DE3931716C2

DE3931716C2 - Rekombinante DNA, eine sie enthaltende Transformante und ein Verfahren zur Herstellung von wärmestabiler Glucosedehydrogenase und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE3931716C2
Application number: DE3931716A
Authority: DE
Inventors: Yasutaka Makino; Seiji Negoro; Itaru Urabe; Hirosuke Okada
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1988-09-22
Filing date: 1989-09-22
Publication date: 1998-07-02
Anticipated expiration: 2009-09-23
Also published as: JPH0286779A; US5114853A; JPH0573387B2; DE3931716A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine in Escherichia coli replizierbare rekombinante DNA, die eine DNA umfaßt, welche von der für Glucosedehydrogenase (im folgenden "GDH" bezeichnet) aus Bacillus megatorium codierenden DNA abgeleitet ist. Sie betrifft weiterhin auch eine diese DNA enthaltende Transformante, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer wärmestabilen GDH unter Verwendung der Transformante.

GDH (EC 1.1.1.47) ist ein wichtiges Enzym, das in Glucosenachweissystemen auf dem Gebiet der klinischen Tests und Nahrungsmittelindustrie Verwendung findet.

Bisher sind als Mikroorganismen, die in der Lage sind, GDH zu produzieren, Bakterien der Art Bacillus, wie Bacillus megaterium, Bacillus cereus (japanische Patentoffenlegung Nr. Sho 53-137199) und ebenfalls Bacillus subtilis (Lampel et al., J. Bacteriol., 166, 1986, S. 238-243), dessen GDH-Sequenz ca. 80% Homologie zu der GDH-Sequenz der vorliegenden Erfindung hat, bekannt.

Um GDH als Glucose-quantifizierendes Enzym zu verwenden, hat man jedoch nach einer GDH mit besserer Stabilität gesucht, die mit einem geringeren Kostenaufwand herstellbar ist.

Vor kurzem wurde im European Journal of Biochemistry, Band 174, S. 485-490 (1988) ein Verfahren zur Herstellung von GDH unter Verwendung einer Transformante offenbart, in der ein GDH-Gen aus Bacillus megaterium in Escherichia coli integriert wurde.

Es wird gelehrt, daß das GDH-Gen aus Bacillus megaterium mehrfach existiert. Die Transformante wurde erhalten durch ihre Verwendung um GDH herzustellen, jedoch ist der hierfür verwendete Vektor für die Massenproduktion von GDH nicht geeignet, und weiterhin wurde keinerlei Verbesserung der Stabilisierung von GDH erreicht.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, bei geringen Kosten eine wärmestabile GDH in großen Mengen zur Verfügung zu stellen durch Kultivieren einer Transformante, die eine rekombinante, in Escherichia coli replizierbare DNA aus Bacillus megaterium enthält.

Das erste Ziel, nämlich eine kostengünstigere Herstellung von GDH zu erreichen, haben die vorliegenden Erfinder durch eine hohe Produktion von GDH durch Integrierung eines GDH-Gens aus Bacillus megaterium in den starken Expressionsvektor PKK 223-3 und Kultivierung dieser Transformante in einer Nährlösung erreicht.

Danach wurde, als Ergebnis weiterer Untersuchung, eine Transformante, in der eine ver besserte DNA, die durch Substituierung einer Aminosäure, die an einer spezifischen Position in einer Aminosäuresequenz der DNA, die für GDH aus Bacillus megaterium codiert, mit einer anderen Aminosäure erhalten wurde, in Escherichia coli eingebracht wurde, in einer Nährlösung kultiviert. Als ein Ergebnis haben die vorliegenden Erfinder erfolgreich GDH mit einer besseren Wärmestabilität als die herkömmliche GDH in einer großen Menge in der Nährlösung hergestellt. Die vorliegende Erfindung wurde auf diese Weise vollendet.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine in Escherichia coli replizierbare, rekombinante DNA zur Verfügung gestellt, die eine DNA umfaßt, wobei diese DNA von der für Glucosedehydrogenase aus Bacillus megaterium mit der folgenden Aminosäuresequenz kodierenden DNA abgeleitet ist:

wobei A Ser oder Ala bedeutet, X bedeutet Asp oder Glu, Y bedeutet Ala oder Ser und B bedeutet Leu oder Met, wobei die für Glucosedehydrogenase aus Bacillus megaterium kodierende DNA mindestens durch einen der folgenden Aminosäureaustausche verbessert ist:

i) Austausch von Glutaminsäure an Position 96 vom N-Terminus gegen Lysin, Glycin oder Alanin
ii) Austausch von Glutamin an Position 252 vom N-Terminus gegen Leucin
iii) Austausch von Tyrosin an Position 253 vom N-Terminus gegen Cystein

wobei die verbesserte DNA in einen E. coli-Aufnahmevektor integriert ist.

Fig. 1 zeigt eine Restriktionsendonucleasenkarte des Plasmids pGDA1;

Fig. 2 zeigt eine Aminosäuresequenz der GDH aus Bacillus megaterium IWG3; und

Fig. 3 zeigt eine Restriktionsendonucleasenkarte des Plasmids pGDA2.

