DE19818541C2 - Mikrobielle Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel / III - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Substanzen, insbesondere von aromati­ schen Aminosäuren, nach Anspruch 1 bis 20 und 30, Gen­ strukturen nach Anspruch 21 bis 23, sowie transformier­ te Bakterien-Zellen nach Anspruch 24 bis 29.

Mikrobiell hergestellte Substanzen, wie Feinchemikali­ en, insbesondere aromatische Aminosäuren sind von gro­ ßem wirtschaftlichen Interesse, wobei der Bedarf an z. B. Aminosäuren weiterhin zunimmt.

So wird beispielsweise L-Phenylalanin zur Herstellung von Medikamenten und insbesondere auch bei der Herstel­ lung des Süßstoffes Aspartam (∝-L-Aspartyl-L- phenylalaninmethylester) verwendet. L-Tryptophan wird als Medikament und Zusatz zu Futtermitteln benötigt; für L-Tyrosin besteht ebenfalls Bedarf als Medikament, sowie als Rohstoff in der pharmazeutischen Industrie. Neben der Isolierung aus natürlichen Materialien ist die biotechnologische Herstellung eine sehr wichtige Methode, um Aminosäuren in der gewünschten optisch ak­ tiven Form unter wirtschaftlich vertretbaren Bedingun­ gen zu erhalten. Die biotechnologische Herstellung er­ folgt entweder enzymatisch oder mit Hilfe von Mikroor­ ganismen.

Die letztere, mikrobielle Herstellung hat den Vorteil, daß einfache und preisgünstige Rohstoffe eingesetzt werden können. Da die Biosynthese der Aminosäuren in der Zelle aber in vielfacher Weise kontrolliert wird, sind bereits vielfältige Versuche zur Steigerung der Produktbildung unternommen worden. So wurden z. B. Ami­ nosäure-Analoga eingesetzt, um die Regulation der Bio­ synthese auszuschalten. Beispielsweise wurden durch Se­ lektion auf Resistenz gegen Phenylalanin-Analoga Mutan­ ten von Escherichia coli erhalten, die eine erhöhte Produktion von L-Phenylalanin ermöglichten (GB-2,053,906). Eine ähnliche Strategie führte auch zu überproduzierenden Stämmen von Corynebacterium (JP-19037/1976 und JP-39517/1978) und Bacillus (EP-0,138,526).

Desweiteren sind durch rekombinante DNS-Techniken kon­ struierte Mikroorganismen bekannt, bei denen ebenfalls die Regulation der Biosynthese aufgehoben ist, indem die Gene, die für nicht mehr feedback-inhibierten Schlüsselenzyme kodieren, kloniert und exprimiert wer­ den. Als ein Vorbild beschreibt EP-0,077,196 ein Ver­ fahren zur Produktion von aromatischen Aminosäuren, bei dem eine nicht mehr feedback-inhibierte 3-Desoxy-D-ara­ bino-heptulosonat-7-phosphatsynthase (DAHP-Synthase) in E. coli überexprimiert wird. In EP-0,145,156 ist ein E. coli-Stamm beschrieben, in dem zur Produktion von L- Phenylalanin zusätzlich Chorismatmutase/-Prephenatde­ hydratase überexprimiert ist.

Den genannten Strategien ist gemeinsam, daß sich der Eingriff zur Verbesserung der Produktion auf den für die aromatischen Aminosäuren spezifischen Biosynthese­ weg beschränkt. Für eine weitere Erhöhung der Produkti­ on muß jedoch eine verbesserte Bereitstellung der zur Produktion aromatischer Aminosäuren benötigten Primär­ metabolite Phosphoenolpyruvat (PEP) und Erythrose-4- Phosphat (Ery4P) angestrebt werden.

PEP ist ein aktivierter Vorläufer des Glycolyseproduk­ tes Pyruvat (Brenztraubensäure); Ery4P ist ein Interme­ diat des Pentosephosphatweges.

Diese vielfältigen Versuche zur Produktivitätssteige­ rung sind insgesamt darauf gerichtet, die Limitation der cytosolischen Synthese der Aminosäuren zu überwin­ den. Bei der Produktion aromatischer Aminosäuren werden die Primärmetabolite Phosphoenolpyruvat (PEP) und Ery4P für die Kondensation zu 3-Desoxy-D-arabino-heptulosor­ nat-7-phosphat (DAHP) benötigt.

In der Literatur sind mehrere Strategien für die Stei­ gerung der Verfügbarkeit von Ery4P beschrieben, wie beispielsweise durch Überexpression der Transketolase eine erhöhte Bereitstellung von Ery4P und in Folge eine verbesserte Produktbildung von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin ermöglicht (EP Patentanmeldung Nr. 0 600 463; Frost & Draths, Ann. Rev. Microbiol. 49 (1995) 557-579). Kürzlich wurde gezeigt (Flores et al. Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623), daß eine spon­ tane Glukose-positive Revertante einer PTS-negativen Mutante von Escherichia coli Glukose über das GalP-Sy­ stem in die Zellen einschleuste und zum Wachstum auf Glukose befähigt war. Durch zusätzliche Expression des Transketolase-Gens tktA wurde eine vermehrte Bildung des Intermediaten DAHP beobachtet (Flores et al. Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623).

Von den Anmeldern wurde in den 2 Patentanmeldungen DE 196 44 566 A1 und DE 196 44 567 A1 gezeigt, daß durch die Erhöhung der Enzymaktivitäten von Transaldolase oder Transaldolase und Transketolase in Escherichia coli bzw. durch Erhöhung der Aktivität einer Glukokinase in Escherichia coli oder einer Glukokinase und eines PEP- unabhängigen Transportsystems für Zucker in Escherichia coli oder durch Kombinationen der angegebenen Enzyme und des Transportsystems z. B. Phenylalanin in erhöhtem Maße bereitgestellt werden konnte.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein weiteres Verfah­ ren zur Verfügung zu stellen, durch das eine verbesser­ te mikrobielle Synthese von Substanzen, insbesondere aromatischen Aminosäuren, erreicht wird.

Es soll auch ein Mikroorganismus geschaffen werden, bei dem die Bildung von Substanzen erhöht ist.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur mikro­ biellen Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel, beim dem ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der eine erhöhte Aktivität eines Glukose oxidie­ renden Enzyms aufweist und Glukose und glukosehaltige Substrate durch Oxidation zu Glukonolakton oder Gluko­ nat sowie durch Phosphorylierung des Glukonats zu 6- Phospho-Glukonat umsetzt.

Dieses Ergebnis ist besonders überraschend, als daß es keineswegs selbstverständlich ist, daß die alleinige Erhöhung der Aktivität eines Glukose oxidierenden En­ zyms eine wesentliche Rolle bei der Produktion von Sub­ stanzen hat.

Unter Substanzen im Sinne der Erfindung sind beispiels­ weise Feinchemikalien wie aromatische Aminosäuren, In­ digo, Indolessigsäure, Adipinsäure, Melanin, Chinone, Benzoesäure, sowie deren potentielle Derivate und Fol­ geprodukte zu verstehen. Alle diese Substanzen werden im Rahmen dieser Erfindung auch als Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel angesehen. Damit sollen alle Verbindungen umfaßt sein, deren biochemische Synthese durch die erhöhte Bereitstellung von Ery4P oder Ery4P und PEP begünstigt wird.

Es sei dabei bemerkt, daß für die Herstellung von Indi­ go, Adipinsäure und anderen nicht natürlichen Folgepro­ dukten neben den erfindungsgemäßen Eingriffen weitere genetische Veränderungen an den die Substanzen produ­ zierenden Mikroorganismen notwendig sind. (Frost & Draths (Ann. Rev. Microbiol. 49 (1995) 557-579).

Bevorzugt eignet sich das neue Verfahren um Substanzen zu produzieren, bei deren Herstellung Ery4P beteiligt ist.

Substanzen produzierende Mikroorganismen können Glukose oder glukosehaltige Substrate, d. h. glukosehaltige Di- und Oligosaccharide, auf verschiedenen Wegen verstoff­ wechseln: So ist bekannt, daß Glukose durch ATP-abhän­ gige Kinasen (Hexokinase, Glukokinasen) phosphoryliert und damit in die Glykolyse eingeschleust wird. Außerdem verfügen viele Bakterien über ein PEP-abhängiges System zur Aufnahme und Phosphorylierung von Glukose.

