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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Kanamycin-Nukleotidyltransferase
mit deutlich verbesserter Thermostabilität, einen Selektierungsmarker,
welcher diese verwendet, und ein Durchmusterungsverfahren für thermophile
Bakterien, wie Thermus thermophilus, unter Verwendung dieses Selektierungsmarkers.
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Hintergrund der Erfindung
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Thermophile
Bakterien haben aufgrund der Anwendbarkeit ihrer Proteine in der
Biotechnologie Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Da die Proteine
bei extremen pH-Werten stabil sind, kristallisieren sie im Vergleich
zu nicht-thermophilen Proteinen leicht, sind einfach zu handhaben
und als ein gutes Forschungsmaterial bei der Untersuchung des Zusammenhangs
zwischen Enzymstruktur und dessen Funktion nützlich. Wenn thermophiles Protein
in E. coli exprimiert wird, kann dessen natürliche Konformation jedoch
nicht reproduziert werden. Da Standardwerkzeuge der Gentechnologie
nicht verwendet werden können,
können
diese Proteine in thermophilen Bakterien bei hohen Temperaturen
nicht exprimiert werden. Dies verhindert eine Untersuchung der biologischen
Rolle dieser Proteine durch Ausschalten von Genen mit Funktionen,
die aus den Sequenzdaten, die von dem Genomprojekt erhalten wurden,
nicht vorhergesagt werden können,
gefolgt von deren erneutem Einbringen. Thermus thermophilus, welcher
zu einem Eubakterium gehört,
ist ein interessanter Organismus, der bei den höchsten Temperaturen (50 – 82°C) unter
den Organismen, deren Molekularbiologie untersucht wird, gezüchtet werden
kann.
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Die
Sequenzanalyse des gesamten Genoms von hochgradig thermophilem Thermus
thermophilus wird derzeit durchgeführt. Die Sequenzerforschung
an dem gesamten Genom wird bald in Japan (HB8-Stamm) und Deutschland
(HB27-Stamm) abgeschlossen sein. Wie bei anderen Genomprojekten
liegt das Hauptinteresse nicht in der Sequenz selbst, sondern hat
sich auf funktionale und strukturelle Genomuntersuchung verschoben,
was Forschung nach der Sequenzierung bedeutet. Es gibt ein Projekt
zur organisierten Erforschung der Struktur und biologischen Funktion
von T. thermophilus-Protein. Daher besteht ein Bedarf nach einer
schnellen Entwicklung von gentechnischen Werkzeugen. Das unentbehrlichste
Werkzeug ist ein einfach anzuwendender Selektierungsmarker.
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Bis
jetzt gab es nur zwei Selektierungssysteme, die mit T. thermophilus
verwendet werden konnten. Ein System war ein Verfahren, bei dem
ein auxotropher Wirt über
ein Plasmid selektiert wurde, in welches das entsprechende Gen aufgenommen
war. Jedoch ist der auxotrophe Marker für eine Routineanwendung unbequem.
Dies liegt daran, daß die
Herstellung des Selektierungsmediums mühsam und Wachstum von Zellen auf
der hinsichtlich Nährstoff
beschränkten
Platte auch unter der optimalen Wachstumstemperatur langsam ist.
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Ein
weiteres System verwendete ein Kanamycin-Nukleotidyltransferase
(KNT)-Gen, das nur unterhalb von 60°C verwendet werden konnte. T.
thermophilus besitzt Empfindlichkeit gegenüber allgemeinen Antibiotika,
jedoch ist der einzige Antibiotikaresistenzmarker, der mit T. thermophilus
verwendet werden kann, ein mutantes Gen von Staphylococcus aureus
KNT. Da diese mutante KNT jedoch nicht oberhalb von 60°C als ein Selektierungsmarker
verwendet werden kann, ist sie vom Idealen weit entfernt. Bei dieser
Temperatur, welche weit unterhalb der optimalen Wachstumstemperatur
(70 – 75°C) liegt,
ist das Zellwachstum äußerst langsam. Daher
haben wir damit begonnen, die Thermostabilität von KNT zu verbessern.
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Kurze Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
wurden viele Versuche unternommen, die Thermostabilität von Proteinen
zu verbessern. Die meisten Ansätze
wurden auf der Grundlage eines Verständnisses der Proteinfaltung
und der Strukturausbildung rational entworfen. Zum Beispiel wurde
die Einführung
von Disulfidbindungen, das erneute Sequenzieren der Verpackung von
hydrophoben Kernen und die Substitution mit Prolin versucht. Zur
Erforschung, ob es möglich war,
Thermostabilität
durch Aminosäuresubstitution
zu realisieren, wurde ein Vergleich der Sequenzen von homogen Proteinen
von thermophilen und nicht-thermophilen
Bakterien durchgeführt.
Im Gegensatz dazu wurden auch irrationale Verfahren angewendet,
um die Thermostabilität
von Proteinen zu erhöhen.