Um ein rekombinantes GDH-Protein aus Bacillus megaterium mit verbesserter Wärmestabilität herzustellen, ist es notwendig, zuerst eine rekombinante DNA, die für die GDH kodiert, herzustellen.

Als hierfür verwendbare Stämme können alle Stämme verwendet werden, solange sie zu Bacillus megaterium gehören, die in der Lage sind, GDH zu produzieren, jedoch ist es bevorzugt, Bacillus megaterium IAM1030 und Bacillus megaterium IWG3, aus Erde isoliert, zu verwenden.

Von den oben genannten wurde der aus Erde erhaltene Stamm Bacillus megaterium IWG3 auf die folgende Weise identifiziert.

Tests für die bakteriellen Eigenschaften waren gegründet auf The Genus Bacillus (1973) von Ruth E. Gordon und die Klassifizierung wurde in Übereinstimmung mit Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe und dem vorgenannten The Genus Bacillus durchgeführt.

A. Morphologie:

1. Bazillen mit einer Zellgröße von 1,1 bis 1,6 µm × 3,0 bis 5,0 µm. Das Innere der Zellen war granulär, wenn die auf einem Glucosenähragar gewachsenen Zellen mit Fuchsin gefärbt wurden.
2. Keine Bewegung
3. Sporen wurden mit einer Größe von 1,0 bis 1,3 µm × 2,0 bis 2,5 µm gebildet und waren eiförmig oder säulenförmig. Sporandia schwellen nicht aus. Die Sporen werden im zentralen Teil oder in dem Teil nahe der Enden gebildet.
4. Gramfärbung: positiv

B. Physiologische Eigenschaften:

1. Reduktion von Nitrat: negativ
2. Denitrifikation: negativ
3. VP-Test: negativ. Der pH der Nährlösung ist 4,6 bis 5,0 in der Kultur für 7 Tage.
4. Indolbildung: negativ
5. Hydrolyse von Stärke: negativ
6. Verwertung von Citrat: positiv
7. Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen: sowohl Ammoniumsalze als auch Nitrate werden verwertet.
8. Pigmentbildung: ein braunes wasserlösliches Pigment wird in einem Tyrosinmedium gebildet.
9. Urease: schwach positiv
10. Katalase: positiv
11. Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob
12. Bildung von Säure und Gas aus Sacchariden: Säure wird gebildet aus Arabinose, Xylose, Glucose, Fruktose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, Mannitol, Inositol, Glycerin und Stärke, jedoch wird Gas nicht gebildet. Weder Säure noch Gas wird aus Mannose und Sorbitol gebildet.
13. Wachstum in 7% NaCl-Medium: nicht gefunden
14. Wachstum bei 45°C; Wachsen
15. Wachstum bei 65°C: nicht gefunden
16. Wachstum in Sabourauddextrosemedium: Wachsen
17. Deaminierung von Phenylalanin: positiv
18. Verflüssigung von Gelatine: positiv
19. Abbau von Kasein: positiv
20. Abbau von Tyrosin: positiv
21. York-Reaktion: negativ

Unter Bezugnahme auf die obigen Eigenschaften findet man in Übereinstimmung mit der Klassifizierungsmethode in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. Ausgabe), daß der vorliegende Stamm unter dem Genus Bacillus klassifiziert werden muß, da es ein gram-positives aerobes Bacillus ist und Sporen bildet. Die Spezies wurde als Bacillus megaterium wegen der Eigenschaften, daß i) die nährende Zellgröße 1,0 bis 1,6 µm × 3,5 bis 5,0 µm ist und das Innere der Zellen in dem Glucosenähragar granulär ist, ii) Sporandia nicht ausschwellen und Sporen in dem zentralen Teil oder in dem Teil nahe der Enden gebildet werden, iii) Säure aus Glucose gebildet wird und der VP-Test negativ ist, iv) kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen gefunden wird, v) Wachstum in Sabourauddextrosemedium gefunden wird, vi) Säure von Arabinose, Xylose und Mannitol gebildet wird und vii) die Yorkreaktion negativ ist, identifiziert.

Die vorliegenden Erfinder haben den vorliegenden Stamm als Bacillus megaterium IWG3 bezeichnet.

Herstellung der Transformante (1) 1) Aufreinigung der GDH

Bacillus megaterium IWG3 wurde in 2 × TY-Nährlösung inokuliert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Bakterien gesammelt und zerdrückt, gefolgt von einer zentrifugalen Trennung. Der erhaltene Überstand wurde entsalzt und dann konzentriert, gefolgt von einer Gefriertrocknung. Das erhaltene GDH-Rohenzympulver (105 µg) wurde in 15 ml einer 10% Glycerin enthaltenden Imidazolpufferlösung (20 mM, pH 6,5) gelöst und an DEAE-Sephadex A-50 adsorbiert, gefolgt von einer Elution unter Verwendung eines Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten (0,1 M-0,5 M), um die aktiven Fraktionen zu sammeln, die entsalzt und konzentriert wurden. Danach wurde die molekulare Fraktionierung mit Hilfe der hochauflösenden Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung von TSK-Gel DEAE 3 SW als Träger durchgeführt und Adsorption und Elution wurden weiterhin durch hochauflösende Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung von TSK-Gel G3000 SW als Träger durchgeführt, um eine elektrophoretisch einheitlich aktive Fraktion zu erhalten (etwa 5 mg als Proteingewicht).

