JPH07135980A - シュードモナス菌リパーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 工業的に利用価値の高いシュードモナス属細
菌由来のリパーゼの提供。 【構成】 配列番号１のＤＮＡ配列を有するシュードモ
ナス セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃ
ｉａ）１ＦＯ１４５９５株由来のリパーゼ遺伝子と活性
発現を調節する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。該組換え
体ＤＮＡを用い培養ろ液中へのリパーゼ分泌生産をする
ことを特徴とするリパーゼの製造法。 【効果】 本発明において組換えリパーゼを培養ろ液中
に分泌生産させることが可能となった。これにより、工
業生産の際リパーゼの培養ろ液中からの回収を行うこと
ができ、リパーゼの安価な供給が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、シュードモナス菌由来
のリパーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列、該ＤＮＡ
配列を含む組換え体ＤＮＡおよび該組換え体ＤＮＡによ
って形質転換された宿種菌を培養し、培養ろ液中にリパ
ーゼを分泌させて生産することを特徴とするリパーゼの
製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術とその問題点】リパーゼは脂質を加水分解
する酵素として油脂加工、臨床診断薬、洗剤、消化薬な
どに使用されるほか、近年は化成品、特に光学活性化合
物の製造法となるエステルの加水分解、エステル合成、
あるいはエステル交換を触媒する重要な酵素である。ま
た、シュードモナス属細菌は、エステルの加水分解、エ
ステル合成、あるいはエステル交換の触媒として有用な
リパーゼを生産することが知られている（特開昭６２−
１６６８９８）。そしてこれらのリパーゼについては工
業的に大量利用が実施されている。それゆえ、工業用酵
素としてのリパーゼは、熱安定性や特徴ある基質特異性
の他に安価な供給ということが望まれている。近年組換
えＤＮＡ技術の発達により、工業的利用価値のある酵素
遺伝子が単離され、そのＤＮＡ配列が明らかにされてい
る。そして、その技術を利用して生産効率を向上し、
熱、有機溶媒等に対して安定性の増大した酵素、あるい
は基質特異性に特徴のあるものを生産することが検討あ
るいは生産されている。シュードモナス属細菌由来のリ
パーゼについても、遺伝子が単離され、その一次構造や
組換えリパーゼの製造法について報告されている（特開
昭６３−１８７６８４、特開昭６４−７４９９２、特開
平２−１９０１８８、特開平３−４７０７９）。これら
は、生産するための諸因子が解っている事、発現ベクタ
ー等が多数開発されているという事で組換え物質の生産
に有利な大腸菌を宿種菌として使用している。しかし、
これら従来法は大腸菌を超音波処理等で破砕することに
より組換えリパーゼを製造することを特徴としており、
工業生産上不利である。それゆえ、工業生産上有利な培
養ろ液中にリパーゼを分泌生産させることを特徴とする
ＤＮＡを持った宿種菌の開発が必要とされている。一般
に異種遺伝子の分泌生産については未知な部分が多く、
分泌生産させるタンパク質の一次構造、宿種菌、シグナ
ルペプチドなどの諸因子について検討する必要がある。
シュードモナス属細菌のリパーゼにおいても、これらの
因子や、リパーゼ活性発現を調節する遺伝子（特開平３
−８７１８７、特開平４−１６９１８４）について検討
されなければならない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者等は、
シュードモナス属細菌由来のリパーゼを将来的に熱に対
する安定性や基質特異性等の点で一層利用価値の高いも
のへ誘導し、工業的に大量利用することを目的として、
まず工業生産上有利な培養ろ液中にリパーゼを効率良
く、大量に生産させることを特徴とするＤＮＡをもった
宿種菌の開発をめざした。そして鋭意研究の結果、シュ
ードモナス セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅ
ｐａｃｉａ）ＩＦＯ１４５９５株のリパーゼ遺伝子のク
ローニング及びＤＮＡ配列の決定を行い、かかるＤＮＡ
配列を含む組換え体ＤＮＡを導入した宿主菌を用いてリ
パーゼを培養ろ液中に生産させることを特徴とする宿種
菌−リパーゼ生産用組換え体ＤＮＡの系を構築し、本発
明を完成させるに至った。以上の説明から明らかなよう
に本発明の目的は、工業的に有用性の高いリパーゼへの
誘導とその有利な生産性を提供することである。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】本発明は、下記（１）
〜（７）の構成を有する。 （１）配列番号１のＤＮＡ配列を有することを特徴とす
るシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由
来のリパーゼ遺伝子。 （２）配列番号２のＤＮＡ配列を有することを特徴とす
るシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由
来のリパーゼ活性の発現に必要な因子をコードする遺伝
子。 （３）シュードモナス属細菌がシュードモナス セパシ
ア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）ＩＦＯ
１４５９５株である前記第１項記載のリパーゼ遺伝子。 （４）前記第１，２，３項記載のリパーゼ遺伝子もしく
はリパーゼ活性の発現に必要な因子をコードする遺伝子
をベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ。 （５）前記第４項記載の組換え体ＤＮＡによって形質転
換された宿種菌。 （６）前記第５項記載の宿種菌を培養し、その培養ろ液
中にリパーゼを分泌生産させることを特徴とするリパー
ゼの製造法。 （７）前記項第４項記載のベクターが大腸菌用ベクター
であり、かつ、前記第５項記載の宿種菌が大腸菌である
ことを特徴とする前記第６項記載のリパーゼの製造法。

