DE10219714A1 - Verfahren zur mikrobielien Herstellung von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges - Google Patents
Verfahren zur mikrobielien Herstellung von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen AminosäurebiosynthesewegesInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges. DOLLAR A Mikrobiell hergestellte Substanzen, wie Feinchemikalien, insbesondere aromatische Aminosäuren oder Metaboliten des Aromatenbiosyntheseweges sind von großem wirtschaftlichen Interesse, wobei der Bedarf an z. B. Aminosäuren weiterhin zunimmt. DOLLAR A Die Erfinder fanden heraus, daß nach Einbringen einer pyc-Gensequenz in Mikroorganismen, in verbesserter Weise aromatische Aminosäuren sowie Metabolite des aromatischen Biosyntheseweges produziert werden konnten. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von L-Phenylalanin.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges.
- Mikrobiell hergestellte Substanzen, wie Feinchemikalien, insbesondere aromatische Aminosäuren oder Metabolite des Aromatenbiosyntheseweges sind von großem wirtschaftlichen Interesse, wobei der Bedarf an z. B. Aminosäuren weiterhin zunimmt. So wird beispielsweise L- Phenylalanin zur Herstellung von Medikamenten und insbesondere auch bei der Herstellung des Süßstoffes Aspartam (α-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester) verwendet. L-Tryptophan wird als Medikament und Zusatz zu Futtermitteln benötigt; für L-Tyrosin besteht ebenfalls Bedarf als Medikament, sowie als Rohstoff in der pharmazeutischen Industrie. Neben der Isolierung aus natürlichen Materialien ist die biotechnologische Herstellung eine sehr wichtige Methode, um Aminosäuren in der gewünschten optisch aktiven Form unter wirtschaftlich vertretbaren Bedingungen zu erhalten. Die biotechnologische Herstellung erfolgt entweder enzymatisch oder mit Hilfe von Mikroorganismen.
- Die letztere, mikrobielle Herstellung hat den Vorteil, daß einfache und preisgünstige Rohstoffe eingesetzt werden können. Da die Biosynthese der Aminosäuren in der Zelle aber in vielfacher Weise kontrolliert wird, sind bereits vielfältige Versuche zur Steigerung der Produktbildung unternommen worden. So wurden z. B. Aminosäure-Analoga eingesetzt, um die Regulation der Biosynthese auszuschalten. Beispielsweise wurden durch Selektion auf Resistenz gegen Phenylalanin-Analoga Mutanten von Escherichia coli erhalten, die eine erhöhte Produktion von L-Phenylalanin ermöglichten (GB-2,053,906). Eine ähnliche Strategie führte auch zu überproduzierenden Stämmen von Corynebacterium (JP-19037/1976 und JP-39517/1978) und Bacillus (EP 0,138,526).
- Desweiteren sind durch rekombinante DNS-Techniken konstruierte Mikroorganismen bekannt, bei denen ebenfalls die Regulation der Biosynthese aufgehoben ist, indem die Gene, die für nicht mehr feedback-inhibierte Schlüsselenzyme kodieren, kloniert und exprimiert werden. Als ein Vorbild beschreibt EP 0,077,196 ein Verfahren zur Produktion von aromatischen Aminosäuren, bei dem eine nicht mehr feedback-inhibierte 3-Desoxy-D- Arabino-Heptulosonat-7-Phosphatsynthase (DAHP-Synthase) in E. coli überexprimiert wird. In EP 0,145,156 ist ein E. coli-Stamm beschrieben, in dem zur Produktion von L-Phenylalanin zusätzlich Chorismatmutase/-Prephenatdehydratase überexprimiert ist.
- Den genannten Strategien ist gemeinsam, daß sich der Eingriff zur Verbesserung der Produktion auf den für die aromatischen Aminosäuren spezifischen Biosyntheseweg beschränkt.
- Eine weitere Erhöhung der Produktion kann jedoch auch durch eine verbesserte Bereitstellung der zur Produktion aromatischer Aminosäuren benötigten Primärmetabolite Phosphoenolpyruvat (PEP) und Erythrose-4-Phosphat (Ery4P) erfolgen. PEP ist ein aktivierter Vorläufer des Glycolyseproduktes Pyruvat (Brenztraubensäure); Ery4P ist ein Intermediat des Pentosephosphatweges.
- Bei der Produktion aromatischer Aminosäuren oder von anderen Metaboliten des Aromatenbiosyntheseweges werden die Primärmetabolite Phosphoenolpyruvat (PEP) und Erythrose-4-Phosphat (Ery4P) für die Kondensation zu 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP) benötigt.
- Die Wirkung einer verbesserten Bereitstellung des zellulären Primärmetaboliten Phosphoenolpyruvat aus der Glykolyse wurde bereits früher untersucht. So ist bekannt, daß die durch rekombinante Techniken erreichte Überexpression der Transketolase eine erhöhte Bereitstellung von Erythrose-4-P und in Folge eine verbesserte Produktbildung von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L- Phenylalanin ermöglicht (EP 0,600,463).
- Flores et al. zeigten (Flores et al. 1996. Nature Biotechnology 14: 620-623), daß eine spontane Glucose positive Revertante einer Zuckerphosphotransferase-System (PTS)-negativen Mutante von Escherichia coli Glucose über das Galactose-Permease (GalP)-System in die Zellen einschleuste und zum Wachstum auf Glucose befähigt war. Durch zusätzliche Expression des Transketolase-Gens (tktA) wurde eine vermehrte Bildung des Intermediaten DAHP beobachtet (Flores et al. Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623). Weitere Verbesserungen der Bereitstellung von Vorläufermetaboliten für den aromatischen Aminosäurebiosyntheseweg und Verbesserungen des Flusses im aromatischen Aminosäurebiosyntheseweg sind dem Fachmann beispielsweise aus Bongaerts et al. (Bongaerts et al. Metabolic Engineering 3 (2001) 289-300) bekannt.