Durch verschiedene lösliche oder membrangebundene Enzy­ me kann Glukose auch oxidiert werden (über Glukonolak­ ton zu Glukonsäure). Dazu gehören Glukose-Oxidasen oder Glukose-Dehydrogenasen. Glukose-Oxidasen oxidieren Glu­ kose zu Glukonolakton unter Reduktion von molekularem Sauerstoff. Glukosedehydrogenasen oxidieren ebenfalls Glukose zu Glukonolakton aber verwenden andere Elektro­ nenakzeptoren wie Pyrroloquinolin-Quinon (PQQ) oder an­ dere Cofaktoren wie Nicotinadenindinukleotid (NAD) oder NADP. Es ist bekannt, daß membrangebundene Glukosedehy­ drogenasen mit dem Cofaktor Pyrroloquinolin-Quinon (PQQ) Glukose oxidieren können, wobei der Umsatz an der Membranaußenseite erfolgt. Zur Aufnahme des Produkts (Glukonolakton bzw. Glukonsäure) in die Zelle bedarf es dann eines eigenen Transportsystems, wie von von Schie et al. Journal of Bacteriology 163 (1985) 493-499; Is­ turiz et al. Journal of General Microbiology 132 (1986) 3209-3219; Izu et al. Journal of Molecular Biology 267 (1997) 778-793, beschrieben wurde, dessen Expression in der Regel (z. B. in Escherichia coli) durch die Gegen­ wart von Glukose reprimiert ist, wie von Izu et al. Journal of Molecular Biology 267 (1997) 778-793, und Conway. FEMS Microbiology Reviews 103 (1992) 1-27 be­ schrieben.

Glukosedehydrogenasen mit dem Cofaktor NAD oder NADP sind lösliche Enzyme, die innerhalb der Zelle vorkom­ men. Bekannte Produzenten sind u. a. Bacillus-Stämme, die z. T. über mehrere Isoenzyme der Glukosedehydrogena­ se verfügen können (z. B. Glukosedehydrogenasen I bis IV bei Bacillus megaterium; Mitamura et al. 1990. Journal of Fermentation and Bioengineering 70, 363-369). Die Expression der Glukosedehydrogenasen ist strikt regu­ liert und erfolgt bekanntermaßen z. B. nur in Vorsporen­ stadien bei der Endosporenbildung von Bacillus-Arten; die physiologische Rolle der Glukosedehydrogenase beim Wachstum auf Glukose ist unklar, wie von Lampel et al. Journal of Bacteriology 166 (1986) 238-243, sowie von Steinmetz bzw. Fortnagel kürzlich beschrieben ("Bacil­ lus subtilis and other Gram-positive Bacte­ ria" (Sonenshein, Hoch und Losick, Hg.), M. Steinmetz pp. 157-170 und P. Fortnagel pp. 171-180; ISBN 1-55581- 053-5; ASM Press, Washington, D. C., 1993).

Aus Escherichia coli, Corynebakterien, Brevibakterien u. a. sind bisher keine NAD(P)-abhängigen Glukosedehy­ drogenasen beschrieben worden. Gene für Glukosedehydro­ genase(n) aus Bacillus-Stämmen wurden in Escherichia coli kloniert und dort ausgeprägt (Hilt et al. Biochimica et Biophysica Acta 1076 (1991) 298-304). Ziel dabei war vor allem die Gewinnung rekombinanter Glukos­ edehydrogenase, die als Nachweissystem für Glukose eingesetzt wurde bzw. zur Cofaktorregeneration (Hilt et al. Biochimica et Biophysica Acta 1076 (1991) 298-304; DE Patentanmeldung 37 11 881). Zur Verwertung von Glu­ kose z. B. als Substrat für die Gewinnung von Substanzen wie aromatischen Aminosäuren wurden diese Gene dagegen bisher nicht beschrieben.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß das Einbringen oder die Erhöhung der Aktivität einer Glukosedehydroge­ nase überraschend zur Bildung von Substanzen führt. Eine Erhöhung der Aktivität eines Glukose oxidierenden Enzymes führt zur intrazellulären Bildung von Glukono­ lakton und Glukonsäure aus glukosehaltigen Substraten. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die Glukos­ edehydrogenase aus Bacillus megaterium, insbesondere die Glukosedehydrogenase IV aus Bacillus megaterium wie beschrieben von Mitamura et al. Journal of Fermentation and Bioengineering 70 (1990) 363-369, und Nagao et al. Journal of Bacteriology 15 (1992) 5013-5020.

Glukonsäure ist zur Aktivierung auf ein Glukonsäure­ phosphorylierendes Enzym angewiesen. Es ist bekannt, daß solche Enzyme z. B. Phosphoenolpyruvat-abhängige En­ zyme II mit Spezifität für Glukonsäure sein können, oder ATP-abhängige Kinasen mit Spezifität für Glukon­ säure. Bekannt ist z. B. die ATP-abhängige Glukonat­ kinase GntK aus Escherichia coli wie beschrieben von Izu et al. FEBS Letters 394 (1996) 14-16; Izu et al. Journal of Molecular Biology 267 (1997) 778-793, und Tong et al. Journal of Bacteriology 178 (1996) 3260-3269.

Das Produkt, 6-Phosphoglukonat, ist sowohl ein Interme­ diat des oxidativen Zweiges des Pentosephosphatweges als auch des Entner-Doudoroff-Weges in Escherichia coli wie beschrieben von Fraenkel, p. 189-198 in "Escherichia coli and Salmonella", 2. Auflage (Neidhardt et al. Hg.) ASM Press, Washington, USA, ISBN-1-55581-084-5, 1996. Durch die zusätzliche Erhöhung der Aktivität eines Glu­ konsäure (Glukonat)-phosphorylierenden Enzyms kann die Produktion von Substanzen verbessert werden.

Beim Einsatz eines Glukonsäure phosphorylierenden En­ zyms sind z. B. Glukonsäure-phosphorylierende Enzyme aus verschiedenen Mikroorganismen geeignet, vorausgesetzt, daß sie in den Mikroorganismen, insbesondere Substanzen produzierenden Mikroorganismen, funktionell exprimiert werden können. Es empfiehlt sich insbesondere der Ein­ satz einer ATP-abhängigen Glukonatkinase, bevorzugt ei­ ner Glukonatkinase aus Escherichia coli, insbesondere der Glukonatkinase (GntK) aus Escherichia coli K-12. Andere Gene für Glukonsäure-phosphorylierende Enzyme, deren Genprodukte die Glukonsäure phosphorylieren, sind für das erfindungsgemäße Verfahren ebenso geeignet. Beispielhaft genannt seien Gene aus anderen Enterobak­ terien, Zymomonas mobilis, Bacillus subtilis, Coryne­ bacterium glutamicum.

Die Wirkung von Glukonatkinase beschränkt sich auf die Aktivierung von Glukonsäure/Glukonat, die aber z. B. in Gegenwart von Glukose nicht von Escherichia coli oder anderen Bakterien verstoffwechselt wird. Beispielsweise ist die Glukonatkinase GntK in Escherichia coli nur beim Wachstum auf Glukonsäure von Bedeutung, trägt aber nicht zur Verstoffwechslung von Glukose bei, ja ihre Bildung ist sogar in Gegenwart von Glukose reprimiert, wie beschrieben von Izu et al. Journal of Molecular Biology 267 (1997) 778-793, und Tong et al. Journal of Bacteriology 178 (1996) 3260-3269, und erfolgt nicht in Gegenwart von Glukose.

In dieser besonderen Ausführungsform wird daher durch die zusätzliche, erhöhte Aktivität eines Glukonsäure­ phosphorylierendes Enzyms, insbesondere einer Glukonat­ kinase, am besten einer Glukonatkinase aus Escherichia coli und insbesondere der Glukonatkinase GntK aus Escherichia coli K-12, ein Enzym bereitgestellt, das in Substanzen produzierenden Mikroorganismen eine Bereit­ stellung eines Glukonsäure phosphorylierenden Enzyms in Abwesenheit extrazellulären Glukonats bzw. in Anwesen­ heit von Glukose ermöglicht. Der Vorteil ist ein erhöh­ ter Stofffluß über den alternativen Stoffwechselweg. Dies ermöglicht die verstärkte Umsetzung von Glukonsäu­ re zu 6-Phosphoglukonat, sogar in Anwesenheit von Glu­ kose. Dies führt zu einer Erhöhung des intrazellulär vorliegenden Anteils an 6-Phosphoglukonat, welches über bekannte Stoffwechselsequenzen in Substanzen umgesetzt werden kann.