2) Bestimmung der terminalen Aminogruppen der Aminosäuresequenz von GDH

Die Amino-terminalen Gruppen der Aminosäuresequenz des gemäß dem obigen Verfahren 1) erhaltenen gereinigten Enzymproteins wurde unter Verwendung eines Peptidsequenzierers Gas Phase 470 A, hergestellt von ABI (Applied Biosystem Inc.), analysiert, auf diese Weise wurde die Sequenz von 29 Aminosäurenrestgruppen vom N- terminalen Ende bestimmt. Die so erhaltene Aminogruppe-terminale Aminasäuresequenz ist unten gezeigt.

Anmerkung: Der unterstrichene Teil zeigt die Sequenz, die für die Synthese von Proben verwendet wurde.

3) Synthese von DNA-Proben

Es wurde eine Sequenz auf der einen Seite der oben gezeigten Aminosäuresequenz ausgewählt, die durch Unterstreichen gezeigt ist. Unter den möglichen DNA- Basensequenzen auf Genen, die von diesen Aminosäuresequenzen ableitbar sind, wurde eine DNA-Basensequenz ausgewählt unter Berücksichtigung der Codon- Verwendungsfrequenz von Bacillus subtilis, und auf diese Weise wurde die Basensequenz der DNA-Probe mit 38 Nukleotiden, wie unten gezeigt, bestimmt.
TAC ATA TTT CTA GAC CTT CCT TTT CAA CAA
CAA TAA TG

Die Synthese der DNA wurde unter Verwendung eines Synthetisierers, Modell 381A, hergestellt von ABI, ausgeführt.

4) Extraktion der Gesamt-DNA vom Bacillus megaterium und ihre Fragmentierung

Die Gesamt-DNA wurde aus Bacillus megaterium IWG3 extrahiert und gereinigt, in Übereinstimmung mit der Saito und Miura-Methode (Biochim. Biophys. Acta. Bd. 72; 619 (1963)). 240 µg der erhaltenen DNA wurde genommen und mit jeweils 150 Units der Restriktionsendonukleasen EcoRI und BgI II bei 37° C für 3 Stunden verdaut. Die gesamte Reaktionsmischung wurde auf einem 1%-igen Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen, der Teil der darin enthaltenen DNA mit einer Größe von 3 bis 4 kb wurde ausgeschnitten und die DNA-Fragmente aus dem Gel durch Elektroextraktion eluiert. Im folgenden wurde das Eluat schrittweise unter Verwendung von äquimolaren Mengen von Phenol und Phenol-Chlorophorm extrahiert und die DNA durch Zugabe von Ethanol zu der erhaltenen wässrigen Phase gefällt, die danach in 100 µl TE-Pufferlösung gelöst wurde.

5) Insertion des DNA-Fragments in den Vektor

Es wurde der Vektor pBR322 verwendet, dabei wurde lineare Vektor-DNA, die aus einem vollständigen Verdau von 20 µg pBR322 mit EcoRI-BamHI erhalten und in 200 µl TE- Pufferlösung gelöst wurde, für die Insertion des DNA-Fragments verwendet. Die Ligation der im obigen Schritt 4) erhaltenen DNA-Fragmente mit der linearen Vektor-DNA wurde durch Mischen der im Schritt 4) erhaltenen Lösung und der linearen Vektor-DNA-Lösung in einem 10 : 1-Verhältnis und Reaktion mit T4 DNA-Ligase bei 14°C über Nacht ausgeführt.

6) Herstellung einer DNA-Bibliothek von Bacillus megaterium

Die in dem obigen Schritt 5) erhaltene rekombinante DNA wurde in den Wirt Escherichia coli C600 durch Transformation eingebracht und Kolonien, die auf einem L-Nähr- Agarmedium, das 50 µg/ml Ampicillin enthielt, gewachsen waren, wurden gesammelt. Die so erhaltenen Kolonien wurden als DNA-Bibliothek von Bacillus megaterium IWG3 bezeichnet.

