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CN102341497B - 放线菌来源的耐热性转谷氨酰胺酶 - Google Patents

放线菌来源的耐热性转谷氨酰胺酶 Download PDF

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CN102341497B
CN102341497B CN2010800107441A CN201080010744A CN102341497B CN 102341497 B CN102341497 B CN 102341497B CN 2010800107441 A CN2010800107441 A CN 2010800107441A CN 201080010744 A CN201080010744 A CN 201080010744A CN 102341497 B CN102341497 B CN 102341497B
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Abstract

本发明致力于提供具有改良的耐热性的转谷氨酰胺酶。具体地，本发明提供了具有进一步改良的耐热性的转谷氨酰胺酶突变蛋白，如通过将适宜突变引入突变型转谷氨酰胺酶，从而掺入二硫键而获得的。

Description

放线菌来源的耐热性转谷氨酰胺酶
技术领域
本发明涉及放线菌来源的转谷氨酰胺酶(TG)的突变蛋白。转谷氨酰胺酶(也简称为TG)被广泛用于食品加工等等，因为它在蛋白质之间形成交联键且产生凝胶物质。具有改良的转谷氨酰胺酶活性或热稳定性的突变型TG有助于减少需要的TG量且可用于高温范围，从而使这种酶有可能应用于新领域。
背景技术
转谷氨酰胺酶是一种催化蛋白质的肽链中γ-羧酰胺基团的酰基转移反应的酶。当让这种酶作用于蛋白质时，可发生形成ε-(γ-Glu)-Lys交联的反应和Gln通过脱酰胺被替换为Glu的反应。迄今已经知道动物来源的转谷氨酰胺酶和微生物来源的转谷氨酰胺酶。前一类酶是Ca2+依赖性的，分布在动物器官、皮肤、血液等等中。例如，存在豚鼠肝转谷氨酰胺酶(非专利文件1)、人表皮角质形成细胞转谷氨酰胺酶(非专利文件2)、人凝血因子XIII(非专利文件3)等等。后一类酶不是Ca2+依赖性的，已经在链轮丝菌属(Streptoverticillium)的细菌中发现。例子包括灰肉色链轮丝菌(Streptoverticillium griseocarneum)IFO 12776、肉桂色链轮丝菌肉桂色亚种(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.Cinnamoneum)IFO 12852、茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)IFO 13819等等。特别地，在茂原链轮丝菌的一种变体的培养上清液中发现的转谷氨酰胺酶被称作MTG(微生物转谷氨酰胺酶)。另外，还在利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)NRRL B-3446中发现了一种不依赖Ca2+的转谷氨酰胺酶(专利文件1)。通过肽作图法和基因结构分析发现，由这些微生物生成的转谷氨酰胺酶的一级结构与动物来源的转谷氨酰胺酶没有任何同源性(专利文件2)。
MTG是一种单体蛋白，由331个氨基酸组成，具有约38,000的分子量(非专利文件4)。因为MTG是通过纯化操作从上述微生物等之一的培养物生产的，所以在供应量、效率等等方面有问题。还有人尝试通过遗传工程技术来生产转谷氨酰胺酶。已经报告了一种基于大肠杆菌、酵母等等分泌性表达的方法(专利文件3)，一种让大肠杆菌表达MTG成为蛋白质包含体，然后将此包含体用蛋白质变性剂溶解，通过处理除去变性剂，然后复原以生成活性MTG的方法(专利文件4)，及一种使用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的MTG分泌性表达的方法(专利文件5)。与动物来源的转谷氨酰胺酶不同，MTG和微生物来源的其它转谷氨酰胺酶是Ca2+依赖性的，因此被用于生产胶凝食品诸如果冻、酸奶、奶酪，或凝胶化妆品等等，改良肉的质量等等(专利文件6)。MTG还被用于生产热稳定微囊的原材料、固定化酶的载体等等，是在工业上高度有用的酶。关于酶促反应条件，例如，如果酶促反应时间较短的话，不形成胶凝食品，相反，如果反应时间太长的话，胶凝食品变得太硬，难以作为商品。因此，当MTG被用于生产胶凝食品诸如果冻、酸奶、奶酪，或凝胶化妆品等等，改良肉的质量等等时，通过调整底物和酶的浓度、反应温度、和反应时间来制备期望产品。然而，随着利用MTG生产的食品、试剂等等变得越来越多样，在有些场合仅仅通过调整浓度、温度、时间等等无法制备期望的产品；需要改变MTG的酶活性。
已知野生型MTG(野生型MTG指天然存在的且其氨基酸序列没有经过修饰的MTG)在介于约4和10之间的pH是稳定的，而且可以说在相对较宽的pH范围里是稳定的，但是它在极端酸性或碱性条件下难以反应。野生型MTG的最适温度为约50℃，它也难以在很高的温度反应。即使在低于此最适温度的温度，长时间温育可导致酶活性降低。因此，具有改善的pH稳定性、热稳定性等等的突变型转谷氨酰胺酶可望为转谷氨酰胺酶用于新目的提供可能。
MTG迄今为止主要用于食品领域。已经提议了在极其多种用途中应用的可行性，包括纺织品、化学产品(照相胶片、制革)、饲料、化妆品、和药品。
在纺织品领域，用转谷氨酰胺酶进行羊毛改性是已知的。具体地，已知通过用转谷氨酰胺酶处理羊毛，可赋予抗收缩性、抗起球性和疏水性，同时维持原有的质地(专利文件7)。当将转谷氨酰胺酶用于羊毛时，短时间内在较高温度与角蛋白反应会提高单位时间的处理量且改良生产效率，因此被认为在工业上是有用的。
制革指对动物皮(hide/skin)进行包括多个步骤的一系列处理和加工，使得皮成为耐用、柔韧的革(leather)；此加工是通过用六价铬交联皮的胶原来实现的。因为六价铬是有害的且不希望它释放入环境，所以对于替代方法的开发存在强烈的需求。关于将转谷氨酰胺酶用于制革，专利文件8披露了微生物来源的转谷氨酰胺酶可用于制革，但是没有披露实际容许转谷氨酰胺酶作用于皮的例子；转谷氨酰胺酶尚未在实际应用中用于此目的。由于用六价铬进行的交联在pH 3至4发生，转谷氨酰胺酶在此pH也能反应似乎是理想的，但是因为MTG对酸性不稳定，所以难以实际应用。
因此，在诸如纺织品加工和制革等应用的场合，想要改良转谷氨酰胺酶的热稳定性(即耐热性)以在短时间里在高温完成反应，及改良的pH稳定性以容许在酸性区域中反应。
如上所述，作为用于改变和改良转谷氨酰胺酶的酶活性的手段，可监测转谷氨酰胺酶自身的改变，即转谷氨酰胺酶的热稳定性和pH稳定性等等的改良。例如，改良热稳定性可拓宽适用性，从而可以预期提高反应速率等。还有，改良pH稳定性会容许更宽pH范围内的酶促反应和贮存。这在工业化中也会是有利的。
为了改变转谷氨酰胺酶的耐热性和/或pH稳定性，有必要制备转谷氨酰胺酶的突变体，评估其活性等等，并找出卓越的突变体，即具有改良的耐热性和/或pH稳定性的突变体。为了制备突变体，有必要操作野生型基因；因此，必须能制备重组蛋白。对于MTG而言，已建立了使用谷氨酸棒状杆菌的分泌性表达系统(专利文件5)。
为了提高蛋白质的稳定性，一般可能使用引入非共价键诸如氢键、静电相互作用或疏水相互作用，或共价键诸如二硫键来增强分子内疏水核的堆填或稳定二级结构中的α螺旋的方法，或消除使得蛋白质的结构不稳定的因素的方法。为了通过引入二硫键来提高蛋白质的稳定性，有必要找出适合于引入半胱氨酸的位置。对于MTG而言，已创建了通过引入二硫键而改良了耐热性和/或pH稳定性的突变型转谷氨酰胺酶(专利文件9)。
专利文件9披露了通过将二硫键引入野生型转谷氨酰胺酶等等而制备的突变型转谷氨酰胺酶。例如，专利文件9披露了拥有转谷氨酰胺酶活性且具有至少一处选自下述的突变的蛋白质：
a)MTG中的7位和58位替代为半胱氨酸，
b)46位和318位替代为半胱氨酸，
c)93位和112位替代为半胱氨酸，
d)106位和213位替代为半胱氨酸，
e)160位和228位替代为半胱氨酸，
f)2位和282位替代为半胱氨酸，
g)2位和283位替代为半胱氨酸，
h)3位和283位替代为半胱氨酸，和
i)17位和330位替代为半胱氨酸，
编码所述蛋白质的多核苷酸、包含所述多核苷酸之一的重组载体、经所述载体之一转化的宿主细胞、包括培养所述宿主细胞的生产转谷氨酰胺酶的方法、等等，还披露了使用此类突变型转谷氨酰胺酶加工底物蛋白的方法。
然而，尽管在通过将二硫键引入上文所述的MTG而制备的突变型转谷氨酰胺酶中观察到耐热性和/或pH稳定性的一些改善，但是想要进一步改善耐热性以容忍用于纺织品加工等等的高温。
为了改变通过将二硫键引入MTG而制备的突变型转谷氨酰胺酶的酶活性，有必要制备其突变体，评估其活性等等，并找出更好的突变体。为了制备突变体，有必要操作野生型基因；因此，必须能制备重组蛋白。在MTG的情况中，已建立了使用谷氨酸棒状杆菌的分泌性表达系统(专利文件5)。
虽然非专利文件5描述了一些MTG突变体，但是这些突变体的耐热性不适合它们在较高温度的用途，如用于纺织品加工等。
文献列表
专利文件
专利文件1：JP-A-H10-504721
专利文件2：EP-A-0481504A1
专利文件3：JP-A-H5-199883
专利文件4：JP-A-H6-30771
专利文件5：WO2002/081694
专利文件6：JP-A-64-27471
专利文件7：JP-A-H3-213574
专利文件8：US-B-6,849,095
专利文件9：WO2008/099898
非专利文件
非专利文件1：K.Ikura等，Biochemistry，27，2898，1988
非专利文件2：M.A.Phillips等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，87，9333，1990
非专利文件3：A.Ichinose等，Biochemistry，25，6900，1986
非专利文件4：T Kanaji等，Journal of Biological Chemistry.268，11565，1993
非专利文件5：C.K.Marx等，Journal ofBiotechnology，136(3)，p.156-162，Sep 2008
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的一个目的是提供具有与野生型(以下也简称为WT)转谷氨酰胺酶和专利文件9中记载的通过将二硫键引入WT转谷氨酰胺酶而制备的突变型转谷氨酰胺酶(以下也简称为“二硫键引入型转谷氨酰胺酶”)相比改善的耐热性的转谷氨酰胺酶突变蛋白，由此使得在高温下短时间内进行酶促反应成为可能。
解决问题的手段
本发明人为了解决上文所述的问题而进行了广泛的探讨，结果，通过向专利文件9中记载的二硫键引入型转谷氨酰胺酶基因进一步引入突变，提供了具有与原始的二硫键引入型转谷氨酰胺酶相比改善的耐热性的转谷氨酰胺酶突变蛋白，从而完成了本发明。本发明的突变蛋白使得在高温下短时内进行酶促反应成为可能，适合于纺织品加工、制革等等。
本发明可概述如下。
[1].一种具有转谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白质：
(A)在SEQ ID NO：2中在至少一个选自101位、157位和250位的位置处具有突变的氨基酸序列；
(B)在序列(A)中在除了101位、157位和250位之外的位置处具有一个至几个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
(C)在选自SEQ ID NO：4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在与选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12的氨基酸序列具有70％或更高同源性并具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的氨基酸序列中，在至少一个选自对应于101位、157位和250位的位置处具有突变的氨基酸序列；或
(D)在序列(C)中在除了对应于SEQ ID NO：2的101位、157位和250位之外的位置处具有一个至几个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
[2].上述[1]的蛋白质，进一步具有至少一个选自下面a)至d)的突变：
a)3位和283位突变为半胱氨酸，
b)2位和282位突变为半胱氨酸，
