DE69116495T2 - Rekombinante Transglutaminase - Google Patents

Description

GEBIET DER ERFINDUNG:
• Die Erfindung betrifft ein DNA-Gen, das Transglutaminase codiert, ein Plasmid, worin das Gen eingebaut ist, eine mit dem Plasmid transformierte Transformante, und ein Verfahren zur Herstellung von Transglutaminase, welches das Kultivieren der Transformante umfasst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
• Transglutaminase (im folgenden als "BTG" bezeichnet) ist ein Enzym, das eine Acyl-Transferreaktion einer γ-Carboxyamidgruppe des Glutaminrests in einer Peptidkette katalysiert.
• BTG induziert intramolekulare oder intermolekulare Bildung von einer ε-(γ-Gln)-Lys-Vernetzung, wenn eine ε-Aminogruppe eines Lysinrests in einem Peptidmolekül als ein Acylrezeptor fungiert. Auch wenn Wasser als Acylrezeptor fungiert, beschleunigt dieses Enzym die Umwandlung von Glutaminresten in Glutaminsäurereste durch Deamidierung.
• Aufgrund seiner Wirkung unter Gelierung von Protein wird BTG bei der Herstellung von verdickten Nahrungsmitteln, verdickten Kosmetika, Yoghurt, Gelatine, Käse u.ä. eingesetzt (JP-B-1-50382) . (Der Begriff "JP-B" wie hierin verwendet, bedeutet "geprüfte japanische Patentoffenlegung"). Dieses Enzym wurde auch bei der Herstellung von thermisch stabilen Materialien, wie Mikrokapseln, trägerimmobilisierte Enzyme u.ä. eingesetzt.
• BTG wurde in Tieren gefunden, z.B. in der Leber von Meerschweinchen (Connellan et al, Journal of Biological chemistry. Bd. 246, Nr. 4, S. 1093-1098 (1971)) und in verschiedenen Organen und im Blut von Säugern (Folk et al, Advances in Enzymology, Bd. 38, S. 109-191 (1973); und Folk et al, Advances in Protein Chemistry, Bd. 31, S. 1-133 (1977)), und seine enzymologischen Eigenschaften sind untersucht worden. Zusätzlich wurde ein unterschiedlicher BTG-Typ, der Calcium (Ca²&spplus;)-unabhängig ist und daher von dem BTG aus Tieren verschieden ist, in verschiedenen Stämmen der Gattung Streptoverticillium gefunden. Beispiele dieser Stämme umfassen Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum IFO 12852, Streptoverticillium mobaraense IFO 13819 und andere Arten (siehe JP-A-64-27471) . (Der Begriff "JP-A", wie hier verwendet, bedeutet "ungeprüfte offengelegte japanische Patentanmeldung")
• Da BTG aus Tieren, Mikroorganismen, usw. erhalten wird, gibt es viele Probleme zu lösen, wie die niedrige Produktausbeute, und die hohen Produktionskosten.
• Als Ergebnis intensiver Untersuchungen zur Lösung dieser Probleme aus dem Stand der Technik ist es den Erfindern der vorliegenden Erfindung gelungen, ein DNA-Gen zu isolieren und zu reinigen, das BTG codiert, und seine Basensequenz aufzuklären. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse haben die Erfinder ein Verfahren zur Herstellung von BTG effizient in einer grossen Menge durch Expression eines DNA-Gens in Mikroorganismen, wie Escherichia coli, unter Einsatz gentechnischer Methoden, zur Verfügung gestellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
• Angesichts dessen ist es daher eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein DNA-Fragment, das Transglutaminase codiert, ein Plasmid, in dem das DNA- Fragment eingebaut wird, eine Transformante, die mit dem Plasmid transformiert ist, und ein Verfahren zur Herstellung von Transglutaminase, das die Kultur der Transformante umfasst, bereitzustellen.
• Diese und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung offensichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:
• Die Zeichnung zeigt die Ergebnisse von Western-Blotting, die im folgenden Beispiel 4 erhalten wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
• Erfindungsgemäss wird ein DNA-Fragment zur Verfügung gestellt, das BTG codiert, insbesondere ein DNA-Fragment, das eine Basensequenz enthält, die eine Aminosäuresequenz, wie in der folgenden Tabelle 1 gezeigt, codiert, worin jede Aminosäure durch ihren entsprechenden Einzelbuchstabencode angegeben ist. TABELLE 1
• Dieses DNA-Fragment kann verschiedene alternative Basensequenzen umfassen, wenn die Codondegeneration in Betracht gezogen wird, und diese liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Es ist offensichtlich, dass diese Basensequenzen leicht durch den Fachmann aufgrund vieler Faktoren, die mit dem genetischen Expressionssystem in bezug stehen, wie Wirtszell-abhängige Vorzugscodons u.ä., leicht ausgewählt werden können.
• Als erläuterndes Beispiel für einen solchen Fall ist eine Basensequenz, die geeignet in einem Expressionssystem unter Verwendung von E. coli oder Hefe als Wirtszelle verwendet werden kann, in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2
• Das in obiger Tabelle 1 gezeigte DNA-Fragment kann leicht nach Techniken aus dem Stand der Technik, wie chemische Synthese u.ä., z.B. dem Phosphormidit-Verfahren (M.H. Caruthers, Science, 230, 281 (1985), und Sinha, N.D. et al, Nucleic Acids Res, 12, 4539-4557 (1984)) hergestellt werden.
• Ein weiteres erläuterndes Beispiel für ein DNA-Fragment, das eine für die Aminosäuresequenz, wie in Tabelle 1 gezeigt, codierende Basensequenz enthält, ist das Strukturgen von BTG entsprechend der in Tabelle 1 gezeigten Aminosäuresequenz, das in der folgenden Tabelle 3 gezeigt ist. TABELLE 3
• Das erfindungsgemässe DNA-Fragment ist nicht besonders auf ein DNA-Fragment, das eine Basensequenz enthält, die die Aminosäuresequenz, wie in Tabelle 1 gezeigt. codiert, beschränkt. Die codierte Aminosäuresequenz kann von der in Tabelle 1 gezeigten Sequenz dahingehend verschieden sein, dass ein Teil der Sequenz davon fehlt oder mit einer anderen Aminosäuresequenz ersetzt ist, und/oder dass etwas einer anderen Aminosäuresequenz zugefügt wurde oder in die Sequenz inseriert ist, mit der Massgabe, dass ein Protein mit einer solchen Aminosäuresequenz eine Transglutaminaseaktivität hat oder zu einem reifen Protein prozessiert werden kann, das Transglutaminaseaktivität hat. Daher ist ein DNA-Fragment, das eine für eine solche verschiedene Aminosäuresequenz codierende Basensequenz enthält, ebenfalls vom Umfang der Erfindung eingeschlossen.
• Die Erfindung stellt auch ein DNA-Fragment zur Verfügung, das eine Basensequenz enthält, die für eine Aminosäuresequenz codiert, bei der das 5'-Ende der DNA- Sequenz, die die Aminosäuresequenz der Tabelle 1 codiert, ferner mit einem DNA-Fragment, das die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz, die ein Signalpeptid enthält, wie in der folgenden Tabelle 4 gezeigt, gebunden ist. TABELLE 4
• Ein Beispiel für einen Teil der in Tabelle 4 gezeigten Aminosäuresequenz ist in der folgenden Tabelle 5 angegeben. TABELLE 5
• Die oben beschriebenen DNA-Fragmente können auch verschiedene Basensequenzen auf Grundlage der Codondegeneration umfasst, und sie können nach verschiedenen gut bekannten Methoden, einschliesslich der chemischen Synthese, hergestellt werden.
• Ein Beispiel für eine Basensequenz eines DNA-Fragments, das die Aminosäuresequenz codiert, welche ein Signalpeptid, wie in Tabelle 4 gezeigt, enthält, ist in der folgenden Tabelle 6 gezeigt. TABELLE 6
• Ein Beispiel für eine Basensequenz eines DNA-Fragments, das für die in Tabelle 5 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, ist in der folgenden Tabelle 7 gezeigt: TABELLE 7
• Das erfindungsgemässe DNA-Fragment kann auch durch Klonieren aus einer genomischen DNA-Bank von Actinomyceten unter Verwendung eines DNA-Fragments als Sonde, die unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Technologie (R.F. Saiki et al, Science, 239, 487 (1988) und K.B. Mullis und F.A. Faloona, Methods Enzymol., 155, 335 (1989)) erhalten wird, hergestellt werden. Ein Beispiel einer Basensequenz für ein auf diese Weise erhaltenes DNA- Fragment, das das gesamte oben beschriebene DNA-Fragment enthält, d.h. das Strukturgen von BTG und einem Teil stromaufwärts von seinem 5'-Ende, ist in der folgenden Tabelle 8 gezeigt. TABELLE 8
• Erfindungsgemäss wird ebenfalls ein Vektor zur Verfügung gestellt, der zur Expression und Sekretion von BTG verwendet werden kann.
• Ein solcher Vektor kann unter Verwendung konventioneller Techniken durch Einfügen eines DNA-Fragments, das eine Basensequenz enthält, die die in Tabelle 1 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, in einem bekannten Expressionsvektor, der je nach dem erwünschten Expressionssystem ausgewählt wird, hergestellt werden. Wenn z.B. ein E. coli-Stamm als Wirtszelle verwendet wird, können üblicherweise verwendete Vektoren, wie pTrc99A (Pharmacia); pPROK-C und pKK233-2 (Clontech Co.); und pNH8a, pNH16a, pNH18a, pcDNAII und pAX (Stratagene) zur Konstruktion eines Expressions/Sekretionsvektors gemäss der Erfindung verwendet werden. Zusätzlich kann auch ein Plasmid pIN-III-ompA2 vorzugsweise eingesetzt werden. Ein Plasmid, im folgenden bezeichnet als pOMPA-BTG, ist ein Beispiel eines Expressions/Sekretionsplasmids gemäss der Erfindung, das durch Inserieren des DNA-Fragments gemäss der Erfindung in pIN-III-ompA2 konstruiert wurde.
• Wird ein Actinomycetestamm als Wirtszelle verwendet, können üblicherweise verwendete Vektoren, wie pIJ 41, pSEV 2, pOA 154 und pSCP 111 ebenfalls eingesetzt werden. Zusätzlich kann auch pIJ 702 vorzugsweise verwendet werden. Wird ferner ein Hefestamm als Wirtszelle verwendet, können üblicherweise verwendete Vektoren, wie pAM82, pYG100, YEp52, pAAH5, YCpAD1, pYαEGF-23, YEpl PT-ISIFN-α2, CPOTinsulin und pcD-Y (siehe Jikkenigaku, Bd. 5, Nr. 11, 138 (1987)), etc. eingesetzt werden. Ferner kann auch ein E. coli-Hefe-Shuttlevektor pNJ 1053 ebenfalls vorzugsweise eingesetzt werden. Beispiele des erfindungsgemässen Sekretionsvektors, der durch Einfügen des erfindungsgemässen DNA-Fragments in diese Vektoren konstruiert wurde, sind pIJ702-BTG, pNJ1053-proBTG und pNJ1053-BTG.
• Die Erfindung betrifft auch verschiedene Transformanten, die durch Transformation von Wirtszellen mit dem BTG-Gen tragenden Expressions- und Sekretionsvektor erhalten wurden.
• Wirtszellen, die zur Verwendung fur eine solche Transformation geeignet sind, können aus verschiedenen procaryontischen und eukaryontischen Zellen ausgewählt werden. Als prokaryontischer Wirt können E. coli-Stämme, Bacillus-Stämme, wie B. subtilis, Actinomycetes (insbesondere Streptomyces-Stämme, wie Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces kasugaensis und Streptomyces parvulus) Erwähnung finden. Als eukaryontischer Wirt können Hefen (insbesondere Saccharomyces-Stämme, wie Saccharomyces cerevisiae), andere Pilze, wie Aspergillus-Stämme, usw., Erwähnung finden.
• Ein Beispiel für einen geeigneten E. coli-Stamm ist der JA 221-Stamm (hsdM&spplus;, trpE5, leuB6, lacY, recA/F', lacIq, lac&spplus;, pro&spplus;). Es wurde eine Transformante durch Transformation des E. coli JA 221-Stamms mit dem erfindungsgemässen Expressions- und Sekretionsplasmid pOMPA-BTG erhalten. Diese Transformante, im folgenden als AJ12569 bezeichnet, wurde von den Erfindern am 28. September 1990 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Hinterlegungs-Nr. FERM P-11745 (FERM BP-3558 gemäss Budapester Vertrag) hinterlegt.
• Ein Beispiel für einen geeigneten Actinomyceten-Stamm ist Streptomyces lividans 3131-TS, der aus Streptomyces lividans 3131 als Thiostrepton-empfindlicher Stamm isoliert wurde. Eine Transformante, die durch Transformation von Streptomyces lividans 3131-TS mit dem erfindungsgemässen Expressions- und Sekretionsvektor pIJ702-BTG, bezeichnet als Streptomyces lividans AKW-1, erhalten wurde, wurde von den Erfindern am 30. September 1991 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-3586, gemäss Budapester Vertrag hinterlegt.