- In der Literatur sind weiterhin mehrere Strategien für die Steigerung der Verfügbarkeit von PEP beschrieben, z. B. durch ein PEP unabhängiges Zuckeraufnahmesystem wobei z. B. das Zuckerphosphotransferase System (PTS) völlig inaktiviert und anschließend durch eine Galaktose-Permease oder die Gene glf (Glucosefacilitator Protein) und glk (Glucokinase) aus Zymomonas mobilis ersetzt wird (Frost und Draths Annual Rev. Microbiol. 49 (1995), 557-579; Flores et al. Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623; Bongaerts et al. Metabolic Engineering 3 (2001) 289-300)
- Auch wurde in früheren Patentanmeldungen (DE 196 44 566.3; DE 196 44 567.1; DE 198 18 541 A1; US-6,316,232) gezeigt, daß durch die Erhöhung der Enzymaktivitäten von z. B. Transketolase, Transaldolase, Glucosedehydrogenase oder Glucokinase in Escherichia coli oder durch Kombinationen der angegebenen Enzyme und eines PEP unabhängigen Transportsystems, Substanzen des aromatischen Biosyntheseweges in erhöhtem Maße bereitgestellt werden konnten.
- In einer Reihe von Mikroorganismen spielt die Pyruvatcarboxylase eine wichtige Rolle für die Synthese der Aminosäuren, die aus dem Tricarbonsäure-Zyklus (TCA- Zyklus) abgeleitet sind.
- Die physiologische Rolle der Pyruvatcarboxylase liegt in der anaplerotischen Reaktion, die ausgehend von Pyruvat und CO2 (bzw. Hydrogencarbonat) die Bereitstellung von C4-Körpern (Oxalacetat) erreicht (Jitrapakdee und Wallace, Biochemical Journal 340 (1999) 1-16). Oxalacetat kann durch Reaktion mit Acetyl-CoA im Tricarbonsäure-Zyklus weiter verstoffwechselt werden (z. B. auch zu den Aminosäuren Glutamat und Glutamin), oder durch Transaminierung zu Asparaginsäure, Vorläufer der Aspartat-Aminosäurefamilie (Aspartat, Asparagin, Homoserin, Threonin, Methionin, Isoleucin und Lysin) bereitstellen (Peters-Wendisch et al. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3 (2001) 295-300). So konnten verschiedene Gruppen zeigen, dass die Aktivität einer Pyruvatcarboxylase für die Produktion von Aminosäuren der Aspartatfamilie in Corynebakterien eine Rolle spielt (DE 198 31 609; EP 1,067,192; Peters-Wendisch et al. Journal of. Molecular Microbiology and Biotechnology 3 (2001) 295-300; Sinskey et al. US 6,171,833 bzw. WO 00/39305). Die WO 01/04325 beschreibt beispielsweise ein fermentatives Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren aus der Aspartat-Aminosäurefamilie mit coryneformen Mikroorganismen, die ein Gen aus der Gruppe dapA (Dihydrodipicolinat-Synthase), lysC (Aspartat Kinase), gap (Glycerolaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase), mqo (Malat-Quinon Oxidoreduktase), tkt (Transketolase), gnd (6-Phosphogluconat Dehydrogenase), zwf (Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase), lysE (Lysin Export), zwal (unnamed protein product), eno (Enolase), opcA (putative oxidative pentose phosphate cycle protein) sowie auch eine pyc-Gensequenz (Pyruvatcarboxylase) enthalten. Dabei wird die aromatische Aminosäure L- Tryptophan neben den Aminosäuren der Aspartat-Aminosäurefamilie, ebenfalls als Produkt des in WO 01/04325 beschriebenen Verfahrens angegeben. Eine Angabe, welche spezielle Gensequenz bzw. welches spezielle Enzym für eine spezifische Produktion von aromatischen Aminosäuren und Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges geeignet ist, wird jedoch nicht angegeben.
- Gene für eine Pyruvatcarboxylase (pyc-Gene) wurden aus einer Reihe von Mikroorganismen isoliert, charakterisiert und in rekombinanter Form ausgeprägt. So wurden Gene für eine Pyruvatcarboxylase bereits in Bakterien wie Corynebakterien, Rhizobien, Brevibacterien, Bacillus subtilis, Mycobacterien, Pseudomonas, Rhodopseudomonas spheroides, Campylobacter jejuni, Methanococcus jannaschii, in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, und in Säugern wie dem Menschen nachgewiesen (Payne & Morris J Gen. Microbiol. 59 (1969) 97-101; Peters-Wendisch et al. Microbiology 144 (1998) 915-927; Gokarn et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 (2001) 188-195; Mukhopadhyay et al. Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414; Mukhopadhyay & Purwantini, Biochim. Biophys. Acta 1475 (2000) 191-206; Irani et al. Biotechnol. Bioengin. 66 (1999) 238-246; US 6,171,833; Dunn et al. Arch. Microbiol. 176 (2001) 355-363; Dunn et al. J. Bacteriol. 178 (1996) 5960-5970; Jitrapakdee et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 266 (1999) 512-517; Velayudhan & Kelly Microbiology 148 (2002) 685-694; Mukhopadhyay et al. Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414; EP 1,092,776).
- Aus Escherichia coli und anderen Enterobakterien sind bisher keine Pyruvatcarboxylasen beschrieben worden.
- In rekombinanten Zellen von Escherichia coli oder Salmonella typhimurium, die das pyc-Gen aus Rhizobium etli tragen, wurde kürzlich gezeigt, dass durch die Expression der Pyruvatcarboxylase das Produktspektrum der Zellen deutlich verändert wurde und zwar in Richtung C4-Körper (z. B. Succinat) unter Verringerung von aus dem Pyruvat abgeleiteten Substanzen wie Lactat oder Acetat (Gokarn et al. Biotechnol. Letters 20 (1998) 795-798; Gokarn et al. Applied Environm. Microbiol. 66 (2000) 1844-1850; Gokarn et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 (2001) 188-195; Xie et al. Biotechnol. Letters 23 (2001) 111-117). Durch Expression eines pyc- Gens aus Bacillus subtilis in E. coli wurde die Bildung der L-Aminosäuren Threonin, Glutaminsäure, Homoserin, Methionin, Arginin, Prolin und Isoleucin erreicht (EP 1,092,776). In der Literatur (Xie et al. Biotechnol. Letters 23 (2001) 111-117; Gokarn et al. Biotechnol. Letters 20 (1998) 795-798; Gokarn et al. Applied Environm. Microbiol. 66 (2000) 1844-1850; Gokarn et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 (2001) 188-195; EP 1,092,776) ist keine erhöhte Bildung von aromatischen Aminosäuren oder von Metaboliten aus dem Aromatenbiosyntheseweg beschrieben.
- Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem eine Produktion von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosynthesewegs erreicht werden kann.
- Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
- Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
- Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, aromatische Aminosäuren sowie Metabolite des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges mikrobiell herzustellen.
- Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von L-Phenylalanin.
- Unter aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges im Sinne der Erfindung, im folgenden auch als "Substanzen" bezeichnet, sind insbesondere die aromatischen Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tryptophan und L-Tyrosin zu verstehen. Unter Metaboliten aus dem aromatischen Aminosäurebiosyntheseweg seien darunter auch von 3-Desoxy- D-Arabino-Heptulosonat-7-Phosphat (DAHP) abgeleitete Verbindungen wie beispielsweise D-Arabino-Heptulosonat (DAH), Shikimisäure, Chorisminsäure und alle ihre Derivate, Cyclohexadientransdiole, Indigo, Indolessigsäure, Adipinsäure, Melanin, Chinone, Benzoesäure, sowie deren potentielle Derivate und Folgeprodukte zu verstehen. Es sei dabei bemerkt, daß für die Herstellung von Indigo, Adipinsäure und anderen nicht natürlichen Folgeprodukten neben den erfindungsgemäßen Eingriffen weitere genetische Veränderungen an den die Substanzen produzierenden Mikroorganismen notwendig sind. Jedoch sollen damit alle Verbindungen umfaßt sein, deren biochemische Synthese durch die erhöhte Bereitstellung von PEP begünstigt wird.
- Die Erfinder fanden überraschenderweise heraus, daß nach Einbringen einer pyc-Gensequenz in Mikroorganismen, die natürlicherweise keine Pyruvatcarboxylase aufweisen, bzw. nach Verstärkung einer vorhandenen pyc- Gensequenz, in verbesserter Weise aromatische Aminosäuren sowie Metabolite des aromatischen Biosyntheseweges produziert werden konnten.
- Im Rahmen der Erfindung werden im folgenden alle Gensequenzen, die für eine Pyruvatcarboxylase codieren unter der Bezeichnung "pyc-Gensequenz" zusammengefaßt.
- Unter dem Begriff "Einbringen" sollen im Rahmen dieser Erfindung also alle Verfahrensschritte verstanden werden, die dazu führen, daß in Mikroorganismen, die keine pyc-Gensequenz aufweisen, eine pyc-Gensequenz eingefügt wird. Weiterhin kann unter dem Begriff "Einbringen" aber auch eine Verstärkung einer bereits vorhandenen pyc-Gensequenz verstanden werden.
- Eine Reihe verschiedener Nachweismethoden sind für die Enzymaktivität von Pyruvatcarboxylasen beschrieben. Das Testprinzip ist der Nachweis des aus Pyruvat gebildeten Oxalacetats. Das Enzym Pyruvatcarboxylase katalysiert die Carboxylierung von Pyruvat und bildet dabei Oxalacetat. Die Aktivität einer Pyruvatcarboxylase ist abhängig von Biotin als prosthetischer Gruppe am Enzym und außerdem abhängig von ATP und Magnesiumionen. Im ersten Reaktionsschritt wird ATP in ADP und anorganisches Phosphat gespalten. Dabei wird der Enzym- Biotinkomplex durch Hydrogencarbonat carboxyliert. Im zweiten Schritt wird die Carboxylgruppe vom Enzym- Biotinkomplex auf Pyruvat übertragen. Dabei wird Oxalacetat gebildet.
- Die Pyruvatcarboxylase von Brevibacterium lactofermentum läßt sich beispielsweise in durch Ultraschallbehandlung erhaltenen Rohextrakten nachweisen, indem gekoppelte Enzymtests mit Malatdehydrogenase oder Citratsynthase durchgeführt werden, die jeweils als Nachweis für das gebildete Oxalacetat dienen (Tosaka et al. Agric. Biol. Chem. 43 (1979) 1513-1519).
- Die Pyruvatcarboxylase aus Methanococcus jannaschii wurde durch eine Kopplung mit Malatdehydrogenase nachgewiesen (Mukhopadhyay et al. Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414).
- In Zellen von Corynebacterium glutamicum, die durch Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) permeabilisiert worden waren, wurde die Pyruvatcarboxylase-Aktivität in einem diskontinuierlichen Verfahren durch Kopplung an eine Glutamat-Oxalacetat-Transaminase nachgewiesen (Peters-Wendisch et al. Microbiology 143 (1997) 1095-1103).
- Ebenfalls in durch CTAB permeabilisierten Zellen von C. glutamicum verwendeten Uy et al. (Journal of Microbiological Methods 39 (1999) 91-96) ein diskontinuierliches Verfahren mit Bestimmung der restlichen Pyruvatkonzentration durch Lactatdehydrogenase und fluorometrische Bestimmung der Umsetzung von Pyruvat und NADH zu Laktat und NAD.
- In rekombinanten E. coli-Zellen, die die pyc-Gensequenz aus Rhizobium etli exprimierten, wurde die Pyruvatcarboxylase-Aktivität in Rohextrakten durch Kopplung mit dem Enzym Citratsynthase und spektrophotometrischem CoenzymA-Nachweis bei 412 nm durch Bildung von Thionitrobenzoat bestimmt (Gokarn et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 (2001)188-195; Payne & Morris J. Gen. Microbiol. 59 (1969) 97-101).
- Die Aktivität der menschlichen Pyruvatcarboxylase und der rekombinanten Hefe-Pyruvatcarboxylase wurde durch die Fixierung radioaktiv markierten 14C-Carbonats nachgewiesen (Jitrapakdee et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266 (1999) 512-517; Irani et al. Biotechnol. Bioengin. 66 (1999) 238-246).