Der größte Teil dieser
Forschung umfaßte
das Einbringen von zufälligen
Mutationen, gefolgt von einer einzelnen Durchmusterung anstelle
von zielgerichteter Entwicklung, welche wiederholte Zyklen des Einbringens
einer Mutation, das Selektieren und das Vervielfältigen der selektierten Mutante
umfaßt.
Nur in zwei von drei Fällen
der Forschung wurde von einer erfolgreichen Verbesserung der Thermostabilität durch
zielgerichtete Entwicklung berichtet.
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Die
hiesigen Erfinder, welche eine Strategie verwendet haben, die auf
zielgerichteter Entwicklung in Richtung der oberen Grenze der Wachstumstemperatur
von T. thermophilus beruht, waren bei der Erhöhung der Thermostabilität eines
Kanamycin-Resistenzgenprodukts bis zu der oberen Grenze der Wachstumstemperatur
erfolgreich. Die erhaltene KNT ist ein bequemer Selektierungsmarker
für thermophile
Bakterien, wie T. thermophilus.
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Mit
anderen Worten stellt die vorliegende Erfindung die folgenden Aspekte
(1) bis (9) bereit:
- (1) Eine mutante Kanamycin-Nukleotidyltransferase
mit einer oder mehreren Punktmutationen, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend
aus Met57Leu, Ala62Val, Ser94Pro, Ser203Pro, Asp206Val, His207Gln, Ser220Pro,
Ile234Val und Thr238Ala, gegenüber
dem Protein, welches die durch SEQ ID NO:1 angegebene Aminosäuresequenz
aufweist, und mit verbesserter Thermostabilität.
- (2) Eine mutante Kanamycin-Nukleotidyltransferase mit verbesserter
Thermostabilität,
wobei diese die durch SEQ ID NO:2 angegebene Aminosäuresequenz
aufweist.
- (3) Die Kanamycin-Nukleotidyltransferase gemäß (1) oben, wobei diese die
durch SEQ ID NO:3 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.
- (4) Ein Kanamycin-Nukleotidyltransferanse-Gen, welches die Kanamycin-Nukleotidyltransferase
nach einem von (1) bis (3) oben codiert.
- (5) Ein Plasmid, welches das Gen gemäß (4) oben umfaßt.
- (6) Eine Transformande, welche das Plasmid gemäß (5) oben
umfaßt.
- (7) Einen Selektierungsmarker für thermophile Bakterien, der
dadurch gekennzeichnet ist, daß er
das Gen gemäß (4) oben
ist.
- (8) Ein Verfahren zur Durchmusterung von thermophilen Bakterien,
wobei der Selektierungsmarker gemäß (7) oben verwendet wird.
- (9) Das Durchmusterungsverfahren gemäß (8) oben, wobei das thermophile
Bakterium Thermus thermophilus ist.
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In
der vorliegenden Erfindung weist der mutante Stamm mit der höchsten Thermostabilität 19 Aminosäuresubstitutionen
gegenüber
der Form vor der Mutation auf. Die Thermostabilität wurde
um 20°C
erhöht,
jedoch wurde keine große
Veränderung
in der Enzymaktivität
als solcher beobachtet. Die meisten der veränderten Reste liegen an der
Oberfläche
des Proteinmoleküls.
Interessanterweise waren 5 Substitutionen von 19 solche Substitutionen
des vorhandenen Restes durch Prolin. Das hervorgebrachte Kanamycin-Resistenzgenprodukt
ist in der Lage, bei der optimalen Wachstumstemperatur von T. thermophilus
ein Selektierungsmarker zu werden. Die Entwicklung solcher bequemer
Gentechnologiewerkzeuge wird die Erforschung von T. thermophilus
nach der Sequenzierung fördern.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1 zeigt
die Restriktionskarten für
jedes der Plasmide (a) pYK134 (b) pTT8 und (c) pJHK1.
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2 zeigt
die Thermostabilität
von KNT.
(A) Die Hitzedenaturierung von WT* (☐), KT3-11
(Δ) und
HTK (O) wurde anhand von CD bei 222 nm beobachtet und aufgezeichnet.
Die Meßbedingungen
waren wie folgt: Proteinkonzentration: 0,8 μM, 50 mM Kaliumphosphatpuffer,
welcher 0,1 M KCl enthielt, und ein pH-Wert von 7,0. Grad
der Denaturierung (%) = (θT 222 – θN 222)/(θD 222 – θN 222)(θT 222 ist die durchschnittliche
Restmolekülelliptizität bei T°C bei 222
nm, und θT 222 und θD 222 sind die durchschnittlichen
Restmolekülelliptizitäten bei
222 nm für
das nicht-denaturierte bzw. das denaturierte Enzym.)
(B) Hitzeinaktivierung:
Enzymlösung
wird für
zehn Minuten auf die angegebene Temperatur erhitzt. Nach dem Abkühlen wird
die Aktivität
bei 25°C
gemessen. Die Hitzebehandlung wurde mit einer Proteinkonzentration
von 1,2 μM und
unter Verwendung des gleichen Puffers wie bei der CD-Messung durchgeführt. Die
Werte für
jedes Enzym sind als ein Verhältnis
im Vergleich zu dem entsprechenden nicht-hitzebehandelten Enzym
ausgedrückt.