【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）リパーゼ遺伝子のクローニング シュードモナス セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｃｅｐａｃｉａ）ＩＦＯ１４５９５株染色体ＤＮＡは、
例えばSmith らの方法（Smith,M.G.,Methods in Enzymo
logy,Academic press,New,York,12,part A,p.545,(196
7))を用いて調製することができる。リパーゼ遺伝子の
クローニングは、Saiki らのPolymerase Chain Reactio
n （ＰＣＲ）法（Saiki,R.K.et al.,Science,230,1350-
1354,(1985))を用いて行うことができる。この時、リパ
ーゼ遺伝子のクローニングに用いるプライマーは、既知
リパーゼのアミノ酸配列を比較検討することにより、よ
く保存された部位またはよく保存されていることが充分
期待できる部位から選び出さなければならない。そして
ＰＣＲ法で得たリパーゼ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片
をスクリーニング用プローブとして使用することによ
り、シュードモナス セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｃｅｐａｃｉａ）ＩＦＯ１４５９５株の染色体ＤＮ
Ａライブラリーよりリパーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａを得ることができる。リパーゼ遺伝子の発現に必要な
領域は、スクリーニングより得たリパーゼ遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡを各種制限酵素を用いてサブクローニン
グし、かかる形質転換株のトリブチリン寒天培地上での
クリアーゾーン形成能を調べることによって決定でき
る。リパーゼ遺伝子およびその発現に必要な領域のＤＮ
Ａ配列は、ジデオキシ（dideoxy)法（Sanger.F. et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,p.5463(1977)）など
公知の手法を用いて決定することができる。

【０００６】（２）培養ろ液中へのリパーゼの生産 上記のようにして得られたリパーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を大腸菌やシュードモナス属細菌内で複製可能な異
種遺伝子の生産用に開発されたプラスミドベクターに導
入することにより、リパーゼ発現用組換え体ＤＮＡを構
築することができる。このようなプラスミドベクターに
例えば大腸菌発現用としてｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社
製）ｐＫＫ２２３−３プラスミド（ファルマシア社製）
などが、またシュードモナス属細菌発現用としてｐＭＭ
Ｂ６６ＥＨ（Furste,J.P.et al.,Gene,48,p.119-131(19
86) ）などがあげられる。しかしこれらのベクターはリ
パーゼの培養ろ液中への分泌生産を期待させるものでな
い。リパーゼの培養ろ液中への分泌生産は、これらのベ
クターを基本とする分泌生産に関与する諸因子について
考慮された組換え体ＤＮＡと宿種菌の系を構築すること
によって達成される。例えば、リパーゼのシグナルペプ
チドとリパーゼ活性発現を調節する遺伝子を考慮にいれ
て構築された図５に示した組換え体ＤＮＡプラスミドｐ
ＴＶ−ＣＰＣｍｕｔＮがあげられる。