- Durch die Verstärkung der Pyruvatcarboxylase-Aktivität bzw. die erstmalige Bereitstellung der Pyruvatcarboxylase in Mikroorganismen, wird vermutlich eine erhöhte intrazelluläre Verfügbarkeit von Phosphoenolpyruvat (PEP) bewirkt, so daß dieses nicht mehr für anaplerotische Reaktionen verbraucht wird. Dies kann dann zu einer verbesserten mikrobiellen Synthese von Substanzen führen, die von PEP abgeleitet werden, insbesondere aromatischen Aminosäuren sowie anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges. Wie von den Erfindern gezeigt werden konnte, wurde durch das Einbringen einer pyc-Gensequenz in Mikroorganismen eine verbesserte mikrobielle Synthese von Substanzen bewirkt, die vom PEP abgeleitet werden. Insbesondere DAHP bzw. sein Abbauprodukt, DAH, wurde in verstärktem Maße im Kulturüberstand wiedergefunden, wenn der zweite Schritt des Aromatenbiosyntheseweges durch eine Mutation des aroB-Gens blockiert ist. DAHP, welches durch Kondensation von PEP und Ery4P synthetisiert wird, bildet die Ausgangssubstanz für aromatische Aminosäuren sowie andere Metabolite des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges. DAHP bzw. DAH werden in der Literatur als Anzeichen für eine verstärkte PEP-Verfügbarkeit diskutiert (Frost und Draths Annual Rev. Microbiol. 49 (1995), 557-579; Flores et al. Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623; Bongaerts et al. Metabolic Engineering 3 (2001) 289-300)
- Der Begriff "Verstärkung" der pyc-Gensequenz beschreibt im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung die Erhöhung der Aktivität der Pyruvatcarboxylase. Zu diesem Zweck können beispielhaft folgende Maßnahmen genannt werden:
- - Einführung der pyc-Gensequenz z. B. mittels Vektoren oder temperenter Phagen;
- - Erhöhung der für die Pyruvatcarboxylase (pyc- Gensequenz) codierenden Genkopienzahl z. B. mittels Plasmiden mit dem Ziel die pyc-Gensequenz in erhöhter Kopienzahl, von leicht (z. B. 2- bis 5-fach) bis zu stark erhöhter Kopienzahl (z. B. 15- bis 50- fach), in den Mikroorganismus einzubringen;
- - Erhöhung der Genexpression der pyc-Gensequenz z. B. durch Steigerung der Transkriptionsrate z. B. durch Verwendung von Promotorelementen wie z. B. Ptac, Ptet oder anderen regulatorischen Nucleotidsequenzen und/oder durch Steigerung der Translationsrate z. B. durch Verwendung einer Konsensusribosomenbindungsstelle;
- - Zusatz von Biotin zum Fermentationsmedium, um die Zellen besser mit der für die Pyruvatcarboxylase essentiellen prosthetischen Gruppe Biotin zu versorgen oder Verstärkung vorhandener Enzyme, die zur Biotin-Biosynthese befähigt sind bzw. Einführung dieser Enzyme in den Mikroorganismus.
- Durch die Verwendung von induzierbaren Promotorelementen, z. B. laclq/Ptac, besteht die Möglichkeit der Zuschaltung neuer Funktionen (Induktion der Enzymsynthese), z. B. durch Zugabe von chemischen Induktoren wie Isopropylthiogalactosid (IPTG).
- Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der pyc- Gensequenz durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Auch die Zugabe essentieller Wuchsstoffe zum Fermentationsmedium kann eine verbesserte Produktion der Substanzen in Sinne der Erfindung bewirken.
- Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenso die Expression verbessert. Weiterhin wird auch durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins die Enzymaktivität verstärkt. Erhöhung der endogenen Aktivität einer vorhandenen Pyruvatcarboxylase (z. B. in Bacillus subtilis oder Corynebakterien) z. B. durch Mutationen, die nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder mutationsauslösende Chemikalien, oder durch Mutationen, die gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nucleotidaustausch(e) erzeugt werden. Auch Kombinationen der genannten und weiteren, analogen Methoden können zur Erhöhung der Pyruvatcarboxylaseaktivität eingesetzt werden.
- Bevorzugt erfolgt das Einbringen der pyc-Gensequenz dadurch, daß eine Integration der pyc-Gensequenz in eine Genstruktur oder in mehrere Genstrukturen erfolgt, wobei die pyc-Gensequenz als einzelne Kopie oder in erhöhter Kopienzahl in die Genstruktur eingebracht wird.
- Als "Genstruktur" ist jedes Gen oder jede Nucleotidsequenz zu verstehen, welche eine pyc-Gensequenz trägt. Entsprechende Nucleotidsequenzen können beispielsweise Plasmide, Vektoren, Chromosomen, Phagen oder andere, nicht zirkulär geschlossene, Nucleotidsequenzen sein. Beispielsweise kann die pyc-Gensequenz auf einem Vektor in die Zelle eingebracht werden oder in ein Chromosom inseriert werden oder durch einen Phagen in die Zelle eingebracht werden. Andere Kombinationen von Genverteilungen sollen durch diese Beispiele nicht von der Erfindung ausgeschlossen werden. Für den Fall, daß bereits eine pyc-Gensequenz vorhanden ist, sollte die Anzahl der in der Genstrukur enthaltenen pyc-Gensequenzen die natürliche Anzahl übersteigen.
- Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete pyc- Gensequenz kann z. B. aus Rhizobium (Gokarn et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 (2001) 188-195), Brevibacterium, Bacillus, Mycobacterium (Mukhopadhyay und Purwantini Biochimica et Biophysica Acta 1475 (2000) 191-206), Methanococcus (Mukhopadhyay et al. Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414), Saccharomyces cerevisiae (Irani et al. Biotechnology and Bioengineering 66 (1999) 238-246) Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Campylobacter oder Methanococcus jannaschii (Mukhopadhyay et al. Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414) stammen. Vorteilhaft hat sich eine pyc-Gensequenz aus Corynebacterium-Stämmen, insbesondere aus Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch et al. Microbiology 144 (1998) 915-927; Peters-Wendisch et al. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3 (2001) 295-300), erwiesen. Ebenso geeignet sind Gene für Pyruvatcarboxylasen aus anderen Organismen.
- Der Fachmann weiß, daß weitere pyc-Gensequenzen aus allgemein zugänglichen Datenbanken identifizierbar sind (wie z. B. EMBL, NCBI, ERGO) und durch Techniken der Genklonierung, z. B. unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion PCR aus solchen anderen Organismen klonierbar sind.
- Für das erfindungsgemäße Verfahren werden Mikroorganismen eingesetzt, in die in replizierbarer Form eine pyc- Gensequenz eingebracht wurde.
- Als Mikroorganismen für die Transformation mit einer pyc-Gensequenz eignen sich Organismen aus der Familie der Enterobacteriaceae wie z. B. Escherichia-Arten, sowie aber auch Mikroorganismen der Gattungen Serratia, Bacillus, Corynebacterium oder Brevibacterium und weitere aus klassischen Aminosäureverfahren bekannte Stämme. Besonders geeignet ist Escherichia coli.