Jeder numerische Wert hat eine Standardabweichung von ± 10%.
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3 zeigt
eine 3-dimensionale Darstellung der Struktur von KNT mit der Asp80Tyr-Mutation (KT3-11 und
HTK). KNT ist ein Homodimer, und die Positionen und die Restenummern
von modifizierten Resten sind nur für eine der Untereinheiten angegeben.
Die mutierten Reste von KT3-11, die zusätzlichen neun mutierten Reste
von HTK, Kanamycin und Adenosin-5'-α,β-Methylentriphosphat,
welches ein Analoges von ATP ist, sind angegeben. Diese Figur wurde
unter Verwendung von MOLSCRIPT erstellt (Per Kraulis, Department
of Molecular Biology, Uppsala Universität, Schweden).
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4 zeigt
eine Restriktionskarte für
das Plasmid pJHK3.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Nachfolgend
wird eine ausführbare
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung erläutert,
jedoch soll dies die vorliegende Erfindung nicht nur auf die hierin
beschriebene Form beschränken.
Geeignete Modifikationen oder Veränderungen, die von dem Fachmann
auf dem Gebiet auf der Grundlage der hierin enthaltenen Beschreibungen
oder auf dem Gebiet bekannter Techniken durchgeführt werden könnten, sollen
im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten sein.
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In
der vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Begriff „zielgerichtete
Entwicklung" Mittel,
durch welche die Zielfunktion durch wiederholtes Durchführen der
folgenden Stufen verbessert wird: Einbringen einer Mutation, Selektion,
Vervielfältigung
der selektierten Mutante und das weitere Einbringen einer Mutation
in diese Mutante.
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Weiterhin
bedeutet in der vorliegenden Beschreibung eine Beschreibung, die
eine Aminiosäuresubstitution
betrifft, z.B. „Met57Leu", daß Met an
Position 57 des Wildtyps (der in dieser Beschreibung als „WT*" bezeichnet wird)
durch Leu ersetzt ist.
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Weiterhin
bezieht sich in der vorliegenden Beschreibung „verbesserte Thermostabilität" auf die Beibehaltung
von Enzymaktivität
unter derart hohen Temperaturbedingungen, daß das Wildtyp-Protein denaturiert und
die Enzymaktivität
verlorengehen würde.
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Medium
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T.
thermophilus-Zellen werden vorzugsweise in einem Flüssigmedium
kultiviert, das 0,4% Trypton, 0,2% Hefeextrakt und 0,1% NaCl (pH
7,5) enthält.
Bei der Selektion des T. thermophilus Transformandenstammes wird
ein 3%-iges Agarplattenmedium mit 50 μg/ml Kanamycin (wenn die Temperatur
unter 70°C
liegt) oder ein 1,5%-iges Gellan-Gummi-Plattenmedium mit 500 μg/ml Kanamycin
(wenn die Temperatur über
70°C liegt) verwendet.
Zur Verfestigung des Gellan-Gummis werden bivalente Kationen, 1,5
mM CaCl2 und 1,5 mM MgCl2, zugefügt. Da diese
Ionen dem Kana mycin entgegenwirken, wird die Konzentration an Kanamycin
in dem Gellan-Gummi-Medium höhergesetzt.
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Konstruktion des Plasmides
pJNK1
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Die
Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz
des Widtyp-KNT von Staphylococcus aureus (SEQ ID NO: 10 und 11)
sind bekannt von Nakanishi, K. et al., J. Ferment. Technol. 54:801-807 (1976), etc. Ein
Plasmid, welches das Protein codiert, umfaßt pUB110 (3.000 kDa, Lacey,
R. W. und I. Chopra, J. Med. Microbiol., 7: 285-297 (1974)). Zielgerichtete
Entwicklung wird von einer Mutante (bezeichnet als „WT*", SEQ ID NO:1) mit
zwei Substitutionen (Asp80Tyr und Thr130Lys) in Bezug auf die Wildtyp-KNT
initiiert. Das WT*KNT-Gen wird durch PCR von pYK134 (12,3 kb, National
Institute of Bioscience and Human-Technology, von Dr. Y. Koyama)
unter Verwendung von zwei Primern (5'-Primer: 5'-GACTGTACGGGTACCCGTTGACGGCGGATATGGTA-3' (der unterstrichene
Abschnitt ist die KpnI-Stelle, SEQ ID NO:4 ) und 3'-Primer: 5'-GACTGTACGCTGCAGCGTAA
CCAACATGATTAACA-3' (der
unterstrichene Abschnitt ist die PstI-Stelle, SEQ ID NO:5)) vervielfältigt. Das
pYK134 ist von dem Plasmid pTT8 abgeleitet, welches von T. thermophilus
HB8 abgetrennt ist (Tokyo Pharmaceutical University, von Dr. Y.