c)2位和283位突变为半胱氨酸，
d)7位和58位突变为半胱氨酸。
[3].一种具有转谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白质：
(A)在SEQ ID NO：2中，在3位和283位具有变为半胱氨酸的突变，并还在至少一个选自101位、157位和250位的位置处具有突变的氨基酸序列；
(B)在序列(A)中在除了3位、101位、157位、250位和283位之外的位置处具有一个至几个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；
(C)在选自SEQ ID NO：4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在与选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12的氨基酸序列具有70％或更高同源性并具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的氨基酸序列中，在对应于SEQ ID NO：2的3位和283位具有变为半胱氨酸的突变，并还在至少一个选自对应于101位、157位和250位的位置处具有突变的氨基酸序列；或
(D)在序列(C)中在除了对应于SEQ ID NO：2的3位、101位、157位、250位和283位之外的位置处具有一个至几个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
[4].一种具有转谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白质：
(A)在SEQ ID NO：2中，在2位和282位具有变为半胱氨酸的突变，并还在至少一个选自101位、157位和250位的位置处具有突变的氨基酸序列；
(B)在序列(A)中在除了2位、101位、157位、250位和282位之外的位置处具有一个至几个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；
(C)在选自SEQ ID NO：4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在与选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12的氨基酸序列具有70％或更高同源性并具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的氨基酸序列中，在对应于SEQ ID NO：2的2位和282位具有变为半胱氨酸的突变，并还在至少一个选自对应于101位、157位和250位的位置处具有突变的氨基酸序列；或
(D)在序列(C)中在除了对应于SEQ ID NO：2的2位、101位、157位、250位和282位之外的位置处具有一个至几个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
[5]一种具有转谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白质：
(A)在SEQ ID NO：2中，在2位和283位具有变为半胱氨酸的突变，并还在至少一个选自101位、157位和250位的位置处具有突变的氨基酸序列；
(B)在序列(A)中在除了2位、101位、157位、250位和283位之外的位置处具有一个至几个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；
(C)在选自SEQ ID NO：4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在与选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12的氨基酸序列具有70％或更高同源性并具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的氨基酸序列中，在对应于SEQ ID NO：2的2位和283位具有变为半胱氨酸的突变，并还在至少一个选自对应于101位、157位和250位的位置处具有突变的氨基酸序列；或
(D)在序列(C)中在除了对应于SEQ ID NO：2的2位、101位、157位、250位和283位之外的位置处具有一个至几个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
[6].一种具有转谷氨酰胺酶活性，并具有下述氨基酸序列A、B、C或D的蛋白质：
(A)在SEQ ID NO：2中，在7位和58位具有变为半胱氨酸的突变，并还在至少一个选自101位、157位和250位的位置处具有突变的氨基酸序列；
(B)在序列(A)中在除了7位、58位、101位、157位和250位之外的位置处具有一个至几个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；
(C)在选自SEQ ID NO：4、6、8、10和12的氨基酸序列中，或在与选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12的氨基酸序列具有70％或更高同源性并具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的氨基酸序列中，在对应于SEQ ID NO：2的7位和58位具有变为半胱氨酸的突变，并还在至少一个选自对应于101位、157位和250位的位置处具有突变的氨基酸序列；或
(D)在序列(C)中在除了对应于SEQ ID NO：2的7位、58位、101位、157位和250位之外的位置处具有一个至几个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
[7].上述[3]的蛋白质，其中在(A)或(B)中SEQ ID NO：2的101位、157位和250位，或在(C)或(D)中对应于这些位置的位置处的氨基酸突变为：
101位：突变为脯氨酸，
157位：突变为丙氨酸或丝氨酸，
250位：突变为丙氨酸或精氨酸。
[8].上述[3]的蛋白质，其中所述蛋白质具有
SEQ ID NO：2中的
3位的天冬氨酸突变为半胱氨酸；
101位的丝氨酸突变为脯氨酸；
157位的甘氨酸突变为丝氨酸；
250位的甘氨酸突变为精氨酸；和
283位的甘氨酸突变为半胱氨酸。
[9].上述[3]的蛋白质，其中所述蛋白质在SEQ ID NO：2中，除了3位的天冬氨酸突变为半胱氨酸和283位的甘氨酸突变为半胱氨酸之外，还具有下述所示突变的组合之任一：
(1)101位的丝氨酸突变为脯氨酸，157位的甘氨酸突变为丝氨酸，和250位的甘氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或天冬氨酸；
(2)157位的甘氨酸突变为丝氨酸，250位的甘氨酸突变为精氨酸，和101位的丝氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸或谷氨酸；或
(3)101位的丝氨酸突变为脯氨酸，250为的甘氨酸突变为精氨酸，和157位的甘氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
[10].上述[3]的蛋白质，其中所述蛋白质在SEQ ID NO：2中，除了3位的天冬氨酸突变为半胱氨酸和283位的甘氨酸突变为半胱氨酸之外，还具有
101位的丝氨酸突变为脯氨酸；
157位的甘氨酸突变为丙氨酸、丝氨酸或精氨酸；和
250位的甘氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或精氨酸。
[11].上述[10]的蛋白质，其中所述蛋白质在SEQ ID NO：2中，除了3位的天冬氨酸突变为半胱氨酸和283位的甘氨酸突变为半胱氨酸之外，还具有下述所示的突变组合之任一：
(1)101位的丝氨酸突变为脯氨酸，157位的甘氨酸突变为丝氨酸，和250位的甘氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或精氨酸；
(2)157位的甘氨酸突变为丝氨酸，250位的甘氨酸突变为精氨酸，和101位的精氨酸突变为脯氨酸；或
(3)101位的丝氨酸突变为脯氨酸，250位的甘氨酸突变为精氨酸，和157位的甘氨酸突变为丙氨酸、丝氨酸或精氨酸。
[12].上述[7]-[11]中任一项的蛋白质，其中所述蛋白质在SEQ ID NO：2中，进一步包含208位的精氨酸突变为亮氨酸、丙氨酸或谷氨酸。
[13].上述[8]的蛋白质，其中所述蛋白质在SEQ ID NO：2中，进一步包含：
(1)208位的精氨酸突变为色氨酸，
(2)268位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，
(3)132位的缬氨酸突变为亮氨酸，
(4)238位的精氨酸突变为甲硫氨酸，或
(5)249位的谷氨酸突变为赖氨酸。
[14].一种多核苷酸，其编码上述[1]-[13]中任一项的蛋白质。
[15].一种重组载体，其包含上述[14]的多核苷酸。
[16].一种宿主细胞，其经上述[15]的重组载体转化。
[17].一种产生上述[1]至[13]中任一项的蛋白质的方法，包括培养上述[16]的宿主细胞，并收集具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质。
[18].一种处理底物蛋白的方法，包括允许上述[1]至[13]中任一项的蛋白质、由上述[17]的方法产生的蛋白质，或上述[16]的宿主细胞作用于底物蛋白的步骤。
[19].上述[18]的方法，其中对底物蛋白的处理在40℃至100℃进行。
发明的效果
依照本发明，通过修饰常规的二硫键引入型转谷氨酰胺酶(特别是二硫键引入型MTG)，有可能提供具有进一步改善的耐热性的转谷氨酰胺酶。另外，通过使用具有改良的耐热性的转谷氨酰胺酶，能提供新产品和新技术。
附图说明
图1是显示自二硫键引入型转谷氨酰胺酶衍生的多种突变体的耐热性(残留活性)的图示。
图2是显示实施例8中鉴定的6种突变体的耐热性(残留活性)的图示。
图3是显示实施例10中的耐热性评估的结果的图。
图4A是显示表6中所列突变体的耐热性评估结果的图示。
图4B是显示表6中所列突变体的耐热性评估结果的图示。
图4C是显示表6中所列突变体的耐热性评估结果的图示。
图5是显示通过MSS2βB的R208处的氨基酸替代生成的各种突变体的耐热性评估结果的图。
图6是显示表11中所列的突变体的耐热性评估结果的图示。
发明详述
下面具体描述本发明。转谷氨酰胺酶被广泛用于生产食品诸如果冻、奶酪、酸奶、豆腐、鱼糕、火腿、香肠、和面条，改良肉的质量等等(JP-A-SHO-64-27471)。转谷氨酰胺酶还被用于生产热稳定微胶囊的原材料、固定化酶的载体等等，是用于多种工业目的的酶。转谷氨酰胺酶催化蛋白质分子的肽链中谷氨酰胺残基上的γ-羧酰胺基团的酰基转移反应。当蛋白质分子中的赖氨酸残基的ε-氨基担当酰基受体时，在蛋白质分子中及在分子间形成ε-(γ-Glu)-Lys键。
转谷氨酰胺酶大体上分为Ca2+依赖性的(来源于动物)和不依赖Ca2+的(来源于微生物)。作为微生物来源的TG，自放线菌衍生的TG是已知的。下表显示了自放线菌衍生的TG的核苷酸序列和氨基酸序列的例子。
表1：放线菌的名称、核苷酸序列和氨基酸序列
  放线菌  核苷酸序列  氨基酸序列
  茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)  SEQ ID NO：1  SEQ ID NO：2
  肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)  SEQ ID NO：3  SEQ ID NO：4
  弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)  SEQ ID NO：5  SEQ ID NO：6
  拉达卡链霉菌(Streptomyces ladakanum)  SEQ ID NO：7  SEQ ID NO：8
  利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)  SEQ ID NO：9  SEQ ID NO：10
  普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)  SEQ ID NO：11  SEQ ID NO：12
