DE69028769T2

DE69028769T2 - Thermostabile (1,3-1,4)-beta-glucanase

Info

Publication number: DE69028769T2
Application number: DE69028769T
Authority: DE
Inventors: Rainer Institut Fuer Mikrobiologie D-O-1017 Berlin Borriss; Juergen Hofemeister; Ole Dk-2300 Copenhagen S Olsen; Karl Kristian Dk-4200 Slagelse Thomsen; Dietrich Dk-3500 Vaerlose Von Wettstein; O-4325 Gatersleben Zentralinstitut Fuer Genetik
Original assignee: Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung; Carlsberg AS
Current assignee: Carlsberg AS
Priority date: 1989-02-16
Filing date: 1990-02-16
Publication date: 1997-05-22
Anticipated expiration: 2010-02-17
Also published as: PT93181A; WO1990009436A1; AU5101390A; CA2050468C; EP0458846A1; DE69028769D1; JP2530942B2; ES2092504T3; DK0458846T3; ATE143688T1; AU638695B2; EP0458846B1; CA2050468A1; JPH05504462A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanasen, die Verwendung neuer thermostabiler (1,3-1,4)-β-Glucanasen, solche Glucanasen codierende DNA-Fragmente, die DNA-Fragmente exprimierende Organismen und ein Verfahren zur Herstellung von thermostabilen (1,3-1,4)-β- Glucanasen.