Oshima), und sein Ursprung ist in der Nähe einer BcII-Stelle angeordnet.
Um die Größe von pTT8
(9,7kb) zu reduzieren, wird ein KpnI-PstI-Fragment (5,5kb), welches
die BcII-Stelle umfaßt,
gelgereinigt und mit dem vervielfältigten WT*-Gen ligiert. Das
erhaltene Plasmid pJHK1 (6,5kb) wird in dem Experiment der zielgerichteten
Entwicklung verwendet. Eine Restriktionskarte für die pYK134, pTT8 und pJHK1
ist in 1 gezeigt.
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Transformation von T.
thermophilus HB27
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Transformation
von T. thermophilus wird vorzugsweise wie folgt durchgeführt: T.
thermophilus, welcher über
Nacht kultiviert wurde, wird um einen Faktor von 100 in einem neuen
Medium, das 0,4 mM CaCl2 und 0,4 mM MgCl2 enthält,
verdünnt,
und anschließend
für 2 Stunden
bei 70°C
unter Schütteln
kultiviert. Das Kulturprodukt (1 × 108 Zellen/ml)
wird mit einem Plasmid gemischt, z.B. pJHK1, und unter Bewegung
für 2 Stunden bei
70°C inkubiert
und anschließend
auf ein Plattenmedium, welches Kanamycin enthält, verteilt.
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Zielgerichtete Entwicklung
einer thermostabilen KNT-Mutante
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DNA-Vermischung
wird in der von Stemmer et al. (Stemmer, W. P. C. et al., Nature,
370, 389-391 (1994)) beschriebenen Art und Weise durchgeführt. In
der Praxis wird die DNA, welche das Zielgen enthält, unter Verwendung von DNasel
fragmentiert, und DNA-Fragmente von 100 – 300 by werden gewonnen. Ein Gemisch
dieser DNA-Fragmente wird durch PCR ohne Primer vervielfältigt. Da
zwischen den verschiedenen Fragmente überlappende Sequenzen vorhanden
sind, wird hier die Vorfragmentierung von DNA der vollen Länge rekonstruiert.
Diese DNA der vollen Länge
wird dann durch PCR unter Verwendung von 5'- und 3'-terminalen Primern vervielfältigt.
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Der
codierende Bereich des WT*-Gens wird von dem oben erhaltenen pJHK1
mittels PCR vervielfältigt.
Der 5'-Primer, der
in der PCR verwendet wird, ist 5'-GACTGTACGGAATTCGAGCTC GAGCAAATCTAAAA-3' (der unterstrichene
Bereich ist die EcoRI-Stelle, SEQ ID NO:6), und die Sequenz des
3'-Primers ist wie
oben (SEQ ID NO:5). Die gemischten Fragmente werden mit EcoRI und
PstI gespalten, gereinigt und in pJNK1 eingebracht, welcher mit
den gleichen Restriktionsenzymen gespalten wurde. Danach wird T. thermophilus
HB27 (National Institute of Bioscience and Human Technology, von
Dr. Y. Koyama) mit diesem pJHK1-Derivat (dem gemischtes Fragment
eingesetzt ist) transformiert. Die Transformande (Bibliothek) wird auf
einer Platte, die Kanamycin enthält,
(64°C, 36
h) durchmustert, positive Kolonien genommen und auf eine Kanamycin-Platte überführt und
bei 64°C
für 40
Stunden kultiviert. Von der Platte werden Zellen mit sterilisierten
Wasser gesammelt, und ein Plasmidgemisch, ein pKT1-Gemisch, wird
hergestellt. Das mutante Gen, das von dem pKT1-Gemisch vervielfältigt wurde,
wird dann gemischt und einer zweiten Durchmusterung wie das erste
Mal unterzogen. D.h., daß die
durch Mischen erhaltene Bibliothek für 40 Stunden beim 69°C kultiviert wird
und noch einmal die positiven Kolonien ausgewählt werden. Dies wird als ein
pKT2-Gemisch bezeichnet. pKT3 wird von den positiven Kolonien, die
aus der dritten Durchmusterung erhalten werden, hergestellt. Die Kultivierung
wird für
20 Stunden bei 79°C
durchgeführt.
T. thermophilus HB27 wird mit pKT3-Gemisch transformiert, und nach
Kultivierung für
40 Stunden bei 81 °C
werden dann die größten Kolonien,
beispielsweise etwa 20, abgenommen, kultiviert und Plasmid (pKT3-1-3-20)
hergestellt. Die codierenden Bereiche jedes Plasmids werden vervielfältigt, in
die KpnI- und PstI-Stellen von pUC18 (TAKARA) subkloniert und in
E. coli exprimieren gelassen. Das E. coli-Kulturlysat wird für 10 Minuten
auf 70°C
erhitzt, und die verbleibende KNT-Aktivität der 20 KT3-Mutantenstämme wird
untereinander verglichen. Die zehn Stämme mit der höchsten Restaktivität werden
ausgewählt
und ihre codierenden Bereiche sequenziert.