Ein Reaktionsprodukt des Glukose oxidierenden Enzyms ist Glukonolakton. Glukonolakton kann sich spontan in Glukonsäure umwandeln, es sind aber auch Enzyme be­ schrieben, die diese Umwandlung katalysiert beschleuni­ gen (Glukonolaktonase z. B. aus Zymomonas mobilis wie beschrieben von Kanagasundaram und Scopes Biochimica et Biophysica Acta 1171 (1992) 198-200). In einer weiteren Ausführungsform wird daher das Gen einer Glukonolakto­ nase (z. B. aus Zymomonas mobilis) zusätzlich zum Gluko­ se-oxidierenden Enzym bzw. zum Glukose oxidierenden En­ zym und zum Glukonsäure phosphorylierenden Enzym ausgeprägt, um die Umsetzung von Glukonolakton zu Glukonsäu­ re (bzw. zu 6-P-Glukonat) zu beschleunigen.

Es sei bemerkt, daß in einigen Bacillus-Arten Gene für Glukosedehydrogenase und Glukonatkinase natürlich vor­ kommen können; allerdings sind die Gene für die Enzyme in unterschiedlichen Operons angeordnet und werden of­ fenbar nicht gemeinsam zur Verstoffwechslung von Gluko­ se benutzt, wie von Steinmetz bzw. Fortnagel beschrie­ ben ("Bacillus subtilis and other Gram-positive Bacte­ ria" (Sonenshein, Hoch und Losick, Hg.), Steinmetz pp. 157-170 und Fortnagel pp. 171-180; ISBN 1-55581-053- 5; ASM Press, Washington, D. C., 1993). Außerdem ist, we­ gen der spezifischen Induktion der Glukosedehydrogena­ sen unter Sporulationsbedingungen, nicht zu erwarten, daß die beiden Enzyme zusammen zur Bildung von Substan­ zen beitragen.

Folglich ist der im Rahmen dieser Erfindung beschriebe­ ne Effekt der erhöhten Aktivität eines Glukose- oxidierenden Enzyms, bzw. eines Glukose oxidierenden Enzyms und eines Glukonsäure phosphorylierenden Enzyms bei Wachstum auf Glukose oder glukosehaltigen Substra­ ten für die Produktion von Substanzen, insbesondere aromatischen Aminosäuren, vollkommen unerwartet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Er­ findung wird zusätzlich zur Erhöhung des Glukose-oxi­ dierenden Enzyms oder des Glukose oxidierenden Enzyms und des Glukonsäure phosphorylierenden Enzyms die Akti­ vität eines Transportproteins zur PEP unabhängigen Auf­ nahme eines Zuckers erhöht.

Diese Ausführungsform schließt auch ein, daß die Akti­ vität eines Transportproteins zur PEP unabhängigen Auf­ nahme von Glukose bzw. von glukosehaltigen Substraten in einem Substanzen produzierenden Mikroorganismus er­ höht wird, der zur Aufnahme des Zuckers mittels eines PEP-abhängigen Transportsystems befähigt ist. Die zu­ sätzliche Integration eines PEP unabhängigen Transport­ systems erlaubt eine erhöhte Bereitstellung des Zuckers in dem die Substanzen produzierenden Mikroorganismus. Dieser Zucker kann erfindungsgemäß von einem intrazel­ lulären Glukose oxidierenden Enzym zu Glukonolakton und in der Folge Glukonsäure umgesetzt werden. Glukonsäure ist dann das Substrat für ein Glukonsäure-phosphorylie­ rendes Enzym. Meistens wird PEP als Energie-Donor für diese Umsetzungen nicht benötigt und steht damit, aus­ gehend von einem konstanten Stofffluß in der Glykolyse und dem Pentosephosphatweg, vermehrt für die Kondensa­ tion mit Ery4P zum primären Metaboliten des allgemeinen Biosyntheseweges für aromatische Verbindungen, 3-De­ soxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP), zur Ver­ fügung und in der Folge für die Produktion von Substan­ zen, wie z. B. aromatischen Verbindungen.

Im Falle des Transportproteins wird Aktivität dabei als proteinvermittelte Aufnahmerate verstanden.

Bezüglich des Transportproteins zur PEP unabhängigen Aufnahme von Glukose bzw. glukosehaltigen Substraten empfiehlt sich der Einsatz von Transportproteinen, ins­ besondere eines Facilitators, das heißt eines Trans­ portproteins, das nach dem Prinzip der proteinvermit­ telten erleichterten Diffusion wirkt. Insbesondere bie­ tet sich der Einsatz des Glukosefacilitator-Proteins (Glf) aus Zymomonas mobilis an. Bei der Verwendung von letzterem stammt das das Protein kodierende Gen glf z. B. aus Z. mobilis, insbesondere das aus Z. mobilis ATCC 31821 isolierte Facilitator-Gen glf, wie beschrie­ ben von Parker et al. 1995. Molecular Microbiology 15 (1995) 795-802, und Weisser et al. 1995. Journal of Bacteriology 177 (1995) 3351-3354. Andere Zuckertrans­ portgene aus Bakterien, deren Genprodukte Glukose transportieren und dabei kein PEP verwenden, sind für das erfindungsgemäße Verfahren aber ebenso geeignet, wie zB. das GalP-System aus Escherichia coli. Außerdem sind Gene für Zuckertransportsysteme wie HXT1 bis HXT7 aus eukaryontischen Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis oder Kluyveromyces lactis, oder allgemein Zuckertransportgene aus anderen Organis­ men einsetzbar, vorausgesetzt, daß sie in den Mikroor­ ganismen funktionell exprimiert werden können und die Genprodukte dabei ohne PEP zur Phosphorylierung und/oder zum Transport der Glukose auskommen. Insbeson­ dere empfiehlt es sich, daß die Zuckertransportgene in Aminosäureproduzenten exprimiert werden können.

Als Maßnahmen zur Steigerung der Aktivität im Sinne der Erfindung sind alle Maßnahmen zu verstehen, die dazu geeignet sind, die Aktivität eines Glukose oxidierenden Enzyms oder die Aktivität eines Glukose oxidierenden Enzyms und zusätzlich mindestens eine Aktivität aus Glukonsäure-phosphorylierendem Enzym, Glukonolaktonase, Transportprotein zur PEP unabhängigen Zuckeraufnahme zu steigern. Insbesondere sind hierzu geeignet:

• - Einführung von Genen z. B. mittels Vektoren oder tem­ perenter Phagen;
• - Erhöhung der Genkopienzahl z. B. mittels Plasmiden mit dem Ziel die erfindungsgemäßen Gene in erhöhter Ko­ pienzahl, von leicht (z. B. 2 bis 5 fach) bis zu stark erhöhter Kopienzahl (z. B. 15 bis 50 fach), in den Mi­ kroorganismus einzubringen;
• - Erhöhung der Genexpression z. B. durch Steigerung der Transkriptionsrate z. B. durch Verwendung von Promoto­ relementen wie z. B. Ptac, Ptet oder anderen regulatorischen Nucleotidsequenzen und/oder durch Steigerung der Translationsrate z. B. durch Verwendung einer Kon­ sensus-ribosomenbindungsstelle;
• - Erhöhung der endogenen Aktivität von vorhandenen En­ zymen z. B. durch Mutationen, die nach klassischen Me­ thoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder mutationsauslösenden Chemi­ kalien, oder durch Mutationen, die gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Inser­ tion(en) und/oder Nucleotidaustausch(e) erzeugt wer­ den;
• - Erhöhung der Aktivität von Enzymen durch Veränderung der Struktur von Enzymen z. B. durch Mutagenese mit physikalischen, chemischen, molekularbiologischen oder sonstigen mikrobiologischen Methoden;
• - Verwendung von deregulierten Enzymen, z. B. nicht mehr feedback inhibierten Enzymen;
• - Einführung entsprechender die deregulierten Enzyme kodierenden Gene.

Auch Kombinationen der genannten und weiteren, analogen Methoden können zur Erhöhung der Aktivität eingesetzt werden. Im Falle von Transportproteinen kann die endo­ gene Aktivität erhöht werden z. B. durch Klonierung des Gens mit beispielsweise o. g. Methoden oder über Selek­ tion von Mutanten mit erhöhtem Transport von Substra­ ten.

Bevorzugt erfolgt die Steigerung der Aktivität dadurch, daß eine Integration des Gens oder der Gene in eine Genstruktur oder in mehrere Genstrukturen erfolgt, wo­ bei das Gen oder die Gene als einzelne Kopie oder in erhöhter Kopienzahl in die Genstruktur eingebracht wird.

Als Genstruktur im Sinne der Erfindung ist ein Gen und jede Nucleotidsequenz zu verstehen, die die erfindungs­ gemäßen Gene trägt. Entsprechende Nucleotidsequenzen können beispielsweise Plasmide, Vektoren, Chromosomen, Phagen oder andere, nicht zirkulär geschlossene, Nucleotidsequenzen sein.