【０００７】以下実施例にて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 （１）染色体ＤＮＡの調整 シュードモナス セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｃｅｐａｃｉａ）ＩＦＯ１４５９５株を２００ｍｌのＬ
Ｂ培地（１％バクトトリプトン、０. ５％酵母エキス、
０. ５％塩化ナトリウム）で３０℃にて一晩培養した。
菌体を集菌し、洗浄した後、１２ｍｌの５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０）、１０ｍＭＥＤＴＡ溶液に
懸濁した。この懸濁液に１ｍｇのリゾチームを加え、１
時間室温に放置した。この溶液に０. ５％ＳＤＳ存在
下、１００μｇ／ｍｌの濃度となるようにプロテナーゼ
Ｋ（メルク社製）を加え、３時間５５℃でゆるやかに振
盪させ菌体を溶菌させた。この試料をフェノール抽出、
エタノール沈澱することによって染色体ＤＮＡを調整し
た。

【０００８】（２）リパーゼ遺伝子のクローニングと解
析 ＰＣＲ法によるリパーゼ遺伝子クローニングに使用した
プライマーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ
ＩＦＯ１２０４９株リパーゼ遺伝子（Aoyama S.et al.,
FEBS Lett.,242,p.36,(1988)）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｓｐ．ＫＷＩ‐５６株リパーゼ遺伝子（Iizumi T.
et al.,Agric.Biol.Chem.,55.p.2349,(1991)）、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ＤＳＭ３９５９株
リパーゼ遺伝子（J φrgensen S. et al.,J.Bacterio
l.,173.p.559,(1991) ）などを比較検討し、以下のアミ
ノ酸に対応するＤＮＡ配列を選んだ。 Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile センス鎖プライマーＡＯＮ−２ 5'- GCG GCG ACG CG(T/C) TA(C/T) CCG AT-3' Trp Asn His Leu Asp Glu Ile アンチセンス鎖プライマー 3'- ACC TTG GT(A/G) GAG CTG CTC TAG-5' ＡＯＲ−４ ＰＣＲ法は、宝酒造社製のＰＣＲ法専用試薬キットを使
用し、以下の条件下で行った。 反応液 Pseudomonas cepacia IFO14595染色体ＤＮＡ １μｇ ＡＯＮ−２プライマー １００ｐｍｏｌ ＡＯＲ−４プライマー １００ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ溶液 １０ｍＭ １０Ｘ反応バッファー １０μｌ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２. ５Ｕｎｉｔ ───────── 計 １００μｌ 反応条件 熱変性 ９４℃、１分 アニーリング ６２℃、１. ５分 ＤＮＡ合成 ７２℃、１. ５分 サイクル数 ３０回 このようにして増幅したＤＮＡ断片を回収し、ｐＵＣ１
３ベクターにサブクローニングしたのち、ジデオキシ法
にてＤＮＡ配列を決定し、リパーゼ遺伝子の一部をコー
ドしていることを確認した。

【０００９】次に、ＰＣＲ法で得たＤＮＡ断片をプロー
ブとして用い、、制限酵素ＥｃｏＲＩ消化したＰｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ＩＦＯ１４５９５株
染色体ＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーション
（Sourthern,E.M.,J.Mol.Biol.,98,p.503,(1975)）を行
った。その結果、約１３. ５ｋｂの位置にプローブに相
補的なＤＮＡ断片を検出した。これらの方法は、ノンラ
ジオシステムＤＮＡ標識及び検出キット（ベーリンガー
マンハイム山之内社製）の方法に従った。次に、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ＩＦＯ１４５９５
株染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、アガロー
スゲル中で電気泳動し、その１３. ５ｋｂ断片を回収し
た。この回収ＤＮＡ断片をＣｈａｒｏｍｉｄ９−４２
（日本ジーン社製）のＥｃｏＲＩ部位にＤＮＡリガーゼ
を用いて連結した。連結したＤＮＡはλＤＮＡインビト
ロパッケージングキットＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＰＬＵ
Ｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてファージ粒子
として大腸菌ＶＣＳ２５７株を感染させ、形質導入し
た。この形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含むＬＢ培地にプレーティングした。３７℃で一晩培養
して得た約２００００個の形質転換体に対し、上記ＰＣ
Ｒ法で得たＤＮＡ断片を標識し、これをプローブとし、
コロニーハイブリダイゼーション法を用いたスクリーニ
ングを行った。その結果５０個の陽性クローンを得るこ
とができた。この５０個の陽性クローンのうち７個につ
いてＣｈａｒｏｍｉｄＤＮＡを調整し制限酵素による解
析をおこなったところ全て同一のものであり、この組換
え体ＣｈａｒｏｍｉｄＤＮＡをｐＣＰＣとした。また、
ｐＣＰＣを導入された大腸菌はクリアーゾーン形成能を
有した。次にｐＣＰＣを各種制限酵素で切断し、各ＤＮ
Ａ断片をｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にサブクローニン
グして、大腸菌ＪＭ８３株を形質転換させ、トリブチリ
ン含有ＬＢ培地でのクリアーゾーン形成の有無を調べ
た。ｐＣＰＣの制限酵素地図とクリアーゾーン形成を指
標とした欠失実験の結果を図１に示した。リパーゼをコ
ードする遺伝子とその発現に必要な領域が、ＳｔｕＩ−
ＥｃｏＲＩ２．８ｋｂＤＮＡ断片中に存在することが示
唆された。このＳｔｕＩ−ＥｃｏＲＩ２．８ｋｂＤＮＡ
断片を有すプラスミドをｐＣＰＣ―ＳＥとした。