• Ein Beispiel für einen geeigneten Hefestamm ist Saccharomyces cerevisiae KSC22-IC (Mata, ss1 1, leu 2, his -, ura 3). Eine Transformante, die durch Transformation von Saccharomyces cerevisiae KSC22-IC mit dem erfindungsgemässen Expressions- und Sekretionsvektor pNJ1053-proBTG erhalten wurde, bezeichnet als Saccharomyces cerevisiae AJ 14669, wurde von den Erfindern am 30. September 1991 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-3585, gemäss Budapester Vertrag hinterlegt.
• Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit BTG-Aktivität zur Verfügung, welches das Kultivieren der obigen Transformante umfasst.
• Die Kulturbedingungen sind nicht strikt limitiert und können daher geeignet durch den Fachmann, je nach Typ der erwünschten Transformante, eingerichtet werden.
• Zum Beispiel können M9 CA&sub5;&sub0;-Medium und M9-Medium, wie unten gezeigt, vorzugsweise zum Kultivieren der E. coli- Transformante verwendet werden. Casaminsäure Glucose L-Tryptophan Thiamin-HCl Ampicillin
• Falls notwendig, kann die Expression des fraglichen Gens durch Zugabe eines Expressionsinduktors, wie IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) zum verwendeten Kulturmedium induziert werden.
• Das so exprimierte Protein kann aus dem Kulturfiltrat, Periplasma oder Cytoplasma der Wirtszellen unter Verwendung verschiedener Mittel aus dem Stand der Technik (siehe Protein Purification - Principles and Practice, Robert K. Scopes, Springer-Verlag, New York (1982); D. Koshland und D. Bostein, Cell, 20, 749 (1980); und R.A. Hitzeman et al, Science, 219, 620 (1983) etc.) isoliert und gereinigt werden.
• Erfindungsgemässe Beispiele werden im folgenden zur Erläuterung angegeben, sollen jedoch nicht als einschränkend für die Erfindung ausgelegt werden. Sofern nicht anders angegeben, sind alle Teile, Prozentangaben, Gewichtsverhältnisse, usw. auf das Gewicht bezogen.
BEISPIEL 1 - Klonieren des BTG-Gens (1) Herstellung der Zellen:
• Ein Actinomycete, Streptoverticillium sp., wurde bei 30ºC 5 Tage im folgenden Medium kultiviert. GP - Medium Glycerin Pepton Hefeextrakte MgSO&sub4; KH&sub2;PO&sub4; Na&sub2;HPO&sub4; Glycin Gew.%
(2) Herstellung von DNA aus Zellen:
• Ein Anteil von 400 ml der oben erhaltenen Kulturbrühe wurde bei 12.000 x g 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, und das erhaltene Pellet (Zellen) wurde in einer Lösung aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA und 50 mM NaCl (im folgenden als "TES" bezeichnet) suspendiert. Die so hergestellte Zellsuspension wurde bei 1100 x g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, und das erhaltene Pellet (Zellen) wurde in 5 ml TES, das mit 2 mg/ml Lysozym (Sigma Chemical Co.) ergänzt wurde, suspendiert. Nach Inkubation der Zellsuspension bei 37ºC für 1 Stunde wurde das erhaltene Lyst rasch in Aceton-Trockeneis eingefroren und dann heftig in 42 ml einer Lösung aus 100 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 % SDS und 100 mM NaCl (im folgenden als "Tris-SDS" bezeichnet) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde bei 60ºC 20 Minuten inkubiert, worauf sofort Einfrieren in Aceton-Trockeneis für 10 Minuten folgte. Nach Re-inkubation bei 60ºC wurde die erhaltene Probe zweimal mit Phenol, das mit Tris-SDS gesättigt worden war, extrahiert. Anschliessend wurden 2 Volumeneinheiten Ethanol zum so erhaltenen Extrakt zugegeben, und die in der Mischungslösung gebildeten DNA- Molekülfilamente wurden durch Aufwinden auf einen Glasstab gewonnen. Die so erhaltenen DNA-Moleküle wurden mit 80 %-igem Ethanol gewaschen, in einem mit einem Belüfter ausgerüsteten Exsiccator getrocknet und dann in 5 ml einer Lösung aus 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA (im folgenden als "TE" bezeichnet) wieder aufgelöst.
• Anschliessend wurde die RNA in der so hergestellten DNA- Probe verdaut und entfernt. Zu diesem Zweck wurde die DNA- Probe in 5 ml TE gelöst und mit 0,5 ml einer Lösung aus 1 mg/ml RNase A (Sigma Chemical Co.) und 2000 E/ml Rnase TI (Boehringer Mannheim Corp.) vermischt. Anschliessend wurde die Mischung 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die inkubierte Probe wurde mit einem TE-gesättigten Phenol/Chloroform-System extrahiert und dann mit Chloroform, und die Wasserschicht, die schliesslich erhalten wurde, mit 1/10 Volumenanteil an 3 M Natriumacetatlösung (pH 5,2) und 2 Volumenteilen Ethanol vermischt. Nach Einstellung bei -80ºC für 30 Minuten wurde die Mischung bei 12.000 x g 15 Minuten bei 4ºC unter Gewinnung eines Pellets zentrifugiert, das dann mit 70 % Ethanol gewaschen und getrocknet wurde. Das so erhaltene DNA-Pellet (ca. 4 mg) wurde in 4 ml TE zur Verwendung in den folgenden Verfahren gelöst.
(3) Herstellung des DNA-Fragments durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion:
• Eine das BTG-Gen enthaltende geeignete DNA-Region wurde unter Verwendung einer PCR-Technik (Saiki, R.F. et al, Science, Bd. 230, S. 1350-1354 (1985); und Mullis, KB. und Faloona, F.A., Methods in Enzymology, Bd. 155, S. 335- 350 (1987)) isoliert und amplifiziert.
(i) Synthese der Primer-DNA für die PCR-Verwendung:
• Obwohl BTG im Stand der Technik bekannt ist, war seine Aminosäuresequenz unbekannt. Die Aminosäuresequenz von BTG wurde zum ersten Mal am Shimonishi Laboratory of Protein Engineering Research Institute, Osaka University, in Zusammenarbeit mit den Erfindern aufgeklärt.
• Es wurde ein DNA-Fragment, basierend auf einer Basensequenz aus einem Teil der aufgeklärten Aminosäuresequenz (von der Position 117 Phenylalanin bis Position 123 Phenylalanin) von BTG synthetisiert. In diesem Fall erfolgte die DNA-Synthese unter Verwendung eines Cyclone Plus DNA-Synthesizers, hergestellt von Milligen Biosearch.
• Das so erhaltene DNA-Fragment wurde als Primer #1 zur Verwendung in der PCR-Synthese bezeichnet, und seine Sequenz ist im folgenden gezeigt. (20 mer, 32 mix, I (Inosin) = 1)
• Ein weiteres DNA-Fragment wurde auf die gleiche Weise hergestellt, beruhend auf einer aus einem Teil der Aminosäuresequenz (von Position 325 Lysin bis Position 331 Prolin) abgeleiteten Basensequenz hergestellt. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde als Primer #2 zur Verwendung in der PCR-Synthese bezeichnet und seine Sequenz ist im folgenden gezeigt: (20 mer, 8 mix, I (Inosin) = 2)
• Jedes der so hergestellten DNA-Fragmente wurde in TE in einer Konzentration von 20 µM gelöst.
(ii) Amplifizierung des DNA-Fragments unter Verwendung von PCR
• Die Amplifizierungsreaktion erfolgte unter Verwendung des GeneAmp DNA-Amplification Reagent Kit mit AmpliTaq (hergestellt von Perkin-Elmer, Japan) und DNA-Thermal Cycler (DNA amplifier, Perkin-Elmer, Japan). Die Zusammensetzung der verwendeten Reaktionslösung ist im folgenden gezeigt. Endkonzentration H&sub2;O [10 x] Reaktionspuffer (GeneAmp DNA-Amplification Reagent Kit mit AmpliTaq ) DNTPs, Mix 1,25 mM Primer #1 von (i) Primer #2 von (i) Matrize (BTG DNA 0,5 µg)* AmpliTaq DNA-Polymerase (gesamt) E/Test * Die in (2) erhaltene DNA wurde in TE auf eine Konzentration von 0,5 µg/10 µl gelöst
• Nach Mischen von 100 µl der obigen Reaktionslösung mit 100 µl Mineralöl (Sigma Chemical Co.) wurde ein Röhrchen, das die erhaltene Mischung enthielt, in den DNA-Thermal Cycler gestellt (DNA amplifier, Perkin-Elmer, Japan), um die Reaktion unter den folgenden Bedingungen fortschreiten zu lassen.
• 95ºC 1 min.
• 37ºC 2 min.
• 72ºC 3 min.
• Die Reaktion wurde für 35 Zyklen unter diesen Bedingungen wiederholt und dann wurde die Endreaktionsmischung bei 72ºC 7 Minuten inkubiert.
(iii) Gewinnung amplifizierter DNA:
• Nach Entfernen des Mineralöls aus der obigen Reaktionsmischung wurde der erhaltene Anteil mit 100 µl Chloroform vermischt und bei 15.000 Upm 2 Minuten unter Verwendung einer Zentrifuge, hergestellt von Tomy Seiko Co., Ltd., unter Gewinnung von 100 µl Überstand zentrifugiert. Unter Verwendung eines 10 ml-Anteils des Überstands wurden die Grösse und die Menge der gewonnenen DNA unter Verwendung von 1,5 %-iger Agarose- Celelektrophorese gemessen. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass ein 645 bp DNA-Fragment auf eine Menge von ca. 2 µg amplifiziert wurde.
• Der übrige 90 µl-Anteil des überstands wurde auf 1,5 % niedrigschmelzender Agarose elektrophoretisiert, um eine Bande entsprechend 645 bp auszuschneiden. Die Bande wurde bei 65ºC aufgelöst und mit dem gleichen Volumen Phenol vermischt. Nach Zentrifugation der Mischung wurde die erhaltene Wasserphase von Phenol/Chloroform und Chloroform in dieser Reihenfolge behandelt. Die so behandelte Wasserphase wurde mit 3 M Natriumacetat auf eine Konzentration von 8 % und dann mit 2 Volumeneinheiten Ethanol vermischt, und die Mischung wurde bei -80ºC für 15 Minuten gehalten. Anschliessend wurde die Mischung bei 15.000 Upm für 10 Minuten bei 4ºC unter Erhalt eines Pellets zentrifugiert, das dann in 20 µl Wasser gelöst wurde. Auf diese Weise wurden ca. 1 µg DNA-Fragmente gewonnen.
(4) Struktur der durch PCR amplifizierten DNA- Fragmente:
• Zur Bestimmung, ob das so durch PCR amplifizierte DNA- Fragment ein Teil des BTG-Gens war, erfolgte eine Direktsequenzierung unter Verwendung von 0,4 µg des DNA- Fragments auf die folgende Weise. In diesem Fall wurde der oben beschriebene Primer #1 als Primer für die Sequenzierung verwendet.
Materialien: (i) Reagenzien für die DNA-Sequenzierung:
• Ein Sequenzierungskit, Sequenase (Version 2.0), hergestellt von USB Corp., USA, wurde zum Sequenzieren verwendet, das im wesentlichen nach dem Dideoxy-Verfahren erfolgte (F. Sanger et al, J. Mol. Biol., 143, 161 (1980))
(ii) Markieren des Primers für die Sequenzierungsverwendung:
• Unter Einsatz eines Anteils von 2 pmol des Primers #1, hergestellt wie zuvor für die PCR-Reaktion beschrieben, wurde dessen 5'-Ende mit [³²P] unter Einsatz von T4-Kinase (Toyobo Co., Ltd.) markiert. In diesem Fall wurde [γ-³²P]- ATP mit einer spezifischen Aktivität von 3000 Ci/mmol verwendet. Freies [γ-³²P]-ATP, das im markierten Primer verblieb, wurde durch Durchleiten des Produkts durch eine geeignete Minisäule (Sephadex G-50 DNA vom Grad "Fein" (Pharmacia)) entfernt.
iii) Reaktionslösung (3,25 µl insgesamt) zur Sequenzierung:
• Unter Einsatz des Sequenase -Kits wurde die folgende Reaktionsmischung in jeweils eines von vier Röhrchen zur Verwendung in der G-, A-, T- und C-Reaktion hergestellt. G-, A-, T-, C-Terminationsmix 5 x Puffer (Sequenase (Version 2.0)) 0,1 M DIT Sequenase (2 Einheiten)
Reaktion:
• (i) Ein 0,4 µg-Anteil der amplifizierten DNA und 2 pmol des [³²-P] -markierten Primers wurden in 12 µl TE gelöst, und die Lösung wurde bei 95ºC 5 Minuten hitzedenaturiert, worauf rasches Abkühlen in einem Eisbad folgte.
• (ii) Unmittelbar nach dem Abkühlen wurde jedes der vier Röhrchen mit 2,8 µl der so in (i) erhaltenen Lösung versetzt und dann mit 3,25 µl der entsprechenden Sequenz- Reaktionslösung (Sequenase (Version 2.0)). Nach Inkubation der so hergestellten Röhrchen bei 37ºC für 10 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 4 µl einer Terminationslösung (Sequenase (Version 2.0)) und Erhitzen auf 75 bis 80ºC für 2 Minuten abgebrochen, und die erhaltenen Proben wurden unter Verwendung eines Sequenziergels elektrophoretisiert.
• Als Ergebnis der Direktsequenzierung wurde eine Basensequenz im DNA-Fragment gefunden, die für einen Teil der Aminosäuresequenz von BTG codiert (von der Position 129 Valin bis zur Position 149 Asparagin). Als Folge nahm man an, dass dieses DNA-Fragment Teil des BTG-Gens war.
(5) Subklonieren des PCR-amplifizierten DNA- Fragments in pUC 19:
• Anschliessend wurde das durch PCR amplifizierte DNA- Fragment in die SmaI-Schnittstelle von pUC 19 subkloniert. Zu diesem Zweck wurden beide Enden des DNA-Fragments unter Verwendung der folgenden Vorschrift mit dem DNA- Glattmachkit (Takara Shuzo Co., Ltd.) glatt gemacht.