In Mikroorganismen, in denen der Stofffluß nach Ery4P erhöht ist, kann die Verfügbarkeit von PEP zur Produk­ tion des ersten Intermediaten des aromatischen Ami­ nosäurestoffwechsels limitiert sein. In solchen Fällen kann es vorteilhaft sein, andere PEP-verbrauchende Re­ aktionen im Metabolismus, wie z. B. die Reaktion des PEP: Zucker-Phosphotransferasesystems (PTS), welches ei­ ne PEP-abhängige Zuckeraufnahme katalysiert, sofern an­ wesend, zu vermindern oder auszuschalten. Erfindungsgemäß können sowohl Organismen eingesetzt werden, die das natürliche Aktivitätsniveau des PTS aufweisen; es können auch, zur weiteren Verbesserung des Verfahrens, PTS-Mutanten eingesetzt werden, in de­ nen das PTS in seiner Aktivität vermindert ist. Eine derartige Verminderung kann entweder auf enzymatischer Ebene oder durch genetische Methoden erfolgen, z. B. durch Verwendung alternativer, stark reprimierbarer Promotoren zur Expression der pts-Gene, oder durch In­ sertion eines glf-Gens in das Chromosom und insbesonde­ re in den Genort des ptsI-Gens, was zugleich eine Sta­ bilisierung der rekombinanten DNS im Chromosom (Segre­ gationsstabilität) und damit den Verzicht auf die Ver­ wendung eines Vektors mit sich bringt. Desweiteren kann in Verbindung mit einem regulierbaren Promotor auch durch die Zugabe von Induktoren oder Inhibitoren des entsprechenden Promotors während der Kultivierung Ein­ fluß auf die Aktivität des PTS genommen werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion von Sub­ stanzen werden bevorzugt Mikroorganismen eingesetzt, in denen ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich an der Synthese der Substanzen beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind.

Dies sind insbesondere die Enzyme des aromatischen Ami­ nosäurestoffwechsels und vor allem DAHP-Synthase, Shi­ kimatkinase und Chorismatmutase/Prephenatdehydratase, sowie aber auch alle anderen Enzyme, insbesondere auch Transaldolase, Transketolase und Glukokinase, die an der Synthese aromatischer Stoffwechselintermediate und deren Folgeprodukte beteiligt sind.

Für die Herstellung von Substanzen wie beispielsweise Adipinsäure, Gallensäure und Chinonverbindungen, sowie deren Derivate ist neben den erfindungsmäßigen Enzymen besonders die Deregulation und Überexpression der DAHP- Syntase von Bedeutung. Zur überhöhten Synthese von bei­ spielsweise L-Tryptophan, L-Tyrosin, Indigo, Derivaten von Hydroxy- und Aminobenzoesäure und Naphtho- und An­ thraquinonen, sowie deren Folgeprodukten sollte zusätz­ lich die Shikimatkinase dereguliert und in ihrer Akti­ vität erhöht werden. Für eine effiziente Produktion von Phenylalanin, Phenylbrenztraubensäure und deren Deri­ vaten ist zusätzlich eine deregulierte und überexpri­ mierte Chorismatmutase/Prephenatdehydratase von beson­ derer Bedeutung. Jedoch sollen damit auch alle anderen Enzyme umfaßt sein, deren Aktivitäten zur biochemischen Synthese von Substanzen beitragen, das heißt Verbindun­ gen deren Produktion durch die Bereitstellung von Ery4P oder Ery4P und PEP begünstigt wird.

Es sei bemerkt, daß für die Herstellung von Indigo, Adipinsäure und anderen nicht natürlichen Folgeproduk­ ten neben den erfindungsgemäßen Eingriffen weitere ge­ netische Veränderungen an den Substanzen produzierenden Mikroorganismen notwendig sind. Diese Maßnahmen sind dem Fachmann bekannt (Frost & Draths, Ann. Rev. Micro­ biol. 49 (1995) 557-579).

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Herstel­ lung von aromatischen Aminosäuren, insbesondere von L- Phenylalanin. Im Falle von L-Phenylalanin wird dabei vorzugsweise die Genexpression und/oder die Enzymakti­ vität einer deregulierten DAHP-Synthase (z. B. in E. co­ li AroF oder AroH) und/oder einer ebenfalls deregulier­ ten Chorismatmutase-/Prephenatdehydratase (PheA) er­ höht.

Als Produktionsorganismen eignen sich Escherichia-Ar­ ten, sowie aber auch Mikroorganismen der Gattungen Ser­ ratia, Bacillus, Corynebacterium oder Brevibacterium und weitere aus klassischen Aminosäureverfahren bekann­ te Stämme. Ebenso Bakterien aus den Familien Nocardia­ ceae und Actinomycetales. Besonders geeignet ist Esche­ richia coli.

Die Erfindung betrifft auch die Bereitstellung von ge­ eigneten Genstrukturen und diese Genstrukturen tragen­ den transformierten Zellen, welche eine besonders er­ folgreiche Realisation des Verfahrens ermöglichen.

Im Rahmen der Erfindung werden jetzt neue Genstrukturen zur Verfügung gestellt, die, in rekombinanter Form, entweder ein Gen enthalten, kodierend für ein Glukose- oxidierendes Enzym a) zusammen mit einem Gen kodierend für ein Glukonsäure phosphorylierendes Enzym oder b) zusammen mit einem Gen kodierend für ein Transportprotein zur PEP unabhängigen Aufnahme eines Zuckers oder c) zusammen mit mindestens zwei der drei nachstehenden Gene kodierend für ein Glukonsäurephosphorylierendes Enzym, für eine Glukonolaktonase, oder für ein Transportprotein zur PEP unabhängigen Aufnahme eines Zuckers.

Insbesonders kodiert das Gen für das Glukose-oxidie­ rende Enzym für eine Glukosedehydrogenase und das Gen für das Glukonsäure-phosphorylierende Enzym für eine Glukonatkinase.

Das Gen für die Glukosedehydrogenase stammt bevorzugt aus Bacillus megaterium, das Gen für die Glukonatkinase aus Escherichia coli und die Gene für Glukonolaktonase und das Transportprotein aus Zymomonas mobilis. Beson­ ders vorteilhaft sind Genstrukturen, bei denen das Gen für die Glukosedehydrogenase die Glukosedehydrogenase IV (gdhIV) aus Bacillus megaterium, das Gen gntK für die Glukonatkinase die GntK aus Escherichia coli, die Gene für das Transportprotein und die Glukonolaktonase die Gene glf und gnl aus Zymomonas mobilis sind.

Die Isolierung der entsprechenden Gene und die Trans­ formation der Zellen erfolgt nach gängigen Methoden: Im Falle z. B. der Klonierung des Glukonatkinasegens gntK aus E. coli, der Glukosedehydrogenase IV (gdh IV)aus Ba­ cillus megaterium, der Glukonolaktonase (gnl) oder des Transportgens glf aus Zymomonas mobilis eignet sich beispielsweise die Methode der Polymerase-Kettenreak­ tion (PCR) zur gerichteten Amplifikation des Gens mit chromosomaler DNS aus Escherichia coli K-12 (gntK), Ba­ cillus megaterium (gdhIV) bzw. Zymomonas mobilis Stäm­ men ATCC 29191 oder ATCC 31821 (gnl, glf).

Nach Amplifikation der DNS und deren in vitro-Rekombi­ nation mit bekannten Vektoren (pGEM7, pUCBM20, pUC19 oder anderen) erfolgt die Transformation der Wirtszelle durch chemische Methoden, Elektroporation, Transduktion oder Konjugation.

Im Falle der Gene gntK, gdhIV, gnl und glf aus den 3 Spenderorganismen sind die vollständigen Nucleotidse­ quenzen bekannt und aus allgemein zugänglichen Quellen erhältlich z. B. in Datenbanken wie beim EMBL/HUSAR in Heidelberg unter den Zugangsnummern D 84362 (gntK), D 10626 (gdhIV), X 67189 (gnl) und M 60615 (glf) hinter­ legt. Im Falle der Klonierung des gntK-Gens aus Esche­ richia coli eignet sich die PCR zur gerichteten Ampli­ fikation des Gens mit chromosomaler DNS aus Escherichia coli K-12 Stämmen anhand der Gen-Sequenzen wie be­ schrieben von Izu et al. Journal of Molecular Biology 267 (1997) 778-793, und Tong et al. Journal of Bacte­ riology 178 (1996) 3260-3269. Im Falle der Klonierung des gdhIV-Gens aus Bacillus megaterium eignet sich bei­ spielsweise chromosomale DNS aus Bacillus megaterium (Nagao et al. Journal of Bacteriology 174 (1992) 5013-5020).