【００１０】（３）塩基配列の決定 ジデオキシ法により、ｐＣＰＣ―ＳＥの挿入ＤＮＡ断片
の塩基配列を決定した。その結果、配列番号１のリパー
ゼ遺伝子をコードするオープンリーディングフレームと
その下流に、配列番号２のリパーゼ活性の発現に必要な
因子をコードするオープンリーディングフレームの存在
が確認された。また、配列番号１のオープンリーディン
グフレーム中には、特開平３−８７１８７、特開平３−
４７０７９のリパーゼのアミノ酸との比較からシグナル
ペプチドが存在することがわかった。挿入ＤＮＡ断片の
ＤＮＡ配列と、対応するリパーゼおよびリパーゼの活性
発現を調節する遺伝子のアミノ酸配列を図２，３および
４（註、全体として一つの遺伝子）に示した。

【００１１】（４）リパーゼの培養ろ液中への分泌生産 ｐＣＰＣ−ＳＥ中のリパーゼ遺伝子の開始コドン部に

【００１２】

【化１】

【００１３】（＊変異導入箇所）の変異導入プライマー
を用い制限酵素ＮｃｏＩ部位を導入し、ｐＣＰＣ−ＳＥ
ｍｕｔＮとした。変異の導入は宝酒造社製のＭｕｔａｎ
−Ｋの操作法に従った。ｐＣＰＣ−ＳＥｍｕｔＮのＮｃ
ｏＩ−ＥｃｏＲＩ２．５ｋｂＤＮＡ断片をｐＴＶ１１８
Ｎ（宝酒造社）のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位に導入しリ
パーゼ発現プラスミドｐＴＶ１１８−ＣＰＣｍｕｔＮを
構築した（図５）。このｐＴＶ１１８−ＣＰＣｍｕｔＮ
を大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。この大腸菌ＪＭ１０
９（ｐＴＶ１１８−ＣＰＣｍｕｔＮ）株をＬＢ培地で３
７℃一晩培養し、その２００μｌを新しいＬＢ培地に植
菌した。３７℃で２時間培養した後、終濃度が１ｍＭと
なるようにＩＰＴＧ（Isopropyl β-D-thiogalactopyra
noside）を加えた。更に同条件下で２時間培養した後、
培養ろ液についてリパーゼ活性をリパーゼキットＳ（大
日本製薬社）を用いて測定した。その結果、培養ろ液１
００μｌあたり１４００ＢＡＬＢ単位であった。同様な
条件下で測定した大腸菌ＪＭ１０９株の値は、測定感度
下限（５０ＢＡＬＢ単位）以下であった。なお測定法お
よび測定単位の計算法はリパーゼキットＳの方法に従っ
た。以上の実施例における菌体からのプラスミドＤＮＡ
の調製、制限酵素などを用いた反応およびＤＮＡ断片の
処理は、特に指定されている以外は通常用いられている
方法によって行った。また、制限酵素、ＤＮＡリガーゼ
などは、宝酒造社と日本ジーン社のものを使用した。

【００１４】以上詳細に説明したように、本発明により
リパーゼをコードする遺伝子が提供され、該遺伝子を組
み込んだ形質転換株を培養することによって培養ろ液中
へのリパーゼの分泌生産することができる。このように
して製造されるリパーゼは安価な供給のための工業的大
量生産の分野等に利用できる。本発明の遺伝子の配列表
は以下の通りである。