TECHNISCHER HINTERGRUND

(1,3-1,4)-β-Glucanasen werden zur Herstellung verschiedener Nahrungsmittelprodukte und Tierfuttermittel sowie als Hilfsstoffe in der biologischen Forschung verwendet, wenn die Spaltung von β-glykosidischen Bindungen in (1,3-1,4)-β-Glucanen erforderlich ist. Insbesondere in der Brauerei-Industrie erlaubt die Verwendung solcher Glucan-hydrolysierender Enzyme die Anwendung größerer Anteile unbehandelter Körner anstelle von Malz, ohne daß dies zu Problemen bei der Filtration aufgrund einer hohen Viskosität der Maische führt, die durch eine erhöhte Menge an Glucan- Verbindungen bewirkt werden könnte.
Die gemischten verknüpften (1,3-1,4)-β-Glucane bilden bei Getreide, wie Hafer und Gerste, den Hauptteil der Endosperm-Zellwand. Sie können in der Brauerei- Industrie ernste Probleme verursachen, wie z.B. eine verringerte Ausbeute des Extrakts oder langsamere Trennung der Bierwürze oder Bier-Filtration. Im fertigen Bier verbleibende β-Glucane können zur Bildung von Trübungen und gelatineartigen Niederschlägen führen (Godfrey, 1983). (1,3-1,4)-β-Glucanasen der Gerste (EC 3. 2. 1. 73) werden im Scutelum und der Aleuron-Schicht während früher Stadien der Samenkeimung synthetisiert (McFadden et al., 1988). Ein großer Teil der Malz-β-Glucanase wird jedoch während des Darrens irreversibel hitzeinaktiviert und die Rest-Aktivität wird während des Maischens schnell zerstört (Loi et al., 1987).
Es ist seit langem bekannt, daß die Viskosität der Würze durch die Verwendung von β-Glucanasen aus mesophilen Bacillus-Stämmen, z.B. aus Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus subtilis, verringert werden kann. Ein großer Nachteil der bekannten Glucanasen ist ihre Temperatur-Empfindlichkeit, was bedeutet, daß sie nur während der frühen Phase des Maischverfahrens wirksam sind. Später, wenn die Temperaturen über 65ºC liegen, ist ihre Aktivität erheblich verringert.
Bei einem Versuch zur Gewinnung einer thermostabileren Glucanase wurde das Glucanase codierende Gen aus Bacillus macerans in Bacillus subtilis eingeführt, um das Gen in diesem Organismus zu exprimieren (DD- Patentanmeldung WP C12N/315 706 1). Bei 70ºC wird jedoch auch diese Glucanase schnell und irreversibel denaturiert. Ein anderer Nachteil der bekannten Glucanasen in bezug auf das Brauverfahren ist, daß diese Glucanasen im pH-Bereich von 4 bis 5, der eine normale Bedingung während des Maischens ist, nicht ihre volle Aktivität zeigen. Bei einem pH-Wert von 4,6 beträgt die Aktivität der Bacillus-β-Glucanase beispielsweise nur etwa 20% der bei einem pH-Wert von 6 bis 7 gezeigten Aktivität. Bei Inkubation bei einem pH-Wert von 4 ist außerdem die Stabilität verringert.
Die am besten charakterisierten bakteriellen (1,3-1,4)-β-Glucanasen sind die Glucanasen von Bacillus subtilis und B. amyloliquefaciens, wobei die Gene, die diese Enzyme codieren, cloniert und sequenziert worden sind (Borriss et al., 1985; Cantwell und McConnell, 1983; Hofemeister et al., 1986; Murphy et al., 1984). Vor kurzem wurde festgestellt, daß die Thermostabilität der β-Glucanase von B. macerans höher als die der B. subtilis- und B. amyloliquefaciens-Enzyme ist (Borriss, 1981; Borriss und Schroeder, 1981). Bei für das industrielle Maischen typischen Temperaturen, die 65ºC übersteigen, und pH-Werten von 4,5 bis 5,5 wird die β-Glucanase von B. macerans schnell inaktiviert. Das Gen für die B. macerans-β-Glucanase ist doniert (Borriss et al., 1988) und seine Nucleotidsequenz bestimmt worden (Borriss et al., in Vorbereitung). Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz der B. macerans-β-Glucanase mit den abgeleiteten Sequenzen der β-Glucanasen von B. subtilis und B. amyloliquefaciens zeigt eine Homologie von insgesamt 70%.
Während der letzten Jahre ist eine ganze Reihe von Versuchen unternommen worden, verbesserte Formen existierender biologisch aktiver Proteine zur besseren Anpassung an industrielle Verfahren und Erweiterung ihres Anwendungsbereiches zu konstruieren. Großes Interesse wurde der Erhöhung der Enzym-Thermostabilität geschenkt. Man hat die Vermutung geäußert, daß die Thermostabilität von Enzymen durch den Austausch einzelner Aminosäuren erhöht werden kann, wobei die Entropie bei der Auflösung der Faltstruktur gesenkt wird (Matthews et al., 1987). Es sind mehrere vorläufige Regeln zur Erhöhung der Thermostabilität von Proteinen aufgestellt worden (Argos et al., 1979; Imanaka et al., 1986; Querol und Parilla, 1987). Die Schwierigkeit, genaue Vorhersagen über Funktionsveränderungen als Folge von Strukturveränderungen zu treffen, bleibt jedoch bestehen.
Verschiedene Forscher haben Experimente zur in vitro-Rekombination homologer Gene durchgeführt, wodurch Hybridproteine entstehen, die die biologische Aktivität der Eltemmoleküle beibehalten. Sowohl Streuli et al. (1981) als auch Weck und Mitarbeiter (1981) haben Hybridgene für menschliches Leukozyten-Interferon konstruiert. Einige der Hybridinterferone schützten einen größeren Wirtszell-Bereich gegen vesiculäre Stomatitis und das Enzephalomyokarditis-Virus. AD-Hybride, die Teile der Interferone A und D kombinieren, induzierten daher in Maus-L-929-Zellen, menschlichen HeLa-Zellen und Kaninchen-Nieren-Primärzellen signifikant höhere antivirale Aktivitäten als jedes der Eltern-Moleküle. Hinsichtlich Hitzestabilität, pH-Stabilität und Antigen-Spezifität waren die Hybrid- und Eltern-Interferonmoleküle gleich.
Die Dänische Patentanmeldung 3368/87 offenbart die Kombination von DNA- Sequenzen der α-Amylase-Gene von Bacillus licheniformis und Bacillus amyloliquefaciens, wobei ein chimäres α-Amylase-Enzym zur Verflüssigung von Stärke erhalten wurde, das keine negative Wirkung auf das Gewichtsprozentmaximum von Dextrose hatte, das bei Verzuckerung mit einer Glykoamylase erhältlich ist. Durch die chimäre α-Amylase wurde diese negative Wirkung herabgesetzt und die thermostabilen Eigenschaften blieben im Vergleich zu den Eltern-Enzymen erhalten.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase, die nach 10-minütiger, vorzugsweise nach 15-minütiger, besonders bevorzugt nach 18-minütiger Inkubation in 10 mM CaCl&sub2; und 40 mM Na-Acetat bei einem pH-Wert von 6,0 und 70ºC mindestens 50% ihrer Aktivität beibehält, wobei die Konzentration der (1,3-1,4)-β-Glucanase in der inkubierten Lösung in einem Bereich von 0,3 bis 1 mg pro ml liegt und unter der Aktivität der (1,3-1,4)-β- Glucanase die Fähigkeit des Enzyms zur Hydrolyse von β-glykosidischen Bindungen in (1,3-1,4)-β-Glucanen verstanden wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "thermostabil" die Widerstandsfähigkeit eines Enzyms gegenüber Denaturierung und die Beibehaltung der enzymatischen Aktivität bei hohen Temperaturen über eine ausreichend lange Zeitspanne, die es dem Enzym erlaubt, sein Substrat in die Reaktionsprodukte umzuwandeln, d.h. im vorliegenden Fall die β-glykosidischen Bindungen in (1,3-1,4)-β-Glucanen zu spalten, wobei reduzierende Zucker erhalten werden. Mit hohen Temperaturen sind Temperaturen über 60ºC gemeint.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase, die nach 10-minütiger Inkubation in Zell-Rohextrakten bei 65ºC und einem pH-Wert von 4,0 eine relative β-Glucanase-Aktivität von mindestens 100%, vorzugsweise mindestens 110% und besonders bevorzugt mindestens 120% aufweist. Ein Beispiel für ein solches charakteristisches Verhalten der erfindungsgemäßen (1,3-1,4)-β-Glucanase ist in Figur 10 gezeigt, in der die relative β-Glucanase-Aktivität des Hybrid-Enzyms H1 mit den relativen β-Glucanase-Aktivitäten der β-Glucanasen von B. amyloliquefaciens und B. macerans verglichen wird. In Figur 10 ist gezeigt, daß die relative β- Glucanase-Aktivität des Enzyms H1 nach 10-minütiger Inkubation etwa 130% beträgt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Hybrid-Gene konstruiert, die rekombinante Bacillus-(1,3-1,4)-β-Glucanasen codieren, die thermostabiler als alle bis jetzt bekannten (1,3-1,4)-β-Glucanasen sind. Die Hybridgene wurden durch den reziproken Austausch von Amino-terminalen und Carboxyterminalen Teilen der β-Glucanase codierenden Gene von Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus macerans konstruiert, indem eine in der Mitte des (1,3-1,4)-β-Glucanase-Gens von B. amyloliquefaciens bzw. B. macerans befindliche gemeinsame Restriktionsstelle der Endonuclease EcoRV als Fusionspunkt verwendet wurde oder Hybrid-Fusionsgene unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach Yon und Fried (Nucleic Acid Research 17 (1989), 4895) sowie Horton et al. (Gene 77 (1989), 61-68) konstruiert wurden.
Das β-Glucanase-Hybridenzym 1 (H1) enthält 107 Amino-terminale Aminosäure- Reste der reifen B. amyloliquefaciens-β-Glucanase und 107 Carboxy-terminale Aminosäure-Reste der B. macerans-β-Glucanase. Das reziproke β-Glucanase- Hybridenzym 2 (H2) besteht aus 105 Amino-terminalen Resten des B. macerans- Enzyms und 107 Carboxy-terminalen Aminosäure-Resten des B. amyloliquefaciens-Enzyms. Die zwei Hybridenzyme unterscheiden sich bezüglich der biochemischen Eigenschaften signifikant voneinander ebenso wie von beiden Eltern-β-Glucanasen.
Die Hybridenzyme H3, H4, H5 und H6 wurden unter Verwendung des PCR- Verfahrens konstruiert. H3 enthält 16 Amino-terminale Aminosäure-Reste der reifen B. amyloliquefaciens-(1,3-1,4)-β-Glucanase und 198 Carboxy-terminale Aminosäure-Reste der B. macerans-β-Glucanase. H4 enthält 36 Amino-terminale Aminosäure-Reste der reifen B. amyloliquefaciens-β-Glucanase und 178 Carboxy-terminale Reste der B. macerans-β-Glucanase. H5 enthält 78 Aminoterminale Aminosäure-Reste der reifen B. amyloliquefaciens-(1,3-1,4)-β- Glucanase und 136 Carboxy-terminale Aminosäure-Reste der reifen B. macerans-β-Glucanase und H6 enthält 152 Amino-terminale Reste der reifen B. amyloliquefaciens-β-Glucanase und 62 Carboxy-terminale Aminosäure-Reste der reifen B. macerans-(1,3-1,4)-β-Glucanase.
Im Vergleich zu den Eltern-Enzymen zeigen die Hybridproteine neuartige biochemische Eigenschaften, wie z.B. unterschiedliche pH-Optima, Thermostabilität und Unterschiede in der pH-Toleranz. Das Protein H1 ist für die Brauerei-Industrie von besonderem Interesse, da dieses Protein niedrigere pH- Werte toleriert, ein niedriges pH-Optimum für seine enzymatische Aktivität aufweist und darüberhinaus bei hohen pH-Werten eine größere Thermostabilität als die B. macerans-β-Glucanase zeigt. Das pH-Optimum und insbesondere die pH-Toleranz sind zu saureren Bedingungen hin verschoben und die Thermostabihtät ist im gesamten getesteten pH-Bereich größer als die beider Eltern-Enzyme.
Aufgrund ihrer Eigenschaften bietet die erfindungsgemäße thermostabile (1,3- 1,4)-β-Glucanase jedoch auch andere interessante Verwendungsmöglichkeiten dort, wo eine enzymatische (1,3-1,4)-β-Glucanase-Aktivität bei hoher Temperatur und möglicherweise niedrigem pH-Wert gewünscht ist, z.B. bei der Herstellung von Kaffee-Ersatzstoffen oder Futterpellets, insbesondere zur Verwendung als Geflügelfutter. Geflügel kann β-Glucane im Futter nicht abbauen. Pelletiertes Futter, das große Mengen an β-Glucanen enthält, verursacht ein verringertes Futter/Gewichtszunahme-Verhältnis und auch Verdauungsstörungen.
Der Abbau von β-Glucanen im Futter durch Zugabe von (1,3-1,4)-β-Glucanasen zum Futter ist deshalb ein Vorteil. Die Produktion von Futterpellets erfolgt bei hohen Temperaturen, was den schnellen Abbau von nicht-thermostabilen (1,3- 1,4)-β-Glucanasen bedeutet. Dieses Problem kann jetzt durch die Verwendung der erfindungsgemäßen thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase in der Produktion gelöst werden.
Bei der Konstruktion eines Hybridgens, das eine thermostabile (1,3-1,4)-β- Glucanase codiert, kann man nach unterschiedlichen Strategien vorgehen. Man kann andere Restriktionsstellen im (1,3-1,4)-β-Glucanase-Gen verwenden, man kann die Nucleotidsequenz des (1,3-1,4)-β-Glucanase-Gens mit einer Nuclease spalten und anschließend synthetische Nucleotidsequenzen einführen, die nützliche Endonuclease-Restriktionsstellen enthalten, oder man kann vollständig oder teilweise ein synthetisches Gen konstruieren. Zur Gewinnung eines Hybridgens, das eine thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase codiert, können auch (1,3-1,4)-β-Glucanase-Gene verwendet werden, die aus anderen Organismen als B. amyloliquefaciens oder B. macerans stammen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine thermostabile Hybrid-( 1,3-1,4)-β-Glucanase, die eine Aminosäuresequenz mit der Formel
A - M
umfaßt, wobei A ein Polypeptid ist, das aus 5 - 200 Aminosäuren besteht, die zu mindestens 75%, vorzugsweise zu mindestens 85%, bevorzugter zu mindestens 90% mit den in Tabelle I angegebenen Aminosäure-Resten des N-terminalen Teils der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus macerans identisch sind, und M ein Polypeptid ist, das aus 5 - 200 Aminosäuren besteht, die zu mindestens 75%, vorzugsweise zu mindestens 85%, bevorzugter zu mindestens 90% mit den in Tabelle I angegebenen Aminosäure-Resten des Carboxy-terminalen Teils der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus macerans oder Bacillus amyloliquefaciens identisch sind.
Der Begriff "identisch mit" bedeutet einen Vergleich zwischen zwei Polypeptiden oder Teilen davon hinsichtlich ihrer Aminosäure- Gesamtzusammensetzung. Bei jedem Polypeptid wird sowohl die Anzahl einzelner Aminosäure-Reste als auch die Gesamtzahl der Aminosäure-Reste bestimmt. Danach wird das Maß an Übereinstimmung durch das Verhältnis der Anzahl identischer Aminosäure-Reste von zwei Polypeptiden zur Gesamtzahl der Aminosäure-Reste des zu vergleichenden Polypeptids angegeben. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird das Maß der Übereinstimmung als Prozentsatz der Aminosäuren der erfindungsgemäßen (1,3-1,4)-β-Glucanase oder einem Teil davon bestimmt, die mit den Aminosäuren eines anderen Polypeptids oder einem Teil davon identisch sind, im vorliegenden Fall sind das der in Tabelle I angegebene Amino-terminale Teil der (1,3-1,4)-β-Glucanase von B. amyloliquefaciens oder B. macerans und der in Tabelle I angegebene Carboxy-terminale Teil der (1,3-1,4)-β-Glucanase von B. macerans oder B. amyloliquefaciens bezogen auf die Gesamtzahl von Aminosäure-Resten des Teiles einer (1,3-1,4)-β-Glucanase, der verglichen wird. Es sollte beachtet werden, daß eine Übereinstimmung nicht von der Aminosäure-Position in den Polypeptiden abhängig ist und insofern absolut ist, als eine Übereinstimmung nicht damit zusammenhängt, ob zwei Aminosäuren mit unterschiedlichen chemischen Formeln mögliche homologe Funktionen aufweisen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung versteht man unter dem Amino-terminalen Teil eines Polypeptids den Teil eines fraglichen Polypeptids oder eines Teils davon, dessen Anzahl von Aminosäuren bestimmt wird und der an seinem Ende eine freie α-NH&sub2;-Gruppe besitzt. Unter dem Carboxyterminalen Teil eines Polypeptids versteht man den Teil eines fraglichen Polypeptids oder eines Teils davon, dessen Anzahl von Aminosäuren bestimmt wird und der an seinem Ende eine freie α-COOH-Gruppe besitzt.
Bei einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein Signalpeptid, das den Protein-Transport aus der Zelle heraus ermöglicht, mit dem Aminoterminalen Ende der thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase verknüpft sein. Das Signalpeptid kann ein Signalpeptid sein, das vom entsprechenden Teil nativer (1,3-1,4)-β-Glucanase-Gene in Bakterien oder anderen Mikroorganismen, wie z.B. Hefe und Pilze, codiert wird. Es kann synthetischen Ursprungs sein oder aus einer Kombination natürlicher und synthetischer Quellen hervorgegangen sein. Die Wahl eines Signalpeptids hängt vom Mikroorganismus ab, der zur Expression der thermostabilen (1,3-1,4)-β- Glucanase verwendet wird. Vorzugsweise ist das Signalpeptid ein homologes (arteigenes) Signalpeptid des fraglichen Mikroorganismus. Bei Verwendung von Hefe zur Expression sollte das Signalpeptid z.B. zu Hefe homolog sein, um den Transport der thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase aus der Hefezelle heraus zu ermöglichen. Ein geeignetes Hefe-Signalpeptid ist das Signalpeptid der Invertase, die bekanntlich eines der wenigen sezernierten Proteine in Hefen, wie z.B. Saccharomyces-Arten, ist. Zum Transport der thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase aus der Hefezelle heraus können jedoch auch andere Signalpeptide verwendet werden, z.B. das Signalpeptid des α-Faktors und das der sauren Phosphatase.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Signalpeptid auf der vorstehend definierten Aminosäure-Ebene zu mindestens 75%, vorzugsweise zu mindestens 85% und bevorzugter zu mindestens 90% mit dem Signalpeptid der β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens identisch.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase, die die folgende Aminosäuresequenz:
oder Analoge davon umfaßt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine thermostabile (1,3-1,4)-β- Glucanase mit der folgenden Aminosäuresequenz:
oder Analoge davon.
Die allgemein anerkannten Abkürzungen für Aminosäuren sind in der folgenden Tabelle angegeben:
Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Analog" bedeutet ein Enzym mit einer Aminosäure-Zusammensetzung oder -Sequenz, die der von der erfindungsgemäßen (1,3-1,4)-β-Glucanase stammenden charakteristischen Aminosäure-Sequenz ähnlich ist, wobei kleinere Variationen möglich sind, die jedoch auf die enzymatische Aktivität und die Thermostabilität des Analogs keine nachteilige Wirkung haben. Analoge Polypeptide oder Proteine können von anderen Mikroorganismen als B. amyloliquenfaciens und B. macerans stammen oder können teilweise oder vollständig synthetischen Ursprungs sein.