Das isolierte Glukosedehydrogenase IV-Gen kann mit ei­ nem oder mehreren der im Rahmen der Erfindung beschrie­ benen Gene in jeglicher Kombination in eine Genstruktur oder in mehrere Genstrukturen integriert werden. Ohne die genaue Verteilung auf Genstrukturen zu berücksich­ tigen, führt dies zu Kombinationen wie zB. gdhIV + gntK, gdhIV + glf, gdhIV + gntK + glf; gdhIV + gntK + gnl; gdhIV + gnl + glf; gdhIV + gntK + gnl + glf.

Bei der Verteilung der Gene wird glf vorzugsweise in niedriger Kopienzahl x (wie beispielsweise x = 1 bis 10) in die Genstruktur oder die Genstrukturen einge­ bracht, um mögliche negative Auswirkungen einer Überex­ pression eines Membranproteins zu vermeiden. Vorteilhaft sind Genstrukturen, die mindestens eine, einem der Gene zugeordnete, regulatorische Gensequenz enthalten.

So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vor­ zugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem insbesondere die Transkriptionssignale verstärkt wer­ den. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß durch Veränderung der den Strukturgenen vorgeschalteten Promotorsequenzen die Wirksamkeit des Promotors oder der Promotoren erhöht wird oder indem die Promotoren komplett durch wirksamere Promotoren ersetzt werden. Auch kann eine Verstärkung der Transkription durch ent­ sprechende Beeinflussung eines den Genen zugeordneten Regulatorgens erfolgen; daneben ist aber auch eine Ver­ stärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der Boten-RNS (m-RNS) verbessert wird.

Weiterhin werden im Rahmen der Erfindung auch transfor­ mierte Bakterien-Zellen bereitgestellt, die in replizierbarer Form eine erfindungsgemäße Genstruktur enthalten.

Als transformierte Bakterien-Zelle im Sinne der Erfindung ist je­ der Mikroorganismus zu verstehen, der eine erfindungs­ gemäße Genstruktur trägt, die die verstärkte Bildung von Substanzen in der Zelle bewirkt. Die Transformation der Wirtszellen kann durch chemische Methoden (Hanahan J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580), sowie auch durch Elektroporation, Konjugation oder Transduktion erfol­ gen.

Es ist vorteilhaft für die Transformation Wirtszellen einzusetzen, in denen ein oder mehrere Enzyme, die zu­ sätzlich an der Synthese der Substanzen beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind. Mit der die jeweiligen Gene enthaltenden Genstruktur wird ein, eine aromatische Aminosäure oder eine andere erfindungsgemäße Substanz produzierender Mikroorganis­ mus-Stamm, insbesondere Escherichia coli, transfor­ miert.

Es ist von Vorteil für die Transformation mit den Gen­ strukturen Wirtszellen einzusetzen, in denen zusätz­ lich, sofern anwesend, das PEP-abhängige Zuckeraufnah­ mesystem in seiner Aktivität vermindert oder ausge­ schaltet ist.

Insbesondere werden transformierte Bakterien-Zellen bereitge­ stellt, die in der Lage sind, eine aromatische Ami­ nosäure zu produzieren, wobei die aromatische Aminosäu­ re vorzugsweise L-Phenylalanin ist.

Es wird also ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Substanzen bereitgestellt, bei dem transformierte Zellen, wie oben beschrieben, enthaltend Genstrukturen, wie oben beschrieben, eingesetzt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des er­ findungsgemäßen Verfahrens werden transformierte Zellen eingesetzt, die außer Ery4P auch andere Zentralstoff­ wechselmetabolite in erhöhter Verfügbarkeit enthalten. Dazu zählen z. B. α-Oxoglutarat oder Oxalacetat, die aus intrazellulären Syntheseprozessen resultieren, oder aber durch Zufütterung der entsprechenden Substanzen, oder ihrer Vorläufer, wie z. B. Fumarat oder Malat als Metaboliten des Zitronensäurezyklus, den wachsenden Zellenazur Verfügung gestellt werden.

Bei DSMZ ist unter den Bedingungen des Budapester Ver­ trages der Stamm Escherichia coli AT2471/pGEM7gntKgdhIV unter der Hinterlegungsnummer DSM 12118 am 15.04.1998 hinterlegt worden.

Der verwendete Wirtsorganismus AT2471 wurde von Taylor und Trotter (Bacteriol. Rev. 13 (1967) 332-53) bei der CGSC unter der Nummer 4510 hinterlegt und ist frei er­ hältlich.

Im Folgenden sollen die verwendeten Materialien und Me­ thoden angegeben, sowie die Erfindung durch experimen­ telle Beispiele und Vergleichsbeispiele unterbaut wer­ den:

Allgemeine Methoden

Im Rahmen der genetischen Arbeiten wurden Stämme von E. coli, sofern nicht anderweitig erwähnt, auf LB-Medium bestehend aus Difco Bacto Trypton (10 g.l^-1), Difco- Hefeextrakt (5 g.l^-1) und NaCl (10 g.l^-1) kultiviert. In Abhängigkeit von den Resistenzeigenschaften der ver­ wendeten Stämme wurde, sofern nötig, dem Medium Ampicillin (100 mg.l^-1) und/oder Chloramphenicol (17-34 mg.l^-1) zugesetzt. Ampicillin wurde dabei zuvor in Wasser und Chloramphenicol in Ethanol gelöst und dem bereits auto­ klavierten Medium sterilfiltriert zugegeben. Zur Her­ stellung von Agarplatten wurde dem LB-Medium Difco Bac­ to Agar (1,5%) zugesetzt.

Plasmid-DNS aus E. coli wurde mittels alkalischer Lyse unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Systems (Qiagen, Hilden) isoliert. Die Isolation von chromoso­ maler DNS aus E. coli und Bacillus megaterium DSM 319 erfolgte nach Chen und Kuo (Nucl. Acid Res. 21 (1993) 2260). Die Verwendung von Restriktionsenzymen, Taq-DNS- Polymerase, DNS-Polymerase I, Alkalische Phosphatase, RNase und T4 DNS-Ligase erfolgte nach den Instruktionen der Produzenten (Boehringer, Mannheim, D oder Promega, Heidelberg, D). Zur Restriktionsanalyse wurden die DNS- Fragmente in Agarosegelen (0,8%) aufgetrennt und mit­ tels Extraktion unter Verwendung eines kommerziell er­ hältlichen Systems (QuiaExII, Hilden, D) aus Agarose isoliert.

Zur Transformation der Zellen wurden diese für 2,5-3 h in LB-Medium (5 ml-Röhrchen) bei 37°C und 200 U.min^-1 inkubiert. Bei einer optischen Dichte (620 nm) von ca. 0,4 wurden die Zellen abzentrifugiert und in einem Zehntel des Volumens in TSS (LB-Medium mit 10% (w/v) PEG 8000, 5% (v/v) DMSO und 50 mM MgCl₂) aufgenommen. Nach 30-minütiger Inkubation bei 4°C mit 0,1 bis 100 ng DNS und anschließender Inkubation bei 37°C für 1 h wurden die Zellen auf LB-Medium mit entsprechendem An­ tibiotikum ausplattiert.