即使在使用这些以外的转谷氨酰胺酶同源物时，依照本文所述方法也可获得具有改善的耐热性的突变蛋白。具体地，因为转谷氨酰胺酶因其来源的微生物物种和菌株不同而可具有略微不同的序列，所以能加以修饰而获得本发明的突变蛋白的转谷氨酰胺酶的氨基酸序列不限于上文的氨基酸序列No.2，4，6，8，10和12；任何具备转谷氨酰胺酶活性并与SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12具有70％、优选80％、更优选90％、特别优选95％或更多、最优选98％或更多同源性的蛋白质均可用来通过以与下文所述方法相同的方式实施比对，并鉴定对应的氨基酸残基以向该氨基酸残基引入突变，来获得本发明的突变体。如本文所述，“同源性”指同一性。
为了同源性分析，可使用例如“Genetyx ver.7(Genetyx Corporation)”的缺省参数进行计算。
另外，在严格条件下与上述SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11所示的核苷酸序列的互补序列或者能从这些序列制备的探针杂交，且编码具备转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的多核苷酸也可用于制备本发明的突变蛋白。
在本文中，“严格条件”的例子包括这样的条件，在此条件下互相高度同源的核苷酸序列(例如共享80、90、95、97或99％或更多同源性的核苷酸序列)彼此杂交，而同源性较之更低的核苷酸序列则不彼此杂交的条件，具体地说，包括常规Southern杂交清洗条件，即涉及在相当于60℃、1x SSC、0.1％SDS，优选0.1x SSC、0.1％SDS，和更优选68℃、0.1x SSC、0.1％SDS等的盐浓度和温度清洗1次，更优选2至3次的条件。
作为探针，也可使用核苷酸序列SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11的部分序列。此类探针可通过PCR来制备，以基于上述核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物，并以包含核苷酸序列SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11的DNA片段作为模板。例如，当使用长约300bp的DNA片段作为探针时，作为杂交清洗条件，可列举50℃、2x SSC、0.1％SDS。
可通过例如对由微生物等等(包括下文描述的转化体)表达和分泌的产物进行分离、回收、纯化等等步骤来获得转谷氨酰胺酶。也可使用由微生物等等表达的转谷氨酰胺酶。
“转谷氨酰胺酶活性”指如上所述在蛋白质中的谷氨酰胺残基和赖氨酸残基之间形成交联的活性。转谷氨酰胺酶活性可以在转谷氨酰胺酶以TG的形式自微生物等等分离和纯化时测量，而且也可以在它在微生物等等中表达时测量。
转谷氨酰胺酶活性可通过氧肟酸盐方法(J.Biol.Chem.，241，5518-5525，1966)来测定。
氧肟酸盐方法中的转谷氨酰胺酶的每个活性单位定义如下。具体地说，用苄氧基羰基-L-谷氨酰胺酰甘氨酸和羟胺作为底物进行反应，并在三氯乙酸存在下将所得的氧肟酸转变成铁复合物，之后以525nm吸光度测量它的量。如此从氧肟酸的量生成标准曲线，并将在1分钟里生成1mmol氧肟酸盐的酶量定义为1个转谷氨酰胺酶活性单位。这种测量方法的详情如已有报告中所述(参见例如JP-A-SHO-64-27471等等)。
“WT(野生型)转谷氨酰胺酶(TG)”指在其氨基酸序列中没有引入突变的天然存在的转谷氨酰胺酶。
如本文所述，“二硫键引入型转谷氨酰胺酶(TG)”指通过将能够形成二硫键的氨基酸突变(将处于互相适宜的空间位置的任何两个氨基酸残基替代成半胱氨酸残基)引入WT转谷氨酰胺酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2等等)而制备的转谷氨酰胺酶。为了获得本发明的转谷氨酰胺酶突变蛋白，优选且方便的是修饰这种“二硫键引入型转谷氨酰胺酶”。这在需要时也称作“原始的(或模板)”二硫键引入型转谷氨酰胺酶。这也可通过修饰WT转谷氨酰胺酶来获得。
此类“二硫键引入型转谷氨酰胺酶”的例子包括但不限于上文所述WO2008/099898(专利文件9)中记载的那些；优选使用具有与WT转谷氨酰胺酶相比改善的耐热性者。在本文中，具体针对它们中的一种在耐热性方面显示较好结果的二硫键引入型突变体，也就是SEQ ID NO：2的3位和283位氨基酸被替代成半胱氨酸的二硫键引入型TG，详细描述了通过引入随机突变来获得本发明耐热性转谷氨酰胺酶(本发明的转谷氨酰胺酶突变体)的步骤；然而，在此以外的二硫键引入型TG(例如上文所述SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12或其同源物的3位和283位及与其对应的位置上的氨基酸已替代成半胱氨酸的TG)亦可用作模板。
在本文中，当本发明的转谷氨酰胺酶突变蛋白的耐热性与二硫键引入型转谷氨酰胺酶的耐热性相比有“改善”时，此突变蛋白被认为是优选的本发明突变体。
在本文中，“耐热性(即热稳定性)改善”指即使在不适于长时间(例如约10分钟或更多)使用WT转谷氨酰胺酶的温度范围(WT转谷氨酰胺酶的活性经长时间温育而显著降低的温度)内，例如在约50℃或更高、优选约55℃或更高、优选约60℃或更高、更优选约65℃或更高、进一步更优选约68℃或更高的温度下，酶变得能够更长时间保留其活性。因此在本文中，“耐热性改善”指当将转谷氨酰胺酶在此范围中的温度(例如约50℃，约55℃，约60℃，约65℃，约68℃)温育较长时间(例如约1小时，约2小时，约3小时)时，其活性降低的比率小于WT转谷氨酰胺酶，更优选小于原始的二硫键引入型转谷氨酰胺酶。
本发明的转谷氨酰胺酶突变蛋白例如是在于65℃加热10分钟后具有1％或更多，3％或更多，优选10％或更多，和更优选20％或更多的残留活性的蛋白质。
从生产效率的观点看，本发明的转谷氨酰胺酶突变蛋白优选是与WT转谷氨酰胺酶或原始的二硫键引入型转谷氨酰胺酶，特别是与原始的二硫键引入型转谷氨酰胺酶相比，当通过本文所述的方法等表达时其表达水平不展现显著降低者。
本发明的转谷氨酰胺酶突变蛋白是具有(A)在选自101位、157位和250位的至少一个位置处具有突变的氨基酸序列；或(B)在SEQ ID NO：2中101位、157位和250位以外的位置处具有一个至数个残基的替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列的蛋白质。另外，具有(C)在选自SEQ ID NO：4，6，8，10和12的氨基酸序列中或在与选自SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12的氨基酸序列具有70％或更多(优选80％或更多，更优选90％或更多，特别优选95％或更多，最优选98％或更多)同源性且具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的氨基酸序列中选自与101位、157位和250位对应的位置的至少一个位置处具有突变的氨基酸序列；或(D)在序列(C)中与SEQ ID NO：2的101位、157位和250位对应的位置以外的位置处具有一个至数个残基的替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列的蛋白质，也落在本发明的范围中。
在上文所述蛋白质中，进一步掺入能够形成二硫(S-S)键的氨基酸突变的蛋白质也落在本发明的范围中。突变包括但不限于专利文件9中披露的那些，优选是选自3位和283位替代成半胱氨酸、2位和282位替代成半胱氨酸、2位和283位替代成半胱氨酸、或7位和58位替代成半胱氨酸的至少一处。
具体地，本发明的转谷氨酰胺酶突变蛋白是具有在SEQ ID NO：2中(A)3位和283位(或者2位和282位，2位和283位，或7位和58位)突变成半胱氨酸，且还在选自101位、157位和250位的至少一个位置处具有突变的氨基酸序列；或(B)在上文(A)中所述位置以外的位置处具有一个至数个残基的替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列的蛋白质。另外，具有(C)在选自SEQ IDNO：4，6，8，10和12的氨基酸序列中，在与SEQ ID NO：2的3位和283位(或者2位和282位，2位和283位，或7位和58位)对应的位置处具有突变成半胱氨酸的突变，而且在选自与SEQ ID NO：2的101位、157位和250位对应的位置中的至少一个位置处具有突变的氨基酸序列；或者，在与选自SEQ IDNO：2，4，6，8，10和12的氨基酸序列具有70％或更多(优选80％或更多，更优选90％或更多，特别优选95％或更多，最优选98％或更多)同源性且具备转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的氨基酸序列中，在与SEQ ID NO：2的3位和283位对应的位置处有突变为半胱氨酸的突变，并且还在选自与SEQ ID NO：2的101位、157位和250位对应的位置中的至少一个位置处具有突变的氨基酸序列；或(D)在序列(C)中上文(C)中所述位置以外的位置处具有一个至数个残基的替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列的蛋白质，也落在本发明的范围中。
上文氨基酸序列(B)具体是除了在SEQ ID NO：2的3位和283位(或者2位和282位，2位和283位，或7位和58位)具有突变成半胱氨酸的突变，并且在选自101位、157位和250位中的至少一个位置处具有突变之外，在所示各位置和/或在它们以外的位置处具有一个至数个残基的替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列。这同样适用于上文氨基酸序列(D)。
在本文中，选自SEQ ID NO：4，6，8，10和12的氨基酸序列中与上述位置“对应”的位置是通过将这些序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列比对来确定的。将任何本文所示者以外的转谷氨酰胺酶同源物的氨基酸序列与SEQ IDNO：2的氨基酸序列比对以确定“对应”位置，以及将突变引入该位置也是可能的。例如，当在SEQ ID NO：2与另一序列的比对中引入缺口时，应当注意上文所述位置可能向前或向后偏移。关于对应位置，参见例如WO2008/099898(专利文献9)的图4。
用于氨基酸序列比对的算法包括NCBI BLAST((美国)国家生物技术信息中心基本局部比对搜索工具)、Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993)中记载的算法(该算法被整合到NBLAST和XBLAST程序(2.0版)(Altschul等，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))中)、Needleman等，J.Mol.Biol.，48：444-453(1970)中记载的算法(该算法被整合到GCG软件包中的GAP程序中)、Myers和Miller，CABIOS，4：11-17(1988)中记载的算法(该算法被整合到ALIGN程序(2.0版，CGC序列比对软件包的一部分中))、Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444-2448(1988)中记载的算法(该算法被整合到GCG软件包中的FASTA程序中)等等。
在衍生自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶(MTG)之外，对于被认定为与该酶具有一定的氨基酸序列同源性且具有转谷氨酰胺酶活性的酶，或具有与该酶相似的3D构象且具有转谷氨酰胺酶活性的酶，基于MTG的3D(三维)构象加以修饰是完全有可能的。在MTG中有效改变底物特异性等等的氨基酸替代，在衍生自如肉桂链霉菌和利迪链霉菌(JP-T-HEI-10-504721)等微生物的相关酶中预期也是有效的。
优选地，本发明的转谷氨酰胺酶突变蛋白是SEQ ID NO：2，4，6，8或10(包括其同源序列)中上文所述位置(或与其对应的位置)中的3位和283位突变成半胱氨酸的蛋白质，以及除了3位和283位的半胱氨酸残基之外，还包含选自101位的突变(优选突变成脯氨酸)、157位的突变(优选突变成丙氨酸或丝氨酸)、和250位的突变(优选突变成丙氨酸或精氨酸)(或与它们对应的位置处的相似突变)的突变的蛋白质。本发明的突变蛋白在这些突变之外还可以具有一个至数个残基的替代、删除、添加和/或插入。