7) Auswahl und Trennung von GDH-Klonen der DNA-Bibliothek

Die in dem obigen Schritt 3) erhaltenen DNA-Proben wurden jeweils unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase und γ-³² P-ATP markiert, in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Ingria et al. (Nucleic Acids Research, Bd. 9, 1627-1642 (1982)). Danach wurden die in dem obigen Schritt 6) erhaltenen Escherichia coli zu Kolonien auf einem L-Nähr- Agarmedium, das 50 µg Ampicillin enthielt, wachsen gelassen, die dann durch Replikaplattierung auf eine Amersham Nylonmembran überführt wurden, gefolgt von Lysozymbakteriolyse, alkalischer DNA-Denaturierung, Neutralisierung unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure und danach Hybridisierung mit der obigen Probe. Die Hybridisierung wurde ausgeführt durch Vor-Hybridisierung unter Verwendung von 6-fach konzentriertem SSC (0,15 M NaCl, 0,15 M Natriumcitrat, pH 7,0), einer 5-fach konzentrierten Denhardt-Lösung (0,02% Ficoli, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin), 0,5% SDS, 20 µg/ml (Endkonzentration) von Rinderthymus-DNA und etwa 5 × 10⁵cpm/ml der markierten DNA-Probe bei 45°C für drei Stunden, und die Hybridisierung wurde danach bei 45°C über Nacht durchgeführt. Danach wurde die Nylonmembran zweimal bei 45°C unter Verwendung von 5-fach konzentriertem SSC, danach zweimal bei 45°C unter Verwendung von 5-fach konzentriertem SSC (enthaltend 0,1% SDS), und zweimal unter Verwendung von 4-fach konzentriertem SSC, gewaschen. Danach wurde die Nylonmembran getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen (Bedingung: -80°C, über Nacht). Als Ergebnis wurden drei Kolonien gefunden, die ein positives Hybridisierungssignal lieferten. Es wurde nun eine Flüssigkultur von den positiven Kolonien durchgeführt, gefolgt von der Methode nach Birnboim et al. Nucleic Acids Research, Bd. 7, 1513-1523 (1979)), um die Plasmid-DNA zu erhalten.

Das erhaltene Plasmid wurde unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen EcoRI und SaII geschnitten und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen, gefolgt von einer Southern-Hybridisierung (Journal of Molecular Biology, Bd. 98, 503-517 (1975)) mit der markierten DNA. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die DNA-Probe stark mit einem etwa 3,6 kb durch den Verdau mit EcoRI und SaII hergestellten DNA-Fragment hybridisiert. Es zeigte sich, daß die drei getrennten Stämme das gleiche Plasmid enthielten, dieses Plasmid wurde mit pGDA1 als Kandidat für den GDH-Klon bezeichnet.

8) Identifizierung der GDH-Klone und Bestimmung der DNA-Basensequenz

Die DNA-Basensequenz wurde von dem 930 Basenpaare langen DNA-Fragment, das von dem Plasmid pGDA1 durch Verdau mit EcoRI und Sau3AI erhalten wurde, nach der Methode von Sanger et al. (Proceeding of National Academy Science, USA, Bd. 74, 5463-5467 (1977)) bestimmt. Als Ergebnis wurde eine Basensequenz, die für eine Aminosäuresequenz, die vollständig mit der Aminogruppe-terminalen Aminosäuresequenz der in dem obigen Schritt 2) erhaltenen GDH übereinstimmt, gefunden, und es hat sich gezeigt, daß dieses Fragment ein Teil des GDH-Gens enthält. Bezüglich des Plasmids pGDA1 wurde die in Fig. 1 gezeigte Restriktionsendonucleasenkarte, basierend auf den Ergebnissen des Verdaus mit Restriktionsendonucleasen erstellt. Es wurde die DNA-Basensequenz bestimmt, die in dem Teil in Stromabwärtsrichtung von der schon bekannten Basensequenz lokalisiert ist, in dem Gene gelesen werden. Als Ergebnis wurde gefunden, daß eine Basensequenz, die für ein Protein aus 261 Aminosäuren codiert, existiert, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Von den vorgenannten Ergebnissen wurde angenommen, daß das Strukturgen der GDH vollständig in dem DNA-Fragment aus Bacillus megaterium IWG3, vorliegend in dem Plasmid pGDA1, enthalten ist.

9) Expression des GDH-Gens

Um die klonierten GDH-Gene unter Verwendung von Escherichia coli zur Expression zu bringen, wurde die Expression der Gene von dem DNA-Fragment aus Bacillus megaterium IWG3, vorliegend in dem Plasmid pGDA1, entsprechend der folgenden Schritte in Angriff genommen.

Unter Verwendung von EcoRI und PvuII wurden 10 µg des Plasmids pGDA1 geschnitten und einer 1%-igen Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, um ein Fragment von etwa 1,5 kb zu erhalten. Zu 1 µg des erhaltenen Fragments wurden dATP, dGTP, dCTP und dTTP, jeweils in einer Endkonzentration von 1 mM und 4 Units von DNA- Polymerase Klenow-Fragment zugegeben und die Reaktion bei 30°C für 20 Minuten in 20 µl einer Reaktionslösung, umfassend eine 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH 7,5), 7 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreitol, durchgeführt. Ein DNA-Fragment mit stumpfen Enden an jeweils beiden Enden wurde auf diese Weise gereinigt und zu etwa 0,5 µg desselben ein PstI-Linker und 10 Units T4 DNA-Ligase zugegeben, gefolgt von einer Reaktion bei 14°C über Nacht in 20 µl einer Reaktionslösung, enthaltend eine 66 mM Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH 7,5), 5 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP. Nach der Reaktion wurde das DNA-Fragment gereinigt und mit BanII geschnitten. Danach wurde zu dem erhaltenen Fragment 1 U Mungbohnennuclease zugegeben, gefolgt von einer Reaktion bei 30°C für 30 Minuten in 50 µl einer Reaktionslösung (pH 4,5), enthaltend 40 mM Natriumacetat, 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl₂ und 10% Glycerin. Als Ergebnis dieses Arbeitsschrittes wurden die kohäsiven Enden von BanII zu stumpfen Enden gemacht, und ein EcoRI-Linker wurde weiterhin in der gleichen, wie oben beschriebenen Art damit verknüpft. Nach der Reaktion wurde das DNA- Fragment gereinigt, und unter Verwendung von EcoRI und PstI an seinen beiden Enden geschnitten und als EcoRI-PstI-Fragment aufgefangen.