Die Aminosäuren der (1,3-1,4)-β-Glucanase können gegebenenfalls modifiziert worden sein, z.B. durch chemische, enzymatische oder eine andere Behandlung, die auf die spezifische Aktivität der (1,3-1,4)-β-Glucanase und deren Thermostabilität keine wesentliche nachteilige Wirkung ausübt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Fragment, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine vorstehend beschriebene thermostabile Hybrid-(1,3-1,4)-β-Glucanase codiert. Das DNA-Fragment kann bei einem Verfahren zur Herstellung einer (1,3-1,4)-β-Glucanase unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken eingesetzt werden. Die Verwendung des erfindungsgemäßen DNA-Fragments bei der Herstellung einer rekombinanten (1,3-1,4)-β-Glucanase (z.B. durch Insertion des Fragments in einen geeigneten Vektor, Transformation eines geeigneten Wirts- Mikroorganismus mit dem Vektor, Züchtung des Mikroorganismus zur Produktion der (1,3-1,4)-β-Glucanase und anschließende Gewinnung des Enzyms aus den Mikroorganismen) hat eine ganze Reihe von Vorteilen. Auf diese Weise ist es möglich, große Mengen an (1,3-1,4)-β-Glucanase bereitzustellen und das produzierte Enzym in einer im wesentlichen reinen Form, d.h. frei von verunreinigenden Stoffen, zu isolieren.
Die erfindungsgemäße (1,3-1,4)-β-Glucanase kann auch mit Hilfe der wohlbekannten Peptidsynthese-Verfahren in Flüssigkeit oder an Festphasen hergestellt werden, indem die einzelnen Aminosäuren der Polypeptid-Sequenz nacheinander verknüpft oder einzelne Aminosäuren zu Fragmenten der Polypeptid-Sequenz verknüpft werden, die anschließend gekoppelt werden und so zum gewünschten Polypeptid führen. Die Peptidsynthese an Festphasen kann z.B. wie von Merrifield beschrieben (1963) durchgeführt werden. Bei der Festphasen-Synthese wird die Aminosäuresequenz aufgebaut, indem eine erste Aminosäure an einen festen Träger gekoppelt wird und anschließend die anderen Aminosäuren der Sequenz durch Peptid-Bindungen schrittweise angelagert werden, bis die gewünschte Länge erreicht ist. Die Herstellung synthetischer Peptide zur Verwendung für Diagnose-Zwecke kann im wesentlichen wie von Shinnick (1983) beschrieben durchgeführt werden.
Ein besonderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Fragment, das im wesentlichen die Nucleotidsequenz:
oder ein Analog oder eine Untersequenz davon umfaßt.
Jedes Nucleotid der vorstehenden Sequenz ist durch eine allgemein verwendete Abkürzung dargestellt, d.h.
A ist Adenin
T ist Thymidin
G ist Guanin
C ist Cytosin.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Analog" ein DNA-Fragment bezeichnen, das eine oder mehrere Modifikationen in der Nucleotidsequenz enthält, wobei die Modifikationen dadurch gekennzeichnet sind, daß das modifizierte DNA-Fragment eine Hybrid-(1,3-1,4)-β-Glucanase mit vorstehend definierten Temperaturstabilitäts-Eigenschaften codieren kann. Die Modifikationen umfassen z.B. Basen-Substitutionen, die keinen Einfluß auf die vom DNA-Fragment codierte resultierende Aminosäuresequenz haben, Substitutionen einzelner Basenpaare, die zur Codierung funktionell äquivalenter Aminosäuren führen, Deletionen und Anlagerungen zusätzlicher Sequenzen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Untersequenz" eine DNA-Sequenz, die einen Teil der vorstehend gezeigten DNA-Sequenz oder andere erfindungsgemäße DNA-Sequenzen umfaßt und die Fähigkeit zur Expression einer (1,3-1,4)-β-Glucanase mit vorstehend definierten Temperaturstabilitäts-Eigenschaften beibehalten hat. Dazu gehören analoge Untersequenzen, die wie vorstehend erklärt, durch Modifikationen erhalten werden.
Ein die (1,3-1,4)-β-Glucanase codierendes DNA-Fragment oder ein Teil davon kann einer Mutagenese unterworfen werden, z.B. durch Behandlung mit ultravioletter Bestrahlung, ionisierenden Strahlen oder einem chemischen Mutagen, wie Mitomycin C, 5-Bromuracil, Methylmethansulfonat, Hydroxylamin, Stickstoffsenfgas oder einem Nitrofuran, um einige der Eigenschaften des von der mutierten Sequenz exprimierten Genprodukts zu verändern, ohne daß die enzymatische Aktivität und die Thermostabilitäts- Eigenschaften des Genprodukts wesentlich beeinträchtigt werden. Zur Verbesserung der Thermostabilität, des pH-Optimums der enzymatischen Aktivität und anderer nützlicher Eigenschaften der (1,3-1,4)-β-Glucanase sind insbesondere eine ortsgerichtete Mutagenese oder eine gerichtete Mutagenese geeignet.
Ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment kann durch Substitution, Anlagerung, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Nucleotide in der Sequenz modifiziert worden sein, um eine Sequenz zu erzeugen, die bei Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus zur Produktion einer (1,3-1,4)-β-Glucanase mit den vorstehend definierten Temperaturstabilitäts-Eigenschaften führt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion einer thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase, umfassend die Züchtung eines Mikroorganismus, in den ein vorstehend beschriebenes DNA- Fragment auf eine solche Weise eingeführt worden ist, daß der Mikroorganismus die thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase produzieren kann, wobei die Züchtung unter Bedingungen durchgeführt wird, die zur Produktion der thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase führen, sowie die Gewinnung der thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase aus der Kultur.
Geeignete Expressionsvektoren zur Produktion einer (1,3-1,4)-β-Glucanase oder eines Teils davon sind Vektoren, die sich nach Transformation eines Wirtsorganismus in diesem replizieren können. Der Vektor kann entweder ein zur autonomen Replikation fähiger Vektor sein, wie z.B. ein Plasmid, oder ein Vektor, der zusammen mit dem Chromosom des Wirtes repliziert wird, wie z.B. ein Bakteriophage. Beispiele für allgemein verwendete geeignete Vektoren sind sowohl pBR322 und damit verwandte Vektoren als auch pUC-Vektoren und ähnliche Vektoren. Beispiele geeigneter Bakteriophagen umfassen M13 und λ. Beispiele für selbständig replizierende Hefe-Vektoren sind Vektoren, die den für eine autonome Replikation verantwortlichen Teil der Hefe-2µ-DNA enthalten.
Der Organismus, der den Vektor mit dem erfindungsgemäßen DNA-Fragment oder einen Teil davon enthält, kann ein beliebiger Organismus sein, der zur Expression dieses DNA-Fragments fähig ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Organismus um einen Mikroorganismus, wie z.B. Hefe oder ein Bakterium. Hefen, wie Saccharomyces-Arten, besitzen von Natur aus einige Eigenschaften, die für die Produktion extrazellulärer Proteine sehr vorteilhaft sein können. Normalerweise sezernieren Hefen nur sehr wenige Proteine in das Medium, in dem sie gezüchtet werden. Die Isolierung und Aufreinigung eines in Hefe produzierten rekombinanten Proteins ist deshalb relativ einfach, falls dieses Protein aus der Hefezelle sezerniert werden kann. Um eine Sekretion einer thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase zu erreichen, muß ein Signalpeptid mit dem N-terminalen Ende des Enzyms verknüpft werden. Das in Hefe produzierte Invertase-Enzym ist eines der wenigen Hefe-Proteine, die aus der Hefezelle sezerniert werden. Es ist daher zu erwarten, daß das Signalpeptid der Hefe- Invertase geeignet ist, den Transport der thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase aus der Hefezelle heraus zu ermöglichen. Als Wirtsorganismen können jedoch auch sowohl gram-positive als auch gram-negative Bakterien verwendet werden. Ein gram-negatives Bakterium wie E. coli ist besonders geeignet, jedoch können auch gram-positive Bakterien wie B. subtilis und andere Typen von Mikroorganismen verwendet werden, wie z.B. Pilze oder solche, die üblicherweise zur Produktion rekombinanter DNA-Produkte verwendet werden.
Bei Verwendung eines Mikroorganismus zur Expression des erfindungsgemäßen DNA-Fragments hängen die Züchtungsbedingungen typischerweise vom Typ des verwendeten Mikroorganismus ab. Der Fachmann weiß, welches Züchtungsverfahren auszuwählen und wie dieses Verfahren zu optimieren ist.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Pflanze, die ein vorstehend beschriebenes DNA-Fragment exprimieren kann. Es kann vorteilhaft sein, eine Pflanze zu konstruieren, die in ihren Körnern und Keimlingen eine thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase exprimieren kann, da es somit nicht notwendig ist, der Maische das Enzym beispielsweise während des Brauverfahrens zuzusetzen. Vorzugsweise handelt es sich bei der Pflanze um Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Reis oder Mais oder um eine beliebige andere Pflanze, die zur Produktion von Bier, Kaffee-Ersatzstoffen und Futter sowie bei anderen Produktionsverfahren verwendet wird, bei denen der Abbau von β- Glucanen durch eine (1,3-1,4)-β-Glucanase erforderlich ist. Eine Pflanze, die im Vergleich zu einer natürlichen Pflanze eine erhöhte (1,3-1,4)-β-Glucanase- Aktivität aufweist, ist z.B. als Rohmaterial für die Bierproduktion von Vorteil, da eine erhöhte β-Glucanase-Aktivität zu verminderten β-Glucan-Mengen in der Bierwürze führt, wodurch die Filtration erleichtert und die Qualität des Endproduktes verbessert wird. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein genetisches Konstrukt, das sich zur Produktion einer vorstehend definierten thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase eignet, d.h. einer von einem vorstehend beschriebenen DNA-Fragment codierten (1,3-1,4)-β-Glucanase, wobei das Konstrukt 1) eine Regulationssequenz aufweist, die 2) mit einem vorstehend definierten DNA-Fragment funktionell verbunden ist, das eine (1,3- 1,4)-β-Glucanase codiert und möglicherweise eine ein Signalpeptid codierende Nucleotidsequenz enthält, und 3) eine DNA-Sequenz zur Transkriptions- Termination umfaßt, die mit dem DNA-Fragment von 2) funktionell verbunden ist.
Das genetische Konstrukt, das zur Produktion einer erfindungsgemäßen (1,3- 1,4)-β-Glucanase verwendet werden kann, oder ein Teil davon wird vorzugsweise zur Konstruktion einer Pflanze verwendet, die im Vergleich zu einer das genetische Konstrukt nicht enthaltenden Pflanze erhöhte β- Glucanase-Aktivität aufweist. Dies muß jedoch nicht der Fall sein, da eine ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment exprimierende Pflanze eine geringere β- Glucanase-Aktivität aufweisen kann, die jedoch bei hohen Temperaturen erhalten bleibt. Bei der Konstruktion einer Pflanze, die eine temperaturtolerante β-Glucanase produziert und möglicherweise eine im Vergleich zur nicht-modifizierten Pflanze erhöhte β-Glucanase-Aktivität aufweist, sollte man darauf achten, daß das genetische Konstrukt in Geweben oder Zellen aktiv ist, in denen die (1,3-1,4)-β-Glucanase für die gewünschte Aktivität erforderlich ist oder aus denen der Transport der β-Glucanase an den Ort der Aktivität erfolgen kann. Das genetische Konstrukt kann zusammen mit einem anderen (1,3-1,4)-β- Glucanase-Gen oder anstelle dieses Gens insertiert werden. Die Insertion kann so erfolgen, daß das Konstrukt unter der Kontrolle von Regulationssequenzen eines Pflanzen-Gens steht und keine weiteren Regulationssequenzen erforderlich sind. In bestimmten Pflanzen, wie z.B. Mais, Reis und Weizen, ist jedoch kein (1,3-1,4)-β-Glucanase-Gen vorhanden. Um eine Expression des insertierten β-Glucanase-Gens in der Pflanze zu erreichen, ist es deshalb erforderlich, Regulationssequenzen zur Kontrolle der Expression des insertierten β-Glucanase-Gens einzuführen oder in einer anderen Ausführungsform andere Regulationssequenzen der Pflanze zur Expressions- Kontrolle zu nutzen. Die Einführung einer DNA in eine Pflanzenzelle kann z.B. durch direkte Injektion von DNA in nackte Protoplasten oder durch Einschießen von DNA-beschichteten Partikeln in die Zellen oder Protoplasten erfolgen.
Eine im vorstehend definierten genetischen Konstrukt enthaltene Regulationssequenz ist vorzugsweise ein pflanzlicher Promotor, wie z.B. ein konstitutiver oder regulierbarer pflanzlicher Promotor. Wenn das genetische Konstrukt in einer genetisch veränderten Pflanze verwendet werden soll, ist der Promotor vorzugsweise ein in einer Pflanze aktiver Promotor, wobei es sich um den CaMV-Promotor, den NOS-Promotor oder den Promotor des (1,3-1,4)-β- Glucanase-Gens handeln kann. Diese Beispiele für Promotoren dienen lediglich zur Veranschaulichung, andere Sequenzen können jedoch auch die gleiche Funktion erfüllen. Die Transkriptionsterminations-Sequenz des genetischen Konstrukts ist eine Nucleotidsequenz, die die Transkription eines DNA- Genfragments beenden kann und ein Polyadenylierungs-Signal bereitstellt. Diese Sequenz stammt vorzugsweise von einer Pflanze, d.h. es handelt sich um eine pflanzliche Transkriptionsterminations-Sequenz.
Das genetische Konstrukt kann weiterhin mit einem Marker versehen werden, der die Selektion des genetischen Konstrukts in einer Pflanzenzelle ermöglicht, in die es überführt worden ist. Es gibt verschiedene Marker, die in Pflanzenzellen verwendet werden können, insbesondere Marker, die eine Antibiotika-Resistenz bewirken. Diese Marker umfassen Resistenz gegen G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin und Gentamycin.
In den letzten Jahren hat man beträchtliche Anstrengungen unternommen, um Verfähren zur Konstruktion neuartiger Pflanzen oder Pflanzenzellen mit spezifischen und wünschenswerten Eigenschaften zu entwickeln. Heutzutage ist eine ganze Reihe solcher Verfahren verfügbar, die auf DNA- Rekombinationstechniken und geeigneten Pflanzen-Transformationssystemen basieren. Erfindungsgemäße Pflanzen, d.h. Pflanzen mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften, können unter Verwendung solcher Verfahren konstruiert werden.
Das Grundprinzip bei der Konstruktion genetisch veränderter Pflanzen besteht in der Insertion der genetischen Information in das Pflanzen-Genom, um das insertierte genetische Material stabil zu erhalten. Zur Insertion der genetischen Information gibt es mehrere Verfahren, wobei die zwei Hauptverfahren die direkte Einführung der genetischen Information und die Einführung der genetischen Information mit Hilfe eines bakteriellen Vektor- Systems sind. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft däher die Einführung eines Gens und eines vorstehend definierten genetischen Konstrukts in das Genom einer Pflanze, wie Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Reis oder Mais.
Bei der Konstruktion von Pflanzenzellen mit neuartiger genetischer Information können diese Zellen nach wohlbekannten Gewebekultur- Verfahren gezüchtet und erhalten werden, wie z.B. Züchtung der Zellen in einem geeigneten Kulturmedium, das mit notwendigen Wachstumsfaktoren, wie Aminosäuren, Pflanzen-Hormonen, Vitaminen, usw., angereichert ist.
Wie vorstehend erwähnt, ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase bei der Bierproduktion besonders vorteilhaft. Während des Maischverfahrens werden β-Glucane aus Malz extrahiert, was zu einer erhöhten Viskosität der Maische führt. Um die β- Glucan-Menge in der Maische und in der Bierwürze zu verringern, sollte eine thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase während des Maischverfahrens zugegeben werden. In einigen Brauereien wird das Maischverfahren schrittweise durchgeführt, wobei die Temperatur allmählich bis zu einer Maximal- Temperatur von etwa 76ºC angehoben wird. In anderen Brauereien wird das Maischverfahren bei einer festgelegten Temperatur durchgeführt, die typischerweise in einem Bereich von 50ºC bis 65ºC liegt. Die in Gerste vorhandene (1,3-1,4)-β-Glucanase wird bei etwa 55ºC inaktiviert. Im Handel erhältliche Produkte, wie z.B. Cereflo (ein von Novo-Nordisk A/S, Dänemark erhältliches zusammengesetztes Enzymprodukt, das eine (1,3-1,4)-β-Glucanase umfaßt), werden bei etwa 67ºC inaktiviert. Aufgrund der hohen Thermostabilität und hohen spezifischen Aktivität der erfindungsgemäßen (1,3-1,4)-β-Glucanasen reicht es aus, zum Abbau von β-Glucanen in der Maische viel geringere Mengen dieses Enzyms zuzugeben. Während zum Abbau von β- Glucanen in einer typischen Maische die Zugabe von 4 mg Cereflo pro kg Malz erforderlich ist, ist zu erwarten, daß zur Erzielung des gleichen Ergebnisses eine viel geringere Menge einer erfindungsgemäßen thermostabilen (1,3-1,4)- β-Glucanase ausreicht. Man geht davon aus, daß zum Abbau von β-Glucanen in einer typischen Maische eine Menge einer thermostabilen (1,3-1,4)-β- Glucanase von nur 20 µg/kg Malz oder eine noch geringere Menge ausreicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ferner ein Verfahren zum Abbau von (1,3-1,4)-β-Glucanen in einem Substrat, wo bei das Verfahren das Einwirken einer wirksamen Menge einer vorstehend beschriebenen thermostabilen (1,3- 1,4)-β-Glucanase über eine geeignete Zeitspanne bei einer Temperatur von 65ºC oder höher umfaßt, wobei die (1,3-1,4)-β-Glucanase-Menge höchstens 200 µg, vorzugsweise höchstens 100 µg, bevorzugter höchstens 50 µg, noch bevorzugter höchstens 20 µg und am bevorzugtesten höchstens 15 µg pro kg Substrat beträgt.
Ein β-Glucane enthaltendes Substrat kann in fester oder flüssiger Form vorliegen und verschiedene Typen unbehandelter Körner, wie Hafer oder Gerste, oder Teile bzw. Gemische davon umfassen. Das (1,3-1,4)-β-Glucanase- Enzym kann in aufgereinigter Form oder als Teil eines Gemisches zugegeben werden, das andere Enzyme oder Hilfsstoffe enthält, wobei das Enzym vorzugsweise solubilisiert wird. Das Enzym kann auch aufgrund seines Einbaus in die Pflanze mittels gentechnischer Verfahren im Substrat enthalten sein.
Ein (1,3-1,4)-β-Glucane enthaltendes Substrat kann auch mit einem zweiten Substrat gemischt werden, das eine thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase enthält, wobei das zweite Substrat von Mais, Reis oder Weizen stammt. Mais, Reis und Weizen produzieren von Natur aus keine (1,3-1,4)-β-Glucanase, können jedoch mittels gentechnischer Verfahren so verändert werden, daß sie nach Einbau eines eine thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase codierenden Gens das Protein exprimieren können.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die angefügten Figuren und die folgenden Beispiele weiter beschrieben.