本发明的突变蛋白可包含上文所述突变的任意组合，只要获得的转谷氨酰胺酶突变蛋白拥有转谷氨酰胺酶活性，尤其是具有与原始的二硫键引入型转谷氨酰胺酶相比改善的耐热性即可。上文所述位置的氨基酸突变优选是氨基酸替代突变。
除了这些突变(特别是上文所述3位和283位突变成半胱氨酸)之外，还可具有仅1对突变成半胱氨酸的突变或多对突变成半胱氨酸的突变的组合。此类成对的突变成半胱氨酸的突变包括但不限于专利文件9中披露的那些。这样的蛋白质可依照本领域公知的方法来制备。
上文所述替代、删除、添加和/或插入不受特别限制，只要获得的转谷氨酰胺酶突变蛋白拥有转谷氨酰胺酶活性，特别是其耐热性与原始的二硫键引入型转谷氨酰胺酶相比得到改善即可。这样的突变蛋白中存在的替代、删除、添加和/或插入的数目虽然希望是一个至数个残基(1至30，优选1至15，更优选1至5，3或2个残基)，但是可替代、插入、添加和/或删除任何数目的氨基酸，只要突变蛋白拥有转谷氨酰胺酶活性，特别是只要其耐热性与原始的二硫键引入型转谷氨酰胺酶相比得到改善即可。例如，当此突变是替代时，因为预测用相似氨基酸进行的替代(即保守氨基酸替代)不太可能影响蛋白质的功能，所以用相似氨基酸进行的替代是优选的。在本文中，“相似氨基酸”指具有相似物理化学特性的氨基酸；其例子包括归在如芳香族氨基酸(Phe，Trp，Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala，Leu，Ile，Val)、极性氨基酸(Gln，Asn)、碱性氨基酸(Lys，Arg，His)、酸性氨基酸(Glu，Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser，Thr)和具有小侧链的氨基酸(Gly，Ala，Ser，Thr，Met)等同组下的氨基酸，诸。保守氨基酸替代的具体例子是本领域已知的。
最优选的本发明转谷氨酰胺酶突变蛋白是SEQ ID NO：2中3位的天冬氨酸突变成半胱氨酸、101位丝氨酸突变成脯氨酸、157位甘氨酸突变成丝氨酸、250位甘氨酸突变成精氨酸、且283位甘氨酸突变成半胱氨酸的蛋白质。
此外，在SEQ ID NO：2中除了3位天冬氨酸突变成半胱氨酸和283位甘氨酸突变成半胱氨酸之外，还具有选自101位丝氨酸突变成脯氨酸、157位甘氨酸突变成丝氨酸、和250位甘氨酸突变成精氨酸中的两处突变，且其余一个位置突变成另一种氨基酸的蛋白质也是优选的。优选地，这些蛋白质是在SEQ ID NO：2中除了3位天冬氨酸突变成半胱氨酸和283位甘氨酸突变成半胱氨酸之外，还包含(1)101位丝氨酸突变成脯氨酸，157位甘氨酸突变成丝氨酸，和250位甘氨酸突变成丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或天冬氨酸；(2)157位甘氨酸突变成丝氨酸，250位甘氨酸突变成精氨酸，和101位丝氨酸突变成甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸或谷氨酸；或(3)101位丝氨酸突变成脯氨酸，250位甘氨酸突变成精氨酸，和157位甘氨酸突变成丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸的蛋白质。
还优选在SEQ ID NO：2中除3位天冬氨酸突变成半胱氨酸和283位甘氨酸突变成半胱氨酸之外，还具有101位丝氨酸突变成脯氨酸；157位甘氨酸突变成丙氨酸、丝氨酸或精氨酸；和250位甘氨酸突变成丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或精氨酸的蛋白质。
更优选的蛋白质是在SEQ ID NO：2中除3位天冬氨酸突变成半胱氨酸和283位甘氨酸突变成半胱氨酸之外，还包含(1)101位丝氨酸突变成脯氨酸，157位甘氨酸突变成丝氨酸，和250位甘氨酸突变成丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或精氨酸；(2)157位甘氨酸突变成丝氨酸，250位甘氨酸突变成精氨酸，和101位丝氨酸突变成脯氨酸；或(3)101位丝氨酸突变成脯氨酸，250位甘氨酸突变成精氨酸，和157位甘氨酸突变成丙氨酸、丝氨酸或精氨酸的蛋白质。
在上述优选的本发明蛋白质中，还优选208位精氨酸残基被进一步突变的蛋白质。此类优选蛋白质的例子包括在SEQ ID NO：2中除了3位天冬氨酸突变成半胱氨酸，101位丝氨酸突变成脯氨酸，157位甘氨酸突变成丝氨酸，250位甘氨酸突变成精氨酸，和283位甘氨酸突变成半胱氨酸之外，208位精氨酸残基被进一步突变的蛋白质。例如，此突变优选是208位精氨酸突变成亮氨酸、丙氨酸或谷氨酸。
或者，在SEQ ID NO：2中除了3位天冬氨酸突变成半胱氨酸，101位丝氨酸突变成脯氨酸，157位甘氨酸突变成丝氨酸，250位甘氨酸突变成精氨酸，和283位甘氨酸突变成半胱氨酸之外，进一步包含(1)208位精氨酸突变成色氨酸，(2)268位天冬氨酸突变成天冬酰胺，(3)132位缬氨酸突变成亮氨酸，(4)238位精氨酸突变成甲硫氨酸，或(5)249位谷氨酸突变成赖氨酸的蛋白质也可以是优选的本发明蛋白质。
本发明还提供了编码本发明转谷氨酰胺酶突变蛋白的多核苷酸(称作本发明的多核苷酸)。此类多核苷酸可使用本领域公知的方法(例如本文中描述的方法)来获得。可使用适宜的限制酶将此多核苷酸插入载体以获得重组载体。
本发明的重组载体中使用的载体骨架可根据其目的(例如克隆、蛋白质表达)、或者从适合于载体要导入的宿主细胞(优选微生物)的载体恰当地选择。当此重组载体是表达载体时，此表达载体包含与适宜启动子可操作连接的本发明的多核苷酸，优选在本发明的多核苷酸的下游包含转录终止信号，即终止子区。另外，重组载体可进一步包含用于选择转化体的选择标志基因(药物抗性基因、补偿营养缺陷型突变的基因等等)。重组载体也可包含编码对分离/纯化表达的蛋白质有用的标签序列等的序列。载体也可以是整合入受试宿主细胞的基因组者。
可使用例如公知的转化技术，诸如感受态细胞法、原生质体法、磷酸钙共沉淀方法、聚乙二醇法、锂法、电穿孔法、显微注射法、脂质体融合法、或颗粒枪法，将载体导入对象宿主细胞。
本发明还提供了用这样的重组载体转化的宿主细胞(以下也称作本发明的转化体)。作为宿主细胞，可列举原核细胞诸如大肠杆菌和放线菌，和真核细胞诸如酵母。如果期望表达蛋白质，宿主细胞是适合于蛋白质生成且能够表达功能性形式的本发明突变蛋白的宿主细胞。本发明的转化体可使用上文所述转化技术之一来获得。虽然任何已开发了可用的重组载体系统的微生物均可用作宿主细胞，但是优选的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母、芽孢杆菌属的细菌、各种放线菌等等。
本发明的转化体可以在本领域常用的条件下培养。例如，可根据培养的转化体恰当地选择培养温度、时间、培养基组成、pH、搅拌条件等等。
本发明的转谷氨酰胺酶突变蛋白被本发明的转化体所表达。转谷氨酰胺酶突变蛋白可在自转化体分泌或自转化体分离/纯化之后使用，也可以作为含有突变蛋白的转化体原样使用。蛋白质的分离和纯化可依照本身已知的方法来实施。
本发明的转谷氨酰胺酶突变蛋白可首先作为原形(pro-form)表达，然后用适宜的蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶)处理，产生成熟形；或者，可以在对象宿主细胞中同时表达原形和蛋白酶以获得成熟形。
在本发明中，提供为了进一步改善二硫键引入型转谷氨酰胺酶的耐热性而向二硫键引入型转谷氨酰胺酶基因中引入随机变异，从而具有与原始的二硫键引入型转谷氨酰胺酶相比改善的耐热性的转谷氨酰胺酶突变蛋白。
二硫键引入型转谷氨酰胺酶基因中随机突变的引入以及对二硫键引入型转谷氨酰胺酶突变体的初次筛选可以如下文所述来实现。衍生自茂原链轮丝菌DSMZ株的转谷氨酰胺酶基因的序列已得到测定(Eur.J.Biochem.，257，570-576，1998)。参考此序列构建了突变型转谷氨酰胺酶基因，其中在编码MTG活性本体的成熟形区(约1,000bp)中引入了7位和58位替代成半胱氨酸，或2位和282位替代成半胱氨酸，或2位和283位替代成半胱氨酸，或3位和283位替代成半胱氨酸的替代。将突变引入这种二硫键引入型转谷氨酰胺酶基因，使得会在碱基序列水平上两个或三个位点处发生突变。通过用限制性内切核酸酶处理掺入有突变的PCR产物和MTG表达载体pPSPTG11(App.Env.Micro.，2003，69，358-366)并连接它们，可容易地用引入有突变的MTG基因替换pPSPTG11的MTG基因部分。用通过连接制备的质粒转化大肠杆菌，并对获得的菌落进行混合培养，接着进行质粒提取。用获得的质粒通过电穿孔转化自谷氨酸棒状杆菌AJ12036构建的YDK010(FERM BP-734)(WO 2002/081694)(所用的构建方法记载于WO2002/081694)。
转化体的筛选可通过氧肟酸盐方法(J.Biol.Chem.，241，5518-5525，1966)来实现。该测定可以使用96孔板，也可以使用试管来实施。当使用未掺入突变的菌株作为对照时，可选择具有与对照等同或更多的吸光度者。
可通过确认通过筛选获得的菌株的碱基序列来分析突变点。对于突变点已鉴定的，可通过此类活性和蛋白质含量来计算比活性。活性和蛋白质含量可通过文献(Prot.Exp.Puri.，2002，26，329-335)中记载的方法来测量。
如果在通过确认碱基序列来鉴定会产生高活性的突变点后发现存在具有多处突变的突变体，也可以生成只导入一处突变点的突变体，确切地评估突变点对活性的效果。还可以通过从鉴定的突变点中选择多个来生成多重突变体，并评估突变点组合的效果。突变的引入可以方便地使用Stratagene等等的QuikChange II Site-Directed Mutagenesis试剂盒来实现。
获得的转化体的培养及转谷氨酰胺酶突变蛋白的分离和纯化可如例外下文所述来实施。将含有卡那霉素的CM2G培养基分配至试管中。接种转化体并于30℃预培养24小时。将含有卡那霉素和CaCO3二者的MM培养基以每个烧瓶50ml分配至坂口烧瓶中，接种预培养液并培养。将培养液离心，过滤上清液，并利用Sephadex G25(M)更换溶剂为20mM磷酸盐缓冲溶液，pH7.0。以转谷氨酰胺酶量的1/100量添加枯草杆菌蛋白酶，并让反应于30℃进行16小时以活化转谷氨酰胺酶。将经过活化的溶液使用Sephadex G25(M)与阳离子交换层析平衡缓冲溶液(20mM乙酸盐缓冲溶液，pH 5.5)交换。接着，将全量加载至用相同缓冲溶液完全平衡的阳离子交换柱(Resource S 6ml；由GE Healthcare Bioscience制造)上。用相同缓冲溶液再平衡后，以波长280nm处的UV吸收作为指标，对在线性浓度梯度0→0.5M NaCl上200mM的NaCl浓度附近洗脱的蛋白质级分分级。测量所得级分活性和蛋白质含量，并回收排除了比活性低的级分的、具有几乎等同的比活性的峰顶附近的级分。使回收的级分通过Sephadex G25(M)以将溶剂更换为20mM磷酸盐缓冲溶液，pH 6.0。将获得的样品用20mM磷酸盐缓冲溶液，pH 6.0稀释至约1mg/ml的浓度，并保存于-80℃直至使用。
本发明还提供了使用本发明的转谷氨酰胺酶突变蛋白或表达该蛋白的转化体加工底物蛋白的方法。作为能够充当转谷氨酰胺酶的底物的蛋白质，可提到具有转谷氨酰胺酶可及的谷氨酰胺残基和/或赖氨酸残基的蛋白质。这种方法适用于各种想要在不适合使用WT转谷氨酰胺酶或常规的二硫键引入型转谷氨酰胺酶的温度范围中实施蛋白质交联反应的应用(织物加工、制革等)。
例如，本发明的突变蛋白可用于在约40℃至约100℃，优选约50℃至约100℃，更优选约55℃至约100℃，仍更优选约60℃至约100℃，进一步更优选约65℃至约100℃进行的反应。具体而言，因为纺织品加工中使用的较高温度处理是在至少约60℃的温度进行的，所以本发明的突变蛋白适合于在纺织品加工中使用。
实施例
下面借助下述实施例来更具体地描述本发明，然而本发明绝不限于实施例。
实施例1：二硫键引入型转谷氨酰胺酶基因中随机突变的引入及二硫键引入型转谷氨酰胺酶突变体的筛选文库的构建