• (i) In ein Mikrozentrifugationsröhrchen wurden eine Gesamtmenge von 9 µl der folgenden Reaktionslösung gegeben.
• DNA-Fragment 8 µl (0,4 µg)
• 10 x Puffer 1 µl
• (ii) Zur Vermeidung des Verschmelzens an den DNA- Enden wurde das so praparierte Röhrchen bei 70ºC 5 Minuten inkubiert und dann in einen Inkubator von 37ºC überführt.
• (iii) Ein 1 µl-Anteil T4-DNA-Polymerase wurde in das Röhrchen überführt und der Inhalt im Röhrchen wurde sanft durch Pipettieren vermischt.
• (iv) Die erhaltene Mischung im Röhrchen wurde 5 Minuten bei 37ºC inkubiert.
• (v) Ein DNA-Verdünnungspuffer (DNA Blunting Kit, Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde zu der so inkubierten Mischung auf eine Endkonzentration von 1 µg DNA/so µl zugegeben, und die erhaltene Mischung wurde heftig unter Verwendung eines Vortex-Mischers geschüttelt.
• Das so erhaltene glatt gemachte DNA-Fragment wurde ligiert mit einem SmaI-Verdau von PUC 19, und E. coli DH 5α wurde mit dem erhaltenen Ligat in Gegenwart von 5-Brom-1-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-gal) und Isopropyl-β-D- thiogalactosid (IPTG) transformiert. Es wurde ein Plasmid aus einer Ampicillin-resistenten weissen Kolonie isoliert, in die das PCR-amplifizierte DNA-Fragment in die SmaI- Schnittstelle von pUC 19 eingebaut worden war. Dieses Plasmid wurde als pUC 19 BTG bezeichnet und in den folgenden Verfahren verwendet. In diesem Beispiel erfolgte die Ligation unter Verwendung eines DNA-Ligationskits, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.
• Zur anschliessenden Bestimmung eines noch weiteren Bereichs der Basensequenz des PCR-amplifizierten DNA- Fragments erfolgte die DNA-Sequenzierung unter Verwendung des so erhaltenen Plasmids pUC 19 BTG als Matrize unter Einsatz eines üblichen Verfahrens, bei dem das 7-deaza dGTPλ-Sequenase-Kit von USB Corp. verwendet wurde. Als Ergebnis wurde die Basensequenz, bestehend aus 564 Basen, wie im folgenden in Tabelle 9 gezeigt, ermittelt. TABELLE 9
(6) Herstellung einer DNA-Bank: (6-1) Teilweiser Verdau von chromosomaler DNA von Streptoverticillium sp.:
• (a) Eine Mischung von 24 µg chromosomaler DNA und 60 µl BamHI 10 x Puffer (10 x High Buffer von Toyobo Co., Ltd.) wurde mit sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 594 µl eingestellt.
• (b) Die erhaltene Mischung wurde auf 37ºC 5 Minuten vorerhitzt.
• (c) Die so vorerhitzte Mischung wurde ferner mit 6 µl BamHI (Toyobo Co., Ltd.) vermischt und die erhaltene Mischung wurde 10 Minuten bei 37ºC unter Abschluss der Restriktionsenzym- Reaktion inkubiert.
• (d) Die Reaktion wurde durch Inaktivieren des Restriktionsenzyms unter Erhitzen der Reaktionsmischung auf 65ºC für 15 Minuten abgebrochen.
(6-2) Klonieren (unter Verwendung des EMBL3- Klonierungskits von Stratagene Cloning Systems): (i) Ligation:
• (a) Ein 25 µl-Anteil der wie oben beschrieben erhaltenen, teilweise verdauten DNA wurde einer Ethanolpräzipitation unterworfen, und das erhaltene Präzipitat wurde in 2,5 µl TE gelöst.
• (b) Hierzu wurden 1,0 µl EMBL3-vorverdaute Arme (1 µg/µl), 0,5 µl 10 x Ligationspuffer, 0,5 µl 10 mM ATP (pH 7,5) und 0,5 µl 14 DNA-Ligase (8 Einheiten/µl, Produkt der Boehringer Mannheim Corp.) gegeben. Nach Mischen erfolgte Ligation bei 4ºC über Nacht. In diesem Fall bestand der 10 x Ligationspuffer aus 500 mM Tris-HCl (pH 7,5), 70 mM MgCl&sub2; und 10 mM DTT.
(ii) Verpacken (unter Verwendung von Gigapack II Gold Packaging Extract, hergestellt von Stratagene Cloning Systems):
• (a) Geeignete Anteile des Ultraschall-behandelten Extrakts und eingefrorenen und aufgetauten Lysats des Verpackungs-Kits, das in einem Gefrierschrank (-70ºC) gelagert war, wurden auf Trockeneis gestellt, und man liess den Ultraschall-behandelten Extrakt beginnen zu Schmelzen.
• (b) Das eingefrorene und aufgetaute Lysat wurde erwärmt, bis es zwischen den Fingern zu schmelzen begann.
• (c) Nach Zugabe von 4 µl (1,6 µg auf DNA-Basis) der oben beschriebenen DNA-Lösung wurde das eingefrorene und aufgetaute Lysat auf ein Eisbad gestellt.
• (d) Unmittelbar hierauf wurden 15 µl des Ultraschallbehandelten Extrakts zum DNA-haltigen eingefrorenen und aufgetauten Lysats gegeben.
• (e) Die erhaltene Mischung wurde bis zu einer innigen Mischung ohne Verursachung von Schaum gerührt.
• (f) Die Mischung wurde bei 4000 x g 5 Sekunden unter Präzipitation des gesamten Inhalts der Mischung in dem Röhrchen zentrifugiert.
• (9) Das erhaltene Röhrchen wurde bei Raumtemperatur (22ºC) 2 Stunden inkubiert.
• (h) Hierzu wurden 500 µl eines Phagen- Verdünnungspuffers (hergestellt durch Auflösen von 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO&sub4;, 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5, und 5 ml 2 % Gelatine in 1 l Wasser und anschliessendem Autoklavieren) zugegeben.
• (i) Nach Zugabe von 20 µl Chloroform wurde die erhaltene Probe sanft gemischt.
• (j) Die erhaltene Mischung wurde bei 4000 x g 5 Sekunden und Präzipitation der Zelltrümmer zentrifugiert.
• (k) Der so erhaltene Überstand wurde bei 4ºC gelagert.
(iii) Plattieren:
• (a) E. Coli P2392 wurde in TB-Medium inokuliert, das aus 5 g/l NaCl und 10 g/l Bactotrypton bestand. Der Stamm P2392 hat die folgenden Eigenschaften: hsdR 514 (rk&supmin;, mk&spplus;), supE 44, supF 58, lacY 1 oder Δ (lacIZY), galK 2, galT 22, metB 1, trpR 55, (P2)
• (b) Das so im TB-Medium angeimpfte P2392 wurde bei 37ºC unter Schütteln kultiviert.
• (c) Nachdem die Turbidität bei OD&sub6;&sub0;&sub0; 0,5 erreicht hatte, wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 1100 x g für 15 Minuten bei Raumtemperatur gesammelt und anschliessend in einem geeigneten Volumen von 10 mM MgSO&sub4;- Lösung unter Einstellung der Turbidität der Suspension auf OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,5 suspendiert.
• (d) Die erhaltene Zellsuspension wurde mit einem kleinen Anteil des in (ii)-(k) erhaltenen Überstands vermischt und bei 37ºC 15 Minuten inkubiert.
• (e) Die erhaltene Suspension wurde mit 8 ml Top-Agar vermischt, der geschmolzen und zuvor erwärmt worden war, und die Mischung auf eine NZY-Platte überschichtet.
• Top-Agar: NaCl 5 g/l, MgSO&sub4; H&sub2;O 2 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, NZ-Amin 10 g/l, Agarose 0,7 %
• NZY-Platte: NaCl 5 g/l, MgSO&sub4; H&sub2;O 2 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, NZ-Amin 10 g/l, Agar 15 g/e
• (f) Die erhaltene Platte wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert
• Als Ergebnis wurde eine Bank aus 3,0 x 10&sup4; unabhängigen Klonen erhalten.
(7) Screenen des BTG-Gens:
• Das Klonieren des BTG-Gens erfolgt unter Verwendung der in (6) erhaltenen Bank. Zunächst erfolgte Ausplattieren der Phagen in der Bank auf die gleiche Weise wie in (6) - (iii). Nach über-Nacht-Kultur bei 37ºC erfolgte das Abheben der Phagen aus den so geformten Plaques auf die folgende Weise.
• (a) Jede Platte wurde bei 4ºC für einige Stunden gehalten.
• (b) Ein Nitrocellulosefilter (S & S) wurde auf die Oberfläche der Platte (Oberfläche des Top-Agars) aufgelegt.
• (c) Die so filterabgedeckte Platte wurde wie sie war für 2 Minuten gehalten.
• (d) Der Nitrocellulosefilter wurde von der Platte entfernt und 1 Minute in einer Lösung aus 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl getränkt.
• (e) Der so behandelte Nitrocellulosefilter wurde 5 Minuten in einer Lösung aus 1,5 M NaCl und 1 M Tris-HCl (pH 7,5) getränkt.
• (f) Der erhaltene Nitrocellulosefilter wurde dann 30 Sekunden in 2 x SSC (1 x SSC besteht aus 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat und hat einen pH-Wert von 7,0) getränkt.
• (g) Der so unter Tränken behandelte Nitrocellulosefilter wurde an der Luft auf 3 MM- Filterpapier getrocknet.
• (h) Der so getrocknete Nitrocellulosefilter wurde zwischen 3 MM-Filterpapieren gehalten und bei 80ºC 2 Stunden erhitzt.
• Anschliessend an das auf diese Weise durchgeführte Abheben der Phagen erfolgte die Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die durch Isolieren eines 650 bp-Fragments aus EcoRI-HindIII verdauen des Plasmids pUC 19 BTG, erhalten auf die vorhergehende Weise, und Markieren des Fragments mit ³²P hergestellt wurde. Dieses 650 bp- Fragment enthielt den gesamten Anteil des DNA-Fragments, das durch die PCR amplifiziert worden war. Das ³²P- Markieren erfolgte unter Verwendung eines Multi-Prime DNA- Markierungssets, hergestellt von Amersham. Die spezifische Aktivität der so hergestellten Sonde wurde zu 3 x 108 cpm/µg DNA gefunden. Die Hybridisierung erfolgte unter den folgenden Bedingungen.
Vorhybridisierung:
• Über Nacht Inkubation bei 42ºC in einer Hybridisierungslösung aus 50 % Formamid, 1 x Denhanvits (0,02 % RSA, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon), 0,1 % SDS, 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) und 200 µg/µl denaturierter Lachssperma-DNA.
Hybridisierung:
• Über Nacht Inkubation bei 42ºC in der Hybridisierungslösung in Gegenwart von 2 ng/ml der Sonde.
Waschen:
• 1. 2 x SSC, 0,1 % SDS, 3 x zu 5 Minuten, Raumtemperatur
• 2. 1 x SSC, 0,1 % SDS, 2 x zu 1 Stunde, 68ºC
• Nach Waschen wurde der Nitrocellulosefilter an der Luft getrocknet und einer Autoradiografie unterzogen.
• Durch Durchführen dieser Schritte wurde eine Gesamtmenge von ca. 40.000 Plaques gescreent (erstes Screening), welches zur Isolierung von 16 Klonen mit starken Signalen führte. Jeder dieser Klone wurde ferner einem zweiten Screenen unter Reinigung in ein einzelnes Plaque unterzogen. Als Ergebnis wurde eine Gesamtzahl von sechs einzelnen Plaqueklonen mit starken Signalen erhalten.
(8) Strukturanalyse der klonierten DNA:
• Zur Überprüfung der DNA-Struktur der so erhaltenen sechs Klone wurden die DNA-Fragmente aus diesen Klonen nach dem bei Maniatis, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Ausgabe, offenbarten Verfahren hergestellt.
• Restriktionsenzym-Verdaukarten der so erhaltenen DNA- Fragmente wurden unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI, SphI, NicoI, BglII und KpnI (alle von Toyobo Co., Ltd. bezogen) erstellt. Als Ergebnis wurde gefunden, dass diese Klone beinahe das gesamte DNA-Fragment enthielten und die Restriktionsenzym-Verdauungskarte des Fragments wurde wie folgt bestimmt. λBTG linker Arm rechter Arm K: KpnI, B: BamHI, N: NcoI
• Anschliessend erfolgte Southern-Hybridisierung durch Verdau des DNA-Fragments mit jedem Restriktionsenzym, Isolieren der verdauten Fragmente durch Elektrophorese, Fixieren der isolierten Fragmente auf einem Nitrocellulosefilter, und anschliessende Hybridisierung der fixierten Fragmente mit der im oben beschriebenen Gen- Screening verwendeten Sonde. Dieselben Hybridisierungsbedingungen wie für das Screenen des BTG- Gens wurden verwendet.
• Im Ergebnis wurde gefunden, dass das 3,6 Kbp NicoI- Fragment der oben beschriebenen Restriktionsenzym- Verdaukarte mit der Sonde hybridisierte und ein starkes Signal zeigte. Als Folge schloss man, dass mindestens ein Teil des BTG-Gens im NcoI-Fragment enthalten ist,
(9) Subklonieren des 3,6 Kbp NicoI-Fragments:
• Anschliessend wurde ein Versuch zur Subklonierung des 3,6 Kbp NcoI-Fragments in ein Plasmid unternommen. Das DNA-Fragment des oben erhaltenen Phagenklons wurde mit NcoI verdaut und es wurde ein 3,6 Kbp DNA-Fragment unter Verwendung niedrigschmelzender Agarose gewonnen. Das so erhaltene NcoI-Fragment wurde mit einem DNA-Fragment ligiert, das durch Verdau eines Plasmids pTV118n (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit NcoI erhalten worden war, und E. coli DH 5α wurde mit der so ligierten DNA-Probe transformiert. Unter Kultur einer auf diese Weise erhaltenen Transformante wurde ein Plasmid, bezeichnet als pTV118N NcoI, erhalten, in dem das 3,6 Kbp NcoI-Fragment in pTV118N subkloniert worden war.