- Bei der DSMZ wurde gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages am 22.03.2002 der folgende Stamm hinterlegt: Escherichia coli K-12 LJ110 aroB/pF36 unter der Nummer DSM 14881.
- Die Transformation der Mikroorganismen bzw. Wirtszellen kann durch chemische Methoden (Hanahan D, J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580), sowie auch durch Elektroporation, Konjugation, Transduktion oder durch Subklonierung aus in der Literatur bekannten Plasmidstrukturen erfolgen. Im Falle z. B. der Klonierung der Pyruvatcarboxylase aus Corynebacterium glutamicum eignet sich beispielsweise die Methode der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur gerichteten Amplifikation der pyc-Gensequenz mit chromosomaler DNS aus Corynebacterium glutamicum Stämmen.
- Es ist vorteilhaft für die Transformation Mikroorganismen einzusetzen, in denen ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich an der Synthese der aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind. Insbesondere werden transformierte Zellen verwendet, die in der Lage sind, eine aromatische Aminosäure zu produzieren, wobei die aromatische Aminosäure vorzugsweise L-Phenylalanin ist.
- In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können in Mikroorganismen mit einer pyc-Gensequenz die Gene, die für Enzyme codieren, die mit der Pyruvatcarboxylase um PEP konkurrieren, wie z. B. die PEP-Carboxylase, das PEP abhängige Zuckerphosphotransferasesystem (PTS) oder Pyruvatkinasen, einzeln oder im Verbund in ihrer Expression erniedrigt bzw. inaktiviert oder völlig ausgeschaltet werden und diese Mikroorganismen eingesetzt werden. So kann die Bereitstellung von PEP für die Synthese aromatischer Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges weiter verbessert werden und damit die Herstellung dieser Verbindungen verbessert werden.
- Diese vorteilhafte Ausführungsform schließt auch ein, daß die Aktivität eines Transportproteins zur PEP unabhängigen Aufnahme von Glucose in Mikroorganismen mit einem PEP-abhängigen Transportsystem für Glucose, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, erhöht wird. Die zusätzliche Integration eines PEP unabhängigen Transportsystems erlaubt eine erhöhte Bereitstellung von Glucose in dem die Substanzen produzierenden Mikroorganismus. PEP als Energie-Donor wird für diese Umsetzungen nicht benötigt und steht damit, ausgehend von einem konstanten Stofffluß in der Glykolyse und dem Pentosephosphatweg, vermehrt für die Kondensation mit Erythrose-4-Phosphat (Ery-4-P) zum primären Metaboliten des allgemeinen Biosyntheseweges für aromatische Verbindungen wie z. B. Desoxy-D-arabino- heptulosonat-7-phosphat (DAHP) zur Verfügung und in der Folge für die Produktion von beispielsweise aromatischen Aminosäuren, wie z. B. L-Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan.
- Die vorteilhafte Verwendung eines PEP unabhängigen Zuckertransportsystems, eines Glucosefacilitator-Proteins (Glf) sowie der Gene für Transketolase, Transaldolase und Glucokinase wurde bereits in früheren Patentanmeldungen gezeigt (DE 196 44 566.3, DE 196 44 567.1, DE 198 18 541 A1; US 6,316,232)
- Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion von Substanzen können in einer bevorzugten Ausführung Mikroorganismen eingesetzt werden, in denen ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich an der Synthese der Substanzen beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind. Dies sind insbesondere die Enzyme des aromatischen Aminosäurestoffwechsels und vor allem die DAHP-Synthase (z. B. in E. coli AroF oder AroH), die Shikimatkinase und die Chorismatmutase/Prephenatdehydratase (PheA). Auch alle anderen Enzyme, die an der Synthese aromatischer Aminosäuren bzw. Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosynthesewegs und deren Folgeprodukten beteiligt sind können verwendet werden.
- Für die Herstellung von Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges und deren Derivaten wie beispielsweise Adipinsäure, Gallensäure und Chinonverbindungen, sowie deren Derivate hat sich neben der pyc- Gensequenz besonders die deregulierte und überexprimierte DAHP-Synthase als geeignet erwiesen. Zur erhöhten Synthese von beispielsweise L-Tryptophan, L-Tyrosin, Indigo, Derivaten von Hydroxy- und Aminobenzoesäure und Naphtho- und Anthroquinonen, sowie deren Folgeprodukte sollten zusätzlich die Shikimatkinase dereguliert und in ihrer Aktivität erhöht werden. Für eine effiziente Produktion von Phenylalanin, Phenylbrenztraubensäure und deren Derivaten ist zusätzlich eine deregulierte und überexprimierte Chorismatmutase/- Prephenatdehydratase von besonderer Bedeutung. Jedoch sollen damit auch alle anderen Enzyme umfaßt sein, deren Aktivitäten zur mikrobiellen Synthese von anderen Metaboliten als die aus dem aromatischen Aminosäurebiosyntheseweg beitragen, das heißt Verbindungen deren Produktion durch die Bereitstellung von PEP begünstigt wird, z. B. CMP-Ketodesoxyoctulosonsäure, UDP-N-Acetylmuraminsäure, oder N-Acetyl-Neuraminsäure. Die vermehrte Bereitstellung von PEP kann sich dabei nicht nur positiv auf die Synthese von DAHP auswirken, sondern kann auch die Einführung einer Pyruvat-Gruppe bei der Synthese von 3-Enolpyruvoylshikimat-5-phosphat als Vorläufer von Chorismat begünstigen. Für die Herstellung von Indigo, Adipinsäure, Cyclohexadientransdiolen und anderen nicht natürlichen Folgeprodukten sind neben den erfindungsgemäßen Verfahrensmerkmalen weitere genetische Veränderungen an den Substanzen produzierenden Mikroorganismen notwendig.
- Im folgenden sollen die verwendeten Materialien und Methoden angegeben, sowie die Erfindung durch experimentelle Beispiele und Vergleichsbeispiele erläutert werden:
- Fig. 1 zeigt die Verknüpfungen zwischen dem Zentralstoffwechsel und dem aromatischen Aminosäurebiosyntheseweg von Bakterien unter Hervorhebung der Reaktionen des Phosphoenolpyruvats und Pyruvats.
Reaktion 1 bezeichnet die Pyruvatcarboxylase-Reaktion,
Reaktion 2 die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase Reaktion
und Reaktion 3 das PEP abhängige Zuckerphosphotransferase-System (PTS).