MTG基因由三个区组成：前(pre)区，原(pro)区，和成熟形区。通过易错PCR，将突变引入编码MTG活性自身的成熟形区(约1000 bp)，其中引入D3C和G283C突变以形成二硫键(D3C/G283C)。衍生自茂原链轮丝菌DSMZ菌株衍生的转谷氨酰胺酶基因的序列已得到测定(Eur.J.Biochem.，257，570-576，1998)。参考此序列，合成分别位于成熟形区上游和下游的正向引物(TCCATAGCAATCCAAAGG(SEQ ID NO：13))和反向引物(GGGCGACCGAGAAGTTTTTTACAAAAGGCA(SEQ ID NO：14))；使用Genemorph Ver.2试剂盒(由STRATAGENE制造)依照制造商推荐的规程用下文所示的反应液组成和条件实施易错PCR。反应液的组成是这样设立的，使得在碱基序列水平上会在两个或三个位点处引入突变。为了用获得的PCR产物替换Appl.Environ.Microbiol.，2003，69(1)，358-366中记载的原-MTG表达载体pPSPTG11的相应部分，将它们用BamHI处理(37℃，2小时)，然后用EcoO65I处理(37℃，2小时)。切出载体并在60μl ddH2O中溶解。PCR产物通过乙醇沉淀来纯化。将载体和PCR产物混合到一起达到1∶5的比例之后，使用Ligation Solution试剂盒I(由Takara Inc.制造)让反应于16℃进行3小时以连接它们。用通过连接而制备的质粒转化大肠杆菌JM109，产生4500个菌落，以500个菌落分组进行质粒提取。通过电穿孔用通过提取获得的质粒转化自谷氨酸棒状杆菌AJ12036构建的YDK010(FERM BP-734)(WO2002/081694)(使用的构建方法记载于WO 2002/081694)；将转化体在补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G板(葡萄糖5g，Polypepton 10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，DL-Met 0.2g，pH 7.2/1L)中培养(30℃，24小时)。电穿孔通过文献(FEMS Microbiol.Lett.，53，299-303，1989)中记载的方法来实施。
实施例2：二硫键引入型转谷氨酰胺酶突变体的初次筛选
将1ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基(葡萄糖5g，Polypepton 10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，DL-Met 0.2g，pH 7.2/1L)分配至每个96孔深孔。接种实施例1中获得的每个转化体(约10000个菌株)并以1,500rpm于30℃预培养24小时。将1ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/L CaCO3的MM培养基(葡萄糖60g，MgSO4·7H2O 1g，FeSO4·7H2O0.01g，MnSO4·5H2O 0.01g，(NH4)2SO4 30g，KH2PO4 1.5g，VB1-HCl 0.45mg，生物素0.45mg，DL-Met 0.15g，pH 7.5/1L)分配至每个96孔深孔，并传代培养50μl预培养液。以1,500rpm于30℃培养5小时后，将DTT添加至96孔深孔以达到3mM的浓度。添加DTT后，将每个转化体以1,500rpm于30℃培养43小时。将培养液以3000rpm于4℃离心10分钟；将200μL获得的培养上清液用20mM MOPS，pH 7稀释5倍。将枯草杆菌蛋白酶以MTG量的1/100的量添加至稀释液，并容许反应于30℃进行16小时以活化MTG。通过氧肟酸盐方法来测量活性来实施筛选。在测量活性时，将30μl经过活化的溶液分配至96孔孔并预先于37℃加温5分钟。向每个孔中分别施加50μl先前于37℃温热5分钟的A液(0.05M MES，0.1M NH2OH，0.03MCBZ-Gln-Gly，pH 6.0)，并让反应于37℃进行20分钟，之后向每个孔分别施加50μl B液(1N HCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)以终止反应，然后使用读板仪测量525nm处的吸光度。接着，将100μL反应液分加至每个96孔深孔；添加PMSF以达到1mM，并让反应于25℃进行1小时。使用热循环仪将经过PMSF处理的反应液于65℃加热10分钟。对经过加热处理的反应液如上所述用氧肟酸盐法测量活性。以原始的二硫键引入型转谷氨酰胺酶突变体(即导入有D3C和G283C突变的株)作为对照，选择70个加热处理之前和之后的吸光度与对照几乎相等，且自加热处理之前和之后的吸光度导出的残留活性与对照相同或高于对照的株。以下，为方便起见，将掺入了D3C和G283C突变的株以及自该株获得的二硫键引入型转谷氨酰胺酶(蛋白质)称作D3C/G283C、3/283或3-283。
实施例3：通过初次筛选而选择的株的突变点分析
通过鉴定通过筛选而获得的株的碱基序列来分析突变点。将每个通过筛选而获得的株使用补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基于30℃培养24小时，之后使用QIAGEN的QIAprepSpin Miniprep试剂盒来提取质粒，并用该质粒转化大肠杆菌JMl09株。将经过转化的大肠杆菌JM109株用LB培养基于37℃培养16小时，之后以相同方式提取质粒。使用ABI PRISM CycleSequencing试剂盒依照制造商推荐的规程实施碱基序列分析。结果，确认了47个株中存在突变点，并鉴定了30种突变体(表2)。
表2：通过初次筛选而鉴定的突变体
Figure BDA0000089275410000221
实施例4：二硫键引入型转谷氨酰胺酶突变体的二次筛选
将3ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基分别加入至每个试管。分别接种30种通过初次筛选而选择的突变体并于30℃预培养24小时。将4ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/L CaCO3的MM培养基分别添加至每个试管，并传代培养50μl预培养培养液。于30℃培养5小时后，添加DTT以达到3mM的浓度。添加DTT后，将各个突变体于30℃培养43小时。将培养液离心(10,000rpm，10分钟)；向获得的培养上清液中添加以MTG量的1/100的量的枯草杆菌蛋白酶，并让反应于30℃进行16小时，以活化MTG。经过活化的溶液使用PD-10(由GE Healthcare Bioscience制造)进行处理以将溶剂更换为20mM MES，pH 6.0。适当地稀释培养液，并以与实施例2相同的方式实施二次筛选。测量加热处理后氧肟酸盐活性的结果是，7种突变体(表3)展现与对照3-283等同或更高的残留活性。
表3：通过二次筛选而选择的突变体
Figure BDA0000089275410000231
实施例5：通过二次筛选而选择的二硫键引入型转谷氨酰胺酶的纯化
将3ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基分别添加至每个试管。接种7种通过二次筛选而选择的突变体和对照(3-283)，并于30℃预培养24小时。将50ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/L CaCO3的MM培养基分别添加至每个坂口烧瓶，接种2.5ml预培养液，并于30℃培养48小时。于30℃培养5小时后，添加DTT以达到3mM的浓度。添加DTT后，将各个突变体于30℃培养43小时。将培养液离心(8,000rpm，10分钟)；向获得的培养上清液中添加MTG量的1/100量的枯草杆菌蛋白酶，并让反应于30℃进行16小时以活化MTG。利用Sephadex G25(M)使经过活化的溶液与阳离子交换层析平衡缓冲溶液(20mM乙酸盐缓冲溶液，pH 5.5)交换。接着，将整个体积施加到用相同缓冲溶液完全平衡的阳离子交换柱(Resource S 6ml；由GE Healthcare Bioscience制造)上。用相同缓冲溶液再平衡后，以波长280nm处的UV吸收作为指标对在0→0.5M NaCl线性浓度梯度上200mM的NaCl浓度附近洗脱的蛋白质级分进行分级。通过上文所述方法来测量级分活性和蛋白质含量，并回收排除了比活性低的级分的、具有几乎等同的比活性的峰顶附近的级分。使回收的级分通过Sephadex G25(M)以将溶剂更换为20mM磷酸盐缓冲溶液，pH 6.0。在所有情况下，层析均于室温实施。
实施例6：纯化的突变型酶的耐热性的评估
分别制备8种纯化的突变型酶以达到0.5mg/mL。将100μL酶溶液分别添加至每个96孔深孔；添加PMSF以达到1mM，让反应于25℃进行1小时。使用热循环仪将酶溶液于63℃、64.8℃、66.6℃和68.4℃分别加热10分钟。将未加热的酶溶液和上文经过加热处理的酶溶液各30μl分别添加至每个96孔孔并预先于37℃加温5分钟。将50μl预先于37℃加温5分钟的A液(0.05M MES，0.1M NH2OH，0.03M CBZ-Gln-Gly，pH 6.0)分别添加至每个孔，并让反应于37℃进行20分钟，之后将50μl B液(1N HCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)分别添加至每个孔以终止反应，再使用读板仪测量525nm处的吸光度。以未加热的酶溶液的吸光度值作为100％，计算63℃、64.8℃、66.6℃、和68.4℃的残留活性。
耐热性评估结果汇总于表4。发现所有7种突变体在66.6℃条件下均展现改善的耐热性。
表4：纯化的突变型酶的耐热性评估
Figure BDA0000089275410000241
实施例7：有希望的突变点组合
作为筛选的结果，选择了7种突变体，并鉴定了7个突变位点。为了通过组合它们来进一步改善耐热性，构建了多重突变体。如实施例1中那样使用Stratagene的QuikChange II Site-Directed Mutagenesis试剂盒将突变引入实施例3中鉴定的4-3-11H(表5中的MSS2)。通过与上文所述方法相同的方式分析碱基序列来检查突变的引入。构建的突变体列于表5。
表5：有希望的突变点的组合
  编号   引入的突变点
  1   3-283
  2   MSS2   S101P
  3   MSS2α   S101P/G250A
  4   MSS2αA   S101P/G250A/G157A
  5   MSS2αA+1   S101P/G250A/G157A/T53S
  6   MSS2αA+2   S101P/G250A/G157A/T53S/A83T
  7   MSS2αA+3   S101P/G250A/G157A/T53S/A83T/N92S
  8   MSS2αA+4   S101P/G250A/G157A/T53S/A83T/N92S/V112I
  9   MSS2αB   S101P/G250A/G157S
  10   MSS2αB+1   S101P/G250A/G157S/T53S
  11   MSS2αB+2   S101P/G250A/G157S/T53S/A83T
  12   MSS2αB+3   S101P/G250A/G157S/T53S/A83T/N92S
  13   MSS2αB+4   S101P/G250A/G157S/T53S/A83T/N92S/V112I
  14   MSS2β   S101P/G250R
  15   MSS2βA   S101P/G250R/G157A
  16   MSS2βA+1   S101P/G250R/G157A/T53S
  17   MSS2βA+2   S101P/G250R/G157A/T53S/A83T
  18   MSS2βA+3   S101P/G250R/G157A/T53S/A83T/N92S
  19   MSS2βA+4   S101P/G250R/G157A/T53S/A83T/N92S/V112I
  20   MSSβB   S101P/G250R/G157S
  21   MSS2βB+1   S101P/G250R/G157S/T53S
  22   MSS2βB+2   S101P/G250R/G157S/T53S/A83T
  23   MSS2βB+3   S101P/G250R/G157S/T53S/A83T/N92S
  24   MSS2βB+4   S101P/G250R/G157S/T53S/A83T/N92S/V112I
实施例8：有希望的多重突变体的选择