Beispiel 1 Bereitung von pGEM7gntKgdhIV als Vorbild erfindungs­ gemäßer, plasmidbasierter Genstrukturen

Die Klonierung des Gens gdhIV aus Bacillus megaterium DSM 319 kodierend für die Glukosedehydrogenase IV er­ folgte nach spezifischer Amplifikation der chromosoma­ len DNS von Bacillus megaterium DSM 319 mit der Polyme­ rasekettenreaktion (PCR) aufgrund der bekannten DNS-Se­ quenz des Gens, die von Nagao et al. Journal of Bacte­ riology 15 (1992) 5013-5020 beschrieben wurde. Die PCR- Oligonukleotidprimer wurden mit Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI (5'Ende) bzw. SacI (3'Ende) versehen. Primer 1 (BamHI) bestand aus 5' ATG GAT CCA TGA AAA CAC TAG GAG GAT TTT 3'. Primer 2 (Sac I) be­ stand aus 5' GCC AGA GCT CTT TTT TCC ACA TCG ATT AAA AAC TAT 3' und war komplementär zum 3'Ende des gdhIV- Gens. Das erhaltene DNS-Amplifikationsprodukt von ca. 800 Basenpaaren wurde mit BamHI plus SacI restringiert und danach in den gleichermaßen behandelten Vektor pGEM7 (s. Tab. 1) ligiert. Transformation erfolgte in den Stamm JM109DE3 mit Selektion auf LB-Agarplatten, die X-Gal und Ampicillin enthielten. Der Nachweis der erfolgreichen Klonierung erfolgte durch die Bestimmung der DNS-Sequenz des klonierten Gens gdhIV. Dieser Vek­ tor (pGEM7gdhIV) ermöglichte auch in Abwesenheit des T7-Polymerasesystems (Stamm JM109DE3) die Expression der Glukosedehydrogenase IV-Aktivität (s. Tab. 2). Die Klonierung des Gens gntK für die Glukonatkinase GntK aus Escherichia coli K-12 erfolgte durch spezifi­ sche DNS-Amplifikation ausgehend von Stamm E. coli K-12 W3110 als chromosomale Matrize. Die Sequenz des gntK- Gens wurde von Tong et al. Journal of Bacteriology 178 (1996) 3260-3269 beschrieben. Zur Vermehrung mittels PCR wurden Oligonukleotidprimer gewählt, die zusätz­ lich mit Restriktionsschnittstellen für EcoRI (5') bzw. BamHI (3') versehen wurden. Primer 1 bestand aus 5'CCG AAT TCT TGT ATT GTG GGG GCA C 3' und bindet 5'stromaufwärts vom gntK-Gen; Primer 2 bestand aus 5' CCG GAT CCG TTA ATG TAG TCA CTA CTT A 3' und ist kom­ plementär zum 3'Ende des gntK-Gens. Das Amplifikations­ produkt von ca. 600 Basenpaaren wurde gereinigt, mit EcoRI plus BamHI restringiert und in den gleichermaßen geöffneten Vektor pGEM7 ligiert. Transformation erfolg­ te in den Stamm JM109DE3 mit Selektion auf LB- Agarplatten, die X-Gal und Ampicillin enthielten. Der Nachweis der erfolgreichen Klonierung erfolgte durch die Bestimmung der DNS-Sequenz des klonierten Gens gntK. Dieser Vektor (pGEM7gntK) ermöglichte auch in Abwesenheit des T7-Polymerasesystems (Stamm JM109DE3) die Expression der Glukonatkinase-Aktivität (s. Tab. 2).

Die Kombination der Gene gntK und gdhIV erfolgte durch Öffnung des Vektors pGEM7gntK durch doppelte Restrikti­ on mit BamHI plus SacI. In diesen dermaßen geöffneten Vektor wurde ein 800 Basenpaarfragment, das nach Re­ striktion des Vektors pGEM7gdhIV gewonnen worden war und das das gdhIV-Gen enthielt, ligiert. Transformation erfolgte wiederum mit Selektion auf Ampicillin. Die neue, erfindungsgemäße Genstruktur pGEM7gntKgdhIV ver­ mittelt die T7 Polymerase-unabhängige Expression der Enzymaktivitäten für Glukosedehydrogenase IV und für Glukonatkinase GntK (s. Tab. 2).

Die Aufbewahrung der erhaltenen Transformanden erfolgte auf LB-Medium in Form von Glycerinkulturen (30%) bei -80°C. Bei Bedarf wurden die Glycerinkulturen direkt vor dem Gebrauch aufgetaut.

Beispiel 2 Bestimmung der Enzymaktivitäten von Glukosedehydroge­ nase und Glukonatkinase

Zur Bestimmung der Enzymaktivitäten in bakteriellen Ro­ hextrakten wurden die Zellen von E. coli sowie von plasmid-tragenden Mutanten in mineralischem Medium kul­ tiviert. Dies bestand aus Natriumcitrat.3H₂O (1,0 g.l^-1), MgSO₄.7H₂O (0,3 g.l^-1), KH₂PO₄ (3,0 g.l^-1), K₂HPO₄ (12,0 g.l^-1), NaCl 0,1 (g.l^-1), (NH₄)₂SO₄ (5,0 g.l^-1), CaCl₂.2H₂O (15,0 mg.l^-1), FeSO_4.7H₂O (0,075 g.l^-1), und L-Tyrosin (0,04 g.l^-1). Die Zugabe weiterer Minerale erfolgte über eine Spurenelementlösung (1 ml.l^-1) zusammengesetzt aus Al₂(SO₄)₃.18H₂O (2,0 g.l^-1), CoSO₄.6H₂O (0,7 g.l^-1), Cu­ SO₄.5H₂O (2,5 g.l^-1), H₃BO₃ (0,5 mg.l^-1), MnCl₂.4H₂O (20,0 g.l^-1), Na₂MoO₄.2H₂O (3,0 g.l^-1), NiSO₄.3H₂O (2,0 g.l^-1) und ZnSO₄.7H₂O (15,0 g.l^-1). Vitamin B1 (5,0 mg.l^-1) wurde in Wasser gelöst und dem Medium nach dem Autoklavieren sterilfiltriert zugegeben, ebenso wie bei Bedarf Ampi­ cillin bzw. Ampicillin und Chloramphenicol. Glukose (30 g.l^-1) wurde separat autoklaviert und dem Medium eben­ falls nach dem Autoklavieren zugefügt.

Die geernteten Zellen wurden in 100 mM Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) gewaschen. Die Zellen des Sediments wurden mittels Ultraschall (Branson Sonifier 250 mit Microtip) in einem Beschallungszyklus von 25% und mit einer In­ tensität von 40 Watt für 4 min pro ml Zellsuspension aufgeschlossen. Nach Zentrifugation für 30 min bei 18000 g und 4°C wurde der Überstand (Rohextrakt) für die Messung der Aktivität der Glukosedehydrogenase bzw. der Glukonatkinase verwendet.

Die Bestimmung der Aktivität der Glukosedehydrogenase erfolgte nach Harwood & Cutting. Molecular Biological Methods für Bacillus. John Wiley & Sons. Glukosedehy­ drogenase katalysiert die Oxidation von Glukose zu Glu­ konolakton. Die Aktivität des Enzyms wurde über die Zu­ nahme der Konzentration des reduzierten Cofaktors NADH + H⁺ photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm be­ stimmt. Die Bestimmung erfolgte in Quarzküvetten mit einem Gesamtvolumen von 1 ml. Der Reaktionsansatz be­ stand aus Tris HCl Endkonzentration 250 mM pH 8.0), Na­ trium-EDTA 2.5 mM, KCl 100 mM und NAD 2 mM. Rohextrakt wurde im Puffer 5 Minuten bei 25°C vorinkubiert. Zum Start der Nachweisreaktion wurde Glukose zugegeben (Endkonzentration 100 mM). Die Zunahme der Extinktion wurde bei 340 nm verfolgt. Als Kontrolle diente jeweils ein Ansatz ohne Glukose. Die spezifische Glukosedehy­ drogenase-Aktivität wird angegeben in U/mg, definiert als die Bildung von 1 µMol NADH pro Minute und mg Pro­ tein, was äquivalent zum Umsatz von 1 µMol Glukose pro Minute und mg Protein gesetzt wird.

Die Bestimmung der Glukonatkinase im Rohextrakt erfolg­ te wie von Izu et al. FEBS Letters 394 (1996) 14-16 be­ schrieben.

Glukonatkinase katalysiert die ATP-abhängige Phosphory­ lierung von Glukonat zu 6-Phosphoglukonat. Das gebilde­ te 6-Phosphoglukonat wird im Enzymtest durch das NADP- abhängige Hilfsenzym 6-Phosphoglukonat-Dehydrogenase (Boehringer Mannheim, No. 108 405) über die Zunahme der NADPH-Konzentration photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm bestimmt. Die Bildung von 1 µmol NADPH ent­ spricht dabei der Phosphorylierung von 1 µmol Glukonat. Der enzymatische Nachweis wurde in Quarzküvetten mit einem Gesamtvolumen von 1 ml durchgeführt bei 25°C durchgeführt. Der Reaktionsansatz enthielt Tris HCl 50 mM pH 8.0, ATP 100 mM, NADP 0.25 mM, 1.2 Einheiten des Hilfsenzyms 6-Phosphoglukonat-Dehydrogenase und varia­ ble Mengen an Rohextrakt. Die Ansätze wurden bei 25°C für 5 Minuten vorinkubiert und durch Zugabe von Glukon­ säure (pH 6.8; Endkonzentration 10 mM im Ansatz) ge­ startet. Als Kontrolle dienten Ansätze ohne Zugabe von Glukonsäure.

