーム結合部位および成熟リパーゼをコードするＤＮＡに骨組が融合したバチルスリチェニホルミスα− アミラーゼ遺伝子からのシグナルペプチドコード領域を有するが、しかしｌｉｍ遺伝子を含まない。ｐＳＪ　４９４の構築は第７図および第８図に略示する。融合領域の配列は以下のとおりである。

ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＣＧＧ　ＣＴＴ　ＴＡＣＧＣＣＣＧＡ　ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＣＴＧＭｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ α−アミラーゼシグナルペプチド５ｔＪＴＴＡ　ＴＴＴ　ＧＣＧ　ＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＡＴ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＧ　ＧＣＣＬｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ門１ｕＩＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＧＣＴＡＣＧＣＧ　ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＣＧＴ　ＴＡＣＣＣＧ　ＡＴＣ−−Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　−−（成熟リパーゼ配列このα−アミラーゼ／リパーゼ融合遺伝子を大腸菌へ導入するために、プラスミドｐＳＪ　９０９が構築された（第８図）。

菌株ＳＪ　９０９（ｐＳＪ　９０９を含む大腸菌Ｈ−１）はグリセロールトリブチレートを含むプレート上に何らの輪も作らない。

（２）別々のプラスミドにおけるｌｉｐおよびＩｉｍ菌株ＳＪ　９０９はコンピテントとなり、ｐＳＪ　３７７（第６図に示すように構築）またはｐＳＪ　７２９のいずれかで形質転換され、これはｌｉｍ遺伝子（第９図）の５′末端から約６００塩基対を欠失することによりｐＳＪ　３７７から導びかれた。二重の形質転換細胞をグリセロールトリブチレートを含むプレート上に筋状に付けると、ｐＳＪ　３７７を含むこれら（ｌｉｍ”プラスミド）がコロニーを囲む透明な輪郭を形成し、このことはリパーゼ生産を示し、一方ｐＳＪ　７２９を含むもの（ｌｉｍ−）はいかなる輪郭をも形成しない。

Ｃ６枯草菌における修飾したリパーゼ遺伝子の発現（１）ｌｉｍを有しないｌｉｐプラスミドｐＳＪ　４９３およびｐＳＪ　４９５はＢ、１）で記載されたｐｓＪ　４９４と同一で、アミラーゼ−リパーゼ融合物を有するがしかしｌｉｍ遺伝子は有しない。これらは枯草菌株ＤＮ　１８８５へ導入され、そして形質転換細胞をＢＰＸ増殖培地を含む振とうフラスコ中、オレイルアルコール３０ｇ／ｊ！までおよびクロラムフェニコール１２ｇ／Ｍ１まで添加しながら、３７°Ｃで４日間増殖した。

培養ブロス中のリパーゼ活性はＬＵ−滴定法（材料および方法に記載）により測定され、１−２ＬＵ／ｄ！であった。これは菌株ＤＮ　１８８５について見出されたバックグラウンドレベルを越えず、Ｑ　−５ＬＵ／ｄ！の間で変化する。

（２）同じプラスミドにおける１ｉｐとＪｉｍプラプラスミドｐＳＪ１６はｐＳＪ　４９３−４９５と同じアミラーゼ−リパーゼ融合物を含むが、しかしリパーゼ遺伝子はｐｓＪ　１５０と同じように正確にｌｉｍ遺伝子が直ちに下流に続＜　（ｐＳＪ　４１６の構築は第１０図に略示される）。

このプラスミドが上記のように振とうフラスコ中で増殖した枯草菌ＤＮ　１８８５および形質転換細胞へ導入されると、収率は４日間で４０ＬＵ／ｄに達した。

Ｄ、バチルスリチェニホルミスにおける修飾したリパーゼ遺伝子の発現（１）Ｊｉｍを有しないｌｉｐプラスミドｐＳＪ　４８８はｐＳＪ　４９３と同じアミラーゼ−リパーゼ融合物を含むが、しかしその宿主菌株へカナマイシン耐性を付与するバチルスベクターｐｐｔ　１１３１上にある（第１１図）。