LEGENDE ZU DEN FIGUREN

Figur 1. Konstruktion eines Expressions- und Sekretionsvektors für E. coli der das Hybridgen bgl-H1 enthält. bgl-A: (1,3-1,4)-β-Glucanase-Gen von B. amyloliquefaciens. bgl-M: (1,3-1,4)-β-Glucanase-Gen von B. macerans. Bezüglich Einzelheiten vgl. Beispiel 1.
Figur 2. Konstruktion eines Expressions- und Sekretionsvektors für E. coli der das Hybridgen bgl-H2 enthält. bgl-A: (1,3-1,4)-β-Glucanase-Gen von B. amyloliquefaciens. bgl-M: (1,3-1,4)-β-Glucanase-Gen von B. macerans. Bezüglich Einzelheiten vgl. Beispiel 1.
Figur 3. Graphische Darstellung des bgl-H1-Gens und Einzelheiten des Fusionsbereiches. SP: Signalpeptid.
Figur 4. Graphische Darstellung des bgl-H2-Gens und Einzelheiten des Fusionsbereiches. SP: Signalpeptid.
Figur 5. SDS-PAGE-Analyse von Proben, die Hybrid-β-Glucanasen bzw. die B. macerans-β-Glucanase enthalten. Laufspuren 1-3: 2 µg, 5 µg und 1 µg gereinigte β-Glucanase H1. Laufspur 4: Probe, die 50 µg Protein aus dem Überstand enthält, und Laufspur 5: 100 µg Extrakt aus mit pUC-H2 transformierten E. coli-Zellen. Laufspur 6: 2 µg partiell aufgereinigte B. macerans-β-Glucanase. Laufspur 7: 1 µg gereinigte B. macerans-β-Glucanase.
Figur 6. Aktivität der Bacillus-Hybrid-β-Glucanase H1 und der Eltern-Enzyme in Rohextrakten aus transgenen E. coli-Zellen nach Inkubation über verschiedene Zeitspannen bei 70ºC und einem pH-Wert von 6,0. Die Aktivität ist als Prozentsatz der Aktivität zum Zeitpunkt 0 angegeben.
Figur 7. Aktivität der Bacillus-Hybrid-β-Glucanase H1 und der Eltern-Enzyme in Rohextrakten (vgl. Materialien und Verfahren) aus transgenen E. coli-Zellen nach Inkubation über verschiedene Zeitspannen bei 65ºC und einem pH-Wert von 6,0. Die Aktivität ist als Prozentsatz der Aktivität zum Zeitpunkt 0 angegeben.
Figur 8. Zeitverlauf der Hitzeinaktivierung der Bacillus-Hybrid-β-Glucanasen H1 und H2 bei 65ºC und einem pH-Wert von 5,5 im Vergleich zur β-Glucanase von B. amyloliquefaciens. Das gereinigte Enzym von B. amyloliquefaciens und das H1-Enzym wurden in einer Konzentration von 1 µg ml&supmin;¹ in 40 mM Na- Acetat, pH-Wert 5,5, 10 mM CaCl&sub2; und 50 µg ml&supmin;¹ Rinderserumalbumin gelöst. Das H2-Enzympräparat wurde in einer Proteinkonzentration von 0,75 µg ml&supmin;¹ in einem identischen Puffer gelöst. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben entnommen und auf β-Glucanase-Restaktivität getestet.
Figur 9. pH-Abhängigkeit der Aktivität der Bacillus-Hybrid-β-Glucanasen H1 und H2. Die Reaktionen wurden mit 1 µg - 6 µg H1-β-Glucanase bzw. 7 µg - 70 µg H2-β-Glucanase-Präparat in den folgenden Puffern durchgeführt: 40 mM Na- Acetat, pH-Wert 3,6 - 5,6, 40 mM K/Na-Phosphat, pH-Wert 6 - 8, und 40 mM Tris- HCl, pH-Wert 8,4 - 8,8. Die Aktivität wurde im Biocon-Test unter Verwendung von Azo-β-Glucan aus Gerste als Substrat bestimmt (McCleary, 1988).
Figur 10. Aktivität der Bacillus-Hybrid-β-Glucanase H1 und der Eltern-Enzyme in Rohextrakten von transgenen E. coli-Zellen nach Inkubation über verschiedene Zeitspannen bei 65ºC und einem pH-Wert von 4,0. Die Aktivität ist als Prozentsatz der Aktivität zum Zeitpunkt 0 angegeben.
Figur 11. pH-Abhängigkeit der Stabilität von Bacillus-β-Glucanasen bei 55ºC. 2 µg Hybrid-β-Glucanase H1, 375 µg Protein des H2-Hybrid-β- Glucanasepräparates, 2 µg B. macerans-β-Glucanase bzw. 10 µg B. amyloliquefaciens-β-Glucanase wurden mit 10 mM CaCl&sub2; und 50 µg ml&supmin;¹ Rinderserumalbumin entweder in 40 mM Na-Acetat-Puffer, der auf die angegebenen pH-Werte im Bereich von 3,6 bis 5,6 eingestellt worden war, oder in 40 mM K/Na-Phosphat-Puffer getestet, der auf die angegebenen pH-Werte im Bereich von 6,0 bis 8,0 eingestellt worden war. Nach 1-stündiger Inkubation bei 55ºC wurde die Restaktivität mit Verfahren A bestimmt (vgl. Materialien und Verfahren).
Figur 12. Verbesserte Thermostabilität von Bacillus-Hybrid-β-Glucanasen in Gegenwart von CaCl&sub2;. 0,1 µg Bacillus-Hybridenzym H1 oder 750 µg eines Hybridenzym H2-Präparates wurden in 1 ml mit 50 µg ml&supmin;¹ Rinderserumalbumin angereichertem 40 mM Na-Acetat-Puffer, pH-Wert 5,5, mit oder ohne 50 mM CaCl&sub2; gelöst. Nach 30-minütiger Inkubation bei den angegebenen Temperaturen wurde die Restaktivität bestimmt.
Figur 13. Zeitverlauf der Hitzeinaktivierung der gereinigten Bacillus-Hybrid-β- Glucanasen H3, H4, H5 und H6 bei 65ºC und einem pH-Wert von 4,1 im Vergleich zu gereinigten nativen β-Glucanasen von B. amyloliquefaciens B. macerans und B. subtilis. Die Enzyme wurden in einer Konzentration von 0,1 mg ml&supmin;¹ in 40 mM Na-Acetat-Puffer, pH-Wert 4,1, und 10 mM CaCl&sub2; gelöst. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben entnommen und auf β-Glucanase-Restaktivität untersucht.
Figur 14. Zeitverlauf der Hitzeinaktivierung der gereinigten Bacillus-Hybrid-β- Glucanasen H3, H4, H5 und H6 bei 70ºC und einem pH-Wert von 6,0 im Vergleich zu gereinigten nativen β-Glucanasen von B. amyloliquefaciens. B. macerans und B. subtilis. Die Enzyme wurden in einer Konzentration von 0,1 mg ml&supmin;¹ in 40 mM Na-Acetat-Puffer, pH-Wert 5,5, und 10 mM CaCl&sub2; gelöst. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben entnommen und auf β-Glucanase-Restaktivität untersucht.
Figur 15. Konzentration der Malz-β-Glucan-Restmenge während des Maischens von Gemischen, die aus 50 g feingemahlenem Malz und 200 ml Wasser bestanden und 5 µg Hybrid-β-Glucanase H3, 5 µg B. subtilis-β-Glucanase bzw. keine β-Glucanase enthielten, und Konzentration von Rest-β-Glucanen in Lösungen, die aus 50 ml β-Glucan-Lösung (1,5 mg/ml) in 100 ml Na-Acetat- Puffer, pH-Wert 5,5, 5 mM CaCl&sub2; bestanden und denen 250 ng B. subtilis-β- Glucanase bzw. Hybrid-Glucanase H3 zugegeben wurden. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben entnommen und auf β-Glucan-Restmengen untersucht.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Stämme, Plasmide und Zuchtmedien

Zur Plasmid-Vermehrung und zur Expression von β-Glucanase-Genen wurden E. coli DH5α-Zellen: F&supmin;, endA1, hsd R17 (rk&supmin;, mk&spplus;), supE44, thi1, λ&supmin;, recal, gyrA96, relA1, 80dlacZ, ΔM15 (Hanahan, 1985), verwendet. Die Vektoren umfaßten pBR322 (Bolivar et al., 1977) und pUC19 (Vanish-Perron et al., 1985). Das rekombinante Plasmid pEG1 (Borriss et al., 1985) enthielt eine Insertion mit dem β-Glucanase-Gen von B. amyloliquefaciens und pUC13-M enthielt eine DNA- Insertion mit dem β-Glucanase-Gen von B. macerans, die mit der Insertion des Plasmides pUC19/34 identisch war (Borriss et al., 1988). Medien und Züchtungsbedingungen sind bereits beschrieben worden (Borriss et al., 1988).

Enzyme und Chemikalien

Radioaktive Nucleotide wurden von New England Nuclear, Boston, Massachusetts, USA, bezogen. Restriktionsendonucleasen, Kälberdarm- Phosphatase und T4-DNA-Ligase wurden von Boehringer Mannheim, Mannheim, Westdeutschland, bezogen. Eine modifizierte T7-DNA-Polymerase (Sequenase ) wurde von United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio, USA, erhalten. Von BIO 101 Inc., La Jolla, Kalifornien, USA, wurde ein Geneclean -Kit bezogen. Sowohl Gersten-β-Glucan als auch ein β-Glucanase- Testkit wurde von Biocon, Boronia, Victoria, Australien, gekauft. Lichenan wurde wie bereits beschrieben (Borriss, 1981), aus Cetraria islandica hergestellt.

Transformation

E. coli-Zellen wurden wie von Lederberg und Cohen beschrieben (1974), gezüchtet und zur Transformation vorbereitet. Die kompetenten Zellen wurden wie von Thomsen beschrieben (1983), in gefrorenem Zustand aufbewahrt.

Aufreinigung von DNA

Plasmid-DNA wurde aus E. coli mit Hilfe des Verfahrens von Hattori und Sakaki (1986) isoliert. Durch Spaltung mit Restriktionsendonucleasen erzeugte spezifische DNA-Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese getrennt und aus der Gelgrundmasse unter Verwendung eines Geneclean -Kits entsprechend den Empfehlungen des Herstellers aufgereinigt.

Bestimmung von DNA-Sequenzen

Zur Bestimmung der in der Umgebung der Verbindungen der Spleißstellen der Hybrid-β-Glucanase-Gene befindlichen Nucleotidsequenzen wurde eine modifizierte T7-DNA-Polymerase (Sequenase ) verwendet. Die Reaktionen wurden wie von Zhang et al. beschrieben (1988) durchgeführt.

Aufreinigung und Analyse von Enzymen

Zur Bestimmung der Thermostabilität des Hybridenzyms H1 und der Eltern- Enzyme wurden E. coli-Zellen, die die Plasmide pUC13-H1, pEG1 oder pUC13-M enthielten, in einem Trypton-Hefe-Medium (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl pro 1) 16 bis 20 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die Zellen wurden mittels Ultraschall-Behandlung (Ultraschall-Gerät MSE) lysiert. Nach Klären des Lysates mittels Zentrifugation wurde die β-Glucanase-Stabilität durch Inkubation eines Reaktionsgemisches, das ein Aliquot des geklärten Lysats enthielt, über verschiedene Zeitspannen bei 65ºC oder 70ºC und anschließende Bestimmung der β-Glucanase-Restaktivität untersucht.
Für die Eltern-Enzyme und das Hybridenzym H1 wurde das von Borriss et al. (1988) beschriebene Verfahren zur Aufreinigung von β-Glucanase aus Zellextrakten verwendet. Die β-Glucanase H2 wurde aufgrund der geringen Ausbeute nicht bis zur Homogenität aufgereinigt. Diese β-Glucanase wurde mittels Ammoniumsulfat-Präzipitation von rohen Zellextrakten bis zu einer spezifischen Aktivität von 10,4 E/mg (10,4 µMole Glucose mg&supmin;¹ min&supmin;¹) angereichert. Die Proteinkonzentration wurde nach Bradford (1976) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Enzym- Präparate wurden mittels SDS-PAGE (Laemmli, 1970) analysiert.

β-Glucanase-Tests

Verfahren A: Das Reaktionsgemisch bestand aus 1 ml 0,5% (Gew./Vol.) Lichenan oder Gersten-β-Glucan in 40 mM Na-Acetat-Puffer, pH-Wert 6,0, mit oder ohne 10 mM CaCl&sub2;. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,1 ml Enzymlösung eingeleitet. Anschließend wurde 20 min bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,5 ml 3,5-Dinitrosalicylsäure beendet. Die Menge an reduzierenden Zuckern wurde unter Verwendung des von Miller beschriebenen (1959) Reagenzienpräparates bestimmt. Die spezifische Aktivität wurde als µMole Glucose angegeben, die pro Minute und pro mg Protein freigesetzt wurden.
Verfähren B: In einer anderen Ausführungsform wurde zur Untersuchung der β-Glucanase-Aktivität Gersten-Azo-β-Glucan als Substrat verwendet (McCleary, 1988). Die eingesetzten Puffer waren 40 mM Natriumacetat, pH-Wert 3,6 - 5,6, 40 mM Kalium-Natriumphosphat, pH-Wert 6 - 8 und 40 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,4 - 8,8.