Der in dem vorliegenden Beispiel verwendete Expressionsvektor pKK223-3 ist von Brosius J. et al. (Proceedings of National Academy Science, USA, Bd. 81, 6929-6933 (1984)) beschrieben und hat als Promotor einen Tac-Promotor.

Dieser Expressionsvektor pKK223-3 wurde unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI geschnitten und danach mit dem erhaltenen EcoRI-PstI-Fragment gemischt, um die Ligasereaktion unter Verwendung von T4 DNA- Ligase auszuführen. Mit der Reaktionsmischung wurde die Transformation von Escherichia coli JM105 ausgeführt und Kolonien durch Wachsen auf einem L-Nähr-Agar- Medium, das Ampicillin (50 µg/ml) und Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) enthielt, selektioniert.

Um die Expression von GDH für die erhaltenen Kolonien zu bestätigen, wurde eine Kolonienuntersuchung unter Verwendung eines Farbstoff-Kupplungsverfahrens durchgeführt. Die Kolonien wurden auf ein Filterpapier replika-plattiert und dann wurde eine Lysozymlösung (eine 50 mM Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH 7,5), 10 mM EDTA, 1 mg/ml Lysozym) zu den Kolonien auf dem Filterpapier zugegeben. Die erhaltenen Kolonien wurden bei einer Temperatur von 30°C für 20 Minuten gehalten, gefolgt von der Zugabe einer 1%-igen Tritonlösung und wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Eine Pufferlösung für die Wärmebehandlung (eine 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,5), 2 M NaCl, 50 mM EDTA) wurde weiterhin zugegeben, um dann eine Wärmebehandlung bei 60°C für 20 Minuten durchzuführen.

Danach wurde eine Substratlösung (20 mM Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH 8,0), 1 M NaCl, 100 mM Glucose, 0,5 mM Phenazinethosulfat (PES), 0,5 mM 3-(4',5'- Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium-bromid (MTT), 50 µm NAD) zugegeben und die Mischung wurde bei 37°C für 5 Minuten im Dunklen stehengelassen. Als Kontrolle wurde eine Lösung verwendet, die der obigen Substratlösung entsprach, außer daß sie keine Glucose enthielt. Die Reaktion wurde durch Zugabe einer 10%-igen Essigsäurelösung gestoppt. Bei der Kolonienselektion wurden blau-violett gewordene Kolonien ausgewählt. Als Ergebnis der Kolonienuntersuchung wurden eine Anzahl positiver Kolonien erhalten, und die Plasmid-DNA wurde von einem Stamm unter ihnen extrahiert. Der erhaltene Extrakt wurde mit pGDA2 bezeichnet und die erwartete Struktur (Fig. 3) wurde durch Verdau mit Restriktionsendonucleasen bestätigt.

Das vorliegende Plasmid wurde im Escherichia coli JM105 durch Transformation eingebracht, um einen GDH-Hochexpressionsstamm, Escherichia coli JM105/pGDA2 zu erhalten.

Der vorliegende Stamm wurde im Fermentations-Research Institut, Agency of Industrial Science and Technology unter FERM-BP Nr. 2584 hinterlegt.

Herstellung der Transformante (2)

Unter Verwendung von Bacillus-megaterium IAM1030 statt Bacillus megaterium IWG3 wurden die gleichen Verfahrensschritte von 1) bis 9) für die Herstellung der Transformante 1) wiederholt, um die Hoch-GDH-Expressions-Plasmid-DNA zu extrahieren, die als pGDA3 bezeichnet wurde. Danach wurde die Transformation mit dem vorliegenden Plasmid ausgeführt, um GDH Hochexpressions-Escherichia coli JM105/pGDA3 zu erhalten.

Die Aminosäuresequenz der aus Bacillus megaterium IAM1030 erhaltenen GDH ergab im Vergleich zu der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz der GDH aus Bacillus megaterium IGW3, nur eine Aminosäuresequenz, in der Serin an Position 22 des letzteren N-terminalen Endes mit Alanin, die Asparaginsäure an Position 43 mit Glutaminsäure, Alanin an Position 79 mit Serin und Leucin an Position 95 mit Methionin substituiert war.

Die Aminosäuresequenz der DNA, die für GDH aus Bacillus megaterium codiert, ist im folgenden zusammengefaßt:

wobei die verbesserte DNA in einen E. coli-Aufnahmevektor integriert ist.