このプラスミドを原形質形質転換によりバチルスリチェニホルミス菌株ＡＴＣＣ９７８９へ導入し、この形質転換細胞はグリセロールトリブチレートを含むプレート上に縞を引いた。形質転換細胞の周囲に形成された輪は非常に小さく、形質転換されない菌株の周囲に形成されたものと同じ大きさのものであった。

（２）同じプラスミド上のｌｉｐおよびＪｉｍプラスミドｐｓ、ｒ　６００はｐＳＪ　４８８と同じアミラーゼ−リパーゼ融合物を含むが、しかしリパーゼ遺伝子はｐｓ、ｒ　１５０と同じ方法で正確にｌｉｍ遺伝子が直接下流に続いている（第１１図にｐｓ、ｒ　６００の構築を略示する。）。このプラスミドを原形質形質転換によりバチルスリチェニホルミスＡＴＣＣ９７８９へ導入し、形質転換細胞をグリセロールトリブチレートを含むプレート上で筋状に付けると、顕著な輪がコロニーの周囲に形成されリパーゼ生産を示した。

Ｅ、ストレプトミセスリビダンスにおける修飾されたリパーゼ遺伝子の発現（１）ｌｉｍを有しない１ｉｐ−発現プラスミドｐＳＪ　６０４はプラスミドｐｒ、ｒ　２００２からの８８０ｂｐＨｉｎｄＩ［ｒ　−Ａｖａ■断片を単離することにより構築され、ｄａｇ＾プロモーターおよびシグナルペプチド−コード配列（バラトナ−（Ｂｕｔｔｎｅｒ）　ら、１９８７）の一部を有した。断片へ、以下に示す配列の２つの相補的ホスホリル化およびアニール化オリゴヌクレオチドを加えた：ＡｖａＵ　Ｍｌｕ　Ｉ　Ｘｈｏ　ＩＧＴＣＣＣＧＣＡ　ＣＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡ　ＴＧＣＣＧＣＡ　ＧＣＴＧＧＣＴＡＣＧＣＧＧＣＧＡＣＧＣＧＴＣＧＧＣＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＡ　Ｇ　ＴＡ　ＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＡ　ＴＧＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＡ　Ｇ　Ａ　ＧＣＴこの混合物を、予め旧ｎｄＩ［Ｉおよびｓａｌ　Ｉで消化されたｐＵＣ１９と連結してプラスミドｐＳＪ　６０４とした。

プラスミドｐＳＪ　６７１は、プロモーター、リポソーム結合部位およびストレプトミセスコエリコーラーアガロース遺伝子（ｄａｇ　Ａ　、バラトナーら、１９８７）のシグナルペプチドコード領域間の骨格融合物および成熟リパーゼをコードするＤＮＡを有する大腸菌−ストレプトミセスリビダンスシャトルプラスミドである。Ｊｉｍ遺伝子はプラスミド上に存在するが、しかしいかなる公知のプロモーターによっても転写されないような位置である。ｐｓＪ　６７１の構築は第１２図に略示され、融合領域の配列は次のとおりである：ＧＴＧ　ＧＴＣＡＡＣＣＧＡ　ＣＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣＡＴＣＡＡＧ　ＴＧＧ　ＡＧＴ　ＧＣＣＧＴＣＧＣＡＭｅｔ　Ｖａｌ　八ｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＡｌａアガロークシグナルペプチドｖａｌＣＴＣＧＧＡ　ＧＣＧ　ＧＧＴ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＣＴＣＧＣＧ　ＧＧＴ　ＣＣＣＧＣＡ　ＣＣＣＧＣＣＧＣＴ　ＣＡＴＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｈｉｓｌｕ　ＩＧＣＣＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＧＣＴＡＣＧＣＧ　ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＣＧＴ　ＴＡＣＣＣＧ　ＡＴＣ−Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌｊ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ；成熟ｌｉｐ　Ａ配列ｐＳＪ　６７１が原形質形質転換によりストレプトミセスリビダンスＴＫ　２４へ導入されそして得られた形質転換体をグリセロールトリブチレートを含むプレート上に筋状に引いた場合、非常に小さい輪がコロニーの周囲に形成され、これは少しまたはほとんどリパーゼが生産しないことを示す。