(10) DNA-Sequenzierung des BTG-Gens:
• DNA-Sequenzierung erfolgt unter Verwendung des so erhaltenen Plasmids pTV118 NcoI als Matrize durch Wiederholung des in (4) beschriebenen Prozesses, mit Ausnahme, dass die Reaktionstemperatur auf 48ºC verändert wurde, und je nach Ausmass der Kompression der Frequenz wurde SSB (einzelsträngige DNA bindendes Protein (Toyobo Co., Ltd.) zum Reaktionssystem zugegeben. Die auf diese Weise ermittelte Basensequenz ist in der folgenden Tabelle 10 gezeigt. TABELLE 10
• Man vermutete, dass das Initiationscodon des BTG-Gens die ATG-Einheit, angegeben als Position 1 in der obigen Basensequenz, war, aufgrund der folgenden drei Punkte: (1) Es existiert ein Stoppcodon 81 Basen stromaufwärts der Position 1 und daher scheint der offene Leserahmen des BTG-Gens stromabwärts von dieser Position zu beginnen; (2) eine typische SD-Sequenz (5'AAAGGAG-3') existiert 13 Basen stromaufwärts der Position 1 ATG; und (3) eine Region von ca. 20 Aminosäuren von der Position 1 ATG Methionin ist eine Signalsequenz-ähnliche Einheit, die relativ reich an hydrophoben Aminosäuren ist.
• Da zusätzlich ein Stoppcodon an Position 1219 an der 3¹-Ende-Seite existiert, kann die Position 1216 Prolin als C-Terminus des BTG-Gens angenommen werden. Im aus der Basensequenz abgeleiteten offenen Leserahmen entspricht die N-terminale Aminosäure des BTG, bestimmt durch die Aminosäuresequenzierung, der Position 226 Asparaginsäure. Als Ergebnis wurde gefunden, dass der offene Leserahmen des hierin abgeleiteten BTG-Gens eine Struktur hatte, die aus der Struktur, ermittelt durch die Aminosäuresequenzierung und zusätzlichen 75 Aminosäuren, wie folgt bestand: TABELLE 11
BEISPIEL 2 - Chemische Synthese des BTG-Gens Aufbau und Synthese des BTG-Gens:
• Die BTG-Gen-DNA wurde aufgrund der kompletten Aminosäuresequenz, wie durch die vorhergehende Analyse ermittelt, aufgebaut. In diesem fall wurde die Einsatzfrequenz der Codons in E. coli, Hefe u.ä. (Ikemura, T. und Ozeki, H. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Bd. 47, S. 1087 (1983)) berücksichtigt, und die Restriktionsenzym-Erkennungsstellen wurden auf den DNA- Ketten von beiden Enden eines jeden der Fragmente (1) bis (5) zur Verwendung bei der Ligation dieser Fragmente angeordnet.
• Anschliessend wurde die so entworfene Gen-DNA mit der Phosphoamididtechnik unter Einsatz eines DNA-Synthesizers 380A, hergestellt von Applied Biosystems, chemisch synthetisiert.
• Die Länge einer DNA-Kette wurde auf ca. 30 bis 40 Basen, je nach der Verlässlichkeit und Durchführbarkeit von jüngst verwendeten DNA-Synthesizern und DNA- Reinigungstechniken, gesetzt. Da BTG aus 331 Aminosäuren aufgebaut ist, erfordert sein entsprechendes Gen mindestens 993 Basen. Es ist auch notwendig, die Gen-DNA- Menge zweimal zu synthetisieren, da die DNA in ein Plasmid als doppelsträngige Kette eingebaut werden muss. In der Praxis ist es jedoch notwendig, ferner ein Terminationscodon und Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme für die Ligation eines jeden Fragments einzuführen. Im Ergebnis wurde eine Gesamtzahl von 54 DNA- Ketten als 27 Paare von Doppelsträngen synthetisiert. Da ferner die Basensequenz der DNA-Kette nach ihrem Einbau in ein Plasmid bestätigt werden musste, kann es im Hinblick auf die Handhabung bequem sein, die DNA in mehrere Fragmente aufzuteilen (jeweils ca. 200 bp) und sie als solche in entsprechende Plasmide einzubauen, so dass die Basensequenz sicher bestimmt werden kann.
• Daher wurde in diesem Verfahren die DNA-Kette in 5 Blocks zu jeweils ca. 200 Basenpaaren aufgeteilt, die Basensequenz eines jeden in ein Plasmid eingebauten Blocks wurde bestätigt, und dann wurde das komplette BTG-Gen konstruiert.
Konstruktion eines synthetischen BTG-Gen-Typs:
• Zunächst erfolgte die Konstruktion eines jeden Fragments (ca. 200 bp) der 5 Blocks. Da das 5'-Ende eines chemisch synthetisierten Oligonucleotids keine Phosphorsäure besitzt, erfolgte die Phosphorylierung des 5'-Endes unter Verwendung von Polynucleotidkinase. In diesem Fall erfolgte die Phosphorylierung der DNA-Ketten an beiden 5'-Enden eines jeden Fragments nach der Ligation. 100 pmol Oligonucleotid (gelöst in Wasser) 10 x Puffer* 10 mM ATP Polynucleotidkinase (Takara Shuzo Co., Ltd.) (gesamt) (5 Einheiten)
• * 10 x Puffer bestand aus 650 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 150 mM Dithiothreitol und 10 mM Spermidin
• Die obige Zusammensetzung wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und dann 3 Minuten zur Inaktivierung des Enzyms gekocht. Anschliessend wurde eine Mischung von 5 ml eines Fragments mit demselben Volumen an seinem Komplementärfragment (10 µl insgesamt) bei 90ºC 3 Minuten in einem Wasserbad inkubiert, und dann wurde die Wassertemperatur im Pad schlagartig auf 37ºC gesenkt, um das Verschmelzen abzuschliessen. Anschliessend wurden die beiden DNA- Fragmente (20 µl) miteinander ligiert. Zwei DNA-Fragmentpaare 150 mM Dithiothreitol (DTT) 10 TNM ATP klonierte T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) (gesamt) (150 Einheiten)
• Die obige Zusammensetzung wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und 30 Minuten bei 16ºC inkubiert. Ein Anteil von 22 µl der erhaltenen Reaktionslösung wurde mit dem gleichen Volumen von zwei zusätzlichen Reaktionslösungen, die auf die gleiche Weise erhalten wurden (66 µl insgesamt) gemischt und 0,5 µl Ligase wurde zur Mischung zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation der Mischung bei 16ºC wurde die erhaltene Ligationslösung auf 10 % Polyacrylamidgel unter Erhalt eines DNA-Fragments, bestehend aus ca. 200 Basenpaaren, elektrophoretisiert.
• Ein jedes der so konstruierten DNA-Fragmente (1) bis (5) hatte eine EcoRI-Erkennungsstelle auf seinem 5'-Ende und eine HindIII-Erkennungsstelle auf dem 3'-Ende. Nach Phosphorylierung beider 5'-Enden eines jeden DNA-Fragments wurde das erhaltene Fragment mit einem Plasmid PUC 18 (Yanisch-Perron, C. et al, Gene, Bd. 33, S. 103 (1985)), das mit EcoRI und HindIII zuvor verdaut worden war, vermischt, und die Mischung wurde einer Ligationsreaktion für 1 Stunde bei 16ºC unter Verwendung eines DNA- Ligationskits (Takara Shuzo Co., Ltd.) unterzogen.
• Anschliessend wurde der E. coli JM 109-Stamm mit jeder der so hergestellten Ligationsmischungen transformiert. Dieser Stamm, JM 109, hat die folgenden Eigenschaften: recA 1, Δ lac-pro, endA 1, gryA 96, thi-1, hsdR 17, supE 44, re1A 1, λ&supmin;, (F'traD 36, proAB, lacIqZΔM15).
• Der E. coli-Stamm JM 109 ist ein Stamm, der eine leichte Selektion von Rekombinanten bei Transformation von Plasmid-DNA auf pUC-Basis oder Transduktion von M13- Phagenvektor-DNA erlaubt, wobei die Reaktivierung der β-Galactosidase durch Wirkung des lacZ α-Peptids, hergestellt durch eine Vektor-DNA, und lacZ Δ M15, codiert durch JM 109 F', ausgenutzt wird. Wenn mit anderen Worten der JM 109-Stamm auf einem IPTG (Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid) und X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indol-β- D-galactosid)-haltigem Medium kultiviert wird, bildet dieser Stamm eine blaue Kolonie, wenn er das Plasmid pUC 18 enthält, was das Vorliegen von β-Galactosidaseaktivität anzeigt, wogegen dieser Stamm weisse Kolonien formt, wenn er ein rekombinantes Plasmid enthält, bei dem ein Fremd-DNA-Fragment eingebaut ist, aufgrund seiner Unfähigkeit β-Galactosidaseaktivität zu reaktivieren.
• Die Plasmide wurden aus mehreren weissen Kolonien gewonnen und ihre DNA-Sequenzen nach dem Verfahren von Sänger F. et al, J. Mol. Biol., Bd. 143, S. 161 (1980) bestimmt. Auf diese Weise wurden die fraglichen Klone selektiert, in denen jedes eingefügte Fragment die korrekte Basensequenz, wie entworfen, zeigte.
• Anschliessend erfolgte die Ligation dieser DNA-Fragmente unter Ausnutzung ihrer entsprechenden Restriktionsenzym- Erkennungsstellen.
• Zunächst erfolgte die Ligation der Fragmente (2) mit (3) unter Verwendung von BTG-Gen-haltigen ScaI-XbaI-Fragmenten nach Verdau dieser Fragmente mit ScaI und XbaI unter Verwendung der ScaI-Erkennungsstelle im Ampicillinresistenten Gen von pUC 18. Auf die gleiche Weise erfolgte die Ligation der Fragmente (4) mit (5) unter Einsatz von BTG-Gen-haltigen ScaI-NcoI-Fragmenten nach Verdau dieser Fragmente mit ScaI und NcoI. Ligation der Fragmente (2), (3), (4) und (5) erfolgte unter Einsatz BTG-Gen-haltiger ScaI BgIII-Fragmente nach Verdau der so ligierten Produkte von (2) und (3) und von (4) und (5) mit ScaI und BglII.
• Anschliessend wurde ein EcoRI HpaI-Fragment des DNA- Fragments (1) und ein HapI HindIII-Fragment der so ligierten Probe der Fragmente (2), (3), (4) und (5) mit einem Hochexpressions/Sekretionsvektor zur Verwendung in E. coli, pIN-III-ompA2 (Ghrayeb, J. et al, EMBO J., Bd. 3, S. 2437 (1984)) vermischt, der mit EcoRI und HindIII zuvor verdaut worden war, und die erhaltene Mischung wurde einer Ligationsreaktion bei 16ºC für 30 Minuten unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo Co., Ltd.) unterzogen. Dann wurde die erhaltene Reaktionsmischung in den E. coli-Stamm JA 221 (hsdM&spplus;, trpE 5, leuB 6, lacY, recA/F', lacIq, lac&spplus;, pro&spplus;) (Nakamura, K. et al, J. Mol. Appl. Genet., Bd. 1, S. 289 (1982)) eingebaut. Nach Kultur der so behandelten Zellen wurden mehrere Plasmide aus den gebildeten Kolonien gewonnen und daraufhin untersucht, ob das BTG-Gen (ca. 1 kb) korrekt eingefügt war. Der so erhaltene Vektor zur Verwendung bei der Expression und Sekretion von BTG wurde pOMPA-BTG bezeichnet. Die Basensequenz des chemisch synthetisierten BTG-Gens, eingefügt in pIN-III-ompA2, ist in Tabelle 2 gezeigt.
• Das in diesem Beispiel verwendete Plasmid pIN-III-ompA2, enthielt einen Promotor (lppp) des äusseren Membranlipoproteins von E. coli, einen Promotor und einen Operator (lacpo) des Lactoseoperons, und eine Region für das Signalpeptid von dem äusseren Membranprotein OmpA von E. coli. Im Ergebnis wird die Expression eines in einem stromabwärts gelegenen Teil dieser Regionen eingebauten Gens durch Zugabe von IPTG induziert, und das erhaltene Genprodukt im Periplasma akkumuliert. Bedeutsame Mengen an Genprodukt, wie Subtilisin, wurden im Periplasma berichtet, z.B. von Ikemura, H. et al, J. Biol. Chem., Bd. 262, S. 7859 (1987) und Hsiung, H.M. et al, Bio/Technology, Bd. 4, S. 991 (1986). Die Reinigung des BTG-Proteins kann nach üblichen Verfahren zur Extraktion periplasmatischer Proteinmoleküle unter Einsatz der osmotischen Druck-Schock-Technik (Koshland, D. et al, Cell, Bd. 20, S. 749 (1980)) und anschliessende Reinigung des BTG-Proteins nach verschiedenen biochemischen Techniken, wie der Ammoniumsulfatprazipitation, der Ionenaustauschchromatografie, der Gelfiltration, HPLC u.ä. erfolgen.
• Nicht nur pIN-III-ompA sondern auch andere Expressionsplasmide können als Plasmid zur Verwendung bei der Expression des synthetisierten BTG-Gens eingesetzt werden. Diese anderen Expressionsplasmide können leicht vom Fachmann, je nach zu verwendendem Expressionssystem, ausgewählt werden. Wenn z.B. ein E. coli-Stamm als Wirtszelle verwendet wird, können üblicherweise verwendete Vektoren, wie pTrc99A (Pharmacia), pPROK-C und pKK233-2 (Clontech Co.); und pNH8a, pNH16a, pNH18a, pCDNAII und pAX (Stratagene) zur Konstruktion eines Expressions/Sekretionsvektors gemäss der Erfindung eingesetzt werden.
BEISPIEL 3 - Expression des synthetischen BTG-Gens