Plattentest

E. coli-Zellen wurden auf einem Festmedium inkubiert, das 0,2% (Gew./Vol.) Lichenan enthielt. Eine Färbung mit 0,2% (Gew./Vol.) Kongo-Rot zeigte eine Klarzone um die Kolonien, die β-Glucanase exprimierten.

Sicherheitsmaßnahmen

Alle Experimente, die rekombinante DNA betrafen, wurden unter BL1- Laborbedingungen durchgeführt. Biologisches Material enthaltender Abfall wurde autoklaviert.

BEISPIEL 1

KONSTRUKTION DER HYBRID-β-GLUCANASE-GENE ENTHALTENDEN PLASMIDE pUC13-H1 UND pUC19-H2

Die β-Glucanase-Gene und -Proteine von B. amyloliquefaciens und B. macerans sind hochgradig homolog. In der Mitte der Gene befindet sich eine nur einmal vorkommende EcoRV-Restriktionsstelle, die bei der Konstruktion von β- Glucanase-Hybridgenen als Fusionspunkt verwendet wurde.

Konstruktion von pUC13-H1 (Figur 1)

Aus dem Plasmid pEG1 (Borriss et al., 1985) wurde ein EcoRV-Fragment isoliert, das den flankierenden 5'-Bereich und die Amino-terminal gelegene Hälfte des codierenden Bereichs des β-Glucanase-Gens von B. amyloliquefaciens enthielt, und mit dem großen EcoRV-EcoRI-Fragment von pUC13-M ligiert, das die Carboxy-terminal gelegene Hälfte des B. macerans-Enzyms codiert, wobei das Plasmid pUC13-H1 erzeugt wurde, das das Hybridgen bgl-H1 enthält. Mit pUC13- H1 transformierte E. coli DH5α-Zellen waren gegen Ampicillin resistent.

Konstruktion von pUC19-H2 (Figur 2)

Zur Konstruktion des reziproken rekombinanten Gens wurde das β-Glucanase- Gen von B. macerans aus dem Plasmid pUC13-M als EcoRI-PstI-Fragment ausgeschnitten und erneut im Plasmid pBR322 doniert, wobei das Plasmid pBR- MAC1 erzeugt wurde. Daraus wurde das kleine EcoRV-Fragment aufgereinigt und mit dem großen EcoRV-Fragment des Plasmids pEG1 fusioniert. Das Plasmid, das die Insertion in der richtigen Orientierung enthielt, wurde als pEG-H2 bezeichnet. Mit diesem Plasmid transformierte E. coli-Zellen wurden auf einem Tetracyclin enthaltenden Medium selektiert. Das Hybridgen wurde aus pEG-H2 als EcoRI-BglII-Fragment ausgeschnitten und erneut in pUC19 doniert, das mit EcoRI und BamHI gespalten worden war, wobei das Plasmid pUC19-H2 erhalten wurde.

BEISPIEL 2

STRUKTUR DER β-GLUCANASE-HYBRIDGENE bgl-H1 und bgl-H2

Das zur Expression des rekombinanten bgl-H1-Gens verwendete Fragment ist in Figur 3 gezeigt. Das Konstrukt enthält 469 bp des flankierenden Bereichs des β- Glucanase-Gens von B. amyloliquefaciens 75 bp, die das Signalpeptid dieser β- Glucanase codieren, und 321 bp, die die Amino-terminal gelegene Hälfte dieser β-Glucanase codieren. Dieser 865 bp lange DNA-Abschnitt wurde sowohl mit der Carboxy-terminal gelegenen Hälfte des codierenden Bereichs des β-Glucanase- Gens von B. macerans als auch mit 54 bp des flankierenden 3'-Bereichs davon im Leseraster fusioniert.
Nucleotidsequenz des Gens bgl-H1 und davon abgeleitete Aminosäuresequenz der Prä-Hybrid-β-Glucanase, die aus dem Signalpeptid, der Amino-terminalen Hälfte der β-Glucanase von B. amyloliquefaciens und der Carboxy-terminalen Hälfte der β-Glucanase von B. macerans besteht. Die zum Spleißen verwendete EcoRV-Restriktionsstelle ist angegeben. Ein Pfeil zeigt die Spaltstelle der Signalpeptidase. Tabelle I
Das andere rekombinante Gen bgl-H2 (Figur 4) besteht aus 99 bp des flankierenden 5'-Bereichs des β-Glucanase-Gens von B. macerans 75 bp, die das Signalpeptid dieser β-Glucanase codieren, und 315 bp, die die Amino-terminal gelegende Hälfte der β-Glucanase von B. macerans codieren. Dieses 489 bp große Fragment wurde mit einem 321 bp großen DNA-Abschnitt, der die Carboxyterminal gelegene Hälfte der β-Glucanase von B. amyloliquefaciens codiert, und dem etwa 1,5 kb großen flankierenden 3'-Bereich des Gens im Leseraster fusioniert.
Die Plasmidkonstrukte wurden mittels Restriktionsenzym-Spaltungen, Bestimmung der in der Nähe der Spleiß-Verbindungen befindlichen DNA- Sequenz oder beidem untersucht.
Nucleotidsequenz des Gens bgl-H2 und davon abgeleitete Aminosäuresequenz der Prä-Hybrid-β-Glucanase, die aus dem Signalpeptid und der Aminoterminalen Hälfte der β-Glucanase von B. macerans sowie der Carboxyterminalen Hälfte des B. amyloliquefaciens-Proteins besteht. Die zum Spleißen verwendete EcoRV-Restriktionsstelle ist angegeben. Ein Pfeil zeigt die Spaltstelle der Signalpeptidase. Die Sequenz des nichtcodierenden 3'-Bereichs ist nicht gezeigt. Tabelle II

BEISPIEL 3

ANALYSE DER VON pUC13-H1 UND pUC19-H2 CODIERTEN HYBRIDGEN-PRODUKTE

E. coli DH5α-Zellen wurden mit pUC13-H1 bzw. pUC19-H2 transformiert. Die transformierten E. coli-Zellen exprimierten die β-Glucanase-Hybridgene. Die Hybrid-β-Glucanase H1 wurde nach dem für die B. macerans-β-Glucanase verwendeten Verfahren aufgereinigt (Borriss et al., 1988). Mittels SDS-PAGE wurde bestätigt, daß die β-Glucanase als eine Bande wanderte, die sich mit Coomassie-Blau anfärben ließ (Figur 5). Die Ausbeute des Hybridenzyms H2 betrug nur etwa 1% der von H1 erhaltenen Ausbeute und war zu gering, um ein chromatographisch reines Präparat zu gewinnen (Tabelle III). Tabelle III Expression von β-Glucanase in E. coli-Zellen, die mit pUC13-H1 bzw. pUC19-H2 transformiert worden waren
n. d. = nicht nachweisbar
In einem Trypton-Hefe-Medium wurden Zellen 20 h bei 37ºC unter intensivem Schütteln gezüchtet. Nach Zentrifugation (5000 x g, 10 min) wurde der Überstand direkt für den Test auf Enzymaktivität verwendet. Das Pellet wurde gewaschen, in 40 mM Acetat-Puffer, pH-Wert 6, resuspendiert, auf Eis viermal einer 20-sekündigen Ultraschall-Behandlung mit einer Branson-Ultraschall- Vorrichtung unterworfen und mittels Zentrifugation gereinigt.
Die spezifische Aktivität der β-Glucanase H1 wurde bestimmt, die 3700 µMole Glucose mg&supmin;¹ min&supmin;¹ betrug. Das ist mit der spezifischen Aktivität der β- Glucanasen von Bacillus-IMET B376 (1330 µMole Glucose mg&supmin;¹ min&supmin;¹) (Borriss et al., 1985) und B. macerans (5030 µMole Glucose mg&supmin;¹ min&supmin;¹) vergleichbar.
Zur Charakterisierung des bgl-H2-Genproduktes wurde ein angereicherter Extrakt mit einer spezifischen Aktivität von 10,4 µMole Glucose mg&supmin;¹ min&supmin;¹ verwendet (Tabelle IV). Tabelle IV Parameter der Enzymkinetik von Hybrid- und Eltern-β-Glucanasen
(1) angereicherter Zellextrakt
(2) Borriss und Zemek (1981)

Substrat-Spezifität

Die Hybridenzyme H1 und H2 bauten sowohl Gersten-(1,3-1,4)-β-Glucan als auch Lichenan ab. Die mit beiden Substraten bestimmten Vmax-Werte unterschieden sich nicht signifikant (Tabelle IV). Für beide Hybridproteine wurden die Km- Werte bestimmt, indem als Substrat entweder Gersten-β-Glucan oder Lichenan verwendet wurde.

Kinetik der Hitzeinaktivierung von Hybrid-β-Glucanasen

Die Thermostabilität von Hybrid-β-Glucanasen wurde im Vergleich zu der der Elternenzyme von B. amyloliquefaciens und B. macerans bestimmt, indem der Zeitverlauf der β-Glucanase-Hitzeinaktivierung in Proben gereinigter Lysate von E. coli DH5α-Zellen bestimmt wurde, die mit den Plasmiden pUC13-H1, pEG- H2, pEG1 bzw. pUC13-M transformiert worden waren, die H1, H2, die rekombinante β-Glucanase von B. amyloliquefaciens bzw. die rekombinante β- Glucanase von B. macerans, codieren.
Der mit pUC13-H1 transformierte E. coli-Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Eingangs-Nr. DSM 5461 hinterlegt. Der mit pEG-H2 transformierte E. coli-Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Eingangs-Nr. DSM 5460 hinterlegt. Der mit pEG1 transformierte E. coli-Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Eingangs-Nr. DSM 5459 hinterlegt und der mit pUC13-M transformierte E. coli-Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Eingangs-Nr. DSM 5462 hinterlegt.
Die Proben (Protein-Konzentration meistens im Bereich von 0,3 - 1 mg/ml) wurden in 10 mM CaCl&sub2; und 40 mM Na-Acetat, pH-Wert 6,0, bei 70ºC inkubiert. Zur Bestimmung der β-Glucanase-Restaktivität wurden in regelmäßigen Zeitabständen Proben entnommen (Figur 6). Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten, daß die Halbwertszeit der H1-β-Glucanase signifikant größer ist (50%-ige Inaktivierung in 18,5 min) als die Halbwertszeiten der Elternenzyme von B. amyloliquefaciens (4 min) und B. macerans (9 min). Die Halbwertszeit der H2-β-Glucanase bei der Hitzeinaktivierung betrug weniger als 2 min, das Enzym ist däher gegen Hitze anfälliger als die Elternenzyme. Bei Durchführung der Analyse bei 65ºC (Figur 7) blieb das Hybridenzym H1 länger als 30 min stabil, während die Halbwertszeit des B. amyloliquefaciens-Enzyms etwa 25 min betrug und die des B. macerans-Enzyms zwischen diesen beiden Werten lag. Bei Durchführung der Analyse bei 65ºC und einem pH-Wert von 6, blieb das gereinigte H1-Enzym länger als eine Stunde stabil, während das partiell aufgereinigte H2-Enzym innerhalb von 20 min - 25 min irreversibel hitzeinaktiviert wurde (Figur 8). Zum Vergleich ist der Zeitverlauf der Inaktivierung des gereinigten Enzyms von B. amyloliquefaciens gezeigt.
Folgerichtig war das Hybridenzym H1 beim Test nach 5-minütiger Inkubation bei 65ºC bis 70ºC signifikant aktiviert (Figuren 6 - 8).

Wirkung des pH-Wertes auf die enzymatische Aktivität und Stabilität von Hybrid-β-Glucanasen

Der pH-Bereich für eine optimale enzymatische Aktivität der Hybrid-β- Glucanase H1 lag bei 5,6 bis 6,6, während der des Hybridenzyms H2 bei pH- Werten von 7,0 bis 8,0 lag (Figur 9). Im Vergleich dazu lag der optimale pH- Bereich für die enzymatische Aktivität der β-Glucanasen von B. amyloliquefaciens und B. macerans bei pH-Werten von 6,0 bis 7,0 bzw. 6,0 bis 7,5 (Ergebnisse nicht gezeigt). Figur 9 zeigt auch, daß das Hybridenzym H1 bei einem pH-Wert von 4,8 50% seiner Aktivität beibehält. H2 behält bei einem pH- Wert von 5,6 50% seiner Aktivität bei. Die entsprechenden Werte für die Elternenzyme wurden bei einem pH-Wert von 5,2 (B. amyloliquefaciens) bzw. 5,5 (B. macerans) erhalten.
Ein anderes Merkmal ist die Enzymstabilität in Abhängigkeit vom pH-Wert. Bei Untersuchung des Zeitverlaufs der β-Glucanase-Hitzeinaktivierung in Rohextrakten bei einem pH-Wert von 4,0 und einer Temperatur von 65ºC blieb das Hybridenzym H1 länger als 30 min stabil, während die β-Glucanase von B. amyloliquefaciens eine Halbwertszeit von 20 min und die β-Glucanase von B. macerans eine Halbwertszeit von nur 12 min aufwiesen (Figur 10). Bei Hybridund Eltern-β-Glucanasen wurde dieses Merkmal auch durch 1-stündige Inkubation bei 55ºC im pH-Bereich von 3 bis 9 und anschließende Bestimmung der enzymatischen Restaktivität untersucht (Figur 11). Es scheint, daß die β- Glucanase H1 bei pH-Werten unter 3,6 bis zu 7,0 stabil ist, während die β- Glucanase H2 nur in einem sehr engen pH-Bereich von 5,6 bis 6,0 Stabilität zeigt. Beide Eltern-β-Glucanasen sind bei pH-Werten unter 4,8 und über 6,0 (B. amyloliquefaciens) bzw. 6,5 (B. macerans) nicht stabil.