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Expresion
und Reinigung von KNT
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Das
Expressionsplasmid pUT7 wird durch Verknüpfen des PvuII-ScaI-Fragmentes
von pUC18, welches den Ursprung umfaßt, und des BgIII-Scal-Fragmentes
von pET21b (Novagen), welches einen T7-Promotor umfaßt, konstruiert.
Plasmide, die für
eine Expression von KNT geeignet sind, umfassen alle Plasmide, die zur
Selbstreplikation in einer Wirtszelle in der Lage sind und in ein
Chromosom aufgenommen werden können und
einen Promotor umfassen, der so angeordnet ist, daß das KNT-Gen
transkribiert werden kann, und sie sind ansonsten nicht besonders
beschränkt.
Das mutante KNT-Gen, das durch PCR vervielfältigt wurde, wird in die Ndel-
und Xhol-Stellen von pUT7 sobkloniert. Die hier verwendeten Primer
sind folgende 5'-Primer: 5'-GACTGTACGCATATG
AATGGACCAATAATAATGAC-3' (verwendet
für WT*;
der unterstrichene Bereich ist die Ndel-Stelle; SEQ ID NO:7) und
5'-GACTGTACGCATATGAAAGGACCAATAATAATGAC-3' (für KT3-11
und HTK; der unterstrichene Bereich ist die Ndel-Stelle; SEQ ID
NO:8) und 3'-Primer:
5'-GACTGTACG CTCGAGCGTAACCAACATGATTAACA-3' (der unterstrichene
Bereich ist die Xhol-Stelle, SEQ ID NO:9). Hierin ist das Initiationskodon
von KNT von GTG zu ATG verändert.
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In
der vorliegenden Erfindung umfassen Wirtszellen, die eine Expression
des KNT-Gens erlauben, Bakterien, wie E. coli, Hefe- oder Tierzellen
und Insektenzellen, obwohl der Zelltyp nicht besonders beschränkt ist.
Wo die zu verwendende Wirtszelle E. coli ist, werden E. coli BL21
(DE3, pLysS)-Zellen, welche das erhaltene Expressionsplasmid umfassen, über Nacht
bei 37°C
in einem Medium kultiviert, welches 1,0% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt,
1,0% NaCl (pH 7,0), 100 μg/ml
Ampicillin und 1 mM Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid enthält. Die
Zellen werden gesammelt, in einem 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5),
der 50 mM NaCl und 2 mM Mercaptoethanol enthält, resuspendiert und durch
Ultraschallbehandlung zerstört.
Das folgende Verfahren wird bei 4°C
durchgeführt.
Nach Zentrifugation wird der Überstand
von Rohextrakt auf eine DEAE-Toyo-Pearl-Säule (Tosoh), die mit dem oben
genannten Puffer equilibriert ist, geladen und mit einem linearen
Gradienten von 50 – 250
mM NaCl eluiert. Jede Fraktion wird durch einen KNT-Test und mittels
SDS-PAGE überprüft. Fraktionen, die
KNT enthalten, werden gesammelt und über Nacht einer Dialyse gegen
einen 5 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7.0), der 2 mM 2-Mercaptoethanol
enthält,
unterzogen. Dialyseflüssigkeit
wird dann auf eine Hydroxyapatitsäule, die mit dem Dialysepuffer
equilibriert ist, geladen und mit einem linearen Gradienten von
5 – 100
mM Kaliumphosphat eluiert. Die Fraktionen, welche KNT enthalten,
werden gesammelt und durch Ultrafiltration konzentriert. Anschließend wird
das Enzym durch Eluieren der konzentrierten Lösung durch eine Sephacryl S-200-Säule (Amersham
Pharmacia Biotech), die mit einem 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH
7,0), der 0,1 M KCl enthält,
equilibriert ist, gereinigt. Die Reinigung wird fortgesetzt, bis
die Reinheit 90% auf SDS-PAGE übersteigt.
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KNT-Test
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KNT
von Stpahylococcus aureus katalysiert die Übertragung von AMP aus ATP
auf die 4'-Hydroxygruppe von
Kanamycin. Enzymaktivität
wird bei 25°C
in einem 50 mM Na-MES-Puffer (pH 6,0), der 50 mM MgCl2,
0,1 – 2
mM Kanamycin und 0,4 – 5,4
mM [8-14 C]-ATP (0,4 – 4 mCi/mmol) enthält, gemessen.
Die Reaktion wird durch Zugabe einer halben Menge an 6N HCl gestoppt
und auf eine PEI-Zellulose-DC-Platte aufgetupft. Die Platte wird
für 45
Minuten mit einem Lösungsmittel
entwickelt, welches 1-Propanol/H2O/Essigsäure in einem
Verhältnis
von 60:39:1 enthält.
Die Radioaktivität
des gebildeten Kanamycin-[14C]-AMP wird
mit Fujifilm Phosporimager BAS-2000 (Fujifilm) gemessen. In diesem
System ist der RF-Wert des Produkts 0,3.