【００１５】

【配列表】

【００１６】配列番号：１ 配列の長さ：１０９５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ 株名：ＩＦＯ１４５９５

【００１７】 配列 ATGGCCAGAT CGATGCGTTC CAGGGTGGTG GCAGGGGCAG TGGCATGCGC GATGAGCGTC 60 GCGCCGTTCG CGGGGACGAC CGCAGTGATG ACGCTTGCGA CGACGCACGC AGCGATGGCG 120 GCGACCGCGC CCGCCGACGA CTACGCGACG ACGCGTTATC CGATCATCCT CGTGCACGGG 180 CTCACGGGCA CCGACAAGTA CGCGGGCGTG CTCGAGTACT GGTACGGCAT CCAGGAAGAC 240 CTGCAGCAGC ATGGCGCGAC CGTCTACGTC GCGAACCTGT CGGGCTTCCA GAGCGATGAC 300 GGCCCGAACG GGCGCGGCGA ACAGCTGCTC GCTTACGTGA AGACGGTGCT CGCCGCGACG 360 GGCGCGACCA AGGTCAATCT CGTCGGTCAC AGCCAGGGCG GGCTCACGTC GCGTTATGTC 420 GCGGCCGTCG CGCCCGATCT CGTCGCGTCG GTGACGACGA TCGGCACGCC GCATCGCGGC 480 TCCGAGTTCG CCGACTTCGT GCAGAGCGTG CTCGCATACG ATCCGACCGG GCTTTCGTCG 540 TCGGTGATCG CCGCGTTCGT CAATGTGTTC GGAATCCTGA CGAGCAGCAG TCACAACACG 600 AACCAGGACG CGCTCGCGTC GCTGAAGACG CTGACGACCG CACAGGCCGC CACGTACAAC 660 CAGAACTATC CGAGCGCGGG CCTTGGCGCG CCGGGCAGTT GCCAGACCGG CGCACCGACG 720 GAAACCGTCG GCGGCAACAC GCATCTGCTG TATTCGTGGG CCGGCACGGC GATCCAGCCG 780 ACGCTCTCCG TGTTCGGTGT CACGGGTGCG ACGGACACGA GCACCATTCC GCTCGTCGAC 840 CCGGCGAACG CGCTCGATCT GTCGACGCTC GCGCTGTTCG GCACGGGCAC GGTGATGATC 900 AACCGCGGCT CGGGCCAGAA CGACGGGCTC GTGTCGAAGT GCAGCGCGCT GTACGGCCAG 960 GTGCTGAGCA CGAGCTACAA GTGGAACCAT ATCGACGAGA TCAACCAGTT GCTTGGCGTG 1020 CGCGGCGCGT ATGCGGAAGA TCCGGTCGCG GTGATCCGCA CGCATGCGAA CCGGCTGAAA 1080 CTGGCGGGCG TGTAA 1095

【００１８】配列番号：２ 配列の長さ：１０３５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ 株名：ＩＦＯ１４５９５

【００１９】 配列 ATGACGGCAC GTGAAGGGCG CGCGCCGCGG GCGCGGCGCG CTGTGGTCTA CGGTGTCGCG 60 GGGCTGGCGG CGATCGTCGG CGTCGCGATG TGGAGCGGTG CGGGATGGCA TCGCGATACG 120 GGTAGCACCG GCGAGTCGCC CGATGCTGCG GCGGTGGGCG GCGTGGCTGC GGCACCGCCG 180 CAGGCCGCCG TGCCGGCGAG CGCGGGCCTG CCGTCGTCGC TGGCCGGTTC CAGCGCGCCG 240 CGGCTGCCGC TCGATGCCGG CGGCCATCTC GCGAAGGTGC GCGCGGTACG CGATTTCTTC 300 GATTACTGCC TGACCGCGCA GAGCGATCTC AGTACGGCCG CGCTCGATGC GCTCGTCGCG 360 CGCGAGATTG CCGCGCAGCT CGACGGTACG GTTGCGCAGG CCGACGCGCT CGACGTGTGG 420 CGCCGGTATC GCGCGTATCT CGACGCGCTC GCGAAACTGC GCGATGCCGG CGCGGTCGAC 480 AAGTCCGACC TGGGCGCGCT GCAGCTCGCG CTCGACCAGC GCGCGTCGAT CGCGTATCGC 540 ACGCTCGGCG ACTGGAGTCA GCCGTTCTTC GGCGCGGAGC AGTGGCGGCA GCGCTACGAT 600 CTCGCACGGC TGAAGATCGC GCAGGATCGC ACGCTGACCG ATGCGCAGAA GGCCGAACGG 660 CTCGCGGCGC TCGAGCAGCA GATGCCGGCC GACGAACGCG CGGCGCACGA GCGGGTCGAC 720 CGGCAGCGGG CCGCGATCGA CCAGATCGCG CAGTTGCAGA AGAGCGGGGC GACGCCCGAT 780 GCGATGCGCG CGCAACTGAC GCAGACGCTC GGGCCCGAGG CCGCCGCACG CGTCGCGCAG 840 ATGCAGCAGG ACGACGCATC GTGGCAGAGC CGCTACGCGG ACTATGCGGC ACAGCGTGCG 900 CAGATCGAGT CGGCCGGCCT GTCGCCGCCG GACCGCGACG CGCAGATCGC CGCACTGCGG 960 CAGCGCATGT TCACGAAGCC CGGCGAAGCC GTGCGCGCGG CGTCGCTCGA TCGCGGCGCG 1020 GGCAGCGCGC AGTAA 1035