Herstellung einer rekombinanten DNA (1) 1) Herstellung von Einzelstrang-DNA

Das obige Plasmid pGDA2 oder pGDA3 wurde unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI geschnitten, um ein GDH-Genfragment von etwa 0,9 kb zu erhalten, gefolgt von Klonierung in den M13 Phagen mp18 oder mp19. Von der erhaltenen Rekombinante wurde Einzelstrang-DNA mit den üblichen Methoden hergestellt.

2) Variations-Behandlung der einzelsträngigen DNA unter Verwendung von chemischen Reagenzien

In 50 µl einer 0,5 M Acetatpufferlösung (pH 4,3) wurden 40 µg der im obigen Schritt erhaltenen einzelsträngigen DNA gelöst, und 50 ml einer 2 M Natriumnitritlösung zu der erhaltenen Lösung zugegeben und bei 20°C für 1 bis 3 Stunden die Behandlung durchgeführt.

In ähnlicher Weise wurde statt der Natriumnitritlösung 100 µl einer 12 M Ameisensäurelösung zugegeben, um die Behandlung bei 20°C für 5 bis 20 Minuten durchzuführen. Weiterhin wurden 100 µl einer 60%-igen Hydrazinlösung zugegeben, um gleichzeitig die Behandlung bei 20°C für 5 bis 20 Minuten durchzuführen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 µl einer 2,5 M Acetatpufferlösung (pH 7,0) enthaltend 20 µg tRNA zu jeder der obigen Behandlungslösungen gestoppt. Danach wurden 200 µl destilliertes Wasser zu jeder der Reaktionsmischungen zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 1 ml eiskaltem Ethanol zur Fällung der variations-behandelten DNA, die weiterhin dreimal mit eiskaltem 70%-igem wässrigen Ethanol gewaschen wurde.

3) Herstellung eines variierten doppelsträngigen DNA-Fragments

Zu 10 µg der in dem vorhergehenden Schritt erhaltenen variations-behandelten DNA wurden 10 µl einer zehnfach konzentrierten, für die reverse Transcriptase verwendeten Pufferlösung (eine 70 mM Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH 7,5), 70 mM Magnesiumchlorid, 0,5 M Natriumchlorid und 20 mM Dithiothreitol), 2 µl einer Lösung enthaltend 20 pmol eines Primers und 74 µl destilliertes Wasser zugegeben. Die Mischung wurde bei einer Temperatur von 85°C für 5 Minuten und dann bei einer Temperatur von 40°C für 15 Minuten gehalten, gefolgt von der Zugabe von 13 µl einer 10 mM dNTP-Lösung und 1 µl (20 u) reverser Transcriptase, um die Reaktion bei 37°C durchzuführen. Nach einer Stunde wurde die Reaktionsmischung mit Phenol extrahiert, danach wurde mit Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde gelöst und danach unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI verdaut, gefolgt von Agarosegel-Elektrophorese und dann wurde das variierte doppelsträngige DNA- Fragment aus dem Gel mit üblichen Methoden aufgefangen.

4) Selektion eines Stammes, der ein thermisch stabilisiertes GDH-Gen enthält

Das im vorhergehenden Schritt erhaltene variierte doppelsträngige DNA-Fragment wurde in den Expressionsvektor pKK223 in die mit EcoRI und PstI geschnittenen Stellen eingebracht, um Escherichia coli JM103 zu transformieren. Die auf einem Laborplattenmedium gewachsenen Kolonien wurden auf ihre enzymatische Aktivität gemäß der Replikaaufdruckmethode unter Verwendung von Filterpapier untersucht. Das Filterpapier wurde vorher einer Wärmebehandlung bei 60°C für 20 Minuten ausgesetzt. Für die Klone, die eine starke Farbbildung auf dem Filterpapier zeigten, wurde angenommen, daß sie als Ergebnis von Austauschen in den Genen der GDH mit der Folge der Variation thermisch stabilisiert waren und somit wurden die entsprechenden Stämme ausgewählt.

Danach wurden die durch die obige Methode selektionierten Stämme jeweils in 5 ml 2 × TY-Medium inokuliert und die Kultur bei 37°C für 18 Stunden geschüttelt. Nach Sammeln und Waschen der Bakterien wurde die Bakteriensuspension einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt, gefolgt von einer zentrifugalen Trennung, um einen Überstand zu erhalten. Wärmebehandlung dieses Überstandes wurde bei 60°C für 20 Minuten durchgeführt und die Restaktivität wurde gemessen, um thermisch stabilisierte variierte Enzymgene enthaltende Stämme zu selektionieren.

5) Bestimmung der Basensequenz von thermisch stabilisierten variierten Enzymgenen und Identifizierung der Variation

Plasmid-DNA wurde von den Stämmen, die thermisch stabilisierte variierte Enzymgene enthielten bereitet; die Basensequenz der Genfragmente wurde gemäß einer üblichen Methode zur Klärung von Variationsstellen bestimmt, und diese Änderung auf der Aminosäuresequenz der Enzymproteine bestätigt.