• Ein E. coli-Stamm JA 221, der das Plasmid pOMPA-BTG enthielt, bei dem das synthetische BTG-Gen eingebaut worden war (E. coli AJ12569; BP-3558) wurde in einem M9- Casaminsäuremedium, ergänzt mit 50 µg/ml Ampicillin, 2 Stunden unter Schütteln bei 37ºC kultiviert, worauf eine weitere Kultur bei 23ºC für 4 Stunden in Gegenwart von 1 mM IPTG folgte. Die Zellen wurden aus 50 ml der Kulturbrühe durch Zentrifugation gewonnen und in 2,5 ml einer Lösung aus 20 %-iger Saccharose und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) suspendiert, wozu 0,125 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) zugefügt wurden. Nach Halten auf Eis für 30 Minuten wurde die erhaltene Zellsuspension bei 12000 Upm 10 Minuten unter Abtrennung des überstands von den Zellen zentrifugiert. Das erhaltene Pellet oder Zellen wurden in 3 ml destilliertem Wasser suspendiert, 30 Minuten auf Eis gehalten und dann bei 12.000 Upm 10 Minuten unter Abtrennung des Überstands von den Zellen zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt und bei 38 Upm 60 Minuten ultrazentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde als Periplasmafraktion verwendet.
• Die nach Zentrifugation zurückbleibenden Zellen wurden in 3 ml destilliertem Wasser suspendiert, die Suspension wurde einer Ultraschall-Aufbrechbehandlung (200 Watt, 5 Minuten) unterzogen, und die erhaltene Probe wurde als Cytoplasmafraktion verwendet.
Messung der BTG-Aktivität in jeder Fraktion:
• Die BTG-Aktivität in jeder der so erhaltenen Fraktionen (Kulturfiltrat, Periplasmafraktion und Cytoplasmafraktion) wurde unter Verwendung des Hydroxamsäureverfahrens (colorimetrisches Hydroxamatverfahren nach dem Verfahren von Folk und Cole) gemessen.
• Die Messung erfolgte im Prinzip nach dem Verfahren von Folk und Cole (Colorimetrisches Hydroxamatverfahren), wie in J. Biol. Chem., Bd. 241, S. 5518 (1966), offenbart. Das heisst, die Reaktion wurde unter Verwendung von Benzyloxycarbonyl-L-glutamylglycin (CBZ-gln-gly) und Hydroxylamin als Substrate in Gegenwart oder Abwesenheit von Ca²+ durchgeführt. Die so gebildete Hydroxamsäure wurde in einen Eisenkomplex in Gegenwart von Trichloressigsäure überführt. Anschliessend wurde die Absorption des Eisenkomplexes bei 525 nm gemessen und die Menge an Hydroxamsäure wurde aus einer Kalibrierungskurve unter Berechnung der Aktivität der Probe erhalten.
Messung der Aktivität: Reagens A
• 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,0)
• 0,1 M Hydroxylamin
• 0,05 M Calciumchlorid
• 0,01 M Glutathion in reduzierter Form
• 0,03 M CBZ-gln-gly (Kokusan Kagaku Co., Ltd.)
Reagens B
• 3 N HCl 1 Volumenteil
• 12 % Trichloressigsäure 1 Volumenteil
• 5 % FeCl3 6H&sub2;O (gelöst in 0,1 N HCl) 1 Volumenteil
• Ein Anteil von 0,4 ml einer Probe (BTG als Enzymlösung) wurde mit 0,4 ml Reagens A vermischt. Nach Inkubation der Mischung bei 37ºC für 10 Minuten wurden 0,4 ml von Reagens B zur erhaltenen Mischung unter Abbrechen der Reaktion und Bildung eines Eisenkomplexes zugegeben. Anschliessend wurde die Absorption des Komplexes bei 525 nm gemessen.
• Zur Kontrolle wurde eine Enzymlösung unter Erhitzen inaktiviert und dem gleichen Verfahren unterworfen, und seine Absorption bei 525 nm wurde von der der aktiven Enzymlösung abgezogen. Es wurde eine Kalibrierungskurve erstellt unter Verwendung des gleichen Verfahrens, mit Ausnahme, dass γ-Monohydroxamsäure-L-glutamat anstelle der Enzymlösung verwendet wurde. Die Menge an gebildeter Hydroxamsäure wurde aus der korrigierten Absorption unter Einsatz der so erstellten Kalibrierungskurve ermittelt. In diesem Fall wurde eine Einheit an Enzymaktivität als die Menge Enzym definiert, die die Bildung von 1 µM Hydroxamsäure pro Minute unter den oben beschriebenen Reaktionsbedingungen katalysiert.
• Die folgende Tabelle zeigt die erhaltenen Ergebnisse. Proben IPTG (mM) BTG-Aktivität (Einheit/mg Protein) Kulturfiltrat Periplasmafraktion Cytoplasmafraktion
• Obwohl in keinem signifikanten Ausmass, wurden BTG- Aktivitäten in allen Proben bei Induktion mit IPTG nachgewiesen.
• Zur Bestätigung der Bildung eines BTG-Genprodukts wurde ein Anti-BTG-Antikörper in einem Kaninchen unter Verwendung von gereinigtem BTG erzeugt und Western- Blotting wurde durchgeführt unter Einsatz eines Vectastain ABC-Kits, hergestellt von Vector Laboratories, Inc., auf die folgende Weise.
• Ein 0,5 µl-Anteil einer jeden Proteinfraktion wurde auf SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisiert, und das erhaltene Gel wurde auf einen Membranfilter (Immobilon, hergestellt von Millipore Corp.) unter Fixierung des Antigenproteins auf den Filter überführt. Anschliessend erfolgte Western-Blotting unter Einsatz des Kaninchen- Anti-BTG-Antikörpers (1000-fache Verdünnung einer Stock- Lösung mit einem Antikörpertiter von 64) unter Bestätigung des Produkts des BTG-Cens auf der Proteinstufe.
• In diesem Fall wurden die Proteinproben auf das SDS- Polyacrylamidgel in der folgenden Reihenfolge oder Bahnen aufgegeben.
• 1: gereinigtes BTG (Kontrolle)
• 2: Kulturfiltrat (kein zugesetztes IPTG)
• 3: Kulturfiltrat (1 mM IPTG zugefügt)
• 4: Periplasmafraktion (kein zugesetztes IPTG)
• 5: Periplasmafraktion (1 mM IPTG zugefügt)
• 6: Cytoplasmafraktion (kein zugesetztes IPTG)
• 7: Cytoplasmafraktion (1 mM zugesetztes JPTG)
• Im Ergebnis wurden gefärbte Banden an der gleichen Position in den Bahnen 1, 3, 5 und 7 beobachtet. Mit anderen Worten, mit dem Anti-BTG-Antikörper reagiertes Protein wurde in jeder IPTG-versetzten Fraktion an der gleichen Position nachgewiesen, die dem Molekulargewicht des gereinigten BTG äquivalent war.
• Erfindungsgemass ist daher offensichtlich, dass ein DNA- Gen zur Verfügung gestellt wurde, welches Transglutaminase codiert, ein Plasmid, in dem das Gen eingebaut ist, eine mit dem Plasmid transformierte Transformante, und ein Verfahren zur Herstellung von Transglutaminase, das die Kultur der Transformante umfasst.
BEISPIEL 4 - Expression des BTG-Gens (natürlich) in Actinomyceten (1) Herstellung des Plasmidvektors (PIJ 702):
• Streptomyces lividans 3131 ATCC 35287, der das Plasmid PIJ 702 enthielt, wurde 2 Tage bei 30ºC unter Verwendung des folgenden Mediums kultiviert. YEME-Medium + 0,5 % Glycin + 50 µg/ml Thiostrepton Hefeextrakte Pepton Malzextrakte Magnesiumchlorid Glucose Saccharose Glycin 50 mg/ml Thiostreptonlösung (Sigma Chemical Co.; Dimethylsulfoxidlösung) (gesamt 1 l, pH 7,0)
• Ein 200 ml-Anteil der so erhaltenen Kulturbrühe wurde bei 12.000 x g 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, und das erhaltene Pellet (Zellen) wurde unter Suspendierung der Zellen in einer Lösung aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA und 50 mM NaCl unter 5-minütiger Zentrifugation bei 13.000 x g bei Raumtemperatur gewaschen. Die so gewaschenen Zellen wurden in 10 ml einer Lösung aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA und 25 % Saccharose (im folgenden als "TE-Saccharose" bezeichnet) suspendiert. Die erhaltene Zellsuspension wurde mit 2 ml TE-Saccharose, enthaltend 30 mg/ml Lysozym (Sigma Chemical Co.) und 4 ml 0,25 M EDTA, vermischt und die Mischung wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Hierzu wurden dann 2 ml 20 % SDS und 5 ml 5 M NaCl in dieser Reihenfolge zugegeben. Nach sanftem Rühren wurde die erhaltene Mischung über Nacht bei 0ºC inkubiert. Das erhaltene Zelllysat wurde bei 100.000 x g 40 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, und der so erhaltene Überstand mit einer 30 %-igen Lösung von Polyethylenglykol 6000 (Endkonzentration 10 %) vermischt. Nach 4,5-stündiger Inkubation bei 0ºC wurde die erhaltene Mischung bei 900 x g 5 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, und das so erhaltene Präzipitat in einer Lösung aus 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA und 50 mM NaCl gelöst. Hierzu wurden 16,8 g Cäsiumchlorid und 1,2 ml einer Lösung aus 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA (im folgenden als "TE" bezeichnet), in der Ethidiumbromid in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst wurden war, zugegeben. Die erhaltene Mischung wurde bei 1300 x g 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Entfernung der Zelltrümmer zentrifugiert und dann bei 230.000 x g 12 Stunden bei 20ºC. Anschliessend wurde eine Plasmid-DNA-haltige Schicht aus dem Zentrifugationsröhrchen durch Nachweis der Schicht mit ultraviolettem Licht abgetrennt. Zur Entfernung von Ethidiumbromid wurde die so erhaltene Plasmid-DNA dreimal mit Butanol, das mit TE gesättigt worden war, extrahiert, worauf Dialyse über Nacht gegen TE bei 4ºC folgte. Die so dialysierte Probe wurde einmal mit TE-gesättigtem Phenol und dann zweimal mit einem Chloroform/Isoamylalkohol- System extrahiert. Hierzu wurden 1/10 Volumenanteil von 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2 Volumenanteile Ethanol zugegeben. Nach 30-minütigem Stehenlassen bei -80ºC wurde die erhaltene Mischung bei 12.000 x g 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Das so erhaltene Präzipitat wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und dann in 200 µl TE gelöst. Auf diese Weise wurden ca. 10 µg DNA erhalten.
(2) Herstellung der Wirtszellen:
• pIJ 702-haltiges Streptomyces lividans 3131 wurde 7 Tage in YEME-Medium bei 30ºC kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe wurde mit YEME-Medium auf ein Mass von 10&sup5; bis 10&sup9; verdünnt, und ein 100 µl-Anteil von jeder der so dezimal verdünnten Proben wurde auf jeweils fünf Platten, enthaltend YEME-Agar-Mediuin (YEME-Medium, ergänzt mit 1,5 % Agar) inokuliert. Nach 7-tägiger Kultur bei 30ºC wurden die auf dem Plattenmedium gebildeten Kolonien auf YEME-Agar-Medium, enthaltend 200 µg/ml Thiostrepton, unter Verwendung eines RepliPlate Colony Transfer Pad (Takara Shuzo Co., Ltd.) repliziert, und die so replizierten Kolonien wurden nochmals 7 Tage bei 30ºC kultiviert. Ein Thiostrepton-empfindlicher Stamm, Streptomyces lividans 3131-TS, der auf diese Weise isoliert wurde, wurde als Wirt verwendet.
(3) Herstellung von Streptomyces lividans 3131-TS- Protoplasten:
• Der Thiostrepton-empfindliche Stamm von Streptomyces lividans 3131, erhalten wie oben in (2), wurde 2 Tage bei 30ºC unter Verwendung von YEME + 0,5 % Glycinmedium kultiviert. Ein 200 ml-Anteil der erhaltenen Kulturbrühe wurde bei 1300 x 9 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, und die so prazipitierten Zellen in 72 ml 0,35 M Saccharoselösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde bei 1300 x g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, und die so präzipitierten Zellen in 60 ml Pufferlösung P, enthaltend 1 mg/ml Lysozym (Sigma Chemical Co.), suspendiert. Nach 2,5-stündiger Inkubation bei 30ºC wurde die erhaltene Suspension durch ein Absorptions- Baumwolltuch unter Entfernung von Zelltrümmern abfutriert. Das so erhaltene Filtrat wurde bei 1300 x g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, und die so präzipitierten Protoplasten wurden zweimal mit 25 ml Pufferlösung P nach Zentrifugation gewaschen. Anschliessend wurden das so gewaschene Präzipitat in 1 ml Pufferlösung P unter Erhalt einer Protoplastensuspension suspendiert. Pufferlösung P, wie hier verwendet, wurde wie folgt hergestellt. TES [N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure Saccharose Magnesiumchlorid Kaliumsulfat Calciumchlorid Spurenelementlösung* (gesamt) *Spurenelementlösung (pro l) Zinkchlorid Eisen(III)chlorid Kupfer(II)chlorid Manganchlorid Natriumtetraborat Ammoniummolybdat
In diesem Fall wurde eine 1 %-ige
• Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung getrennt hergestellt und ein Anteil von 1 ml der Lösung zu 100 ml der Pufferlösung P vor Verwendung zugegeben.
(4) Konstruktion des Actinomycetes-Expressionstyp- BTG-Genfragments (Mp-BTGspm):