CHD = Cyclohexadiencarboxylattransdiole
DAHP = 3-Desoxy-Arabino-Heptulosonat-7-Phosphat
DAH = 3-Desoxy-Arabino-Heptulosonat
DHAP = Dihydroxyacetonphosphat
2,3-DHB = 2,3-Dihydroxybenzoat
EPSP = Enol-Pyruvoyl-Shikimat-Phosphat
GA3-P = Glyceraldehyd-3-Phosphat
pABA = para-Aminobenzoat
PEP = Phosphoenolpyruvat - Fig. 2 zeigt beispielhaft experimentelle Daten des Pyruvatcarboxylase-Aktivitätsnachweises. Dabei gibt die Abszisse X die Zeit in Sekunden wieder und die Ordinate Y die Extinktion bei einer Wellenlänge von 412 nm. Die durch schwarz ausgefüllte Rauten dargestellten Meßpunkte sind Ergebnisse, die mit E. coli Zellen, die mit einem pyc-Vektor transformiert wurden, erhalten wurden. Die mit einem nicht ausgefüllten Quadrat dargestellten Meßpunkte, geben die Ergebnisse der E. coli Zellen wieder, die mit einem Leervektor ohne pyc-Gensequenz transformiert wurden. Die grau durchgezogene Linie gibt die Regressionsgerade wieder. Tab. 1 Verwendete Plasmide und Bakterienstämme
- Die erste Klonierung der pyc-Gensequenz aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ist beschrieben unter Peters-Wendisch et al. Microbiology 144 (1998) 915-927. Die Subklonierung der pyc-Gensequenz in den Expressionsvektor pVWEx1-pyc ist beschrieben in Peters-Wendisch et al. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3 (2001) 295-300. Aus dem Vektor pVWEx1-pyc wurde durch Restriktion mit den Enzymen SphI und HindIII ein 3,7 kb DNA-Fragment mit der pyc-Gensequenz aus C. glutamicum erhalten. Dieses 3.7 kb Fragment wurde mit dem Vektor pACYCPtac (SphI plus Hind III-restringiert) ligiert. Die Transformation erfolgte in den E. coli-Stamm DH5α. Die Selektion erfolgte auf LB-Platten mit Chloramphenicol (25 mg/l). Plasmide mit dem korrekten Insert wurden als pF36 bezeichnet.
- Die Einführung von Defektmutationen in der Biosynthese aromatischer Aminosäuren erfolgte durch P1-vermittelte Transduktion. Die Defekte für die beiden Shikimatkinasen (aroL und aroK) wurden durch nacheinander erfolgende P1-Transduktion aus dem Stamm DV80 (aroK::kan, aroL::Tn10, Vinella et al. Journal of Bacteriology 178 (1996) 3818-3828) erzeugt. Dazu wurde der Wildtyp-Stamm E. coli K-12 LJ110 zuerst auf Kanamycinresistenz selektioniert (Erhalt des aroK::Kan-Markers). In einer zweiten P1-Transduktion erfolgte dann Selektion auf den Erhalt des Tetrazyklin-Resistenzmarkers (Erhalt des aroL::Tn10-Markers). Zellen, die beide Resistenzen aufwiesen, wurden anschließend auf Auxotrophie für die aromatischen Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L- Tryptophan (je 40 mg/l) und auf Auxotrophie für p- Aminobenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure und 2,3-Dihydroxybenzoesäure (je 20 mg/l) überprüft. Mutanten mit einem Defekt in aroB wurden erhalten, in dem eine P1-Transduktion aus dem Donorstamm AB2847 rpe::Km aroB in den Stamm LJ110 erfolgte. Im ersten Schritt wurde dabei auf Kanamycin-Resistenz selektioniert. Bakterien, die außerdem auxotroph für aromatische Aminosäuren und für Shikimat waren (aroB-negativ) wurden weiter verwendet. In einer zweiten P1-Transduktion (mit einem P1-Lysat aus dem Wildtypstamm LJ110) wurde auf Verwertung von Pentose-Zuckern auf Minimalmedium selektioniert. Der rpe::Km-Defekt führt zu pentose-negativem Phänotyp, Erhalt von rpe führt zu Pentoseverwertung. Zellen, die pentose-positiv wurden, aber aromatenauxotroph blieben (aroB) wurden als LJ110 aroB weiter verwendet (Marco Krämer, Dissertation, Universität Düsseldorf, 1999, S. 34).
- Der Stamm LJ110 Δppc wurde durch die cross-over-PCR- Methode von Link et al. (Link et al. J. Bacteriol. 179 (1997) 6228-6237) hergestellt. Die zur PCR- Amplifikation verwendeten Oligonukleotidprimerpaare waren: Aussenprimer Nin 5'GTTATAAATTTGGAGTGTGAAGGTTATTGCGTGCATATTACCCCAGACACCCC ATCTTATCG 3' (Seq. ID. No. 1) und Innenprimer Nout 5'TTGGGCCCGGGCTCAATTAATCAGGCTCATC 3' (Seq. ID. No. 2) für den 5'Bereich vor dem ppc-Gen. Sowie für den 3'Bereich hinter dem ppc-Gen: Aussenprimer Cout 5'GAGGCCCGGGTATCCAACGTTTTCTCAAACG 3' (Seq. ID. No. 3) und Innenprimer Cin 5'CACGCAATAACCTTCACACTCCAAATTTATAACTAATCTTCCTCTTCTGCAAA CCCTCGTGC 3' (Seq. ID. No 4). Das durch PCR erzeugte DNA-Fragment enthielt eigens eingefügte Schnittstellen für das Restriktionsenzym XmaCI. Durch Klonierung in die XmaCI-Stelle des Vektors pKO3 wurde eine in-frame- Deletion des ppc-Gens erzeugt und dann über die beschriebene Methode (Link et al. J. Bacteriol. 179 (1997) 6228-6237) in den Stamm LJ110 eingeführt. Nach Selektion auf Saccharoseresistenz wurden Stämme erhalten, die auxotroph für die Zugabe von C4-Substraten wie Succinat oder Malat sind. Die korrekte chromosomale Deletion (Δppc) wurde durch PCR mit chromosomaler DNS aus diesen Mutanten bestätigt. Die korrekten Mutanten wurden als LJ110 Δppc bezeichnet.
- Im folgenden ist beispielhaft die Durchführung des enzymatischen Pyruvatcarboxylase-Tests in rekombinanten Escherichia coli-Zellen beschrieben.