Die Bestimmung der Proteinkonzentration im Rohextrakt erfolgte nach Bradford M. M. (Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254) unter Verwendung eines kommerziell erhältli­ chen Farbreagenzes. Als Standard wurde Rinderserumalbu­ min verwendet.

Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Enzymmessungen bei der Verwendung des Wirtsstammes E. coli W3110, sowie dessen Mutanten, die die Plasmide pGEM7gdhIV, pGEM7gntK oder pGEM7gntKgdhIV beinhalten. Es zeigte sich, dass die Enzyme bei der Verwendung der beschriebenen und erfin­ dungsgemäßen Genstruktren in erfindungsgemäßen Zellen funktionsfähig exprimiert werden können.

Beispiel 3 Produktion von Substanzen unter Verwendung von Stämmen, die eine erhöhte Aktivität der Glukosedehydrogenase aufweisen

Die Syntheseleistung von Escherichia coli AT2471 und Escherichia coli AT2471/pGEM7ghdIV wurde in dem unter Beispiel 2 beschriebenen Mineralmedium bestimmt. Hier­ für wurden Schüttelkolben (1000 ml mit 100 ml Medium) mit 2 ml Glycerinkultur angeimpft und bei 37°C und 150 U.min^-1 für 72 h auf einem Kreisschüttler inkubiert. In Intervallen von ungefähr 12 h wurde der pH-Wert der Kulturen gemessen und bei Bedarf durch Zugabe von KOH (45%) auf den Startwert von 7.2 zurückgebracht. Des­ weiteren wurden nach 24 und 48 h Proben (2 ml) zur Be­ stimmung der optischen Dichte, sowie der Glukose- und der L-Phenylalaninkonzentrationen genommen.

Die Phenylalaninkonzentration wurde mittels Hochdruck­ flüssigkeitschromatographie (HPLC, Hewlett Packard, München, D) in Verbindung mit Fluoreszenzdetektion (Ex­ tinktion 335 nm, Emission 570 nm) ermittelt. Als feste Phase wurde eine Nucleosil-120-8-C18-Säule (250.4,6 mm) verwendet; die Elution erfolgte unter Verwendung eines Gradienten (Eluent A: 90% 50 mM Phosphorsäure, 10% Methanol, pH 2,5; Eluent B: 20% 50 mM Phosphorsäure, 80% Methanol, pH 2,5; Gradient: 0-8 min 100% A, 8-13 min 0% A, 13-19 min 100% A). Die Elutionsgeschwindig­ keit wurde auf 1,0 ml.min^-1 festgesetzt; die Säulentem­ peratur auf 40°C. Die Nachsäulenderivatisierung er­ folgte unter Verwendung von o-Phthaldialdehyd in einer Reaktionskapillare (14 m.0.35 mm) bei Raumtemperatur. Für L-Phenylalanin wurde unter den beschriebenen Bedin­ gungen eine Retentionszeit von 6,7 min ermittelt. Durch die Messung der Glukosekonzentration mittels en­ zymatischer Teststreifen (Diabur, Boehringer Mannheim, D) und, abhängig von den Resultaten, Nachdosieren von 2 ml einer konzentrierten Glukoselösung (500 g.l^-1) wurde sichergestellt, daß keine Glukoselimitierung in den Versuchsansätzen auftrat.

Nach einer Inkubationszeit von 48 h wurde im Vergleich zu einem (Phenylalanin)-Indexwert von 100 für den Wirtsstamm E. coli AT2471, durch das alleinige Einbrin­ gen des Plasmides pGEM7gdhIV ein die Phenylalaninekonzentration beschreibender Indexwert von 145 erreicht. Dieses Ergebnis zeigt den erfindungsgemäßen, die Syn­ these aromatischer Verbindungen erhöhenden Effekt der Erhöhung der Aktivität einer Glukosedehydrogenase in Substanzen produzierenden Mikroorganismen.

Beispiel 4 Produktion von Substanzen unter Verwendung von Stämmen, in denen zusätzlich zu einer erhöhten Aktivität der Glukosedehydrogenase ein PEP-unabhängiges Zuckeraufnah­ mesystem exprimiert ist

Das glf-Gen aus Zymomonas mobilis wurde unter Verwen­ dung des Plasmids pZY600 (Weisser et al. J. Bacteriol 177 (1995) 3351-3345) als Matrize amplifiziert. Dabei wurde durch die Wahl der Primer eine BamHI- und eine KpnI-Schnittstelle eingeführt. Unter Verwendung dieser singulären Schnittstellen wurden das Gen in den Vektor pUCBM20 (Boehringer Mannheim), der ebenfalls mit BamHI und KpnI geöffnet worden war, eingebracht. Aus diesem Vektor (pBM20glf) wurde durch Restriktion mit BamHI und Hindill ein 1.5 kb großes DNS-Fragment gewonnen und mit dem Vektor Plasmid pZY507 (Weisser et al. J. Bacteriol 177 (1995) 3351-3345), der ebenfalls mit den Restrikti­ onsenzymen BamHI und Hind III geöffnet worden war, li­ giert. Nach Transformation von E. coli und Klonierung der Transformanden wurde das rekombinierte Plasmid pZY507glf erhalten. Dieser Vektor führt zur Chloramphe­ nicol-Resistenz, enthält das lacI^q-tac-Promotorsystem und hat eine niedrige Kopienzahl.

Der Vektor pZY507glf wurde zusammen mit den erfindungs­ gemäßen Genstrukturen aus Beispiel 1 in den Wirtsstamm AT2471 transformiert.

Den für Beispiel 3 beschriebenen experimentellen Bedin­ gungen folgend, wurden die Mutanten E. coli AT2471glf, E. coli AT2471glf/pGEM7, E. coli AT2471glf/pGEM7gntK und E. coli AT2471glf/pGEM7gntKgdhIV in je zwei Parallelan­ sätzen kultiviert. Nach 48 h wurde die L-Phenylalanin­ konzentration im Medium bestimmt.

Im Vergleich zum Ausgangsstamm E. coli AT2471glf, der eine dem Indexwert von 100 entsprechende L-Phenylala­ ninkonzentration erreichte, ermöglichte die Anwesenheit des Vectors pGEM7 einen Indexwert von 96 und damit na­ hezu identische Konzentrationen. Der Einsatz von E. co­ li AT247glf/pGEM7gntK hingegen erlaubt eine L- Phenylalaninkonzentration, die im Vergleich zu den zu­ vor genannten Stämmen einem Indexwert von 179 ent­ sprach. Eine weitere Erhöhung auf einen die Phenylala­ ninkonzentration repräsentierenden Indexwert von 195 ermöglichte die Expression beider Gene des alternativen Stoffwechsels, d. h. Glukosedehydrogenase und Glukonat­ kinase in E. coli AT2471glf/pGEM7gntKgdhIV.

Dieses Ergebnis zeigt, daß die Expression eines alter­ nativen Stoffwechselweges durch Einbringen der Aktivi­ tät der Glukosedehydrogenase und Erhöhen der Aktivität der Glukonatkinase die Synthese von L-Phenylalanin ge­ rade in jenen Mikroorganismem positiv beeinflußt, in denen gleichzeitig ein PEP-unabhängiges Zuckeraufnahme­ system transformiert und exprimiert ist.

Beispiel 5 Produktion von Substanzen unter Verwendung von PTS^--Mu­ tanten, in denen zusätzlich zu einer erhöhten Aktivität der Glukosedehydrogenase ein PEP-unabhängiges Zuc­ keraufnahmesystem exprimiert ist

Zur Integration des glf-Gens in die Gene, die für Kom­ ponenten des PTS-Systems von E. coli kodieren, wurde das Plasmid pPTS1 mit BglII verdaut und mit Klenow- Fragment behandelt. Die singuläre Schnittstelle liegt im ptsI-Gen. Das glf-Gen wurde als BamHI-KpnI-Fragment aus dem Plasmid pBM20glfglk isoliert und ebenfalls mit Klenow-Fragment behandelt. Durch blunt-end-Ligation wurden Klone erhalten, die das glf in gleicher Orien­ tierung wie die Gene ptsHI tragen. Aus dem resultieren­ den Plasmid pPTSglf konnte ein 4,6 kb PstI-Fragment er­ halten werden, welches den 3'-Bereich des ptsH-Gens so­ wie ptsl mit integriertem glf und crr trägt. Dieses Fragment wurde in die EcoRV-Schnittstelle des Vektors pGP704 ligiert. Da dieser Vektor nur in λpir-Stämmen repliziert werden kann, haben Transformanden, die die­ sen Phagen nicht tragen, den Vektor ins Chromosom inte­ griert, wenn sie auf Carbenicillin wachsen können. Die Integration wurde mittels Southern Analyse überprüft (Miller V. L. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2575-83). Die erhaltenen Transformanden enthielten neben dem glf- Gen auch die vollständigen PTS-Gene.