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Hitzedenaturierung
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Die
Hitzedenaturierungskurve wird in einer 5 mm Kuvette mit einem Jasco
J-720WI-Spektropolarimeter
(JASCO) mit einem thermoelektrischen PTC-348WI-Temperatursteuerungssystem über einen
Temperaturbereich von 30 – 90°C (für HTK, 30 – 95°C) aufgezeichnet.
Die Proteinkonzentration beträgt
0,8 μM,
und der Puffer ist 50 mM Kaliumphosphat mit 0,1 M KCl mit einem
pH-Wert von 7,0. Die Temperatur der Probe wird um 1 °C pro Minute
erhöht,
während
bei 222 nm aufgezeichnet wird.
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Beispiele:
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Nachfolgend
wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen weiter erläutert. Dies
soll die vorliegende Erfindung jedoch nicht auf diese Beispiele
beschränken.
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Beispiel 1: Zielgerichtete
Entwicklung
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Die
erste Durchmusterung wurde durchgeführt, wie es nachfolgend beschrieben
ist. Eine Mutation wurde in das WT*-Gen durch DNA-Durchmischung,
deren Stufen oben erläutert
wurden, eingebracht. Von den 3,2 × 106 bei
64°C durchmusterten
Transformanden wurden 431 positive Kolonien ausgesondert.. Schließlich wurde
von den positiven Kolonien ein Plasmidgemisch, pKT1-Gemisch, hergestellt.
Das von dem pKT1-Gemisch vervielfältigte KNT-Gen wurde weiterer
DNA-Durchmischung
unterzogen, um das mutante Gen rekombinieren zu lassen, wobei eine
weitere Punktmutation angenommen wurde. Eine zweite Durchmusterung
wurde bei 69°C
durchgeführt
(Bibliotheksgröße: 4,8 × 106; 109 ausgewählte Kolonien) und eine dritte
Durchmusterung bei 79°C
(Bibliotheksgröße: 2,4 × 105; 209 ausgewählte Kolonien). Mit pKT3-Gemisch
transformierte T. thermophilus-Zellen bildeten auf einer Platte,
die Kanamycin enthielt, bei 81 °C
Kolonien. Da der Wirt T. thermophilus jedoch bei einer Temperatur
höher als
81 °C keine
Kolonien bilden kann, war eine vierte Durchmusterung unmöglich.
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Beispiel 2: KT3-Mutentenstamm
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Zwanzig
KT-3-Mutantenstämme,
die während
der Durchmusterung bei 81 °C
von großen
Kolonien erhalten worden waren, wurden genauer untersucht. KT3-Mutantenstämme (KT3-1
bis KT3-20) wurden jeweils in E. coli exprimiert, und die Thermostabilität jedes
Stammes wurde anhand der verbleibenden katalytischen Aktivität nach Erhitzen
der Lösung
auf 70°C
für 10
Minuten vorhergesagt. Auf der Grundlage dieser Analyse wurden die
10 stabilsten Stämme
von KT3 ausgewählt
und ihre DNA-Sequenzen bestimmt (KT3-1 bis KT-3-19; siehe Tabelle
1).
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Jeder
Mutantenstamm hatte etwa 15 Punktmutationen. Unter diesen waren
4 von 5 stille Mutationen. Es besteht die Möglichkeit, daß der GC-Gehalt
des KNT-Gens nach einer Hochtemperaturdurchmusterung zunimmt, jedoch
wurde in den 39 stillen Mutationen keine spezielle Tendenz in Richtung
von G oder C beobachtet. (Keine Daten). Die Va175Ala-Substitution,
welche eine konservierte Substitution ist, wurde in allen zehn Stämmen von
KT3 gefunden (Tabelle 1). Andere konservierte Substitutionen waren
Glu61Gly, die man in 7 Mutantenstämmen fand, His66Tyr in 8 Stämmen, Gln91Arg
in 9 Stämmen,
Ser112Pro in 7 Stämmen
und Ser199Pro in 7 Stämmen.
In allen der untersuchten KT3-Stämme
war Gln102 durch eine basische Aminosäure substituiert (in 7 Stämmen durch
Arg und in 3 Stämmen
durch Lys). Interessanterweise waren unter den 29 Substitutionen
5 Substitutionen durch Prolin. Es sind viele Beispiele dafür bekannt,
daß Prolin-Substitutionen die
Thermostabilität
von Proteinen erhöhen.
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KT3-11,
welches die höchste
Thermostabilität
unter den 10 Stämmen
von KT3 hatte, wurde in E. coli exprimiert und gereinigt. Das gereinigte
KT3-11 (SEQ ID NO:2) besaß nach
der Behandlung (70°C,
10 Minuten) Aktivität,
aber diese war bei 75°C
vollständig
verloren (keine Daten). Das Plamid pKT3-11, welches KT3-11 enthält, transformiert
jedoch T. thermophilus-Zellen bei 81 °C. KT3-11 könnte eine höhere Thermostabilität im Zytoplasma
haben, oder es könnte
schnell exprimiert werden, so daß es KNT-Aktivität aufweist.