- Zellen von Escherichia coli LJ110 Δppc, die entweder mit dem Leervektor (Kontrollvektor ohne pyc-Gensequenz) pACYCtac oder mit dem pyc-enthaltenden Vektor pF36 transformiert worden waren, wurden in einem Minimalmedium (s. Vorkulturmedium Tab. 2) mit 0.5% Glucose und Chloramphenicol (25 mg/l) angezogen. Dem Medium wurde Biotin (200 µg/l) zugesetzt, um das Biotin-Bedürfnis der Pyruvatcarboxylase zu erfüllen. Da die Zellen einen PEP-Carboxylase-Defekt haben, wurde dem Minimalmedium 0.5 g/l Natrium-Succinat zugesetzt. Die Kulturen wurden in Schüttelkolben (500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml Füllvolumen) bei 37°C 6 Stunden auf einem Rundschüttler (200 Umdrehungen pro Minute) inkubiert, bis sie eine optische Dichte bei 600 nm (OD600)von 1 bis 1,5 erreicht hatten (spät-exponentielle Wachstumsphase). Zur Induktion der Pyruvatcarboxylase wurde den Kulturmedien IPTG zu einer Endkonzentration von 100 µM zugesetzt. Nach Erreichen der angegeben optischen Dichte wurden die Kulturen durch Zentrifugation geerntet. Die so erhaltenen Sedimente wurden zweimal mit 100 mM TrisHCl-Puffer (pH 7.4) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen im gleichen Puffer resuspendiert und es wurde eine Zellkonzentration eingestellt, die eine OD600 von 5 in 1 ml Puffer aufwies. Derartige Proben wurden mit 10 µl Toluol/ml versetzt und 1 Minute lang auf einem Vortex- Apparat gemischt. Anschließend erfolgte Inkubation bei 4°C (auf Eis) für 10 Minuten. Dadurch wurden die Zellen permeabilisiert. Für den anschließenden Pyruvatcarboxylase-Test wurden die Zellen in 100 µL-Aliquots eingesetzt.
- Das Testprinzip ist der Nachweis des aus Pyruvat und Hydrogencarbonat gebildeten Oxalacetats (OAA) über eine Kopplung mit dem Hilfsenzym Citratsynthase und Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) nach folgenden Reaktionen:
Pyruvat + HCO3 - + ATP → OAA + ADP + Pi (1)
OAA + Acetyl-CoA → Citrat + HS-CoA- (2)
HS-CoA + DTNB → CoA-Derivat + TNB2- (3)
OAA = Oxalacetat
DTNB = Dithionitrobenzoesäure
TNB2- = 5-Thio-2-Nitrobenzoat
CoA-Derivat = gemischtes Disulfid aus CoA und Thionitrobenzoesäure - Pyruvat wird durch die Pyruvatcarboxylase Pyc unter ATP-Hydrolyse zum Oxalacetat (OAA) umgesetzt (1). Das gebildete OAA wird mit Acetyl-CoA über die Citratsynthase-Reaktion (2) zu Citrat und CoenzymA (HS-CoA) umgesetzt. Der Pyc-Aktivitätsnachweis beruht auf der Reaktion (3) des freiwerdenden CoenzymA (HS-CoA) mit Dithionitrobenzoesäure zu einem gemischten Disulfid von CoA und Thionitrobenzoesäure sowie einem molaren Äquivalent an gelbgefärbtem 5-Thio-2-Nitrobenzoat (TNB2-). Dieses hat einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13,6 mM-1 cm-1 und kann photometrisch bei einer Wellenlänge von 412 nm nachgewiesen werden. Die Bildungsrate von TNB2- korreliert direkt mit der Acetylierung von OAA und somit mit dem Umsatz von Pyruvat zu OAA durch Pyruvatcarboxylase.
- Der Testansatz enthielt in 1 mL:
NaHCO3 (25 mM), MgCl2 (1 mM), Acetyl-CoA (0,2 mM), DTNB (0,2 mM), ATP (4 mM), Citratsynthase (1 U = 1 Einheit), Zellsuspension (0,5 OD600), Testpuffer (100 mM Tris-HCl pH 7,3). Die Ansätze wurden in einem 2 mL Eppendorf- Reaktionsgefäß für 2 Minuten auf 25°C vorgewärmt. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe von Pyruvat (5 mM). - Zum Stoppen der Reaktion zu den entsprechenden Zeitpunkten wurden die Reaktionsgefäße in flüssigen Stickstoff überführt und während des Auftauprozesses wurde die Biomasse durch Zentrifugation bei 4°C und 15.300 rpm abgetrennt. In den klaren Überständen wurde die Extinktion bei 412 nm photometrisch bestimmt. Als Referenz dienten Ansätze ohne Pyruvat.
- Aus den in Fig. 2 gezeigten Daten ergibt sich eine Extinktionszunahme [E412] von 0,029 pro Minute und somit eine absolute Pyruvatcarboxylaseaktivität von 210 mU/mL.
- Bezogen auf die eingesetzte Zellzahl von OD600 = 0,5 ergibt sich daraus eine spezifische Pyc-Aktivität von 42 mU/OD600. In den Kontrollen wurde keine Pyc- Aktivität festgestellt.
- Als erster Metabolit für den Aromatenbiosyntheseweg kann durch eine aroB-Mutation die Anhäufung von DAH (Abbauprodukt von DAHP) nachgewiesen werden. Es wurden die Stämme E. coli K-12 LJ110 aroB/pF36 (= DSM14881, "PYC") und der Kontrollstamm E. coli K-12 LJ110 aroB/pACYCtac (Leervektor, "LV") verwendet. Die Durchführung erfolgte in 6 parallel geschalteten Sixfors Vario-Laborfermenter (2 Liter) mit einem Füllvolumen von 1,5 L.