通过电穿孔将实施例7中构建的每种质粒导入棒状杆菌(Corynebacterium)，产生转化体。将1ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基(葡萄糖5g，Polypepton 10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，DL-Met 0.2g，pH 7.2/1L)分别添加至每个96孔深孔。接种各个转化体并以1,500rpm于30℃预培养24小时。将1ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/L CaCO3的MM培养基(葡萄糖60g，MgSO4·7H2O 1g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·5H2O0.01g，(NH4)2SO4 30g，KH2PO4 1.5g，VB1-HCl 0.45mg，生物素0.45mg，DL-Met 0.15g，pH 7.5/1L)分别添加至每个96孔深孔，并接种50μl预培养液。以1,500rpm于30℃培养5小时后，将DTT条件至96孔深孔以达到3mM的浓度。添加DTT后，将转化体以1500rpm于30℃培养43小时。将培养液以3000rpm于4℃离心10分钟，并将200μL获得的培养上清液用20mMMOPS，pH 7稀释5倍。以每种TG量的1/100的量将枯草杆菌蛋白酶添加至稀释液，并让反应于30℃进行16小时以活化各种TG。通过氧肟酸盐方法测量活性来进行筛选。在测量活性时，将30μl经过活化的溶液分别添加至96孔孔并预先于37℃加温5分钟。将50μl先前于37℃加温5分钟的A液(0.05M MES，0.1M NH2OH，0.03M CBZ-Gln-Gly，pH 6.0)分别添加至每个孔，并让反应于37℃进行20分钟，之后将50μl B液(1N HCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)分别添加至每个孔以终止反应，之后使用读板仪测量525nm处的吸光度。接着，将100μL反应液分别添加至96孔深孔；添加PMSF以达到1mM，并让反应于25℃进行1小时。使用热循环仪将经过PMSF处理的反应液于67℃加热10分钟。如上所述对经过加热处理的反应液用氧肟酸盐法测量活性。结果，鉴定出6种具有与对照(3-283)等同或更高的酶活性和表达水平且残留活性与对照相比显著改善的突变体(MSS2αA，MSS2αB，MSS2β，MSS2βA，MSS2βA+1和MSS2βB)(表5，图1)。
实施例9：有希望的多重突变体的纯化及它们的耐热性的评估
将3ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基分别添加至每个试管。分别接种实施例8中鉴定的6种突变体并于30℃预培养24小时。将50ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/L CaCO3的MM培养基分别添加至每个坂口烧瓶中，并传代培养2.5ml预培养液。于30℃培养5小时后，添加DTT达到3mM的浓度。添加DTT后，将各个突变体于30℃培养43小时。将培养液离心(8,000rpm，10分钟)；将枯草杆菌蛋白酶以MTG量的1/100的量添加至获得的培养上清液，并让反应于30℃进行16小时以活化MTG。使用Sephadex G25(M)使经过活化的溶液与阳离子交换层析平衡缓冲溶液(20mM乙酸盐缓冲溶液，pH 5.5)交换。接着，将整个体积施加到用相同缓冲溶液完全平衡的阳离子交换柱(Resource S 6ml；由GE Healthcare Bioscience制造)上。用相同缓冲溶液再平衡后，以波长280nm处的UV吸收作为指标对在0→0.5M NaCl线性浓度梯度上200mM的NaCl浓度附近洗脱的蛋白质级分进行分级。通过上文所述方法来测量级分活性和蛋白质含量，并回收排除了比活性低的级分的、具有几乎等同的比活性的峰顶附近的级分。使回收的级分通过Sephadex G25(M)以将溶剂更换为20mM磷酸盐缓冲溶液，pH 6.0。在所有情况中，层析均于室温实施。分别制备6种纯化的突变型酶以达到0.5mg/mL。将100μL酶溶液分别添加至96孔深孔；添加PMSF以达到1mM，并让反应于25℃进行1小时。使用热循环仪将酶溶液于63.6℃、64.2℃、66.8℃、68.2℃、69.7℃、和71.1℃加热各10分钟。将未加热的酶溶液和经过加热处理的酶溶液各30μl分别添加至96孔孔并预先于37℃加温5分钟。将50μl先前于37℃加温过5分钟的A液(0.05M MES，0.1M NH2OH，0.03M CBZ-Gln-Gly，pH 6.0)分别添加至每个孔，让反应于37℃进行20分钟，之后将50μl B液(1N HCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)分别添加至每个孔以终止反应，之后使用读板仪测量525nm处的吸光度。以未加热的酶溶液的吸光度值作为100％，计算63.6℃、64.2℃、66.8℃、68.2℃、69.7℃和71.1℃的残留活性。
耐热性评估结果汇总于图2。观察到，在于68.2℃加热处理10分钟时，对照亲本酶丧失它的活性，而所有6种αA、αB、β、βA、βA+1、和βB均具有显著改善的耐热性。
实施例10：依照氧肟酸盐法的MSS2βB的耐热性评估
使用依照实施例9中描述的方法而纯化的MSS2βB(S101→P，G157→S，G250→R)、D3C/G283C、和野生型MTG(在此实施例中，此后简称为MTG)，通过氧肟酸盐法来测量活性的温度依赖性。依照Protein Expr.Purif.26(2002)329-335中记载的方法通过反相层析来测定酶浓度。将1.0mL先前于35℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、和70℃加温5分钟的A液(0.05M MES，0.1M NH2OH，0.03M CBZ-Gln-Gly，pH 6.0)分别添加至每个试管；添加100μL酶溶液，并让反应于各个温度进行10分钟，之后分别添加1.0mL B液(1NHCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)以终止反应，然后测量525nm处的吸光度。依照Protein Expr.Purif.26(2002)329-335中记载的方法来计算比活性。
耐热性评估结果汇总于图3。MTG于45℃至50℃展现最大活性，比活性为约45U/mg。D3C/G283C于55℃至60℃展现最大活性，比活性为约75U/mg；它的耐热性比MTG超出10℃，而且它的比活性二倍于MTG。MSS2βB(S101→P，G157→S，G250→R)于60℃至65℃展现最大活性，比活性为约115U/mg；它的耐热性比D3C/G283C超出5℃，而且它的比活性最大值也比D3C/G283C改善约50％。
实施例11：引入的突变点的耐热性改善效果的确认
作为上文所述实验的结果，观察到MSS2βB(S101→P，G157→S，G250→R)具有与D3C/G283C相比改善的耐热性。为了确认D3C/G283C中引入的突变点S101→P、G157→S、和G250→R的位点对耐热性的改善有贡献，通过氨基酸替代进行可确认。具体地，构建了通过向导入有G157→S和G250→R的D3C/G283C中引入氨基酸替代S101→G、A、V、I、P、F、N、Q、Y、K、R或E而生成的突变体、通过向导入有S101→P和G250→R的D3C/G283C中引入氨基酸替代G157→A、V、I、S、N、K、R、H、D或E而生成的突变体、和通过向导入有S101→P和G157→S的D3C/G283C中引入氨基酸替代G250→A、V、L、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、K、R、H或D而生成的突变体。如实施例1中那样使用Stratagene的QuikChange IISite-Directed Mutagenesis试剂盒将用于实现氨基酸替代的突变引入实施例7中鉴定的MSS2βB。通过以与上文所述方法相同的方式分析碱基序列来检查突变的引入。构建的突变体列于表6。通过电穿孔将构建的每种质粒导入棒状杆菌，产生转化体。
表6：有希望的突变点的组合
  编号   引入天然型MTG的突变点   氨基酸替代
  1   D3C/G157S/G250R/G283C   S101G
  2   D3C/G157S/G250R/G283C   S101A
  3   D3C/G157S/G250R/G283C   S101V
  4   D3C/G157S/G250R/G283C   S101I
  5   D3C/G157S/G250R/G283C   S101P
  6   D3C/G157S/G250R/G283C   S101F
  7   D3C/G157S/G250R/G283C   S101N
  8   D3C/G157S/G250R/G283C   S101Q
  9   D3C/G157S/G250R/G283C   S101Y
  10   D3C/G157S/G250R/G283C   S101K
  11   D3C/G157S/G250R/G283C   S101R
  12   D3C/G157S/G250R/G283C   S101E
  13   D3C/S101P/G250R/G283C   G157A
  14   D3C/S101P/G250R/G283C   G157V
  15   D3C/S101P/G250R/G283C   G157I
  16   D3C/S101P/G250R/G283C   G157S
  17   D3C/S101P/G250R/G283C   G157N
  18   D3C/S101P/G250R/G283C   G157K
  19   D3C/S101P/G250R/G283C   G157R
  20   D3C/S101P/G250R/G283C   G157H
  21   D3C/S101P/G250R/G283C   G157D
  22   D3C/S101P/G250R/G283C   G157E
  23   D3C/S101P/G157S/G283C   G250A
  24   D3C/S101P/G157S/G283C   G250V
  25   D3C/S101P/G157S/G283C   G250L
  26   D3C/S101P/G157S/G283C   G250M
  27   D3C/S101P/G157S/G283C   G250P
  28   D3C/S101P/G157S/G283C   G250F
  29   D3C/S101P/G157S/G283C   G250W
  30   D3C/S101P/G157S/G283C   G250S
  31   D3C/S101P/G157S/G283C   G250T
  32   D3C/S101P/G157S/G283C   G250N
  33   D3C/S101P/G157S/G283C   G250Q
  34   D3C/S101P/G157S/G283C   G250Y
  35   D3C/S101P/G157S/G283C   G250K
  36   D3C/S101P/G157S/G283C   G250R
  37   D3C/S101P/G157S/G283C   G250H
  38   D3C/S101P/G157S/G283C   G250D
实施例12：实施了氨基酸替代的突变体的粗纯化及其耐热性的评估
将3ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基分别添加至每个试管。接种实施例11中生成的每种突变体并于30℃预培养24小时。将4ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/L CaCO3的MM培养基分别添加至每个试管，并次培养0.2ml预培养液。于30℃培养5小时后，添加DTT以达到3mM的浓度。添加DTT后，将各个突变体于30℃培养43小时。将培养液离心(8,000rpm，10分钟)。制备获得的培养上清液以达到0.1至0.2mg/mL的酶浓度，之后将它施加到PD-10柱(由GE Healthcare制造)上，于室温下与20mM乙酸钠缓冲溶液，pH 5.0交换来对酶加以粗纯化。向3.0mL经过粗纯化的酶溶液中小心地添加氢氧化钠以达到pH 6.8至7.0；以MTG量的1/100量添加枯草杆菌蛋白酶，并让反应于30℃进行16小时以活化突变型酶。将经过活化的突变型酶用20mM磷酸钠缓冲溶液，pH 6.0稀释2倍。将100μL经过2倍稀释的酶溶液分别添加至96孔深孔；添加PMSF以达到1mM，并让反应于25℃进行1小时。使用热循环仪将经过PMSF处理的酶溶液于25℃、60℃、和67℃加热各10分钟。将20μl经过加热处理的酶溶液分别添加至96孔孔并预先于37℃加温5分钟。将50μL先前已于37℃加温5分钟的A液(0.05M MES，0.1M NH2OH，0.03M CBZ-Gln-Gly，pH 6.0)分别添加至每个孔，并让反应于37℃进行20分钟，之后将50μL B液(1N HCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)分别添加至每个孔以终止反应，之后使用读板仪测量525nm处的吸光度。以经过25℃加热的酶溶液的吸光度值作为100％，计算60℃和67℃的残留活性。