Bei einem zweiten homologen crossover kann der Vek­ toranteil herausrekombinieren, was zum Verlust der Car­ benicillin-Resistenz führt. Da in diesem Falle die pts- Gene durch die Insertion des glf-Gens unterbrochen vor­ liegen, wird das PTS in diesen Mutanten nicht funktio­ nell exprimiert. Die gewünschten PTS^--Mutanten wurden wie folgt selektioniert: Nach mehrmaligem Überimpfen der noch PTS⁺-Transformanden auf LB-Medium ohne Anti­ biotika wurden Aliquots der Zellsuspension auf LB-Plat­ ten mit 100 µg.l^-1 Phosphomycin ausplattiert. PTS^--Mu­ tanten können auf diesen Platten wachsen. Wachsende Klone wurden auf LB-Platten mit entweder Phosphomycin oder mit 20 µg.l^-1 Carbenicillin ausgestrichen. Von Klo­ nen, die erneutes Wachstum auf den Phosphomycin-Plat­ ten, nicht aber auf den Carbenicillin Platten zeigten, wurde chromosomale DNS isoliert. Die Integration des glf-Gens in die Gene, die für das, PTS-System kodieren, wurde durch Southern-Analyse bestätigt. Entsprechende Mutanten wurden als phänotypisch PTS-defizient identi­ fiziert.)

Ein Klon wurde als Wirtsorganismus E. coli AT2471glfintPTS^- ausgewählt und für die Transformationen (s. oben) mit Plasmid pGEM7gntKgdhIV eingesetzt.

Den für Beispiel 3 und 4 beschriebenen experimentellen Bedingungen folgend, wurden die PTS-negative Mutante E. coli AT2471glfintPTS^-/pGEM7gntKgdhIV, sowie der kor­ respondierende Wirtsstamm AT2471glfintPTS^- in je zwei Parallelansätzen kultiviert. Nach 48 h wurde aus den Ergebnissen die integrale biomassespezifische Produkti­ vität errechnet.

Im Vergleich zum Wirtsstamm E. coli AT2471glfintPTS^-, dessen integrale biomassespezifische Produktivität durch einen Indexwert von 100 representiert ist, erreichte die Mutante AT2471glfintPTS-/pGEM7gntKgdhIV eine integrale biomas­ sespezifische Produktivität mit einem Indexwert von 133.

Dieses Ergebnis zeigt, daß das Einbringen der Aktivität der Glukosedehydrogenase und Erhöhen der Aktivität der Glukonatkinase die Produktivität der Synthese von Phe­ nylalanin gerade in jenen Mikroorganismem positiv be­ einflußt, die sich durch ein in seiner Aktivität ver­ mindertes oder gänzlich ausgeschaltetes PTS-System aus­ zeichnen und in denen gleichzeitig ein PEP-unabhängiges Zuckeraufnahmesystem integriert ist.

Tabelle 1

Tabelle 2

Bestimmung der Glukosedehydrogenase- und Glukonatkinase­ aktivität in Rohextrakten von Escherichia coli mit verschie­ denen Genstrukturen

Claims (30)

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Substan­ zen aus dem aromatischen Stoffwechsel, bei dem ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der eine erhöhte Aktivität eines Glukose oxidierenden Enzyms aufweist und Glukose und glukosehaltige Substrate durch Oxi­ dation zu Glukonolakton oder Glukonat sowie durch Phosphorylierung des Glukonats zu 6-Phospho-Glukonat umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Substanzen hergestellt werden, an deren Synthese das Intermediat Erythrose-4-Phosphat beteiligt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität einer Glukosedehydrogenase in den Mikroorganismus eingebracht und/oder erhöht wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität einer Glukosedehydrogenase aus Ba­ cillus megaterium in den Mikroorganismus eingebracht und/oder erhöht wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität der Glukosedehydrogenase IV aus Bacillus megaterium in den Mikroorganismus einge­ bracht und/oder erhöht wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Aktivität eines Glukonsäure phos­ phorylierenden Enzyms erhöht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität einer Glukonatkinase erhöht wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität einer Glukonatkinase aus Escheri­ chia coli erhöht wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Aktivität einer Glukonolaktonase, insbesondere eine aus Zymomonas mobilis, erhöht wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Aktivität eines Transportproteins zur PEP unabhängigen Aufnahme eines Zuckers erhöht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Transportprotein ein Facilitator ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Facilitator das Glukosefacilitator-Protein (Glf) aus Zymomonas mobilis ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität eines Glukose oxidierenden Enzyms oder die Aktivität eines Glukose oxidierenden Enzyms und zusätzlich mindestens eine Aktivität aus Glukon­ säure phosphorylierendem Enzym, Glukonolaktonase, Transportprotein zur PEP unabhängigen Zuckeraufnah­ me, gesteigert wird,

• a) durch Einführung der Gene
• b) und/oder durch Erhöhen der Genkopienzahl
• c) und/oder durch Erhöhung der Genexpression
• d) und/oder durch Erhöhung der endogenen Aktivität der genannten Enzyme
• e) und/oder durch Strukturveränderung an den Enzymen
• f) und/oder durch Verwendung von deregulierten Enzy­ men
• g) und/oder durch Einführen von Genen, die für dere­ gulierte Enzyme kodieren.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Steigerung der Aktivität dadurch erreicht wird, daß eine Integration des Gens oder der Gene in eine Genstruktur oder in mehrere Genstrukturen er­ folgt, wobei das Gen oder die Gene als einzelne Ko­ pie oder in erhöhter Kopienzahl in die Genstruktur eingebracht wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Aktivität eines PEP-abhängigen Zuckeraufnahmesystems, sofern anwesend, vermindert oder ausgeschaltet wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus eingesetzt wird, in dem ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich an der Synthese der Substanzen beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind.

17. Verfahren nach der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die hergestellte Substanz eine aromatische Ami­ nosäure ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die aromatische Aminosäure L-Phenylalanin ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte Mikroorganismus den Gattungen Escherichia, Serratia, Bacillus, Corynebacterium oder Brevibacterium zugeordnet ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Escherichia coli ist.

21. Genstruktur enthaltend in rekombinanter Form entweder ein Gen kodierend für ein Glukose oxidie­ rendes Enzym zusammen mit einem Gen kodierend für ein Glukonsäure phosphorylierendes Enzym,
oder ein Gen kodierend für ein Glukose oxidierendes Enzym zusammen mit einem Gen kodierend für ein Transportprotein zur PEP unabhängigen Aufnahme von Zuckern,
oder ein Gen kodierend für ein Glukose oxidierendes Enzym zusammen mit mindestens zwei der drei nachste­ henden Genen, kodierend für ein Glukonsäurephospho­ rylierendes Enzym, für eine Glukonolaktonase oder für ein Transportprotein zur PEP unabhängigen Auf­ nahme von Zuckern.

22. Genstruktur nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für das Glukose oxidierende Enzym eine Glukosedehydrogenase kodiert und das Gen für das Glukonsäure phosphorylierende Enzym eine Glukonatki­ nase kodiert.

23. Genstruktur nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für die Glukosedehydrogenase aus Bacil­ lus megaterium stammt, das Gen für die Glukonatkina­ se aus Escherichia coli stammt und die Gene für die Glukonolaktonase und das Transportprotein aus Zymo­ monas mobilis stammen.

24. Transformierte Bakterien-Zelle, enthaltend in repli­ zierbarer Form eine Genstruktur nach den Ansprüchen 21 bis 23.

25. Transformierte Bakterien-Zelle nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß in der Zelle ein oder mehrere Enzyme, die zu­ sätzlich an der Synthese der Substanzen beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind.

26. Transformierte Bakterien-Zelle nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine Escherichia coli-Zelle ist.

27. Transformierte Bakterien-Zelle nach einem der An­ sprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich das PEP-abhängige Zuckeraufnahmesy­ stem, sofern anwesend, in seiner Aktivität vermin­ dert oder ausgeschaltet ist.

28. Transformierte Bakterien-Zelle nach einem der An­ sprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Lage ist, eine aromatische Aminosäure zu produzieren.

29. Transformierte Bakterien-Zelle nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die aromatische Aminosäure L-Phenylalanin ist.

30. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Substan­ zen nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß transformierte Bakterien-Zellen nach einem der Ansprüche 24 bis 29, in denen eine Genstruktur nach einem der Ansprüche 21 bis 23 vorliegt, eingesetzt werden.