• Da die DNA-Sequenzierergebnisse anzeigten, dass das BTG ein Prepro-Protein ausbilden würde, nahm man an, dass das Prozessieren eines Vorläufers in die reife Form glatt durch Expression des Gens in Streptomyces lividans 3131-TS, der zur gleichen Actinomyceten-Familie wie im Fall des BTG-produzierten Streptoverticillium sp. gehört, eher als bei Expression in anderen Mikroorganismen durchgeführt werden könnte. Im Ergebnis wurde ein BTG- Genfragment vom Expressionstyp auf die folgende Weise konstruiert.
(i) Herstellung eines Fragments, enthaltend Signal-, Pro- und Struktursequenzen des BTG-Gens:
• Ein Fragment, enthaltend Signal-, Pro- und Struktursequenzen des BTG-Gens (im folgenden als "BTGspm- Fragment" bezeichnet) wurde unter Verwendung der PCR- Technik unter Einsatz eines 3,6 Kbp NcoI-Fragments des BTG-Gens als Matrize erhalten. Die Sequenzen der Primer #3 und Primer #4 zur Verwendung für das PCR-Verfahren waren wie folgt: Primer #3 Primer #4
• Die PCR-Technik ist bereits in Einzelheiten im obigen Beispiel 1 für die folgenden Prozeduren beschrieben.
(ii) Herstellung des Fragments der mel (Melamin- Syntesegen)-Promotorregion:
• Das mel-Gen wurde als Expressionspromotor für das BTG-Gen ausgewählt, und ein Fragment der mel-Gen-Promotorregion (im folgenden als "Mp-Fragment" bezeichnet), wurde unter Einsatz von PCR unter Verwendung von PIJ 702 als Matrize hergestellt. Die für die PCR-Verfahren verwendeten Primer #5- und #6-Sequenzen waren wie folgt: Primer #5 Primer #6
(iii) Konstruktion des BTG-Genfragments (Mp-BTGspm):
• Jedes der so durch PCR und pUC 19 amplifizierten Mp- Fragmente wurde mit EcoRI und SacI (Toyobo Co., Ltd.) verdaut und die verdauten Fragmente mit der geeigneten Grösse von Interesse (ca. 260 bp bzw. ca. 2700 bp) wurden durch niedrigschmelzende Agarose-Elektrophorese gewonnen. Nach Ligieren der so erhaltenen Fragmente wurde E. coli DHα mit dem erhaltenen Ligat in Gegenwart von X-Gal und IPTG unter Isolierung einer Ampicillin-resistenten weissen Kolonie transformiert. Ein aus der Kolonie gewonnenes Plasmid, bei dem das Mp-Fragment in die EcoRI SacI- Schnittstelle von pUC 19 eingefügt war, wurde als pUC19-Mp bezeichnet und in den folgenden Verfahren eingesetzt.
• Jedes der durch PCR auf die gleiche Weise amplifizierten Btgspm-Fragmente und das so erhaltene pUC19-Mp wurde mit BamHI und SacI (Toyobo Co., Ltd.) verdaut und subkloniert. Ein Plasmid, in das das BTGspm-Fragment in die BamHI SacI- Schnittstelle von pUC19-Mp eingefügt war, wurde als pUC19-Mp-BTGspm bezeichnet und in den folgenden Verfahren eingesetzt.
• Das so hergestellte Plasmid pUC19-Mp-BTGspm wurde mit PstI und BglII (Toyobo Co., Ltd.) unter Erhalt eines Mp-BTGspm- Fragments aus 1,4 Kilobasenpaaren (Kbp) behandelt. In diesem Experimenten wurde ein DNA-Ligationskit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet.
(5) Einbau des BTG-Gens in Streptomyces lividans 3131-TS:
• Das oben erhaltene 1,4 Kbp Mp-Btgspm-Fragment wurde mit einem 5,1 Kbp PstI-BglII-Fragment von pIJ 702 ligiert. Die Ligation erfolgte unter Inkubation der folgenden Reaktionsmischung über Nacht bei 4ºC. 1,4 Kbp Mp-BTGspm-Fragment 5,1 Kbp pIJ702 PstI-BglII 5 Einheiten/µl T4 DNA-Ligase (Boehringer) 10 x Ligationspuffer 2,0 µl (Boehringer)
• Nach der Inkubation wurde Streptomyces lividans 3131-TS mit der so ligierten DNA auf die folgende Weise transformiert.
• (a) Die folgende Reaktionsmischung wurde hergestellt und das Gesamtvolumen auf 140 µl eingestellt. DNA-Lösung Streptomyces lividans 3131-TS-Protoplasten 0,35 M Saccharose
• (b) Ein Anteil zu 1,5 ml der Pufferlösung P, enthaltend 20 % Polyethylenglykol 1000, wurde zur Reaktionsmischung zugegeben und sanft durch Pipettieren vermischt.
• (c) Man liess die erhaltene Mischung 2 Minuten bei Raumtemperatur still stehen.
• (d) Dann wurde die Mischung bei 1700 x g 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Gewinnung des Pellets zentrifugiert.
• (e) Das so erhaltene Pellet wurde zweimal mit Pufferlösung P durch Zentrifugation gewaschen.
• (f) Das gewaschene Pellet wurde in 1 ml Pufferlösung P suspendiert, und ein 200 µl-Anteil der Suspension auf ein R-2-Medium inokuliert. In diesem Fall wurden die Medienzusammensetzungen R-2/A und R-2/B, wie unten gezeigt, getrennt hergestellt, und das R-2/A-Medium wurde durch Mischen dieser beiden Zusammensetzungen zusammen mit 1 % KH&sub2;PO&sub4;-Lösung (1 ml pro 200 ml Endvolumen) hergestellt. R-2/A (pro 1 Liter) Kaliumsulfat Magnesiumchlorid Calciumchlorid Glucose Prolin Casaminosäure Spurenelementlösung Agar R-2/B (pro 1 Liter, pH 7,4) TES Hefeextrakte Saccharose
• (g) Die so angeimpften Platten wurden 18 Stunden bei 30ºC inkubiert.
• (h) Die gesamte Oberfläche des Plattenmediums wurde mit 1 ml Pufferlösung P, enthaltend 200 µg/ml Thiostrepton und 400 µg/ml Tyrosin, bedeckt.
• (i) Die erhaltenen Platten wurden weiter 7 Tage bei 30ºC unter Isolierung von Thiostrepton-resistenten weissen Kolonien inkubiert. In diesem Fall bildet eine Zelle, die pIJ 702 enthält, in das kein Fremd-DNA-Fragment eingefügt wurde, eine schwarze Kolonie aufgrund der Melaninsynthese durch das mel-Gen.
• Plasmide wurden aus mehreren, so isolierten Weisskolonien gewonnen und auf Vorliegen von eingefügtem BTG-Gen überprüft. Der so erhaltene BTG- Expressions/Sekretionsvektor wurde pIJ702-BTG bezeichnet.
(6) Expression des BTG-Gens:
• Streptomyces lividans AKW-1 wurde mit dem so erhaltenen BTG-Gen-eingebauten Expressionsvektor pIJ702-BTG transformiert, und die erhaltene Transformante wurde 5 Tage bei 30ºC unter Verwendung eines Mediums mit der folgenden Zusammensetzung kultiviert. Polypepton lösliche Stärke Hefeextrakte Adekanol LH126 50 mg/ml Thiostrepton-Lösung
• Ein 100 ml-Anteil der so erhaltenen Kulturbrühe wurde bei 12.000 x g 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, und die erhaltene Überstandsflüssigkeit auf einen Faktor von ca. 17 unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (nominaler Molekulargewichtsausschluss von 1000; Amicon Corp.) konzentriert.
• Anschliessend wurde die Menge an BTG in der so erhaltenen Probe mittels EIA (Enzymimmuntest) unter Einsatz einer Anti-BTG-Antikörperpräparation, erhalten in einem Kaninchen unter Verwendung von gereinigtem BTG, gemessen. Im Ergebnis wurden ca. 0,1 mg/l BTG nachgewiesen. In diesem Fall erfolgte der EIA auf die folgende Weise.
• (a) Ein 50 µl-Anteil einer Probe wurde mit 500 µl Puffer A vermischt. Nach Zugabe von einer einzelnen mit Antikörpern gekoppelten Perle (die Perlen wurden aus Polystyrol #80 von Sekisui hergestellt), wurde die Mischung bei 37ºC 30 Minuten inkubiert.
• (b) Die Perle wurde aus der so erhaltenen Mischung entfernt und zweimal mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0( gewaschen.
• (c) Ein 500 µl-Anteil einer β-Galactosidasemarkierten Antikörperpräparation (50 mu/500 µl Puffer A) wurde zu der so gewaschenen Perle zugegeben und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
• (d) Die Perle wurde aus der so inkubierten Mischung entfernt und zweimal mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.
• (e) Ein 500 µl-Anteil von CPRG wurde zu der so gewaschenen Perle zugegeben und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
• (f) Nach Abbruch der Reaktion mit 2 ml einer Abbruchlösung wurde die Absorption bei 575 nin gemessen. Puffer A Natriumchlorid RSA Magnesiumchlorid Natriumazid Phosphatpuffer (pH 7,0) CPRG (pro 1 Liter, pH 5,0) CPRG (Chlorphenolrot-β-D-galactopyranomid, Boehringer hydrolysierte Gelatine Abbruchlösung Galactose
• Das erhaltene BTG wurde dann durch Western-Plotting analysiert. Die Ergebnisse des Western-Blottings sind in der anliegenden Figur gezeigt. Zunächst wurde eine Probe auf die übliche Weise vor der SDS-PAGE behandelt. Nach Elektrophorese wurde das Protein, das im Gel vorlag, auf eine Membran (Immobilon , Millipore Corp.) überführt unter Verwendung eines Elektrophorese-Transferkits (LKB Instruments, Inc.) unter den im Kit beigefügten Herstellerangaben beschriebenen Transferbedingungen. Die Protein-transferierte Membran wurde 1 Stunde in 10 ml eines Blockadepuffers aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) und 5 % entrahinter Milch und dann über Nacht bei 4ºC in 10 ml einer Lösung von BTG-Antiserum, das auf einen Faktor von 200 mit einem Spülpuffer aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 0,15 M NaC1, 0,1 mM EDTA (3 Na), 0,25 % entrahmter Milch und 0,01 % NaN&sub3; verdünnt worden war, inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit Spülpuffer (jeweils 20 ml) wurde die so inkubierte und gewaschene Membran 4 Stunden bei 4ºC in 10 ml des Spülpuffers, enthaltend 1 µCi Anti-Kaninchen ¹²&sup5;I-markierter Voll-Antikörper (Amersham) inkubiert. Anschliessend wurde die so inkubierte Membran zweimal mit Spülpuffer (jeweils 20 ml) gewaschen, an der Luft getrocknet und dann einer Autoradiografie unterzogen.
• Im Ergebnis wurde BTG als reifes Protein bei einer Position von ca. 37 Kilodaltons (KDa) gefunden, wobei die Position dem Molekulargewicht von gereinigtem BTG äquivalent war, was darauf hindeutete, dass reifes BTG- Protein durch normales Prozessieren trotz der Einführung eines Vorstufengens in das Expressionssystem des BTG-Gens in Streptomyces lividans AKW-1 sekretiert worden war.
BEISPIEL 5 - Expression des BTG-Gens (synthetisch) in Hefe
• Zur Expression des BTG-Gens in Hefe wurde an der Seite des 3'-Endes des Signalsequenzgens das reife BTG-Gen, oder mit Sequenzen eines BTG-Pro-Sequenzgens und dem reifen BTG-Gen ligiert, in einen Expressionsvektor eingefügt.
• Ein E. coli-Hefe-Shuttlevektor pNH 1053, der die Promotorsequenz des Enolasegens (ENO 1), welches am Glycolyseweg beteiligt ist, enthält, wurde als Expressionsvektor verwendet, da diese Sequenz eine starke Promotoraktivität in Hefe zeigt. So wurde z.B. der ENO 1- Promotor zur Expression eines humanen Lysozymgens u.ä. in Hefezellen verwendet, wie z.B. bei Ichikawa, K et al, in Agric. Biol. Chem., Bd. 53, S. 2687 (1989) offenbart. Dieser Vektor ist ein Hochkopie-Typ (YEp)-Vektor, der gleichzeitig den pBR322-abgeleiteten E. coli- Replikationsursprung und das Ampicillin-Resistenzgen, Hefe 2 µm-Replikationsursprung und das LEU 2-Gen als Selektionsmarker enthält.
• Als Signalsequenz wurde eine humane Gastrin-Signalsequenz (Kato, K. et al, Gene, Bd. 26, S. 53-57 (1983)) verwendet. Diese Signalsequenz, die aus 21 Aminosäureresten besteht, und bei der das Alanin an Position 21 an dem Carboxylterminus durch Wirkung einer Signalpeptidase abgeschnitten ist, wurde in Hefezellen zur Expression und Sekretion verschiedener Fremdproteine, wie der humanen α-Amylase (Sato, T. et al, Gene, Bd. 83, S. 355-365 (1989)) verwendet.
• Wie man aus Bacillus subtilis weiss, spielt wahrscheinlich eine Pro-Sequenz, die zwischen der Signalsequenz und der reifen Gensequenz eingefügt ist, eine wichtige Rolle bei der Expression der Aktivität von translatiertem Protein (Ikemura, H. et al, J. Biol. Chem., Bd. 262, S. 7859-7864 (1987), und andere Berichte). Der Begriff "BTG-Pro- Sequenz", wie hierin verwendet, bedeutet eine Sequenz von 39 Aminosäureresten, ausgehend von der -39-Position Lysin bis zur -1-Position Prolin, angeordnet stromabwärts der BTG-signalähnlichen Sequenz, wie in Beispiel 1 gezeigt. (1) Konstruktion des reifen BTG-Expressions/ Sekretionsvektors pNJ1053-BTG: Ein XhoI-HindIII-Fragment, das aus ca. 90 Basenpaaren besteht und ein eine Signalsequenz codierendes Gen enthält, wurde aus einem Gastrin-Signalsequenz-haltigen Vektor ausgeschnitten (Sato, T. et al, Gene, Bd. 83, S. 355-365 (1989)) und in den Vektor PHSG 396 (Takara Shuzo Co., Ltd.; Takeshita, 5. et al, Gene, Bd. 61, 5. 63-74 (1987)) eingefügt, der zuvor mit XhoI und HindIII verdaut worden war, unter Erhalt des Plasmids PHSG3g6-GS. Ein HindIII-verdautes Fragment dieses Plasmids wurde in Reihe mit einem synthetischen Oligonucleotid aus ca. 30 Basenpaaren (bp), wie unten gezeigt, und einem PvuII-HindIII-Fragment (ca. 1 Kb) des wie in Beispiel 2 chemisch synthetisierten BTG-Gens ligiert, um ein Fragment auszuwählen, bei dem das reife BTG-Gen korrekt an einen Ort stromabwärts der Signalsequenz eingefügt war.