（２）同じプラスミド上の１ｉｐおよびｌｉｍｐＳＪ　６６９は、これがｐＳＪ　１５０と正く同じようにリパーゼ遺伝子からすぐ下流にｌｉｍ遺伝子を含むこと以外ｐＳＪ　６７１と同じである（ｐＳＪ　６６９の構築は第１３図に略示する）。

ｐＳＪ　６６９を上述のようにストレプトミセスリビダンスＴＫ　２４へ導入しそして形質転換細胞をグリセロールトリブチレート含有プレート上に縞状に引くと、ｐＳＪ　６７１の周囲のものと比較して非常に大きな輪がコロニーの周囲に形成された。

Ｆ、修飾されたｔｉｎ遺伝子の作用第６図に示されたように、ｐＳＪ　３７７は１ａｃＺプロモーターから発現されたｌｉｍ遺伝子を含む。このプラスミドはＣ１ａ　Ｉで消化され、Ｃ１ａｉの周囲の欠失はＥｘｏ　ＩＩ［を用いて生じた。このような欠失プラスミドの１つはｐＳＪ　７２１であり、１５塩基対が欠失して岩り、これは最初の２つのコドンだけが欠失するｌｉｍ遺伝子と融合したｐＵｃ１９１ａｃＺ遺伝子からの９個のＮ末端コドン＋ｌｉｐ遺伝子からの８個のＣ末端コドンから誘導される融合タンパク質を作った。融合領域の配列は以下のようである：５只σスター）　Ｊ−月」Ｃ−末端部分＾ＴＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＣＣＡ　ＡＧＣＴＴＧ　ＣＡＴ　ＧＣＧ　＾＾ＣＣＧＧ　ＣＴＧ　＾＾Ｇ　ＣＴＧＭｅｔ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ旧ｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ＾ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ：　Ｉｉｓ　ｆｒｏｍ　３．　ｃｏｄｏｎＧＣＧ　ＧＧＧ：ＧＣＡ　ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧＣＧＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＧＣＧ　ＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＴＧ１０＾１ａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ＶａｌＴＣａｌ融合構築物＋１ａｃプロモーターは、第６図に示されたｐｓＪ　６２２の構築と同じようにして、１．５　ｋｂ　Ｐｖｕ　ＩＩ断片としてｐＳＪ　７２１から切り取られ、ｐＡＣＹＣ１７７のＨｉｎｄｌ１部位へ挿入されｐＳＪ　８１２が得られた。

ｐＳＪ　８１２はコンピテントＳＪ　５１Ｂ　（リパーゼ遺伝子だけを有するｐＳＪ　５１Ｂを含む菌株）へ導入され、アンピシリンおよびカナマイシン耐性について選択し、形質転換細胞をグリセロールトリブチレート含有プレート上に複製した。形質転換体の周囲に形成された輪はｐｓＪ　６２２を有するＳＪ　５１８の形質転換体の周囲に形成されるものとほぼ同じ大きさであり、非修飾Ｊｉｍ遺伝子を発現する。

例３ポリペプチドをコードしたｌｉｍの発現および同定Ｊｉｍ遺伝子は１．１７　ｋｂ　Ｃ１ａ　Ｉ　−５ｐｈ　Ｉ断片としてｐＳＪ　１５０から切り取られ、ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントでプラント末端を作った後プラスミドｐＪＷ２（ウォンら、１９９０）のＮｄｅ　Ｉ部位へ挿入した０組換体プラスミドは２つの可能性のある方向のいずれかで挿入されたｌｉｍ遺伝子で得られた。ｐＣＢＥ　３およびｐＣＢＥ　４の両方ともｐＪＷ　Ｚ上で温度誘因λｐＲおよびｐＬプロモーターから転写について正方向で１ｉｍ遺伝子を含み、一方ｐｃＢＥ　２はＪｉｍ遺伝子を反対方向で含む。プラスミドを大腸菌ＪＡ　２２１　（クラークおよびカーボン、１９７８）へ導入し、ｐｔ、およびｐＲプロモーターからの転写を培養物の温度を４２°Ｃまで上げることにより引き起こした。誘導時に生じたタンパク質は引き起こされた培養物から採取された細胞のポリアクリルアミドゲル電気泳動により同定された。これによりｐＣＢＥ　３を有する形質転換体の誘発培養物中で見出された明白な分子量３４０００のタンパク質の同定がされたが、ｐＣＢＥ　２を有する形質転換体の誘発培養物中または非誘発培養物中には見られなかった。