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Beispiel 3: Erzeugung
einer Mutante mit höherer
Thermostabilität
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Die
zielgerichtete Entwicklung von Beispiel 2 wurde mit drei Durchmusterungen
und Selektionen abgeschlossen. Wenn eine weitere Durchmusterung
möglich
wäre, könnte man
eine Mutante mit höherer
Thermostabilität
durch Rekombination zwischen den KT3-Mutanten erhalten. Um eine
weitere Verbesserung der Thermostabilität von KT3-11 zu erzielen, wurde
daher die folgende Strategie angewendet. Mutationen, die in zwei
oder mehr anderen KT3-Stämmen
konserviert waren, und Mutationen, die zu Prolin modifiziert waren, wurden
ausgewählt.
Da KT3-3 unter den KT3-Mutanten besonders war (Tabelle 1), wurden
Mutationen, die man in KT3-3 fand, aber nicht in KT3-11, ausgewählt. Diese
Mutationen wurden unabhängig
voneinander mit einem Amersham-Kit (Sculpter®) zu
KT3-11 hinzugefügt.
Jeder einzigartige Mutantenstamm von KT3-11 wurden in E. coli exprimieren
gelassen, und die Thermostabilität
von Rohlysat jeder Mutante wurde mit KT3-11 verglichen. Wie die
Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, verbesserte jede der folgenden neun
Mutationen die Thermostabilität
von KT3-11: Met57Leu, Ala62Val, Ser94Pro, Ser203Pro, Asp206Val,
His207Gln, Ser220Pro, Ife234Val und Thr238Ala.
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Tabelle
2: Relative Restaktivität
von KT3-11-Mutantenstämmen
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(Die
Werte geben die relative Restaktivität nach Hitzebehandlung für 10 Minuten
bei 70°C
oder 75°C eines
Lysates des E. coli BL21 (pLysS)-Stammes, der diese Mutanten exprimierte,
an.)
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Andererseits
wirken die drei für
KT3-3 einzigartigen Mutationen Asp25Asn, Glu117Gly und Ser190Leu dahingehend,
daß sie
das Protein wenigstens in Verbindung mit der Sequenz von KT3-11 destabilisieren
(Tabelle 2). „Hochgradig
thermostabile Kanamycin-Nukleotidyltransferase", HTK, SEQ ID NO:3, wurde durch Einsetzen
aller neun positiven Mutationen in KT3-11 mit einem Amersham-Kit
(Sculpter®)
hergestellt (Tabelle 1). HTK hat im Vergleich mit WT* 19 Aminosäuresubstitutionen.
Bei der Herstellung von HTK wurde beobachtet, daß die Wirkung dieser Mutationen
auf die Thermostabilität
im wesentlichen ergänzend
war (siehe Tabelle 2). Die Kcat- und Km-Werte von HTK gegen ATP
(in der Gegenwart von 2 mM Kanamycin) waren etwa zweimal so hoch
wie diejenigen von WT*, jedoch gab es aufgrund der Mutationen fast
keine Veränderungen
in den Eigenschaften von HTK als ein Katalysator.
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Tabelle
3: Dynamische Parameter der KNT-Mutante
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Enzymaktivität wurde
bei 25°C
und einem pH-Wert von 6,0 gemessen. Dynamische Parameter für ein Substrat
werden bestimmt, während
die Konzentration des anderen Substrats konstant gehalten wird.
kan:
Kanamycin
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Beispiel 4: Die Thermostabilität von drei
Typen von KNT
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Zur
Bestimmung der Thermostabilität
von WT, KT3-11 und HTK wurde die Denaturierung jedes Proteins unter
Verwendung von CD-Spektroskopie verfolgt (2A). Die
ersichtlichen Tm-Werte
von WT*, KT3-11 und HTK waren 61, 73 bzw. 84°C. Die Denaturierung von KNT
ist irreversibel, und KT3-11 und HTK aggregieren nach der Denaturierung,
so daß die
Denaturierungskurve aus 2A nicht
für die
Berechnung des Wertes von ΔΔG verwendet
werden kann. Um die relative Stabilität der drei Typen von KNT nach
Hitzebehandlung für 10
Minuten bei 60, 72 und 80°C
zu bestätigen,
wurde die Restaktivität
von jeder KNT gemessen (2B). Bei 60°C fiel die
Aktivität
von WT* auf 5%, aber es gab keine Veränderung für KT3-11 und HTK. Bei 72°C war WT* vollständig inaktiviert,
die Aktivität
von KT3-11 fiel auf 5%, und HTK war nach wie vor aktiv. HTK behielt
sogar nach 10 Minuten Hitzebehandlung bei 80°C noch 15% Aktivität. Dieses
Ergebnis paßte
gut zu dem aus der Denaturierungskurve erhaltenen Tm-Wert. Man kann
sagen, daß die
Thermostabilität
von HTK eine Zunahme von wenigstens 20°C im Vergleich zu derjenigen
von WT* darstellt. WT* weist zwei Mutationen auf, wie es oben beschrieben
ist, und besitzt eine erhöhte
Thermostabilität
von etwa 10°C
im Vergleich zu derjenigen der Wildtyp-KNT. Daher war die Thermostabilität von HTK
durch das Einbringen von 21 Substitutionen insgesamt 30°C höher als
diejenige des Wildtyp-Enzyms
von Staphylococcus aureus. Soweit die Kenntnis des Erfinders reicht,
kann diese Erfindung unter Projekten zur Erhöhung der Thermostabilität eines
Proteins als eines der erfolgreichsten Beispiele bezeichnet werden.