【図面の簡単な説明】

図１〜５は、本発明の説明図である。

【図１】ｐＣＰＣの挿入ＥｃｏＲＩ１３．５ｋｂＤＮＡ
断片の制限酵素地図の一例とプラスミドｐＵＣ１１９に
サブクローニングした時のクリアーゾーン形成の有無を
指標とした欠失実験の結果を示し、＋はクリアーゾーン
形成を示す。

【図２】本発明の遺伝子のアミノ酸配列である。

【図３】図２につづくアミノ酸配列である。

【図４】図３につづくアミノ酸配列である。

【図５】大腸菌用リパーゼ分泌生産プラスミドｐＴＶ−
ＣＰＣｍｕｔＮを示す。

【手続補正書】

【提出日】平成６年８月４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００８】 （２）リパーゼ遺伝子のクローニングと
解析 ＰＣＲ法によるリパーゼ遺伝子クローニングに使用した
プライマーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ
ＩＦＯ１２０４９株リパーゼ遺伝子（Ａｏｙａｍａ
Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２４２，
ｐ．３６，（１９８８））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．ＫＷＩ−５６株リパーゼ遺伝子（Ｉｉｚｕｍｉ
Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，５５．ｐ．２３４９，（１９９１））、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ＤＳＭ３９５９株リ
パーゼ遺伝子（Ｊ φｒｇｅｎｓｅｎ Ｓ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３．ｐ．５５
９，（１９９１））などを比較検討し、以下のアミノ酸
に対応するＤＮＡ配列を選んだ。 ＰＣＲ法は、宝酒造社製のＰＣＲ法専用試薬キットを使
用し、以下の条件下で行った。 このようにして増幅したＤＮＡ断片を回収し、ｐＵＣ１
３ベクターにサブクローニングしたのち、ジデオキシ法
にてＤＮＡ配列を決定し、リパーゼ遺伝子の一部をコー
ドしていることを確認した。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:38）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１のＤＮＡ配列を有することを
   特徴とするシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
   属細菌由来のリパーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号２のＤＮＡ配列を有することを
   特徴とするシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
   属細菌由来のリパーゼ活性の発現に必要な因子をコード
   する遺伝子。
3. 【請求項３】 シュードモナス属細菌がシュードモナス
   セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉ
   ａ）ＩＦＯ１４５９５株である請求項第１項記載のリパ
   ーゼ遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項第１，２，３項記載のリパーゼ遺
   伝子もしくはリパーゼ活性の発現に必要な因子をコード
   する遺伝子をベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮ
   Ａ。
5. 【請求項５】 請求項第４項記載の組換え体ＤＮＡによ
   って形質転換された宿種菌。
6. 【請求項６】 請求項第５項記載の宿種菌を培養し、そ
   の培養ろ液中にリパーゼを分泌生産させることを特徴と
   するリパーゼの製造法。
7. 【請求項７】 請求項第４項記載のベクターが大腸菌用
   ベクターであり、かつ、請求項第５項記載の宿種菌が大
   腸菌であることを特徴とする請求項第６項記載のリパー
   ゼの製造法。