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Claims

【特許請求の範囲】１．プソイドモナスセパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼの生産のモジュレーターとして途中で作用するファクターをコードするか、またはプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターの機能的類似物質をコードするＤＮＡ配列を含むものであって、前記プソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターまたはその機能的類似物質はプソイドモナスと異なる発現シグナルを用いてプソイドモナスセパシアリパーゼが発現する場合および／またはプソイドモナスセパシアリパーゼが異種宿主細胞中で発現する場合リパーゼ生産をモジコレートすることができるものを含むＤＮＡ構築物。２．ＤＮＡ配列がプソイドモナスセパシアの染色体から由来する請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ構築物。３．ＤＮＡ配列がプソイドモナスセパシア染色体上であって〜３３ｋＤリパーゼをコードするＤＮＡ配列の下流に位置する請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ構築物。４．ＤＮＡ配列が添付の第１図Ａ−Ｃに示されたものまたはプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターの機能的類似物質をコードするその修飾物である請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ構築物。５．プソイドモナスセパシアリパーゼまたはその誘導体をコードする第一のＤＮＡ配列および請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１に記載のプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターをコードする第二のＤＮＡ配列とからなるＤＮＡ構築物。６．第一のＤＮＡ配列が〜３３ＫＤリパーゼをコードする請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ構築物。７．ＤＮＡ配列が添付の第２図Ａ−Ｃに示されるものであるかまたはプソイドモナスセパシアリパーゼの誘導体をコードするその修飾物である請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ構築物。８．プソイドモナスセパシアリパーゼをコードするＤＮＡ配列がプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターをコードするＤＮＡ配列の上流に位置する請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ構築物。９．プソイドモナスセパシアリパーゼをコードするＤＮＡ配列がプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターをコードするＤＮＡ配列の下流に位置する請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ構築物。１０．第一および／または第二のＤＮＡ配列がさらにプソイドモナスのものと異なる発現シグナルを含む請求の範囲第５項〜第９項のいずれか１に記載のＤＮＡ構築物。１１．プソイドモナスセパシアリパーゼの生産のモジュレーターとして途中で作用するファクターをコードするかまたはプソイドモナスセパシアモジュレーティングフアクターの機能的類似物質をコードする挿入されたＤＮＡ配列を有するものであって、プソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターまたはその機能的類似物質がプソイドモナスと異なる発現シグナルを用いてプソイドモナスセパシアリパーゼが発現された場合および／またはプソイドモナスセパシアリパーゼが異種宿主細胞において発現された場合リパーゼ生産をモジコレートしうるものである複製可能な発現ベクター。１２．ＤＮＡ配列が請求の範囲第２項〜第４項のいずれか１に記載のものである請求の範囲第１１項に記載のベクター。１３．プソイドモナスセパシアリパーゼまたはその誘導体をコードする第一の挿入されたＤＮＡ配列および請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１に記載されたプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターをコードする第二の挿入されたＤＮＡ配列を有する複製可能な発現ベクタ１４．第一のＤＮＡ配列が〜３３ｋＤリパーゼをコードする請求の範囲第１３項に記載のベクター。１５．