• Eine SalI-HindIII-Region stromaufwärts der XhoI- Erkennungsstelle des so ausgewählten Fragments wurde mit den entsprechenden Restriktionsenzymen unter Erhalt eines Fragments von ca. 1,1 Kilobasenpaaren (Kbp) ausgeschnitten. Anschliessend wurde eine SalI-HindIII- Region, die auf einem stromabwärts gelegenen Teil des ENO 1-Promotors des Hefeexpressionsvektors pNJ 1053 angeordnet war, durch das 1,1 Kbp-Fragment ersetzt, und das erhaltene Plasmid wurde in E. coli JM 109 unter Wiedergewinnung des Titel-Expressions/Sekretionsvektors pNJ1053-BTG eingeführt.
(2) Konstruktion der BTG-Pro-Sequenz - Reifes Protein Expressions/Sekretionsvektor pNJ1053-proBTG:
• Zunächst erfolgte die Synthese eines Gens, das eine BTG- Pro-Sequenzregion codiert. In diesem Fall wurde die Verwertungsfrequenz der Codons in E. coli, Hefe usw. berücksichtigt, und die Restriktionsenzym- Erkennungsstellen wurden zur Verwendung bei der Ligation des Signalsequenzgens und reifen Gens angeordnet. Das heisst, wie unten gezeigt, das 5'-Ende des Pro-Sequenzgens wurde mit einer HindIII-kohäsiven Endsequenz zur Verwendung für die Ligation mit dem Signalsequenzgen angeordnet, und das 3'-Ende mit einer glatten PvuII- Endsequenz zur Verwendung für die Ligation mit der PvuII- Erkennungsstelle des chemisch synthetisierten BTG-Gens wie in Beispiel 2.
• Die chemische Synthese der BTG-Pro-Sequenz erfolgte zunächst durch Synthese von insgesamt 6 Oligonucleotidketten, von denen jede aus ca. 50 Basen bestand, als drei Doppelstrangpaare unter Verwendung eines DNA-Synthesizers 380A, hergestellt von Applied Biosystems. Die so chemisch synthetisierten Oligonudeotide wurden phosphoryliert, verschmolzen und ligiert, in dieser Reihenfolge, auf die gleiche Weise wie bei der chemischen Synthese des in Beispiel 2 durchgeführten BTG-Gens. Nach diesen Reaktionen erfolgte eine 10 %-ige Polyacrylamidgel- Elektrophorese unter Gewinnung eines DNA-Fragments von ca. 150 Basenpaaren aus dem Gel. Anschliessend wurde auf die gleiche Weise wie in Abschnitt (1) oben ein HindIII- verdautes Produkt von pHSG396-GS, das so gewonnene 150 bp synthetische Oligonucleotid und das PvuII-HindIII-Fragment (ca. 1 Kb) des wie in Beispiel 1 chemisch synthetisierten BTG-Gens miteinander in dieser Reihe verbunden, und ein Fragment, bei dem das BTG-Pro-Sequenzgen korrekt zwischen die Signalsequenz und das reife BTG-Gen eingefügt worden war, wurde ausgewählt. Eine stromaufwärts der XhoI- Erkennungsstelle gelegene SalI-HindIII-Region des so erhaltenen Fragments wurde mit den entsprechenden Restriktionsenzymen unter Erhalt eines Fragments von ca. 1,2 Kilobasenpaaren (Kbp) ausgeschnitten. Anschliessend wurde eine auf einem stromabwärts gelegenen Teil des ENO 1-Promotors des Hefe-Expressionsvektors pNJ 1053 angeordnete SalI-HindIII-Region durch das 1,2 Kbp-Fragment ersetzt, und das erhaltene Plasmid wurde in E. coli JM 109 unter Gewinnung des Titel-Expressions/Sekretionsvektors pNJ1053-proBTG eingeführt.
(3) Expression des BTG-Gens in Hefe:
• Jeder der Expressions/Sekretionsvektoren pNH1053-BTG und pNJ1053-proBTG, wie in den Abschnitten (1) und (2) erhalten, wurden in eine Hefewirt, Saccharomyces cerevisiae KSC22-1C (MATa, ssl 1, leu 2, his-, ura 3) mittels Alkalimetallbehandlung (Itoh, H. et al, J. Bacteriol., Bd. 153, S. 163-168 (1983)) eingeführt. Da es notwendig ist, ein essentielles Minimalmedium zur Selektion und Kultur eines Klons zu verwenden, der mit einem Plasmid transformiert worden war, das ein Gen enthielt, um eine auxotrophe Mutation zu kompensieren, wurde in diesem Fall eine 0,67 %-ige Lösung von Bactohefe- Stickstoffbase (YNB), erhältlich von Difco Laboratories, als Minimalmedium unter Ergänzung mit 2 % Glucose und, je nach der auxotrophen Natur der Wirtshefe, mit 20 mg/l L-Histidin-hydrochlorid und 20 mg/l Uracil (plus 2 % Agar im Falle eines Plattenmediums) verwendet. Transformante Zellen, die Leu&spplus; wurden, bildeten Kolonien bei Kultur auf dem Plattenmedium für 2 bis 4 Tage bei 30ºC.
• Jede Transformante, die den Expressions/Sekretionsvektor pNH1053-BTG oder pNJ1053-proBTG enthielt, wurde über Nacht im minimalen essentiellen Medium bei 30ºC kultiviert, um Plasmiddeletion zu verhindern, und dann wurde die erhaltene Kulturbrühe (5 % Inokulum) in 10 ml des folgenden synthetischen Mediums angeimpft und bei 30ºC 2 Tage unter Schütteln kultiviert. Synthetisches Medium YNB Glucose L-Histidin-hydrochlorid Uracil Casaminosäure (Difco)
• Anschliessend wurde ein Zellextrakt unter Verwendung des Glasperlenverfahrens (Hitzeman, R.A. et al, Science, Bd. 219, S. 620-625 (1983)) hergestellt. Das heisst, die Zellen wurden aus 10 ml Kulturbrühe durch Zentrifugation gesammelt, mit sterilem Wasser gewaschen und in 1 ml einer Tris-HCl-Lösung (pH 6,0) suspendiert. Ein Volumen von 1 ml an Glasperlen (0,45 bis 0,5 mm Durchmesser, hergestellt von B. Brown) wurden zur Zellsuspension zugegeben und die Mischung wurde heftig bei 0 bis 4ºC 1 Minute auf einem Vortex-Mischer geschüttelt. Der Schüttelschritt wurde dreimal wiederholt. Nach Entfernen der Glasperlen unter Verwendung von Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit wurde der erhaltene Überstand in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Das Röhrchen wurde dann bei 12.000 Upm 5 Minuten zentrifugiert, und der erhaltene Überstand als Zellextrakt verwendet.
• Zur Bestätigung der Produktion des BTG-Genprodukts wurde ein Anti-BTG-Antikörper in einem Kaninchen unter Verwendung von gereinigtem BTG hergestellt und Western- Blotting erfolgte unter Verwendung eines Vectastain ABC- Kits (hergestellt von Vector Laboratories, Inc.) auf die folgende Weise. Ein vorherbestimmtes Volumen (ca. 1 µg, als Gesamtprotein) eines jeden Extrakts an Hefezellen, enthaltend den Expressions/Sekretionsvektor pNJ1053-BTG oder pNJ1053-probtg, wurde einer SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese unterzogen, und das erhaltene Gel auf ein Membranfilter (Immobilon, hergestellt von Millipore Corp.) unter Fixierung des Antigenproteins auf dem Filter transferiert. Anschliessend erfolgte Western-Blotting unter Verwendung von Kaninchen-Anti-BTG-Antikörper (1000- fache Verdünnung einer Stocklösung mit einem Antikörpertiter von 64) unter Bestimmung des BTG- Genprodukts auf der Proteinstufe.
• In diesem Fall wurden die Proteinproben auf ein SDS- Polyacrylamidgel in der folgenden Reihenfolge oder Bahnen aufgegeben.
• 1. gereinigtes BTG (Kontrolle)
• 2: Extrakt von Hefezellen, enthaltend pNJ1053
• 3: Extrakt von Hefezellen, enthaltend pNJ1053-BTG (reifes BTG-Gen)
• 4: Extrakt von Hefezellen, enthalten pNJ1053-proBTG (BTG-Pro-Sequenz und reifes BTG-Gen)
• Im Ergebnis wurden gefärbte Banden an derselben Position in Bahnen 1, 3 und 4 beobachtet. Mit anderen Worten, mit dem Anti-BTG reagiertes Protein wurde in jedem Extrakt der Hefezellen, die das BTG-Gen enthielten, an der gleichen Position nachgewiesen, die dem Molekulargewicht von gereinigtem BTG äquivalent war.
• In diesem Fall wurden auch die während des Verfahrens zur Herstellung dieser Zellextrakte erhaltenen Kulturfiltrate einem Western-Blotting unterzogen, es wurde jedoch keine entsprechende BTG-Bande gefunden. Bei den Hefezellen, die Expressions/Sekretionsvektor pNJ1053-proBTG enthielten, in den die BTG-Pro-Sequenz und das reife BTG-Gensystem eingebaut worden war, wies das Auftreten einer Bande entsprechend dem BTG in Bahn 4 an derselben Position wie das gereinigte BTG darauf hin, dass korrektes Prozessieren der synthetischen Pro-Sequenz in den Hefezellen erfolgt war.
SEQUENZLISTE
• (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
• (i) APPLICANT:
• Amano Pharmaceutical
• Co, Ltd, and
• Ajinomoto Co, Inc
• (ii) TITLE OF INVENTION: Recombinant transglutaminase
• (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 22
• (v) COMPUTER READABLE FORM:
• (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
• (B) COMPUTER: IBM PC compatible
• (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
• (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.24
• (vii) PRIOR APPLICATION DATA:
• (A) APPLICATION NUMBER: JP 2-282566
• (B) FILING DATE: 19-OCT-1990
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:
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• (A) LENGTH: 331 amino acids
• (B) TYPE: amno acid
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• (ii) MOLECULE TYPE: protein
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• (C) STRANDEDNESS: double
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 1218 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: double
• (0) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 20 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: single
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (ix) FEATURE:
• (A) NAME/KEY: modified_base
• (B) LOCATION: 18
• (D) OTHER INFORMATION: /mod_base= i
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 20 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: single
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (ix) FEATURE:
• (A) NAME/KEY: modified_base
• (B) LOCATION: 6
• (D) OTHER INFORMATION: /mod_base= i
• (ix) FEATURE:
• (A) NAME/KEY: modified_base
• (B) LOGATION: 15
• (D) OTHER INFORMATION: /mod_base= i
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 564 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: double
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 1322 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: double
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
• (vi) ORIGINAL SOURCE
• (A) ORGANISM: Streptoverticillium sp.
• (vii) IMMEDIATE SOURCE:
• (B) CLONE: pTV118 NcoI
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 406 amino acids
• (B) TYPE: amino acid
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: protein
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 36 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: single
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 36 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: single
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 26 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: singie
• (D) TOPOLOGY: unear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 30 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: single
• (D) TOPOLOGY: unear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 35 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: double
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 31 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: double
• (D) TOPOLOGY: imear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 152 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: double
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 48 amino acids
• (B) TYPE: amino acid
• (D) TOPOLOGY: linear
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22:
• (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
• (A) LENGTH: 148 base pairs
• (B) TYPE: nucleic acid
• (C) STRANDEDNESS: double
• (D) TOPOLOGY: linear
• (ii) MOLECULE TYPE: Other nucleic acid (synthetic DNA)
• (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:

Claims (17)

1. Chemisch synthetisiertes oder kloniertes DNA- Fragment, enthaltend eine Basensequenz, die die folgende Aminosäuresequenz codiert:

2. DNA-Fragment nach Anspruch 1, worin das 5'-Ende der Basensequenz ferner mit einer Basensequenz ligiert ist, die die folgende Aminosäuresequenz codiert:

3. DNA-Fragment nach Anspruch 1, worin das 5'-Ende der Basensequenz ferner an eine Basensequenz ligiert ist, die die folgende Aininosäuresequenz codiert:

4. DNA-Fragment nach Anspruch 1, worin das Fragment die folgende Basensequenz enthält:

5. DNA-Fragment nach Anspruch 4, worin das 5'-Ende der Basensequenz ferner mit der folgenden Basensequenz ligiert ist:

6. DNA-Fragment nach Anspruch 1, worin das Fragment die folgende Basensequenz enthält:

7. DNA-Fragment nach Anspruch 6, worin das 5'-Ende der Basensequenz ferner mit der folgenden Basensequenz ligiert ist:

8. Expressionsvektor, umfassend das DNA-Fragment der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7.

9. Expressions/Sekretionsvektor nach Anspruch 8, worin der Vektor in E. coli AJ12569 FERM BP-3558 enthalten ist.

10. Expressions/Sekretionsvektor nach Anspruch 8, worin der Vektor pNJ1053-BTG ist, wie in Beispiel 5 angegeben.

11. Expressions/Sekretionsvektor nach Anspruch 8, worin der Vektor in Saccharomyces AJ14669 FERM BP-3585 enthalten ist.

12. Expressions/Sekretionsvektor nach Anspruch 8, worin der Vektor in Streptomyces lividans AKW-1 FERM BP-3586 enthalten ist.

13. Transformante, enthaltend einen Wirt, der mit dem Expressions/Sekretionsvektor nach Anspruch 8 transformiert ist.

14. Transformante nach Anspruch 13, worin der Wirt Escherichia coli ist.

15. Transformante nach Anspruch 13, worin der Wirt Streptomyces lividans ist.

16. Transformante nach Anspruch 13, worin der Wirt Saccharomyces cerivisiae ist.

17. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Transglutaminaseaktivität, welches die Kultur der Transformante nach Anspruch 13 und Gewinnen des produzierten Proteins umfasst.