耐热性评估结果汇总于图4。在所有通过于S101处引入氨基酸替代而生成的突变体(G157→S和G250→R也作为突变点引入)、通过于G157处引入氨基酸替代而生成的突变体(S101→P和G250→R也作为突变点引入)、和通过于G250处引入氨基酸替代而生成的突变体(S101→P和G157→S也作为突变点引入)中，于67℃加热处理10分钟后的残留活性均超出对照D3C/G283C(图4(A)，(B)，(C))。上述结果证明了在S101、G157、和G250这三个点处引入氨基酸替代时，MTG的耐热性得到改善。
实施例13：MSS2βB中突变的引入以及获得的突变体(此后有时称作MSS2βB突变体)的筛选文库的构建
MTG基因由三个区组成：前(pre)区，原(pro)区，和成熟形区。通过易错PCR向编码活性MSS2βB(D3C/S101P/G157S/G250R/G283C)自身的成熟形区(约1000bp)中引入突变，其中MSS2βB是为了形成二硫键(D3C/G283C)而引入D3C和G283C突变，并且为了进一步改善耐热性而引入S101P、G157S、和G250R突变而制备的。合成分别在成熟形区上游和下游的正向引物(TCCATAGCAATCCAAAGG(SEQ ID NO：13))和反向引物(GGGCGACCGAGAAGTTTTTTACAAAAGGCA(SEQ ID NO：14))，并使用Genemorph Ver.2试剂盒(由STRATAGENE制造)依照制造商推荐的规程用下文所示反应液组成和条件实施易错PCR。反应液组成是这样设立的，使得在碱基序列水平会在三个左右的位点引入突变。为了将获得的PCR产物与载体pPSPTG11连接，将它们用BamHI处理(37℃，2小时)，然后用EcoO65I处理(37℃，2小时)。切出载体并在60μl ddH2O中溶解。通过乙醇沉淀来纯化PCR产物。将载体和PCR产物混合到一起以达到1∶5的比例，然后使用Ligation Solution试剂盒I(由Takara Inc.制造)容许反应于16℃进行3小时以连接它们。用通过连接而制备的质粒转化大肠杆菌JM109，产生4500个菌落，以500个菌落一组进行质粒提取。用提取的质粒通过电穿孔转化实施例1中描述的YDK010。将转化体在补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G板(葡萄糖5g，Polypepton 10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，DL-Met 0.2g，pH 7.2/1L)上培养(30℃，24小时)。电穿孔通过文献(FEMS Microbiol.Lett.，53，299-303，1989)中记载的方法来实施。
实施例14：MSS2βB突变体的初次筛选
将1ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基(葡萄糖5g，Polypepton10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，DL-Met 0.2g，pH 7.2/1L)分别添加至每个96孔深孔。接种实施例13中获得的各个转化体(约8200个菌株)并以1,500rpm于30℃预培养24小时。将1ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/LCaCO3的MM培养基(葡萄糖60g，MgSO4·7H2O 1g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·5H2O 0.01g，(NH4)2SO4 30g，KH2PO4 1.5g，VB1-HC1 0.45mg，生物素0.45mg，DL-Met 0.15g，pH 7.5/1L)分别添加至每个96孔深孔，并传代培养50μl预培养液。以1,500rpm于30℃培养5小时后，将DTT添加至96孔深孔以达到3mM的浓度。添加DTT后，将每个转化体以1500rpm于30℃培养43小时。将培养液以3000rpm于4℃离心10分钟，并将200μL获得的培养上清液用20mM MOPS pH 7稀释5倍。将枯草杆菌蛋白酶以MTG量的1/100的量添加至稀释液，并让反应于30℃进行16小时以活化MTG。通过氧肟酸盐法测量活性来实施筛选。在测量活性时，将30μl经过活化的溶液分别添加至96孔并预先于37℃加温5分钟。将50μL先前已于37℃加温5分钟的A液(0.05M MES，0.1M NH2OH，0.03M CBZ-Gln-Gly，pH 6.0)分别添加至每个孔，并让反应于37℃进行20分钟，之后将50μL B液(1NHCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)分别添加至每个孔以终止反应，之后使用读板仪测量525nm处的吸光度。接着，将100μL反应液分别添加至96孔深孔；添加PMSF以达到1mM，并让反应于25℃进行1小时。将经过PMSF处理的反应液用热循环仪于67℃加热10分钟。如上所述对经过加热处理的反应液用氧肟酸盐法测量活性。以MSS2βB作为对照，选择171个加热处理之前和之后的吸光度与对照几乎等同、且自加热处理之前和之后的吸光度导出的残留活性与对照相比等同或更高的株。
实施例15：通过初次筛选而选择的株的突变点分析
通过鉴定筛选获得的株的碱基序列来分析突变点。将每个筛选获得的株使用补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基于30℃培养24小时，之后使用QIAGEN的QIAprepSpin Miniprep试剂盒来提取质粒，并用它转化大肠杆菌JM109株。将经过转化的大肠杆菌JM109株用LB培养基于37℃培养16小时，之后以相同方式提取质粒。使用ABI PRISM Cycle Sequencing试剂盒依照制造商推荐的规程实施碱基序列分析。结果，鉴定了86种突变体(表7)。
表7：通过初次筛选而鉴定的突变体
Figure BDA0000089275410000331
实施例16：MSS2βB突变体的二次筛选
将1ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基(葡萄糖5g，Polypepton10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，DL-Met 0.2g，pH 7.2/1L)分别添加至每个96孔深孔。在实施例15中选择的86种转化体中，采用导入了单一突变或双重突变的73种进行一式八份接种，并以1,500rpm于30℃预培养24小时。将1ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/L CaCO3的MM培养基(葡萄糖60g，MgSO4·7H2O 1g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·5H2O 0.01g，(NH4)2SO4 30g，KH2PO4 1.5g，VB1-HCl 0.45mg，生物素0.45mg，DL-Met 0.15g，pH 7.5/1L)分别添加至每个96孔深孔，并传代培养50μl预培养液。以1,500rpm于30℃培养5小时后，将DTT添加至96孔深孔以达到3mM的浓度。添加DTT后，将每个转化体以1500rpm于30℃培养43小时。将培养液以3000rpm于4℃离心10分钟，并将200μL所得的培养上清液用20mM MOPS pH 7稀释5倍。将枯草杆菌蛋白酶以MTG量的1/100的量添加至稀释液，并让反应于30℃进行16小时以活化MTG。通过氧肟酸盐法测量活性来实施筛选。在测量活性时，将30μl经过活化的溶液分别添加至各96孔孔并预先于37℃加温5分钟。将50μL先前已于37℃加温5分钟的A液(0.05M MES，0.1M NH2OH，0.03M CBZ-Gln-Gly，pH 6.0)分别添加至每个孔；容许反应于37℃进行20分钟，之后将50μL B液(1N HCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)分别添加至每个孔以终止反应，之后使用读板仪测量525nm处的吸光度。接着，将100μL反应液分别添加至每个96孔深孔；添加PMSF以达到1mM，并让反应于25℃进行1小时。使用热循环仪将经过PMSF处理的反应液于67℃加热10分钟。如上所述对经过加热处理的反应液用氧肟酸盐法测量活性。作为测量加热处理后氧肟酸盐活性的结果，8种突变体(表8)展现与对照MSS2βB相比等同或更好的残留活性。
表8：通过二次筛选而选择的突变体
Figure BDA0000089275410000341
实施例17：通过二次筛选而选择的MSS2βB突变体的纯化
将3ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基分别添加至每个试管。分别接种8种通过二次筛选而选择的突变体和对照(MSS2βB)，并于30℃预培养24小时。将50ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/L CaCO3的MM培养基分别添加至每个坂口烧瓶，传代培养2.5ml预培养液，并于30℃培养48小时。实施传代培养。于30℃培养5小时后，添加DTT以达到3mM的浓度。添加DTT后，将各个突变体于30℃培养43小时。将培养液离心(8,000rpm，10分钟)；将枯草杆菌蛋白酶以MTG量的1/100的量添加至获得的培养上清液，并让反应于30℃进行16小时以活化MTG。使用Sephadex G25(M)使经过活化的溶液与阳离子交换层析平衡缓冲溶液(20mM乙酸盐缓冲溶液，pH 5.5)交换。接着，将整个体积施加到用相同缓冲溶液完全平衡的阳离子交换柱(Resource S 6ml；由GE Healthcare Bioscience制造)。用相同缓冲溶液再平衡后，以波长280nm处的UV吸收作为指标，对在0→0.5M NaCl线性浓度梯度上200mM的NaCl浓度附近洗脱的蛋白质级分进行分级。通过上文所述方法来测量级分活性和蛋白质含量，并回收排除了比活性低的级分的、具有几乎等同的比活性的峰顶附近的级分。使回收的级分通过Sephadex G25(M)以将溶剂更换为20mM磷酸盐缓冲溶液，pH 6.0。在所有情况中，层析均于室温实施。
实施例18：纯化的突变型酶的耐热性的评估
制备8种纯化的突变型酶以达到0.1mg/mL。将100μL每个酶溶液分别添加至每个96孔深孔；添加PMSF以达到1mM，并让反应于25℃进行1小时。使用热循环仪将酶溶液于25℃、67℃、和70℃分别加热10分钟。将20μl上文所述的经过加热处理的酶溶液分别添加至96孔孔，并预先于37℃加温5分钟。将50μl先前已于37℃加温5分钟的A液(0.05M MES，0.1MNH2OH，0.03M CBZ-Gln-Gly，pH 6.0)分别添加至每个孔；让反应于37℃进行20分钟，之后将50μl B液(1N HCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)分别添加至每个孔以终止反应，之后使用读板仪测量525nm处的吸光度。以经过25℃加热的酶溶液的吸光度值作为100％，计算67℃和70℃的残留活性。
耐热性评估结果汇总于表9。发现2-4-11A(R208L)、5-5-11A(D268N)、9-7-2A(V132L)、11-3-10B(R238M)、12-2-9A(R208W)、和12-6-9F(E249K)在70℃条件下的耐热性得到改善。其中，2-4-11A(R208L)展现最高的残留活性。因为12-2-9A(R208W)是通过筛选而提取的，提示MSS2βB的耐热性是因为在R208处引入的突变而得到改善的。
表9：纯化的突变型酶的耐热性评估
Figure BDA0000089275410000361
实施例19：R208的耐热性改善效果的确认