Die Thermostabilitäten
von Glukose-Dehydrogenase und Iso-1-Cytochrom wurden um 20°C bzw. 17°C erhöht (Makino,
Y., J. Biol. Chem. 264, 6381-6385 (1989); Nagao, T., FEBS Lett.
253, 113-116 (1989); Das, G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 496-499
(1989)), jedoch war jeder Fall ein Ergebnis einer einzelnen Aminosäuresubstitution.
Diese zwei Beispiele sind äußerst interessant,
aber unser KNT-Ansatz ist allgemeiner. Von der natürlichen
Entwicklung eines Proteins nimmt man an, daß sie durch die Ansammlung
vieler Mutationen voranschreitet, und jede Mutation leistet einen
kleinen Beitrag zu der Gesamtwirkung. Das Konzept, daß die Ansammlung
von kleinen Wirkungen wichtig ist, wird durch die Tatsache gestützt, daß viele
Studien, welche das Einbringen einer kleinen Anzahl von rational
entworfenen Substitutionen anwenden, mit sehr begrenztem Erfolg
enden. Was klargemacht werden sollte ist, daß die. zwei unabhängigen Studien
zur Isolierung von hitzebeständigen
KNT-Mutantenstämmen
durch eine einzelne zufällige Mutation
und Durchmusterung lediglich nur die gleichen zwei stabilen Mutanten
fanden.
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Beispiel 5: Die Verteilung
von modifizierten Resten in der Struktur von KNT
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Mit
der Ausnahme von Val175 und Ile234, die man in dem hydrophoben Kern
findet, findet man alle anderen Mutationen von HTK auf der Oberfläche des
Moleküls
(3). An der Untereinheitengrenze befinden sich
keine Mutationen. Die Gln91Arg-Substitution stabilisiert wahrscheinlich
den helikalen Dipol. Es gibt Berichte, daß die Thermostabilität von Protein
mit Substitutionen durch Prolin erhöht wird. In HTK gibt es fünf Prolin-Substitutionen.
Ser94 und Ser112 findet man an der zweiten Stelle der β-Wende, Ser199
und Ser203 an der Schleife der Oberfläche und Ser220 an der N-terminalen
Kappenstruktur der α-Helix. Überraschenderweise
ist trotz der Tatsache, daß die
Hydroxylgruppe der Ser94-Seitenkette innerhalb eines Wasserstoffbindungsabstandes
von der 1-Amidgruppe
von Kanamycin liegt, die katalytische Wirksamkeit von HTK mit der Ser94Pro-Mutation
fast unverändert.
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Beispiel 6: Konstruktion
von herkömmlichen
Vektoren für
T. thermophilus
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Ein
Plasmid, welches den Replikationsursprung von T. thermophilus und
das HTK-Gen umfaßt,
pJHK3 (die Restriktionskarte ist in 4 gezeigt),
ist ein bequemer Vektor zur Durchführung eines molekularbiologischen
Experiments mit T. thermophilus. Wenn pJHK3 verwendet wird, ist
es möglich,
die Standardverfahren von der Transformation und der Aussonderung
von Kolonien bis zur Flüssigkultur
in zwei Tagen durchzuführen. Jedoch
sind mit dem gleichen Protokoll bei Verwendung des herkömmlichen
WT*-Gens vier Tage erforderlich. Mit dem neuen Selektierungsmarker
der vorliegenden Erfindung kann die Forschung an T. thermophilus,
Thermus aquaticus, Bacillus stearothermophilus und anderen solchen
thermophilen Bakterien erheblich beschleunigt werden.
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Wie
es oben ausführlich
beschrieben ist, liefert die vorliegende Erfindung eine neue Kanamycin-Nukleotidyltransferase
mit deutlich erhöhter
Thermostabilität,
einen Selektierungsmarker, der diese verwendet, und ein Verfahren
zur Durchmusterung von thermophilen Bakterien, wie Thermus thermophilus,
unter Verwendung dieses Selektierungsmarkers.
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Mit
dem neuen Selektierungsmarker der vorliegenden Erfindung kann die
Forschung an T. thermophilus, Thermus aquaticus, Bacillus stearothermophilus
und anderen solchen thermophilen Bakterien erheblich beschleunigt
werden.