Im einzelnen wurde eine rekombinante DNA pGDA2F-18 erhalten, in der die Glutaminsäure an der Position 96 vom N-terminalen Ende der Aminosäuresequenz, codiert von der natürlichen GDH-DNA aus Bacillus megaterium IWG3 zu Alanin verändert war, in ähnlicher Weise modifizierte rekombinante DNAs waren pGDA2H-35, in der Glutaminsäure an der Position 96 vom N-terminalen Ende gegen Glycin ausgetauscht war; pGDA2F-20, in der Glutamin an der Position 252 vom N-terminalen Ende gegen Leucin ausgetauscht war, pGDA2N-71, in der Tyrosin an Position 253 vom N-terminalen Ende ausgetauscht war gegen Cystein; pGDA2N-1, in der Glutaminsäure an Position 96 vom N-terminalen Ende und Valin an Position 183 vom N-terminalen Ende ausgetauscht waren gegen Lysin bzw. Isoleucin, pGDA2N-13, in der Glutaminsäure, Valin, Glutaminsäure und Tyrosin an den Positionen 96, 112, 133 und 217 vom N-terminalen Ende ausgetauscht waren gegen Lysin, Alanin, Lysin bzw. Histidin; und auch pGDA2N- 28, in der Glutaminsäure, Asparaginsäure, Prolin und Glutaminsäure an den Positionen 96, 108, 194 und 210 vom N-terminalen Ende ausgetauscht waren gegen Lysin, Asparagin, Glutamin bzw. Lysin. Danach wurde jede durch Transformation von Escherichia coli JM103 mit jedem Plasmid erhaltene Transformante bei 37°C für 18 Stunden in einem 2 × TY-Nähr-Medium kultiviert. Nachdem die Bakterien sich angesammelt hatten, wurde die Bakteriensuspension einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt, gefolgt von der zentrifugalen Trennung. In den erhaltenen Überständen wurde nach Behandlung bei 50°C für 20 Minuten und bei 60°C für 20 Minuten die GDH- Restaktivität gemessen.

Als eine Kontrolle wurde ein Vergleich unter Verwendung von einem Escherichia coli JM103/pGDA2-Stamm durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Wie aus der Tabelle 1 zu entnehmen ist, wird die Wämestabilität der GDH erheblich verbessert, wenn eine spezifisch gezeigte Aminosäure in der für GDH-codierenden Aminosäuresequenz, i. e. Glutaminsäure an Position 96 vom N-terminalen Ende mit irgendeiner von Alanin, Glycin oder Lysin substituiert ist, oder auch wenn Glutamin an Position 252 vom N-terminalen Ende mit Leucin substituiert ist und wenn Tyrosin an der Position 253 vom N-terminalen Ende durch Cystein substituiert ist.

Herstellung einer rekombinanten DNA (2)

Die Verfahrensschritte 1) bis 5) in dem Abschnitt "Herstellung von rekombinanter DNA (1)" wurden wiederholt mit der Ausnahme, daß statt des Plasmids pGDA2 das Plasmid pGDA3 verwendet wurde, um eine rekombinante DNA pGDA3F-20 zu erhalten, in der Glutaminsäure an Position 96 vom N-terminalen Ende der Aminosequenz der natürlichen DNA aus Bacillus megaterium IAM1030 gegen Alanin ausgetauscht ist; pGDA3F-20, in der Glutamin an Position 252 vom N-terminalen Ende gegen Leucin ausgetauscht ist und pGDA3N-71 in dem Tyrosin an Position 253 vom N-terminalen Ende gegen Glycin ausgetauscht ist.

Danach wurde jede Transformante, die durch Transformation von Escherichia coli JM103 mit jedem Plasmid erhalten wurde bei 37°C für 18 Stunden in einem 2 × TY-Nähr- Medium kultiviert. Nachdem sich die Bakterien angesammelt hatten, wurde die Bakteriensuspension einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt, gefolgt von der zentrifugalen Trennung. In dem, nach Behandlung bei 50°C für 20 Minuten und bei 60°C für 20 Minuten, erhaltenen Überstand wurden die GDH-Restaktivitäten gemessen.

Als eine Kontrolle wurde ein Vergleich unter Verwendung des Stammes Escherichia coli JM103/pGDA3 durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt:

Tabelle 2

Transformation nach GCA der Basensequenz GAA entsprechend der Glutaminsäure an Position 96 vom N-terminalen Ende der DNA der GDH aus Bacillus megaterium IWG3

Bei Verwendung einer gezielten Mutagenesemethode (M. Soller and M. Smith, Nucleic Acids Research, Bd. 10, 6487 (1982)) wurde die Basensequenz GAA gemäß der Glutaminsäure an Position 96 vom N-terminalen Ende des GDH-Gens in GCA (Alanin) konvertiert, um ein variiertes Gen zu erhalten. Die Wärmestabilität des produzierten Enzyms wurde auf die gleiche Art wie oben beschrieben untersucht. Als Ergebnis wurde eine hohe Wärmestabilität gefunden.