ＤＮＡ配列が添付の第２図Ａ−Ｂに示されるものまたはプソイドモナスセパシアリパーゼの誘導体をコードするその修飾物である請求の範囲第１４項に記載のベクター。１６．第一および第二のＤＮＡ配列が同じプロモーターから発現される請求の範囲第１３項に記載のベクター。１７．プソイドモナスセパシアリパーゼをコードする第一のＤＮＡ配列がプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターをコードする第二のＤＮＡ配列の上流に位置する請求の範囲第１６項に記載のベクター。１８．プソイドモナスセパシアリパーゼをコードする第一のＤＮＡ配列がプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターをコードする第二のＤＮＡ配列の下流に位置する請求の範囲第１６項に記載のベクター。１９．プソイドモナスセパシアリパーゼをコードする第一のＤＮＡ配列およびプソイドモナスセパシアリパーゼモジュレーティングファクターをコードする第二のＤＮＡ配列が別々のプロモーターから各々発現されたものである請求の範囲第１３項に記載のベクター。２０．第一および／または第二のＤＮＡ配列がさらにプソイドモナスのものと異なる発現シグナルからなる請求の範囲第１３項〜第１９項のいずれか１に記載のベクター。２１．プソイドモナスセパシアリパーゼまたはその誘導体をコードするＤＮＡ配列からなる第一のＤＮＡ構築物と請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１に記載の第二のＤＮＡ構築物とを含む宿主細胞。２２．第一のＤＮＡ構築物が〜３３ｋＤリパーゼをコードする請求の範囲第２１項に記載の宿主細胞。２３．ＤＮＡ構築物のＤＮＡ配列が添付の第２図Ａ−Ｂに示されるものまたはプソイドモナスセパシアリパーゼの誘導体をコードするその修飾物である請求の範囲第２２項に記載の宿主細胞。２４．第一および／または第二のＤＮＡ構築物がさらにプソイドモナスのものと異なる発現シグナルを含む請求の範囲第２１項〜第２３項のいずれか１に記載の宿主細胞。２５．請求の範囲第５項〜第１０項のいずれか１に記載のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。２６．第一のＤＮＡ構築物を有する複製可能な発現ベクターおよび請求の範囲第１１項に記載の複製可能な発現ベクターで形質転換された請求の範囲第２１項に記載の宿主細胞。２７．プソイドモナスセパシアリパーゼをコードするＤＮＡ配列がさらにプソイドモナスのものと異なる発現シグナルを含む請求の範囲第２６項に記載の宿主細胞。２８．請求の範囲第１３項〜第２０項のいずれか１に記載の複製可能な発現ベクターで形質転換された請求の範囲第２１項に記載の宿主細胞。２９．その染色体中に組込まれた第一のＤＮＡ構築物を有しそして請求の範囲第１１項に記載の複製可能な発現ベクターを含む請求の範囲第２１項に記載の宿主細胞。３０．その染色体中に組込まれた第二のＤＮＡ構築物を有しそして第一のＤＮＡ構築物を含む複製可能な発現ベクターを含む請求の範囲第２１項に記載の宿主細胞。３１．プソイドモナスセパシアリパーゼをコードするＤＮＡ配列およびリパーゼモジュレーティングファクターをコードするＤＮＡ配列が各々別のプロモーターから発現するようにその染色体中に組込まれた第一および第二のＤＮＡ構築物を有する請求の範囲第２１項に記載の宿主細胞。３２．細菌、酵母またはフィラメント状真菌である請求の範囲第２１項〜第３１項のいずれか１に記載の宿主細胞。３３．グラム陽性菌である請求の範囲第３２項に記載の宿主細胞。３４．グラム陽性菌が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスプレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａ−ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉ−ｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスコアグユランス（Ｂａｃｉ−ｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒ−ｃｕｌａｎｓ）またはストレプトミセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）もしくはストレプトミセスムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｕｒｉｎｕｓ）からなる群から選択される請求の範囲第３３項に記載の宿主細胞。３５．グラム陰性菌たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である請求の範囲第３２項記載の宿主細胞。３６．リパーゼまたは類似物質の生産を助成する条件下で請求の範囲第２１項〜第３５項のいずれか１に記載の宿主細胞を培養し、そして培地からリパーゼまたは類似物質を回収することからなるプソイドモナスセパシアリパーゼまたはその誘導体の生産方法。