- Die Untersuchungen wurden mit folgenden Medienzusammensetzungen und unter folgenden Fermentationsbedingungen durchgeführt: Medien Tab. 2 Vorkulturmedium
Tab. 3 Fermentationsmedium
Feedmedium Glucose: 454 g/L -
- - Fedbatch (6-fach Parallelansatz im gerührten und begasten Bioreaktor "Sixfors-Vario" der Firma Infors, mit Abgasanalytik der Firma Rosemount)
- - Dauer: 30 h
- - Temperatur [°C]: 37 (geregelt)
- - pH: 6,5 (geregelt)
- - pO2: 30% (geregelt)
- - Titrationsmittel: 25% NH3
- - Induktionsmittel: IPTG (100 µmol/L), wird vorgelegt
- - Anfangsvolumen: 1,5 L
- - Startbedingungen:
- - Rührerdrehzahl: 500 rpm, Flussrate 0,5 L/min
- - In der Anwachsphase stufenweises Erhöhen der Rührerdrehzahl und der Flussrate (max. 1,5 L/min), bei Erreichen von 900 bis 1000 rpm Einschalten der pO2- Regelung über die Rührerdrehzahl
- - Probenahme alle 2 Stunden (Bestimmung von: OD620, Glucosekonzentration mittels "Accutrend" der Firma Roche, pH-offline, Biotrockenmasse BTM), Aufbewahrung von Fermentationsüberstand und Pellet, (Kontrolle der Plasmidstabilität über die gesamte Prozesszeit).
- - Startkonzentration Glucose im Fermenter: 13,64 g/L, keine Regelung der Glucosekonzentration im Fermenter, sondern offline-Ermittlung und entsprechender Start des Dosiersystems Fedbatch-Pro der Firma DASGIP, Jülich bei Restmenge von ca. 4 g/L und manuelle Anpassung der Dosierrate, so dass 5 g/L möglichst nicht überschritten wird.
- - Prozessdatenerfassung über LabView (National Instruments)
- - Stämme:
E. coli K-12 LJ110 aroB/pF36 ("PYC")
E. coli K-12 LJ110 aroB/pACYCtac ("LV") - Die folgende Tabelle 4 gibt die Ergebnisse der Fermentationen wieder.
- Ausbeuten (bezogen auf die verbrauchte Glucose;
[mol Produkt/mol Glucose])der Stämme:
LJ110 aroB-/pF36 (Pyc-Stamm) und
LJ110 aroB-/pACYCtac (Kontrolle mit Leervektor)
- Aus den Fermentationsergebnissen wird erkennbar, daß durch das Einbringen der pyc-Gensequenz in E. coli eine deutliche Zunahme der Ausbeute an DAH zu verzeichnen war. Die mit der pyc-Gensequenz transformierten Organismen wiesen eine mindestens 2,5-fache Steigerung der Ausbeute von DAH gegenüber den Kontrollorganismen auf, die mit dem Leervektor (Kontrollvektor ohne pyc- Gensequenz) transformiert wurden bzw. deren Pyruvatcarboxylase nicht durch die Zugabe von IPTG induziert wurde. SEQUENZPROTOKOLL
Claims (21)
1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von
aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des
aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges,
gekennzeichnet durch,
Einbringen einer pyc-Gensequenz in einen
Mikroorganismus und Verwendung dieses Mikroorganismus.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die pyc-Gensequenz in einem Mikroorganismus
verstärkt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Kopienzahl der pyc-Gensequenz in einem
Mikroorganismus erhöht wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Genexpression der pyc-Gensequenz in einem
Mikroorganismus erhöht wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine pyc-Gensequenz verwendet wird, die aus
einem Organismus aus der Gruppe der Corynebakterien,
Rhizobien, Brevibacterien, Bacillus, Mycobakterien,
Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Campylobacter,
Methanococcus oder Saccharomyces Stämmen stammt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine pyc-Gensequenz verwendet wird, die aus
Corynebacterium glutamicum stammt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Herstellung Substanzen aus der Gruppe der
aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten
des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges
betrifft.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Herstellung die Substanzen L-Phenylalanin,
L-Tryptophan sowie L-Tyrosin betrifft.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen aus der Gruppe der
Enterobacteriaceae, Serratia Stämme, Bacillus Stämme,
Corynebakterium Stämme sowie Brevibacterium Stämme
eingesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß Escherichia coli eingesetzt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Verfahren eine Fermentation der
Mikroorganismen in einem Medium, enthaltend Komponenten aus
der Gruppe Biotin, IPTG und essentielle
Wuchsstoffe, betrifft.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß die pyc-Gensequenz in Genstrukturen eingebaut
wird, die in Wirtszellen eingebracht sind.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß mindestens ein PEP verbrauchendes Enzym in
einem Mikroorganismus ausgeschaltet oder inaktiviert
wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
daß mindestens ein Enzym aus der Gruppe PEP-
Carboxylasen, PEP abhängige
Zuckerphosphotransferasen (PTS) sowie Pyruvatkinasen in einem
Mikroorganismen ausgeschaltet oder inaktiviert wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein PEP unabhängiges Transportsystem für die
Glucoseaufnahme in einen Mikroorganismus
eingebracht wird und dieser Mikroorganismus verwendet
wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein Glucosefacilitator-Protein (Glf) in einen
Mikroorganismus eingebracht wird und dieser
Mikroorganismus verwendet wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein Glucosefacilitator-Protein aus Zymomonas
mobilis in einen Mikroorganismus eingebracht wird
und dieser Mikroorganismus verwendet wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
daß Zuckertransportgene in einen Mikroorganismus
eingebracht werden und dieser Mikroorganismus
verwendet wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Transaldolase und/oder Transketolase in
einen Mikroorganismus eingebracht wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Transketolase A und/oder Transketolase B
aus E. coli in einen Mikroorganismus eingebracht
wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Deregulierung und/oder Verstärkung der
Enzyme aus der Gruppe DAHP-Synthase, Shikimatkinase,
Chorismatmutase oder Prephenatdehydratase in einem
Mikroorganismus durchgeführt wird.
Priority Applications (7)
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| US10/513,424 US20060234358A1 (en) | 2002-05-02 | 2003-04-29 | Method for the microbial production of aromatic amino acids and other metabolites of the aromatic amino acid biosynthetic pathway |
| EP03732215A EP1499737A1 (de) | 2002-05-02 | 2003-04-29 | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aromatischen aminosäuren und anderen metaboliten des aromatischen aminosäurebiosyntheseweges |
| PCT/DE2003/001380 WO2003093490A1 (de) | 2002-05-02 | 2003-04-29 | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aromatischen aminosäuren und anderen metaboliten des aromatischen aminosäurebiosyntheseweges |
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| DE10219714A DE10219714A1 (de) | 2002-05-02 | 2002-05-02 | Verfahren zur mikrobielien Herstellung von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges |
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