实施例18中的结果显示了2-4-11A(R208L)具有与MSS2βB相比改善的耐热性。为了确认将突变点R208→L引入MSS2βB的位点对耐热性的改善有贡献，通过氨基酸替代进行了验证。具体地说，构建了将氨基酸替代R208→A、L、I、W、N、Y或E引入MSS2βB的突变体。如实施例13中那样使用Stratagene的QuikChange II Site-Directed Mutagenesis试剂盒将用于实现氨基酸替代的突变引入MSS2βB。通过以与上文所述方法相同的方式分析碱基序列来检查突变的引入。构建的突变体列于表10。通过电穿孔将构建的各种质粒导入棒状杆菌，产生转化体。
表10：有希望的突变点的组合
  编号   引入天然型MTG的突变点   氨基酸替代
  1   D3C/S101P/G157S/G250R/G283C   R208A
  2   D3C/S101P/G157S/G250R/G283C   R208L
  3   D3C/S101P/G157S/G250R/G283C   R208I
  4   D3C/S101P/G157S/G250R/G283C   R208W
  5   D3C/S101P/G157S/G250R/G283C   R208Y
  6   D3C/S101P/G157S/G250R/G283C   R208N
  7   D3C/S101P/G157S/G250R/G283C   R208E
实施例20：实施了氨基酸替代的突变体的粗纯化及其耐热性的评估
将3ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基分别添加至每个试管。接种实施例19中生成的每个突变体并于30℃预培养24小时。将4ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/L CaCO3的MM培养基分别添加至试管，并传代培养0.2ml预培养液。于30℃培养5小时后，添加DTT以达到3mM的浓度。添加DTT后，将突变体于30℃培养43小时。将培养液离心(8,000rpm，10分钟)。制备获得的培养上清液以达到0.1至0.2mg/mL的酶浓度，之后将它应用于PD-10柱(由GE Healthcare制造)并于室温与20mM乙酸钠缓冲溶液，pH 5.0交换以粗纯化酶。向3.0mL经粗纯化的酶溶液中小心地加入氢氧化钠以达到pH 6.8至7.0；以MTG量的1/100量添加枯草杆菌蛋白酶，并让反应于30℃进行16小时以活化突变型酶。将经过活化的突变型酶溶液用20mM磷酸钠缓冲溶液，pH 6.0稀释2倍。将100μL经过2倍稀释的酶溶液分别添加至96孔深孔；添加PMSF以达到1mM，并让反应于25℃进行1小时。使用热循环仪将经过PMSF处理的酶溶液于25℃、60℃、和67℃分别加热10分钟。将20μl上文经过加热处理的酶溶液分别添加至96孔孔，并预先于37℃加温5分钟。将50μL先前于37℃加温5分钟的A液(0.05M MES，0.1M NH2OH，0.03M CBZ-Gln-Gly，pH 6.0)分别添加至每个孔，并让反应于37℃进行20分钟，之后将50μL B液(1N HCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)分别添加至每个孔以终止反应，再使用读板仪测量525nm处的吸光度。以经过25℃加热的酶溶液的吸光度值作为100％，计算60℃和67℃的残留活性。
耐热性评估结果汇总于图5。关于通过MSS2βB的R208处的氨基酸替代而生成的突变体，在R208A、R208L、和R208E这三处氨基酸替代的情形，67℃加热处理10分钟后的残留活性超过了对照MSS2βB。上述结果证明了在R208用A或L或E替代时，MSS2βB的耐热性得到改善。
实施例21：有希望的突变点的组合
根据实施例18的结果，发现当将2-4-11A(R208L)引入MSS2βB时耐热性得到改善。因此，在实施例18中提取的其它突变点即V132L、R238M、E249K、和D268N中分别引入2-4-11A(R208L)以生成多重突变体，并检查耐热性改善的效果。如实施例13中那样使用Stratagene的QuikChange IISite-Directed Mutagenesis试剂盒将突变引入2-4-11A(R208L)。通过与上文相同的方式分析碱基序列来检查突变的引入。构建的突变体列于表11。
表11：有希望的突变点的组合
  编号   引入天然型MTG的突变点   氨基酸替代
  1   D3C/S101P/G157S/R208L/G250R/G283C   V132L
  2   D3C/S101P/G157S/R208L/G250R/G283C   R238M
  3   D3C/S101P/G157S/R208L/G250R/G283C   E249K
  4   D3C/S101P/G157S/R208L/G250R/G283C   D268N
实施例22：有希望的多重突变体的耐热性的评估
通过电穿孔将实施例21中构建的每种质粒导入棒状杆菌以产生转化体。将3ml补充有25μg/ml卡那霉素的CM2G培养基分别添加至每个试管。接种获得的每个转化体，并于30℃预培养24小时。将4ml补充有25μg/ml卡那霉素和50g/L CaCO3的MM培养基分别添加至每个试管，并传代培养0.2ml预培养液。于30℃培养5小时后，添加DTT以达到3mM的浓度。添加DTT后，将转化体于30℃培养43小时。将培养液离心(8,000rpm，10分钟)。制备获得的培养上清液以达到0.1至0.2mg/mL的酶浓度，之后将它应用于PD-10柱(由GE Healthcare制造)并于室温与20mM乙酸钠缓冲溶液，pH 5.0交换以对酶进行粗纯化。向3.0mL经过粗纯化的酶溶液中小心地加入氢氧化钠以达到pH 6.8至7.0；以MTG量的1/100量添加枯草杆菌蛋白酶，并让反应于30℃进行16小时，以活化突变型酶。将经过活化的突变型酶用20mM磷酸钠缓冲溶液，pH 6.0稀释2倍。将100μL经过2倍稀释的酶溶液分别添加至96孔深孔；添加PMSF以达到1mM，并让反应于25℃进行1小时。使用热循环仪将经过PMSF处理的酶溶液于25℃、60℃、和67℃分别加热10分钟。将20μl上文经过加热处理的酶溶液分别添加至96孔孔，并预先于37℃加温5分钟。将50μL先前已于37℃加温5分钟的A液(0.05M MES，0.1MNH2OH，0.03M CBZ-Gln-Gly，pH 6.0)分别添加至每个孔，并让反应于37℃进行20分钟，之后将50μL B液(1N HCl，4％TCA，1.67％FeCl3·6H2O)分别添加至每个孔以终止反应，之后使用读板仪测量525nm处的吸光度。以经过25℃加热的酶溶液的吸光度值作为100％，计算60℃和67℃的残留活性。
耐热性评估结果汇总于图6。即使在将V132L、R238M、E249K、和D268N分别导入2-4-11A(R208L)时，耐热性也没有改善。
实施例23：评估MSS2βB的pH稳定性
将0.5至0.6mg/ml MTG、D3C/G283C(3-283)突变体和MSS2βB分别用给定的缓冲溶液(0.1M甘氨酸缓冲溶液pH 3，0.1M磷酸钠缓冲溶液pH 12)稀释4倍；容许此稀释物于室温静置1小时，然后用0.4M磷酸盐缓冲溶液pH 6稀释2倍，并用氧肟酸盐法测量活性。结果显示于表12，以pH 6时的活性为100％。发现MSS2βB与D3C/G283C相比，在pH 3的耐酸性水平和pH 12的耐碱性略微改善。
表12：pH稳定性的评估
  pH 3.0   pH 6.0   pH12.0
  MTG   28.7   100.0   7.3
  D3C-G283C   91.4   100.0   39.4
  MSS2βB   95.2   100.0   39.9
工业实用性
依照本发明，通过修饰MTG，有可能提供具有改善的耐热性的转谷氨酰胺酶。另外，通过使用具有改善的耐热性的转谷氨酰胺酶，能提供新产品和新技术。
本申请基于在日本提交的专利申请No.2009-053537，通过述及将其中公开的内容完整并入本文。另外，通过述及将本说明书中引用的专利文件和非专利文件完整并入本文，达到在本说明书中公开它们的程度。
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Claims (14)

1.一种具有转谷氨酰胺酶活性，并由下述氨基酸序列组成的蛋白质：
在SEQ ID NO:2中，在3位和283位突变为半胱氨酸，并还在一个选自101位、157位和250位的位置处进行突变的氨基酸序列，其中101位、157位和250位的位置处的氨基酸突变为：
101位：突变为脯氨酸，
157位：突变为丙氨酸或丝氨酸，
250位：突变为丙氨酸或精氨酸。
2.一种具有转谷氨酰胺酶活性，并由下述氨基酸序列组成的蛋白质：
其中在SEQ ID NO:2中，除了3位的天冬氨酸变为半胱氨酸的突变和283位的甘氨酸变为半胱氨酸的突变之外，还具有下述突变组合中的任一种突变组合：
(1)101位的丝氨酸变为脯氨酸的突变，157位的甘氨酸变为丝氨酸的突变，和250位的甘氨酸变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或天冬氨酸的突变；
(2)157位的甘氨酸变为丝氨酸的突变，250位的甘氨酸变为精氨酸的突变，和101位的丝氨酸变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸或谷氨酸的突变；或
(3)101位的丝氨酸变为脯氨酸的突变，250位的甘氨酸变为精氨酸的突变，和157位的甘氨酸变为丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸的突变。
3.权利要求2的蛋白质，其中所述蛋白质在SEQ ID NO:2中，除了3位的天冬氨酸变为半胱氨酸的突变和283位的甘氨酸变为半胱氨酸的突变之外，还具有
101位的丝氨酸变为脯氨酸的突变；
157位的甘氨酸变为丙氨酸、丝氨酸或精氨酸的突变；和
250位的甘氨酸变为丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或精氨酸的突变。
4.权利要求3的蛋白质，其中在SEQ ID NO:2中，除了3位的天冬氨酸变为半胱氨酸的突变和283位的甘氨酸变为半胱氨酸的突变之外，还具有下述突变组合中的任一种突变组合：
(1)101位的丝氨酸变为脯氨酸的突变，157位的甘氨酸变为丝氨酸的突变，和250位的甘氨酸变为丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或精氨酸的突变；
(2)157位的甘氨酸变为丝氨酸的突变，250位的甘氨酸变为精氨酸的突变，和101位的精氨酸变为脯氨酸的突变；或
(3)101位的丝氨酸变为脯氨酸的突变，250位的甘氨酸变为精氨酸的突变，和157位的甘氨酸变为丙氨酸、丝氨酸或精氨酸的突变。
5.一种具有转谷氨酰胺酶活性，并由下述氨基酸序列组成的蛋白质：
在SEQ ID NO:2中，在3位和283位突变为半胱氨酸，并还在101位、157位和250位3个位置处进行突变的氨基酸序列，其中101位、157位和250位的位置处的氨基酸突变为：
101位：突变为脯氨酸，
157位：突变为丙氨酸或丝氨酸，
250位：突变为丙氨酸或精氨酸。
6.权利要求5的蛋白质，其中所述蛋白质在SEQ ID NO:2中具有
3位的天冬氨酸变为半胱氨酸的突变；
101位的丝氨酸变为脯氨酸的突变；
157位的甘氨酸变为丝氨酸的突变；
250位的甘氨酸变为精氨酸的突变；和
283位的甘氨酸变为半胱氨酸的突变。
7.权利要求1-6中任一项的蛋白质，其中在SEQ ID NO:2中，进一步包含208位的精氨酸变为亮氨酸、丙氨酸或谷氨酸的突变。
8.权利要求1的蛋白质，其中在SEQ ID NO:2中，进一步包含：
(1)208位的精氨酸变为色氨酸的突变，
(2)268位的天冬氨酸变为天冬酰胺的突变，
(3)132位的缬氨酸变为亮氨酸的突变，
(4)238位的精氨酸变为甲硫氨酸的突变，或
(5)249位的谷氨酸变为赖氨酸的突变。
9.一种多核苷酸，其编码权利要求1-8中任一项的蛋白质。
10.一种重组载体，其包含权利要求9的多核苷酸。
11.一种宿主细胞，其经权利要求10的重组载体进行了转化。
12.一种产生权利要求1至8中任一项的蛋白质的方法，包括培养权利要求11的宿主细胞，并收集具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质。
13.一种处理底物蛋白的方法，包括使权利要求1至8中任一项的蛋白质、由权利要求12的方法产生的蛋白质或权利要求11的宿主细胞作用于底物蛋白的步骤。
14.权利要求13的方法，其中对底物蛋白的处理在40℃至100℃进行。
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