Beispiel 1

Die Transformante Escherichia coli JM105/pGDA2F-18 wurde in 100 ml 2 × TY- Nährlösung enthaltend 50 µg/ml Ampicillin inokuliert und die Kultur bei 37°C für 13 Stunden geschüttelt. Danach wurde IPTG (Endkonzentration: 0,1 M) zugegeben. Nach zwei Stunden wurden die Bakterien durch einen Zentrifugationsschritt gesammelt, mit einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,5), enthaltend 2 M NaCl, gewaschen und danach in 10 ml der gleichen Pufferlösung suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde unter Verwendung eines Ultraschall-Brechers aufgeschlossen, gefolgt von einer Zentrifugation, um einen Überstand zu erhalten (eine Enzymlösung). Auf der anderen Seite wurde als Kontrolle Bacillus megaterium IWG3 in 100 ml 2 × TY-Nährlösung inokuliert und die Kultur bei 37°C für 24 Stunden geschüttelt. Danach wurden auf die gleiche Art und Weise wie oben die Bakterien gesammelt, gewaschen und danach mit Ultraschall aufgebrochen, gefolgt von der zentrifugalen Abtrennung. Der erhaltene Überstand wurde als eine Enzymlösung verwendet.

Die enzymatischen Aktivitäten wurden über den Anstieg der Absorption bei 340 nm bestimmt, wenn die Enzymlösung zu einer Tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung (pH 8,0), die 0,1 M D-Glucose und 20 mM NAD enthielt, zugegeben, um die Reaktion bei 30°C in einer Photometerkammer durchzuführen. Die enzymatische Aktivität, die in der Lage ist, 1 mM NADH während einer Reaktionszeit von 1 Minute zu produzieren wurde als 1 Unit festgesetzt. Die spezifische Aktivität wurde als Unit pro 1 mg Protein, enthaltend in der Enzymlösung, angegeben. Als Ergebnis wurde die spezifische Aktivität für Escherichia coli JM105/pGDA2F-18 von 7,8 u/mg gefunden. Auf der anderen Seite wurde die spezifische Aktivität für Bacillus megaterium IWG von 0,07 u/mg gefunden.

Beispiel 2

Eine Enzymlösung der wärmestabilen GDH aus einem Escherichia coli JM105/pGDA2F- 18-Stamm und als Kontrolle eine Enzymlösung von GDH aus einem Bacillus megaterium IWG3-Stamm wurden verglichen, um ihre jeweiligen Stabilität bei 37°C für 6 Monate zu untersuchen.

Als Ergebnis zeigte die wärmestabile GDH der Transformanten eine Restaktivität von 90% oder mehr, während die Kontrolle eine Restaktivität von 80% oder weniger hatte.

Beispiel 3

Die Transformante Escherichia coli JM105/pGDA3F-18 wurde in 100 ml 2 × TY- Nährlösung, enthaltend 50 µg/ml Ampicillin inokuliert und die Kultur bei 37°C für 13 Stunden geschüttelt. Danach wurde IPTG (Endkonzentration: 0,1 M) zugegeben. Nach 2 Stunden wurden die Bakterien durch Zentrifugation gesammelt, mit einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,5), enthaltend 2 M NaCl gewaschen und danach in 10 ml der gleichen Pufferlösung suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde unter Verwendung eines Ultraschallbrechers aufgeschlossen, gefolgt von einem Zentrifugationsschritt, um einen Überstand zu erhalten.

Die spezifische Aktivität des obigen Überstandes wurde entsprechend der spezifischen Aktivitätsmeßmethode nach Beispiel 1 bestimmt und betrug 6,6 u/mg.

Wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, hat die vorliegende Erfindung es möglich gemacht, eine wärmestabile GDH bei geringen Kosten und in großer Menge durch Kultivierung der Transformanten zur Verfügung zu stellen, die eine DNA umfaßt, die für GDH aus Bacillus megaterium codiert und welche durch Substituierung einer von dieser DNA-Sequenz codierten Aminosäure durch eine andere Aminosäure in einer spezifischen Position erhalten wird und in einen Escherichia coli-Aufnahmevektor eingebracht ist.

Claims

1. In Escherichia coli replizierbare rekombinante DNA, umfassend eine DNA, die von der für Glucosedehydrogenase aus Bacillus megaterium mit der folgenden Aminosäuresequenz kodierenden DNA abgeleitet ist:
wobei A Ser oder Ala bedeutet, X bedeutet Asp oder Glu, Y bedeutet Ala oder Ser und B bedeutet Leu oder Met, wobei die für Glucosedehydroge nase aus Bacillus megaterium kodierende DNA mindestens durch einen der folgenden Aminosäureaustausche verbessert ist:

a) Austausch von Glutaminsäure an Position 96 vom N-Terminus gegen Ly sin, Glycin oder Alanin
b) Austausch von Glutamin an Position 252 vom N-Terminus gegen Leucin
c) Austausch von Tyrosin an Position 253 vom N-Terminus gegen Cystein

wobei die verbesserte DNA in einen E. coli-Aufnahmevektor integriert ist.

2. Escherichia coli, enthaltend eine rekombinante DNA nach Anspruch 1.

3. Verfahren zum Herstellen stabiler Glucosedehydrogenase, umfassend das Kultivieren einer Transformante nach Anspruch 2 in einer Nährlösung, das Produzieren von wärmestabiler Glucosedehydrogenase in einem kultivierten Produkt, das Gewinnen der wärmestabilen Glucosedehydrogenase aus die sem kultivierten Produkt.