Wirkung von Ca&spplus;&spplus; auf die Thermostabilität

Die Wirkung von Ca&spplus;&spplus; auf die Stabilität von Hybrid-β-Glucanasen wurde in einem 30-minütigen Test bei einem pH-Wert von 5,5 und Temperaturen im Bereich von 45ºC bis 75ºC untersucht. Aus den in Figur 12 gezeigten Ergebnissen dieser Untersuchung kann die Temperatur abgeleitet werden, die in dem 30-minütigen Test zu einer 50%-igen Inaktivierung führt. Es zeigt sich deutlich, daß Ca&spplus;&spplus;-Ionen auf beide Hybridenzyme eine stabilisierende Wirkung ausüben. Für beide Hybrid-β-Glucanasen erhöhen sich die zu einer 50%-igen Inaktivierung führenden Temperaturen in Gegenwart von 10 mM Ca&spplus;&spplus; um etwa 5ºC. Die gleiche stabilisierende Wirkung von Ca&spplus;&spplus;-Ionen läßt sich auch bei den zwei Elternenzymen feststellen.

BEISPIEL 4

KONSTRUKTION DER HYBRID-β-GLUCANASEN H3, H4, H5 UND H6

Durch Konstruktion von Glucanasen codierenden Fusions-Hybridgenen, wobei Polymerase-Kettenreaktionstechniken gemäß dem von Yon und Fried, Nucleic Acid Res. 17 (1989), 4895, und Horton et al., Gene, 77 (1989), 61-68, beschriebenen Verfahren verwendet wurden, wurden vier (1,3-1,4)-β- Glucanasen produziert. Die Fusionsgene umfassen DNA-Sequenzen des β- Glucanase-Gens von B. amyloliquefaciens BE20/78 und des β-Glucanase-Gens von B. macerans E 138. Die Fusionsgene wurden in das Plasmid pTZ19R (Mead et al., Protein Engineering 1 (1986), 67-74) insertiert. Die vier erhaltenen rekombinanten Plasmide wurden als pTZ19R-H3, pTZ19R-H4, pTZ19R-H5 bzw. pTZ19R-H6 bezeichnet. Mit den Plasmiden wurde der E. coli-Stamm DH5α transformiert. Zur Expression der β-Glucanase-Gene wurden die Wirtszellen in Minimalmedium bis zur stationären Phase gezüchtet. Die erhaltenen Hybridenzyme wurden als H3, H4, H5 bzw. H6 bezeichnet. Das Enzym H3 besitzt die Formel A16 - M, was bedeutet, daß es sich um ein Hybridenzym handelt, das 16 Aminosäuren des N-terminalen Teils der reifen (1,3-1,4)-β-Glucanase von B. amyloliquefaciens umfaßt, die gegen die entsprechenden 16 Aminosäuren des N-terminalen Teils der reifen (1,3-1,4)-β-Glucanase von B. macerans ausgetauscht wurden. Die Hybridenzyme H4 - H6 wurden in ähnlicher Weise konstruiert, indem 36, 78 bzw. 152 Aminosäuren des N-terminalen Teils der reifen (1,3-1,4)-β-Glucanase von B. macerans durch die entsprechende Anzahl von Aminosäuren des N-terminalen Teils der β-Glucanase von B. amyloliquefaciens ersetzt wurden. Alle vier konstruierten Hybridenzyme besitzen daher ein N-terminales Ende, das von der (1,3-1,4)-β-Glucanase von B. amyloliquefaciens stammt. Außerdem werden alle Hybridenzyme mit dem kurzlebigen Signalpeptid der B. amyloliquefaciens-β-Glucanase synthetisiert.
Der E. coli-Stamm, der das das Hybridenzym H3 codierende Plasmid pTZ19R-H3 enthält, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Eingangs-Nr. DSM 5790 hinterlegt. Der E. coli-Stamm, der mit dem das Hybridenzym H4 codierenden Plasmid pTZ19R-H4 transformiert wurde, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Eingangs-Nr. DSM 5791 hinterlegt. Der E. coli-Stamm, der mit dem das Hybridenzym H5 codierenden Plasmid pTZ19R-H5 transformiert wurde, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Eingangs-Nr. DSM 5792 hinterlegt und der E. coli-Stamm, der das das Hybridenzym H6 codierende Plasmid pTZ19R- H6 enthält, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Eingangs-Nr. DSM 5793 hinterlegt. Die vier vorstehend beschriebenen Stämme wurden allesamt am 9. Februar 1990 hinterlegt.

BEISPIEL 5

AUFREINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER HYBRID-β-GLUCANASEN H3, H4, H5 UND H6

Die von den Fusions-Hybridgenen codierten Hybridenzyme wurden durch Bestimmung ihres Temperatur-Optimums, ihres pH-Optimums, ihrer spezifischen Aktivität und ihrer Thermostabilität charakterisiert. Diese Merkmale wurden mit den entsprechenden Merkmalen des vorstehend beschriebenen Hybridenzyms H1 und nativer Bacillus-β-Glucanasen verglichen, die von den folgenden Bacillus-Arten produziert werden: B. amyloliquefaciens BE20/78, B. macerans E138 und einer B. subtilis-Art. E. coli- Zellen, die mit Plasmiden transformiert waren, die das B. amyloliquefaciens-β- Glucanase (pEG1) bzw. das B. macerans-β-Glucanase (pUC13-M) codierende Gen enthielten, wurden in Minimalmedium bis zur stationären Phase gezüchtet, um eine Expression der β-Glucanase-Genprodukte zu erreichen.
Jeweils ein bis fünf Liter Kulturmedium, das nach Züchtung der vorstehend beschriebenen transformierten E. coli-Zellen erhalten worden war, die die Hybrid-β-Glucanasen H3, H4, H5 oder H6 bzw. die nativen β-Glucanasen von B. amyloliquefaciens oder B. macerans exprimierten, wurden mittels Zentrifugation und Filtration durch ein 0,8 µm-Filter gereinigt. Die gereinigten Überstände wurden mittels Ultrafiltration auf ein Volumen von 100 ml konzentriert. Nach Diafiltration gegen 20 mM Na-Acetat, pH-Wert 5,0 und 5 mM CaCl&sub2; wurde der unbehandelte Überstand auf eine CM-Sepharose- Kationenaustausch-Säule aufgetragen. Nach Waschen wurde die Säule mit 50 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,0, 50 mM NaCl und 5 mM CaCl&sub2; eluiert. Die durch dieses Reinigungsverfahren gewonnene β-Glucanase war im wesentlichen rein. Die β-Glucanase-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden jedoch wie üblich vereinigt und in 20 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,0, und 5 mM CaCl&sub2; einer Molekularsieb-Chromatographie auf einer Sephacryl-S200-HR- Säule (2,5 x 60 cm) unterworfen. Die β-Glucanase enthaltenden Peak-Fraktionen wurden zur Untersuchung der Thermostabilität der reinen Enzyme verwendet. Die Ausbeute an reiner β-Glucanase lag im Bereich von 0,5 mg - 25 mg pro Liter Kulturmedium.
Bei dem nativen B. subtilis-Enzym handelte es sich um ein im Handel erhältliches (1,3-1,4)-β-Glucanase-Produkt (Cereflo 200L, Novo-Nordisk A/S, Bagsværd, Dänemark). Im ersten Reinigungsschritt wurde dieses Produkt fünffach konzentriert. Anschließend wurde eine Diafiltration gegen 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, und dann eine Anionenaustausch-Chromatographie (Whatman DE 53) durchgeführt. Nichtgebundenes Protein wurde konzentriert und der Puffer wurde durch Diafiltration gegen 20 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,0, und 5 mM CaCl&sub2; ausgetauscht. Eine weitere Aufreinigung wurde durch eine Kationenaustausch-Chromatographie auf CM5&sub2; (Whatman) erreicht. Die β- Glucanase-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und einer Molekularsieb-Chromatographie auf einer Sephacryl-S200-HR-Säule unterworfen. Aus 1 Liter Cereflo 200L wurden etwa 100 mg reine B. subtilis-β- Glucanase gewonnen.

Temperatur-Optima von H3 - H6

Die vorstehend gewonnenen reinen Präparate der vier Test-Enzyme und der vier Vergleichs-Enzyme, die 100 µg gereinigtes Enzym pro ml enthielten, wurden so verdünnt, daß sie eine Enzym-Menge enthielten, die unter den Testbedingungen zu meßbaren Werten führten (0,5 µg - 1,5 µg pro ml). Die Reaktionsgemische enthielten 1 ml Substrat (0,5 mg/ml Lichenan) in 100 mM Na-Acetat-Puffer, pH-Wert 6,0, der mit 50 µg/ml Rinderserumalbumin und 0,1 ml der in geeigneter Weise verdünnten Enzympräparate angereichert worden war. Die Reaktionsgemische wurden 10 Minuten bei den folgenden Temperaturen inkubiert: 25ºC, 37ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC, 65ºC, 70ºC, 75ºC, 80ºC und 85ºC. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 0,5 ml 3,5-Dinitrosalicylsäure beendet. Die optimalen Temperaturen und die Temperaturbereiche, in denen die Enzyme mindestens 90% der optimalen Aktivität aufwiesen, wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt: Tabelle V Temperatur-Optima für H3 - H6, H1 und native Bacillus-β-Glucanasen
Außerdem wies das Enzym H3 bei 80ºC eine Restaktivität auf, die 75% der optimalen Aktivität betrug. Bei 85ºC betrug die entsprechende Restaktivität 20%.
Von den getesteten Hybridenzymen wies H4 ein höheres Temperatur-Optimum als alle nativen Enzyme (70ºC) auf und das Enzym H3 zeigte den breitesten Temperaturbereich, in dem 90% oder mehr der optimalen Aktivität beibehalten wurden (55ºC - 75ºC). Dieses Enzym besaß auch die höchste Temperaturgrenze, bei der mindestens 90% der Aktivität im Vergleich zur optimalen Aktivität erhalten blieben.

pH-Optima von H3 - H6

Bei diesen Experimenten wurde die enzymatische Aktivität derselben vorstehend beschriebenen Enzympräparate einschließlich der vier Vergleichs-Enzyme bei unterschiedlichen pH-Werten im Bereich von 3,6 bis 8,0 untersucht. Im Test wurde Gersten-Azo-β-Glucan als Substrat verwendet. 200 µl Substratlösung wurden mit 200 µl 100 mM Puffer-Lösungen gemischt, die geeignete pH-Werte aufwiesen und jeweils 10 ng - 100 ng gereinigtes Enzym- Präparat enthielten. Für den pH-Bereich von 3,6 bis 6,0 wurde Na-Acetat-Puffer verwendet. Für den pH-Bereich von 6,1 bis 8,0 wurde Tris-Acetat verwendet. Die Test-Zeit betrug 10 Minuten. Für jedes Enzym-Präparat wurden das pH-Optimum und der pH-Bereich bestimmt, in dem mindestens 90% der optimalen Aktivität vorlagen. Außerdem wurde die Aktivität der Enzyme bei einem pH-Wert von 5,0 im Vergleich zur Aktivität bei dem pH-Optimum berechnet. Die Ergebnisse des Tests sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt: Tabelle VI pH-Optima der β-Glucanasen H3 - H6 und H1 sowie nativer Bacillus-β- Glucanasen
Die pH-Optima der vier Test-Enzyme lagen im Bereich von 6,5 - 7,0. Im Vergleich zu ihren pH-Optima-Aktivitäten zeigten die Enzyme H5 und H6 bei einem pH-Wert von 5,0 Aktivitäten, die die entsprechenden Werte für alle drei nativen Bacillus-Enzyme überstiegen, was auf die etwas geringere Empfindlichkeit gegen nicht-optimale pH-Bedingungen hinweist. Die untere pH-Grenze, bis zu der mindestens 90% der Aktivität erhalten bleibt, betrug für alle Test-Enzyme 5,9 und ist damit der für die nativen Enzyme festgestellten Grenze ähnlich. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen daher, daß durch die Konstruktion von Hybridenzymen, die Polypeptid-Teile der (1,3-1,4)-β- Glucanasen von B. amyloliquefaciens und B. macerans umfassen, Enzyme mit größerer Widerstandsfähigkeit gegenüber sauren Bedingungen erhalten werden können.

Spezifische Aktivität von H3 - H6

Die spezifische Aktivität der β-Glucanasen H3 - H6 wurde im wesentlichen wie vorstehend beschrieben ermittelt, wobei gereinigte Enzym-Präparate in einer Konzentration von 100 µg β-Glucanase-Protein pro ml mit 5 mM CaCl&sub2; angereichertem 20 mM Na-Acetat-Puffer, pH-Wert 6,0, verwendet wurden. Die Reaktionsgemische wurden 20 Minuten bei 25ºC bzw. 50ºC inkubiert. Danach wurde die spezifische Aktivität als µMole Glucose bestimmt, die pro mg Enzym pro Minute freigesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt. Tabelle VII Spezifische Aktivitäten der β-Glucanasen H3 - H6 und H1 sowie nativer Bacillus- β-Glucanasen (µMole Glucose mg gereinigtes Enzym&supmin;¹ min&supmin;¹)
Aus den Ergebnissen wird deutlich, daß das Hybridenzym H6 bei 25ºC eine spezifische Aktivität aufweist, die signifikant höher ist als die spezifischen Aktivitäten der Bacillus-Elternenzyme und der B. subtilis-β-Glucanase. Im allgemeinen waren die spezifischen Aktivitäten bei 50ºC 1,5 - 3-fach höher als die Werte bei 25ºC. Auch bei dieser Temperatur war die spezifische Aktivität von H6 größer als die spezifische Aktivität der Elternenzyme und der nativen Bacillus subtilis-β-Glucanase. Auch das Hybridenzym H1 zeigte bei beiden Temperaturen eine hohe spezifische Aktivität, die in der gleichen Größenordnung lag wie die des Enzyms H6.

Thermostabilität der Hybrid-β-Glucanasen H3 - H6

Die Thermostabilitäten der gereinigten Hybridenzyme wurden im wesentlichen nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren bestimmt und mit denen gereinigter nativer Enzyme aus den vorstehend erwähnten Bacillus-Arten verglichen. Die Enzym-Aktivitäten wurden sowohl bei 65ºC und einem pH-Wert von 4,1 als auch bei 70ºC und einem pH-Wert von 6,0 getestet. Die Konzentration der Enzyme betrug 100 µg/ml Testpuffer. Proben der Reaktionsgemische wurden in Zeitabständen entnommen, die in den Figuren 13 und 14 angegeben sind, in denen auch die Ergebnisse zusammengefaßt sind. Sie zeigen, daß die Hybrid-β-Glucanasen H3, H4 und H5 bei 65ºC und einem pH-Wert von 4,1 im Vergleich zu den nativen Enzymen eine extrem hohe Stabilität zeigten. Nach 60 Minuten blieben mehr als 90% der ursprünglichen Enzymaktivität von H3 und H4 sowie 85% der Enzymaktivität von H5 erhalten. Nach 60-minütiger Inkubation bei 70ºC und einem pH-Wert von 6,0 betrug die Enzym-Restaktivität von H3 85%. Im Gegensatz dazu betrug die Restaktivität der nativen Enzyme nach 60-minütiger Inkubation bei 65ºC und einem pH-Wert von 4,1 im Falle der (1,3-1,4)-β-Glucanasen von B. amyloliquefaciens und B. subtilis nur etwa 10%, während die B. macerans-β-Glucanase nach 10 Minuten vollständig inaktiviert war. Nach 60-minütiger Inkubation bei 70ºC und einem pH-Wert von 6, blieben weniger als 10% der Aktivität der Enzyme von B. subtilis. B. macerans und B. amyloliquefaciens erhalten.

BEISPIEL 6

WIRKUNG DER HYBRID-(1,3-1,4)-β-GLUCANASE H3 AUF DIE HYDROLYSE VON GERSTEN-β-GLUCAN WÄHREND DES MAISCHENS

Es wurde ein Experiment durchgeführt, bei dem die Wirksamkeit des Hybridenzyms H3 zum Abbau von Gersten-β-Glucan während des Maischverfahrens mit der Wirksamkeit eines im Handel erhältlichen β- Glucanase-Produkts verglichen wurde. Das Maischgemisch bestand aus 50 g feingemahlenem Malz, dem 200 ml vorgewärmtes (37ºC) Leitungswasser zugegeben wurden. Unter gründlichem Rühren wurden diesem Substratgemisch 5 µg gereinigtes H3-Enzym-Präparat zugegeben. Zur Kontrolle wurden zwei ähnliche Maischgemische hergestellt, wobei einem davon das im Handel erhältliche β-Glucanase-Produkt Cereflo 200 L (Novo-Nordisk A/S) in einer 5 µg Bacillus subtilis-β-Glucanase enthaltenden Menge zugegeben wurde. Das letzte Maischgemisch diente als Negativ-Kontrolle, d.h. es wurde keine β- Glucanase zugegeben. Zur Inituerung des Maischverfahrens ließ man die so hergestellten Gemische etwa 50 Minuten bei 37ºC stehen. Anschließend wurden die Gemische entsprechend der in Figur 15 angegebenen Temperaturkurve bis zur 175. Minute erhitzt. Während der Zeitspanne von der 65. Minute bis zur 185. Minute wurden den Gemischen Proben in den in Figur 15 angegebenen Zeitabständen entnommen. Im Anschluß an diese Zeitspanne, in der das eigentliche Maischen erfolgte, wurden weitere Proben nach 4, 6 und 24 Stunden entnommen.
Die entnommenen Proben wurden sofort auf Eis gekühlt und dann bei 40ºC zentrifugiert. Danach wurden die Überstände in frische Röhrchen überführt und zur Enzym-Inaktivierung 15 Minuten in kochendem Wasser inkubiert. Die Proben wurden dann auf restliches β-Glucan hin untersucht, wobei die Bildung von Calkofluor-Komplexen und die Fließinjektions-Analyse nach dem von J rgensen beschriebenen Verfahren (Carlsberg Res. Commun. 53 (1988), 277- 285 sowie 287-296) verwendet wurden.
Die Ergebnisse der Maisch-Experimente sind in Figur 15 zusammengefaßt, die die β-Glucan-Restmenge in den vorstehend beschriebenen Maischgemischen zeigt. Sie zeigen, daß die Zugabe von β-Glucanasen im Vergleich zur Negativ- Kontrolle zu signifikant verringerten β-Glucan-Mengen in den Gemischen führte. Während die Hydrolyse weiterer β-Glucane durch das im Handel erhältliche β-Glucanase-Produkt bei Temperaturen über 67ºC beendet wurde, baute das in der gleichen Konzentration zugegebene Hybridenzym H3 unabhängig von den Temperatur-Bedingungen während der gesamten Inkubationsdauer kontinuierlich β-Glucane ab. Das Enzym H3 war so aktiv, daß nach Beendigung des Maischverfahrens die β-Glucan-Restmenge weniger als 100 mg pro Liter betrug. Im Vergleich dazu betrug die entsprechende Menge in dem als Negativkontrolle dienenden Gemisch etwa 1600 mg pro Liter und die entsprechende Menge im Gemisch, das die im Handel erhältliche B. subtilis-β- Glucanase enthielt, etwa 600 mg pro Liter. Nach einer 24-stündigen-Zeitspanne, in der man die Gemische gemaischt und anschließend stehengelassen hatte, konnte in dem Gemisch, dem das Hybridenzym H3 zugegeben worden war, im wesentlichen keine β-Glucan-Restmenge festgestellt werden.
Während des gleichen Experiments wurden die β-Glucan-Restmengen in Lösungen aus reinen β-Glucanen nach Zugabe von 250 µg Hybrid-β-Glucanase H3 bzw. B. subtilis-β-Glucanase untersucht. Die Lösungen bestanden aus 50 ml β- Glucan (1,5 mg/ml) in 100 mM Na-Acetat, pH-Wert 5,5, und 5 mM CaCl&sub2;. Vor Zugabe der Enzyme wurden die Lösungen auf 37ºC vorgewärmt.

LITERATURSTELLEN

Argos, P., M. G. Rossman, V. M. Grau, H. Zuber und J. D. Tratschin: Thermal stability and protein structure. Biochemistry 18 (1979), 5698-5703.
Bolivar, F., R. L Rodriguez, P. J. Greene, M. C. Betlach, H. L Heynecker und H. W. Boye: Construction and characterization of new cloning vehicle. II. A multipurpose cloning system. Gene 2 (1977), 95-113.
Borriss, R.: Purification and characterization of an extracellular beta-glucanase from Bacillus IMET B376. Z. Allg. Mikrobiologie 21(1981), 7-17.
Borriss, R. und K. L. Schroeder: β-1,3-1,4-glucanase in sporeforming microorganisms. V. The efficiency of β-glucanase in reducing the viscosity of wort. Zbl. Bakt. II Abt. 136 (1981), 330-340.
Borriss, R., H. Bäumlein und J. Hofemeister: Expression in Escherichia coli of a cloned β-glucanase gene from Bacillus amyloliquefaciens. Appl. Microbiol. Biotechnol. 22 (1985), 63-71.
Borriss, R., R. Manteuffel und J. Hofemeister: Molecular cloning of a gene coding for thermostable beta-glucanase from Bacillus macerans. J. Basic Microbiol. 28 (1988), 3-10.
Bradford, M. M.: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 72 (1976), 248-254.
Cantwell, B. A. und D. J. McConnell: Molecular cloning and expression of a Bacillus subtilis β-glucanase gene in Escherichia coli. Gene 23 (1983), 211-219.
DD-Patentanmeldung WP c12N/315 706 1.
Godfrey, T.: On comparison of key characteristics of industrial enzymes by type and source. In: Industrial Enzymology. Godfrey, T. und J. Reichelt (Herausgeber), (1983), S.466, MacMillan, London.
Hanahan, D.: Techniques for transformation of E. coli. In: DNA Cloning, Bd. 1. A practical approach. D. M. Glover (Herausgeber), (1985), S. 109-135, IRL Press, Oxford.
Hattori, M. und Y. Sakaki: Dideoxy sequencing method using denatured plasmid templates. Anal. Chem. 152 (1986), 232-238.
Hofemeister, J., A. Kurtz, R. Borriss und J. Knowles: The β-glucanase gene from Bacillus amyloliquefaciens shows extensive homology with that of Bacillus subtilis. Gene 49 (1986), 177-187.
Horton, R. M., H. D. Hunt, S. N. Ho, J. K. Pullen und L R. Pease: Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: Gene splicing by overlap extension. Gene 77 (1989), 61-68.
Imanaka, T., M. Shibazaki und M. Takagi: A new way of enhancing the thermostability of proteases. Nature 324 (1986), 695-697.
Jergensen, K. G.: Quantification of high molecular weight (1T3) (1T4)-β-D- glucan using calcofluor complex formation and flow injection analysis. II. Analytical principle and its standardization. Carlsberg Res. Commun. 53 (1988), 277-285.
J rgensen, K. G.: Quantification of high molecular weight (1T3) (1T4)-β-D- glucan using calcofluor complex formation and flow injection analysis. II. Determination of total β-glucan content of barley and malt. Carlsberg Res. Commun. 53 (1988), 287-296.
Laemmli, U. K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 (1970), 680-685.
Lederberg, E. M. und S. N. Cohen: Transformation of Salmonella typhimurium by plasmid deoxyribonucleic acid. J. Bacteriol. 119 (1974), 1072-1074.
Loi, L, P. A. Barton und G. B. Fincher: Survival of barley (1T3) (1T4)-β- glucanase isoenzymes during kilning and mashing. J. Cereal Sci. 5 (1987), 45-50.
Matthews, B. W., H. Nicholson und W. J. Becktel: Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 6663-6667.
McCleary, B. V.: Soluble, dye-labeled polysaccharides for the assay of endohydrolases. Methods Enzymol. 160 (1988), 74-86.
McFadden, G. I., B. Ahluwalia, A. E. Clarke und G. B. Fincher: Expression sites and developmental regulation of genes encoding (1T3) (1T4)-β-glucanases in germinated barley. Planta 173 (1988), 500-508.
Mead, B. A., E. Szczesna-Skorupa und B. Kemper: Single-stranded DNA "blue" T7 promoter plasmids: A versatile tandem promoter system for cloning and protein engineering. Protein engineering 1 (1986), 67-74.
Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), S. 2149.
Miller, G. L: Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugars. Analytical Chemistry 31 (1959), 426-428.
Murphy, N., D. J. McConnell und B. A. Cantwell: The DNA sequence of the gene and genetic control sites for the excreted B. subtilis enzyme β-glucanase. Nucleic Acids Res. 12 (1984), 5355-5367.
Querol, E. und A. Parilla: Tentative rules for increasing the thermostability of enzymes by protein engineering. Enzyme Microb. Technol. 9 (1987), 238-244.
Shinnick, Ann. Rev. Microbiol. 37 (1983), 425-446.
Streuli, M., A. Hall, W. Boll, W. E. Stewart II, S. Nagata und C. Weissmann: Target cell specificity of two species of human interferon-alpha produced in Escherichia coli and of hybrid molecules derived from them. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981), 2848-2852.
Thomsen, K. K.: Mouse α-amylase synthesized by Saccharomyces cerevisiae is released into the culture medium. Carlsberg Res. Commun. 48 (1983), 545-555.
Vanish-Perron, C. J. Vieira und J. Messing: Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mp 18 and pUC19 vectors. Gene 33 (1985), 103-119.
Weck, P., T. Apperson, N. Stebbing, H. M. Shepard und D. V. Goeddel: Antiviral activities of hybrids of two major human leukocyte interferons. Nucleic Acids Res. 9 (1981), 6153-6165.
Yon, J. und M. Fried: Precise gene fusion by PCR. Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4895.
Zhang, H., R. Scholl, J. Browse und C. Sommerville: Double stranded sequencing as a choice for DNA sequencing. Nucleic Acids Res. 16 (1988), 1220.

Claims

1. Thermostabile Hybrid-(1,3-1,4)-β-Glucanase, die von einem durch reziproken Austausch der aminoterminalen und carboxyterminalen Teile der (1,3-1,4)-β-Glucanasegene von Bacillus spp. hergestellten Hybridgen codiert wird, wobei die Glucanase mindestens 50 % ihrer Aktivität nach 10minütiger oder längerer Inkubation in 5 bis 10 mM CaCl&sub2; und 20 bis 40 mM Na-Acetat bei einem pH-Wert von 6,0 oder niedriger und einer Temperatur von 65ºC oder höher behält und dabei die inkubierte Lösung eine Enzymkonzentration im Bereich von 0,05 mg bis 1 mg (1,3-1,4)- β-Glucanase pro ml aufweist, und unter Aktivität der (1,3-1,4)-β-Glucanase die Fähigkeit des Enzyms zur Hydrolyse von β-glycosidischen Bindungen in (1,3-1,4)-β- Glucanen verstanden wird, und wobei die Hybrid-(1,3- 1,4)-β-Glucanase thermostabiler als andere Glucanasen ist, die von den ursprünglichen (1,3-1,4)-β-Glucanasegenen von Bacillus spp. codiert werden.

2. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 1, wobei die Inkubationszeit 15 Minuten beträgt.

3. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 1, wobei die Inkubationszeit 18 Minuten beträgt.

4. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Inkubationstemperatur 70ºC beträgt.

5. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Lösung eine Konzentration im Bereich von 0,3 bis 1 mg (1,3-1,4)-β-Glucanase pro ml aufweist.

6. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 1, die mindestens 85 % ihrer Aktivität nach 30minütiger oder längerer Inkubation behält.

7. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 6, wobei die Inkubationszeit 60 Minuten beträgt.

8. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 6, die mindestens 85 % ihrer Aktivität nach 30minütiger oder längerer Inkubation in 5 bis 10 mM CaCl&sub2; und 20 bis 40. mM Na-Acetat bei einem pH-Wert von 4,1 und einer Temperatur von 65ºC behält, wobei die inkubierte Lösung eine Enzymkonzentration von 0,1 mg (1,3-1,4)-β-Glucanase pro ml aufweist.

9. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 6, die mindestens 85 % ihrer Aktivität nach 30minütiger oder längerer Inkubation in 5 bis 10 mM CaCl&sub2; und 20 bis 40 mM Na-Acetat bei einem pH-Wert von 6,0 und einer Temperatur von 70ºC behält, wobei die inkubierte Lösung eine Enzymkonzentration von 0,1 mg (1,3-1,4)-β-Glucanase pro ml aufweist.

10. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Inkubationszeit 60 Minuten beträgt.

11. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach einem der Ansprüche 8 bis 10, die mindestens 90 % ihrer Aktivität behält.

12. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach einem der Ansprüche 1 bis 11, die nach 10minütiger Inkubation bei 65ºC und einem pH-Wert von 6,0 in Rohzellextrakten eine relative β-Glucanaseaktivität von mindestens 100 % hat.

13. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 12, die eine relative β-Glucanaseaktivität von 130 % hat.

14. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach einem der Ansprüche 1 bis 13, umfassend eine Aminosäuresequenz mit der Formel

A - M

wobei A ein Polypeptid ist, das aus 5 bis 200 Aminosäuren besteht und zu mindestens 75 % identisch ist mit einem Polypeptid mit der gleichen Gesamtzahl an Aminosäureresten im N-terminalen Teil der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus macerans, wie es in den Tabellen I und II dargestellt ist, und M ein Polypeptid ist, das aus 5 bis 200 Aminosäuren besteht und zu mindestens 75 % identisch ist mit einem Polypeptid mit der gleichen Gesamtzahl an Aminosäureresten im C-terminalen Teil der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus macerans, wie es in den Tabellen I und II dargestellt ist.

15. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 14, umfassend eine Aminosäuresequenz mit der Formel

A - M

wobei A ein Polypeptid ist, das aus 5 bis 200 Aminosäuren besteht und zu mindestens 85 % identisch ist mit einem Polypeptid mit der gleichen Gesamtzahl an Aminosäureresten im N-terminalen Teil der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus macerans, wie es in den Tabellen I und II dargestellt ist, und M ein Polypeptid ist, das aus 5 bis 200 Aminosäuren besteht und zu mindestens 85 % identisch ist mit einem Polypeptid mit der gleichen Gesamtzahl an Aminosäureresten im C-terminalen Teil der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus macerans, wie es in den Tabellen I und II dargestellt ist.

16. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 15, umfassend eine Aminosäuresequenz mit der Formel

A - M

wobei A ein Polypeptid ist, das aus 5 bis 200 Aminosäuren besteht und zu mindestens 90 % identisch ist mit einem Polypeptid mit der gleichen Gesamtzahl an Aminosäureresten im N-terminalen Teil der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus macerans, wie es in den Tabellen I und II dargestellt ist, und M ein Polypeptid ist, das aus 5 bis 200 Aminosäuren besteht und zu mindestens 90 % identisch ist mit einem Polypeptid mit der gleichen Gesamtzahl an Aminosäureresten im C-terminalen Teil der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus macerans, wie es in den Tabellen I und II dargestellt ist.

17. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 16, umfassend eine Aminosäuresequenz mit der Formel

A - M

wobei A ein Polypeptid ist, das aus 5 bis 200 Aminosäuren besteht und identisch ist mit einem Polypeptid mit der gleichen Gesamtzahl an Aminosäureresten im N-terminalen Teil der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus macerans, wie es in den Tabellen I und II dargestellt ist, und M ein Polypeptid ist, das aus 5 bis 200 Aminosäuren besteht und identisch ist mit einem Polypeptid mit der gleichen Gesamtzahl an Aminosäureresten im C-terminalen Teil der (1,3-1,4)-β- Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus macerans, wie es in den Tabellen I und II dargestellt ist.

18. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 14, wobei A ein Polypeptid ist, das aus 16 Aminosäuren besteht, die zu mindestens 75 %, vorzugsweise zu mindestens 85 % und insbesondere zu mindestens 90 % identisch mit den Aminosäureresten des N-terminalen Teils der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens sind, wie es in Tabelle I dargestellt ist.

19. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 14, wobei A ein Polypeptid ist, das aus 36 Aminosäuren besteht, die zu mindestens 75 %, vorzugsweise zu mindestens 85 % und insbesondere zu mindestens 90 % identisch mit den Aminosäureresten des N-terminalen Teils der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens sind, wie es in Tabelle I dargestellt ist.

20. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 14, wobei A ein Polypeptid ist, das aus 78 Aminosäuren besteht, die zu mindestens 75 %, vorzugsweise zu mindestens 85 % und insbesondere zu mindestens 90 % identisch mit den Aminosäureresten des N-terminalen Teils der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens sind, wie es in Tabelle I dargestellt ist.

21. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 14, wobei A ein Polypeptid ist, das aus 107 Aminosäuren besteht, die zu mindestens 75 %, vorzugsweise zu mindestens 85 % und insbesondere zu mindestens 90 % identisch mit den Aminosäureresten des N-terminalen Teils der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens sind, wie es in Tabelle I dargestellt ist.

22. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 14, wobei A ein Polypeptid ist, das aus 152 Aminosäuren besteht, die zu mindestens 75 %, vorzugsweise zu mindestens 85 % und insbesondere zu mindestens 90 % identisch mit den Aminosäureresten des N-terminalen Teils der (1,3-1,4)-β-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens sind, wie es in Tabellen I und II dargestellt ist.

23. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach einem der Ansprüche 1 bis 22, die ein an das N-terminale Ende des Enzyms gebundenes Signalpeptid besitzt.

24. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 23, die ein von einer Hefe, wie einer Saccharomyces-Art, stammendes Signalpeptid besitzt.

25. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 24, die ein Signalpeptid besitzt, das das Signalpeptid vom α-Faktor von Hefe, von saurer Phosphatase von Hefe oder von Invertase von Hefe ist.

26. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 23, die ein Signalpeptid besitzt, das auf Aminosäureebene zu mindestens 75 %, vorzugsweise zu mindestens 85 % und stärker bevorzugt zu mindestens 90 % identisch mit dem Signalpeptid von Bacillus amyloliquefaciens ist.

27. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 1, die die folgende Aminosäuresequenz umfaßt:

oder Analoge davon.

28. Thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 1, die die folgende Aminosäuresequenz umfaßt:

oder Analoge davon.

29. DNA-Fragment, umfassend eine Nucleotidsequenz, die die thermostabile (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 17 codiert.

30. DNA-Fragment nach Anspruch 29, die die folgende Nucleotidsequenz umfaßt:

oder ein Analog oder eine Subsequenz davon.

31. Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen (1,3- 1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 1, umfassend die Züchtung eines Mikroorganismus, in den ein DNA-Fragment nach Anspruch 29 oder 30 so eingeführt wurde, daß der Mikroorganismus in der Lage ist, die thermostabile (1,3-1,4)-β- Glucanase zu exprimieren, wobei die Züchtung unter Bedingungen durchgeführt wird, die zur Produktion der thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase und Gewinnung der (1,3-1,4)-β-Glucanase aus der Kultur führt.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium ist.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Bakterium ein gram-negatives Bakterium ist.

34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei das gram-negative Bakterium ein E. coli-Stamm ist.

35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei der E. coli-Stamm ein das Plasmid pUC13-H1 enthaltender E. coli-Stamm ist und das Plasmid bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 5461 hinterlegt ist.

36. Verfahren nach Anspruch 34, wobei der E. coli-Stamm ein das Plasmid pTZ19R-H3 enthaltender E. coli-Stamm ist und das Plasmid bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 5790 hinterlegt ist.

37. Verfahren nach Anspruch 34, wobei der E. coli-Stamm ein das Plasmid pTZ19R-H4 enthaltender E. coli-Stamm ist und das Plasmid bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 5791 hinterlegt ist.

38. Verfahren nach Anspruch 34, wobei der E. coli-Stamm ein das Plasmid pTZ19R-H5 enthaltender E. coli-Stamm ist und das Plasmid bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 5792 hinterlegt ist.

39. Verfahren nach Anspruch 34, wobei der E. coli-Stamm ein das Plasmid pTZ19R-H6 enthaltender E. coli-Stamm ist und das Plasmid bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 5793 hinterlegt ist.

40. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Mikroorganismus eine Hefe ist.

41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Hefe eine Saccharomyces-Art ist.

42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Saccharomyces-Art Saccharomyces cerevisiae ist.

43. Eukaryontischer oder prokaryontischer Organismus, der mit dem DNA-Fragment nach Anspruch 29 oder 30 transformiert ist und dieses exprimieren kann.

44. Organismus nach Anspruch 43, der ein Mikroorganismus ist.

45. Mikroorganismus nach Anspruch 44, der ein Bakterium ist.

46. Bakterium nach Anspruch 45, das ein gram-negatives Bakterium ist.

47. Bakterium nach Anspruch 46, das ein E. coli-Stamm ist.

48. E. coli-Stamm, der das Plasmid pUC13-H1 enthält, das bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 5461 hinterlegt ist, und Mutanten und Varianten davon.

49. E. coli-Stamm, der das Plasmid pTZ19R-H3 enthält, das bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 5790 hinterlegt ist, und Mutanten und Varianten davon.

50. E. coli-Stamm, der das Plasmid pTZ19R-H4 enthält, das bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 5791 hinterlegt ist, und Mutanten und Varianten davon.

51. E. coli-Stamm, der das Plasmid pTZ19R-H5 enthält, das bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 5792 hinterlegt ist, und Mutanten und Varianten davon.

52. E. coli-Stamm, der das Plasmid pTZ19R-H6 enthält, das bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 5793 hinterlegt ist, und Mutanten und Varianten davon.

53. Mikroorganismus nach Anspruch 44, der eine Hefe ist.

54. Hefe nach Anspruch 53, die eine Saccharomyces-Art ist.

55. Saccharomyces-Art nach Anspruch 54, die Saccharomyces cerevisiae ist.

56. Organismus nach Anspruch 43, der eine Pflanze ist.

57. Pflanze nach Anspruch 56, die Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Reis oder Mais ist.

58. Verfahren zum Abbau von (1,3-1,4)-β-Glucanen in einem Substrat, umfassend das Einwirken einer wirksamen Menge an thermostabiler (1,3-1,4)-β-Glucanase nach einem der Ansprüche 1 bis 22 für einen bestimmten Zeitraum bei einer Temperatur von 65ºC oder höher auf das Substrat, wobei die Menge an (1,3-1,4)-β-Glucanase höchstens 200 µg, bevorzugt höchstens 100 µg, stärker bevorzugt höchstens 50 µg, noch stärker bevorzugt höchstens 20 µg und am stärksten bevorzugt 15 µg pro kg Substrat beträgt.

59. Verfahren nach Anspruch 58, wobei das Substrat nicht-modifizierte, unbehandelte Körner oder Teile davon von Gerste oder Hafer oder anderem Getreide umfaßt.

60. Verfahren nach Anspruch 58 oder 59, wobei das (1,3-1,4)- β-Glucane enthaltende Substrat mit einem zweiten Substrat gemischt wird, das aus eine thermostabile (1,3- 1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 1 enthaltendem Mais, Reis oder Weizen stammt.

61. Verfahren zur Herstellung von Bier, dadurch gekennzeichnet, daß die Würze der Behandlung mit einer thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase nach einem der Ansprüche 1 bis 22 während des Zerstampfens bei einer Temperatur von 65ºC oder höher und einem pH-Wert zwischen 4 und 5,5 unterzogen wird.

62. Verfahren nach Anspruch 61, bei dem die Temperatur 70ºC oder mehr beträgt.

63. Verfahren zur Herstellung von β-Glucane enthaltender Tiernahrung, dadurch gekennzeichnet, daß die Tiernahrung mit einer thermostabilen (1,3-1,4)-β-Glucanase nach Anspruch 1 in einer Menge versetzt wird, die zum Erhalt eines signifikanten Abbaus von β-Glucanen im Gastrointestinaltrakt eines Tieres geeignet ist, das mit mit (1,3-1,4)-β-Glucanase versetzter Tiernahrung gefüttert wurde.

64. Verfahren nach Anspruch 63, wobei die Tiernahrung zu Pellets geformt ist.